KR101730135B1 - 케르세틴의 생물전환을 통한 람네틴의 제조방법 - Google Patents

케르세틴의 생물전환을 통한 람네틴의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 케르세틴의 생물전환을 통한 람네틴의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 S-아데노신-L-메티오닌(S-adenosine-L-methionine) 생성능을 가지는 미생물에 플라보노이드의 7-하이드록실 그룹(7-hydroxyl group)으로 메틸(methyl)을 전달하는 메틸전이효소(O-methyltransferase)를 코딩하는 SaOMT2 유전자가 도입되어 있는, 미생물 변이체를 이용하여 케르세틴(Quercetin)에서 람네틴(Rhamnetin)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, S-아데노신-L-메티오닌(S-adenosine-L-methionine) 생성능을 가지는 미생물에 플라보노이드의 7-하이드록실 그룹(7-hydroxyl group)으로 메틸(methyl)을 전달하는 메틸전이효소(O-methyltransferase)를 코딩하는 SaOMT2 유전자가 도입된 미생물 변이체를 이용하여 케르세틴으로부터 높은 전환율로 람네틴을 생산할 수 있다.

Description

케르세틴의 생물전환을 통한 람네틴의 제조방법{Method for Preparing Rhamnetin Using Biotransformation of Quercetin}
본 발명은 케르세틴의 생물전환을 통한 람네틴의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 S-아데노신-L-메티오닌(S-adenosine-L-methionine) 생성능을 가지는 미생물에 플라보노이드의 7-하이드록실 그룹(7-hydroxyl group)으로 메틸(methyl)을 전달하는 메틸전이효소(O-methyltransferase)를 코딩하는 SaOMT2 유전자가 도입되어 있는 미생물 변이체 및 이를 이용하여 케르세틴(Quercetin)에서 람네틴(Rhamnetin)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
플라보노이드는 다양한 식물에 존재하는 이차 대사산물이며, 이들 이차 대사산물들은 주변의 환경 조건이나 발달 단계에 의존적으로 식물의 조직이나 기관에 축적된다. 자연적으로 발생된 8000종 이상의 플라보노이드는 대부분 고등식물에서 발견되며(Harborne JB et al., Phytochemistry, 55:481-504, 2000; Ververidis F, et al., Biotechnol J, 2:12141234, 2007) 과일, 채소, 땅콩, 씨앗, 줄기, 꽃, 뿌리, 차, 와인, 커피 등의 식품에 널리 분포한다(Gattuso G et al., Molecules, 12:1641-1673, 2007). 플라보노이드는 항균, 항암, 항바이러스, 항알레르기 및 항염증 활성이 있고, 의약분야에서는 새로운 플라보노이드 물질이 추출됨에 따라 치료 대상 질환이 다양해졌다. 또한, 간질환, 당뇨병, 류마티스 관절염, 각종 암, 진통, 바이러스성 질환, 알레르기성 질환, 동맥경화 등 혈관계 질환, 심근 관련 질환, 스트레스 및 우울증 등에 약리활성이 있다는 것이 알려지면서 물질의 개발 및 활용에 관한 관심이 커지고 있다.
케르세틴은 암의 예방 및 항암치료 보조제로서 잘 알려져 있고(Spagnuolo C et al., Ann N Y Acad Sci, 1259:95-103, 2012; Mendoza EE et al., Mini Rev Med Chem, 11:1216-1221,2011), 신경보호 및 인지기능 개선 효과가 있으며, 면역체계를 유지시키고 히스타민의 방출과 염증반응을 조절하는 항염증, 항알레르기 효과 및 동맥경화를 막고 혈압을 감소시키는 효과가 보고되고 있다(Vasanthi HR et al., Curr Med Chem, 19:2242-2251, 2012; Larson AJ et al., Adv Nutr, 3:39-46, 2012; Pandey AK et al., Int Rev Neurobiol, 102:107-146, 2012; Cherniack EP, Be J Nutr, 108:794-800, 2012).
케르세틴은 플라보노이드계 화합물처럼 열에 대한 불안정성, 산화 조건에 대한 불안정성 및 물에 대한 불용성 등의 문제점이 있으나, 플라보노이드의 메틸화(Methoxylation)는 이러한 문제를 감소시키고 생물학적 이용성이 증가시키는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 발명자들은 메틸화된 7-하이드록시-8-메톡시플라본(7-hydroxy-8-methoxyflavone)이 메틸화되지 않은 형태의 7,8-디하이드록시프라본(7,8-dihydroxyflavone)과는 달리, 내피세포의 생존성에 영향을 주지 않는 범위에서 항산화 활성을 갖는다는 것을 알아내었고(Koirala N et al., J Biotech, 184:128-137, 2014a), 람네틴이 케르세틴에 비하여 향상된 생체이용률을 갖고 있으며, 20uM 농도로 처리하였을 때, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 세포살해를 케르세틴에 비해 더 잘 유도하는 것으로 밝혀졌다(Lee S et al., Bioorganic Med Chem Lett, 21:3866-3870, 2011).
람네틴은 자연적으로 발생한 7-O-methylated quercetin으로, 털갈매나무(Ozipek M et al., Phytochemistry, 37:249-253, 1994), 미나리과의 고수(Chaudhry NM et al., Pak J Pharm Sci, 19:214-218, 2006), 정향나무(Vosgen B et al., Z. Lebensm, Unters, Forsch, 170:204-207, 1980), 벚나무(Szabo ME et al., Invest Ophthalmol Vis Sci, 45:3727-32, 2004)에 존재하는 플라보노이드의 일종이다. 메틸화된 플라보노이드는 그 모체에 비하여 다양한 활성을 가진다고 알려져 있으며, 람네틴은 강한 항산화, 항염증(Jnawali HN et al., J Nat Prod, 77:258-263, 2014), 항암, 항콜레스테롤, 항박테리아(Igarashi K et al., Bioscience Biotechnol Biochem, 59:595601, 1995; Yamamoto N et al., Archieves of Biochemistry and Biophysics, 372:347-354, 1999), 멜라닌합성저해 활성을 갖으며, 베타 아밀로이드 형성을 억제한다고 알려져 있다(Kim BG et al., J Biotechnol, 126:241-247, 2005). 방사선 증감제로서의 람네틴의 작용은 폐암 세포주의 방사선 조사 요법에서, mir-34a 매개 경로를 통한 방사선 저항성 신호인 Notch-1이 유도되는 것을 방해함으로써 방사선 치료 효과를 향상시킨다(Kang J et al., J Biol Chem, 288:27343-27357, 2013).
람네틴이 의약시장에서의 잠재성을 주목받으며, 대량 생산 기술 개발이 요구되고 있으나, 식물이 람네틴의 자연적인 근원처 임에도 불구하고, 식물 추출법에 의한 대량 생산이나 조직배양, 화학합성법을 이용한 대량 생산은 아직 실용화되지 못하고 있다.
대장균(E. coli)이나 사카로마이세스(Saccharomyces) 등과 같은 미생물을 형질전환시켜 화합물을 생합성하는 방법이 연구되고 있으며(Lim EK et al., Biotechnol Bioeng, 87:623631, 2004; Trantas E et al., Metab Eng, 11:355-366, 2009), 람네틴 같은 대부분의 플라보놀은 퀘르시틴과 같은 기질의 생물전환에 의해서 생산될 수 있다. 위치선택적 7-O-메틸트랜스퍼레이즈(regioselective 7-O-trasferase)인 POMT7을 이용한 에피제닌(apigenin)과 케르세틴의 생물전환률은 90% 이상이며(Kim BG et al., J Biotechnol, 126:241-247, 2005), POMT7발현과 cofactor 생산의 최적조합을 통해 케르세틴의 생물전환방법으로 람네틴 생산량을 111mg/로 증가시켰다(Lee S et al., Bioorganic Med Chem Lett, 21:3866-3870, 2011).
그러나, 상기 선행기술에서 사용된 POMT7을 이용한 형질전환은 생성물의 구조 이성질체를 수반하는 비특이적인 방법으로 전환수율이 낮으며, 케르세틴의 전환수율 향상을 위해서 추가적으로 조효소(cofactor)를 필요로 하는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, S-아데노신-L-메티오닌(S-adenosine-L-methionine) 생성능을 가지는 미생물에 플라보노이드의 7-하이드록실 그룹(7-hydroxyl group)으로 메틸(methyl)을 전달하는 메틸전이효소(O-methyltransferase)를 코딩하는 SaOMT2 유전자가 도입된 미생물 변이체를 이용하면 케르세틴으로부터 높은 전환율로 람네틴을 생산할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 메틸전이효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 케르세틴에서 람네틴의 생산능을 가지는 미생물 변이체 및 상기 미생물 변이체를 이용한 케르세틴에서 람네틴을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 S-아데노신-L-메티오닌(S-adenosine-L-methionine) 생성능을 가지는 미생물에 플라보노이드의 7-하이드록실 그룹(7-hydroxyl group)으로 메틸(methyl)을 전달하는 메틸전이효소(O-methyltransferase)를 코딩하는 SaOMT2 유전자가 도입되어 케르세틴(Quercetin)에서 람네틴(Rhamnetin)의 생산능을 가지는 미생물 변이체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 미생물 변이체 배양액에 케르세틴을 첨가한 다음, 추가로 배양하는 것을 특징으로 하는 람네틴의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, S-아데노신-L-메티오닌(S-adenosine-L-methionine) 생성능을 가지는 미생물에 플라보노이드의 7-하이드록실 그룹(7-hydroxyl group)으로 메틸(methyl)을 전달하는 메틸전이효소(O-methyltransferase)를 코딩하는 SaOMT2 유전자가 도입된 미생물 변이체를 이용하여 케르세틴으로부터 높은 전환율로 람네틴을 생산할 수 있다.
도 1은 형질전환된 미생물 변이체내에서 람네틴을 생산하는 방법에 관한 모식도이다.
도 2는 생산된 람네틴을 (A)크로마토그래피 방법을 이용해 분석한 데이터와 (B)QTOF-ESI/MS 질량분석에 관한 데이터이다.
도 3은 생산된 람네틴의 1H NMR spectra, 13C NMR spectra, COSY spectra, ROSEY spectra, HMQC spectra 데이터이다.
도 4는 (A)케르세틴의 농도와 배양시간에 따른, (B)배지(LB, TB, 및 M9 배지)에 따른 람네틴의 생산량을 확인한 그래프이다.
도 5는 스케일 업(Scale-up) 시스템에서 람네틴의 생산량을 확인한 그래프이다.
도 6은 다양한 암세포주와 내피세포의 성장에 미치는 람네틴의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 멜라닌 합성과 멜라닌자극호른몬에 의해 자극된 B16F10 피부 흑색종 세포에서의 tyrosinase 활성에 미치는 람네틴의 영향을 나타낸 그래프이다.
본 발명에서는 SaOMT2 메틸전이효소 유전자를 미생물에 도입하여 추가적인 조효소의 과발현 없이 케르세틴으로부터 높은 전환율로 람네틴을 생산할 수 있는, 발효기 수준(fermentor scale)에서 93.5%의 전환효율을 갖는 미생물 변이체를 제작하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, S-아데노신-L-메티오닌(S-adenosine-L-methionine) 생성능을 가지는 미생물에 플라보노이드의 7-하이드록실 그룹(7-hydroxyl group)으로 메틸(methyl)을 전달하는 메틸전이효소(O-methyltransferase)를 코딩하는 SaOMT2 유전자가 도입되어 있는, 케르세틴(Quercetin)을 람네틴(Rhamnetin)으로 전환시킬 수 있는 미생물 변이체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 메틸전이효소(O-methyltransferase)인 SaOMT2는 S-아데닌-L-메티오닌 생합성 경로를 통해 생산된 S-아데닌-L-메티오닌을 이용하여 케르세틴을 람네틴으로 메틸화하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 대장균 변이체는 S-아데닌-L-메티오닌 생합성과 관련된 효소에 의해서 S-아데닌-L-메티오닌이 생성되고, 케르세틴을 첨가하여 반응하면 대장균 변이체 내에서 발현된 메틸전이효소는 상기에서 생성된 S-아데닌-L-메티오닌을 메틸공여체로 사용하여 케르세틴을 람네틴으로 전환시키는 과정을 거쳐 최종적으로 람네틴을 제조할 수 있다 (도 1).
본 발명의 대장균 변이체가 케르세틴에서 람네틴을 생산하는지 확인하기 위하여 대장균 변이체에 케르세틴을 첨가하여 반응시킨 후 HPLC를 이용하여 분석한 결과, 케르세틴의 표준물질 및 람네틴의 잔류 시간(tR)은 10.0분 및 11.4분으로 대장균 변이체와의 반응시간에 따라 케르세틴에서 람네틴으로 전환율이 증가하는 것을 확인하였다 (도 2A).
또한, 생산된 람네틴의 양적 확인을 위해, QTOF-ESI/MS 방법을 통해 분석한 결과, 분리된 화합물의 총 m/z값은 317로 대장균 변이체에 의해 케르세틴이 메틸화된 것을 확인하였다(도 2B).
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 미생물 변이체 배양액에 케르세틴을 첨가한 다음, 추가로 배양하는 것을 특징으로 하는 람네틴의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 대장균 변이체를 이용하여 케르세틴에서 람네틴의 전환수율을 높이기 위해 케르세틴을 100μM, 200μM, 500μM 및 1000μM으로 첨가하여 람네틴의 전환수율을 확인한 결과, 200μM의 케르세틴을 첨가하여 48시간 동안 반응하였을 때 175μM 농도의 람네틴이 생산되는 것을 확인하였다(도 4A). 또한, LB 배지, TB 배지 및 M9 배지를 이용하여 대장균 변이체를 배양하여 케르세틴을 반응시킨 결과, TB 배지에서 대장균 변이체를 배양하면서 케르세틴을 반응시킨 경우가 LB 배지 및 M9 배지보다 각각 1.07배 및 1.24배 높은 187μM의 람네틴을 생산하는 것을 확인하였다(도 4B).
본 발명에서 케르세틴에서 람네틴으로의 높은 전환수율을 보인 조건에서 대장균 변이체를 이용하여 3ℓ 발효조에서 케르세틴과 함께 반응시켰을 때, 케르세틴에서 람네틴으로의 전환수율을 확인한 결과, 200μM 농도의 케르세틴이 24시간 후에 약 98% (196uM, 61.94/L) 람네틴으로 전환되었고, 이 시점에서 200μM 농도의 케르세틴을 추가적으로 배양액에 첨가하여 다시 24시간 동안 반응한 결과, 최종적으로 374μM(118/L)의 람네틴으로 전환된 것을 확인할 수 있었다(도 5).
람네틴이 케르세틴에 비하여 향상된 생체이용률을 갖고 있으며, 20μM 농도로 처리하였을 때, 케르세틴보다 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 세포살해를 더 잘 유도하는 것으로 밝혀졌다(Lee S et al., Bioorganic Med Chem Lett, 21:3866-3870, 2011).
람네틴은 강한 항산화, 항염증(Jnawali HN et al., J Nat Prod, 77:258-263, 2014), 항암, 항콜레스테롤, 항박테리아(Igarashi K et al., Bioscience Biotechnol Biochem, 59:595601, 1995; Yamamoto N et al., Archieves of Biochemistry and Biophysics, 372:347-354, 1999), 멜라닌합성저해 활성 및 방사선 증감제로서의 작용(Kang J et al., J Biol Chem, 288:27343-27357, 2013) 등이 이미 보고되어 있는 바, 람네틴이 다양한 종류의 암세포 및 내피세포 증식을 억제하므로 암의 예방 또는 치료적 효과를 기대할 수 있다.
본 발명에 있어서, 암의 종류는 위암, 간암, 뇌종양, 피부암, 유방암, 폐암, 대장암 등 종래 알려져 있는 모든 종류의 암을 포괄한다. 또한 암의 예방 또는 치료라는 것은, 내피세포의 증식을 저해함으로써 암의 성장과 전이를 동시에 막을 수 있고, 더 나아가서는 암을 예방할 수 있음을 의미한다.
바람직하게는 상기 암은 위암, 간암, 흑색종, 교모세포종이나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 세포 성장 억제에 관한 실시예에서는 흑색종(B16F10), 위암(AGS), 간암(HepG2), 교모세포종(U87MG) 세포주 및 혈관내피세포(HUVECs)에 람네틴을 처리한 결과, 이들 세포 성장이 감소하는 것을 확인하였고, 또한, 람네틴의 모체인 케르세틴에 비해서 현저히 강한 억제효과를 나타내는 것도 확인하였다(도 6).
특히, 람네틴은 세포 성장 억제에 관한 실시예에서 행해진 여러 암세포주 가운데 AGS 위암 세포의 성장을 가장 효과적으로 억제하였다(IC50 values=3.66μM)(표 1). 이것은 람네틴이 위암치료를 위한 화학요법제로 개발될 가능성이 크다는 것을 의미한다.
본 발명의 또다른 실시예에서는 멜라닌합성 분석을 위한 플라보노이드들의 세포독성 가능성을 평가하고 세포 독성을 일으키지 않는 최적 농도를 결정하기 위해 트립판 블루 염색을 통해 세포생존을 측정한 결과, 20μM 농도의 플라보노이드를 72시간 동안 처리한 B16F10 세포들은 90% 이상의 생존률을 보이는 것을 확인하였다(도 7A).
멜라닌 합성에 관한 실시예는 세포 독성이 없는 플라보노이드의 농도인 5~20μM 농도 범위에서 진행하였다.
한편, 람네틴의 멜라닌 합성 억제 능력을 퀘르세틴과 비교하여 측정하기 위해서, B16F10 흑색종 세포에 멜라닌 세포 자극 호르몬을 처리하고 멜라닌 합성을 유도하여 각각의 억제 활성을 측정한 결과, 람네틴을 처리한 경우 멜라닌자극호르몬에 의해 유도된 멜라닌 합성이 람네틴의 농도에 따라 감소하였고, 케르세틴에 비하여 멜라닌 합성 저해 능력이 우수하다는 것을 확인하였다(도 7B).
멜라닌 색소는 멜라닌세포 내에 존재하는 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)이 티로시나제(tyrosinase)라는 효소와 작용함으로써 만들어진다. 티로시나제에 의해 산화되어 DOPA로 변하고, DOPA가 산화하여 최종적으로 흑갈색의 멜라닌을 만들어낸다.
본 발명의 또다른 실시예에서는 티로시나제에 의해 촉진된 L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine)의 산화 억제 정도로 람네틴과 케르세틴의 티로시나제 활성 억제 능력을 측정하였다. 그 결과, 케르세틴을 처리한 세포의 티로시나제 활성은 케르세틴의 농도에 따라 증가하는데 반해, 람네틴을 처리한 세포에서의 티로시나제 활성은 람네틴의 농도에 따라 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 7C). 이들 결과는 람네틴이 B16F10 세포에서 티로시나제 활성저해를 통해 멜라닌세포자극 호르몬에 의해 유도되는 멜라닌 합성을 억제한다는 것을 나타낸다.
이러한 결과들을 바탕으로 람네틴이 케르세틴보다 우수한 항암, 항신생혈관 및 미백(anti-melanogenic activity)작용을 갖는 암 예방 및 치료를 위한 후보 물질임을 확인하였다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 대장균 변이체의 제작 및 배양
(1) SaOMT2 유전자 발현벡터의 제작 및 이를 이용한 대장균 변이체 구축
NCBI에 등록된 SaOMT2(GenBank accession No. NP_823558) 유전자 염기 서열에 근거하여 서열번호 1/2의 프라이머 쌍을 제작하였고, 삽입한 제한효소는 BamHI(서열번호 1에서 이태릭 밑줄)과 EcoRI(서열번호 2에서 이태릭 밑줄)이며 프라이머의 염기 서열은 다음과 같다.
서열번호 1: 5＇- GGATCC GATGAGCTGCCGCACCGGCA-3＇
서열번호 2: 5＇- GAATTC TCAGCCAACCGCGCGCAGTTCGA-3＇
SaOMT2 유전자는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR법으로 증폭시킨 후, pRSFDuet-1(Novagen)벡터의 MCS(restriction site BamHI/EcoRI)로 클로닝하여 SaOMT2 유전자 발현벡터를 제작하였다.
상기에서 제작된 벡터는 BLAST(Basic local alignment search tool) 및 CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw)를 사용하여 염기서열을 분석하였고, 확인한 벡터는 대장균에 도입하여 대장균 변이체를 구축하였다.
(2) 대장균 변이체를 이용한 케르세틴에서 람네틴을 생산
본 발명에 따른 대장균 변이체를 이용하여 케르세틴에서 람네틴을 생산하기 위한 최적반응 조건을 확립하기 위해, 대장균 변이체는 항생제를 포함하는 LB 액상 배지 3㎖에 접종시킨 후, 하룻밤 동안 37℃, 220rpm에서 배양하였다. 배양된 미생물 변이체 200㎕를 취해 항생제를 포함하는 LB 액상 배지 50㎖에 접종한 후, OD600값이 0.6에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 최종 농도가 0.5mM이 되도록 IPTG(isopropyl--D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고 20℃에서 3시간동안 배양하였다. 케르세틴은 20% DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해하고, 생물전환반응의 최적조건을 확인하기 위하여 다양한 농도로 넣은 후 20℃에서 60시간동안 220rpm으로 진탕반응하였다. 반응하는 동안 12시간마다 500㎕를 취하여 두배 부피의 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 처리한 후 용매를 증발시키기 위해 건조시켜서 농축하였다. 농축된 물질은 500㎕의 메탄올에 용해시켜 크로마토그래피 분석에 사용하였다.
케르세틴을 100μM, 200μM, 500μM 및 1000μM으로 첨가하여 람네틴의 전환수율을 확인한 결과, 200μM의 케르세틴을 첨가하여 48시간 동안 반응하였을 때 175μM 농도의 람네틴이 생산되는 것을 확인하였고(도 4A), LB 배지, TB 배지 및 M9 배지를 이용하여 대장균 변이체를 배양하여 케르세틴을 반응시킨 결과, TB 배지에서 대장균 변이체를 배양하면서 케르세틴을 반응시킨 경우가 LB 배지 및 M9 배지보다 각각 1.07배 및 1.24배 높은 187μM의 람네틴이 생산된 것을 확인하였다(도 4B).
(3) 발효조를 이용한 스케일업(Scale-up) 시스템에서 케르세틴에서 람네틴의 제조
발효는 5ℓ 부피의 용기가 장착된 BioTron(BioTron Ltd., Incheon, suto-gwon, South Korea) 장비에서 3ℓ 부피로 실시하였다. 온도, pH, 회전자 속도는 각각 25℃, 7.5, 400rpm으로 지속적으로 유지하였다. SaOMT2 유전자를 포함한 벡터로 형질전환된 대장균(E.coli)은 3%(w/v) 글루코스를 포함한 TB 배지에서 케르세틴을 람네틴으로 생물전환시키는데 사용하였다. 실시예를 진행하는 동안 용존 산소는 70% 이상으로 유지하였다. 배양된 대장균은 파장 600nm에서 흡광도가 5가 되었을 때, L-lactose의 최종농도가 0.15M이 되도록 첨가해 주고, D-글루코스는 세포의 밀도와 성장을 높게 유지하기 위하여 매 시간마다 넣어 주었다(Koirala N et al., J Biotech, 184:128-137, 2014a; Koirala N et al., J Ind Microbiol Biotechnol (article in press)).
케르세틴을 첨가하고 6시간 간격으로 배양 배지를 수확하여 HPLC 분석을 통해 케르세틴의 생물전환을 확인하였다. 200μM 케르세틴이 배양액에 첨가되었을 때, 24시간 반응 동안 기질의 약 98%가 람네틴으로 전환되었다. 반응한지 24시간 시점에서 200μM 케르세틴을 추가적으로 배양액에 첨가하였다. 반응 48시간 후에 374μM(118/L)의 람네틴이 생산되었고, 이후의 반응시간에서는 더 이상의 생산량의 증가가 없었다(도 5). 상등액에 에틸아세테이트를 첨가하여 추출, 건조 후, 메탄올에 녹여 HPLC 분석을 통하여 람네틴을 분리하였다.
실시예 2: 람네틴의 정제 및 분석
(1) HPLC 및 QTOF-ESI/MS를 이용한 람네틴의 정제 및 분석
실시예 1에서 대장균 변이체를 이용하여 제조된 람네틴은 preparative HPLC에 의해서 정제되고, UV 검출기(254㎚)가 연결된 역상 C18컬럼(Mightysil RP-18 GP, 250 x 4.6㎜, kanto chemical, Japan)을 이용하는 HPLC-PDA (high-performance liquid chromatography coupled with photo diode array, shimadzu, Japan; SPD-M20A Detector)로 검출, 분석 및 정량하였다. HPLC를 이용하여 분석한 결과, 케르세틴의 표준물질 및 람네틴의 잔류 시간(tR)은 10.0분 및 11.4분으로 대장균 변이체의 반응시간에 따라 케르세틴에서 람네틴으로 전환율이 증가하는 것을 확인하였다(도 2A).
또한, 생산된 람네틴의 양적 확인을 위해, QTOF-ESI/MS [ACQUITY(UPLC, Waters Corp., USA)-SYNAPT G2-S(Waters Corp., USA)] 방법을 통해 분석한 결과, 분리된 화합물의 총 m/z값은 317로 대장균 변이체에 의해 케르세틴이 메틸화된 것을 확인하였다(도 2B).
람네틴의 정제는 ACN 20% (0-5분), 40%(5-10분), 40%(10-15분), 90%(15-25분), 90%(25-30분) 및 10%(30-35분)을 유속 10㎖/min으로 진행하는 36분 binary 프로그램을 이용하는 UV 검출기(270㎚)가 연결된 C18컬럼(Mightysil RP-18 GP, 250 x 4.6㎜ , kanto chemical, Japan)을 사용하는 preparative HPLC에 의해서 수행되었다.
(2) 람네틴의 구조 분석
NMR spectra는 brunker Advance 800 instrument (800 MHz)에 쓰이는 DMSO-d6 용매(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 분리하였다. 대사체의 구조들은 MestReNova 8 program(Mestrelab Research S.L., Feliciano Barrera 9B-Bajo, Santiago de Compostela, Spain)을 이용하여 추출하였다. 람네틴의 구조는 1H, 13C, COSEY, NOSEY, ROSEY 및 HMQC 스펙트로스코피(spectoscopy)에 의해서 추출하였다(도 3). 생산된 람네틴의 1H 및 13C NMR spectra는 전체적으로 케르세틴의 1H 및 13C NMR spectra 결과와 유사하였으나, aromatic region에서의 화학적 이동이 변화되었고, 3.85 ppm에서 새로운 신호가 확인되었다. HMQC spectra에서 메톡시 양성자(methoxy proton)들은 탄소 피크에 직접 연결되어 있기 때문에 새로운 양성자 피크들은 메톡시 양성자들을 나타내고 있는 것이다.
1H NMR (DMSO-d6)7.71 (H-2), 7.58 (H-6), 6.89 (H-5), 6.68 (H-8), 6.33 (H-6), 3.85 (MeO-7); 13C NMR (DMSO-d6)176.40 (C-4), 165.34 (C-7), 160.80 (C-5), 156.51 (C-9), 148.28 (C-4), 147.73 (C-2), 145.53 (C-3), 136.47 (C-3), 122.31 (C-6), 120.49 (C-1), 116.02 (C-5), 115.67 (C-2), 104.45 (C-10), 97.91 (C-6), 92.35 (C-8), 56.48 (MeO-7). 이 결과들에 의해서 본 발명의 제조방법으로 케르세틴의 생물전환반응으로 생긴 결과물이 람네틴이라는 것을 확인하였다.
실시예 3: 람네틴의 효능 분석
본 실시예에서 람네틴의 암 관련 화학요법제로서의 약학적 잠재성을 확인하기 위한 생물학적 활성 효과를 평가하기 위하여 인간의 피부 흑색종, 위암, 간암, 뇌암 세포 및 내피세포를 사용하였고, 람네틴의 모체이며, 현재 암의 예방 및 항암치료 보조제로서 잘 알려져 있는 케르세틴을 비교물질로 하여 세포 증식, 멜라닌합성, 티로시나제 활성에 미치는 람네틴의 효과를 평가하였다.
사람의 제대정맥내피세포(HUVECs)는 계대가 4번에서 8번사이로 이루어진 것을 이용하였으며, 10% FBS(Fetal bovine serum, Invitrogen, Grand Island, NY, USA)를 첨가한 EGM2(Endothelial growth medium-2, Lonza, Walkersville, MD, USA) 배지에서 배양하였다. B16F10(흑색종)과 HepG2(간암) 세포들은 10% FBS를 첨가한 DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium, Invitrogen) 배지에서 배양하였다. AGS(위암)와 U87MG(교모세포종) 세포들은 각각 10% FBS를 첨가한 RPMI 1640(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)와 MEM(minimum essential medium, Invitrogen, NY, USA) 배지에서 배양하였다. 모든 세포들은 5% CO2 가습 배양기에서 37℃로 유지하였다.
(1) 세포성장 분석
세포성장 분석를 위해서, 세포들은 96칸 배양접시(SPL Lifesciences, Gyeonggi, Korea) 한 칸당 2 x 103 세포들을 옮긴 후, 72시간 동안 퀘르세틴과 람네틴을 각각 1~100μM의 다양한 농도로 세포에 처리하였다. 세포 성장은 MTT 분석법(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide colorimetric assay)으로 측정하였다. MTT 분석법은 세포내에 존재하는 산화환원효소에 의해 tetrazolium 계열의 발색 시약이 노란색에서 보라색으로 변하는 정도를 흡광도로 측정하여 세포의 성장을 측정하는 방법이다. 도 6에서 나타난 바와 같이, 람네틴은 각 세포주에서 다른 범위의 세포성장 저해 범위를 가지고 모든 세포주에서 세포증식을 억제하였다. 특히, 람네틴은 케르세틴에 비해 암세포주(B16F10, AGS, HepG2, U87MG)와 사람의 제대정맥내피세포(HUVECs) 성장을 저해하는 특성이 우수하였다. 이것은 람네틴이 케르세틴에 비해 항암제 및 항신생혈관제로서 잠재력이 크다는 것을 의미한다. 더불어, 표 1에 나타난 바와 같이 람네틴은 실시예에서 행해진 여러 암세포주 가운데 AGS 위암 세포의 성장을 가장 효과적으로 억제하였다(IC50 values=3.66μM). IC50(half maximal inhibitory concentration)은 특정한 생물학적 또는 생화학적 기능을 저해하는 물질의 효능을 나타내는 것으로, 특정 약물이나 물질이 주어진 생물학적 과정을 절반으로 억제하는데 필요한 양을 나타낸다.
Figure 112014099048111-pat00001

(2) 멜라닌 합성 분석
람네틴의 멜라닌 합성 억제 능력을 케르세틴과 비교하여 측정하기 위해서, B16F10 흑색종 세포에 멜라닌 세포 자극 호르몬을 처리하고 멜라닌 합성을 유도하여 각각의 억제 활성을 측정하였다. 멜라닌합성 분석을 위한 플라보노이드들의 세포독성 가능성을 평가하고 세포 독성을 일으키지 않는 최적 농도를 결정하기 위해 트립판 블루 염색을 통해 세포생존을 측정하였다. 12칸 배양접시 한 칸당 1 x 105 세포들을 옮긴 후, 케르세틴과 람네틴을 각각 0~40μM 농도로 첨가하여 72시간까지 배양하였다. 72시간 후, 세포들을 트립판 블루로 염색하고 혈구세포측정기를 이용하여 살아있는 세포의 수를 세었다. 도 7A에 나타난 바와 같이, 20μM 농도의 플라보노이드를 72시간 동안 처리한 B16F10 세포들은 90% 이상의 생존률을 보였다. 이 결과를 바탕으로, 멜라닌 합성에 관한 실시예는 세포 독성이 없는 플라보노이드의 농도인 5~20μM 농도 범위에서 진행하였다. 람네틴과 케르세틴은 각각 0~20μM의 다양한 농도로 72시간동안 B16F10 흑색종 세포에 처리한 후, 200nM의 멜라닌세포자극 호르몬(α-MSH, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 이들 세포를 자극하거나 자극하지 않았다. PBS로 헹구어낸 세포들은 수확하여 80℃에서 1시간동안 1N NaOH에 용해하였다. 상대적인 멜라닌 함량은 ELISA plate reader를 이용하여 405㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 도 5B에 나타난 바와 같이, 람네틴을 처리한 경우 멜라닌자극호르몬에 의해 유도된 멜라닌 합성이 람네틴의 농도에 따라 감소하였고, 케르세틴에 비하여 멜라닌 합성 저해 능력이 우수하였다.
(3) Tyrosinase 활성 분석
티로시나제 활성 억제 능력은 티로시나제에 의해 촉진된 L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine)의 산화 억제 정도로 결정하였다. 람네틴과 케르세틴은 각각 0~20μM의 다양한 농도로 72시간동안 B16F10 흑색종 세포에 처리한 후, 200nM의 멜라닌세포자극 호르몬(α-MSH, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 이들 세포를 자극하거나 자극하지 않았다. 차가운 PBS로 헹구고 세포용해완충액(0.1M sodium phosphate (pH6.8), 1% Triton X-100, protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)포함)으로 처리하였다. 세포 용해물은 4℃에서 12,000 x g 속도로 20분 동안 원심분리하고, 상층액은 모아 두었다. 단백질 양을 측정하고, 100㎕의 상층액은 L-DOPA 용액(100㎕, 2㎎/㎖ in 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8), Sigma-Aldrich)과 섞은 후 37℃에서 30분간 정체하였다. ELISA plate reader를 이용하여 475㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 도 7C에 나타난 바와 같이, 케르세틴을 처리한 세포의 tyrosinase 활성은 케르세틴의 농도에 따라 증가하는데 반해, 람네틴을 처리한 세포에서의 tyrosinase 활성은 현저히 감소하였다. 이들 결과는 람네틴이 B16F10 세포에서 tyrosinase 활성저해를 통해 멜라닌세포자극 호르몬에 의해 유도되는 멜라닌 합성을 억제한다는 것을 나타낸다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Sun Moon University <120> Method for Preparing Rhamnetin Using Biotransformation of Quercetin <130> P14-B269 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SaOMT F <400> 1 ggatccgatg agctgccgca ccggca 26 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SaOMT R <400> 2 gaattctcag ccaaccgcgc gcagttcga 29

Claims (3)

  1. S-아데노신-L-메티오닌(S-adenosine-L-methionine) 생성능을 가지는 미생물에 플라보노이드의 7-하이드록실 그룹(7-hydroxyl group)으로 메틸(methyl)을 전달하는 메틸전이효소(O-methyltransferase)를 코딩하는 SaOMT2 유전자가 도입되어 있는, 케르세틴(Quercetin)을 람네틴(Rhamnetin)으로 전환시킬 수 있는 미생물 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는 미생물 변이체.
  3. 제1항 또는 제2항의 미생물 변이체 배양액에 케르세틴을 첨가한 다음, 추가로 배양하는 것을 특징으로 하는 람네틴의 제조방법.




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