CN114796526B - 一种仿生双特异性纳米编辑系统及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种仿生双特异性纳米编辑系统及其用途，所述系统包括(a)聚双硫阳离子高分子材料(PD)能够复合编码Cas9或CasRx的质粒DNA(P)；(b)巨噬细胞膜包被于PD/P复合物，组成仿生纳米粒子，靶向炎症病灶部位；(c)质粒系统由肝特异性启动子启动下游基因表达，具有在肝脏组织高度表达的特性。本发明所述系统可制备药物靶向性将此纳米编辑系统递送至肝脏炎症性部位，在肝实质细胞特异性启动下游编辑性基因例如Cas9或CasRx的表达，发挥基因编辑或RNA编辑效果，从而下降疾病相关基因的表达水平，达到精准预防或治疗炎症性肝脏类疾病的目的。本发明能降低脱靶风险，提高全身治疗的安全性。

Description

一种仿生双特异性纳米编辑系统及其用途
技术领域
本发明涉及药物化学、合成生物学、药剂学等领域，具体涉及一种仿生双特异性的纳米编辑系统及其用途，该系统可制备药物靶向性将此纳米编辑系统递送至肝脏炎症性部位，在肝实质细胞特异性启动下游编辑性基因例如Cas9或CasRx的表达，从而下降疾病相关基因的表达水平，达到精准预防或治疗炎症性肝脏类疾病的目的，降低脱靶风险，提高全身治疗的安全性。
背景技术
来自细菌的成簇、规则间隔、短回文重复序列(CRISPR)/相关蛋白(Cas)的RNA引导的核酸内切酶基因组工程的编辑工具，具有简便、成本低、和高效性的优点，可以高度特异性地编辑基因组。目前，CRISPR/Cas系统在医学、农学、生物学等领域已得到广泛应用。基于CRISPR-Cas9的基因编辑系统可在单向导RNA(sgRNA)的引导下切割目标基因组位点以诱导DNA双链断裂(DSBs)，碱基的插入和缺失(indels)的产生会导致移码或基因突变，从而下调基因表达。尽管CRISPR/Cas9系统已成为治疗肝脏性疾病的潜在治疗选择，但缺乏能够有效介导基因组编辑器靶向递送的载体仍然是临床转化的主要挑战。因此，开发用于治疗肝脏性疾病的基因组编辑器的递送载体是目前的研究热点。除CRISPR/Cas9，CasRx(也称为RfxCas13d)是靶向RNA的Cas13家族的成员，是一种很有前景的RNA编辑工具，可以高效特异性地敲低RNA转录本。CasRx是一种RNA引导的RNA靶向工具，对RNA转录物表现出有限的脱靶效应，其作用于RNA，具有可逆性及安全性。目前已有文献证明，其可在体外和体内特异性高效地降低RNA水平，具备强大的敲低性能及安全性。CasRx是一种有吸引力的肝脏代谢调节治疗策略，在降低RNA水平的基因表达方面起到关键作用。然而，对于Cas9和CasRx编辑器，病毒或非病毒载体的体内递送不可避免地会在全身给药时出现非特异性分布，导致在非靶向器官和组织中积累。因此，这些非靶器官中的不必要的基因表达可能会导致难以预测的基因毒性和严重的副作用，设计一个精确的编辑系统来解决脱靶编辑的关键问题，以避免从在转化上任何潜在的临床后果至关重要。
启动子对控制治疗基因的表达至关重要。组织特异性启动子是一种仅在特定细胞类型或组织中具有活性的启动子，其可有效地限制基因在其他正常部位的不必要的表达。以肝脏特异性的启动子控制基因编辑元件仅在病变部位也就是肝脏部位表达，组成组织特异性的基因编辑系统，可以防止基因在非靶器官的编辑，大大提高治疗的特异性、准确性和安全性。肝脏特异性表达基因编辑工具已被报道用于肝脏疾病的治疗，例如苯丙酮尿症和鸟氨酸转甲酰基酶缺乏症。肝特异性启动子由肝细胞特异性顺式调节模块(HS-CRM8)和最小转甲状腺素(TTRmin)启动子组成，以肝细胞特异性方式高水平表达，在其他组织或细胞中低表达或不表达。尽管靶向性载体由于炎症趋向性可蓄积在肝脏部位，但是对于非特异性摄取的非肝细胞来说，所产生的编辑效果是不必要的，因此设计肝特异性表达的基因编辑元件来规避以上问题。然而，CasRx用于转录组工程的组织特异性表达系统尚未见报道。在炎症靶向性载体的构建方面，仍存有一些待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种仿生双特异性纳米编辑系统，是一种可精确预防或治疗炎症性肝脏类疾病的仿生双特异性纳米编辑元件。所述的仿生双特异性纳米编辑系统包括：(a)聚双硫阳离子聚合物(PD)，其能够复合编码Cas9或CasRx的质粒DNA(P)，形成PD/P纳米粒子；(b)一层涂覆在PD/P纳米粒子上的仿生巨噬细胞膜，形成膜包被的纳米粒子PD/P@M，可炎症趋向性靶向递送PD/P纳米粒子(PD/Cas9或PD/CasRx复合物)至炎症性肝脏病灶部位；(c)一种能够肝特异性表达的编码Cas9或CasRx质粒，表达局限于肝脏部位。
所述的聚双硫阳离子聚合物(PD)是含有二亚乙基三胺和胍基配体的双组份共聚物，其结构如式1所示：
所述的聚双硫阳离子聚合物(PD)，与编码可肝脏特异性启动子的Cas9序列或CasRx序列的质粒形成PD/P纳米粒子。
所述的涂在PPD/P纳米粒子的仿生巨噬细胞膜通过液氮处理及反复挤压从RAW264.7细胞中获得。膜包被的PD/P纳米粒子(PD/P@M)用于基因编辑元件的靶向递送。
在所述的仿生双特异性纳米编辑系统及其肝脏疾病的精准治疗策略中，肝特异性启动子主要是由肝细胞特异性顺式调节模块(HS-CRM8)和最小转甲状腺素(TTRmin)启动子组成，以肝细胞特异性方式高水平表达，通过酶切酶连分子生物学手段替换原有质粒上的通用型启动子CMV，使得基因编辑元件局限于肝脏部位表达并发挥作用，减少不必要的非靶器官编辑与基因毒性。
在一些实施方式中，其中所述的聚双硫阳离子聚合物PD与质粒DNA(P)以氮磷比(N/P)为0.2:1、0.4:1、0.8:1、1.0:1、2.0:1或4.0:1复合形成一系列的PD/P纳米粒子，其中PD具体为含胍基的双硫主链的阳离子高分子材料，质粒DNA(P)为编码Cas9的质粒DNA，最佳氮磷比(N/P)为2.0:1，N/P值计算为PD中带正电荷的胺与P(质粒DNA)中带负电荷的磷酸基团的比率。
在一些实施方式中，其中所述的仿生巨噬细胞膜与PD/P纳米粒子的质量比为1:1，其中PD具体为含有二亚乙基三胺和胍基配体的双组份共聚物，其结构如式(1)所示。质粒DNA(P)编码Cas9或CasRx，序列如SEQ ID No.1-2所示。孵育后通过挤压器反复挤压后形成膜包被的纳米复合物，即PD/P@M。
在一些实施方式中，其中所述的肝脏特异性启动子是肝细胞特异性顺式调节模块(HS-CRM8)和最小转甲状腺素(TTRmin)启动子组成，通过特异性的酶切位点将肝脏特异性启动子序列连接到编码Cas9或CasRx的质粒中，构建肝特异性启动子驱动的基因编辑质粒。
本发明的再一个目的是提供上述仿生双特异性纳米编辑系统在制备预防或治疗炎症性肝脏疾病药物中的应用。
本发明的仿生双特异性纳米编辑系统全身给药后能将Cas9或CasRx质粒炎症性靶向递送到肝脏部位的炎症病变部位中，通过肝脏特异性启动子驱动以特异性在肝脏部位稳定表达Cas9或CasRx，进行肝脏炎症病变部位的基因编辑或RNA编辑，避免其他可能存在的炎症部位的编辑。我们在此提出了仿生双特异性纳米编辑系统，该系统结合了炎症靶向递送和Cas9或CasRx的肝脏体内的特异性表达。此仿生双特异性纳米编辑系统设计如下。首先聚双硫阳离子聚合物(PD)是一种可以有效压缩并复合带负电的核酸阳离子聚合物，可有效递送肝脏特异性启动子驱动的Cas9或CasRx质粒，形成PD/P复合物。其中，肝脏特异性启动子通过分子克隆手段插入质粒中，构建肝特异性表达的基因编辑元件。随后，仿生巨噬细胞膜涂覆在PD/P的纳米复合物表面形成PD/P@M，以实现Cas9或CasRx靶向递送至炎症病变的肝脏部位。在PD/P@M系统性全身给药后，仿生巨噬细胞膜可以将PD/P引导聚集在炎症病灶，在肝脏部位特异性表达，所表达的基因编辑元件可通过靶向切割或下调疾病相关基因达到预防或治疗效果，避免在一些炎症性非肝脏部位的非靶部位切割，降低基因毒性，增加治疗的安全性与有效性。这样的仿生双特异性纳米编辑系统可作为一个有吸引力的平台，用于有效递送和特异表达基因编辑元件，用于体内精确的基因组编辑或RNA编辑。
本发明设计了一种仿生双特异性纳米编辑系统，可作为精准炎症性肝脏部位的靶向递送制剂。一方面，利用巨噬细胞天然的炎症趋向能力，以细胞膜涂层的纳米技术为基础，制备出仿生的纳米颗粒PD/P@M。这样的仿生纳米颗粒一方面可有效负载治疗性基因编辑质粒，将其递送至细胞内发挥作用。另一方面可利用天然巨噬细胞膜的表面涂层，具备炎症细胞的靶向能力，将其内核PD/P导向至炎症部位，聚集在肝脏病灶部位。其中，PD是一种聚二硫阳离子聚合物，具有较好的转染能力与生物相容性，可有效介导质粒等负电性核酸的转导，有效发挥基因编辑或RNA编辑作用。
研究表明，利用肝脏特异性启动子驱动的基因编辑系统可在肝脏的病变部位实现精准高效的表达，规避了非靶组织部位的不必要的基因编辑问题，降低脱靶作用，提高系统性给药治疗的安全性。但基因编辑元件在肝脏部位的聚集仍具有一定问题亟待解决。基因编辑元件主要的递送载体为病毒载体与非病毒载体，非病毒载体具良好的生物安全性和高效性，可有效避免病毒载体所存在的安全隐患，但如何提高非病毒载体在全身给药的靶向性仍是现在的科学研究热点。仿生化的巨噬细胞膜包被的纳米载体具有良好的炎症趋向性，可将载体引导至炎症部位聚集，达到炎症靶向性效果。针对炎症性肝脏疾病，一方面利用载体本身具有的炎症靶向性能，将负载的基因编辑元件传递至炎症性的肝脏部位，达到肝脏特异性递送的效果。另一方面，基因编辑元件被递送至肝脏部位后，在肝脏特异性启动子的驱动下，可减少在非肝细胞的表达与编辑，实现肝脏特异性编辑。因此，构建具有肝脏炎症靶向性的可高效负载基因编辑工具的非病毒载体与肝脏特异性表达的基因编辑或RNA编辑元件的仿生双特异性纳米编辑系统是本发明的关键性问题。
本发明发现巨噬细胞膜包被的纳米复合物趋向炎症性部位，在炎症性的肝脏疾病中，虽然有时伴有感染、肾衰竭等并发症，导致部分基因组编辑器在非靶器官或者组织中积累，但质粒含有的肝特异性启动子可避免在这些在非靶部位的编辑器的表达，从而避免不必要的基因编辑或RNA编辑，减少基因毒性及一些不必要的副作用。目前。针对肝特异性的基因编辑质粒，已有文献报道将其用于肝脏遗传性代谢疾病的治疗，例如：苯丙酮尿症、血友病等。通过肝细胞特异性顺式调节模块(HS-CRM8)和最小的转甲状腺素(TTRmin)启动子，构建肝特异性P3启动子，肝实质细胞中表达较高的转录因子可结合启动子上游的顺式作用元件的识别序列上，通过多个转录因子的协同作用，在肝脏中高表达，在非靶部位低表达或不表达。在目前的研究中，肝特异性的启动子驱动的基因组编辑或RNA编辑可在仿生双特异性的纳米编辑系统中起到肝特异性表达的作用，显著减少在非靶部位的非特异性编辑，提高治疗的安全性，降低毒副作用。
本发明设计的仿生双特异性纳米编辑系统集成了基因编辑或RNA编辑的炎症靶向传递和肝特异性启动表达，为炎症性肝脏疾病提供了精确的，特定于靶器官的预防或治疗性编辑手段。这样的系统可以避免在非靶组织或器官的不必要编辑，降低基因毒性，提高治疗安全性。仿生双特异性纳米编辑系统主要针对炎症性的肝脏疾病，可以通过设计不同的靶向位点，下调疾病相关基因的表达，达到预防或治疗肝脏类炎症疾病的目的。例如：肝缺血再灌注，肝纤维化或肝衰竭等。总体而言，所设计的仿生双特异性纳米编辑系统为CRISPR为基础的基因编辑或RNA编辑的应用提供了新的设计方案，用于精确、安全高效的基因治疗方案，提供炎症性肝脏疾病的预防或治疗手段。
附图说明
图1是仿生双特异性纳米编辑系统中聚双硫阳离子聚合物PD的化学结构，聚双硫阳离子聚合物PD/质粒纳米复合物(PD/P)和包被聚双硫阳离子聚合物PD/质粒纳米复合物形成膜包被的复合物(PD/P@M)的形态和尺寸分布。
图2是仿生双特异性纳米编辑系统中聚双硫阳离子聚合物PD/质粒纳米复合物(PD/P)和包被聚双硫阳离子聚合物PD/质粒纳米复合物形成膜包被的复合物(PD/P@M)的zeta电位分析。
图3是仿生双特异性纳米编辑系统中巨噬细胞膜M、PD/P和PD/P@M的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。
图4是仿生双特异性纳米编辑系统中PD/P、PD/P@M和M的细胞膜蛋白的蛋白质印迹分析。
图5是肝特异性启动子在CRISPR为基础的质粒中，在不同器官来源的体外细胞中转染后T7E1切割图。
图6是通过尾静脉注射PD/P@M复合物到小鼠体内一定时间，小鼠活体成像后，体内荧光素的表达，其中质粒含有编码荧光素报告基因。
图7是PD介导的肝特异性表达的Cas9质粒即复合物PD/PCas9转染AML12细胞后，在Alox12和Fas基因座的T7E1插入缺失分析，mRNA表达变化，WB结果和深度测序结果。
图8是PD介导的肝特异性表达的CasRx质粒即复合物PD/PCasRx转染AML12细胞后，Alox12和Fas的mRNA表达情况和WB结果。
图9是PD/PCas9@M复合物在预防肝缺血而再灌注损伤的模型小鼠体内的Alox12基因座的插入缺失分析和PD/P@M给药后Alox12的蛋白及凋亡相关蛋白表达变化结果。
图10是PD/P@M复合物作用于缺血而再灌注损伤小鼠后肝脏切片的H&E和免疫荧光染色分析。
图11是PD/P@M复合物作用于缺血而再灌注损伤小鼠后AST、ALT及炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的含量。
图12是PD/P@M复合物作用于ConA诱导的肝衰竭小鼠模型后Fas基因座的插入缺失分析，mRNA水平变化和PD/P@M给药后Fas的蛋白表达变化结果。
图13是PD/P@M复合物作用于ConA诱导的肝衰竭小鼠模型后的预防效果的评价，包括小鼠肝脏图片，H&E肝脏切片，生存曲线，血清中AST和ALT含量。
图14是PD/P@M复合物作用于ConA诱导的肝纤维化小鼠模型后的Fas基因座的插入缺失分析，mRNA水平变化和PD/P@M给药后Fas的蛋白表达变化结果。
图15是PD/P@M复合物作用于ConA诱导的肝纤维化小鼠模型后的治疗效果评价，包括肝脏切片的α-SMA染色、天狼星红染色和马松染色，血清中TNF-α和前胶原三肽含量及肝脏组织中羟脯氨酸含量。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明做进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：仿生双特异性纳米编辑系统的制备和形态学表征
制备方法：
聚双硫阳离子聚合物PD的合成：硫辛酸(4.12g,20mmol)和CDI(4.28g,26.4mmol)溶解在干燥的DCM(100ml)中，滴加到溶解在无水DCM(30ml)中的二亚乙基三胺2(DET,16g,155mmol)的溶液中。将反应混合物在0℃搅拌1小时并在室温下恢复1小时。盐水(3×100ml)用于洗涤终端产品。有机层干燥浓缩后得到含有二亚乙基三胺的单体1(1.9g，50％)。随后合成含有胍基的单体2，其具体为在无水DMF(50ml)中加入硫辛酸(4.12g,20mmol)和CDI(3.24g,20mmol)，然后在室温下搅拌温度2h。将上述混合物加入到甲基L-精氨酸甲酯二盐酸盐(2.61g，10mmol)和DIEA(1.74μl，10mmol)在无水DMF(40ml)溶液中，然后在室温下搅拌3.5小时。将该混合溶液滴加到Et2O(200ml)中以进行沉淀。离心(2分钟，3000转/分)后收集沉淀物。将获得的黄色油状物用MeOH/Et2O混合物(1:2,50×100ml)洗涤3次。通过快速硅胶柱色谱(DCM/MeOH＝50:1)纯化获得含胍基的单体2。含有二亚乙基三胺的单体1与含有胍基的单体2(比例为1:2，总共2.4mM)进行聚合。然后将混合物在水中透析7天，得到聚双硫阳离子聚合物PD。
PD/质粒纳米复合物(PD/P)的制备：将2μl(1mg/ml)的阳离子聚合物PD与400ng的质粒DNA等体积复合，混匀，室温孵育30min后获得PD/P纳米粒子，可根据需要等比放大PD和质粒的用量。
巨噬细胞膜(M)制备：将1×108RAW 264.7细胞收集在15mL离心管中。用冷的1×PBS洗涤2次后，将细胞用细胞膜提取试剂重新悬浮，并分入两个1.5mL离心管中。在冰浴中孵育10～15分钟，然后在液氮和室温下冻融3次。悬浮液进一步离心(700×g，4℃)10分钟以去除细胞核和完整细胞。将上清液在4℃、14000×g下离心30分钟以获得细胞膜碎片。将细胞膜片段重悬于ddH2O中，根据供应商提供的说明书通过BCA测定和SDS-PAGE测定浓度和细胞膜蛋白。
PD/质粒纳米复合物@巨噬细胞膜(PD/P@M)的制备：将PD/P纳米复合物和巨噬细胞膜以1:1的质量比混合，超声2min，随后将其通过400nm滤膜的挤出装置(Avanti.Co.，Ltd，USA)反复挤压21次左右，再通过200nm滤膜反复挤压21次，得到PD/P@M的纳米粒子。
实验结果：聚双硫阳离子聚合物已成功制备，随后分别通过透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)表征获得的PD/质粒纳米复合物(PD/P)和包被PD/P复合物形成膜包被的复合物(PD/P@M)的形态和尺寸分布。
如图1所示，PD结构式如图1a，纳米粒子PD/P呈圆球形，结构致密，粒径大约在200nm左右。在巨噬细胞膜包裹后，TEM电镜可观察到纳米粒子PD/P表面有一层薄膜层，说明膜包被成功。此外DLS结果显示粒径大小与TEM结果相似。
如图2所示，Zeta电位分析表明，带正电的PD/P在巨噬细胞膜涂覆后变为负电，这主要归因于膜的电荷屏蔽。
如图3所示，巨噬细胞膜可通过膜表面的CCR2蛋白，通过趋化因子-趋化因子受体轴将包被的纳米颗粒引导至炎症病变。此外TNFR2蛋白与TNF-α结合以减轻炎症症状。为了确认挤出后膜蛋白是否仍然保留，检查了巨噬细胞膜的总蛋白，来自PD/P@M的蛋白质谱几乎与天然巨噬细胞膜(M)相同。
如图4所示，蛋白质印迹结果，表明来自巨噬细胞膜(M)的关键蛋白质，包括CCR2和TNFR2，在膜包被后得到了很好的保留。
如图5所示，在体外对多种人源的不同器官或组织来源的细胞进行转染，靶向切割EMX1内源性的基因，在体外进行T7E1的验证，可观察到来源于肝的肝癌细胞HepG2的切割效率可达到20.1％，其他细胞未观察到明显切割，证明了启动子的肝特异性。
如图6所示，将包膜的纳米粒子尾静脉注射到小鼠体内，其中装载的编辑元件可编码荧光素酶，通过小鼠活体成像观察质粒表达分布，结果显示，PD/P@M包膜纳米粒子的表达主要分布在肝脏部位，在体内证明了质粒的肝特异性启动性能。
实施例2：仿生纳米双特异性纳米编辑元件在细胞水平对相关疾病基因表达下调
评价证明方法：
T7E1检测和深度测序：通过T7E1测定评估目标基因组位点的插入缺失频率。使用DNeasy Blood&Tissue Kit(Vazyme,China)从转染的细胞和肝组织中提取DNA。使用QIAquick PCR Purification Kit(Vazyme，China)通过PCR扩增目标区域，根据推荐的方案，使用200ng PCR产物进行T7E1测定。产品通过琼脂糖凝胶电泳(2％琼脂糖凝胶)进行分析，并通过凝胶曝光系统(c150，Azure Biosystems，USA)进行可视化。最后，使用Image J测量DNA条带灰度的量化。插入缺失频率分析的计算公式为：[1-(1-fraction cleaved)1/2]×100％，其中裂解率＝每个消化条带强度的总和/(每个消化条带强度的总和+未消化条带强度)。PCR产物通过深度测序进一步定量，以获得更精确的插入缺失频率。
qPCR分析：用qRT-PCR方法检测其敲减效果。首先，用RNAIsolator totalRNAExtraction Reagent(Vazyme,China)提取总RNA。提取的RNA作为模板，经逆转录酶转录为cDNA。为了进一步分析，将cDNA稀释到合适的稀释液，作为qRT-PCR反应的模板。采用SYBRGreen qRT-PCR方法进行两步法qRT-PCR检测。qPCR步骤的引物从PrimerBank(http://pgamgh.harvard.edu/primerbank/)中检索设计。
蛋白质印迹分析：通过含有1％蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液从细胞系和肝组织中提取蛋白质。通过BCA试剂盒(Thermo Fisher)测量蛋白质浓度，并用RIPA裂解缓冲液进行同等调整。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在80V浓缩凝胶和120V分离胶下分离蛋白质裂解物。根据标准程序将蛋白质凝胶转移到PVDF膜上。PVDF膜用5％BSA封闭1.5小时，并与抗体在4℃下孵育过夜，洗膜后室温孵育二抗1h，再次洗膜后曝光，观察条带趋势。
实验结果：仿生纳米双特异性纳米编辑元件在细胞水平对相关疾病基因表达下调验证。
如图7所示，通过T7E1插入缺失分析，mRNA表达变化，WB结果和深度测序结果证实了肝特异性表达的Cas9质粒可有效在细胞水平对Alox12和Fas两个靶点进行特异性敲除，T7E1图显示了明显的两条切割条带，有效的基因编辑也进一步被TA克隆结果证实，如SEQID No.3-8。mRNA的相对表达结果说明了基因水平的敲低下调了基因转录水平。WB的结果证实了基因水平的敲低降低了蛋白表达水平。
如图8所示，通过mRNA表达变化，WB结果证实了肝特异性表达的CasRx质粒可有效在细胞水平对Alox12和Fas两个靶点的mRNA进行特异性敲除，mRNA的相对表达结果说明了CasRx可有效下调了基因转录水平。WB的结果证实了转录水平的敲低降低了蛋白表达水平。
实施例3：仿生双特异性纳米编辑系统用于预防肝缺血再灌注损伤
手术诱导肝缺血再灌注损伤模型的建立：C57BL/6小鼠(6-8周)通过尾静脉注射给予PBS、PD、PD/Pnt@M、PD/Pcas9@M或PD/PCasRx@M。分别在第1天、第3天、第5天和第7天给予含有30μg质粒和150μL PD/Pnt@M复合物(1.5μg/μL)或PBS的复合物。将注射的小鼠分为六组(对照组，注射PBS的Con A，ConA与PD，ConA与PD/Pnt@M，ConA与PD/Pcas9@M和ConA与PD/PCasRx@M)，每组5只小鼠。第7天，用异氟醚麻醉小鼠，然后仰卧固定在手术台上。腹部脱毛和消毒后，通过中线剖腹手术对小鼠进行暴露肝脏。用微血管夹阻断左侧和正中肝叶以阻断血液供应60分钟，然后通过去除夹子进行再灌注。用无菌医用丝线缝合腹部。缺血肝叶的漂白表明缺血手术的成功。在再灌注后24小时获取肝组织和血液用于进一步分析，对小鼠体内的Alox12基因座的插入缺失、Alox12蛋白表达和凋亡相关蛋白表达进行分析。免疫荧光染色评价肝脏中炎症细胞激活的情况，并对小鼠血清中的AST、ALT及炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的含量进行测量，评价肝脏损伤情况及炎症缓解效果。
实验结果：
如图9所示，PD/PCas9@M复合物尾静脉注射小鼠后，进行手术造模，取肝组织样本评估靶向切割效果，T7E1实验证明给药后，可在Alox12基因位点产生明显突变，如SEQ IDNo.9-11。此外，PD/PCas9@M复合物和PD/PCasRx复合物均可在小鼠肝脏内实现Alox12蛋白表达的有效下调。
如图10所示，为评估肝脏细胞坏死及损伤程度，对肝脏组织内的凋亡相关蛋白进行WB分析，抗凋亡基因Bcl-2表达高于造模组，凋亡基因Bax和C-CASP3表达明显下调。肝脏切片H&E证明经给药处理后的小鼠可明显缓解细胞坏死状况。免疫荧光染色表明经仿生双特异性纳米系统编辑处理后的小鼠炎症细胞激活情况得到明显缓解。
如图11所示，小鼠血清中的AST，ALT含量明显下降，相应炎症因子含量降低，表明PD/P@M有效缓解了肝功能损伤状况以及炎症情况。
实施例4：仿生双特异性纳米编辑系统用于预防ConA诱导的急性肝损伤
ConA诱导的急性肝损伤模型建立：C57BL/6小鼠(6-8周)尾静脉注射PD/Pcas9@M或PD/PCasRx@M复合物，复合物含有30μg质粒和150μL PD/Pnt@M复合物(1.5μg/μL)或PBS每周两次。将注射的小鼠随机分为六组(对照组、注射PBS的Con A、ConA与PD、ConA与PD/PNT@M、ConA与PD/Pcas9@M和ConA与PD/PCasRx@M)，每组8只小鼠。然后通过静脉尾静脉注射将伴刀豆球蛋白-A(Sigma-Aldrich)(悬浮在100μL无热原盐水中，17mg/kg)给予小鼠。将上述复合物每周两次继续注射到小鼠体内。随后，检测血清中ALT和AST的水平，获得的肝切片用H&E染色。然后，如前所述，进行T7E1测定、T-A克隆、深度测序和qRT-PCR分析。
实施例4的实验结果
如图12所示，PD/PCas9@M复合物尾静脉注射小鼠后，进行ConA造模，取肝组织样本评估靶向切割效果，T7E1实验证明给药后，可在Fas基因位点产生明显突变，如SEQ IDNo.12-14。此外，PD/PCas9@M复合物和PD/PCasRx复合物均可在小鼠肝脏内实现Fas mRNA降低和蛋白表达的有效下调。
如图13所示，小鼠肝脏图片及H&E切片图说明仿生双特异性的纳米编辑系统可有效预防ConA诱导的急性肝损伤，延长小鼠生存时间，降低血清中AST，ALT水平，缓解肝损伤情况。
实施例5：仿生双特异性纳米编辑系统用于治疗ConA诱导肝纤维化
ConA诱导的肝纤维化模型建立：C57BL/6小鼠(6-8周)每周通过尾静脉注射刀豆素-A(Con-A，8mg/kg)溶液，持续4周。注射后48小时，小鼠分别每周用PBS、PD、PD/Pnt@M、PD/Pcas9@M和PD/PCasRx@M处理4周。为了进一步分析和治疗评估，处死小鼠以收集肝脏和血液。如前所述进行T7E1测定、T-A克隆、深度测序、qRT-PCR、蛋白质印迹和ELISA。
实施例5的实验结果
如图14所示，PD/PCas9@M复合物尾静脉注射小鼠后，进行ConA造模，取肝组织样本评估靶向切割效果，T7E1实验证明给药后，可在Fas基因位点产生明显突变，如SEQ IDNo.15-17。此外，PD/PCas9@M复合物和PD/PCasRx复合物均可在小鼠肝脏内实现Fas mRNA降低和蛋白表达的有效下调。
如图15所示，经过仿生双特异性纳米编辑系统处理后的小鼠肝脏切片的α-SMA染色、天狼星红染色和马松染色，显示其可有效抑制肝脏纤维化，血清中前胶原三肽含量及肝脏组织中羟脯氨酸含量下降也证明了这一结论。TNF-α含量下降证实了炎症中和与缓解情况。
以上实施例只是为了说明本发明技术构思及特点，让本领域普通技术人员能够了解本发明内容并据以实施，并不能以此限制本发明保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作的等效变化和修饰，都应涵盖在本发明保护范围内。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种仿生双特异性纳米编辑系统及其用途
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8832
<212> DNA
<213> 根据可肝特异性表达的编码Cas9的质粒设计的人工序列(Unknow)
<400> 1
aagcttgatt taggtgacac tatagaatac aagctacttg ttctttttgc aggatcgcca 60
ccatggacta taaggaccac gacggagact acaaggatca tgatattgat tacaaagacg 120
atgacgataa gatggcccca aagaagaagc ggaaggtcgg tatccacgga gtcccagcag 180
ccgacaagaa gtacagcatc ggcctggaca tcggcaccaa ctctgtgggc tgggccgtga 240
tcaccgacga gtacaaggtg cccagcaaga aattcaaggt gctgggcaac accgaccggc 300
acagcatcaa gaagaacctg atcggagccc tgctgttcga cagcggcgaa acagccgagg 360
ccacccggct gaagagaacc gccagaagaa gatacaccag acggaagaac cggatctgct 420
atctgcaaga gatcttcagc aacgagatgg ccaaggtgga cgacagcttc ttccacagac 480
tggaagagtc cttcctggtg gaagaggata agaagcacga gcggcacccc atcttcggca 540
acatcgtgga cgaggtggcc taccacgaga agtaccccac catctaccac ctgagaaaga 600
aactggtgga cagcaccgac aaggccgacc tgcggctgat ctatctggcc ctggcccaca 660
tgatcaagtt ccggggccac ttcctgatcg agggcgacct gaaccccgac aacagcgacg 720
tggacaagct gttcatccag ctggtgcaga cctacaacca gctgttcgag gaaaacccca 780
tcaacgccag cggcgtggac gccaaggcca tcctgtctgc cagactgagc aagagcagac 840
ggctggaaaa tctgatcgcc cagctgcccg gcgagaagaa gaatggcctg ttcggaaacc 900
tgattgccct gagcctgggc ctgaccccca acttcaagag caacttcgac ctggccgagg 960
atgccaaact gcagctgagc aaggacacct acgacgacga cctggacaac ctgctggccc 1020
agatcggcga ccagtacgcc gacctgtttc tggccgccaa gaacctgtcc gacgccatcc 1080
tgctgagcga catcctgaga gtgaacaccg agatcaccaa ggcccccctg agcgcctcta 1140
tgatcaagag atacgacgag caccaccagg acctgaccct gctgaaagct ctcgtgcggc 1200
agcagctgcc tgagaagtac aaagagattt tcttcgacca gagcaagaac ggctacgccg 1260
gctacattga cggcggagcc agccaggaag agttctacaa gttcatcaag cccatcctgg 1320
aaaagatgga cggcaccgag gaactgctcg tgaagctgaa cagagaggac ctgctgcgga 1380
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ccattctgcg gcggcaggaa gatttttacc cattcctgaa ggacaaccgg gaaaagatcg 1500
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gattcgcctg gatgaccaga aagagcgagg aaaccatcac cccctggaac ttcgaggaag 1620
tggtggacaa gggcgcttcc gcccagagct tcatcgagcg gatgaccaac ttcgataaga 1680
acctgcccaa cgagaaggtg ctgcccaagc acagcctgct gtacgagtac ttcaccgtgt 1740
ataacgagct gaccaaagtg aaatacgtga ccgagggaat gagaaagccc gccttcctga 1800
gcggcgagca gaaaaaggcc atcgtggacc tgctgttcaa gaccaaccgg aaagtgaccg 1860
tgaagcagct gaaagaggac tacttcaaga aaatcgagtg cttcgactcc gtggaaatct 1920
ccggcgtgga agatcggttc aacgcctccc tgggcacata ccacgatctg ctgaaaatta 1980
tcaaggacaa ggacttcctg gacaatgagg aaaacgagga cattctggaa gatatcgtgc 2040
tgaccctgac actgtttgag gacagagaga tgatcgagga acggctgaaa acctatgccc 2100
acctgttcga cgacaaagtg atgaagcagc tgaagcggcg gagatacacc ggctggggca 2160
ggctgagccg gaagctgatc aacggcatcc gggacaagca gtccggcaag acaatcctgg 2220
atttcctgaa gtccgacggc ttcgccaaca gaaacttcat gcagctgatc cacgacgaca 2280
gcctgacctt taaagaggac atccagaaag cccaggtgtc cggccagggc gatagcctgc 2340
acgagcacat tgccaatctg gccggcagcc ccgccattaa gaagggcatc ctgcagacag 2400
tgaaggtggt ggacgagctc gtgaaagtga tgggccggca caagcccgag aacatcgtga 2460
tcgaaatggc cagagagaac cagaccaccc agaagggaca gaagaacagc cgcgagagaa 2520
tgaagcggat cgaagagggc atcaaagagc tgggcagcca gatcctgaaa gaacaccccg 2580
tggaaaacac ccagctgcag aacgagaagc tgtacctgta ctacctgcag aatgggcggg 2640
atatgtacgt ggaccaggaa ctggacatca accggctgtc cgactacgat gtggaccata 2700
tcgtgcctca gagctttctg aaggacgact ccatcgacaa caaggtgctg accagaagcg 2760
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actactggcg gcagctgctg aacgccaagc tgattaccca gagaaagttc gacaatctga 2880
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tggtggaaac ccggcagatc acaaagcacg tggcacagat cctggactcc cggatgaaca 3000
ctaagtacga cgagaatgac aagctgatcc gggaagtgaa agtgatcacc ctgaagtcca 3060
agctggtgtc cgatttccgg aaggatttcc agttttacaa agtgcgcgag atcaacaact 3120
accaccacgc ccacgacgcc tacctgaacg ccgtcgtggg aaccgccctg atcaaaaagt 3180
accctaagct ggaaagcgag ttcgtgtacg gcgactacaa ggtgtacgac gtgcggaaga 3240
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ccaccgtgcg gaaagtgctg agcatgcccc aagtgaatat cgtgaaaaag accgaggtgc 3480
agacaggcgg cttcagcaaa gagtctatcc tgcccaagag gaacagcgat aagctgatcg 3540
ccagaaagaa ggactgggac cctaagaagt acggcggctt cgacagcccc accgtggcct 3600
attctgtgct ggtggtggcc aaagtggaaa agggcaagtc caagaaactg aagagtgtga 3660
aagagctgct ggggatcacc atcatggaaa gaagcagctt cgagaagaat cccatcgact 3720
ttctggaagc caagggctac aaagaagtga aaaaggacct gatcatcaag ctgcctaagt 3780
actccctgtt cgagctggaa aacggccgga agagaatgct ggcctctgcc ggcgaactgc 3840
agaagggaaa cgaactggcc ctgccctcca aatatgtgaa cttcctgtac ctggccagcc 3900
actatgagaa gctgaagggc tcccccgagg ataatgagca gaaacagctg tttgtggaac 3960
agcacaagca ctacctggac gagatcatcg agcagatcag cgagttctcc aagagagtga 4020
tcctggccga cgctaatctg gacaaagtgc tgtccgccta caacaagcac cgggataagc 4080
ccatcagaga gcaggccgag aatatcatcc acctgtttac cctgaccaat ctgggagccc 4140
ctgccgcctt caagtacttt gacaccacca tcgaccggaa gaggtacacc agcaccaaag 4200
aggtgctgga cgccaccctg atccaccaga gcatcaccgg cctgtacgag acacggatcg 4260
acctgtctca gctgggaggc gacaagcgtc ctgctgctac taagaaagct ggtcaagcta 4320
agaaaaagaa aggaagcgga gccactaact tctccctgtt gaaacaagca ggggatgtcg 4380
aagagaatcc cgggccaaaa ttcatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg 4440
tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg 4500
agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca 4560
agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca 4620
gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct 4680
acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg 4740
tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg 4800
aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata 4860
tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg 4920
aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc 4980
ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca 5040
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gcatggacga gctgtacaag taaggatccc atcgattcga attcaaggcc tctcgagcct 5160
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tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca acaattgcat 5340
tcattttatg tttcaggttc agggggaggt gtgggaggtt ttttaattcg cggccgcggc 5400
gccaatgcat tgggcccggt accaaaaaaa gcaccgactc ggtgccactt tttcaagttg 5460
ataacggact agccttattt taacttgcta tttctagctc taaaacaggt cttctcgaag 5520
acccggtgtt tcgtcctttc cacaagatat ataaagccaa gaaatcgaaa tactttcaag 5580
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gaaattatta ctttctacgt cacgtatttt gtactaatat ctttgtgttt acagtcaaat 5700
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gaaataggcc ctcggtaccc agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt gcgcgcttgg 5820
cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca 5880
acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca 5940
cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 6000
attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt 6060
cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 6120
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caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 6240
ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 6300
cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 6360
ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 6420
tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 6480
gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 6540
ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 6600
ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 6660
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aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 6780
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ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 6900
tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 6960
aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 7020
tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 7080
ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 7140
gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 7200
gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 7260
taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 7320
tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 7380
ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 7440
tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 7500
ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 7560
tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 7620
ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 7680
aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 7740
actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 7800
aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 7860
tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 7920
aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 7980
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 8040
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 8100
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 8160
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 8220
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 8280
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 8340
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 8400
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 8460
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagt cgacaccggc 8520
gcgccggggg aggctgctgg tgaatattaa ccaaggtcac cccagttatc ggaggagcaa 8580
acaggggcta agtccacacg cgtggtaccg tctgtctgca catttcgtag agcgagtgtt 8640
ccgatactct aatctcccta ggcaaggttc atatttgtgt aggttactta ttctcctttt 8700
gttgactaag tcaataatca gaatcagcag gtttggagtc agcttggcag ggatcagcag 8760
cctgggttgg aaggaggggg tataaaagcc ccttcaccag gagaagccgt cacacagatc 8820
cacaagctcc tg 8832
<210> 2
<211> 7274
<212> DNA
<213> 根据可肝特异性表达的编码CasRx的质粒设计的人工序列(Unknow)
<400> 2
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc gcgtagggat aacagggtaa tgcgcgcgta atacgactca 660
ctatagggcg aattgggtac cgggcccccc ctcgaggtcg acaccggcgc gccgggggag 720
gctgctggtg aatattaacc aaggtcaccc cagttatcgg aggagcaaac aggggctaag 780
tccacacgcg tggtaccgtc tgtctgcaca tttcgtagag cgagtgttcc gatactctaa 840
tctccctagg caaggttcat atttgtgtag gttacttatt ctccttttgt tgactaagtc 900
aataatcaga atcagcaggt ttggagtcag cttggcaggg atcagcagcc tgggttggaa 960
ggagggggta taaaagcccc ttcaccagga gaagccgtca cacagatcca caagctcctg 1020
gaattcgcca ccatgcctaa aaagaaaaga aaggtgggtt ctggtatcga gaagaagaag 1080
agcttcgcca agggcatggg agtgaagagc accctggtgt ccggctctaa ggtgtacatg 1140
accacatttg ctgagggaag cgacgcccgg ctggagaaga tcgtggaggg cgatagcatc 1200
agatccgtga acgagggaga ggctttcagc gccgagatgg ctgacaagaa cgctggctac 1260
aagatcggaa acgccaagtt ttcccaccca aagggctacg ccgtggtggc taacaaccca 1320
ctgtacaccg gaccagtgca gcaggacatg ctgggactga aggagacact ggagaagagg 1380
tacttcggcg agtccgccga cggaaacgat aacatctgca tccaggtcat ccacaacatc 1440
ctggatatcg agaagatcct ggctgagtac atcacaaacg ccgcttacgc cgtgaacaac 1500
atctccggcc tggacaagga tatcatcggc ttcggaaagt tttctaccgt gtacacatac 1560
gacgagttca aggatccaga gcaccaccgg gccgctttta acaacaacga caagctgatc 1620
aacgccatca aggctcagta cgacgagttc gataactttc tggataaccc caggctgggc 1680
tacttcggac aggctttctt ttctaaggag ggcagaaact acatcatcaa ctacggaaac 1740
gagtgttacg acatcctggc cctgctgagc ggactgaggc actgggtggt gcacaacaac 1800
gaggaggagt ctcggatcag ccgcacctgg ctgtacaacc tggacaagaa cctggataac 1860
gagtacatct ccacactgaa ctacctgtac gacaggatca ccaacgagct gacaaacagc 1920
ttctccaaga actctgccgc taacgtgaac tacatcgctg agaccctggg catcaaccca 1980
gctgagttcg ctgagcagta cttcagattt tccatcatga aggagcagaa gaacctgggc 2040
ttcaacatca caaagctgag agaagtgatg ctggacagaa aggatatgtc cgagatcagg 2100
aagaaccaca aggtgttcga ttctatcaga accaaggtgt acacaatgat ggactttgtg 2160
atctacaggt actacatcga ggaggatgcc aaggtggccg ctgccaacaa gagcctgccc 2220
gacaacgaga agtctctgag cgagaaggat atcttcgtga tcaacctgag aggctccttt 2280
aacgacgatc agaaggacgc tctgtactac gatgaggcca acaggatctg gagaaagctg 2340
gagaacatca tgcacaacat caaggagttc cggggaaaca agacccgcga gtacaagaag 2400
aaggacgctc caaggctgcc taggatcctg cctgctggaa gggacgtgag cgccttcagc 2460
aagctgatgt acgccctgac aatgtttctg gacggaaagg agatcaacga tctgctgacc 2520
acactgatca acaagttcga caacatccag tcttttctga aagtgatgcc tctgatcggc 2580
gtgaacgcta agttcgtgga ggagtacgcc ttctttaagg acagcgccaa gatcgctgat 2640
gagctgcggc tgatcaagtc ctttgccagg atgggagagc caatcgctga cgctaggaga 2700
gctatgtaca tcgatgccat ccggatcctg ggaaccaacc tgtcttacga cgagctgaag 2760
gctctggccg acaccttcag cctggatgag aacggcaaca agctgaagaa gggcaagcac 2820
ggaatgcgca acttcatcat caacaacgtg atcagcaaca agcggtttca ctacctgatc 2880
agatacggcg acccagctca cctgcacgag atcgctaaga acgaggccgt ggtgaagttc 2940
gtgctgggac ggatcgccga tatccagaag aagcagggcc agaacggaaa gaaccagatc 3000
gaccgctact acgagacctg catcggcaag gataagggaa agtccgtgtc tgagaaggtg 3060
gacgctctga ccaagatcat cacaggcatg aactacgacc agttcgataa gaagagatct 3120
gtgatcgagg acaccggaag ggagaacgcc gagagagaga agtttaagaa gatcatcagc 3180
ctgtacctga cagtgatcta ccacatcctg aagaacatcg tgaacatcaa cgctagatac 3240
gtgatcggct tccactgcgt ggagcgcgat gcccagctgt acaaggagaa gggatacgac 3300
atcaacctga agaagctgga ggagaagggc tttagctccg tgaccaagct gtgcgctgga 3360
atcgacgaga cagcccccga caagaggaag gatgtggaga aggagatggc cgagagagct 3420
aaggagagca tcgactccct ggagtctgct aaccctaagc tgtacgccaa ctacatcaag 3480
tactccgatg agaagaaggc cgaggagttc accaggcaga tcaacagaga gaaggccaag 3540
accgctctga acgcctacct gaggaacaca aagtggaacg tgatcatccg ggaggacctg 3600
ctgcgcatcg ataacaagac ctgtacactg ttccggaaca aggctgtgca cctggaggtg 3660
gctcgctacg tgcacgccta catcaacgac atcgccgagg tgaactccta ctttcagctg 3720
taccactaca tcatgcagag gatcatcatg aacgagagat acgagaagtc tagcggcaag 3780
gtgtctgagt acttcgacgc cgtgaacgat gagaagaagt acaacgatag actgctgaag 3840
ctgctgtgcg tgcctttcgg atactgtatc ccacggttta agaacctgag catcgaggcc 3900
ctgttcgacc gcaacgaggc tgccaagttt gataaggaga agaagaaggt gagcggcaac 3960
tccggttctg gtctcgagcc caagaagaag aggaaagtcc tcgaggctac taacttcagc 4020
ctgctgaagc aggctggaga cgtggaggag aaccctggac ctatgcatat ggtgagcaag 4080
ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac 4140
ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc 4200
ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc 4260
ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc 4320
ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac 4380
ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc 4440
gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac 4500
aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg 4560
aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag 4620
cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc 4680
cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc 4740
gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagtaaac gctagcctcg 4800
actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc 4860
ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt 4920
ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat 4980
tgggaagaga atagcaggca tgctggggag atccactagt tctagagcgg ccgccaccgc 5040
ggtggagctc cagcttttgt tccctttagt gagggttaat tgcgcgcatt accctgttat 5100
ccctacgcgc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct 5160
cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg 5220
agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct 5280
gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg 5340
gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 5400
ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 5460
aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 5520
ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 5580
gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 5640
cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 5700
gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 5760
tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 5820
cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 5880
cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 5940
gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 6000
agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 6060
cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 6120
tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 6180
tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag 6240
ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat 6300
cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc 6360
cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat 6420
accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag 6480
ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg 6540
ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc 6600
tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca 6660
acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg 6720
tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc 6780
actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta 6840
ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc 6900
aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg 6960
ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc 7020
cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc 7080
aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat 7140
actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag 7200
cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc 7260
ccgaaaagtg ccac 7274
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 3
accccatgct ttgagacgct ccacctct 28
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 4
cacccatttg agacgctcca cctct 25
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 5
accccatgct ttttgagacg ctccacctct 30
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 6
gcatctccga gagttgagg 19
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 7
tcatatcgtc gagttcaaag ttgagg 26
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 8
gcatctccga gagtttctga gg 22
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 9
accccatgct ttgagacgct ccccctct 28
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 10
accccatttt gatacgatcc acctct 26
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 11
accccatgct ctttgcactc tccaccgct 29
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 12
gcatctccga gagtttactg agg 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 13
gcatctccga gagtttaaag agg 23
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 14
gctttccgaa aagtttaaac tgagg 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 15
gcatctccga gagtttaaac tgagg 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 16
gcatctcaga gagttaaacc tgagg 25
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 17
gcatctccga gagtttaaga gg 22

Claims (4)

1.一种仿生双特异性纳米编辑系统，其特征在于，所述的仿生双特异性纳米编辑系统包括：(a) 聚双硫阳离子聚合物，能够复合编码Cas9或CasRx的质粒DNA，形成PD/P纳米粒子；(b) 一层涂覆在PD/P纳米粒子上的仿生巨噬细胞膜，形成仿生性膜包被的纳米粒子PD/P@M，靶向递送PD/P纳米粒子至炎症性肝脏病灶部位；(c) 一种能够肝特异性表达的编码CasRx的质粒；
所述聚双硫阳离子聚合物选用含有二亚乙基三胺和胍基配体的双组份共聚物，其结构如式（1）所示，所述编码CasRx的质粒DNA的序列如SEQ ID No.2所示；
所述仿生巨噬细胞膜与PD/P纳米复合物的质量比为 1:1。
2.根据权利要求1所述的一种仿生双特异性纳米编辑系统，其特征在于，所述的聚双硫阳离子聚合物与质粒DNA以氮磷比为2.0:1复合形成PD/P纳米粒子。
3.权利要求1所述的仿生双特异性纳米编辑系统在制备预防或治疗炎症性肝脏疾病药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用是仿生双特异性纳米编辑系统通过将CasRx质粒靶向递送到炎症病变部位，通过肝脏特异性启动子驱动稳定表达CasRx，进行RNA编辑，敲低疾病相关基因，PD/P纳米粒子外部包被的巨噬细胞膜能够中和炎症，缓解炎症情况，减少正常肝细胞死亡。
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Rational Design of Poly(disulfide)s as a Universal Platform for Delivery of CRISPR-Cas9 Machineries toward Therapeutic Genome Editing;Jiajing Guo等;《ACS Cent. Sci》;第7卷(第6期);摘要；第993页右栏最后1段到第994页左栏第9行；第995页左栏第2段；第977页左栏第2段到底998页左栏第1段；图2c *
Treatment of Phenylketonuria Using Minicircle-Based Naked-DNA GeneTransfer to Murine Liver;Hiu Man Viecelli等;《HEPATOLOGY》;第60卷(第3期);第1037页左栏第1-5行，Supporting Materials and Methods *

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