JPWO2008026507A1 - 美白剤 - Google Patents
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Abstract
ホップ組織の冷水抽出物を有効成分とする美白剤が提供される。この冷水抽出物は、アストラガリン、アストラガリンマロニルグルコシド、イソケルシトリン、イソケルシトリンマロニルグルコシド、ケルセチンマロニルグルコシド、ケンフェロールルチノシド、ケンフェロールマロニルグルコシド、ルチン及びフロロアシルフェノン配糖体からなる群より選ばれるフラボノイド配糖体の少なくとも1種を含有することが好ましい。
Description
本発明は、美白剤に関する。
ホップはビール製造に欠かせない原料であり、ビールに苦味や香りを与え、泡立ち・泡持ちを向上させるとともに、清澄性を高め、雑菌の繁殖も抑制すると言われている。また、ホップは健胃、消化促進等の薬理作用があり、従来、薬用植物としても利用されてきた。
近年、このようなホップの有用性に着目して、その抽出物をビール以外の用途に適用する試みがなされている。例えば、ホップ抽出物を有効成分とする耐熱性好酸性菌増殖抑制剤(特許文献1)、ホップ抽出物を有効成分とする米加工食品用香味改良剤(特許文献2)、ホップ抽出物を含有する入浴剤(特許文献3)、活性酸素消去作用を有するホップ抽出物(特許文献4)等の用途が提案されている。
ホップ抽出物については皮膚外用剤に用いることも検討されており、例えば、ハンニチバナ科の植物体から抽出された成分を含有する皮膚外用剤において、この成分と併用するための植物抽出物の一例としてホップ抽出物が挙げられている(特許文献5)。
特開2005−137241
特開2005−269988
特開平9−67245
特開平4−202138
特開2003−300859
しかしながら、ホップには抽出可能な成分が多く含有されていることから、抽出媒体や抽出温度等の抽出条件が異なれば組成の異なった抽出物が得られることとなり、抽出物が奏する効果も異質なものとなる。したがって、ホップ抽出物を皮膚外用剤の一成分として適用した場合においても、抽出条件により美白効果等の外用剤の効果が不十分となる場合も多い。
そこで、本発明の目的は、ホップ抽出物を含有し、美白効果に特に優れた美白剤を提供することにある。
上記目的を達成するために、本発明は、ホップ組織の冷水抽出物を有効成分とする美白剤を提供する。
ここで、冷水抽出によるホップ抽出物は、アストラガリン、アストラガリンマロニルグルコシド、イソケルシトリン、イソケルシトリンマロニルグルコシド、ケルセチンマロニルグルコシド、ケンフェロールルチノシド、ケンフェロールマロニルグルコシド、ルチン及びフロロアシルフェノン配糖体からなる群より選ばれるフラボノイド配糖体の少なくとも1種を含有するものが良く、フロロアシフフェノン誘導体としては、フロロイソブチロフェノン−2−O−β−D−グルコピラノシド、フロロ−2−メチルブチロフェノン−2−O−β−D−グルコピラノシド及びフロロイソバレロフェノン−2−O−β−D−グルコピラノシドからなる群より選ばれる少なくとも1種が好適である。
上記成分が高含有率で抽出できることから、ホップ組織は、ホップの茎、球花又は葉であることが好ましく、乾燥されたホップ苞の粉砕物が特に好ましい。同様の観点から、ホップ組織は、乾燥されたホップ球花の粉砕物から、ルプリンの大きさ以下の粉砕物の少なくとも一部が除かれたものが好適であり、乾燥されたホップ球花の粉砕物は、乾燥されたホップ球花の凍結物の粉砕物を用いることができる。なお、ホップ組織としては、乾燥されたホップ球花から有機溶媒抽出又は超臨界流体抽出によって抽出される物質の少なくとも一部を、当該ホップ球花から除いて得られたホップ残渣を用いてもよい。
このような美白剤は、皮膚外用剤又はその一成分として用いることができるのはもちろんであるが、経口摂取型美白剤としても機能する。
ホップ抽出物を含有し、美白効果に特に優れた美白剤が提供される。
2…組織培養ウェル、4…培養インサート、6…培養液、8…膜、10…組織、100…皮膚モデルカップ。
以下、本発明に係る美白剤の好適な実施形態について説明する。
本発明の美白剤の有効成分はホップ組織の冷水抽出物であり、いずれの品種のホップも冷水抽出の対象とすることができる。しかしながら、得られる抽出成分の美白効果が高いことから、チェコ産ザーツ種、ドイツ産ハラタウ・トラディション種、国産フラノ18号、中国産等のビール醸造用ホップ品種が好ましく、チェコ産ザーツ種が特に好ましい。
本発明においてホップ組織とは、ホップのいずれかの組織又はその一部を意味する。冷水抽出に用いるホップ組織は、葉、茎及び球花のいずれでもよく、球花が好ましく、ホップ苞がより好ましい。ホップ苞は、球花を構成する苞葉のことであって、球花からルプリン部分(黄色の顆粒)の少なくとも一部を取り除いて得ることができる。このため、本発明の冷水抽出に用いるホップ組織は、ビール等発泡性アルコール飲料の醸造に用いるホップペレットを加工する際に規定の大きさに粉砕されずに廃棄されるホップ苞であってもよく、後述するホップ球花を超臨界流体又は有機溶媒で抽出した後に残るホップ残渣であってもよい。
ホップ組織の冷水抽出物は、ホップ組織を冷水で抽出する工程を備える製造方法により得られる。ここで「冷水」とは室温以下の水を意味し、通常、0℃超50℃以下の水のことをいう。冷水の温度は、0℃超40℃以下が好ましく、5℃以上30℃以下がより好ましく、10℃以上30℃以下がよりいっそう好ましく、20±5℃(さらには20±3℃)が特に好ましい。このような温度の冷水を用いることによって、抽出が効率的になり、抽出物収量が多くなる。0℃以下の冷水を用いると、冷却コストが増大してしまい、40℃超の水を用いると、炎症作用を誘発するような成分までもが溶出されてしまう傾向がある。なお、抽出時間を短縮するためには、水に少量のアルコール、好ましくはエタノールを、10質量%以下添加することができる。
ホップ組織から抽出物を得る方法としては、植物から天然物を水抽出する方法が広く採用でき、例えば、ホップ組織と一定量の冷水とを容器に入れ、適宜撹拌しながら所定時間静置し、抽出液を濾過して残渣を取り除く方法が挙げられる。混入する残渣や不純物等を完全に取り除くためには、濾過した抽出液をさらに遠心分離すればよく、その上澄(以下、遠心上澄)を冷水抽出物として使用できる。なお、得られた冷水抽出物は、濃縮し、乾燥して使用することもできる。
ホップ組織の冷水抽出物は、合成吸着剤を充填したカラムに通して、精製して使用することもできる。合成吸着剤としては、例えば、Amberlite XAD−4、7及び16(オルガノ社)、活性炭、ポリビニルポリピロリドン(PVPP;ポリフェノール吸着剤)が挙げられ、この中でもAmberlite XAD−4が好ましく用いられる。具体的には、ホップ組織の冷水抽出物を、合成吸着剤を充填したカラムに通し、その吸着成分を、例えば、水及びメタノールの混合溶媒で溶出させ、溶出した画分を使用できる。
本発明の美白剤は、乾燥されたホップ苞の粉砕物の冷水抽出物を有効成分とすることが好ましく、また、乾燥されたホップ球花の粉砕物からルプリンの大きさ以下の粉砕物の少なくとも一部が除かれたものの冷水抽出物を有効成分とすることが好ましい。冷水抽出に用いる乾燥ホップ球花の粉砕物は、例えば、ホップ球花を乾燥して乾燥ホップ球花を得る乾燥工程と、乾燥ホップ球花を粉砕して粉砕物を得る粉砕工程と、この粉砕物からルプリンの大きさ以下の粉砕物を取り除く選別工程と、を備える製造方法により得られる。
乾燥工程では、ホップ球花を100℃以下の温度で乾燥させ、ホップ球花を保存可能な程度にまで水分を除去できればよいが、55℃以下の温度で水分含量を7〜9%まで乾燥することが好ましい。粉砕工程では、ホップ球花を効率的に微粉状に粉砕できればよく、例えば、ピンミル、ハンマーミル、ボールミル等の粉砕機を用いればよい。選別工程では、粉砕物をふるいにかけ、例えば、長径が0.1mm以上の粉砕物を「ルプリンを超える大きさ」のものとして選別することができる。この場合において、ふるいを通過させない大きさを長径0.3mm以上とすることが好ましく、長径0.5mm以上とすることがより好ましい。乾燥ホップ球花の粉砕物からルプリンの大きさ以下の粉砕物を取り除くには、例えば、目開き0.1、0.3又は0.5mmのふるいで乾燥ホップ球花の粉砕物をふるい分け、ふるいを通過しなかった粉砕物を回収すればよい。なお、乾燥ホップ球花の粉砕物からルプリンの大きさ以下の粉砕物の少なくとも一部が除かれたものの冷水抽出物は、こうして選別された乾燥ホップ球花の粉砕物を、上述した冷水で抽出する工程で記載した方法で抽出すればよい。
さらに、本発明において使用する乾燥されたホップ球花の粉砕物は、乾燥されたホップ球花の凍結物の粉砕物であることが好ましい。乾燥されたホップ球花を凍結する方法は、特に制限されないが、凍結温度は−10℃以下が好ましく、−35℃以下がより好ましい。
また、冷水抽出物は、乾燥されたホップ球花から有機溶媒抽出又は超臨界流体抽出によって抽出される物質の少なくとも一部を、当該ホップ球花から除いて得られたホップ残渣の冷水抽出物であってもよい。有機溶媒抽出に用いる有機溶媒としては、例えば、アルコール又はヘキサンが挙げられ、炭素数1〜4の低級アルコールが好ましく、エタノールがより好ましい。超臨界流体抽出に用いる超臨界流体としては、例えば、二酸化炭素、水、メタン、エタン、エチレン、プロパン、ペンタン、メタノール、エタノールが挙げられ、二酸化炭素が好ましい。
冷水抽出物は、典型的には、アストラガリン、アストラガリンマロニルグルコシド、イソケルシトリン、イソケルシトリンマロニルグルコシド、ケルセチンマロニルグルコシド、ケンフェロールルチノシド、ケンフェロールマロニルグルコシド、ルチン及びフロロアシルフェノン配糖体からなる群より選ばれるフラボノイド配糖体の少なくとも1種を含有する。
ここで、フロロアシルフェノン配糖体は、下記一般式(1)で表すことができる。
[式(1)中、R1はイソプロピル基、イソブチル基又はsec−ブチル基を示す。]
式(1)において、R1がイソプロピル基である場合は、フロロアシルフェノン配糖体は下記式(2)で表されるフロロイソブチロフェノン−2−O−β−D−グルコピラノシドであり、R1がイソブチル基である場合は、フロロアシルフェノン配糖体は下記式(3)で表されるフロロ−2−メチルブチロフェノン−2−O−β−D−グルコピラノシドであり、R1がsec−ブチル基である場合は、フロロアシルフェノン配糖体は下記式(4)で表されるフロロイソバレロフェノン−2−O−β−D−グルコピラノシドである。
美白剤における、ホップ組織の冷水抽出物の含有量は、抽出媒体を除いた成分として美白剤全質量基準で0.0001〜100質量%が好ましく、0.01〜100質量%がより好ましく、1〜100質量%が更に好ましく、5〜100質量%が特に好ましい。
美白剤は、ホップ組織の冷水抽出物の他、浸潤剤、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、分散助剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬剤、香料、樹脂、賦形剤、防菌防黴剤、消臭・脱臭剤、酵素、精製水、アルコールを含有していてもよい。また、他の美白剤を添加してもよい。
本発明の美白剤はそれ単独で美白効果を有する皮膚外用剤として皮膚等に適用でき、化粧料や薬剤に添加してこれらに美白効果を付与させる美白効果付与剤としても使用できる。更に、服用して美白効果を発揮させる経口摂取型美白剤としても利用できる。
以下、実施例及び比較例に基づき本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
[製造例1]
冷水抽出:
ホップ(国産フラノ18号)の葉を刻み10倍量(w/v)の蒸留水に浸して5℃にて一晩静置した。これを、9200Gにて15分間遠心分離した後、上澄を回収して、ホップの葉の冷水抽出物を得た。
冷水抽出:
ホップ(国産フラノ18号)の葉を刻み10倍量(w/v)の蒸留水に浸して5℃にて一晩静置した。これを、9200Gにて15分間遠心分離した後、上澄を回収して、ホップの葉の冷水抽出物を得た。
冷水抽出物の同定:
得られた冷水抽出物を分液ロートに移し、ヘキサンを加えヘキサン移行成分を廃棄した。さらに、水層に酢酸エチルを加え、酢酸エチル移行成分を廃棄した。最後に水層にn−ブタノールを加えブタノール抽出操作を3回繰り返して得たブタノール層を合併し、減圧濃縮してフラボノール画分(ホップの組織の冷水抽出物から分離されたフラボノイド配糖体)を得た。
得られた冷水抽出物を分液ロートに移し、ヘキサンを加えヘキサン移行成分を廃棄した。さらに、水層に酢酸エチルを加え、酢酸エチル移行成分を廃棄した。最後に水層にn−ブタノールを加えブタノール抽出操作を3回繰り返して得たブタノール層を合併し、減圧濃縮してフラボノール画分(ホップの組織の冷水抽出物から分離されたフラボノイド配糖体)を得た。
得たフラボノール画分を、まず、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析した。HPLCによる分析は、C18カラム(Waters Symmetry)を40℃にて使用し、流速を0.2mL/分とした。移動相は、0.05%TFA/H2Oを1液とし、アセトニトリルを2液とし、2液の割合を10%〜50%まで16分間で変化させるリニアグラジェントとした。検出は350nmのUV検出器で行った。
さらに、上記フラボノール画分の各ピークを分取用HPLCで分離し、各ピークの成分を同定した。HPLCによる分取用分離は、C18カラム(Waters SunFire)を40℃にて使用し、流速を6mL/分とした。移動相は、10%MeCNを10分間保持し、さらに150分間かけて60%MeCNまで変化させるリニアグラジェントとした。検出は350nmのUV検出器で行った。HPLCの分析結果を図1に示す。
図1に示すように、ホップの葉の冷水抽出物のフラボノール画分には主ピークが3つ存在し、これらは全てケンフェロール配糖体であることが同定された。詳しくは、図1の1で示すピークはケンフェロールルチノシド、2で示すピークはアストラガリン、3で示すピークはケンフェロールマロニルグルコシドであった。
[製造例2]
冷水抽出:
ホップ(チェコ産ザーツ種)のタイプ90ペレット1kgを蒸留水10Lに入れ、20℃にて適宜撹拌しながらペレットを消失させて一晩静置した。これを、9200Gにて15分間遠心分離した。遠心分離機は日立社製のCR21Gを用いた。遠心分離後、上澄を回収し、それをさらに濃縮して、150gの濃縮液(以下、冷水抽出物Aという。)を得た。
冷水抽出:
ホップ(チェコ産ザーツ種)のタイプ90ペレット1kgを蒸留水10Lに入れ、20℃にて適宜撹拌しながらペレットを消失させて一晩静置した。これを、9200Gにて15分間遠心分離した。遠心分離機は日立社製のCR21Gを用いた。遠心分離後、上澄を回収し、それをさらに濃縮して、150gの濃縮液(以下、冷水抽出物Aという。)を得た。
冷水抽出物の同定:
冷水抽出物Aを製造する際に得た上澄を分液ロートに移し、製造例1と同様の方法でフラボノール画分を取得し、HPLCで分析して成分の同定を行った。HPLC分析の結果を図2に示す。図2に示すように、冷水抽出物Aのフラボノール画分には主要ピークが3つ存在し、これらはケンフェロール配糖体(アストラガリン及びケンフェロールマロニルグルコシド)とケルセチンマロニルグルコシドであることが同定された。詳しくは、図2の1で示すピークはケンフェロールマロニルグルコシド、2で示すピークはアストラガリン、3で示すピークはケルセチンマロニルグルコシドであった。なお、図2の4で示すピークはルチン、5で示すピークはイソケルシトリン、6で示すピークはケンフェロールルチノシドであった。
冷水抽出物Aを製造する際に得た上澄を分液ロートに移し、製造例1と同様の方法でフラボノール画分を取得し、HPLCで分析して成分の同定を行った。HPLC分析の結果を図2に示す。図2に示すように、冷水抽出物Aのフラボノール画分には主要ピークが3つ存在し、これらはケンフェロール配糖体(アストラガリン及びケンフェロールマロニルグルコシド)とケルセチンマロニルグルコシドであることが同定された。詳しくは、図2の1で示すピークはケンフェロールマロニルグルコシド、2で示すピークはアストラガリン、3で示すピークはケルセチンマロニルグルコシドであった。なお、図2の4で示すピークはルチン、5で示すピークはイソケルシトリン、6で示すピークはケンフェロールルチノシドであった。
[製造例3]
冷水抽出:
乾燥したホップ(中国産)の球花を超臨界CO2抽出して、その残渣をペレット化した。このペレット1000kgを市水20kLに入れ、20℃にて適宜撹拌しながらペレットを消失させて12時間静置した。これを500Gにて遠心分離した後、上澄を回収し、それをさらに濃縮して、960kgの濃縮液(以下、冷水抽出物Bという。)を得た。冷水抽出物B中の固形分は、192kgであった。以下、実施例においては、この固形分を該濃度に調製して使用した。
冷水抽出:
乾燥したホップ(中国産)の球花を超臨界CO2抽出して、その残渣をペレット化した。このペレット1000kgを市水20kLに入れ、20℃にて適宜撹拌しながらペレットを消失させて12時間静置した。これを500Gにて遠心分離した後、上澄を回収し、それをさらに濃縮して、960kgの濃縮液(以下、冷水抽出物Bという。)を得た。冷水抽出物B中の固形分は、192kgであった。以下、実施例においては、この固形分を該濃度に調製して使用した。
冷水抽出物の同定:
冷水抽出物Bを製造する際に得た上澄について、製造例2と同様の方法でHPLC分析を行ったところ、冷水抽出物Bのフラボノール画分には主要ピークが3つ存在し、これらはケンフェロール配糖体(アストラガリン及びケンフェロールマロニルグルコシド)とケルセチンマロニルグルコシドであることが同定された。
冷水抽出物Bを製造する際に得た上澄について、製造例2と同様の方法でHPLC分析を行ったところ、冷水抽出物Bのフラボノール画分には主要ピークが3つ存在し、これらはケンフェロール配糖体(アストラガリン及びケンフェロールマロニルグルコシド)とケルセチンマロニルグルコシドであることが同定された。
[実施例1−1] チロシナーゼ活性阻害試験1
本試験には、冷水抽出物A(製造例2で得られたもの)及び冷水抽出物B(製造例3で得られたもの)を試料として用いた。試験は、以下の手順で行った。
本試験には、冷水抽出物A(製造例2で得られたもの)及び冷水抽出物B(製造例3で得られたもの)を試料として用いた。試験は、以下の手順で行った。
容器に、L―チロシン40mgとMilliQ水を加えて100mLとした。その容器を、熱湯を入れたビーカーの中で温めた。さらに超音波を用いて、L−チロシンをMilliQ水に溶解させ、チロシン溶液とした。チロシン溶液は、分注し冷凍保存した。
リン酸二水素カリウム(KH2PO4)4.536gを含む酸性のMilliQ水溶液を500mL調製し、A液とした。リン酸水素二ナトリウム(Na2HPO4)4.73g又はリン酸水素二ナトリウム12水和物(Na2HPO4・12H2O)11.938gを含むpH9程度のMilliQ水溶液を500mL調製し、B液とした。A液とB液とを1:1の割合で混合し、PH6.8の1/15Mリン酸緩衝液を調製した。
冷水抽出物A及び冷水抽出物BそれぞれをMilliQ水で希釈し、各濃度の試料溶液を調製した。各濃度の試料溶液ごとに、10mLねじ口試験管を4本用意した。4本の試験管のうち、2本をサンプル(+)用とし、残りの2本をサンプル(−)用とした。また、コントロール用のねじ口試験管を4本用意し、そのうち2本をコントロール(+)用とし、残りの2本をコントロール(−)用とした。ここで、(+)はチロシン溶液添加を、(−)はチロシン溶液不添加を意味する。以下、それぞれの試験管の反応溶液を調製していく。表1は、それぞれの試験管の反応溶液の組成を示すものである。
表1に従って、サンプル(+)用試験管及びサンプル(−)用試験管に、試料溶液を2mLずつ添加した。コントロール(+)用試験管及びコントロール(−)用試験管には、試料溶液の代わりにMilliQ水を2mLずつ添加した。続いて全ての試験管に、PH6.8の1/15Mリン酸緩衝液を2mLずつ添加した。
サンプル(+)用試験管及びコントロール(+)用試験管に、チロシン溶液を0.5mLずつ添加した。サンプル(−)用試験管及びコントロール(−)用試験管には、チロシン溶液の代わりにMilliQ水を0.5mLずつ添加した。
ファルコンチューブに必要量程度のチロシナーゼを入れ、重さを量った。チロシナーゼの量に応じてMilliQ水を加え、1000unit/mLの酵素溶液を調製した。なお、酵素溶液は使用する直前に調製した。全ての試験管について、酵素溶液0.5mLを添加し、試験管のふたを閉め、ボルテックスで撹拌する作業を15秒おきに行った。
全ての試験管を、37℃に保たれた恒温振とう器内にセットし、70/minにて1時間振とうした。恒温振とう器から全ての試験管を取り出し、2、3度混ぜてから、酵素反応を停止させるために5分間氷冷した。十分に冷やした96ウェルプレートに、各試験管の溶液を、温めないように注意しながら300μLずつ添加し、プレートリーダーを用いて475nmの吸光度を測定した。なお、ゼロ合わせはMilliQ水で行った。
サンプル(+)、コントロール(+)、サンプル(−)、コントロール(−)用試験管の溶液から測定された吸光度の値をそれぞれAs、Ab、As´、Aoとしたとき、下式によって求めた値をチロシナーゼ活性阻害率とした。図3は、冷水抽出物A及び冷水抽出物Bのチロシナーゼ活性阻害率(%)を示すグラフである。なお、ポジティブコントロールとしてコウジ酸のMilliQ水希釈液を用いた。
[(Ab−(As−As´))/(Ab−Ao)]×100(%)
[(Ab−(As−As´))/(Ab−Ao)]×100(%)
図3が示すように、冷水抽出物A及び冷水抽出物Bの試料溶液でチロシナーゼ活性阻害率が上昇した。すなわち、冷水抽出物A及び冷水抽出物Bにチロシナーゼ活性阻害作用があることが明らかになった。特に、冷水抽出物Aを400ppm添加したサンプルでは、コントロールと比べて顕著なチロシナーゼ活性阻害作用が認められた。
[実施例1−2] チロシナーゼ活性阻害試験2
本試験には、冷水抽出物C(製造例1で得られたもの)を試料として用いた。試験は、実施例1−1とほぼ同様の手順で行った。
本試験には、冷水抽出物C(製造例1で得られたもの)を試料として用いた。試験は、実施例1−1とほぼ同様の手順で行った。
試料溶液としては、冷水抽出物CをMilliQ水で希釈し、冷水抽出物Cの1倍希釈溶液(原液)(×1)、2倍希釈溶液(×1/2)、及び10倍希釈溶液(×10)を調製した。また、酵素反応後の各試験管の溶液は、96ウェルプレートに200μLずつ添加した。その他は実施例1−1と同様の手順により、チロシナーゼ活性阻害率を求めた。図4は、冷水抽出物Cのチロシナーゼ活性阻害率(%)を、コントロール(MilliQ水)のチロシナーゼ活性阻害率を0%としたときの相対値として示すグラフである。
図4が示すように、冷水抽出物Cの試料溶液で濃度依存的にチロシナーゼ活性阻害率が減少した。すなわち、冷水抽出物Cに濃度依存的なチロシナーゼ活性阻害作用があることが明らかになった。
[実施例2] B16メラノーマ培養細胞に対するメラニン生成抑制試験
本試験には、冷水抽出物A、冷水抽出物B及び冷水抽出物Cを試料として用いた。試験は、以下の手順で行った。
本試験には、冷水抽出物A、冷水抽出物B及び冷水抽出物Cを試料として用いた。試験は、以下の手順で行った。
10%のFBS(ウシ胎児血清)、ペニシリン及びストレプトマイシンを含むイーグルMEM培地に、B16メラノーマ細胞(ヒューマンサイエンス資源バンク JCRB0202)を1×105cells/mLとなるようにサスペンドし、プレートに播種した。5%CO2に調整したインキュベーターにプレートを入れ、37℃にて24時間培養した。プレートに、DMSOに溶解した試料を添加し、同じ条件で3日間培養した。なお、試料の代わりにDMSOを添加した場合をコントロールとし、アルブチンを添加した場合をポジティブコントロールとした。
培養後、トリプシン処理により細胞を回収し、血球計算盤により細胞数を測定した。それに基づいて1ウェル当りの細胞数を算出し、細胞生存率を求めた。図5、図7、図9はそれぞれ、冷水抽出物A、冷水抽出物B、冷水抽出物Cを添加した場合のメラノーマ細胞の細胞生存率を、コントロールの細胞生存率を100%としたときの相対値として示すグラフである。
また、細胞数測定後、リン酸緩衝液PBS(−)で細胞を洗浄して回収した。回収したメラノーマ細胞の白色化状況を肉眼にて目視判定した。表2は、目視判定の基準を示すものである。図6、図8、図10はそれぞれ、冷水抽出物A、冷水抽出物B、冷水抽出物Cを添加した場合のメラノーマ細胞の白色化状況と目視判定の結果を示す写真図である。
図5〜図10より、冷水抽出物A、冷水抽出物B及び冷水抽出物Cは、毒性のない範囲で、濃度依存的にメラニン生成抑制作用を示すことが明らかとなった。
[実施例3] 正常ヒト皮膚3次元モデルに対するメラニン生成抑制試験
本試験には、冷水抽出物Aを試料として用いた。試験は、以下の手順で行った。
本試験には、冷水抽出物Aを試料として用いた。試験は、以下の手順で行った。
ヒト正常皮膚3次元モデル(MEL−300A(Asian donor)、Lot、No.6761、クラボウ)に、31.5mJ/cm2にてUVBを照射した。UV照射はトランスイルミネーターDT−20MP(ATTO)で行った。UV量の測定は、UVXデジタルラジオメーター(UVP Inc.)にUVX−31検出器を取り付け、UV310nmの強度を測定した。
図11は、皮膚モデルカップの構造を示す斜視図(a)及び断面図(b)である。皮膚モデルカップ100は、組織培養ウェル2の内部に培養インサート4を備えてなる。培養インサートの内側には水平方向に膜8が張られており、組織培養ウェル2は、膜8の高さまで培養液6で満たされている。培養インサート4中の膜8上には、ヒト正常表皮角化細胞やメラノサイトからなる組織10が設置されている。皮膚モデルカップ100においては、培養液6から膜8を通して組織10に栄養が与えられる。
UV照射後、皮膚モデルカップの培養液に試料溶液を添加した。試料溶液の代わりに培養液を添加した場合をコントロールとした。5%CO2に調整したインキュベーターに皮膚モデルカップを入れ、37℃にて培養を開始した。培養は、EPI−100−LLMM長期維持培地を用いて行った。24時間培養後、培地交換し、再び試料溶液を添加した。3日後、再び培地交換し、試料溶液を添加した。さらに2日後、培地交換と試料添加を行い、24時間後に細胞毒性試験を行った。
細胞毒性試験は、MTTアッセイにより行った。MTTアッセイは、以下の手順で行った。皮膚モデルカップをPBS250μLで3回洗浄した。MTT溶液300μLが入った24ウェルプレートに組織を入れ、5%CO2に調整したインキュベーターで37℃にて3時間培養した。再び皮膚モデルカップをPBSにて洗浄した。0.04NのHCLを含むイソプロパノール2mLが入った24ウェルプレートに組織を入れ、2時間抽出した。抽出液200μLを96ウェルプレートに移し、560nmの吸光度を測定した。なお、Referenceは655nmとした。吸光度の値から、組織細胞の生存率を求めた。図12は、冷水抽出物Aを添加した場合の組織細胞の生存率を、コントロールの生存率を100%としたときの相対値として示すグラフである。
また、培養後、それぞれの組織の写真撮影を行った。図13は、コントロールのメラニン生成状況を示す写真、図14は、冷水抽出物Aの0.08質量%溶液を添加した場合のメラニン生成状況を示す写真、図15は、冷水抽出物Aの0.008質量%溶液を添加した場合のメラニン生成状況を示す写真である。
図12〜図15より明らかなように、冷水抽出物Aを添加した場合は、コントロールと比べて組織が黒化していなかった。特に、冷水抽出物Aの0.08%溶液を添加した場合は、コントロールと比べてかなり白かった。すなわち、冷水抽出物Aは、細胞毒性のない範囲で、濃度依存的にメラニン生成抑制作用を示すことが明らかとなった。
本発明によれば、ホップ抽出物を含有し、美白効果に特に優れた美白剤が提供される。
Claims (9)
- ホップ組織の冷水抽出物を有効成分とする美白剤。
- 前記冷水抽出物は、アストラガリン、アストラガリンマロニルグルコシド、イソケルシトリン、イソケルシトリンマロニルグルコシド、ケルセチンマロニルグルコシド、ケンフェロールルチノシド、ケンフェロールマロニルグルコシド、ルチン及びフロロアシルフェノン配糖体からなる群より選ばれるフラボノイド配糖体の少なくとも1種を含有する請求項1記載の美白剤。
- 前記フロロアシフフェノン誘導体は、フロロイソブチロフェノン−2−O−β−D−グルコピラノシド、フロロ−2−メチルブチロフェノン−2−O−β−D−グルコピラノシド及びフロロイソバレロフェノン−2−O−β−D−グルコピラノシドからなる群より選ばれる少なくとも1種を含有する、請求項1又は2記載の美白剤。
- 前記ホップ組織は、ホップの茎、球花又は葉である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の美白剤。
- 前記ホップ組織は、乾燥されたホップ苞の粉砕物である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の美白剤。
- 前記ホップ組織は、乾燥されたホップ球花の粉砕物から、ルプリンの大きさ以下の粉砕物の少なくとも一部が除かれたものである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の美白剤。
- 前記乾燥されたホップ球花の粉砕物は、乾燥されたホップ球花の凍結物の粉砕物である、請求項6記載の美白剤。
- 前記ホップ組織は、乾燥されたホップ球花から有機溶媒抽出又は超臨界流体抽出によって抽出される物質の少なくとも一部を、当該ホップ球花から除いて得られたホップ残渣である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の美白剤。
- 経口摂取型美白剤である請求項1〜9のいずれか一項に記載の美白剤。
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