CN101804064A - 二氢槲皮素及糖苷类化合物在制备抗耐药菌药物中的用途 - Google Patents

Abstract

二氢槲皮素及糖苷类化合物在制备抗耐药菌药物中的用途，本发明从多科属植物如地耳草(Hypericum japonicum Thunb.)中提取二氢槲皮素及其糖苷类化合物并证实其抗耐药菌活性，所述的二氢槲皮素及其糖苷类化合物经药理试验，结果证实除了对临床上常见的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)具有显著的直接抑制作用外，还能增强现有抗生素的抗耐药菌作用，本发明所述的化合物二氢槲皮素及其糖苷类化合物，可进一步作为活性成分，制成新型治疗耐药菌感染的药物；制剂形式包括与药物可接受载体组合制成的口服制剂、注射剂和/或外用制剂。

Description

二氢槲皮素及糖苷类化合物在制备抗耐药菌药物中的用途

技术领域

本发明涉及二氢黄酮醇类化合物，尤其是二氢槲皮素及其糖苷类在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的新用途。

背景技术

随着抗生素的广泛应用，越来越多的细菌对常用抗生素产生耐药性，且耐药程度日益加重。自从1961年英国首先报道耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus)以来，至今世界各地相继发现，且MRSA感染呈上升趋势，甚至引起医院内爆发流行。目前MRSA与爱滋病、肝炎、癌症并列为当今世界上的四大顽症。MRSA对多种抗生素耐药，致病力强且治疗效果差，为引起医院感染的主要病原菌之一。由于其多重耐药性，即除了对万古霉素等少数几种抗生素有效外，几乎对现有各类抗生素如β-内酰胺类、氟喹诺酮类、大环内酯类、氨基糖苷类等抗生素都耐药，而且感染多发生于免疫缺陷者、老弱患者及烧伤、手术患者，故治疗难度大、病死率高，引起医务工作者的高度重视。建国以来，我国虽然对中草药抗金葡菌等感染的作用进行过筛选研究，但这些研究多限于药材提取物，对耐药菌的作用也只是在近年来才得到关注，国内迄今罕见针对MRSA感染的单体化合物的研究报道。我们针对临床上国内外耐药菌感染的现状，集中对滇产药用植物包括地耳草中的抗MRSA黄酮类成分进行了深入筛选研究，首次发现了对MRSA有较强抑制活性的二氢黄酮醇类化合物，进一步研究发现，该类化合物还能够使MRSA对现有抗生素起到增敏作用，特别是能够增强甚至逆转对MRSA无效的氟喹诺酮类抗生素的抗MRSA作用。

二氢槲皮素及其糖苷类化合物属于二氢黄酮醇类化合物，发明人检索到国内外有关此类化合物抗MRSA的如下专利：专利文献1，US 6294526B1，Use of flavone derivatives forinduction of β-lactam-sensitivity of MRSA；专利文献2，US 2006/0229262A1，Pharmaceuticalcomposition for treatment of infection with drug resistant bacterium and disinfectant。其中提到的二氢黄酮醇类化合物花旗松素(Taxifolin)，又名二氢槲皮素(Dihydroquercetin)具有抗MRSA作用，并且能增强甲氧西林(Methicillin)等β-内酰胺类抗生素的抗MRSA作用。发明人还检索到二氢槲皮素衍生物(2R，3R)-dihydroquercetin-7，4′-dimethyl ether具有抗皮肤真菌作用(Pacciaroni Adel V et al，Antifungal activity of Heterothalamus alienus metabolites.Phytother Res.2008，22：524-528)以及落新妇苷或花旗松素-3-鼠李糖苷(Astilbin，taxifolin-3-rhamnoside)具有抗皮肤微生物菌群作用，其中，对表皮葡萄球菌的最小抑制量(minimal inhibitory quantity，MIQ)为50μg(Moulari B et al.Isolation and in vitro antibacterial activity of astilbin，thebioactive flavanone from the leaves of Harungana madagascariensis Lam.ex Poir.(Hypericaceae).J.Ethnopharmacol.2006，106：272-278)。

综观国内外专利及其他文献的报道，除上述专利文献中提到的花旗松素作用外，没有一项专利或其他文献特指本发明所涉及的二氢槲皮素及其糖苷类化合物的抗MRSA作用。

发明内容

本发明的目的是提供二氢槲皮素及其糖苷类化合物在制备抗耐药菌MRSA药物中的应用，尤其是化合物花旗松素(I)、落新妇苷(II)、花旗松素-7-鼠李糖苷(III)的抗MRSA的新用途。

本发明基于当前临床耐药菌感染的实际，结合植物药抗菌药敏筛选和有效成分分离纯化方法，从藤黄科(Guttiferae)地耳草(Hypericumjaponicum Thunb.)等药用植物中提取二氢槲皮素及其糖苷类化合物并证实其抗耐药菌活性。

本发明所述的活性二氢槲皮素及其糖苷类化合物具有下式I～III代表的化学结构：

                                       R¹       R²

I花旗松素(Taxifolin)                   H        H

II花旗松素-3-鼠李糖苷(落新妇苷)        rha      H

(Taxifolin-3-O-α-L-rhamnoside，Astilbin)

III花旗松素-7-鼠李糖苷                 H        rha

(Taxifolin-7-O-α-L-rhamnoside)

其中，rha为鼠李糖基(rhamnosyl)的缩写形式。R¹和R²为羟基、具有2～6个碳原子的多羟基类化合物如单糖(鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和果糖等)、取代单糖及其聚合体。

上述化合物及衍生物在制备抗耐药菌药物中的用途，包括直接对耐药菌(含非耐药菌)的抗菌作用，以及与抗生素联合应用时，具有抗生素的增敏作用，即能够增强抗生素的疗效甚至逆转耐药菌对于抗生素的耐药性。

耐药菌是指耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；非耐药菌是指金黄色葡萄球菌。

化合物是指化合物II和III，所述被增敏的抗生素类别包括β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗生甚至逆转耐药菌对于抗生素的耐药性。

耐药菌是指耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；非耐药菌是指金黄色葡萄球菌。

化合物是指化合物II和III，所述被增敏的抗生素类别包括β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗生素；或者，被增敏的抗生素类别是指氟喹诺酮类抗生素。

所述的二氢槲皮素及其糖苷类化合物经药理试验，结果证实除了对临床上常见的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)具有显著的直接抑制作用外，还能增强现有抗生素的抗耐药菌作用，本发明所述的化合物二氢槲皮素及其糖苷类化合物，可进一步作为活性成分，制成新型治疗耐药菌感染的药物。制剂形式包括与药物可接受载体组合制成的口服制剂、注射剂和/或外用制剂。

本发明涉及的二氢槲皮素及其糖苷类化合物I～III的结构及其制备方法已经公开发表在文献中。在本发明中用作有效成分的化合物I～III中的一个或多个在多种药用植物类群中均有分布，如花旗松素在藤黄科(Guttiferae)、豆科(Leguminosae)、唇形科(labiateae)、仙人掌科(Cactaceae)、八角科(Illiciaceae)、蓼科(Polygonaceae)、杨柳科(Salicaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、五桠果科(Dilleniaceae)、火把树科(Eucryphiaceae)、松柏科(Coniferae)、金缕梅科(Hamamelidaceae)、蛇菰科(Balanophoraceae)、樟科(Lauraceae)、山榄科(Sapotaceae)、漆树科(Anacardiaceae)、壳斗科(Fagaceae)、蔷薇科(Rosaceae)等20余科植物中均有分布。Ishiguro等曾从地耳草(Hypericum japonicum)中分离得到花旗松素-7-鼠李糖苷(Ishiguro K.，et al.A flavanonol rhamnoside from Hypericum japonicum.Photochemistry，1991，30(9)：3152)。

用于实施本发明的二氢槲皮素及其糖苷类化合物可以按文献提示的提取分离方法制备，其中花旗松素(I)和落新妇苷(II)也可以通过市售途径得到。例示的化合物III可以从地耳草(Hypericum japonicum Thunb.)中制得。但是，这些实施仅以例示方式提供，而不起限定作用。

附表的说明：

表1是MRSA菌株对抗生素的药敏试验结果；

表2是二氢黄酮醇类化合物I～III与四种抗生素单用对MSSA和10株MRSA的MIC；

表3是花旗松素-7-鼠李糖苷(III)与四种抗生素对10株MRSA联合用药MIC和FIC指数；

表4是落新妇苷(II)与左氧氟沙星联合抗MRSA作用；

表5是花旗松素(I)与左氧氟沙星联合抗MRSA作用；

表6是纸片琼脂扩散法测得花旗松素-7-鼠李糖苷(III)对MRSA4对三种氟喹诺酮抗生素的抑菌圈。

具体实施方式

实施例1：从地耳草全草中提取分离单体花旗松素-7-鼠李糖苷(III)

取地耳草(Hypericumjaponicum Thunb Murray)干燥全草粗粉4.76kg于室温下用80％乙醇23L浸渍7天，过滤，重复3次。提取液合并，减压浓缩，得浸膏505g。将浸膏用蒸馏水制成悬浮液后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分配萃取。各有机层减压蒸干后分别得到90g，160g，105g浸膏，余为水部位。取乙酸乙酯层浸膏90g用硅胶柱(200-300目，2kg)，以乙酸乙酯-甲醇(1∶0-0∶1)为洗脱剂梯度洗脱，其中5％甲醇洗脱部位(8g)再用硅胶柱(300-400目，300g)以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(3∶1∶0.2-2∶2∶1)为洗脱剂梯度洗脱，3∶1∶0.2溶剂洗脱部位(0.6g)进行低压硅胶柱层析和葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析，经薄层层析检查，含相同组分者合并，得到化合物花旗松素-7-鼠李糖苷(III，150mg)。

实施例2：花旗松素-7-鼠李糖苷(III)的理化和波谱数据

黄色粉末(甲醇)，C₂₁H₂₃O₁₁ ⁺，mp 150-153℃。ESI MS(positive ion mode)m/z：451。¹HNMR(CD₃OD，400MHz)：δ_H6.97(1H，s，J＝11.6Hz，H-2′)，6.83(1H，dd，J＝1.0，8.0Hz，H-6′)，6.79(1H，d，J＝8.1Hz，H-5′)，6.26(1H，d，J＝1.9Hz，H-8)，6.17(1H，d，J＝1.8Hz H-6)，5.47(1H，d，J＝5.4Hz，H-1)，4.95(1H，d，J＝11.6Hz，H-2)，4.56(H，d，J＝11.6Hz，H-3)，3.96(1H，s，Rha-H-2)，3.76(H，dd，J＝3.1，9.4Hz，Rha-H-3)，3.53(1H，m，Rha-H-5)，3.43(1H，t，Rha-H-4)，1.22(3H，d，J＝6.0Hz Rha-Me)；¹³C NMR(CD₃OD，100MHz)：δ_C 115.9(d，C-2)，73.8(s，C-3)，199.3(s，C-4)，164.9(s，C-5)，98.0(d，C-6)，166.2(s，C-7)，96.9(d，C-8)，164.2(s，C-9)，103.4(s，C-10)，129.6(s，C-1′)，115.9(d，C-2′)，146.3(s，C-3″)，147.2(s，C-4′)，116.1(d，C-5′)，120.9(d，C-6′)，99.6(d，C-1″)，71.6(d，C-2″)，72.0(d，C-3″)，73.6(d，C-4″)，71.2(d，C-5″)，18.0(d，C-6″)。

实施例3：用作药敏试验的临床耐药菌株MRSA的筛选

1.试验材料

抗菌素药敏纸片(中国药品生物制品检定所)，MH琼脂(杭州天和微生物试剂有限公司)。

2.标本来源

从申请人的临床标本中分离筛选10株细菌，编号为MRSA189、MRSA155、MRSA328、MRSA144、MRSA247、MRSA4、MRSA92、MRSA55、MRSA330、MRSA123，冰箱-20℃下保存备用。

3.细菌鉴别

依据《全国临床检验操作规程》及本领域技术人员公知的细菌鉴别方法对上述标本细菌进行分离、培养，经鉴定为金黄色葡萄球菌(SA)，并按公知的抗菌素药敏常规测试方法(K-B纸片法)，参照美国临床试验室标准委员会(NCCLS)2004年标准进行耐药菌鉴定，头孢西丁对所有菌株的抑菌圈均≤19mm，故视为耐药SA菌株(MRSA)。

4.药敏试验

进一步用K-B纸片法，按照我国卫生部于2000年5月1日颁布实施的《纸片法抗菌药物敏感试验标准》(SAST)常规操作，用MH琼脂培养基于35℃培养17小时，测定10株MRSA对常用抗菌素的敏感性，结果见表1。

表1.MRSA菌株对抗生素的药敏试验结果

菌株	耐药	中介	敏感
				MRSA189	青霉素、氨苄西林、苯唑西林、头孢西丁、头孢唑啉、头孢呋辛、利福霉素	/	万古霉素、莫西沙星、联邦他唑仙、利萘唑胺
MRSA155	青霉素、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢西丁、阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素	/	万古霉素、加替沙星、利萘唑胺

菌株	耐药	中介	敏感
				MRSA328	青霉素、氨苄西林、苯唑西林、克拉霉素、克林霉素、头孢呋辛、头孢唑啉、阿奇霉素	左氧氟沙星	万古霉素、联邦他唑仙、磷霉素、利萘唑胺
MRSA144	青霉素、苯唑西林、氨苄西林、阿奇霉素、克林霉素、克拉霉素、头孢唑啉、头孢硫咪、头孢呋辛	/	万古霉素、磷霉素、利萘唑胺
				MRSA247	青霉素、苯唑西林、氨苄西林、阿奇霉素、头孢唑啉、头孢硫咪、头孢呋辛	克林霉素	万古霉素、磷霉素、利萘唑胺
MRSA4	青霉素、苯唑西林、氨苄西林、阿奇霉素、头孢唑啉、头孢硫咪、头孢呋辛	加替沙星	万古霉素、联邦他唑仙、磷霉素、利萘唑胺
				MRSA92	青霉素、苯唑西林、氨苄西林、阿奇霉素、头孢唑啉、头孢硫咪、头孢呋辛、左氧氟沙星	/	万古霉素、加替沙星、联邦他唑仙、磷霉素、利萘唑胺
MRSA55	苯唑西林、氨苄两林、阿奇霉素、克林霉素、青霉素、克拉霉素、红霉素、头孢唑啉、头孢硫咪、头孢呋辛	加替沙星	万古霉素、磷霉素、利萘唑胺
				MRSA330	青霉素、氨苄西林、苯唑西林、头孢唑啉、头孢呋辛、左氧氟沙星、克拉霉素、阿奇霉素、	头孢硫唑	万古霉素、加替沙星、联邦他唑仙、磷霉素、利萘唑胺
MRSA123	青霉素、氨苄两林、苯唑西林、头孢唑啉、头孢呋辛、左氧氟沙星、克拉霉素、阿奇霉素、	/	万古霉素、磷霉素、利萘唑胺

实施例4：化合物I～III对耐药菌株MRSA的直接抗菌活性和抗生素增敏作用测定

1.试验材料

培养基：MH肉汤(杭州天和微生物试剂有限公司)；受试药：二氢槲皮素-7-O-鼠李糖苷(由地耳草中提取分离得到)氨苄西林(华北制药)，头孢他啶(积大制药)，左氧氟沙星(扬子江制药)、阿奇霉素(扬子江制药)，溶剂：DMSO(分析纯)，蒸馏水；标准金黄色葡萄球菌(MSSA)：ATCC25923(中国药品生物制品检定所)，耐药菌(MRSA)：MRSA189、MRSA155、MRSA328、MRSA144、MRSA247、MRSA4、MRSA92、MRSA55、MRSA330、MRSA123：

2.药液制备

无菌DMSO将花旗松素-7-鼠李糖苷、氨苄西林、头孢他啶、左氧氟沙星和阿奇霉素分别配成配成1024μg/mL、2048μg/mL、2048μg/mL、512μg/mL、8192μg/mL溶液作为原药溶液。

稀释法分别测定氨苄西林、头孢他啶、左氧氟沙星、阿奇霉素、单体对MRSA的最低抑菌浓度值(Minimal inhibitory concentration，MIC)，把单体、左氧氟沙星先分别配成1024μg/mL、128μg/mL的原液，氨苄西林、头孢他啶、阿奇霉素均配成2048μg/mL的原液，均使用稀释法分别测定他们对MRSA的M IC，控制菌悬液浓度为1.0×10⁶CFU/mL。

3.菌液的制备

用接种环把菌株接种在MH琼脂平板上，置于35℃恒温箱中培养24h，再用接种环把菌株转移至试管中，用无菌生理盐水配成浓度为1.0×10⁶CFU/mL控制菌悬液。

4.测定药物抑制MRSA的最小抑菌浓度(MIC)

采用公知的二倍稀释法，取无菌96孔板，于每横排1号孔加200μL MH肉汤培养基作空白对照，12号孔加MH肉汤培养基和菌液各100μL作阳性对照。每横排2-11号孔先各加入50μL MH肉汤培养基，取原药液50μL与2号孔混匀，继而吸取50μL加入3号孔中，依次类推稀释至第11号孔，弃去50μL，2-11号孔各都加100μL稀释为1.0×10⁶CFU/mL菌液摇匀，置培养箱中于35℃培养24小时，按本领域技术人员公知方法进行受试药物活性评价，所得测定结果见表2。

表2.二氢黄酮醇类化合物I～III与四种抗生素单用对MSSA和10株MRSA的MIC

(单位：μg/mL)

细菌编号	MSSA	189	155	328	144	247	4	92	55	330	123
												I	/	512	512	512	512	512	512	512	512	512	512
II	/	512	512	512	512	512	512	512	512	512	512
												III	8	32	64	64	64	32	64	32	64	64	64
AMP	16	64	128	128	64	64	64	16	128	64	64
												CAZ	32	512	512	512	512	512	256	128	512	256	512
LEO	2	16	16	8	8	16	16	8	16	16	16
												AZI	＞1000	2048	2048	2048	2048	2048	2048	2048	2048	2048	2048

MSSA：甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(标准菌ATCC25923)；AMP，氨苄西林；CAZ，头孢他啶；LEO，左氧氟沙星；AZI，阿奇霉素.

5.化合物I～III与抗生素联合抑菌实验

5.1棋盘式微量稀释法(checkerboard microdilution assay)

棋盘法能精确测定两种抗菌药物在适当浓度的比例下所产生的相互作用。合用的两种药物于96孔板上以二维棋盘的纵(A至H)横(2-11)两方向分别进行二倍的倍比稀释，测定联合用药的MIC。FICI是评价药物体外联合用药的两药相互作用方式的主要参数。部分抑菌浓度指数(Fractional inhibitory concentration，FIC)为每一种药物联合抑菌时所需最低抑菌浓度(MIC_c)与单独时MIC_a的比值，而FICI则等于两种药物FIC之和。计算的公式为：FICI＝FIC₁+FIC₂＝MIC_1a/MIC_1c+MIC_2a/MIC_2c。当FICI≤0.5时，为协同作用；当1≥FICI＞0.5时，为相加作用；当2≥FICI＞1时，药物体外的相互作用方式为无关；当FIC指数＞2时，为拮抗作用。结果见表3～5。

表3.花旗松素-7-鼠李糖苷与四种抗生素对10株MRSA联合用药MIC和FIC指数

^aT7R：花旗松素-7-鼠李糖苷；AMP，氨苄西林；CAZ，头孢他啶；LEO，左氧氟沙星；AZI，阿奇霉素；^bMIC₅₀，抑制50％MRSA的浓度；MIC₉₀，抑制90％MRSA的浓度.

FICI₅₀，抑制50％MRSA的FIC指数；FICI₉₀，抑制90％MRSA的FIC指数.

表4落新妇苷与左氧氟沙星联合抗MRSA作用(单位：μg/mL)

表5花旗松素与左氧氟沙星联合抗MRSA作用(单位：μg/mL)

5.2用纸片琼脂扩散法测得花旗松素-7-鼠李糖苷对MRSA4对三种氟喹诺酮抗生素的抑菌圈，结果见表6。

表6纸片琼脂扩散法测得花旗松素-7-鼠李糖苷对MRSA4对三种氟喹诺酮抗生素的抑菌圈

^a联合用药化合物III的量为64μg/片。

Claims (6)

1.二氢槲皮素、其糖苷类化合物及衍生物在制备抗耐药菌药物中的用途，包括直接对耐药菌的抗菌作用，以及与抗生素联合应用时，具有抗生素的增敏作用，即能够增强抗生素的疗效甚至逆转耐药菌对于抗生素的耐药性。

2.按权利要求1所述的用途，其特征是所述的二氢槲皮素、其糖苷类化合物及其衍生物具有如下通式的化学结构，即化合物I、II和III或其可药用盐：

                                 R¹    R²

I花旗松素                        H     H

II花旗松素-3-鼠李糖苷(落新妇苷)  rha   H

III花旗松素-7-鼠李糖苷           H     rha

其中，rha为鼠李糖基(rhamnosyl)的缩写形式，R¹和R²为羟基、具有2～6个碳原子的多羟基类化合物如单糖(鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和果糖等)、取代单糖及其聚合体。

3.按权利要求1所述的用途，其特征是所述的耐药菌是指耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；非耐药菌是指金黄色葡萄球菌。

4.按权利要求1或2所述的用途，其特征是所述的化合物是指化合物II和III，所述被增敏的抗生素类别包括β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗生素。

5.按权利要求1或2所述的用途，其特征是所述的化合物是指化合物I、II和III，所述被增敏的抗生素类别是指氟喹诺酮类抗生素。

6.按权利要求1～5任一项所述的用途，其特征是制剂形式包括与药物可接受载体组合制成的口服制剂、注射剂和/或外用制剂。