CN112553275B - 一种植物中苯乙醇苷成分生物转化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物中苯乙醇苷成分生物转化的方法，含总苯乙醇苷的植物提取液或提取物中加入糖基供体和糖基转移酶，经生物转化获得转化产物。特别地，本发明将成本较低、产量高的列当等植物中所含的毛蕊花糖苷通过生物转化成市场需求量大、价值更高的松果菊苷，有助于减少松果菊苷生产对肉苁蓉和松果菊等的依赖性，大幅降低松果菊苷的生产成本。

Description

一种植物中苯乙醇苷成分生物转化的方法

技术领域

本发明涉及生物电转化方法，特别涉及一种植物中毛蕊花糖苷等苯乙醇苷系列成分生物转化的方法。

背景技术

列当科属于双子叶植物纲，为寄生草本植物，植株内无叶绿素或少许叶绿素。共有13属180种，主要位于欧亚大陆的北温带，少数位于美洲及热带地区。中国有肉苁蓉属、草苁蓉属、野菰属、丁座草属和列当属等10属，约35种。列当科中以列当属最多，共140种，如在中国分布广泛的野菰，东北和西北产的列当等，肉苁蓉属在中国仅生长在西北部的盐碱地和砂地上，其中以肉苁蓉最为著名。

列当(Orobanche caerulescens Steph.)为列当科列当属药用植物，又称草苁蓉，别名紫花列当、兔子拐棍、独根草，为寄生草本，东北、华北和西北等地分布，被称为东北不老草，是国家二级保护植物。列当全草药用，有补肾助阳、强筋骨和润肠的功效，主治阳痿、腰腿冷痛、神经官能症等，外用可消肿。蒙药主治炭疽。

向日葵列当(Orobanche cumana Wallr.)别称兔子拐棍，为列当科列当属一年生寄生草本植物，在我国分布范围很广，主要分布于黑龙江省、吉林省、北京市、甘肃省、辽宁省、内蒙古自治区、河北省、山西省、陕西省、青海省和新疆维吾尔自治区等地区。具有强筋壮骨、补肾助阳、抗疲劳、改善脑组织循环和增强免疫力等作用，其主要活性成分为苯乙醇苷类。

分枝列当(Orobanche aegyptiaca Pers)为列当科列当属一年生寄生草本植物，异名有瓜列当、埃及列当。主要生长于新疆地区，常寄生于田间瓜类植物根上，常见的寄主有番茄、西瓜、香瓜和黄瓜等，高15-50cm，全株被腺毛，茎挺直，有多数分枝，叶鳞片状，黄褐色，披针形或三角状披针形，长0.5-1.2cm，宽2-4mm。穗状花序，圆柱形，长5-20cm，苞片贴生于花梗的基部，卵状披针形或披针形，小苞片2枚，线形。其含有的主要活性成分为苯乙醇苷类，与同属列当科的传统药材肉苁蓉、草苁蓉中的化学成分类似。

肉苁蓉(CistancheHerba)为列当科肉苁蓉属植物，别名大芸、查干告亚(蒙语)，其味甘、咸，性温，归肾、大肠经，是传统的补肾阳中药，最早记载于《神农本草经》，列为上品，具有补肾阳、益精血和润肠通便的功效，主治男子阳痿、女子不孕和血枯便秘等症，有“沙漠人参”之美誉。《中华人民共和国药典》2015年版收载肉苁蓉和管花肉苁蓉为正品药材。肉苁蓉主要含苯乙醇苷、环烯醚萜苷、木脂素和甾醇等类成分其中苯乙醇苷类是肉苁蓉抗衰老、抗疲劳、补肾助阳、抗年性痴呆等药理作用的主要活性成分(曹振杰，赵文军，吴雪萍.肉苁蓉中苯乙醇甙类化合物的LC-MS分析.中药材，2004，(03)：175-177.)。

列当科多为寄生性沙地植物，我国新疆辽阔的沙漠为其提供了良好的生长环境，在新疆的大范围种植的葵花也有列当寄生。发明人2018年7月在新疆首先发现甜叶菊成为了列当的寄主之一，并且列当对其产业造成了部分的危害(郭书巧，杨秋萍，陈育如等，甜叶菊生产中新发生的一种有害植物——列当.特种经济动植物，2019，22(04)：39-41)。虽然列当类植物广泛分布，但其中的肉苁蓉类资源因采挖量大变得资源日益匮乏。

松果菊(Echinacea purpurea Moench)是原产于北美且广泛使用的药用植物，是著名的植物药，具有突出的抗感染和免疫促进作用，曾多年名列西方草药销售额的第一位，其具有抗炎促免疫的生理活性主要是因为其中所含的烷基酰胺类、链烯酮和菊苣酸能够增强粒细胞的吞噬作用，其中松果菊苷含量不高。松果菊苷最早由Stoll A(Stoll A，Renz J，Brack A.Isolation and constitution of echinacoside，a glycoside from the rootsof Echinacea angustifolia DC[J].Helv Chim Acta，1950，33：1877-1893.)于1950年从松果菊中提取分离而得名，但松果菊中松果菊苷含量极低，仅有0.0002-0.015％(闫晓慧，胡世俊，谢峻，冯巍，谈锋.HPLC同时检测狭叶松果菊中松果菊苷和绿原酸的含量[J].重庆师范大学学报(自然科学版，2013，30(03)：127-129)。可见，松果菊苷在松果菊中含量极低，实际利用制备松果菊苷产量和效益均很低。

苯乙醇苷类化合物是列当科植物的主要功能成分(宋志宏，雷丽，屠鹏飞.肉苁蓉属植物的药理活性研究进展.中草药，2003，(09)：113-115.)，具有抗氧化、清除自由基、神经保护、增强学习记忆、抗病毒和强心等明显的生理活性(靖会，佐建锋，李教社.苯乙醇苷类化合物的药理研究进展.时珍国医国药，2006，(03)：440-441)。

松果菊苷是苯乙醇苷中的指标性成分，松果菊苷最早在1950年由Stoll等从松果菊根部中分离得到(戴亮，郝海平，汪玉馨，王广基.松果菊苷药动/药效研究进展与思考.中国临床药理学与治疗学，2010，15(03)：342-349.)，含松果菊苷的药品或保健品在欧美等地特别受欢迎。有研究表明，松果菊苷可能通过增加转化生长因子-β1(TGF-β1)来促进肠道上皮细胞MODE-K细胞的增殖和增大细胞存活率，从而修复肠道上皮细胞，促进小肠推进力，有益肠道健康。但松果菊植物中松果菊苷含量极低，而含量较高的肉苁蓉由于近年来需求量增大，导致资源紧缺，价格居高不下，因此松果菊苷的大量生产还需寻找更为经济有效的原料。

毛蕊花糖苷也具有增强免疫、抗自由基和防止脂质过氧化等作用(Jia丫Guan Q，Guo Y.et al.Echinacoside Stimulates Cell Proliferation and Prevents CellApoptosis in Intestinal Epithelial MODE-K Cells by Up-Regulation ofTransforming Growth Factor-β1 Expression[J].Journa1 ofpharmaco1ogica1sciences，2012，118(1)：99)，如果将其经酶转化为松果菊苷将有更好和更多的应用价值。

第一个苯乙醇苷类化合物被发现距今已有40多年，有关其化学合成的报道很少，可见这类化合物的化学合成具有一定的难度(吴培培，闫明，霍仕霞.苯乙醇苷类化合物的研究进展.医药导报，2011，30(10)：1316-1319.)。通过化学合成法或生物合成法制取苯乙醇苷的相关研究有以下方法：

Duynstee H I等首次报道毛蕊花糖苷的全合成(Duynstee H I等，1999)，但全合成法路线过长，成本居高不下。赵岳琦运用Interrupted Pummerer反应介导的糖苷化方法，将新的糖基加至原料苯乙醇苷的鼠李糖残基或葡萄糖残基上，合成苯乙醇二糖苷和苯乙醇三糖苷，但没有生成松果菊苷，且Interrupted Pummerer反应介导的糖苷化方法成本依然很高(赵岳琦.基于Interrupted Pummerer反应介导的糖苷化方法合成天然苯乙醇苷.华中科技大学，2017.)。

松果菊苷是高价值产品，需求量很高。但是松果菊这种植物自身中的松果菊苷含量极低，列当科中也只有肉苁蓉中含量较高，而肉苁蓉是珍贵药材，且近些年的滥采对其生态和资源已经造成了严重的破坏，因此寻找其他来源的松果菊苷原料具有极大的应用前景和经济效益。

除列当科植物外，其他一些植物也含有苯乙醇苷类物质。如紫珠也含有毛蕊花糖苷。紫珠属(Callicarpa)始载于唐代《本草拾遗》，马鞭草科植物，主产于广东和广西，生于平地、低海拔的山坡、谷地、溪旁林中或灌丛中。叶可药用，有止血止痛和散瘀消肿之效，主要用于外伤出血、跌打肿痛、风湿肿痛、肺结核咯血和胃肠出血。紫珠中的苯乙醇苷以金石蚕苷为主，含量为0.023-2.69％，毛蕊花糖苷含量则为0.180-0.940％(孙秀漫.广东紫珠物质基础及其主要活性成分的药代动力学研究.广州中医药大学，2015)。

近年来，苯乙醇糖苷的全合成和半合成研究取得了进展，化学全合成生产苯乙醇糖苷的优点是原料廉价易得、产物易分离，但合成路线长、副反应多、手性拆分繁琐、收率低和成本高。Van BOOM课题组对毛蕊花糖苷的全合成路径，见图1。

半合成苯乙醇糖苷的优点是合成路线较短、纯度高和收率高，但如何大量获得其关键前体2-苯基乙基-β-D-葡萄糖苷是潜在的问题，并且需要使用手性催化剂4-吡咯烷基吡啶，用于酰化肉桂酸酐的O-4位。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供一种植物中苯乙醇苷成分生物转化的方法。毛蕊花糖苷是苯乙醇苷系列成分中的一种，毛蕊花糖苷可转化成松果菊苷。

技术方案：本发明提供一种植物中苯乙醇苷成分生物转化的方法，含总苯乙醇苷的植物提取液或提取物中加入糖基供体和糖基转移酶，经生物转化获得转化产物。

进一步地，所述糖基供体为糊精或淀粉；所述含总苯乙醇苷的植物中含毛蕊花糖苷、2-乙酰毛蕊花糖苷、金石蚕苷、2-乙酰金石蚕苷。

进一步地，所述转化产物为松果菊苷、苯乙醇三糖苷或苯乙醇四糖苷。

进一步地，含总苯乙醇苷的植物提取液或提取物采用含苯乙醇苷的植物提取获得。

进一步地，所述含有苯乙醇苷的植物包括含有苯乙醇苷的列当科植物和非列当科植物，如紫珠。

进一步地，所述含有苯乙醇苷的植物包括紫花列当、瓜列当、黄花列当、向日葵列当、分枝列当、锯齿列当和马鞭草科。

进一步地，所述糖基转移酶是酶液或酶粉或菌液或菌粉。

进一步地，所述糖基转移酶是含或产糖基转移酶的菌液或菌粉。

进一步地，生物转化过程中转化液经树脂法或醇沉法除去糖基供体或其他成份，精制或浓缩后的液体直接作为产品或脱除溶剂成为固体产品。

进一步地，转糖基方法可以直接用含苯乙醇苷或其前体成份的原料，经加入产糖基转移酶和水解酶的菌液或菌粉，经固体或半固体发酵后，转化即可。

转化液直接应用或经树脂吸附、醇沉等方法除去糖基供体和其他成份，将苯乙醇苷浓缩或精制得到不同含量的液体或固体产品。

本发明利用资源更多、价格更有竞争力的植物(如列当和紫珠等)提取出的苯乙醇苷类物质，通过自制酶或成熟的工业糖基转移酶经生物转化形成目标苯乙醇苷，具有污染小和生产步骤少等优点，因此是极具前景的新方法。

毛蕊花糖苷与2-乙酰毛蕊花糖苷及松果菊苷的结构差异

毛蕊花糖苷的中心葡萄糖的6’-OH上再以糖苷键连接一个葡萄糖残基变为松果菊苷；乙酰化发生在中心葡萄糖的2’-OH上，变为乙酰化糖苷。因此考虑转糖基酶的作用原理和苯乙醇苷类物质中心葡萄糖的反应特点，通过转糖基反应，在毛蕊花糖苷中心葡萄糖6’-OH上继续连接一个葡萄糖残基使其变为松果菊苷是可行的。本发明的用糖基转移酶转化含毛蕊花糖苷等成份的转化实验结果可见(见图2和图3)，松果菊苷的响应峰在转化后(峰高1600)比转化前(峰高800)升高了一倍，而底物峰(图2中25min后峰)高在转化后明显降低，因此通过这种生物酶加糖基转化毛蕊花糖苷得到松果菊苷是可行和有效的。

有益效果：本发明方法充分利用廉价、分布更广泛的植物原料，使用生物转化的方法，得到更高价值的松果菊苷等产物，提高这些植物资源的利用价值，将成本低廉的植物中所含毛蕊花糖苷等用转化的方式得到肉苁蓉中特有的松果菊苷或其他稀有糖苷，有助于减少采挖肉苁蓉对生态的破坏和缓解肉苁蓉资源减少的现状，具有重要的生态价值和经济价值。与化学合成方法相比，生物转化法具有具有步骤少、工艺简单、操作方便、环境友好和能耗低等优点，大幅度降低生产成本，有利于环境保护，转化过程中未反应的糖基供体(淀粉或糊精)可以回收。

附图说明

图1为Van BOOM课题组对毛蕊花糖苷的全合成路径；

图2为苯乙醇苷提取液转化前的HPLC分析图；

图3为苯乙醇苷提取液经CGT酶生物转化后的HPLC分析图。

具体实施方式

一种将含毛蕊花糖苷等的植物成分经生物转化为松果菊苷的方法，

步骤1：将含毛蕊花糖苷等苯乙醇苷的植物进行除杂清洗，粉碎，用60-100℃热水或含甲醇、乙醇1-100％的溶剂浸提，以物料：溶剂固液比为1∶20至1∶100，固液分离后得到浸提液，经常规分离提取得到含总苯乙醇苷的提取液。

步骤2：将步骤1得到的总苯乙醇苷提取液，加入作为糖基供体的淀粉或糊精混匀，加入CGT酶液或含CGT酶的菌液，在30-90℃和pH 3-9条件下转化1-24h。

步骤3：将步骤2的反应液，加入2-4倍体积比的乙醇，淀粉或糊精不溶于乙醇而沉淀，苯乙醇苷类物质在乙醇中溶解度大不会析出，过滤得含苯乙醇苷类物质的醇溶液。

步骤4：将步骤3得到醇溶液通过蒸发乙醇，浓缩苯乙醇苷类物质的浓度，回收乙醇，浓缩液经常规分离步骤得到松果菊苷。

采用上述技术方案，具有成本低廉，节约资源，工艺简单，污染小等优点，易通过廉价植物的提取物通过转化得到原本提取自珍贵药材的高价值产物。

实施例1

取紫花列当进行除杂清洗，经常规提取方法得到列当浸提液，在含100Kg毛蕊花糖苷的原料中加入糖基供体淀粉60KG和CGT酶液，在60度，加酶量0.5％CGT糖基转移酶的条件下转化6小时，料液中毛蕊花糖苷转化至松果菊苷的转化率达92％，经分离剩余淀粉，可得到富含松果菊苷的产品。

实施例2

取黄花列当进行除杂清洗，经常规提取方法得到列当浸提液，在含100Kg毛蕊花糖苷的原料中加入糖基供体糊精70KG和CGT酶液，在90度，加酶量0.8％CGT糖基转移酶的条件下转化12小时，料液中毛蕊花糖苷转化至松果菊苷的转化率达98％，经分离剩余糊精，可得到富含松果菊苷的产品。

实施例3

取向日葵列当进行除杂清洗，经常规提取方法得到列当浸提液，在含100Kg毛蕊花糖苷的原料中加入糖基供体糊精90KG和CGT酶液，在60度，加酶量0.9％CGT糖基转移酶的条件下转化10小时，料液中毛蕊花糖苷转化至松果菊苷的转化率达91％，经分离剩余糊精，可得到富含松果菊苷的产品。

实施例4

取分枝列当进行除杂清洗，经常规提取方法得到列当浸提液，在含100Kg毛蕊花糖苷的原料中加入糖基供体淀粉55KG和CGT酶液，在45度，加酶量0.6％CGT糖基转移酶的条件下转化10小时，料液中毛蕊花糖苷转化至松果菊苷的转化率达87％，经分离剩余淀粉，可得到富含松果菊苷的产品。

实施例5

取植物紫珠进行除杂清洗，经常规提取方法得到浸提液，在含100Kg毛蕊花糖苷的原料中加入糖基供体糊精80KG和CGT酶液，在80度，加酶量0.8％CGT糖基转移酶的条件下转化8小时，料液中毛蕊花糖苷转化至松果菊苷的转化率达92％，经分离剩余糊精，可得到富含松果菊苷的产品。

实施例6

取含100Kg毛蕊花糖苷的紫株提取物原料，配成5％含量的溶液，加入糖基供体糊精70KG和CGT酶液，在90度，加酶量0.8％CGT糖基转移酶的条件下转化12小时，料液中毛蕊花糖苷转化至松果菊苷的转化率达98％，经分离剩余糊精，可得到富含松果菊苷的产品。

实施例7

取含100Kg毛蕊花糖苷的紫花列当提取物，配成6％含量的溶液，加入糖基供体糊精80KG和CGT酶液，在90度，加酶量0.8％CGT糖基转移酶的条件下转化11小时，料液中毛蕊花糖苷转化至松果菊苷的转化率达90％，经分离剩余糊精，可得到富含松果菊苷的产品。

实施例8

取含100Kg毛蕊花糖苷的黄花列当提取物，配成6％含量的溶液，加入糖基供体糊精80KG和CGT酶液，在90度，加酶量0.8％CGT糖基转移酶的条件下转化11小时，料液中毛蕊花糖苷转化至松果菊苷的转化率达90％，经分离剩余糊精，可得到富含松果菊苷的产品。

实施例9

取含100Kg毛蕊花糖苷的列当提取物，配成6％含量的溶液，加入糖基供体糊精80KG和0.4％CGT酶液，在90度件下转化10小时，料液中毛蕊花糖苷转化至松果菊苷的转化率达93％，经分离剩余糊精，可得到富含松果菊苷的产品。

实施例10

取含100Kg毛蕊花糖苷的锯齿列当提取物，配成6％含量的溶液，加入糖基供体糊精80KG和0.2％CGT酶粉，在90度，加含CGT糖基转移酶的物料在常规酶转化条件下8小时，料液中毛蕊花糖苷转化至松果菊苷的转化率83％，经分离剩余糊精，可得到富含松果菊苷的产品。

实施例11

取含100Kg总苯乙醇苷的列当提取物，配成8％含量的溶液，加入糖基供体糊精80KG和0.5％CGT酶液，在75度条件下转化9小时，料液中毛蕊花糖苷转化至松果菊苷的转化率达90％，经分离剩余糊精，可得到富含松果菊苷的产品。

实施例12

取含100Kg毛蕊花糖苷的列当提取物，配成6％含量的溶液，加入糖基供体环糊精80KG和含CGT酶的菌粉(0.2％)，在89度，加含CGT糖基转移酶的菌液在常规酶转化条件下转化10小时，料液中毛蕊花糖苷转化至松果菊苷的转化率8达93％，经分离剩余的环糊精，可得到富含松果菊苷的产品。

Claims (3)

1.一种植物中苯乙醇苷成分生物转化的方法，其特征在于：含总苯乙醇苷的植物提取液或提取物中加入糖基供体和糖基转移酶，经生物转化获得转化产物；

所述含总苯乙醇苷的植物中含毛蕊花糖苷；所述糖基供体为糊精或淀粉；

所述糖基转移酶为CGT酶液或含CGT酶的菌液；

所述转化产物为松果菊苷；

包括以下步骤：

步骤1：将含毛蕊花糖苷的植物进行除杂清洗，粉碎，用60-100℃热水或含甲醇、乙醇1-100％的溶剂浸提，以物料：溶剂固液比为1：20至1：100，固液分离后得到浸提液，经常规分离提取得到含毛蕊花糖苷的提取液；

步骤2：将步骤1得到的毛蕊花糖苷提取液，加入作为糖基供体的淀粉或糊精混匀，加入CGT酶液或含CGT酶的菌液，在30-90℃和pH 3-9条件下转化1-24h；

步骤3：将步骤2的反应液，加入2-4倍体积比的乙醇，淀粉或糊精不溶于乙醇而沉淀，毛蕊花糖苷在乙醇中溶解度大不会析出，过滤得含毛蕊花糖苷的醇溶液；

步骤4：将步骤3得到醇溶液通过蒸发乙醇，浓缩毛蕊花糖苷的浓度，回收乙醇，浓缩液经常规分离步骤得到松果菊苷。

2.根据权利要求1所述的植物中苯乙醇苷成分生物转化的方法，其特征在于：含总苯乙醇苷的植物提取液或提取物采用含苯乙醇苷的植物提取获得；所述含有苯乙醇苷的植物包括含有苯乙醇苷的列当科植物。

3.根据权利要求2所述的植物中苯乙醇苷成分生物转化的方法，其特征在于：所述含有苯乙醇苷的植物包括紫花列当、瓜列当、黄花列当、向日葵列当、分枝列当、锯齿列当和马鞭草科。

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