JP2009046414A - プレニルフラボノイド、その製造方法、抗癌剤及び抗菌剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】抗癌作用及び抗菌作用等を発揮して医薬品として有用な新規プレニルフラボノイド及びその製造方法の提供。
【解決手段】下記一般式（１）に示されるプレニルフラボノイド。
式中、Ｒ1 〜Ｒ9 は水素、水酸基又はメトキシ基を示す。例えば、一般式（１）のプレニルフラボノイドは、原料としてガランギン、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸、及びナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を配合することにより製造される。
【選択図】なし
【解決手段】下記一般式（１）に示されるプレニルフラボノイド。
式中、Ｒ1 〜Ｒ9 は水素、水酸基又はメトキシ基を示す。例えば、一般式（１）のプレニルフラボノイドは、原料としてガランギン、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸、及びナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を配合することにより製造される。
【選択図】なし
Description
本発明は、新規なプレニルフラボノイド及びその製造方法に係り、さらにプレニルフラボノイドを有効成分として含有する抗癌剤及び抗菌剤に関する。
一般に、炭素数５のイソプレン単位から構成されるプレニル基を芳香族化合物に転移する酵素として多種類のプレニル基転移酵素（プレニルトランスフェラーゼ）が知られている。微生物の生体内で芳香族化合物を原料にプレニル基を付加する反応によって、ヒトに対して有用な様々な生理活性物質が生合成されることが知られる。例えば、抗酸化物質のナフテルピン、抗腫瘍活性を示すフラノキシン、その他多数のポリフェノール等が産生されている。抗酸化物質のナフテルピンは、放線菌、例えば、ストリプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＣＬ１９０株から生合成されることが知られている。ナフテルピンは、マロニル−ＣｏＡを出発原料として、中間代謝物のテトラヒドロキシナフタレン（ＴＨＮ）、若しくはフラビオリン又はその代謝物に、炭素数１０のゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）由来のゲラニル基が付加して合成される（非特許文献１，２参照）。ゲラニル基を付加してナフテルピンを合成する酵素として、プレニル基転移酵素（ゲラニル基転移酵素）が、同定され、アミノ酸配列及び立体構造等が解明されている（非特許文献１，２参照）。ナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を用いて、芳香族化合物を原料にプレニル基を付加し、ヒトに対して有用な様々な生理活性物質が創製されることが期待されている。
特開２００４−１５９５６３号公報
Kuzuyama T, et al: Nature (2005) 435: 983-987
葛山智久：細胞工学 (2005) 24: 830-831
ところで、プロポリスは、巣の防御及び補強等を目的として、ミツバチが種々の植物の滲出液、新芽、及び樹脂等から集めてきた膠状ないしは蝋状の物質である。このプロポリスは、抗菌効果や抗炎症効果を有していることが古くから知られている。また、プロポリスの主要な生理活性として、抗酸化作用及び免疫賦活作用が知られている。
プロポリス中に含まれる有効成分としては、極性の高い有機酸、フラボノイド類等のポリフェノール類、極性の低いテルペノイド類、その他各種のミネラル、ビタミン等の多種多様な有用成分を含有している。これら多様な種類の有効成分の生理活性が複雑に作用しあって、プロポリスの優れた生理活性を形成しているものと考えられる。例えば、フラボノイド類により抗酸化作用等を発揮することが知られている（特許文献１参照）。プロポリス中に含まれるフラボノイド類としては、例えば、クリシン、アピゲニン等のフラボン類、ガランギン、ケンペロール等のフラボノール類、サクラネチン、イソサクラネチン等のフラバノン類等が知られている。
本発明は、本発明者らの鋭意研究の結果、プロポリス中に含まれる特定のフラボノイド類にナフテルピンの生合成酵素であるプレニル基転移酵素を作用させることにより、従来知られていない新規なプレニルフラボノイドを得たことに基づくものである。また、該プレニルフラボノイドが高い抗癌作用及び抗菌作用を有することを見出したことに基づくものである。
本発明の目的とするところは、医薬品等の様々な用途に利用することが可能な新規プレニルフラボノイド及びその製造方法を提供することにある。別の目的とするところは、高い抗癌作用を発揮する抗癌剤及び高い抗菌作用を発揮する抗菌剤を提供することにある。
上記の目的を達成するために請求項１に記載の発明のプレニルフラボノイドは、下記一般式（１）に示される構造を有する。
（式中、Ｒ1 〜Ｒ9 は、それぞれ水素、水酸基又はメトキシ基を示す。）
請求項２に記載の発明のプレニルフラボノイドは、下記一般式（２）に示される構造を有する。
請求項２に記載の発明のプレニルフラボノイドは、下記一般式（２）に示される構造を有する。
（式中、Ｒ1 〜Ｒ9 は、それぞれ水素、水酸基又はメトキシ基を示す。）
請求項３に記載の発明のプレニルフラボノイドは、下記一般式（３）に示される構造を有する。
請求項３に記載の発明のプレニルフラボノイドは、下記一般式（３）に示される構造を有する。
（式中、Ｒ1 〜Ｒ8 は、それぞれ水素、水酸基又はメトキシ基を示す。）
請求項４に記載の発明のプレニルフラボノイドは、下記一般式（４）に示される構造を有する。
請求項４に記載の発明のプレニルフラボノイドは、下記一般式（４）に示される構造を有する。
（式中、Ｒ1 〜Ｒ8 は、それぞれ水素、水酸基又はメトキシ基を示す。）
請求項５に記載の発明のプレニルフラボノイドは、下記一般式（５）に示される構造を有する。
請求項５に記載の発明のプレニルフラボノイドは、下記一般式（５）に示される構造を有する。
請求項６に記載の発明のプレニルフラボノイドは、下記一般式（６）に示される構造を有する。
請求項７に記載の発明のプレニルフラボノイドは、下記一般式（７）に示される構造を有する。
請求項８に記載の発明は、請求項５に記載のプレニルフラボノイドの製造方法において、原料としてガランギン、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸、及びナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を配合する工程を備えることを特徴とする。
請求項９に記載の発明は、請求項６又は請求項７に記載のプレニルフラボノイドの製造方法において、原料としてイソサクラネチン、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸、及びナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を配合する工程を備えることを特徴とする。
請求項１０に記載の発明は、請求項１から請求項７のいずれか一項に記載のプレニルフラボノイドの製造方法において、原料としてプロポリス、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸、及びナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を配合する工程を備えることを特徴とする。
請求項１１に記載の発明の抗癌剤は、請求項１から請求項７のいずれか一項に記載のプレニルフラボノイドを有効成分として含有することを特徴とする。
請求項１２に記載の発明の抗菌剤は、請求項１から請求項７のいずれか一項に記載のプレニルフラボノイドを有効成分として含有することを特徴とする。
請求項１２に記載の発明の抗菌剤は、請求項１から請求項７のいずれか一項に記載のプレニルフラボノイドを有効成分として含有することを特徴とする。
本発明によれば、医薬品等の様々な用途に利用することが可能な新規プレニルフラボノイドを提供することができる。また、高い抗癌作用を発揮する抗癌剤及び高い抗菌作用を発揮する抗菌剤を提供することができる。
以下、本発明のプレニルフラボノイドを具体化した実施形態について詳細に説明する。
本実施形態の第１のプレニルフラボノイドは、下記一般式（１）で示される構造を有する化合物である。
本実施形態の第１のプレニルフラボノイドは、下記一般式（１）で示される構造を有する化合物である。
（式中、Ｒ1 〜Ｒ9 は、それぞれ水素、水酸基又はメトキシ基を示す。）
一般式（１）は、フラボノイドの一種であるフラボン及びフラボノール、又はそれらの誘導体の６位にゲラニル基を備えている化合物である。フラボンとしては、例えばクリシンが挙げられる。フラボノールとしては、例えばガランギン（galangin:３，５，７−トリヒドロキシフラボン）、ケンペロール（kaempferol）、ケンペライド（kaempferide）が挙げられる。一般式（１）で示される化合物は、フラボノイドの６位にゲラニル基を備えていることからフラボノイドよりも親油性（膜透過性）が高い。一般式（１）で示される化合物は、高い抗癌作用及び高い抗菌作用を有している。
一般式（１）は、フラボノイドの一種であるフラボン及びフラボノール、又はそれらの誘導体の６位にゲラニル基を備えている化合物である。フラボンとしては、例えばクリシンが挙げられる。フラボノールとしては、例えばガランギン（galangin:３，５，７−トリヒドロキシフラボン）、ケンペロール（kaempferol）、ケンペライド（kaempferide）が挙げられる。一般式（１）で示される化合物は、フラボノイドの６位にゲラニル基を備えていることからフラボノイドよりも親油性（膜透過性）が高い。一般式（１）で示される化合物は、高い抗癌作用及び高い抗菌作用を有している。
一般式（１）で表わされる化合物のうち好ましいものとして、下記一般式（５）で示される化合物が挙げられる。
前記一般式（５）に示されるフラボノイド化合物は、６−ゲラニルガランギン（6-geranylgalangin、分子量４０６）である。ガランギン（galangin:３，５，７−トリヒドロキシフラボン（3,5,7-trihydroxyflavone）、分子量２７０．２４）の６位にゲラニル基を備えていることからガランギンよりも親油性（膜透過性）が高い。６−ゲラニルガランギンは、高い抗癌作用及び高い抗菌作用を有している。
本実施形態の第２のプレニルフラボノイドは、下記一般式（２）で示される構造を有する化合物である。
本実施形態の第２のプレニルフラボノイドは、下記一般式（２）で示される構造を有する化合物である。
（式中、Ｒ1 〜Ｒ9 は、それぞれ水素、水酸基又はメトキシ基を示す。）
一般式（２）は、フラボノイドの一種であるフラボン及びフラボノール、又はそれらの誘導体にゲラニル基を備えている化合物である。フラボンとしては、例えばクリシンが挙げられる。フラボノールとしては、例えばガランギン（galangin:３，５，７−トリヒドロキシフラボン）、ケンペロール（kaempferol）、ケンペライド（kaempferide）、６−メトキシケンペロール（6-methoxykaempferol）、ベツレトール（betuletol）が挙げられる。一般式（２）で示される化合物は、フラボノイドにゲラニル基を備えていることからフラボノイドよりも親油性（膜透過性）が高い。一般式（２）で示される化合物は、高い抗癌作用及び高い抗菌作用を有している。
本実施形態の第３のプレニルフラボノイドは、下記一般式（３）に示される構造を有する。
一般式（２）は、フラボノイドの一種であるフラボン及びフラボノール、又はそれらの誘導体にゲラニル基を備えている化合物である。フラボンとしては、例えばクリシンが挙げられる。フラボノールとしては、例えばガランギン（galangin:３，５，７−トリヒドロキシフラボン）、ケンペロール（kaempferol）、ケンペライド（kaempferide）、６−メトキシケンペロール（6-methoxykaempferol）、ベツレトール（betuletol）が挙げられる。一般式（２）で示される化合物は、フラボノイドにゲラニル基を備えていることからフラボノイドよりも親油性（膜透過性）が高い。一般式（２）で示される化合物は、高い抗癌作用及び高い抗菌作用を有している。
本実施形態の第３のプレニルフラボノイドは、下記一般式（３）に示される構造を有する。
（式中、Ｒ1 〜Ｒ8 は、それぞれ水素、水酸基又はメトキシ基を示す。）
一般式（３）は、フラボノイドの一種であるフラバノン及びジヒドロフラボノール、又はそれらの誘導体の６位にゲラニル基を備えている化合物である。フラバノンとしては、例えばピノセンブリン（pinocembrin）、サクラネチン（sakuranetin）、イソサクラネチン（isosakuranetin:５，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシフラバノン）が挙げられる。ジヒドロフラボノールとしては、例えばピノバンクシン（pinobanksin）、アロマデンドリン（aromadendrin）、ジヒドロケンペライド（dihydrokaempferide）が挙げられる。一般式（３）で示される化合物は、フラボノイドの６位にゲラニル基を備えていることからフラボノイドよりも親油性（膜透過性）が高い。一般式（３）で示される化合物は、高い抗癌作用及び高い抗菌作用を有している。
一般式（３）は、フラボノイドの一種であるフラバノン及びジヒドロフラボノール、又はそれらの誘導体の６位にゲラニル基を備えている化合物である。フラバノンとしては、例えばピノセンブリン（pinocembrin）、サクラネチン（sakuranetin）、イソサクラネチン（isosakuranetin:５，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシフラバノン）が挙げられる。ジヒドロフラボノールとしては、例えばピノバンクシン（pinobanksin）、アロマデンドリン（aromadendrin）、ジヒドロケンペライド（dihydrokaempferide）が挙げられる。一般式（３）で示される化合物は、フラボノイドの６位にゲラニル基を備えていることからフラボノイドよりも親油性（膜透過性）が高い。一般式（３）で示される化合物は、高い抗癌作用及び高い抗菌作用を有している。
一般式（３）に示される化合物のうち好ましいものとして、下記一般式（６）で示される化合物が挙げられる。
前記一般式（６）に示されるフラボノイド化合物は、６−ゲラニルイソサクラネチン（6-geranylisosakuranetin、分子量４２２）である。イソサクラネチン（isosakuranetin:５，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシフラバノン（5,7-dihydroxy-4’-methoxyflavanone）、分子量２８６．２９）の６位にゲラニル基を備えていることからイソサクラネチンよりも親油性（膜透過性）が高い。６−ゲラニルイソサクラネチンは、高い抗癌作用及び高い抗菌作用を有している。
本実施形態の第４のプレニルフラボノイドは、下記一般式（４）で示される構造を有する化合物である。
本実施形態の第４のプレニルフラボノイドは、下記一般式（４）で示される構造を有する化合物である。
（式中、Ｒ1 〜Ｒ8 は、それぞれ水素、水酸基又はメトキシ基を示す。）
一般式（４）は、フラボノイドの一種であるフラバノン及びジヒドロフラボノール、又はそれらの誘導体にゲラニル基を備えている化合物である。一般式（４）で示される化合物は、フラボノイドにゲラニル基を備えていることからフラボノイドよりも親油性（膜透過性）が高い。一般式（４）で示される化合物は、高い抗癌作用及び高い抗菌作用を有している。
一般式（４）は、フラボノイドの一種であるフラバノン及びジヒドロフラボノール、又はそれらの誘導体にゲラニル基を備えている化合物である。一般式（４）で示される化合物は、フラボノイドにゲラニル基を備えていることからフラボノイドよりも親油性（膜透過性）が高い。一般式（４）で示される化合物は、高い抗癌作用及び高い抗菌作用を有している。
一般式（４）に示される化合物のうち好ましいものとして、下記一般式（７）で示される化合物が挙げられる。
前記一般式（７）に示されるフラボノイド化合物は、７−O−ゲラニルイソサクラネチン（7-O-geranylisosakuranetin、分子量４２２）である。イソサクラネチンにゲラニル基が付加されていることからイソサクラネチンよりも親油性（膜透過性）が高い。７−O−ゲラニルイソサクラネチンは、高い抗癌作用及び高い抗菌作用を有している。
上記第１〜第４のプレニルフラボノイドは、フラボノイド類を含有する原料として天然素材、例えばプロポリス中に、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸（geranyl diphosphate）及びプレニル基転移酵素（ゲラニル基転移酵素）を配合することにより合成することができる。また、公知の化学合成法を用いて合成してもよい。
上記第１〜第４のプレニルフラボノイドは、フラボノイド類を含有する原料として天然素材、例えばプロポリス中に、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸（geranyl diphosphate）及びプレニル基転移酵素（ゲラニル基転移酵素）を配合することにより合成することができる。また、公知の化学合成法を用いて合成してもよい。
第１のプレニルフラボノイドの一つである６−ゲラニルガランギンは、例えば、原料としてガランギン、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸及び反応酵素としてナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素（ゲラニル基転移酵素）を配合し、所定条件下で反応させることにより合成することができる。その他、公知の化学合成法を用いて合成してもよい。
原料であるガランギンとしては、生合成品、化学合成品、天然素材から水・親水性有機溶媒を用いて抽出された粗抽出品又は精製品を使用してもよく、ガランギンを含有する天然素材を適用してもよい。ガランギンは、例えばプロポリスに多く含有されている。その他、ガランカ（Alpinia officinarum）の根茎等に多く含有されている。それらをガランギンが含有される素材として好ましく使用することができる。ガランギンの抽出物を得るために用いられるプロポリス原塊としては、ブラジルを含む南アメリカ諸国、中国や日本等のアジア諸国、ヨーロッパ諸国、北アメリカ諸国、オセアニア諸国等のあらゆる産地のものを使用することができる。
プロポリス原塊からのガランギンの抽出方法は、公知の抽出法、例えば親水性有機溶媒又は水／親水性有機溶媒の混合溶媒を用いた抽出法、超臨界抽出法が用いられる。これらの中でガランギンを含むフラボノイド類を効率よく抽出することができる水／親水性有機溶媒の混合液が好ましく適用される。本実施形態において用いられる親水性有機溶媒としては、水に溶解する性質を有するエタノール、メタノール、イソプロパノール等の低級アルコールのほか、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類を適宜選択して使用することができる。これらの親水性有機溶媒を単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの中でも、摂取することを考えればエタノールが最も好ましい。
例えば、水／親水性有機溶媒の混合液においてエタノールを用いる場合、その濃度は、好ましくは６０〜１００容量％、より好ましくは７０〜１００容量％、最も好ましくは９５容量％である。エタノール濃度が６０容量％未満の場合には、有効成分の抽出率が悪いので好ましくない。一方、エタノールの配合割合を高めることによりフラボノイド類の抽出効率を高めることができる。エタノール溶媒の使用容量は、プロポリス原塊の質量に対して好ましくは１〜２０倍量、より好ましくは２〜１０倍量、さらに好ましくは３〜８倍量である。エタノール溶媒の使用容量が１倍量未満の場合には、目的成分の抽出率が悪いので好ましくない。逆にエタノール溶媒の使用容量が２０倍量を超える場合には、不必要に大きな装置が必要となるばかりでなく、濃縮等の工程に時間を要し、作業性が著しく低下するので好ましくない。
また、前記親水性有機溶媒としてエタノールを用いて抽出する場合、目的成分の抽出効率を向上させるために、抽出処理前に採取時に混入するゴミ等の夾雑物を除去し、粉砕することが好ましい。抽出温度は５〜４０℃であることが好ましい。抽出温度が５℃未満の場合には、目的成分の抽出率が悪いので好ましくない。逆に抽出温度が４０℃を超える場合には、ロウ成分が抽出されて、抽出後の濾過性が悪くなるおそれがある。また、抽出溶媒（エタノール）が蒸発するため好ましくない。なお、抽出操作は、前記抽出温度で攪拌しながら例えば４時間以上行なえばよい。そして、上記の抽出条件で目的成分を十分に抽出した後、濾紙濾過、珪藻土濾過などの濾過処理を行なうことによりガランギンを含有する粗抽出物を得ることができる。
本実施形態においては、ガランギンを含有する粗抽出物を原料として使用してもよく、さらにカラムクロマトグラフィー、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び薄層クロマトグラフィー等を用いて、分離及び精製したものを使用してもよい。クロマトグラフィー担体としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーが挙げられる。それらを適宜組み合わせて、公知の分離手段により精製することができる。
反応酵素として使用されるナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素（ゲラニル基転移酵素）は、放線菌、例えば、ストリプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＣＬ１９０株のナフテルピンの生合成酵素のうちの一つである。ナフテルピンは、マロニル−ＣｏＡを出発原料として、中間代謝物のテトラヒドロキシナフタレン（ＴＨＮ）、若しくはフラビオリン又はその代謝物に、炭素数１０のゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）由来のゲラニル基が付加して合成される（上記非特許文献１，２参照）。プレニル基転移酵素は、炭素数１０のプレニル基供与体としてゲラニル二リン酸を基質としてナフテルピンを合成する反応を触媒する酵素である。プレニル基転移酵素は、アミノ酸配列、該アミノ酸配列をコードする塩基配列及びタンパク質の立体構造等が解明されている（上記非特許文献１，２参照）。
プレニル基転移酵素は、市販品を使用してもよく、放線菌、例えば、ストリプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＣＬ１９０株の菌体、該放線菌の培養上清から公知の方法を用いて粗抽出又は精製したものを使用してもよい。また、プレニル基転移酵素をコードするＤＮＡより公知の方法、例えば、プラスミド等の発現ベクターを大腸菌、酵母等の微生物に導入することにより発現させるインビトロ（in vitro）タンパク合成系を利用することにより取得してもよい。プレニル基転移酵素をコードするＤＮＡは、公知の塩基配列より公知の人工遺伝子合成法を用いて合成してもよく、放線菌、例えば、ストリプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＣＬ１９０株より公知の方法を用いてクローニングしてもよい。
上記プレニル基転移酵素を用いた原料のプレニル化処理は、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸を配合し、所定条件下で反応させることにより合成することができる。また、その他の成分として、Ｍｇ２＋を反応溶液中に配合したほうが良い。Ｍｇ２＋の配合量は、例えばＭｇＣｌ２として好ましくは１〜１０ｍＭ、より好ましくは３〜７ｍＭである。反応ｐＨは、適宜設定され得るが、好ましくはｐＨ４〜９、より好ましくはｐＨ７〜８である。反応温度は、適宜設定され得るが、好ましくは１０〜４５℃、より好ましくは２５〜３５℃である。反応温度が１０℃未満の場合、酵素活性が低く反応が遅くなり、逆に４５℃を超える場合、酵素が失活するおそれがある。反応時間は、上記反応ｐＨ及び反応温度により適宜設定され得るが、好ましくは１〜４８時間、より好ましくは６〜１５時間である。反応時間が１時間未満の場合、十分な量の反応生成物が得られないので好ましくない。逆に反応時間が４８時間を超える場合、それ以上の反応生成物が得られず、効率が悪い。得られた反応生成物である６−ゲラニルガランギンは、上記クロマトグラフィーを適用することにより精製することができる。
第３のプレニルフラボノイドの一つである６−ゲラニルイソサクラネチン及び第４のプレニルフラボノイドの一つである７−O−ゲラニルイソサクラネチンは、例えば、原料としてイソサクラネチン、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸及び反応酵素としてプレニル基転移酵素（ゲラニル基転移酵素）を配合することにより、合成することができる。プレニル基転移酵素は、上記６−ゲラニルガランギンと同様のナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を適用することができる。酵素の反応条件も上記６−ゲラニルガランギンと同様の条件を適用することができる。その他、６−ゲラニルイソサクラネチン及び７−O−ゲラニルイソサクラネチンは、公知の化学合成法を用いて合成してもよい。
原料であるイソサクラネチンとしては、生合成品、化学合成品、天然素材から水・親水性有機溶媒を用いて抽出された粗抽出品又は精製品を使用してもよく、イソサクラネチンを含有する天然素材を適用してもよい。イソサクラネチンは、例えばプロポリスに多く含有されている。その他、カラタチ（枳殻）の花弁中にフラバノン配糖体の形で多く含まれている。それらをイソサクラネチンが含有される素材として好ましく使用することができる。尚、フラバノン配糖体はβ−グルコシダーゼによりグリコシド結合が加水分解されてフラバノンと還元糖を遊離する。プロポリス原塊からのイソサクラネチンの抽出方法は、上記の方法を適宜採用することができる。
原料としてイソサクラネチン、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸及び反応酵素としてナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を配合することにより、６−ゲラニルイソサクラネチン及び７−O−ゲラニルイソサクラネチンの２つの反応生成物が生成される。２つの反応生成物は、公知のカラムクロマトグラフィー、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び薄層クロマトグラフィー等を用いて、分離及び精製することができる。
上記第１〜第４のプレニルフラボノイドは抗癌活性を有する。そのため、それらを有効成分として含有する抗癌剤として好ましく適用することができる。抗癌剤は、抗癌作用を効果・効能とする医薬品、医薬部外品、飲食品、化粧品等の形態で摂取され得る。
上記第１〜第４のプレニルフラボノイドは、抗菌活性を有する。そのため、それを有効成分として含有する抗菌剤として適用することができる。この抗菌剤は、飲食品の腐敗を防止するために該飲食品中に添加して利用してもよい。また、この抗菌剤は、医薬品中に含有させて利用してもよく、或いは感染症治療薬や抗菌性化学療法薬等の医薬品として利用してもよい。また、この抗菌剤は、皮膚、口腔、腋下等を清潔に保つために、化粧品又は医薬部外品中に添加して利用してもよい。
本実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
（１）本実施形態において、上記第１〜第４のプレニルフラボノイドは、高い抗癌作用を有している。したがって、抗癌作用を目的とした医薬品等に好ましく適用することができる。
（１）本実施形態において、上記第１〜第４のプレニルフラボノイドは、高い抗癌作用を有している。したがって、抗癌作用を目的とした医薬品等に好ましく適用することができる。
（２）本実施形態において、上記第１〜第４のプレニルフラボノイドは、高い抗菌作用を有している。したがって、抗菌作用を目的とした医薬品等に好ましく適用することができる。
（３）本実施形態において、６−ゲラニルガランギンは、原料としてガランギン、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸、及びナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を配合することにより製造される。したがって、安価に且つ容易に製造することができる。
（４）本実施形態において、６−ゲラニルイソサクラネチン及び７−O−ゲラニルイソサクラネチンは、原料としてイソサクラネチン、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸、及びナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を配合することにより製造される。したがって、安価に且つ容易に製造することができる。
（５）本実施形態において、上記第１〜第４のプレニルフラボノイドを製造するための原料としてプロポリスを使用することができる。したがって、プロポリスは、例えばガランギン及びイソサクラネチン等の他、ゲラニル基が付加されるフラボノイド類を多数含有するため、容易に製造することができる。
なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。
・上記実施形態では、合成酵素としてナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を原料に配合することにより新規プレニルフラボノイドを製造した。しかしながら、ナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を使用する代わりに、ナフテルピンを生合成する放線菌、例えば、ストリプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＣＬ１９０株を使用して、発酵処理により新規プレニルフラボノイドを製造してもよい。放線菌を用いた原料のフラボノイド類のプレニル化処理は、放線菌の培養に適した培地、培養温度、培養期間等の処理条件を適宜選択すればよい。
・上記実施形態では、合成酵素としてナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を原料に配合することにより新規プレニルフラボノイドを製造した。しかしながら、ナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を使用する代わりに、ナフテルピンを生合成する放線菌、例えば、ストリプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＣＬ１９０株を使用して、発酵処理により新規プレニルフラボノイドを製造してもよい。放線菌を用いた原料のフラボノイド類のプレニル化処理は、放線菌の培養に適した培地、培養温度、培養期間等の処理条件を適宜選択すればよい。
・上記実施形態において、フラボノイド類を含有する原料として天然素材、例えばプロポリス中に、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸及び合成酵素を配合して、上記一般式（１）〜（７）のプレニルフラボノイドを得た場合、酵素変換後の天然素材をそのまま医薬品、食品等として使用してもよい。また、酵素変換後の天然素材からカラムクロマトグラフィー等を用いて、新規プレニルフラボノイドを抽出及び精製処理して使用してもよい。
次に、実施例及び比較例を挙げて前記実施形態を更に具体的に説明する。
＜新規プレニルフラボノイドの製造＞
（実施例１：６−ゲラニルガランギンの製造１）
原料としてガランギン（ＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ社製）１０ｍｇをメタノール２０ｍｌに溶解させた後、蒸留水を２２０ｍｌ加えた。該水溶液に０．５Ｍ ２−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル]エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．９）及び０．０５Ｍ塩化マグネシウムを各４０ｍｌ加えた。その後、プレニル基供与体として０．６ｍｇ／ｍｌゲラニル二リン酸アンモニウム（シグマ社製）、ナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素（ＮｐｈＢ）溶液（０．８ｍｇ／ｍｌ）を各４０ｍｌ加え、３０℃で１２時間、９０ｒｐｍで回転振とうしながら反応させた。その後、反応溶液について酢酸エチルを用いた分配を行い、酢酸エチル層を得た。酢酸エチル層を濃縮し、ＯＤＳカラム（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＨＧ−５、２０ｍｍ×２５０ｍｍ、野村化学株式会社製）にアプライし、流速６ｍｌ／ｍｉｎ、溶出溶媒９５％メタノールで溶出させた。２７０ｎｍの吸収をモニターしながら、ガランギンとは異なる主要なピーク（ピーク１、リテンションタイム１７．５〜１８．５分、収量４．４ｍｇ）を分取した。
＜新規プレニルフラボノイドの製造＞
（実施例１：６−ゲラニルガランギンの製造１）
原料としてガランギン（ＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ社製）１０ｍｇをメタノール２０ｍｌに溶解させた後、蒸留水を２２０ｍｌ加えた。該水溶液に０．５Ｍ ２−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル]エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．９）及び０．０５Ｍ塩化マグネシウムを各４０ｍｌ加えた。その後、プレニル基供与体として０．６ｍｇ／ｍｌゲラニル二リン酸アンモニウム（シグマ社製）、ナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素（ＮｐｈＢ）溶液（０．８ｍｇ／ｍｌ）を各４０ｍｌ加え、３０℃で１２時間、９０ｒｐｍで回転振とうしながら反応させた。その後、反応溶液について酢酸エチルを用いた分配を行い、酢酸エチル層を得た。酢酸エチル層を濃縮し、ＯＤＳカラム（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＨＧ−５、２０ｍｍ×２５０ｍｍ、野村化学株式会社製）にアプライし、流速６ｍｌ／ｍｉｎ、溶出溶媒９５％メタノールで溶出させた。２７０ｎｍの吸収をモニターしながら、ガランギンとは異なる主要なピーク（ピーク１、リテンションタイム１７．５〜１８．５分、収量４．４ｍｇ）を分取した。
次いで、前記ピーク１について、1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲを測定することにより構造解析を行なった。核磁気共鳴スペクトル1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲ（MERCURY plus 300NB, Varian社製）の測定結果を下記の表１に示す。なお、表１において、（Ｎｏ．）の欄の番号は図１に記載されている番号である。更に、構造決定のために、ＨＭＢＣスペクトル及びＨＭＱＣスペクトルなど様々な測定法を用い、その詳細な構造決定を行なった。詳細は以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲスペクトルをＨＭＱＣスペクトルと組み合わせて解析したところ、芳香族領域にガランギンの基本骨格の存在を示唆するシグナル（２〜１０，１ａ〜６ａ）が観測された。一方、脂肪族領域には、ゲラニル基の存在を示唆するメチルプロトン（８ｂ〜１０ｂ）、メチレンプロトン（１ｂ，４ｂ，５ｂ）、メチンプロトン（２ｂ，６ｂ）が観測された。これら部分構造と４級炭素の帰属はＨＭＢＣスペクトルの解析により行なった。詳細を以下に示す。
ＨＭＢＣスペクトルにより、上述のガランギン基本骨格の３個の芳香族炭素（Ｃ５，Ｃ６，Ｃ７）に対してゲラニル基のメチレンプロトン（１ｂ）からＨＭＢＣ相関が観測されたことから、Ｃ−１ｂはガランギン基本骨格上のＣ−６に結合していると考えられた。すなわち、ピーク１は、ガランギンにゲラニル基が炭素間結合した化合物、６−ゲラニルガランギンであると同定した。分子量は４０６、分子式はＣ2 5Ｈ26Ｏ5である。図１に６−ゲラニルガランギンの構造を示す。矢印でＨＭＢＣの特徴的相関も示した。以上、実施例１に示されるように、原料としてガランギン、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸、及びナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を配合することにより新規プレニルフラボノイドである６−ゲラニルガランギンが製造されることが確認された。
（実施例２：６−ゲラニルイソサクラネチン及び７−O−ゲラニルイソサクラネチンの製造１）
原料としてイソサクラネチン（ＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ社製）２４ｍｇをメタノール５０ｍｌに溶解させた後、蒸留水を５００ｍｌ加えた。該水溶液に０．５Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）及び０．０５Ｍ塩化マグネシウムを各１００ｍｌ加えた。その後、プレニル基供与体として０．６５ｍｇ／ｍｌゲラニル二リン酸アンモニウム（シグマ社製）を２００ｍｌ、ナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素（ＮｐｈＢ）溶液（７．２ｍｇ／ｍｌ）を５０ｍｌそれぞれ加え、３０℃で１２時間、９０ｒｐｍで回転振とうしながら反応させた。その後、反応溶液について酢酸エチルを用いた分配を行い、酢酸エチル層を得た。酢酸エチル層を濃縮し、ＯＤＳカラム（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＨＧ−５、２０ｍｍ × ２５０ｍｍ、野村化学株式会社製）にアプライし、流速８ｍｌ／ｍｉｎ、溶出溶媒９２．５％メタノールで溶出させた。２９０ｎｍの吸収をモニターしながら、イソサクラネチンとは異なる主要な２つのピーク（ピーク２、リテンションタイム１７．５〜１８．５分、収量４ｍｇ；ピーク３、リテンションタイム２６．５〜２８分、収量１０ｍｇ）を分取した。
原料としてイソサクラネチン（ＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ社製）２４ｍｇをメタノール５０ｍｌに溶解させた後、蒸留水を５００ｍｌ加えた。該水溶液に０．５Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）及び０．０５Ｍ塩化マグネシウムを各１００ｍｌ加えた。その後、プレニル基供与体として０．６５ｍｇ／ｍｌゲラニル二リン酸アンモニウム（シグマ社製）を２００ｍｌ、ナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素（ＮｐｈＢ）溶液（７．２ｍｇ／ｍｌ）を５０ｍｌそれぞれ加え、３０℃で１２時間、９０ｒｐｍで回転振とうしながら反応させた。その後、反応溶液について酢酸エチルを用いた分配を行い、酢酸エチル層を得た。酢酸エチル層を濃縮し、ＯＤＳカラム（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＨＧ−５、２０ｍｍ × ２５０ｍｍ、野村化学株式会社製）にアプライし、流速８ｍｌ／ｍｉｎ、溶出溶媒９２．５％メタノールで溶出させた。２９０ｎｍの吸収をモニターしながら、イソサクラネチンとは異なる主要な２つのピーク（ピーク２、リテンションタイム１７．５〜１８．５分、収量４ｍｇ；ピーク３、リテンションタイム２６．５〜２８分、収量１０ｍｇ）を分取した。
まず、前記ピーク２について、1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲを測定することにより構造解析を行なった。核磁気共鳴スペクトル1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲの測定結果を下記の表２に示す。なお、表２において、（Ｎｏ．）の欄の番号は図２に記載されている番号である。更に、構造決定のために、ＨＭＢＣスペクトル及びＨＭＱＣスペクトルなど様々な測定法を用い、その詳細な構造決定を行なった。詳細は以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲスペクトルをＨＭＱＣスペクトルと組み合わせて解析したところ、芳香族領域にイソサクラネチンの基本骨格の存在を示唆するシグナル（２〜１０，１ａ〜６ａ）が観測された。一方、脂肪族領域には、ゲラニル基の存在を示唆するメチルプロトン（８ｂ〜１０ｂ）、メチレンプロトン（１ｂ，４ｂ，５ｂ）、メチンプロトン（２ｂ，６ｂ）が観測された。これら部分構造と４級炭素の帰属はＨＭＢＣスペクトルの解析により行なった。詳細を以下に示す。
ＨＭＢＣスペクトルにより、上述のイソサクラネチン基本骨格の３個の芳香族炭素（Ｃ５，Ｃ６，Ｃ７）に対してゲラニル基のメチレンプロトン（１ｂ）からＨＭＢＣ相関が観測されたことから、Ｃ−１ｂはＣ−６に結合していると考えられた。すなわち、ピーク２は、イソサクラネチンにゲラニル基が炭素間結合した化合物、６−ゲラニルイソサクラネチンであると同定した。分子量は４２２、分子式はＣ26Ｈ30Ｏ5である。図２に６−ゲラニルイソサクラネチンの構造を示す。矢印でＨＭＢＣの特徴的相関も示した。尚、表２及び図２中における「Ｍｅ」はメチル基を示す（以下同じ）。
次いで、前記ピーク３について、1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲを測定することにより構造解析を行なった。核磁気共鳴スペクトル1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲの測定結果を下記の表３に示す。なお、表３において、（Ｎｏ．）の欄の番号は図３に記載されている番号である。更に、構造決定のために、ＨＭＢＣスペクトル及びＨＭＱＣスペクトルなど様々な測定法を用い、その詳細な構造決定を行なった。詳細は以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲスペクトルをＨＭＱＣスペクトルと組み合わせて解析したところ、芳香族領域にイソサクラネチンの基本骨格の存在を示唆するシグナル（２〜１０，１ａ〜６ａ）が観測された。一方、脂肪族領域には、ゲラニル基の存在を示唆するメチルプロトン（８ｂ〜１０ｂ）、メチレンプロトン（１ｂ，４ｂ，５ｂ）、メチンプロトン（２ｂ，６ｂ）が観測された。これら部分構造と４級炭素の帰属はＨＭＢＣスペクトルの解析により行なった。詳細を以下に示す。
ＨＭＢＣスペクトルにより、上述のイソサクラネチン基本骨格の芳香族炭素（Ｃ７）に対してゲラニル基のメチレンプロトン（１ｂ）からＨＭＢＣ相関が観測されたことから、Ｃ−１ｂは酸素原子を介してＣ−７に結合していると考えられた。すなわち、ピーク３は、７−O−ゲラニルイソサクラネチンであると同定した。分子量は４２２、分子式はＣ26Ｈ30Ｏ5である。図３に７−O−ゲラニルイソサクラネチンの構造を示す。矢印でＨＭＢＣの特徴的相関も示した。以上、実施例２に示されるように、原料としてイソサクラネチン、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸、及びナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を配合することにより新規プレニルフラボノイドである６−ゲラニルイソサクラネチン及び７−O−ゲラニルイソサクラネチンが製造されることが確認された。
（実施例３：６−ゲラニルガランギンの製造２）
原料として中国産プロポリスの原塊１００ｇに９５容量％エタノール４００ｍｌを加え、室温で一晩撹拌した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上清をロータリーエバポレーターを用いて溶媒留去した。このようにして得られた中国産プロポリス抽出物のうち１０ｍｇをメタノール１０ｍｌに溶解させ、このうち３μｌを蒸留水３０μｌに加えた。該水溶液に０．５Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）及び０．０５Ｍ塩化マグネシウムを各１０μｌ加えた。その後、プレニル基供与体として０．６ｍｇ／ｍｌゲラニル二リン酸アンモニウム（シグマ社製）を１０μｌ、ナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素（ＮｐｈＢ）（３．５ｍｇ／ｍｌ）溶液を３０μｌそれぞれ加え、３０℃で１２時間、９０ｒｐｍで回転振とうしながら反応させた。その後、反応溶液について酢酸エチルを用いた分配を行い、酢酸エチル層を得た。酢酸エチル層を濃縮し、ＯＤＳカラム（ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＡＧ１２０、４．６ｍｍ × ２５０ｍｍ、資生堂製）にアプライし、０．１％トリフルオロ酢酸含有蒸留水：０．１％トリフルオロ酢酸含有メタノール＝４５：５５→０：１００（０分〜３５分で直線的にメタノール濃度増加し、以後０．１％トリフルオロ酢酸含有メタノールを流し続ける）、流速０．８ｍｌ／ｍｉｎの条件で溶出させた。２１０〜４００ｎｍの吸収を検出（検出器：Ｗａｔｅｒｓ９９６ Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）した結果、もとの中国産プロポリス抽出物には無い、リテンションタイムとＵＶスペクトルが６−ゲラニルガランギン（リテンションタイム３２．３分、極大吸収２７０．３ｎｍ）と推定されるピークを新たに確認した。以上、実施例３に示されるように、原料として中国産プロポリスのエタノール抽出物、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸、及びナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を配合することにより新規プレニルフラボノイドである６−ゲラニルガランギンが製造されることが確認された。
原料として中国産プロポリスの原塊１００ｇに９５容量％エタノール４００ｍｌを加え、室温で一晩撹拌した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上清をロータリーエバポレーターを用いて溶媒留去した。このようにして得られた中国産プロポリス抽出物のうち１０ｍｇをメタノール１０ｍｌに溶解させ、このうち３μｌを蒸留水３０μｌに加えた。該水溶液に０．５Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）及び０．０５Ｍ塩化マグネシウムを各１０μｌ加えた。その後、プレニル基供与体として０．６ｍｇ／ｍｌゲラニル二リン酸アンモニウム（シグマ社製）を１０μｌ、ナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素（ＮｐｈＢ）（３．５ｍｇ／ｍｌ）溶液を３０μｌそれぞれ加え、３０℃で１２時間、９０ｒｐｍで回転振とうしながら反応させた。その後、反応溶液について酢酸エチルを用いた分配を行い、酢酸エチル層を得た。酢酸エチル層を濃縮し、ＯＤＳカラム（ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＡＧ１２０、４．６ｍｍ × ２５０ｍｍ、資生堂製）にアプライし、０．１％トリフルオロ酢酸含有蒸留水：０．１％トリフルオロ酢酸含有メタノール＝４５：５５→０：１００（０分〜３５分で直線的にメタノール濃度増加し、以後０．１％トリフルオロ酢酸含有メタノールを流し続ける）、流速０．８ｍｌ／ｍｉｎの条件で溶出させた。２１０〜４００ｎｍの吸収を検出（検出器：Ｗａｔｅｒｓ９９６ Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）した結果、もとの中国産プロポリス抽出物には無い、リテンションタイムとＵＶスペクトルが６−ゲラニルガランギン（リテンションタイム３２．３分、極大吸収２７０．３ｎｍ）と推定されるピークを新たに確認した。以上、実施例３に示されるように、原料として中国産プロポリスのエタノール抽出物、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸、及びナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を配合することにより新規プレニルフラボノイドである６−ゲラニルガランギンが製造されることが確認された。
（実施例４：６−ゲラニルガランギンの製造３）
実施例３と同様の方法で得られた中国産プロポリス抽出物のうち５．０ｇをシリカゲル（ＢＷ８２０ＭＨ、４１ｍｍ×４００ｍｍ、富士シリシア化学株式会社製）に供し、９５％クロロホルム／５％メタノール混液で溶出させ５０ｍｌずつ分画した。フラボノイドの含有量が多かった１３及び１４番目の溶出画分を混合し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒留去して濃縮物２．２ｇを得た。このようにして得られたフラボノイド画分のうち１０ｍｇをメタノール１０ｍｌに溶解させ、このうち２５μｌを蒸留水６１．７μｌに加えた。該水溶液に０．５Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）及び０．０５Ｍ塩化マグネシウムを各１０μｌ加えた後、プレニル基供与体として１．５ｍｇ／ｍｌゲラニル二リン酸アンモニウムを１０μｌ、ナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素（ＮｐｈＢ）（１２ｍｇ／ｍｌ）溶液を８．３μｌそれぞれ加えた。そして、３０℃で１２時間、９０ｒｐｍで回転振とうしながら反応させた。その後、反応溶液について酢酸エチルを用いた分配を行い、酢酸エチル層を得た。酢酸エチル層を濃縮し、実施例３の条件でＯＤＳカラムにアプライし、２１０〜４００ｎｍの吸収を検出した。その結果、もとのプロポリス抽出物には無い、リテンションタイムとＵＶスペクトルが６−ゲラニルガランギン（リテンションタイム３２．３分、極大吸収２７０．３ｎｍ）と推定されるピークを新たに確認した。以上、実施例４に示されるように、原料として中国産プロポリスのエタノール抽出物のフラボノイド分画、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸、及びナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を配合することにより新規プレニルフラボノイドである６−ゲラニルガランギンが製造されることが確認された。
実施例３と同様の方法で得られた中国産プロポリス抽出物のうち５．０ｇをシリカゲル（ＢＷ８２０ＭＨ、４１ｍｍ×４００ｍｍ、富士シリシア化学株式会社製）に供し、９５％クロロホルム／５％メタノール混液で溶出させ５０ｍｌずつ分画した。フラボノイドの含有量が多かった１３及び１４番目の溶出画分を混合し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒留去して濃縮物２．２ｇを得た。このようにして得られたフラボノイド画分のうち１０ｍｇをメタノール１０ｍｌに溶解させ、このうち２５μｌを蒸留水６１．７μｌに加えた。該水溶液に０．５Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）及び０．０５Ｍ塩化マグネシウムを各１０μｌ加えた後、プレニル基供与体として１．５ｍｇ／ｍｌゲラニル二リン酸アンモニウムを１０μｌ、ナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素（ＮｐｈＢ）（１２ｍｇ／ｍｌ）溶液を８．３μｌそれぞれ加えた。そして、３０℃で１２時間、９０ｒｐｍで回転振とうしながら反応させた。その後、反応溶液について酢酸エチルを用いた分配を行い、酢酸エチル層を得た。酢酸エチル層を濃縮し、実施例３の条件でＯＤＳカラムにアプライし、２１０〜４００ｎｍの吸収を検出した。その結果、もとのプロポリス抽出物には無い、リテンションタイムとＵＶスペクトルが６−ゲラニルガランギン（リテンションタイム３２．３分、極大吸収２７０．３ｎｍ）と推定されるピークを新たに確認した。以上、実施例４に示されるように、原料として中国産プロポリスのエタノール抽出物のフラボノイド分画、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸、及びナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を配合することにより新規プレニルフラボノイドである６−ゲラニルガランギンが製造されることが確認された。
（実施例５：６−ゲラニルイソサクラネチン及び７−O−ゲラニルイソサクラネチンの製造２）
原料としてブラジル産プロポリスの原塊１２０ｇに９５容量％エタノール４００ｍｌを加え、室温で一晩撹拌した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上清をロータリーエバポレーターを用いて溶媒留去した。このようにして得られたブラジル産プロポリス抽出物のうち１０ｍｇをメタノール１０ｍｌに溶解させ、このうち１０μｌを蒸留水６１．７μｌに加えた。該水溶液に０．５Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）及び０．０５Ｍ塩化マグネシウムを各１０μｌ加えた後、プレニル基供与体として０．６ｍｇ／ｍｌゲラニル二リン酸アンモニウムを１０μｌ、ナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素（ＮｐｈＢ）（１２ｍｇ／ｍｌ）溶液を８．３μｌそれぞれ加えた。そして、３０℃で１２時間、９０ｒｐｍで回転振とうしながら反応させた。その後、反応溶液について酢酸エチルを用いた分配を行い、酢酸エチル層を得た。酢酸エチル層を濃縮し、実施例３の条件でＯＤＳカラムにアプライし、２１０〜４００ｎｍの吸収を検出した。その結果、もとのブラジル産プロポリス抽出物には無い、６−ゲラニルイソサクラネチン（リテンションタイム３１．０分、極大吸収２９５．５ｎｍ）、７−O−ゲラニルイソサクラネチン（リテンションタイム３６．１分、極大吸収２９０．７）と推定されるピークを新たに確認した。以上、実施例５に示されるように、原料としてブラジル産プロポリスのエタノール抽出物、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸、及びナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を配合した。それにより、新規プレニルフラボノイドである６−ゲラニルイソサクラネチン及び７−O−ゲラニルイソサクラネチンが製造されることが確認された。
原料としてブラジル産プロポリスの原塊１２０ｇに９５容量％エタノール４００ｍｌを加え、室温で一晩撹拌した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上清をロータリーエバポレーターを用いて溶媒留去した。このようにして得られたブラジル産プロポリス抽出物のうち１０ｍｇをメタノール１０ｍｌに溶解させ、このうち１０μｌを蒸留水６１．７μｌに加えた。該水溶液に０．５Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）及び０．０５Ｍ塩化マグネシウムを各１０μｌ加えた後、プレニル基供与体として０．６ｍｇ／ｍｌゲラニル二リン酸アンモニウムを１０μｌ、ナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素（ＮｐｈＢ）（１２ｍｇ／ｍｌ）溶液を８．３μｌそれぞれ加えた。そして、３０℃で１２時間、９０ｒｐｍで回転振とうしながら反応させた。その後、反応溶液について酢酸エチルを用いた分配を行い、酢酸エチル層を得た。酢酸エチル層を濃縮し、実施例３の条件でＯＤＳカラムにアプライし、２１０〜４００ｎｍの吸収を検出した。その結果、もとのブラジル産プロポリス抽出物には無い、６−ゲラニルイソサクラネチン（リテンションタイム３１．０分、極大吸収２９５．５ｎｍ）、７−O−ゲラニルイソサクラネチン（リテンションタイム３６．１分、極大吸収２９０．７）と推定されるピークを新たに確認した。以上、実施例５に示されるように、原料としてブラジル産プロポリスのエタノール抽出物、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸、及びナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を配合した。それにより、新規プレニルフラボノイドである６−ゲラニルイソサクラネチン及び７−O−ゲラニルイソサクラネチンが製造されることが確認された。
（試験例１：抗癌作用に対する試験）
上記実施例１で得られた６−ゲラニルガランギンと実施例２で得られた６−ゲラニルイソサクラネチン及び７−O−ゲラニルイソサクラネチンについて、ヒト胃癌細胞Kato III及びヒト大腸癌細胞ＳＷ４８０の増殖におよぼす影響を調べた。Kato III細胞（ＴＫＧ ０２１３）及びＳＷ４８０細胞（ＴＫＧ ０５０５）は、東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターより供給を受けた。これらの細胞は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社、＃Ｒ８７５８）で３７℃、５％二酸化炭素存在下で継代培養を行なった。シャーレより０．０２％ＥＤＴＡで細胞を剥離し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１００，０００細胞／ｍｌになるように希釈した。９６ウェルプレート（ヌンク社、＃１６７００８）に、１ウェル当たり０．１ｍｌ（１０，０００細胞）を分注し、３７℃，５％二酸化炭素存在下で２４時間培養した。培地を除き、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した試料を１％添加した試験液を１ウェル当たり０．１ｍｌ添加し、更に４８時間培養した。次に、試験液を除いて１ウェル当たり０．１ｍｌのＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4，８ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4，ｐＨ７．３）を加え、ＭＴＴアッセイキット（Chemicon International, Inc. #28835; Colorimetric assay for cell survival and proliferation kit）を用い、反応を行なった。生細胞数の測定には、マイクロプレートリーダー（Bio-Tek Instruments, Inc.; μQuant）で６３０ｎｍを対照にとり、５７０ｎｍの吸収を測定した。なお、陰性対照群は試料の代わりにＤＭＳＯを１％含む培地で培養した。また、上記ゲラニル化合物のほかに、ゲラニル基を付加していないガランギン及びイソサクラネチンも同様に試験を行なった。各試料及び各対照群は、ｎ＝６で行なった。試験例１の結果を表４に示した。試料の細胞増殖抑制活性及び増殖促進活性は、陰性対照群における吸光度を１００としたときの相対値で表した。
上記実施例１で得られた６−ゲラニルガランギンと実施例２で得られた６−ゲラニルイソサクラネチン及び７−O−ゲラニルイソサクラネチンについて、ヒト胃癌細胞Kato III及びヒト大腸癌細胞ＳＷ４８０の増殖におよぼす影響を調べた。Kato III細胞（ＴＫＧ ０２１３）及びＳＷ４８０細胞（ＴＫＧ ０５０５）は、東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターより供給を受けた。これらの細胞は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社、＃Ｒ８７５８）で３７℃、５％二酸化炭素存在下で継代培養を行なった。シャーレより０．０２％ＥＤＴＡで細胞を剥離し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１００，０００細胞／ｍｌになるように希釈した。９６ウェルプレート（ヌンク社、＃１６７００８）に、１ウェル当たり０．１ｍｌ（１０，０００細胞）を分注し、３７℃，５％二酸化炭素存在下で２４時間培養した。培地を除き、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した試料を１％添加した試験液を１ウェル当たり０．１ｍｌ添加し、更に４８時間培養した。次に、試験液を除いて１ウェル当たり０．１ｍｌのＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4，８ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4，ｐＨ７．３）を加え、ＭＴＴアッセイキット（Chemicon International, Inc. #28835; Colorimetric assay for cell survival and proliferation kit）を用い、反応を行なった。生細胞数の測定には、マイクロプレートリーダー（Bio-Tek Instruments, Inc.; μQuant）で６３０ｎｍを対照にとり、５７０ｎｍの吸収を測定した。なお、陰性対照群は試料の代わりにＤＭＳＯを１％含む培地で培養した。また、上記ゲラニル化合物のほかに、ゲラニル基を付加していないガランギン及びイソサクラネチンも同様に試験を行なった。各試料及び各対照群は、ｎ＝６で行なった。試験例１の結果を表４に示した。試料の細胞増殖抑制活性及び増殖促進活性は、陰性対照群における吸光度を１００としたときの相対値で表した。
表４に示されるように、ゲラニル基を付加していないガランギン及びイソサクラネチンは、Kato III細胞及びＳＷ４８０細胞に対し、比較的低濃度において増殖促進活性を示した。一方、６−ゲラニルガランギン及び６−ゲラニルイソサクラネチンは、Kato III細胞及びＳＷ４８０細胞に対し、濃度依存的な増殖抑制（阻害）活性を示した。７−O−ゲラニルイソサクラネチンは、ＳＷ４８０の細胞に対し、増殖抑制活性を示した。
（試験例２：抗菌作用に対する試験）
上記実施例１で得られた６−ゲラニルガランギンと実施例２で得られた６−ゲラニルイソサクラネチン及び７−O−ゲラニルイソサクラネチンについて、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; ＭＲＳＡ）、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus; ＭＳＳＡ）及び枯草菌（Bacillus subtilis）に対する抗菌活性を調べた。ＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ ３３５９１）及びＭＳＳＡ（ＡＴＣＣ ６５３８Ｐ）は、ＡＴＣＣより入手した。枯草菌（ＪＣＭ ２４９９）は、理化学研究所バイオリソースセンターより購入した。ＤＭＳＯに溶解した試料を４％添加した感受性測定用ブイヨン「ニッスイ」（日水製薬株式会社製、＃０５５３４）を、４％ＤＭＳＯを含む感受性測定用ブイヨンを用いて２倍系列希釈を行って試験培地とした。この試験培地をあらかじめ、９６ウェルプレートに１ウェル当たり０．１ｍｌ添加した。１０4 ｃｆｕ／０．１ｍｌとなるように感受性測定用ブイヨンで調整しておいた黄色ブドウ球菌液又は枯草菌液を試験培地の入ったウェルに１ウェルあたり０．１ｍｌ添加し、混合後３７℃で一晩静置培養した。黄色ブドウ球菌や枯草菌が増殖すれば、培地に濁りを生ずるが、増殖が抑制された場合、培地は澄明なままである。したがって、培地が澄明になったウェルを目視により判定し、そのうち最も低い試料濃度を最小生育阻止濃度（ＭＩＣ）とした。なお、陽性対照群は、試料の代わりにオキサシリンを用いた。また、上記ゲラニル化合物のほかに、ゲラニル基を付加していないガランギン及びイソサクラネチンも同様に試験を行なった。試験例２の結果を表５に示した。各試料のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ及び枯草菌に対する抗菌活性は、最小生育阻止濃度（ＭＩＣ）で表した。
上記実施例１で得られた６−ゲラニルガランギンと実施例２で得られた６−ゲラニルイソサクラネチン及び７−O−ゲラニルイソサクラネチンについて、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; ＭＲＳＡ）、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus; ＭＳＳＡ）及び枯草菌（Bacillus subtilis）に対する抗菌活性を調べた。ＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ ３３５９１）及びＭＳＳＡ（ＡＴＣＣ ６５３８Ｐ）は、ＡＴＣＣより入手した。枯草菌（ＪＣＭ ２４９９）は、理化学研究所バイオリソースセンターより購入した。ＤＭＳＯに溶解した試料を４％添加した感受性測定用ブイヨン「ニッスイ」（日水製薬株式会社製、＃０５５３４）を、４％ＤＭＳＯを含む感受性測定用ブイヨンを用いて２倍系列希釈を行って試験培地とした。この試験培地をあらかじめ、９６ウェルプレートに１ウェル当たり０．１ｍｌ添加した。１０4 ｃｆｕ／０．１ｍｌとなるように感受性測定用ブイヨンで調整しておいた黄色ブドウ球菌液又は枯草菌液を試験培地の入ったウェルに１ウェルあたり０．１ｍｌ添加し、混合後３７℃で一晩静置培養した。黄色ブドウ球菌や枯草菌が増殖すれば、培地に濁りを生ずるが、増殖が抑制された場合、培地は澄明なままである。したがって、培地が澄明になったウェルを目視により判定し、そのうち最も低い試料濃度を最小生育阻止濃度（ＭＩＣ）とした。なお、陽性対照群は、試料の代わりにオキサシリンを用いた。また、上記ゲラニル化合物のほかに、ゲラニル基を付加していないガランギン及びイソサクラネチンも同様に試験を行なった。試験例２の結果を表５に示した。各試料のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ及び枯草菌に対する抗菌活性は、最小生育阻止濃度（ＭＩＣ）で表した。
表５に示されるように、６−ゲラニルガランギンは、ＭＲＳＡに対するＭＩＣが１２．５μｇ／ｍｌとなり、陽性対照のオキサシリンに相当する抗菌活性が認められた。また、ＭＳＳＡや枯草菌に対してもＭＩＣがそれぞれ６２．５μｇ／ｍｌ、１５．６μｇ／ｍｌとなり、ゲラニル基を付加していないガランギンよりも抗菌活性が顕著に上昇した。また、イソサクラネチンのゲラニル化合物である６−ゲラニルイソサクラネチン及び７−O−ゲラニルイソサクラネチンは、イソサクラネチンよりも枯草菌に対する抗菌活性が僅かに向上した。
次に、上記実施形態及び別例から把握できる技術的思想について、それらの効果とともに以下に追記する。
（ａ）前記プレニルフラボノイドの製造方法において、原料としてのプロポリスと放線菌培地とを混合する工程からなることを特徴とする。したがって、（ａ）に記載の発明によれば、放線菌が自ら合成しているナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素およびプレニル基供与体であるゲラニル二リン酸を使用するため、プレニル基転移酵素やゲラニル二リン酸を新たに添加することなく新規プレニルフラボノイドを製造することができる。
（ａ）前記プレニルフラボノイドの製造方法において、原料としてのプロポリスと放線菌培地とを混合する工程からなることを特徴とする。したがって、（ａ）に記載の発明によれば、放線菌が自ら合成しているナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素およびプレニル基供与体であるゲラニル二リン酸を使用するため、プレニル基転移酵素やゲラニル二リン酸を新たに添加することなく新規プレニルフラボノイドを製造することができる。
Claims (12)
- 下記一般式（１）に示される構造を有するプレニルフラボノイド。
- 下記一般式（２）に示される構造を有するプレニルフラボノイド。
- 下記一般式（３）に示される構造を有するプレニルフラボノイド。
- 下記一般式（４）に示される構造を有するプレニルフラボノイド。
- 下記一般式（５）に示される構造を有するプレニルフラボノイド。
- 下記一般式（６）に示される構造を有するプレニルフラボノイド。
- 下記一般式（７）に示される構造を有するプレニルフラボノイド。
- 原料としてガランギン、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸、及びナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を配合する工程を備えることを特徴とする請求項５に記載のプレニルフラボノイドの製造方法。
- 原料としてイソサクラネチン、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸、及びナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を配合する工程を備えることを特徴とする請求項６又は請求項７に記載のプレニルフラボノイドの製造方法。
- 請求項１から請求項７のいずれか一項に記載のプレニルフラボノイドの製造方法において、原料としてプロポリス、プレニル基供与体としてゲラニル二リン酸、及びナフテルピンの合成酵素であるプレニル基転移酵素を配合する工程を備えることを特徴とするプレニルフラボノイドの製造方法。
- 請求項１から請求項７のいずれか一項に記載のプレニルフラボノイドを有効成分として含有することを特徴とする抗癌剤。
- 請求項１から請求項７のいずれか一項に記載のプレニルフラボノイドを有効成分として含有することを特徴とする抗菌剤。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009113403A1 (ja) * | 2008-03-10 | 2009-09-17 | 株式会社 ポッカコーポレーション | 抗メチシリン耐性黄色ブドウ球菌剤及び抗バンコマイシン耐性腸球菌剤 |
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2007
- 2007-08-17 JP JP2007213145A patent/JP2009046414A/ja active Pending
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