TW201615827A - 有氧下可提升重組蛋白質表現的菌株 - Google Patents
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Abstract
一種有氧下可提升重組蛋白質表現的菌株,其屬於大腸桿菌,且含有:至少一非內源啟動子,為可操作地連接至菌株染色體上的glpF基因、gldA基因、dhaKLM基因操縱組、及araE基因;一araBAD啟動子,為可操作地連接至染色體上的T7 RNA聚合酶基因;及一T7啟動子,為可操作地連接至一重組蛋白質基因。而且,菌株缺少araABD基因操縱組、及araFGH基因操縱組。
Description
本發明關於一種利用基因工程技術建構的菌株,且特別關於一種有氧下可提升重組蛋白質表現的大腸桿菌菌株。
細胞內的蛋白質表現為一耗能的生理現象,而消耗的能量大多由細胞攝取、代謝的碳源所供應。因此,若欲提升細胞內重組蛋白質的表現量,細胞須大量攝取並代謝碳源。葡萄糖因容易攝取、代謝,故為這些碳源中最為常見者。
大腸桿菌代謝葡萄糖時,葡萄糖會抑制乳糖、蜜二糖、麥芽糖、與甘油等碳源的穿透酶活性,使菌體無法代謝這類碳源。這過程稱為「誘導物排除(inducer exclusion)」。同時,葡萄糖亦會抑制環化酶(adenylyl cyclase)活性,使環化酶無法催化三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)成環腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)。環化酶活性的抑制造成菌體內環腺苷酸的含量降低,從而抑制木質糖、阿拉伯糖、鼠李糖、與半乳糖等碳源的穿透酶基因與代謝基因表現,讓菌體無法代謝此類碳源。此過程稱為「代謝物抑制(catabolite repression)」。
於具T7表現系統(T7 expression system)的大腸桿菌內,因代謝物抑制會抑制表現系統之lac
基因操縱組的啟動子活性,以間接向下調控(down regulate)重組蛋白質的表現量。為解決此問題,J Agric Food Chem. 2011; 59 (12): 6534-42已建構一株新穎大腸桿菌菌株,命名為BAD5。阿拉伯糖於有氧下能誘導菌株BAD5表現重組蛋白質。然而,菌株BAD5無法有效代謝葡萄糖以外的碳源,故不能產生足夠的能量,以致限制重組蛋白質的表現量。申言之,菌株BAD5的重組蛋白質表現量無法滿足業界需求。
本發明的第一構想提出一種有氧下可提升重組蛋白質表現的菌株,其屬於大腸桿菌,且包含:至少一非內源啟動子,為可操作地連接至菌株之染色體上的glpF
基因、gldA
基因、dhaKLM
基因操縱組、及araE
基因;一araBAD
啟動子,為可操作地連接至染色體上的T7 RNA聚合酶基因;以及一T7啟動子,為可操作地連接至一重組蛋白質基因。而且,菌株缺少araABD
基因操縱組、及araFGH
基因操縱組。
本發明的第二構想提出一種有氧下可提升重組蛋白質表現的菌株,此屬於大腸桿菌,且包含:至少一非內源啟動子,為可操作地連接至菌株之染色體上的glpF
基因、gldA
基因、dhaKLM
基因操縱組、araE
基因、galP
基因、及glk
基因;一araBAD
啟動子,為可操作地連接至染色體上的T7 RNA聚合酶基因;以及一T7啟動子,為可操作地連接至一重組蛋白質基因。而且,菌株缺少araABD
基因操縱組、araFGH
基因操縱組、及ptsG
基因。
為讓本發明更明顯易懂,文中使用的基因全名於下:araA
,阿拉伯糖異構酶(arabinose isomerase);araB
,核酮糖激酶(ribulokinase);araD
,核酮糖-5-磷酸-4-表異構酶(ribulose 5-phosphate 4-epimerase);araE
,阿拉伯糖轉運蛋白(arabinose transporter);araFGH
,阿拉伯糖轉運蛋白(arabinose transporter);dhaKLM
,二羥基丙酮激酶(dihydroxyacetone kinase);galP
,半乳糖穿透酶(galactose permease);gldA
,甘油脫氫酶(glycerol dehydrogenase);glk
,葡萄糖激酶(glucokinase);glpF
,傳送甘油的輔助蛋白(glycerol uptake facilitator protein);ptsG
,葡萄糖磷酸轉移酶系統穿透酶(glucose phosphotransferase system permease)。
請參照圖1,大腸桿菌的甘油代謝可分為:有氧代謝及無氧代謝。於有氧代謝中,先將甘油轉變成甘油-3-磷酸(glycerol-3-phosphate,G3P),接著將甘油-3-磷酸轉變為二羥丙酮磷酸(dihydroxyacetone phosphate,DHAP)。於無氧代謝中,先將甘油轉化為二羥基丙酮(dihydroxyacetone,DHA),再將二羥基丙酮轉化成二羥丙酮磷酸。由上可知,glpF
基因、gldA
基因、及dhaKLM
基因操縱組的啟動子可能為缺氧(hypoxia)相關的調控件。若替換這些啟動子為其他與缺氧無關的調控件,則可能於有氧下同時進行甘油有氧代謝與甘油無氧代謝。透過此方式,當菌體於有氧下表現重組蛋白質時,可利用甘油此等代謝方式所產生的能量。
於是,本發明的第一實施方式提出一種有氧下可提升重組蛋白質表現的菌株。此菌株屬於大腸桿菌,且包括:至少一非內源啟動子,為可操作地連接至菌株染色體上的glpF
基因、gldA
基因、dhaKLM
基因操縱組、及araE
基因;一araBAD
啟動子,為可操作地連接至染色體上的T7 RNA聚合酶基因;以及一T7啟動子,為可操作地連接至一重組蛋白質基因。此外,此菌株缺少araABD
基因操縱組、及araFGH
基因操縱組。
文中使用的「非內源啟動子」乙詞意指,一非自然(non-naturally)連接於一基因的啟動子,其實例可以為但不限於EM7啟動子、Trc啟動子、或λ噬菌體PR
啟動子。文中使用的「可操作地連接(operably linked)」片語意指,二核酸片段相當接近,且其中一者可影響另一者。
於本實施方式中,連接至glpF
基因的非內源啟動子為Trc啟動子,連接至gldA
基因的非內源啟動子為λ噬菌體PR
啟動子,連接至dhaKLM
基因操縱組的非內源啟動子為λ噬菌體PR
啟動子,且連接至araE
基因的非內源啟動子為EM7啟動子。
於本實施方式中,glpF
基因的非內源啟動子為位於glpF
基因上游區域,gldA
基因的非內源啟動子為位於gldA
基因上游區域,dhaKLM
基因操縱組的非內源啟動子為位於dhaKLM
基因操縱組上游區域,而araE
基因的非內源啟動子為位於araE
基因上游區域。
於本實施方式中,重組蛋白質基因為位於菌株染色體上,或位於菌株內的一質體。
於本實施方式中,T7啟動子為位於重組蛋白質基因上游區域。
綜上,本實施方式的菌株於有氧下培養於一含甘油與阿拉伯糖的培養基時,阿拉伯糖可活化araBAD
啟動子以表現T7 RNA聚合酶,接著能活化T7啟動子而表現重組蛋白質。由於glpF
基因、gldA
基因、及dhaKLM
基因操縱組的產物量增加,可於有氧下一併進行甘油有氧代謝與甘油無氧代謝,以大量產生能量。產生的能量可供重組蛋白質的表現利用,以促進其表現量。另外,基於araE
基因的產物含量提升、且缺乏araFGH
基因操縱組的產物,菌株與其他如本實施方式的菌株可均勻地受阿拉伯糖誘導來產生重組蛋白質。此外,由於缺少araABD
基因操縱組的產物,菌株可避免代謝阿拉伯糖,從而長時間地受到阿拉伯糖誘導。簡言之,本實施方式的菌株於有氧下可利用甘油有氧代謝與甘油無氧代謝產生的能量,來促進受阿拉伯糖誘導之重組蛋白質的表現量。
請再參照圖1,於大腸桿菌的葡萄糖有氧代謝中,葡萄糖磷酸轉移酶系統與半乳糖穿透酶均能磷酸化葡萄糖成葡萄糖-6-磷酸。於葡萄糖磷酸轉移酶系統執行的過程中,伴隨著磷酸烯醇丙酮酸成丙酮酸的反應,這反應同樣發生於甘油無氧代謝中二羥基丙酮轉變為二羥丙酮磷酸的過程。因此,葡萄糖有氧代謝中葡萄糖磷酸轉移酶系統執行的過程與甘油無氧代謝中二羥基丙酮轉變為二羥丙酮磷酸的過程會相互調控。若加強第一實施方式菌株之葡萄糖有氧代謝中半乳糖穿透酶執行的過程,並阻斷葡萄糖磷酸轉移酶系統執行的過程,則此菌株於有氧下尚可利用葡萄糖代謝產生的能量來表現重組蛋白質。
於是,本發明之第二實施方式提出一種有氧下可提升重組蛋白質表現的菌株。此菌株屬於大腸桿菌,且包括:至少一非內源啟動子,為可操作地連接至菌株染色體上的glpF
基因、gldA
基因、dhaKLM
基因操縱組、araE
基因、galP
基因、及glk
基因;一araBAD
啟動子,為可操作地連接至染色體上的T7 RNA聚合酶基因;以及一T7啟動子,為可操作地連接至一重組蛋白質基因。此外,菌株缺少araABD
基因操縱組、araFGH
基因操縱組、及ptsG
基因。
於本實施方式中,連接至glpF
基因的非內源啟動子為Trc啟動子,連接至gldA
基因的非內源啟動子為λ噬菌體PR
啟動子,連接至dhaKLM
基因操縱組的非內源啟動子為λ噬菌體PR
啟動子,連接至araE
基因的非內源啟動子為EM7啟動子,連接至galP
基因的非內源啟動子為Trc啟動子,而連接至glk
基因的非內源啟動子為λ噬菌體PR
啟動子。
於本實施方式中,glpF
基因的非內源啟動子為位於glpF
基因上游區域,gldA
基因的非內源啟動子為位於gldA
基因上游區域,dhaKLM
基因操縱組的非內源啟動子為位於dhaKLM
基因操縱組上游區域,araE
基因的非內源啟動子為位於araE
基因上游區域,galP
基因的非內源啟動子為位於galP
基因上游區域,而且glk
基因的非內源啟動子為位於glk
基因上游區域。
於本實施方式中,重組蛋白質基因為位於菌株染色體上,或位於菌株內的一質體中。
於本實施方式中,T7啟動子為位於重組蛋白質基因上游區域。
依上,本實施方式的菌株於有氧下培養於一含葡萄糖、甘油、與阿拉伯糖的培養基時,阿拉伯糖可活化araBAD
啟動子以表現T7 RNA聚合酶,進而活化T7啟動子來表現重組蛋白質。由於glpF
基因、gldA
基因、及dhaKLM
基因操縱組的產物含量增加,可於有氧下同時進行甘油有氧代謝與甘油無氧代謝,以產生能量。再者,透過galP
基因及glk
基因的產物含量上升、與缺少ptsG
基因的產物,可於有氧下進行葡萄糖有氧代謝以產生能量,且葡萄糖有氧代謝與甘油無氧代謝無相互干擾。產生的能量可供作重組蛋白質的表現,以提升其表現量。另外,基於araE
基因的產物含量提升、與缺乏araFGH
基因操縱組的產物,菌株與其他如本實施方式的菌株均可受阿拉伯糖誘導來產生重組蛋白質。此外,藉由欠缺araABD
基因操縱組的產物,菌株可避免代謝阿拉伯糖,從而長時效地受阿拉伯糖誘導。申言之,本實施方式的菌株於有氧下可利用甘油代謝與葡萄糖有氧代謝產生的能量,來提升受阿拉伯糖誘導之重組蛋白質的表現量。
茲以下述具體例,詳細說明本發明之實施方式。
《實驗方法與材料》
下文採用的實驗方法與材料可參考本發明所屬技術領域人士熟悉的工具書:Sambrook J., et al., 2001, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd ed.,如限制酶剪切DNA(DNA cleavage by restriction enzyme)、T4 DNA黏接酶接合DNA(DNA ligation with T4 DNA ligase)、聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)及非原態硫酸十二酯鈉-聚丙烯醯胺電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)等均可透過上述工具書及所屬技術領域人士本身的專業素養來實現。
菌液濃度是使用分光光度計(Thermo Co.)測得的,測量使用的光波長為550nm,而濃度紀錄為OD550
。細菌染色體、質體、及DNA片段的純化是各利用Blood & Tissue Genomic Mini Kit(Viogene Co.)、Plasmid Extraction Mini Kit(Favorgen Co.)、及Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit(Geneaid Co.)等商業套組完成的。限制酶購自New England Biolabs、及Thermo Co.。T4 DNA黏接酶、與PfuDNA聚合酶購自Promega Co.。PCR使用的引子為委託明欣生物科技公司、及源資生物科技公司合成的。轉形使用的細胞為大腸桿菌菌株BAD5,其具備以下特徵:(1)一araBAD
啟動子可操作地連接至菌株染色體上的T7 RNA聚合酶基因;(2)一EM7啟動子可操作地連接至菌株染色體上的araE
基因;(3)菌株缺乏araABD
基因操縱組、araFGH
基因操縱組、及ptsG
基因。
針對下文提到的「化學轉形法」、及「電穿孔法(electroporation)」於下做詳細介紹:
Ⅰ、化學轉形法
從固態培養基中挑選單一菌落至液態培養基,並於適當溫度下以150rpm震盪培養12至16小時。將菌液接種到液態培養基,其起始濃度為OD550
=0.08,並在適當溫度下以150rpm震盪培養。直到菌液濃度為OD550
=0.3至0.5,取出4mL的菌液至試管中,冰浴10分鐘,然後以4000rpm離心2分鐘並移除得到的上清液。將所剩下的菌體與2mL的MgCl2
(0.1M)均勻混合後,冰浴5分鐘,再以4000rpm離心2分鐘並移除離心後的上清液。將離心剩餘的菌體與1.5mL的CaCl2
(0.05M)均勻混合後,冰浴20分鐘,再以4000rpm離心2分鐘並移除離心得到的上清液。加入300μL的CaCl2
(0.05M)與離心殘存的菌體均勻混合後,則製得勝任細胞(competent cell)。
接著,取2ng/mL的質體與100μL的勝任細胞加入至試管中混合均勻。冰浴30分鐘後,將試管移至42℃恆溫水浴槽中2分鐘,再冰浴5分鐘。加入1mL的液態培養基(4℃)至勝任細胞菌液後,置於適當溫度中培養2小時,再以4000rpm離心10分鐘並移除得到的上清液。將殘存的液態培養基與離心下來的勝任細胞混合均勻後,吸取適量的勝任細胞菌液,均勻塗在含抗生素的固態培養基,並將其置於適當溫度的恆溫培養箱中,隔夜培養至長出菌落。
Ⅱ、電穿孔法
從固態培養基中挑選單一菌落至含適當量之抗生素的液態培養基,並於適當溫度下,以150rpm震盪培養12至16小時。將菌液接種到液態培養基,其起始濃度為OD550
=0.08,並在適當溫度下以150rpm震盪培養。直到菌液濃度達OD550
=0.3至0.5,取出20mL的菌液至試管中,冰浴10分鐘,然後以4000rpm離心2分鐘並移除所得的上清液。將剩下的菌體與5mL的10%甘油均勻混合後,於4℃下以4000rpm離心10分鐘並移除得到的上清液。將離心剩餘的菌體與5mL的10%甘油均勻混合後,於4℃下以4000rpm離心10分鐘並移除離心後的上清液。加入240μL的10%甘油與離心殘存的菌體均勻混合後,則製得勝任細胞。
接著,取500ng/mL的線性DNA與40μL的勝任細胞加入至電穿管中並混合均勻。冰浴1分鐘後,以250歐姆、2500伏特的條件電擊勝任細胞,接著迅速加入2mL的SOC培養基(98mL的SOB培養基、1mL之2M的MgSO4
、及1mL之2M的葡萄糖,其中SOB培養基的配方為:20g/L的胰蛋白(tryptone)、5g/L的酵母萃取物(yeast extract)、0.584g/L的NaCl、0.186g/L的KCl、及980mL的水)。於適當溫度下培養SOC培養基2小時後,以4000rpm離心10分鐘並移除離心上清液。將殘存的SOC培養基與離心下來的勝任細胞混合均勻後,吸取適量的勝任細胞菌液,均勻塗佈在含抗生素的固態培養基,並將其置於適當溫度的恆溫培養箱中,隔夜培養至長出菌落。
《實施例1》
Ⅰ、Trc啟動子取代glpF
基因的啟動子
依質體pTrc99A設計Ta1引子(SEQ ID NO:1)及Ta2引子(SEQ ID NO:2),Ta1引子有限制酶Eco
RI的剪切位。以質體pTrc99A為模板,利用此二引子對其進行PCR,以增幅得到一含Trc啟動子的DNA片段。依質體pLoxKm-PR(參考中華民國發明專利申請號102144504)設計PK1引子(SEQ ID NO:3)與PK2引子(SEQ ID NO:4),PK1引子有限制酶Sma
I的剪切位,PK2引子有限制酶Eco
RI的剪切位。以質體pLoxKm-PR為模板,使用此二引子對其進行PCR,以增幅得到一依序含LoxP位、抗卡納黴素(kanamycin)基因、LoxP位的DNA片段。使用限制酶Eco
RI剪切前者的DNA片段,並使用限制酶Sma
I及限制酶Eco
RI剪切後者的DNA片段後,利用T4黏接酶接合二剪切的DNA片段,以得到質體pLoxKm-Trc,此依序含LoxP位、抗卡納黴素基因、LoxP位、Trc啟動子。
依照大腸桿菌菌株BL21(DE3)染色體設計PT09185引子(SEQ ID NO:5)與PT09186引子(SEQ ID NO:6),PT09185引子有限制酶Xho
I的剪切位,PT09186引子有限制酶Xba
I的剪切位。以大腸桿菌菌株BL21(DE3)染色體為模板,利用此二引子對其進行PCR,以增幅得到一含glpF
基因之部分上游區域及glpF
基因之部分區域的DNA片段。使用限制酶Xho
I和限制酶Xba
I剪切得到的DNA片段與質體pBluescript後,利用T4黏接酶接合剪切的DNA片段與剪切的質體,以得到質體pBlue-glpF,其含有glpF
基因的部分上游區域及glpF
基因的部分區域。
依質體pBlue-glpF設計PT09187引子(SEQ ID NO:7)與PT09188引子(SEQ ID NO:8),PT09187引子有限制酶Bam
HI的剪切位,PT09188引子有限制酶Nde
I的剪切位。以質體pBlue-glpF為模板,透過此二引子對其進行PCR,以增幅出一含glpF
基因之部分上游區域及glpF
基因之部分區域的直線DNA片段。以限制酶Bam
HI與限制酶Nde
I剪切得到的直線DNA片段與質體pLoxKm-PR後,利用T4黏接酶接合剪切的直線DNA片段與剪切的質體,以得到質體pBlue-glpF-lox,其含有glpF
基因的部分上游區域、LoxP位、抗卡納黴素基因、LoxP位、λ噬菌體PR
啟動子、glpF
基因的部分區域。使用限制酶Bam
HI及限制酶Nde
I剪切質體pLoxKm-Trc及質體pBlue-glpF-lox後,利用T4黏接酶接合二剪切的質體,以得到質體pLoxKm-Trc/glpF’,其依序含glpF
基因的部分上游區域、LoxP位、抗卡納黴素基因、LoxP位、Trc啟動子、glpF
基因的部分區域。
依質體pLoxKm-Trc/glpF’設計PT09189引子(SEQ ID NO:9)與PT09190引子(SEQ ID NO:10),並以質體pLoxKm-Trc/glpF’為模板,採用此二引子對其進行PCR。以上述「電穿孔法」將增幅得到的線性DNA片段轉形至一大腸桿菌菌株BAD5,再參照Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97 (12): 6640-5,自轉形後的菌株BAD5中移除LoxP位、抗卡納黴素基因。而,此處最後得到的菌株BAD5稱為「菌株BAD5-1」此外,於電穿孔法轉形前,以上述「化學轉形法」將質體pKD46轉形至菌株BAD5內。
Ⅱ、λ噬菌體PR
啟動子取代gldA
基因的啟動子
照大腸桿菌菌株BL21染色體設計gldA1引子(SEQ ID NO:11)與gldA2引子(SEQ ID NO:12),gldA1引子有限制酶Kpn
I的剪切位,gldA2引子有限制酶Sac
I的剪切位。以菌株BL21染色體為模板,利用此二引子對其進行PCR,以增幅出一含gldA
基因之部分上游區域及gldA
基因之部分區域的DNA片段。以限制酶Kpn
I與限制酶Sac
I剪切DNA片段與質體pBluescript後,利用T4黏接酶接合剪切的DNA片段與剪切的質體,以得到質體pBlue-gldA,其含有gldA
基因的部分上游區域及gldA
基因的部分區域。
依質體pBlue-gldA設計gldA3引子(SEQ ID NO:13)與gldA4引子(SEQ ID NO:14),gldA3引子有限制酶Nde
I的剪切位,gldA4引子有限制酶Bam
HI的剪切位。以質體pBlue-gldA為模板,使用此二引子對其進行PCR,以增幅得到一含gldA
基因之部分上游區域及gldA
基因之部分區域的線性DNA片段。使用限制酶Nde
I與限制酶Bam
HI剪切線性DNA片段與質體pLox-Km-PR後,利用T4黏接酶接合剪切的線性DNA片段與剪切的質體,以得到質體pPR-gldA,此依序含gldA
基因的部分上游區域、LoxP位、抗卡納黴素基因、LoxP位、λ噬菌體PR
啟動子、gldA
基因的部分區域。
據質體pPR-gldA設計gldA5引子(SEQ ID NO:15),且以質體pPR-gldA為模板,利用gldA2引子與gldA5引子對其進行PCR。以上述「電穿孔法」將增幅得到的直線DNA片段轉形至菌株BAD5-1,再參照Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97 (12): 6640-5,自轉形後的菌株BAD5-1中移除LoxP位、抗卡納黴素基因。而,此處最後得到的菌株BAD5-1稱為「菌株BAD5-2」。
Ⅲ、λ噬菌體PR
啟動子取代dhaKLM
基因操縱組的啟動子
依照質體pLoxKm-PR設計dhakA+
引子(SEQ ID NO:16)與dhakA-
引子(SEQ ID NO:17),並以質體pLoxKm-PR為模板,利用此二引子對其進行PCR。增幅得到的DNA片段依序含LoxP位、抗卡納黴素基因、LoxP位、λ噬菌體PR
啟動子。
依據前述DNA片段設計dhakB+
引子(SEQ ID NO:18)與dhakB-
引子(SEQ ID NO:19),並以此片段為模板,使用此二引子對其進行PCR,以增幅得一線形DNA片段,其依序含dhaKLM
基因操縱組的部分上游區域、LoxP位、抗卡納黴素基因、LoxP位、λ噬菌體PR
啟動子、dhaKLM
基因操縱組的部分區域。
根據前述的線形DNA片段設計dhakC+
引子(SEQ ID NO:20)與dhakC-
引子(SEQ ID NO:21),並以此線形片段為模板,使用此二引子對其進行PCR,以增幅得到一直線DNA片段,其依序含dhaKLM
基因操縱組的部分上游區域、LoxP位、抗卡納黴素基因、LoxP位、λ噬菌體PR
啟動子、dhaKLM
基因操縱組的部分區域。
以上述「電穿孔法」將前述的直線DNA片段轉形至菌株BAD5-2,再參照Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97 (12): 6640-5,自轉形後的菌株BAD5-2中移除LoxP位、抗卡納黴素基因、質體pKD46。而,此處最後得到的菌株BAD5-2稱為「菌株N30」。
《實施例2》
以上述「化學轉形法」將質體pChHDT(參考J Biotechnol. 2005; 117 (3): 267-75)分別轉形至菌株N30與菌株BAD5,以得到重組菌株N30/pChHDT與重組菌株BAD5/pChHDT,其中質體pChHDT至少含T7啟動子可操作地連接的D型乙內醯酶基因。
自LB固態培養基中挑選此二重組菌株的一菌落至5mL之含50μg/mL胺芐青黴素的LB液態培養基後,菌液於30℃培養箱內以200rpm震盪培養16小時,再接種至20mL之含1.5g/L酵母粉、50μg/mL胺芐青黴素及0.6%甘油的M9液態培養基(6g/L的Na2
HPO4
、3g/L的KH2
PO4
、0.5g/L的NaCl、1g/L的NH4
Cl、1mM的MgSO4
.7H2
O、0.1mM的CaCl2
),其起始濃度為OD550
=0.08。接著,菌液於30℃培養箱內以250rpm震盪培養,直到其濃度達OD550
=0.3,再加入30μM的阿拉伯糖繼續培養6小時,以誘導重組菌株表現D型乙內醯酶。然後,先自培養液收集菌體並以0.1M的Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)清洗菌體,後將菌體懸浮於3mL的Tris-HCl緩衝液。超音波作用於懸浮後的緩衝液以打破菌體,其中超音波條件如下:震幅強度為35%、開啟/關閉時間為1秒/1秒、總作用時間為3分鐘。最後,於4℃下以15294Xg轉速離心超音波處理後的緩衝液10分鐘,並取10μL的所得上層液進行非原態硫酸十二酯鈉-聚丙烯醯胺電泳分析表現的重組蛋白質。
如圖2所示,於阿拉伯糖誘導後,此二重組菌株均可生產重組蛋白質,但重組菌株N30/pChHDT生產的重組蛋白質量明顯高於重組菌株BAD5/pChHDT生產的重組蛋白質量。
另外,加入10μL的上層液至反應溶液中,反應溶液含10mM的HPH、0.5mM的MnCl2
、100mM的Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)。所得的反應物總體積為1mL,而反應物於40℃下反應30分鐘後,置於100℃下10分鐘以終止反應。冷卻後,以10625Xg轉速離心反應物,並收集所得的上層物。最後,以0.2μm過濾膜過濾上層物後,採用高效率液相層析(high performance liquid chromatography,HPLC)儀分析過濾後的上層物,以測定D型對羥苯基甘胺酸(D-HDT)的量。
如表一所示,重組菌株N30/pChHDT的甘油消耗速率、D型對羥苯基甘胺酸量、D型乙內醯酶活性各約為重組菌株BAD5/pChHDT的9倍、1.6倍、和1.4倍。也就是說,重組菌株N30/pChHDT於有氧下同時進行甘油有氧代謝與甘油無氧代謝,這不僅可提升甘油代謝速率,還可提升重組蛋白質的表現量。 表一
《實施例3》
Ⅰ、Trc啟動子取代galP
基因的啟動子
依大腸桿菌菌株BL21染色體設計gal1引子(SEQ ID NO:22)與gal2引子(SEQ ID NO:23),gal1引子有限制酶Kpn
I的剪切位,gal2引子有限制酶Sac
I的剪切位。以菌株BL21染色體為模板,利用此二引子對其進行PCR,以增幅出一含galP
基因之部分上游區域及galP
基因之部分區域的DNA片段。以限制酶Kpn
I與限制酶Sac
I剪切DNA片段與質體pBlue-glpF-lox後,利用T4黏接酶接合剪切的DNA片段與剪切的質體,以得到質體pBlue-galP,其含galP
基因的部分上游區域及galP
基因的部分區域。
根據質體pBlue-galP設計gal3引子(SEQ ID NO:24)與gal4引子(SEQ ID NO:25),gal3引子有限制酶Nde
I的剪切位,gal4引子有限制酶Bam
HI的剪切位。以質體pBlue-galP為模板,使用此二引子對其進行PCR,以增幅出一含galP
基因之部分上游區域及galP
基因之部分區域的線性DNA片段。使用限制酶Nde
I與限制酶Bam
HI剪切線性DNA片段與質體pLoxKm-Trc後,利用T4黏接酶接合剪切的線性DNA片段與剪切的質體,以得到一質體pTrc-galP,此依序含galP
基因的部分上游區域、LoxP位、抗卡納黴素基因、LoxP位、Trc啟動子、galP
基因的部分區域。
依照質體pTrc-galP設計gal5引子(SEQ ID NO:26)及gal6引子(SEQ ID NO:27),並以質體pTrc-galP為模板,利用此二引子對其進行PCR。以上述「電穿孔法」將增幅得到的直線DNA片段轉形至菌株N30,再參照Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97 (12): 6640-5,自轉形後的菌株N30中移除LoxP位、抗卡納黴素基因。而,此處最後得到的菌株N30稱為「菌株N30-1」同樣地,於電穿孔法轉形前,以上述「化學轉形法」將質體pKD46轉形至菌株N30內。
Ⅱ、λ噬菌體PR
啟動子取代glk
基因的啟動子
根據大腸桿菌菌株BL21染色體設計glk1引子(SEQ ID NO:28)與glk2引子(SEQ ID NO:29),glk1引子有限制酶Sac
I的剪切位,glk2引子有限制酶Eco
RV的剪切位。以菌株BL21染色體為模板,利用此二引子對其進行PCR,以增幅出一含glk
基因之部分上游區域及glk
基因之部分區域的DNA片段。以限制酶Sac
I與限制酶Eco
RV剪切DNA片段與質體pBluescript後,利用T4黏接酶接合剪切的DNA片段與剪切的質體,以得到質體pBlue-glk,其含glk
基因的部分上游區域及glk
基因的部分區域。
依據質體pBlue-glk設計glk3引子(SEQ ID NO:30)與glk4引子(SEQ ID NO:31),glk3引子有限制酶Nde
I的剪切位,glk4引子有限制酶Bam
HI的剪切位。以質體pBlue-glk為模板,使用此二引子對其進行PCR,以增幅得出一含glk
基因之部分上游區域及glk
基因之部分區域的線性DNA片段。使用限制酶Nde
I與限制酶Bam
HI剪切線性DNA片段與質體pLoxKm-PR後,利用T4黏接酶接合剪切的線性DNA片段與剪切的質體,以得到一質體pPR-glk,此依序含glk
基因的部分上游區域、LoxP位、抗卡納黴素基因、LoxP位、λ噬菌體PR
啟動子、glk
基因的部分區域。
以質體pPR-glk為模板,利用glk1引子與glk2引子對其進行PCR。以上述「電穿孔法」將增幅得到的直線DNA片段轉形至菌株N30-1,再參照Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97 (12): 6640-5,自轉形後的菌株N30-1中移除LoxP位、抗卡納黴素基因、及質體pKD46。而,此處最後得到的菌株N30-1稱為「菌株N30-Gal」。
《實施例4》
分別接種菌株N30與菌株N30-Gal至20mL之含1.5g/L酵母粉、0.3%葡萄糖及0.3%甘油的M9液態培養基(6g/L的Na2
HPO4
、3g/L的KH2
PO4
、0.5g/L的NaCl、1g/L的NH4
Cl、1mM的MgSO4
.7H2
O、0.1mM的CaCl2
),其起始濃度為OD550
=0.08。接著,菌液於30℃培養箱內以250rpm震盪培養,並採用高效率液相層析儀分析不同培養時間後的菌液葡萄糖濃度與甘油濃度。
如圖3所示,菌株N30先消耗甘油,而於甘油消耗完後,再開始消耗葡萄糖。而且,於培養10小時後,菌株N30消耗完這二種碳源。又如圖4所示,菌株N30-Gal同時消耗這二種碳源,且於培養8小時後,消耗完畢。亦即,菌株N30-Gal於有氧下可同時進行甘油有氧代謝、甘油無氧代謝、與葡萄糖有氧代謝。
《實施例5》
依質體pET-TrHDTCh(參考中華民國發明專利公開號201418462)設計TrH1引子(SEQ ID NO:32)與TrH2引子(SEQ ID NO:33),TrH1引子有限制酶Sac
I的剪切位,TrH2引子有限制酶Nhe
I的剪切位。以質體pET-TrHDTCh為模板,利用此二引子對其進行PCR,以增幅得一含T7啟動子可操作地連接之TrxA/D-HDT融合基因的DNA片段。以限制酶Sac
I與限制酶Nhe
I剪切DNA片段與質體pPhi80-Km(參考Biotechnol Bioeng. 2008; 101 (5): 985-95)後,利用T4黏接酶接合剪切的DNA片段與剪切的質體,以得到質體pφ80-WTrHDTCh,其依序含attB位、T7啟動子、TrxA/D-HDT融合基因。
參考Biotechnol Bioeng. 2008; 101 (5): 985-95,將質體pφ80-WTrHDTCh各自轉形至菌株N30與菌株N30-Gal,且轉形前,轉形質體pAH123至此二菌株。如此一來,菌株染色體上的attP位會與質體pφ80-WTrHDTCh上的attB位進行同源重組(homologous recombination),以將T7啟動子與TrxA/D-HDT融合基因鑲嵌於染色體上,且T7啟動子可操作地連接於TrxA/D-HDT融合基因。其中,轉形後的菌株N30稱為重組菌株N30(φ80-TrHDT),轉形後的菌株N30-Gal稱為重組菌株N30-Gal(φ80-TrHDT)。
自LB固態培養基中挑選此等重組菌株的一菌落至5mL的LB液態培養基後,菌液於37℃培養箱內以200rpm震盪培養16小時,再接種至20mL之含0.2%麩醯胺酸、0.3%葡萄糖與0.2%甘油的M9液態培養基(6g/L的Na2
HPO4
、3g/L的KH2
PO4
、0.5g/L的NaCl、1g/L的NH4
Cl、1mM的MgSO4
.7H2
O、0.1mM的CaCl2
),其起始濃度為OD550
=0.08。接著,菌液於37℃培養箱內以250rpm震盪培養,直到其濃度達OD550
=1.0,再加入30μM的阿拉伯糖並於30℃下繼續培養4小時,以誘導重組菌株表現重組融合蛋白質TrxA/D-HDT。然後,先自培養液收集菌體並以0.1M的Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)清洗菌體,再將菌體懸浮於1mL的Tris-HCl緩衝液。超音波作用於懸浮後的緩衝液以打破菌體,其中超音波條件如下:震幅強度為35%、開啟/關閉時間為1秒/1秒、總作用時間為3分鐘。最後,於4℃下以15,294Xg轉速離心超音波處理後的緩衝液10分鐘,並取5μL所得的上層液及2μL所得的下層液進行非原態硫酸十二酯鈉-聚丙烯醯胺電泳分析表現的重組融合蛋白質TrxA/D-HDT。
如圖5所示,此二重組菌株均可表現可溶性重組融合蛋白質TrxA/D-HDT與不可溶性重組融合蛋白質TrxA/D-HDT。又如表二所示,此二重組菌株均可消耗完甘油,但重組菌株N30-Gal(φ80-TrHDT)的葡萄糖消耗量、可溶性重組融合蛋白質TrxA/D-HDT表現量、與不可溶性重組融合蛋白質TrxA/D-HDT表現量約為重組菌株N30(φ80-TrHDT)的2.3倍、1.4倍與1.27倍。由此可知,重組菌株N30-Gal(φ80-TrHDT)於有氧下同時進行甘油代謝與葡萄糖有氧代謝,這不僅可提升甘油與葡萄糖代謝速率,還可提升重組蛋白質的表現量。 表二
惟以上所述者,僅為本發明之較佳實施例,但不能以此限定本發明實施之範圍;故,凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效改變與修飾,皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
無
圖1說明著大腸桿菌的甘油無氧代謝、甘油有氧代謝、及葡萄糖有氧代謝;圖中符號說明為:+,活化基因的表現;-,抑制基因的表現。 圖2為非原態硫酸十二酯鈉-聚丙烯醯胺電泳圖,以說明菌株生產的可溶性蛋白質;其中,徑M,蛋白質標準物;徑1,重組菌株BAD5/pChHDT生產的可溶性蛋白質;徑2,重組菌株N30/pChHDT生產的可溶性蛋白質;箭頭,D-HDT。 圖3顯示菌株N30之液態培養基於不同時間培養後的葡萄糖與甘油濃度。 圖4顯示菌株N30-Gal之液態培養基於不同時間培養後的葡萄糖與甘油濃度。 圖5為非原態硫酸十二酯鈉-聚丙烯醯胺電泳圖,以說明菌株生產的蛋白質;其中,徑M,蛋白質標準物;徑1,重組菌株N30-Gal(φ80-TrHDT)生產的可溶性蛋白質;徑2,重組菌株N30(φ80-TrHDT)生產的可溶性蛋白質;徑3,重組菌株N30-Gal(φ80-TrHDT)生產的不可溶性蛋白質;徑4,重組菌株N30(φ80-TrHDT)生產的不可溶性蛋白質;箭頭,融合蛋白質TrxA/D-HDT。
<110>逢甲大學 <120>有氧下可提升重組蛋白質表現的菌株 <160>33 <210>1 <211>29 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>Ta1引子 <400>1 ctgggaattc agcttatcat cgactgcac 29 <210>2 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>Ta2引子 <400>2 attccacaca ttatacgagc 20 <210>3 <211>29 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>PK1引子 <400>3 ggtgacccgg gttgcatgta atcctaagg 29 <210>4 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>PK2引子 <400>4 cacgcacggt gttagaattc 20 <210>5 <211>32 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>PT09185引子 <400>5 ccgcgactcg agtgatgagt ctgctcgaag tc 32 <210>6 <211>35 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>PT09186引子 <400>6 Tgctgttcta gagcttccag tttctcaaac acttc 35 <210>7 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>PT09187引子 <400>7 gcaatcggat cctgaagagt taatg 25 <210>8 <211>34 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223> PT09188引子 <400>8 tccggacata tgagtcaaac atcaaccttg aaag 34 <210>9 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>PT09189引子 <400>9 ctttgcgctt gtcgaaacag 20 <210>10 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>PT09190引子 <400>10 tcctgaattg caaggcgttg 20 <210>11 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>gldA1引子 <400>11 ccggaggtac catgaaatgt gccagtgc 28 <210>12 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>gldA2引子 <400>12 gtactgagct cgtacggttc aggagctg 28 <210>13 <211>30 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>gldA3引子 <400>13 gagcacatat ggaccgcatt attcaatcac 30 <210>14 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>gldA4引子 <400>14 ttgctccttt agagatgagt agtgc 25 <210>15 <211>19 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>gldA5引子 <400>15 ccatgaaatg tgccagtgc 19 <210>16 <211>39 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>dhakA+
引子 <400>16 catcattgat caattttttc atatggatca acctcctta 39 <210>17 <211>40 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>dhakA-
引子 <400>17 gtcgttgaac atcatccatg cccattaatg tcgacgatcc 40 <210>18 <211>45 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>dhakB+
引子 <400>18 ttgttcgtcc agtacgtctt gcacatcatt gatcaatttt ttcat 45 <210>19 <211>45 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>dhakB-
引子 <400>19 ttcatcggca gtcagtggtc gccgtgtcgt tgaacatcat ccatg 45 <210>20 <211>40 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>dhakC+
引子 <400>20 gctttcgcca gtcctgccag ttgttcgtcc agtacgtctt 40 <210>21 <211>40 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>dhakC-
引子 <400>21 ccttgcctga tgcacaatgg attcatcggc agtcagtggt 40 <210>22 <211>29 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>gal1引子 <400>22 aacagggtac cggcaacaaa caaaattgc 29 <210>23 <211>30 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>gal2引子 <400>23 tggaagagct cttttggata ggcgttcacg 30 <210>24 <211>29 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>gal3引子 <400>24 agtagcatat gcctgacgct aaaaaacag 29 <210>25 <211>33 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>gal4引子 <400>25 tatttggatc cgtgaattaa gataggtgag tac 33 <210>26 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>gal5引子 <400>26 accggcaaca aacaaaattg c 21 <210>27 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>gal6引子 <400>27 tcttttggat aggcgttcac g 21 <210>28 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>glk1引子 <400>28 ggcatggagc tcgctgaaac ggataacc 28 <210>29 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>glk2引子 <400>29 tccagatggc taaaaccgag 20 <210>30 <211>30 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>glk3引子 <400>30 gaagacatat gacaaagtat gcattagtcg 30 <210>31 <211>30 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>glk4引子 <400>31 gaagaggatc cgctaaagtc aaaataattc 30 <210>32 <211>31 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>TrH1引子 <400>32 actatgagct cccgcgaaat taatacgact c 31 <210>33 <211>35 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>TrH2引子 <400>33 ctccgctagc ttcttgcttg tatttgcggc gcttc 35
Claims (12)
- 一種有氧下可提升重組蛋白質表現的菌株,係屬於大腸桿菌,且包括: 至少一非內源啟動子,係可操作地連接至該菌株之染色體上的glpF 基因、gldA 基因、dhaKLM 基因操縱組、及araE 基因; 一araBAD 啟動子,係可操作地連接至該染色體上的T7 RNA聚合酶基因;以及 一T7啟動子,係可操作地連接至一重組蛋白質基因; 其中,該菌株缺少araABD 基因操縱組、及araFGH 基因操縱組。
- 如請求項第1項所述之菌株,其中該非內源啟動子係選自於由EM7啟動子、Trc啟動子、及λ噬菌體PR 啟動子所組成的群組。
- 如請求項第1項所述之菌株,其中該連接至glpF 基因的非內源啟動子係為Trc啟動子,該連接至gldA 基因的非內源啟動子係為λ噬菌體PR 啟動子,而該連接至dhaKLM 基因操縱組的非內源啟動子係為λ噬菌體PR 啟動子。
- 如請求項第3項所述之菌株,其中該連接至glpF 基因的非內源啟動子係位於該glpF 基因的上游區域,該連接至gldA 基因的非內源啟動子係位於該gldA 基因的上游區域,而該連接至dhaKLM 基因操縱組的非內源啟動子係位於該dhaKLM 基因操縱組的上游區域。
- 如請求項第1項所述之菌株,其中該重組蛋白質基因係位於該菌株的染色體上,或位於該菌株內的一質體中。
- 如請求項第1或5項所述之菌株,其中該T7啟動子係位於該重組蛋白質基因的上游區域。
- 一種有氧下可提升重組蛋白質表現的菌株,係屬於大腸桿菌,且包括: 至少一非內源啟動子,係可操作地連接至該菌株之染色體上的glpF 基因、gldA 基因、dhaKLM 基因操縱組、araE 基因、galP 基因、及glk 基因; 一araBAD 啟動子,係可操作地連接至該染色體上的T7 RNA聚合酶基因;以及 一T7啟動子,係可操作地連接至一重組蛋白質基因; 其中,該菌株缺少araABD 基因操縱組、araFGH 基因操縱組、及ptsG 基因。
- 如請求項第7項所述之菌株,其中該非內源啟動子係選自於由EM7啟動子、Trc啟動子、及λ噬菌體PR 啟動子所組成的群組。
- 如請求項第7項所述之菌株,其中該連接至glpF 基因的非內源啟動子係為Trc啟動子,該連接至gldA 基因的非內源啟動子係為λ噬菌體PR 啟動子,該連接至dhaKLM 基因操縱組的非內源啟動子係為λ噬菌體PR 啟動子,該連接至galP 基因的非內源啟動子係為Trc啟動子,而該連接至glk 基因的非內源啟動子係為λ噬菌體PR 啟動子。
- 如請求項第9項所述之菌株,其中該連接至glpF 基因的非內源啟動子係位於該glpF 基因的上游區域,該連接至gldA 基因的非內源啟動子係位於該gldA 基因的上游區域,該連接至dhaKLM 基因操縱組的非內源啟動子係位於該dhaKLM 基因操縱組的上游區域,該連接至galP 基因的非內源啟動子係位於該galP 基因的上游區域,而該連接至glk 基因的非內源啟動子係位於該glk 基因的上游區域。
- 如請求項第7項所述之菌株,其中該重組蛋白質基因係位於該菌株的染色體上,或位於該菌株內的一質體中。
- 如請求項第7或11項所述之菌株,其中該T7啟動子係位於該重組蛋白質基因的上游區域。
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