CN109776819A

CN109776819A - 一种白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶及其制备

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Publication number: CN109776819A
Application number: CN201910022699.4A
Authority: CN
Inventors: 刘杨; 黄滢蓓; 史福林; 杨宇; 肖湘; 伦镜盛
Original assignee: Shantou University
Current assignee: Shantou University
Priority date: 2019-01-10
Filing date: 2019-01-10
Publication date: 2019-05-21
Anticipated expiration: 2039-01-10
Also published as: CN109776819B

Abstract

本发明涉及一种白芨多糖‑羧甲基壳聚糖复合水凝胶及其制备，制备主要包括：先配置白芨多糖溶液和羧甲基壳聚糖溶液，将羧甲基壳聚糖溶液按一定配比与充分溶胀的卡波姆940混合，三乙醇胺调节凝胶体系pH，再加入一定量的白芨多糖溶液和去离子水，充分搅拌得到复合多糖水凝胶。制备得到的白芨多糖‑羧甲基壳聚糖复合水凝胶是通过氢键物理交联形成的，具有多孔结构和非晶型结构，其流变学特性显示出固态弹性特征，保水性良好；有良好时生物相容性，对创面损伤有明显修复作用。本发明制备方法简单、在一定溶液条件下通过物理混合制得，避免了有毒交联剂的使用，制备过程安全、易操作；而且成本低、原料易得。

Description

一种白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶及其制备

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶及其制备。

背景技术

日常生活中发生的意外事故比如车祸、烫伤、运动摩擦等造成皮肤的损伤。创面愈合过程漫长复杂且存在被细菌感染化脓的风险。水凝胶敷料能够维持伤口的湿润度；对敏感基础组织粘附性覆盖；缓解疼痛还能促进上皮形成和细胞迁移来减小疤痕形成的风险，在创面愈合过程中有着积极的影响。目前，市面上用于创面修复的有人表皮重组因子水凝胶，但价格较昂贵。也有研究报道出化学交联的水凝胶敷料，但其涂展性差，且使用的化学交联剂有一定的细胞毒性。多糖是一种天然高分子物质，来源广泛易得，具有生物活性，生物相容性，低或无细胞毒性。物理交联法制备的水凝胶可避免使用有毒交联剂。所以多糖水凝胶是一种经济、绿色安全的产品。

白芨是一味传统的中草药，其块茎中多糖含量丰富(约占原药植物的 55％-60％)，是主要的药用活性成分。具有抑制肿瘤血管的生成，兼有抗感染、抗氧化和促进凝血、消肿敛疮、祛癖生肌的功效，是一种优良的天然生物粘附剂。壳聚糖是广泛存在于虾蟹等甲壳类动物的壳中，羧甲基壳聚糖是壳聚糖的水溶性衍生物，有很广的抗菌谱、优良的保湿性能以及良好的生物相容性。卡波姆940是优良的凝胶基质，安全无毒。

发明内容

本发明的目的在于将白芨多糖的创面修复活性与羧甲基壳聚糖抗菌活性结合，通过物理交联制备一种性能优良的水凝胶，具有多孔结构和非晶型结构，呈固态弹性特征，粘附性、涂展性好，保水性强；有良好时生物相容性，对创面损伤有明显修复作用，应用于创面修复领域，以解决现有技术存在的问题。

一种白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶的制备，主要包括以下步骤：

(1)制备白芨多糖溶液：取白芨多糖溶解于去离子水中，制得白芨多糖溶液；

(2)制备羧甲基壳聚糖溶液：取羧甲基壳聚糖溶解于去离子水中，制得羧甲基壳聚糖溶液；

(3)制备卡波姆940凝胶基质：取卡波姆940溶于去离子水中，室温下放置待其充分溶胀；

(4)制备白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶：将羧甲基壳聚糖溶液滴加到卡波姆940凝胶基质中，再加三乙醇胺调pH为6.9-7.2，搅拌均匀后，再加入白芨多糖溶液，25℃下搅拌15min，再加去离子水，搅拌10min，得到白芨多糖- 羧甲基壳聚糖复合水凝胶。

进一步的，步骤(1)中每0.1g白芨多糖溶解于1mL去离子水中。

进一步的，步骤(2)中每0.1g羧甲基壳聚糖溶解于1mL去离子水中。

进一步的，步骤(3)中的卡波姆940凝胶基质中含0.5％卡波姆940。

进一步的，步骤(4)中白芨多糖溶液、羧甲基壳聚糖溶液、卡波姆940的质量比为4:1:1。物料比为白芨多糖：羧甲基壳聚糖：卡波姆940＝4:1:1的水凝胶性能最佳。

其中白芨多糖中多糖含量≥90％，羧甲基壳聚糖要求羧化度≥80％。

上述制备所得白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶。白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶具有多孔结构，通过氢键发生物理交联，属非晶型结构。多孔结构有利于创面气体(如O₂,CO₂)交换，保证创面组织的呼吸，有利于微环境的物质代谢。流变学特征表明其储能模量>损耗模量，呈固态弹性特征。保水性良好；凝胶提取液(1、10、100、1000、10000μg/mL)培养的细胞存活率均达85％以上，溶血率为3.85％；对创面损伤有明显修复作用，14天创面愈合率为83.80％，由皮肤病理切片可观察到新生上皮和血管形成，胶原纤维排列整齐。通过Elisa 检测细胞因子得到，TNF-α呈下降趋势，EGF上升明显，表明复合凝胶具有促进伤口愈合作用。

上述白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶的应用，用于创面愈合与修复。

与现有技术相比，本发明通过三乙醇胺调节凝胶溶液环境、物理交联制得的白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶具有多孔结构和非晶型结构，主要具有以下优势：

(1)本发明仅用两种原料白芨多糖、羧甲基壳聚糖即可达到创面修复的效果，具有经济合理性，节约成本。通过小鼠全层皮肤创伤实验愈合情况可直观地证明其药理作用。

(2)本发明的水凝胶呈半固体状，具有固态弹性特征，涂展性、粘附性良好，能与创面紧密贴合；生物相容性和创面修复效果好。

(3)本发明的水凝胶保水性能强，能够创造并维持一个湿润环境，有利于创面细胞的生长迁移。

(4)本发明采用物理交联制备复合水凝胶，制备步骤简洁，在一定溶液条件下通过物理混合制得，避免了有毒交联剂的使用，制备过程安全、易操作。而其它多糖比如海藻酸钠凝胶一般使含Ca²⁺交联剂，有Ca²⁺、Sr²⁺等阳离子存在时，G单元上的Na⁺与二价阳离子发生离子交换反应，G单元堆积形成交联网络结构，从而形成水凝胶。黄原胶/聚甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(PDMAEMA) 水凝胶的制备需要添加四甲基乙二胺(TEMED)交联，TEMED有很强的神经毒性

(5)本发明采用的白芨多糖、羧甲基壳聚糖、卡波姆940便宜易得；避免了高成本原料的使用，成本低。

附图说明

图1是白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合凝胶制备工艺流程图；

图2是白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合凝胶外观图；

图3是白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合凝胶的扫描电镜图；

图4是白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合凝胶的傅里叶红外分析图；

图5是白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合凝胶的X射线单晶衍射图；

图6是白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合凝胶的流变学性能储能模量(G’)和损耗模量(G”)图；

图7是白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合凝胶的复合凝胶18h内失水率图；

图8是M293T细胞分别在0、1、10、100、1000、10000μg/mL白芨多糖- 羧甲基壳聚糖复合凝胶①提取液中培养24h后的存活率图；

图9是白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合凝胶的溶血实验结果图；

图10是白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合凝胶药理活性效果图，其中(a)为小鼠全层皮肤损伤后在3，7，14天愈合情况图；(b)为愈合率图；(c)为3，7， 14天创面皮肤病例切片H&E染色图；

图11是Elisa检测细胞因子TNF-α，EGF的结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1

制备白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶

工艺流程图如图1所示，主要包括以下步骤：

(1)制备白芨多糖溶液：称取1g白芨多糖溶解于10mL去离子水中，制得白芨多糖溶液；

(2)制备羧甲基壳聚糖溶液：称取1g羧甲基壳聚糖溶解于10mL去离子水中，制得羧甲基壳聚糖溶液；

(3)制备卡波姆940凝胶基质：称取0.5g卡波姆940溶于40mL去离子水中，室温过夜待其充分溶胀；

(4)本实施例中白芨多糖溶液：羧甲基壳聚糖溶液：卡波姆940的配比分别为①4:1:1,②4:1:2,③1:2:1。

(5)制备白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶：按步骤(4)的配比，先将羧甲基壳聚糖溶液滴加到卡波姆940凝胶基质中，搅拌均匀，滴加三乙醇胺调 pH＝7，再加入白芨多糖溶液，25℃搅拌15min。最后加去离子水至凝胶体系达 100g，25℃搅拌10min，得到白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶。

上述所制备的白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶外观图如图2所示。

同时通过粘度计和pH计可测定三种配比的白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶黏度分别为39601.33mPa·s，38600mPa·s，38985mPa·s。在pH计下检测的pH分别为7.0，7.1，7.1。

实施例2

结构表征测定

扫描电镜检测：将白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶放入24孔板中，-40℃ 冷冻24h后掰断，真空干燥48h。冷冻干燥后的样品贴在导电胶上，真空环境下喷金20min。通过10KV电压下的扫描电镜观察其截面微观结构。

傅里叶红外光谱检测：分别将白芨多糖、羧甲基壳聚糖、卡波姆940与少量KBr混合研磨均匀，压成薄片。冷冻干燥的凝胶样品借助ATR附件，通过傅里叶红外光谱在波长500～4000cm^-1范围进行扫描。

X射线单晶衍射仪检测：将冷冻干燥的凝胶样品研碎；分别将凝胶粉末，白芨多糖、羧甲基壳聚糖、卡波姆940置于样品池中，通过X射线单晶衍射仪检测；参数如下：放射源Cu-Kα(λ＝0.154nm)，工作电压、工作电流分别为40KV 和40mA，衍射角度10°到60°。

白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶的表征如图3-5所示，其中，图3是三种配比的复合凝胶截面均具有疏松多孔结构，其中复合凝胶①的结构最为疏松，有较多的孔隙(由图3(1)可得)；如图4所示，白芨多糖在3396.98cm^-1的吸收峰为羟基伸缩振动，2928.46cm^-1出的峰为甲基或亚甲基的C-H振动。1568.07 cm^-1,1450.49cm^-1和1405.61cm^-1处的吸收峰均为乙酰基的振动峰，1031.82 cm^-1的振动峰表明白芨多糖吡喃糖基化结构，845.65cm^-1处的吸收峰为甘露糖的特征吸收峰。羧甲基壳聚糖在3439.57cm^-1的吸收峰表明N-H与O-H氢键结合， 1600.33cm^-1,1507.75cm^-1和1415.93cm^-1的吸收峰分别为羧基的C＝O伸缩， N-H振动和-C＝N伸缩振动。卡波姆940在1716.80cm^-1的吸收峰为-COOH振动。复合凝胶在1600cm^-1～1720cm^-1处的吸收峰变宽且与卡波姆940在1716.80 cm^-1的吸收峰相比发生蓝移，表明卡波姆940的羧基与另外两种物质产生氢键作用力。如图5所示，羧甲基壳聚糖在2θ＝21°的较尖锐峰表明羧甲基壳聚糖的结晶区域。制备成凝胶后呈现宽峰，表明该复合凝胶为非晶型结构。

实施例3

理化性能测定指标评定

流变学性能测试：用M101流变仪对复合水凝胶进行储存模量(G’)、损耗模量(G”)和动态复数黏度(η’)测试。参数：温度37℃，频率0.01-10HZ。

失水实验：取一定质量的复合水凝胶于2mL EP管中，准确称量其初始质量 (W₀)。将复合水凝胶样品放入硅胶干燥器里，37℃放置18h，每隔1h取出准确称取质量(W_t)。失水率用以下公式计算：

结果阐明了白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶的理化性质，其中，图6表明复合水凝胶的储能模量远大于损耗模量，即该复合水凝胶有固态弹性特征，其中复合水凝胶①的储能模量和损耗模量都最小，表明其固态特性小于复合水凝胶②和③，即有最佳的涂展性。失水实验结果如图7所示，12h后三种水凝胶失水率分别为45.33％，50.70％，51.76％，即复合水凝胶①失水最少，有最优保水性能。

由上述实验可筛选出复合水凝胶①有最优性能，即最优凝胶物料配比为白芨多糖溶液：羧甲基壳聚糖溶液：卡波姆940＝4:1:1。

实施例4

生物相容性测定指标评定

细胞毒性实验：将M293T细胞接种于96孔板中，接种密度1×10⁵细胞/ 孔，用200μL含10％胎牛血清的DMEM培养基在5％CO₂，37℃条件下培养24 h。复合水凝胶①浸入DMEM培养基中，37℃浸泡12h，制成1、10、100、1000、 10000μg/mL的凝胶提取液。24h后去除96孔板中的培养基，加入200μL不同浓度凝胶提取液，继续培养24h，然后加入20μL MTT溶液，培养4h后去除凝胶提取液，加入150μL二甲基亚砜，摇晃96孔板15min，490nm处测OD 值。用不含凝胶的DMEM培养基做空白组。每组设6个复孔平行实验，取其平均值。

细胞存活率(％)＝OD_490(样品)/OD_490(空白)×100％

溶血实验：取0.05g复合水凝胶①于2ml生理盐水中，37℃浸泡24h，向凝胶提取液中加入200μL 2％红细胞悬液37℃继续培养1h。向2ml生理盐水中加入200μL 2％红细胞悬液做负对照，2ml去离子水中加入200μL 2％红细胞悬液做正对照。1h后8000r/min离心5min，取上清，545nm出测OD值。做三组平行实验，取其平均值。

白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶有良好的生物相容性，其中，图8所示，凝胶提取液(1、10、100、1000、10000μg/mL)培养24h后M293T细胞存活率均到达85％以上；图9所示，白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶没有溶血物质，其溶血率为3.85％。

实施例5

药理活性测定指标评定

小鼠全层皮肤损伤实验：在72只6～7周的雄性昆明小鼠用3.6％水合氯醛麻醉(10g/mL)，背部脊椎两侧剪出直径10mm的圆形伤口。将小鼠分为三组，每组24只，分别用人表皮重组因子水凝胶，白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶 ①和生理盐水组处理，作为阳性组、凝胶组和生理盐水组。在第3、7、14天分别随机取8只观察伤口情况，测量创面面积A并处死，取伤口周围皮肤组织制作病理切片。

皮肤病理切片实验：将取出的皮肤组织在冷的生理盐水中洗净，滤纸吸干多余的水分，用10％甲醛固定24h以上。制作切片前流水冲组织24h后分别在 70％、80％、90％乙醇中脱水1h，95％、100％乙醇中脱水30min，二甲苯透明 15min左右，62℃浸蜡2h，包埋。用切片机切成5μm薄片，42℃水浴展片。65℃ 烤片固定1h，浸入60℃二甲苯脱蜡30min。分别于100％、90％、80％、70％、水中逐级复水2min；苏木素染色10min，流水冲2min，1％盐酸-乙醇溶液分化 3s，流水冲2min，稀氨水返蓝30s，流水冲2min，伊红染液染色2min，流水冲2min。再在70％、80％、90％、100％酒精中逐级脱水10s，浸入二甲苯中5min，中性树脂封片。

如图10所示白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶有良好的创面修复药理作用。如图(a)所示，第7天阳性组和凝胶组创面比生理盐水组明显收缩，第14 天长出新生皮肤和少量绒毛。如图(b)所示，凝胶组的愈合率与阳性组无显著性差异，第14天时可达到83.8％。如图(c)所示，第3天阳性组和凝胶组有炎症细胞浸润，出现大量新生毛孔；第7天炎症细胞减少，毛孔合并，出现新的腺体和肉芽组织；第14天形成新的皮肤，上皮发育良好，有新生血管生成。

细胞因子检测实验：将小鼠创面皮肤组织与生理盐水按1:9混合，制成10％的组织匀浆液。酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒检测细胞因子TNF-α，EGF的含量。

肿瘤坏死因子(TNF-α)能够参与免疫调节、发热和炎症的发生，具有生长因子样作用。表皮生长因子(EGF)能促进上皮细胞、成纤维细胞的增殖；增强表皮细胞的活力；延缓表皮细胞的老化，使肌肤各组成成份保持最佳生理状态。结果如图11所示，受到创伤后，炎细胞浸润，TNF-α含量迅速上升，第7,14天炎症反应有所缓解，TNF-α呈下降趋势。其中凝胶组和阳性组下降明显。EGF参与细胞增殖过程，随创面修复时间呈上升趋势，其中凝胶组和阳性组的EGF含量明显上升。

另外，研究发现本发明的白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶保水性能强，能够创造并维持一个湿润环境，有利于创面细胞的生长迁移。

实施例6

经本实验的前期工作将白芨多糖和羧甲基壳聚糖进行了混合，结果表明该混合物没有凝胶成型性，质地稀，取少量白芨多糖和羧甲基壳聚糖混合物涂展在载玻片上，室温下4h则失去大量水分，保水性比较差，不利于创面湿润环境的维持。

Claims

1.一种白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶的制备，其特征在于，主要包括以下步骤：

(4)制备白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶：将羧甲基壳聚糖溶液滴加到卡波姆940凝胶基质中，再加三乙醇胺调pH为6.9-7.2，搅拌均匀后，再加入白芨多糖溶液，25℃下搅拌15min，再加去离子水，搅拌10min，得到白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶。

2.根据权利要求1所述白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶的制备，其特征在于，步骤(1)中每0.1g白芨多糖溶解于1mL去离子水中。

3.根据权利要求1所述白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶的制备，其特征在于，步骤(2)中每0.1g羧甲基壳聚糖溶解于1mL去离子水中。

4.根据权利要求1所述白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶的制备，其特征在于，步骤(4)得到的白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶中含0.5％卡波姆940。

5.根据权利要求1所述白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶的制备，其特征在于，步骤(4)中白芨多糖溶液、羧甲基壳聚糖溶液、卡波姆940的质量比为4:1:1。

6.根据权利要求1-5任一项所述制备所得白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶。

7.根据权利要求6所述白芨多糖-羧甲基壳聚糖复合水凝胶的应用，其特征在于，用于创面愈合与修复。