KR20120135448A - 먼나무 잎으로부터 분리된 신규 화합물 및 이의 항산화 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항산화 활성을 갖는 먼나무 잎 추출물로부터 분리된 신규한 헤미테르펜 글루코시드 화합물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 DPPH를 이용한 자유라디칼 소거능 실험에서 아스코르브산과 유사한 정도의 자유라디칼 소거능을 보였으며, 크산틴 산화효소 수퍼옥사이드 소거(Xanthine Oxidase Superoxide Scavenging)활성 평가에서도 우수한 항산화 활성을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 화합물은 항산화 용도의 화장품 조성물 또는 기능성 식품 조성물의 활성성분으로 활용될 수 있다.

Description

먼나무 잎으로부터 분리된 신규 화합물 및 이의 항산화 용도{New Compounds Purified from the Leaves of Ilex Rotunda and Anti-Oxidative Effect Thereof}

본 발명은 먼나무(Ilex Rotunda) 잎으로부터 분리된 신규한 헤미테르펜 글루코시드 화합물 및 이의 항산화 용도에 관한 것이다.

감탕나무속(Ilex L.)은 무환자 나무목 감탕나무과에 속하는 식물군이다. 감탕나무속을 포함하여 byronia, Nemopanthus, Phelline 등 4속으로 구성되어 있으며(1), 난ㅇ온대 지역을 중심으로 전세계에 약 420 여종이 분포하는 것으로 알려져 있다. 그러나 한국에는 감탕나무속 만이 분포하는 것으로 알려져 있다(2). 한국의 감탕나무속에는 Ilex cornuta Lindl. & Paxton 호랑가시나무, Ilex crenata Thunb. var. crenata 꽝꽝나무, Ilex crenata for. microphylla Rehder 좀꽝꽝나무, Ilex integra Thunb. 감탕나무, Ilex macropoda Miq. for. macropoda 대팻집나무, Ilex macropoda for. pseudomacropoda (Loes.) Hara 민대팻집나무, Ilex rotunda Thunb. 먼나무 등 5종 1변종 1품종이 남부 지방을 중심으로 생육하고 있다고 알려져 있다(3). Ilex 속 식물에 대한 연구로는 먼저 같은 속 식물인 마테, 호랑가시나무 등에서 카페인산(caffeic acid), 클로로겐산(chlorogenic acid) 등 다양한 카페인산 유도체가 분리된바 있으며, 그 외에 플라보노이드(flavonoid), 트리테르페노이드(triterpenoid), 탄닌(tnanin), 엘라기탄닌(ellagitannin), 알칼로이드(alkaloid) 등 다양한 성분이 분리되었다(4-12). 그 중 먼나무는(ilex rotunda. Thunb; IR) 높이 10m 안팎이고 가지는 털이 없으며 암갈색이고 수피는 회갈색이다. 잎은 어긋나고 혁질이며 타원형 또는 긴 타원형이고 예두이며 예저이고 길이 4-11 cm, 너비 3-4 cm이며 양면에 털이 없고 중늑이 표면에서는 들어가며 뒷면에서는 튀어나오고 가장자리가 밋밋하며 마르면 갈색으로 되고 엽병은 길이 12-28 cm이다. 5-6 월에 꽃이 피고 꽃은 연한 자주색이며 취산화서는 세가지에서 액생하고 잎보다 짧으며 꽃은 2가화로서 지름 4mm 정도이고 꽃받침잎과 꽃잎은 각각 4-5개이며 꽃잎은 꽃받침보다 길고 뒤로 젖혀지며 수술도 4~5개이고 수꽃에서는 크지만 암꽃에서는 작아지며 구형의 녹색자방이 있다. 10월에 열매가 성숙되며 핵과는 둥굴고 지름 5-8 mm이며 붉은색으로 익는다. 주로 제주도 및 보길도에서 자라는 상록 교목(13)으로 속명은 철동청(鐵冬靑), 백난향(白蘭香), 동청자(冬靑仔), 백은향(白銀香), 홍자인(紅子人), 산동청(山冬靑), 백웅담목(白熊膽木), 좀감탕나무?흑금리(黑金??)라고 한다14). 일반적으로 관상용, 공업용, 약용에 사용 되어 지고 있으며, 특히 사철 나무로써 정원수 및 가로수(街路樹)로 심으며, 참 빛, 끈끈이, 기호료, 페인트재, 반창고, 접착제, 쇠모목지에 쓰이고, 민간에서 열매?수피(樹皮)를 이뇨에 약으로 쓴다(14). 또한, 수피 또는 根皮(근피)를 救必應(구필응)이라 하며, 청열 (淸熱), 해독, 이습(利濕), 지통(止痛), 지혈의 효능이 있어서, 감모발열(感冒發熱), 편도선염, 인상종통 (咽傷腫痛), 급만성 간염, 급성위장염, 위십이지장 궤양, 류머티성 관절염, 타박상, 화상을 치료한다(15-16).

먼나무의 성분 연구로는 먼나무 열매에서 트리테르페노이드(triterpenoid)를 분리보고 하였고(17), 카페오일탄닌(caffeoyltannin) 등을 분리 보고 하였다(18). 또한 IR, I. Paraguayensis 등과 같은 ilex 속 식물을 혼합하여 차로 우려 마시는데 이 차에서는 카페오일탄닌, 플라보노이드 등을 분리함을 보고한 바 있으며, 이를 이용하여 LDL과 같은 항산화 활성에 관하여 보고하였다(19-23). 민간 치료 및 약용으로 이용되어지는 IR은 위에 언급된 보고 내용에서 확인 할 수 있듯이 대부분이 I. Paraguayensis 등과 같은 과 식물에서의 분리 및 활성 연구가 이뤄져 있으며, IR로는 트리테르페노이드(triterpenoid)류 성분연구가 한정되어 있으며, 활성 연구 또한 이루어진 것이 없다.

최근 많은 분야에서는 자유 라디칼 이론(free radical theory), 즉 과산화지질(peroxidized fat)에 의한 세포 장애설(24)이 있다. 자유라디칼(free radical)은 적어도 한 쌍의 짝을 짓지 않은 전자를 포함한 것으로 어떤 물질과 전자를 공유하여 안정화되려 하기 때문에 생체 내에 수많은 활성산소종(reactive oxygen species)을 생성 하게 되며(25), 이러한 활성산소종은 반응성이 큰 ¹O₂ 및 OH를 비롯하여 O2^-, H2O2, ROO, RO, ROOH 및 HOC 등을 포함한다. 이들은 DNA 분절과 단백질의 불활성화 및 세포 생체막의 구성성분인 불포화지방산을 공격하여 과산화 반응을 일으켜 생체기능을 저하시킴으로서, 항산화제 파괴, 지질 과산화반응의 개시, 단백질의 산화, DNA 산화 등을 통하여 인체에 다양한 문제를 가속화시킨다(26-27). 이러한 문제를 완화하기 위한 활성산소를 조절 인자로는 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxid dismutase), 카탈라아제(catalase), 글루타티온 환원효소(glutathion reductase) 등의 효소계열의 항산화제인 페놀 화합물, 플라본(flavon) 유도체, 아스코르브산, 카로테노이드, 글루타티온 등의 천연 항산화제와 BHA (butylated hydroxyanisole), BHT (butylated hydroxytoluen), PG (propyl gallate)등의 합성화제가 있다. 그러나 의약품등에 사용되는 합성 항산화제제는 변이원성 및 독성이 지적되어 있어, 이러한 문제를 해결하기 위해 안전한 대체 항산화제의 개발이 요구되면서 천연물로부터 유래된 물질 개발을 통해 질병의 예방 및 지연하는 분야에서 활용되고 있으며, DPPH, NBT 등과 같은 다양한 방법으로 항산화 실험을 진행하여 과학적 입증을 활발히 진행하고 있다(28-30).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 천연물로부터 항산화 활성을 갖는 신규 화합물을 분리하기 위해 연구 노력한 결과, 먼나무(Ilex Lotunda Thunb) 잎의 메탄올 추출물로부터 컬럼 크로마토 그래피에 의해 분획한 분획중에서 항산화 활성을 갖는 신규의 헤미테르펜 글루코시드(Hemiterpene Glucoside) 화합물을 분리하여 동정하는데 성공함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 항산화 활성을 갖는 신규의 헤미테르펜 글루코시드 화합물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 헤미테르펜 글루코시드(hemiterpene glucoside) 화합물을 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 헤미테르펜 글루코시드 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 헤미테르펜 글루코시드화합물은 감탕나무속 식물인 먼나무(Ilex rotunda Thunb)의 잎의 추출물로부터 컬럼 크로마토그래피에 의해 분획한 분획물로부터 정제하여 얻은 화합물이다.

본 발명에서 먼나무 잎 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 분리할 수 있다.

본 발명의 먼나무 잎 추출물을 추출하기 위한 추출 용매로는 추출공정에서 일반적으로 사용할 수 있는 용매를 사용할 수 있는데, 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출되는 것이 바람직하다.

본 발명의 신규 헤미테르펜 글루코시드 화합물은 천연물의 추출물 또는 분획물로부터 통상적인 화합물을 분리 정제하는 방법에 의해 얻을 수 있다. 예컨대, 추출물 또는 분획물을 실리카겔 또는 셀라이트(celite)겔 컬럼을 이용한 여과(filtration), 액체 컬럼 크로마토그래피를 이용한 크기배제(size-exclusion) 크로마토그래피, 이온교환(ion-exchange) 크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, 친화(affinity) 크로마토그래피 또는 이들 크로마토그래피의 조합을 이용하여 분리 정제할 수 있다. 천연물 추출물로부터 분리된 단일 화합물은 MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight Mass Spectroscopy), EI MS (Electron Ionization Mass Spectroscopy), CI (Chemical Ionization Mass Spectroscopy), FABI (Fast Atom Bombardment Ionization)와 같은 질량분석법과, 적외선 분광법(IR Sectrum), 핵자기공명법(NMR, Nuclear Magnetic Resonance), CD (Circular Dichroism) 등을 이용하여 최종적으로 동정할 수 있다.

하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 헤미테르펜 글루코시드 화합물은 DPPH를 이용한 자유라디칼 소거 활성 측정에서 아스코르브산과 유사한 정도의 자유라디칼 소거 활성을 나타내었고, 크산틴 산화효소 수퍼옥사이드 소거(Xanthine Oxidase Superoxide Scavenging) 활성 평가에서도 양성 대조군인 알로퓨리놀(allopurinol)과 유사한 수준의 우수한 항산화력을 보유하는 것으로 평가되었다.

본 발명의 헤미테르펜 글루코시드 화합물은 화학적으로 합성된 것도 천연물로부터 정제된 것과 동일한 활성을 갖는다는 것은 당업자에게 자명하다.

본 발명은 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 헤미테르펜 글루코시드 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효성분과 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 헤미테르펜 글루코시드 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서의 헤미테르펜 글루코시드 화합물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드 (예컨 대, 덱스트린,시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.

본 발명은 항산화 활성을 갖는 먼나무 잎 추출물로부터 분리된 신규 헤미테르펜 글루코시드 화합물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 DPPH를 이용한 자유라디칼 소거능 실험에서 아스코르브산과 유사한 정도의 자유라디칼 소거능을 보였으며, 크산틴 산화효소 수퍼옥사이드 소거(Xanthine Oxidase Superoxide Scavenging) 활성 평가에서도 우수한 항산화 활성을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 화합물은 항산화 용도의 화장품 조성물 또는 기능성 식품 조성물의 활성성분으로 활용될 수 있다.

도 1은 먼나무(Ilex Rotunda Thunb)의 사진이다.
도 2는 먼나무(Ilex Rotunda Thunb)의 잎 추출물로부터 본 발명의 화합물 1 및 화합물 2를 분리 동정하는 전체 과정을 모식적으로 보여주는 도면이다.
도 3은 먼나무(Ilex Rotunda Thunb)의 잎 추출물 및 분획물의 TLC 모니터링 결과를 보여주는 도면이다.
도 4는 먼나무(Ilex Rotunda Thunb)의 잎 분획물로부터 분리 동정한 화합물 1 및 화합물 2의 TLC 모니터링 결과를 보여주는 도면이다.
도 5는 DPPH법을 이용한 먼나무 잎 분획물의 자유 라디칼 소거 활성을 측정한 결과이다. AS는 양성대조군인 아스코르브산이다.
도 6은 DPPH법을 이용한 먼나무 잎 분획물로부터 분리한 화합물 1 및 화합물 2의 자유 라디칼 소거 활성을 측정한 결과이다. AS는 양성대조군인 아스코르브산이다.
도 7은 먼나무 잎 분획물의 수퍼옥사이드 소거 활성을 측정한 결과이다. AS는 양성대조군인 아스코르브산이다.
도 8은 먼나무 잎 분획물로부터 분리한 화합물 1 및 화합물 2의 수퍼옥사이드 소거 활성을 측정한 결과이다. AS는 양성대조군인 아스코르브산이다.
도 9는 화합물 1의 Negative LC MS 스펙트럼이다.
도 10은 화합물 1의 ¹H-NMR 스펙트럼이다(600 MHz, MeOH-d4 +D2O).
도 11은 화합물 1의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다(600 MHz, MeOH-d4 +D2O).
도 12a 및 도 12b 화합물 1의 COSY 스펙트럼이다.
도 12c 및 도 12d는 화합물 1의 HSQC 스펙트럼이다.
도 12e는 화합물 1의 HMBC 스펙트럼이다.
도 13은 화합물 2의 Negative LC MS 스펙트럼이다.
도 14는 화합물 2의 ¹H-NMR 스펙트럼이다(600 MHz, MeOH-d4 +D2O).
도 15는 화합물 2의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다(600 MHz, MeOH-d4 +D2O).
도 16a는 화합물 2의 COSY 스펙트럼이다.
도 16b는 화합물 2의 HSQC 스펙트럼이다.
도 16c는 화합물 2의 HMBC 스펙트럼이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

1. 추출 및 성분분리

(1) 실험재료

본 실험에 사용한 먼나무 잎(Ilex rotunda Thunb)는 2009년 12월 3kg을 제주도 한라 수목원에서 분양 받아 사용하였다.

(2) 시약 및 기구

본 실시예에서 사용된 시약 및 실험 기구는 다음과 같았다:

① Polarimeter: Jasco DIP-370 (Japan).

② ¹H-NMR spectrometer: Varian GEMINI 2000, 300 MHz(USA), Bruker AMX-500, 500MHz (Germany).

③ ¹³C-NMR spectrometer : Varian GEMINI 2000, 75 MHz (USA), Bruker AMX-500, 125MHz (Germany).

④ FAB MS spectrometer : VG70-VSEQ (England) FAB source : ionized by 35 keV Cs⁺ ion beam Matrix : Glycerol.

⑤ TLC : Adsorbent : Kieselgel 60 F254 (Merck, Germany) Cellulose (Sigma, USA) Solvent(v/v) : Benzene : Ethylformate : Formic acid = 1 : 7 : 1. EA : CH3COOH : HCOOH : H2O = 100 : 11 : 11 : 27 Detection : ⓐ Ethanolic-FeCl3 solution, ⓑ 10%-H2SO4 in H2O(heating), ⓒ UV-lamp (254 nm).

⑥ Chromatographic gels : Sephadex LH 20 (75-230μm mesh, Pharmacia) MCI-gel CHP-20P (75-150μm, Mitsubishi) YMC-gel ODS-A (230/70, 400/230, 500/400 mesh, YMC Co.)

⑦ Middle pressure liquid column chromatograph(MPLC) : sample injector : Waters 650E (Waters, Milford Massachusettsv, USA) pump : TBP5002 (Tauto Biotech, Sanghai, China) detector : Gilson 112 UV/VIS (280 nm) gel : Daisogel (SP-120-40/60-ODS-B, Daiso Co., LTD. Japan) data system : Autochro-Win 3.0 plus (Young-lin Co., Korea).

(3) 추출 및 물질의 단리

먼나무잎 3kg을 80％ 식용 MeOH으로 실온에서 2회 추출하였다. 추출액은 여과한 후 감압 농축하여 추출물(418.22g)을 얻었다. 농축한 추출물은 여과하여 필터층(filter layer)(310.43g)와 비-필터층(non-filter layer)(92g)를 얻었다. 그 중 필터층(310.43g)을 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(0→100％ MeOH, gradient system)를 실시하여 6개의 분획(Fr1, Fr2, Fr3, Fr4, Fr5, Fr6)으로 나누었다. 그 중 우수한 항산화 활성을 나타낸 Fr4은 MCI-gel CHP 20P (30→100％ MeOH, gradient system)(0→100％ MeOH, gradient system)을 실시하여 다시 Fr4을 5개의 분획(Fr4-1, Fr4-2, Fr4-3, Fr4-4, Fr4-5)으로 나누었다. 그중 Fr 4-5는 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시한 결과 화합물 1(360mg)과 화합물 2(995mg)을 얻었다(도 2 참조).

(4) TLC 테스트

먼나무 잎의 구성 성분을 추정하기 위하여 TLC를 통한 분석을 실시하였다. 먼저 먼나무잎을 80％ 식용 MeOH으로 추출하여 먼나무 잎의 추출물을 얻었고, 이어서 농축한 추출물은 여과하여 필터층(filter layer)와 비필터층(non-filter layer)을 얻었다. 그 중 필터층을 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 MeOH 용매를 0-100％까지 농도를 높여 Fr1, Fr2, Fr3, Fr4, Fr5, Fr6로 분획하여 TLC 테스트를 실시하였다. 전개용매는 EA : CH3COOH : HCOOH : H2O = 100 : 11 : 11 : 27 사용하였으며, 전개시킨 뒤에는 염화철분무, 아니스-알데히드(Anis-Aldehyde) 및 10％ 황산을 분무한 후 열판에 가열하는 방법을 이용하여 발색시켰다. TLC 결과 각 분획이 효율적으로 나누어졌음을 알 수 있었다(도 3 및 도 4 참조).

2. 생리활성 실험

(1) 시약 및 기기

Raw 264.7 세포: 한국 세포주 은행(Korea)

DMSO: Sigma Chem. Co. (USA)

FBS: Gibco BRL (USA)

MTT: Sigma Chem. Co. (USA)

Penicillin-Streptomycin: Gibco BRL (USA)

Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM): Mediatech. Inc. (USA)

Antibiotics: Gibco BRL (USA)

NG-monomrthyl-L-arginine (L-NMMA): Sigma Chem. Co. (USA)

Lipopolysaccharide (E.coil 055:B5): Sigma Chem. Co. (USA)

Murine recombinate INF-γ : Sigma Chem. Co. (USA)

Griess reagent: Sigma Chem. Co. (USA)

Sodium Diethyldithiocarbamate hydrate : Sigma Chem. Co. (USA)

Centrifuge : Eppendorff (German)

CO2 incubator : Vision Sci. Co. (Korea)

Microscope : Olympus (Japan)

ELISA reader (TECAN, Sazburg, Austria)

Water Bath : Vision Sci. Co. (Korea)

Multichennel-pipette: Gilson (France)

(2) DPPH를 이용한 자유 라디칼 소거능 측정

Hatano의 방법(36)에 의하여 먼나무 잎 추출물와 먼나무 잎 분획물 Fr1, Fr2, Fr3, Fr4, Fr5, Fr6 시료를 최종 농도가 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 ㎍/㎖이 되도록 6가지 농도로 조제하였으며, 분획물질 중 Fr4 에서 얻은 화합물 1 및 2 시료는 최종 농도가 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 ㎛/㎖이 되도록 6가지 농도로 조제하고, 각 시료 10 ㎕에 0.1 mM DPPH 용액 (99.5％ 에탄올) 180 ㎕을 가하여 볼텍스 믹서(vortex mixer)로 10 초간 진탕하여, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후에 ELISA 리더(TECAN, Sazburg, Austria)를 이용하여 518 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조 약물로는 L-아스코르브산을 마찬가지 방법으로 6가지 농도로 조제하여 측정하였다. 각 시료의 항산화 효과를 측정하기 위하여 DPPH에 대한 EDA％(Electron donating ability, 전자공여능)에 의한 환원력으로 항산화능을 표시하였고, 각 시료의 항산화능을 비교 검토하기 위해서 EDA가 50％에 이르도록 하는데 필요한 시료의 양인 IC₅₀을 측정하였다.

(3) NBT를 이용한 항산화능 측정

NBT(nitroblue tetrazolium) 환원 방법에 의해 측정하였다. 인체내에서 요산(uric acid)의 생성에 관여하는 크산틴 산화효소(xanthine oxidase)는 하이포크산틴(hypoxanthine), 크산틴(xanthine)을 기질로 하여 요산(uric acid)을 생성한다. 하지만 이 과정에서 수퍼옥사이드(superoxide)가 생성되며 이는 인체내에 산화적 손상을 입힌다. 이러한 생체내 과정을 생체 밖 인 비트로(in vitro)에서 재현하여 이들 과정에서 시료 화합물이 수퍼옥사이드(superoxide)를 얼마나 소거하는가를 확인함으로서 항산화 효과를 가늠해 볼 수 있다.

먼저 50 mM PPB(potassium phosphate buffer), pH 7.4, 1mM EDTA, 0.6mM 하이포크산틴, 0.2 mM NBT가 되도록 반응혼합물을 만들었다. 이들을 튜브에 400㎕씩 소분하고 샘플을 적당농도로 설정하여 스톡 용액(stock solution)을 만들고 이들을 5㎕ 가하였다. 여기에 크산틴 산화효소를 100 mU/㎖가 되도록 희석하고 이들을 100㎕ 가하여 최종 크산틴 산화효소농도가 20 mU/㎖이 되도록 하였다. 37℃에서 20분 인큐베이션 시키고, 이를 꺼내어 590nm에서 흡광도를 측정하였다. 크산틴 산화효소 저해제로 알려진 알로퓨리놀(allopurinol)을 이용하여 하이포크산틴/크산틴 산화효소 시스템이 활성화 되었는지 확인하여 보았다. 이들 활성의 평가는 대조군을 기준으로 상대적인 수퍼옥사이드 제거 활성으로 표현하였다.

실험결과

1. 화합물 1 및 2의 구조 확인

(1) 화합물 1

화합물 1은 노란색분말이며 TLC에서 FeCl₃ 분무에 의해서 검정으로, 10％ H₂SO₄를 분무하고 가열시 연주황으로 나타났다. 분자식 C₂₀H₂₆O₁₀로 이루어진 화합물로 High Resolution Negative LC MS 스펙트럼에서 m/z 425.1488[M-H]^- 에서 Molecular ion peak를 나타내었다(도 9 참조).

¹H-NMR 스펙트럼에서 δ7.05(d, J=1.8Hz, H-2), 6.95(dd, J=1.8, 8.4Hz, H-6), 6.80(d, J=8.4Hz, H-5)에서 1개의 ABX type임을 나타내며, δ6.25(d, J=15.6Hz, H-8), 7.56(d, J=16.6Hz, H-7)의 시그널은 트랜스 형태의 1개의 알켄임을 확인하여 카페오일기의 존재를 나타내었다. 한편, 4.35(d, J=7.8Hz, H-1"), 3.29(m, H-2"), 3.42(d, J=9.0Hz, H-3"), 3.57(m, H-4"), 3.39(d, J=9.6Hz, H-5"), 4.51(dd, J=2.4, 12.0Hz, H-6"), 4.37(m, H-6")에서 글루코오스에 해당하는 시그널을 확인할 수 있었으며, 3.92(dd, J=2.4, 10.2Hz, H-1'), 3.50(t, J=1.2, 10.2Hz, H-1'), 4.26(dd, J=5.6Hz, H-2'), 5.02(d, J=1.2Hz, H-4'), 4.87(d, J=1.2Hz, H-4'), 1.70(3H, s, H-5')에서 2개의 메틸렌, 2개의 메틴, 그리고 1개의 메틸기로 구성된 1 몰(mol)의 헤미테르펜(hemiterpene)(isoprene)을 확인함으로써, 카페오일기와 헤미테르펜이 결합한 글리코시드(glycoside)구조임을 추정하였다(도 10 참조).

¹³C-NMR 스펙트럼에서 δ 167.8, 126.3, 115.1, 148.2, 145.9, 113.4, 121.7, 145.3, 113.8에 나타나는 시그널을 통해 1개의 카페오일기의 존재를 확인하였으며, 글루코오스기에 해당하는 시그널이 δ 103.4, 73.7, 76.2, 74.0, 70.3, 63.2에서 나타나고, 나머지 5개의 탄소는 헤미테르펜으로서 2개의 메틴 시그널(δ 73.1, 74.2) 2개의 메틸렌 시그널(δ 144.1, 111.3), 1개의 메틸 시그널(δ 17.5)이 나타나 헤미테르펜임을 확인하였다(도 11 참조). 또한 각각의 수소와 탄소는 1H-1H COSY와 HSQC, HMBC 스펙트럼을 통하여 귀속시킬 수 있었다(도 12a 내지 도 12e 참조). 특히, 결합위치는 HMBC에서 카페오일기의 C-9(δ 167.8)과 글루코오스에 H-6"(δ 4.51, 4.37)에 해당하는 시그널에서 서로 상호관련피크(correlation peak)가 나타나며, 글루코오스 H-1"(δ 4.35)와 헤미테르펜 C-1' (δ 73.1) 사이에 상호관련피크를 각각 확인함으로써 글루코오스 H-6'에 카페오일기가 에스테르 결합하며, 글루코오스 C-1"에 헤미테르펜 H-1'이 결합한 것을 확인할 수 있었다(도 5 참조). 이상의 기기 분석 결과를 통해 화합물 1은 헤미테르페닐-카페오일-글루코시드(hemiterpenyl-caffeoyl-glucoside)로써 Rotundarpenoside A라고 명명하였다.

[α]²⁰ _D :+3.8 (c=0.005, MeOH)

Negative FAB MS : m/z 425.1448 [M-H]^{- 1}H-NMR (600 MHz, MeOH-d₄ ⁺D₂O): δ 7.56(1H, d, J=15.6Hz, H-7), 7.05(1H, d, J=1.8Hz, H-2), 6.95(1H, dd, J=1.8, 8.4Hz, H-6), 6.80(1H, d, J=8.4Hz, H-5), 6.25(1H, d, J=15.6Hz, H-8), 5.02(1H, d, J=1.2Hz, H-4'), 4.87(1H, d, J=1.2Hz, H-4'), 4.51(1H, dd, J=2.4, 12.0Hz, H-6"), 4.37(1H, m, H-6"), 4.35(1H, d, J=7.8Hz, H-1"), 4.26(1H, dd, J=5.6Hz, H-2'), 3.92(1H, dd, J=2.4, 10.2Hz, H-1'), 3.57(1H, m, H-4"), 3.50(1H, t, J=1.2, 10.2Hz, H-1'), 3.42(1H, d, J=9.0Hz, H-3"), 3.39(1H, d, J=9.6Hz, H-5"), 3.29(1H, m, H-2"), 1.70(3H, s, H-5')

¹³C-NMR (125 MHz, MeOH-d₄+D2O, 하기 표 1 참조)

(2) 화합물 2

화합물 2는 노란색 분말이며 TLC에서 FeCl₃ 분무에 의해서 검정으로, 10％ H₂SO₄를 분무하고 가열시 연주황으로 나타났다. 분자식은 C₂₀H₂₆O₁₀로 이루어진 화합물로 Hhigh Resolution Negative LC MS 스펙트럼에서 m/z 425.1488[M-H]^- 에서 Molecular Ion Peak를 나타내었다(도 13 참조). ¹H-NMR 스펙트럼에서 δ 7.06(d, J=1.8Hz, H-2), 6.97(dd, J=1.8, 8.4Hz, H-6), 6.80(d, J=8.4Hz, H-5)에서 1개의 ABX type임이 나타나고, δ 6.30(d, J=15.6Hz, H-8), 7.58(d, J=15.6Hz, H-7)의 시그널은 트랜스 형태의 1개의 알켄임을 확인하여 카페오일기의 존재를 나타내었다. 한편, 4.32(d, J=7.8Hz, H-1"), 3.21(t, J=8.4, 9.0Hz, H-2"), 3.38(m, H-3"), 3.35(m, H-4"), 3.29(m, H-5"), 3.89(dd, J=1.8, 12.0Hz, H-6"), 3.69(dd, J=1.8, 12.0Hz, H-6")에서 글루코시드(glucoside)에 해당하는 시그널을 확인할 수 있었으며, 4.43(m, H-1'), 4.31(m, H-1'), 5.70(2H, s, H-3'), 4.61(2H, s, H-4'), 1.75(3H, s, H-5')에서 2개의 메틸렌, 2개의 메틴, 그리고 1개의 메틸기를 확인함으로써 1번 화합물과 유사하게, 글루코오스에 카페오일기와 헤미테르펜이 결합한 구조임을 추정하였다(도 14 참조).

¹³C-NMR 스펙트럼의 δ 167.6, 126.3, 113.8, 148.2, 145.8, 115.1, 123.5, 145.4, 113.4에서 카페오일기의 존재를 확인하였으며, 글루코오스에 해당하는 δ 101.8, 73.6, 76.6, 70.2, 76.6, 61.3의 시그널이 나타나고 나머지 5개의 탄소는 헤미테르펜의 δ 134.1, 121.6 (2 개의 메틸렌), δ 68.3, 68.3(2 개의 메틴) δ 12.8 (1 개의 메틸) 시그널을 확인하였다(도 15 참조). 또한 각각의 수소와 탄소는 1H-1H COSY와 HSQC, HMBC 스펙트럼을 통하여 귀속 시킬 수 있었다(도 16a 내지 도 16c 참조). 특히, 결합위치는 HMBC에서 카페오일기의 C-9 (δ 167.6)과 헤미테르펜의 H-4'(δ 4.61)에서 서로 상호관련피크(correlation peak)가 나타나며, 글루코오스 H-1"(δ 4.32)와 헤미테르펜 C-1'(δ 68.3) 사이에 상호관련피크(correlation peak)를 각각 확인함으로써, 화합물 1과는 다르게 화합물 2는 먼저 카페오일기가 헤미테르펜에 에스테르결합(C-9 ↔ H-4')하고 헤미테르펜이 글루코오스에 결합(C-1'↔ H-1")한 카페오일 헤미테르펜 글루코시드임을 확인하여, Rotundarpenoside B 라고 명명하였다.

[α]²⁰ _D : -19.2 (c=0.01, MeOH)

Negative FAB MS : m/z 425.1448[M-H]^-

¹H-NMR (600 MHz, MeOH-d ₄ +D₂O) : δ 7.58(1H, d, J=15.6Hz, H-7), 7.06(1H, d, J=1.8Hz, H-2), 6.97(1H, dd, J=1.8, 8.4Hz, H-6), 6.79(1H, d, J=8.4Hz, H-5), 6.30(1H, d, J=15.6Hz, H-8), 5.70(2H, s, H-3'), 4.61(2H, s, H-4'), 4.43(1H, m, H-1'), 4.31(1H, m, H-1'), 4.32(1H, d, J=7.8Hz, H-1″), 3.89(1H, dd, J=1.8, 12.0Hz, H-6″), 3.69(1H, dd, J=1.8, 12.0Hz, H-6″), 3.38(1H, m, H-3″), 3.35(1H, m, H-4″), 3.29(1H, m, H-5″), 3.21(1H, t, J=8.4, 9.0Hz, H-2″), 1.75(3H, s, H-5')

¹³C-NMR (125 MHz, MeOH-d ₄+D₂O, 하기 표 1 참조)

2. 항산화 실험 결과

(1) DPPH 를 이용한 자유라디칼 소거능 측정

DPPH법은 항산화 효과를 측정하는 대표적인 방법이다(39). DPPH는 분자내에 안정한 라디칼을 함유하지만 항산화활성이 있는 물질과 만나면 라디칼이 제거되는데 이때 DPPH의 흡광도의 변화를 측정하여 항산화 효과를 확인할 수 있다. DPPH는 이때 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 프리라디칼로서 시스틴(cystin), 글루타티온(glutathion)과 같은 황을 함유한 아미노산과 아스코르브산, BHA, BHT 등에 의해 환원되어 탈색되므로 이러한 색도의 변화를 통하여 다양한 천연 소재로부터 항산화 물질을 검색하는 데 많이 이용되고 있다(32). 먼나무(I. Rotunda) 잎 추출물과 이를 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피 분획하여 얻은 Fr1, Fr2, Fr3, Fr4, Fr5, Fr6로 자유 라디칼 소거능을 측정하였을 때 먼나무잎(I. Rotunda) 추출물 (IC₅₀ = 30.78 ± 0.51 ㎍/ml)가 양성 대조군인 L-아스코르브산(IC₅₀ = 8.86 ± 0.79 ㎍/ml)에 미치진 못하지만 자유 라디칼 억제능을 보였으며, 컬럼 크로마토그래피 분획한 Fr5 > Fr6 > Fr3 > Fr4 > Fr2 > Fr1 순으로 자유 라디칼 억제능을 확인할 수 있었다. 특히, Fr5 (IC₅₀ = 11.46 ± 0.87 ㎍/㎖)와 Fr6 (IC₅₀ = 12.27 ± 0.02 ㎍/㎖) 의 경우 양성 대조군인 L-아스코르브산(IC₅₀ = 7.94 ± 0.45 ㎍/ml)와 비교하였을 때 우수한 자유 라디칼 억제능을 보였다. 또한 유사한 자유 라디칼 소거능을 나타낸 Fr4로부터 분리된 화합물 1 및 2에 대하여 동일한 방법으로 DPPH를 실행하였다. 그 결과 화합물 1 (IC₅₀ = 47.43 ± 0.85 ㎍/ml), 화합물 2 (IC₅₀ = 48.33 ± 0.31 ㎍/㎖)가 양성 대조군인 L-아스코르브산(IC₅₀ = 9.77 ± 0.21 ㎍/ml)에 미치진 못하지만 자유 라디칼 억제능을 보였다(도 5 및 도 7 참조).

(2) NBT를 이용한 항산화능 측정

먼나무(I. Rotunda) 추출물과 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피 분획하여 얻은 Fr1, Fr2, Fr3, Fr4, Fr5, Fr6를 농도별 조제하여(125-1000㎍/㎖) 크산틴 산화효소 수퍼옥사이드 제거를 실험한 결과 Fr 5 (IC₅₀ = 12.12±0.84㎍/㎖) > Fr 6 (IC₅₀ = 12.53±0.32㎍/㎖) > Fr 3 (IC₅₀ = 12.76±0.93㎍/㎖) > Fr 4 (IC₅₀ = 13.34±0.10㎍/㎖) > Fr 2 (IC₅₀ = 15.12±1.42㎍/㎖) > 추출물 (IC₅₀ = 19.24±0.74㎍/㎖) > Fr 1(IC₅₀ = 34.62±1.54㎍/㎖)순으로 농도 의존적으로 활성을 나타내었고, 화합물 1과 2의 경우 화합물 2(IC₅₀ = 3.69±0.05㎍/㎖) > 화합물 1(IC₅₀ = 4.18±0.01㎍/㎖)순으로 양성대조군인 알로퓨리놀(IC₅₀ = 2.47±0.03㎍/㎖)과 비교하여 농도 의존적으로 우수한 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 7 및 도 8 참조).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims (4)

1. 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 헤미테르펜 글루코시드 화합물.
   [화학식 1]
   

   

   
   [화학식 2]
   

   

   
   
2. 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 헤미테르펜 글루코시드 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   [화학식 2]
   

   

   
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 항산화 화장품 조성물인 것을 특징으로 하는 항산화용 조성물.
   
4. 제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 항산화 기능성 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 항산화용 조성물.
   

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