CN110684792A - 一种可反复消除的乙醇酸传感器及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可反复消除的乙醇酸传感器及其构建方法，属于合成生物技术领域。本发明以乙醇酸响应蛋白GlcC和乙醇酸结合机理为基础，增加远红色荧光蛋白的表达，排除了传统方法单细胞荧光中拷贝数及细胞大小造成的荧光信号干扰。本发明结合了大肠杆菌温敏型复制子Ori101，实现了高温培养反复消除。从而建立了一种精确反应乙醇酸含量且能够反复消除的乙醇酸生物传感器。对于强化乙醇酸的生产策略尤其是诱变育种具有重要意义，不仅为高通量筛选提供了重要工具，而且其可反复消除的特性极大的缩短了育种时间。

Description

一种可反复消除的乙醇酸传感器及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种可反复消除的乙醇酸传感器及其构建方法，属于合成生物技术领域。

背景技术

乙醇酸是极具工业价值的双碳羟基羧酸，应用于包装、纺织、医疗和化妆品等领域。目前合成乙醇酸的方法主要是大肠杆菌以葡萄糖为底物全生物合成乙醇酸，具有价格低廉，操作简单，产品纯度高的优点。若采取诱变育种的策略，乙醇酸的产量有望进一步提升,为了建立乙醇酸快速检测方法，根据乙醇酸和调控蛋白GlcC结合的机理，已构建了检测乙醇酸含量的生物传感器。但是目前的传感器伴随着很多问题，如检测的本底高，动态调节范围小，GlcC对乙醇酸响应不灵敏等问题，不能够真正的应用于高通量筛选。对此，建立一种信噪比高，反应灵敏而且可反复消除的乙醇酸传感器在高通量筛选生产菌株的过程中具有重要意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明更换glcC启动子元件，提供了一种本底低、检测限高的生物传感器，所述生物传感器，是以乙醇酸响应的调控蛋白GlcC为基础构建的反馈响应系统，当细胞乙醇酸合成量增加后诱导绿色荧光蛋白的表达，从而将乙醇酸含量信号转换为荧光信号。

本发明的第一个目的是提供一种生物传感器，包括P_glcD、glcC、第一标记物基因、第二标记物基因和温敏型复制子Ori101；所述传感器中的基因沿基因表达的方向依次为第一标记物基因、glcC基因和第二标记物基因；所述P_glcD调控第二标记物基因的表达；所述P_glcD上整合GlcC-glycolate变构蛋白的结合位点；P_glcD的上游设置顺式反应元件上游增强因子UAS；所述启动子P_ffS位于glcC上游并调控glcC的表达；组成型启动子P_consensitive调控第一标记物基因的表达。

在一种实施方式中，所述第一标记物基因为远红色荧光蛋白基因FRFP基因；所述第二标记物基因为绿色荧光蛋白sfGFP基因。

在一种实施方式中，P_glcD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述P_glcC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述基因glcC的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述UAS的序列如SEQ ID NO.4所示；所述FRFP基因的序列如SEQ ID NO.5所示。

在一种实施方式中，所述生物传感器携带了一个组成型表达的红色荧光蛋白，从而可以校准由于不同细胞内质粒拷贝数不同和细胞体积不同所造成的信号差异。

在一种实施方式中，所述生物传感器通过检测所得绿色荧光强度与红色荧光强度的比值作为最终信号强度，从而排除拷贝数不同的干扰。

在一种实施方式中，所述生物传感器所在质粒与大肠杆菌的温敏型复制起点相结合，从而可实现在42℃连续传代培养反复消除的效果。

在本发明的一种实施方式中，以GlcC和其调控启动子P_glcD构建传感器，组成型表达远红色荧光蛋白校准了质粒拷贝数和细胞大小所造成的误差，并以不同乙醇酸浓度诱导，研究了GlcC蛋白对于乙醇酸的响应范围。发现乙醇酸浓度在0-150mM内荧光比呈现较好的线性关系。

本发明的第二个目的是提供携带所述传感器的质粒或细胞。

在一种实施方式中，所述质粒包括pKD46、pGBS-L-CT、pex-glcC、pKD4、pCP20、pGRT-ffs、pGRT-rmpH、pGRT-ymdBC、pGRT-yjiY、pGRT-yibN。

在一种实施方式中，所述细胞为产乙醇酸的基因工程菌。

本发明的第三个目的是提供所述生物传感器在筛选代谢乙醇酸或其上下游产物的菌株中的应用。

本发明的有益之处：构建了一种高信噪比的乙醇酸传感器，利用远红色荧光蛋白作参照，校准了拷贝数不同所造成的荧光信号差异。能够精确而又及时的反应细胞内乙醇酸的产量。并且能够在高温条件下反复消除，适用于后续的定向进化工作，能够实现快速的诱变育种与筛选。本发明的生物传感器在42℃传代培养5代后依然未消除的细胞占全部细胞的比例为为2.1个/百万细胞，且当检测150mM乙醇酸的时候仍然呈现良好的线性关系，其荧光信号是不加诱导物乙醇酸的96.9倍。

附图说明

图1为本发明所构建生物传感器原理图。

图2为大肠杆菌基因组中glcC对乙醇酸的响应。

图3为用于表达glcC不同启动子传感器菌株对不同浓度乙醇酸的响应程度。

图4A为乙醇酸生物传感器荧光信号比和不同浓度乙醇酸的线性拟合；B为生物传感器对不同浓度乙醇酸的的响应程度。

图5A为带有远红色荧光蛋白的可反复消除的生物传感器质粒图谱；B为高温消除生物传感器效率与传代次数之间的关系。

具体实施方式

菌种和质粒为本实验室保存，DNA聚合酶、限制性内切酶和T4连接酶均购自Takara公司，Gibson组装酶购自NEB公司。多功能酶标仪(BioTek)用于检测样品荧光强度。E.coliK-12MG1655(DE3)用于蛋白质表达，大肠杆菌JM109用于分子克隆。

可反复消除的乙醇酸传感器的构建：传感器质粒由三部分组成：1)Kan抗性基因，卡那抗性基因的上游为glcC及其上游的启动子P_ffS,，卡那基因的下游为sfGFP及其启动子P_glcD；2)用于控制拷贝数变量的远红色荧光蛋白；3)温敏型复制起点Ori101，以实现在42℃条件培养下质粒的消除。

整合GlcC-glycolate变构蛋白后的P_glcD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；P_ffS的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；基因glcC的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；UAS的序列如SEQ ID NO.4所示；FRFP的序列如SEQ ID NO.5所示；温敏型复制子Ori101的序列如SEQ IDNO.6所示。

表1引物序列表

下述实施例中所涉及的菌体培养采用LB培养基，培养条件为30℃、250rpm。乙醇酸体外诱导采用M9培养基，发酵条件为30℃、250rpm。

实施例1 glcC乙醇酸响应特性研究及传感器的设计

如图1所示，传感器包括启动子P_glcD、sfGFP蛋白、启动子P_ffS、glcC基因、启动子P_consensitive、编码FRFP蛋白的基因和温敏型复制子Ori101；所述启动子P_glcD启动sfGFP的表达，P_glcD上设有顺式反应元件增强因子UAS，UAS的核苷酸序列为CCGGACCTCGTGCACAGGTAGGACCAATTTTTCTG；所述P_glcD上整合GlcC-glycolate变构蛋白的结合位点；glcC的下游依次为卡那霉素抗性基因和温敏型复制子Ori101；所述glcD_P位于复制子Ori101的下游。所述glcC上游设置启动子P_ffS，编码所述FRFP蛋白的基因设置在glcC启动子P_ffS的上游，FRFP的表达通过组成型启动子P_consitituve调控。

该传感器的工作原理是：glcC编码的调控蛋白glcC能够与乙醇酸特异性结合，当菌株在有乙醇酸的条件下生长时，GlcC蛋白和乙醇酸结合成可变构蛋白GlcC-glycolate，和顺式反应元件(UAS)结合位点结合，增强glcD基因的表达。本研究根据这个顺式反应元件的特征，利用glcD基因的上游片段作为荧光蛋白基因sfGFP的启动子，构建了乙醇酸传感器质粒。将质粒导入到生产乙醇酸的工程菌株中，当培养基中中含有乙醇酸或者发酵过程中产生乙醇酸时，即可诱导传感器质粒上sfGFP基因的表达，使细胞产生荧光。

实施例2宿主细胞glcC的敲除及其对乙醇酸的响应

含有实施例1的传感器的E.coli K-12MG1655(DE3)在不加乙醇酸诱导的时候其绿色荧光本底表达极高，用不同浓度乙醇酸诱导时，其荧光最高值仅为最低值两倍，无法用于流式分选。对此设计带有同源臂的引物ex-F、ex-R以质粒pGBS-L-CT(构建方法公开于公开号为CN109520985A的专利申请文件中)为模板进行全质粒PCR，PCR产物纯化后利用Gibson进行连接。在原来的基础上构建了一个去除glcC的传感器质粒，并命名为pex-glcC。发现了当只有基因组中的glcC存在的时候其荧光值和乙醇酸浓度具有较好的线性关系(图2)当不存在乙醇酸时，其荧光值较低，当外加不同浓度的乙醇酸时，其荧光值随浓度的变化呈现相应的梯度变化，说明基因组的glcC对乙醇酸的响应是较为灵敏的。基于此结果，我们决定敲除基因组中的glcC,一是排除基因组中glcC对乙醇酸响应的干扰，二是避免今后诱变育种的过程中造成基因组上的glcC突变致使生物传感器失调,不能正确的反映乙醇酸的含量。

利用λ-Red重组法敲除glcC。

(1)pKD46电转化入E.coli K-12MG1655(DE3)菌株并制备其感受态，在制备过程中加L-阿拉伯糖诱导重组酶的的表达。由于同源重组质粒pKD46为温敏型质粒，所以整个过程要在30℃培养。

(2)根据NCBI上glcC的基因序列，设计带有glcC同源臂的卡那抗性基因引物ko-glcCF、ko-glcCR，以质粒pKD4为模板PCR扩增一段两端与glcC前后片段同源、中间含有卡那抗性基因的双链打靶DNA片段。将该片段电转化入上述感受态，在重组酶的作用下，Kan打靶DNA与基因组中glcC的同源处发生重组，卡那抗性基因置换glcC基因，并获得Kan抗性。抚育后涂布卡那抗性平板，置于37℃培养10-12小时，菌落PCR筛选阳性突变体并制备其感受态。

(3)将质粒pCP20电转化入阳性突变体，涂布氨苄抗性平板置于30℃过夜培养，挑取转化子30℃摇瓶培养8h后放入37℃继续培养以热诱导FLP翻转酶的的表达，消除基因组上的的抗性基因，划线验证后用验证引物veri-glcCF和veri-glcCR菌落PCR筛选出敲除正确的突变菌株。将glcC敲除的E.coliMG1655(DE3)作为乙醇酸体外诱导的宿主细胞。

实施例3用于表达glcC的启动子的替换

基于实施例2的结果，对比基因组上glcC对乙醇酸的线性响应关系，其荧光值和不同浓度乙醇酸的拟合系数R²＝0.957。推测目前传感器存在的本底表达过高及检测限低等问题是glcC的表达量没有得到合理的控制造成。所以选取另外5个不同强度的启动子替换P_CT用于表达glcC。

采用引物Pffs-F、Pffs-R；PyibN-F、PYibN-R；PymdBC-F、PymdBC-R；PrpmH-rnpAF、PrpmH-rnpAR；PyjiY-F、PyjiY-R以大肠杆菌MG1655(DE3)基因组为模板PCR扩增5个不同的启动子，分别为：ffS、rmpH-rnpA、ymdBC、yjiY、yibN，并使之两端带有酶切位点BamHⅠ和HindⅢ。将扩增后的启动子片段进行纯化。纯化后的启动子片段和质粒pGRT-CT分别进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切，酶切产物经胶回收后，用T4连接酶连接过夜，连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，转化产物涂布于含50mg/L卡那霉素的LB平板，经30℃培养过夜，平板上挑取菌落PCR筛选阳性转化子。获得阳性转化子后转入卡那抗性的液体LB培养基培养8-12小时，保存甘油管用于质粒的保存，随后抽提质粒，将抽提的质粒分别转化至100mL MG1655△glcC感受态，转化产物涂布于含50mg/L卡那霉素的LB平板，经30℃培养过夜。将转化子转接于液体LB培养基30℃摇床培养12-16小时，保存甘油管分别命名为MG△glcC(GRT-ffs)、MG△glcC(GRT-rmpH)、MG△glcC(GRT-ymdBC)、MG△glcC(GRT-yjiY)、MG△glcC(GRT-yibN)。从甘油管取20微升菌液接种至卡那霉素抗性的液体LB培养基中，30℃，250rpm过夜培养制备种子液。将种子液分别以初始OD0.05的接种量接种至M9培养基，其中所含葡萄糖浓度为4g/L。培养7-8小时后待OD长至0.6左右分别添加2.5M的乙醇酸母液0μL、0.4μL、2μL、4μL、20.4μL、41.5μL、64μL、87μL分别添加到1mLM9培养基中，分别达到终浓度0mM、1mM、5mM、10mM、50mM、100mM、150mM、200mM，诱导绿色荧光蛋白的表达。经过测试，在乙醇酸诱导后的第六小时荧光信号整体达到最高值，所以在第六小时取样50uL适当稀释并用酶标仪测定其绿色荧光值及OD值。发现在不加诱导物乙醇酸的时候P_ffS用于glcC的表达的本底荧光值最低，相比于原始传感器P_CT用于表达时，其单细胞荧光值由4200降至600，仅为原始传感器的1/7；并且其检测限也得到极大的提高。在200mM乙醇酸诱导时信号响应强度是无诱导细胞的63.7倍,而CT启动子用于glcC表达的原始传感器200mM乙醇酸诱导信号仅为无诱导细胞的2.4倍，并且荧光值在5mM乙醇酸诱导时即接近饱和状态(图3)。将筛选出的高信噪比的传感器pGRT-ffS用于后续实施例中的乙醇酸的检测。

实施例4组成型远红色荧光蛋白的引入

基于生物传感器的高通量筛选方法往往面临两方面挑战。第一，利用质粒表达目标基因时往往由于质粒拷贝数的变化而引起基因表达水平的变化。如果在质粒上单独表达glcC和sfGFP，则当细胞内质粒拷贝数增高时会引起sfGFP荧光信号增强，质粒拷贝数降低时会引起sfGFP荧光信号减弱。第二，由于不同细胞生长状态不同，体积更大的细胞包含的sfGFP数量更多，因此所产生的荧光信号更强。为了排除以上两方面的干扰，在同一质粒上组成型启动子表达远红色荧光蛋白(FRFP)。以FRFP荧光信号为标准校准sfGFP荧光信号，即以sfGFP/FRFP信号值表征传感器对不同浓度乙醇酸响应程度。

设计引物将原始传感器质粒扩增为线性化载体，扩增FRFP片段，(FRFP及其启动子序列如SEQ ID NO.5)，将线性化载体和FRFP片段通过Gibson连接，取10微升连接产物转化JM109感受态置于30℃培养，菌落PCR验证远红色荧光蛋白连接，构建带有远红色荧光蛋白的乙醇酸生物传感器。为了精确计算所述生物传感器对乙醇酸的响应程度，在例3的基础上设置更为密集的乙醇酸浓度梯度进行诱导，并将最高浓度提升至500mM,计算不同浓度乙醇酸诱导MG△glcC(GRT-ffS)单细胞sfGFP和FRFP信号，结果显示，随着乙醇酸诱导浓度的增加sfGFP/FRFP荧光信号不断增强。在0-150mM乙醇酸浓度范围内，sfGFP/FRFP信号强度与乙醇酸浓度基本呈线性变化趋势(图4A)。此时，其荧光信号值的最高点是无诱导细胞的96.9倍。而高浓度乙醇酸诱导并不会进一步增加sfGFP/FRFP信号，反而是信号值降低明显图(4B)。该发明所建立的基于glcC的生物传感器对乙醇酸检测浓度范围大，可检测0-150mM(14.7g/L),今后可用于基于流式细胞仪的高通量筛选系统。

实施例5高温可反复消除质粒的构建

为了便于乙醇酸生物传感器应用于高通量筛选，结合大肠杆菌温敏型复制起点Ori101和上述实施案例所构建的生物传感器，组建了高温可反复消除的系统(图5A)。生物传感器的消除是为了防止诱变系统造成传感器质粒的突变，从而导致传感器失去了正常的功能。当生物传感器高温消除之后即可进行诱变，诱变之后可将带有荧光蛋白的生物传感器转入诱变菌株进行发酵并且根据荧光信号的强弱进行流式筛选。这样反复消除系统的构建，可以实现高效的定向进化以及高通量筛选。

设计引物将带有远红色荧光蛋白的传感器质粒扩增为线性化，以质粒pKD46为模板扩增温敏型复制子Ori101及温敏型蛋白。将线性化载体与温敏型复制子片段进行Gibson连接，取10微升连接产物转化JM109感受态置于30℃培养，菌落PCR验证温敏型质粒的构建。高温可消除质粒的构建可以实现快速的诱变-导入传感器-筛选-高温消质粒-再诱变的工作，极大的提高了工作效率，缩短了育种时间。为验证温敏型质粒的消除效率，将带有传感器的菌株30℃培养8-12小时，以1％的接种量接种至无抗性的LB培养基中42℃培养，如此42℃连续传代培养，每传一代后分别在无抗性LB平板和卡那霉素抗性LB平板稀释合适比例涂板，30℃静置培养过夜后计算质粒消除效率。结果发现，连续传代5次后每1百万细胞中仅有2.1个细胞中未消除该质粒(图5B)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种可反复消除的乙醇酸传感器及其构建方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcccggacct cgtgcacagg taggaccaat ttttctgttc ttaactcgca aaacacgcac 60

atcacgtaag tgattatgtt acatcaattt aacattgagt taaccaagac aaggtcacag 120

agctggaaaa aaaatggtct gaccggtagc taaagagata gacgaaaacg aaaagcccgc 180

ttaataactg ttcacagaag cagcgcgcaa aaatcagctg ccacacaaca caacaaagcg 240

aagcctactc 250

<210> 2

<211> 220

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atagccttcg ggaatagcgg cgacgatttg ccagacgcgt tggggaaatg aatcttcttt 60

ttccatcttt tcttcctgag gtaatttttc agcataatct ggaaaaacgc ccgagtgaag 120

tcgcattgcg caagaaacca gcatctggca cgcgatgggt tgcaattagc cggggcagca 180

gtgataatgc gcctgcgcgt tggttctcaa cgctctcaat 220

<210> 3

<211> 765

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaaagatg aacgtcgccc tatttgcgaa gtggttgcag agagtatcga acggttaatt 60

atcgacggcg tactgaaggt cggtcagccg cttccctcgg aacgtcgact gtgtgaaaag 120

ctcggcttct cacgctccgc actgcgtgaa gggctgaccg tgctgcgcgg gcgcgggatt 180

attgaaacgg cgcagggtcg cgattctcgt gtcgcacggc ttaatcgggt gcaggacacc 240

agcccgctga tccatctgtt cagtacgcag ccgcgaacgc tgtacgatct gctcgacgtt 300

cgcgcattac tggagggcga atcggcaagg ctggcggcaa cgctgggaac gcaggctgat 360

tttgttgtga taacccgctg ttatgaaaaa atgctcgccg ccagtgagaa caacaaagag 420

atttcgctga tcgaacatgc gcagttggat cacgctttcc atctcgccat ttgtcaggct 480

tctcacaatc aggtgctggt gtttacgctg caatcattga ccgatctgat gtttaattca 540

gtgtttgcca gcgtaaataa tctctaccat cgaccacagc aaaaaaagca gatcgatcgc 600

cagcatgcgc ggatctacaa cgcggtgttg cagcggctgc cgcacgtcgc ccagcgcgca 660

gcacgcgatc atgtgcggac cgtgaaaaag aatctccacg atatcgagct ggaaggccac 720

catttgattc gctcggcggt gccgctggag atgaacctga gttag 765

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccggacctcg tgcacaggta ggaccaattt ttctg 35

<210> 5

<211> 895

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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ggaggctttt gacttggctc cagcctacac atcatctgtg ccccagtttg ctagggaggt 120

cgcagtatct ggccacagcc acctcgtgct gctcgacgta ggtctctttg tcggcctcct 180

tgattctttc cagtcttctg tccacatagt agacgccggg catcttgagg ttcttagcgg 240

gtttcttgga tctgtatgtg gtcttcaagt tgcagatcag gtggcccccg cccacgagct 300

tcagggccat gtcggctctg ccttccaggc cgccgtcagc ggggtacagg gtctcggtgg 360

aggcctccca gccgagtgtt ttcttctgca tcacagggcc gttggatggg aagttcaccc 420

ctctgatctt gacgttgtag atgaggcagc cgtcctggag gctggtgtcc tgggtagcgg 480

tcagcacgcc cccgtcttcg tatgtggtga ctctctccca tgtgaagccc tcggggaagg 540

actgcttaaa gaagtcgggg atgccctggg tgtggttgat gaaggttttg ctgccgtaca 600

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ttctcatggt ctgggtgccc tcgtagggct tgccttcgcc ctcggatgtg cacttgaagt 720

ggtggttgtt cacggtgccc tccatgtaca gcttcatgtg catgttctcc ttaatcagct 780

cgctcaccat atgtatatct ccttcttaaa gttaaatcca caaacactaa gagccggatg 840

attaattgtc aatcagatcc ttccgtattt agccagtatg ttctctaggt agaaa 895

<210> 6

<211> 741

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gttgatgata ccgctgcctt actgggtgca ttagccagtc tgaatgacct gtcacgggat 60

aatccgaagt ggtcagactg gaaaatcaga gggcaggaac tgctgaacag caaaaagtca 120

gatagcacca catagcagac ccgccataaa acgccctgag aagcccgtga cgggcttttc 180

ttgtattatg ggtagtttcc ttgcatgaat ccataaaagg cgcctgtagt gccatttacc 240

cccattcact gccagagccg tgagcgcagc gaactgaatg tcacgaaaaa gacagcgact 300

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accgagcttg cgagggtgct acttaagcct ttagggtttt aaggtctgtt ttgtagagga 420

gcaaacagcg tttgcgacat ccttttgtaa tactgcggaa ctgactaaag tagtgagtta 480

tacacagggc tgggatctat tctttttatc tttttttatt ctttctttat tctataaatt 540

ataaccactt gaatataaac aaaaaaaaca cacaaaggtc tagcggaatt tacagagggt 600

ctagcagaat ttacaagttt tccagcaaag gtctagcaga atttacagat acccacaact 660

caaaggaaaa ggactagtaa ttatcattga ctagcccatc tcaattggta tagtgattaa 720

aatcacctag accaattgag a 741

Claims (10)

1.一种生物传感器，其特征在于，包括P_glcD、glcC、第一标记物基因、第二标记物基因和温敏型复制子Ori101；所述传感器中的基因沿基因表达的方向依次为第一标记物基因、glcC基因和第二标记物基因；所述P_glcD调控第二标记物基因的表达；所述P_glcD上整合glcC-glycolate变构蛋白的结合位点；P_glcD的上游设置顺式反应元件上游增强因子UAS；组成型启动子P_consensitive调控第一标记物基因的表达。

2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，以启动子P_ffS、P_rmpH-rnpA、P_ymdBC、P_yjiY或P_yibN调控glcC的表达。

3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述第一标记物基因为远红色荧光蛋白基因FRFP基因；所述第二标记物基因为绿色荧光蛋白sfGFP基因。

4.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，P_glcD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述P_glcC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述基因glcC的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述UAS的序列如SEQ ID NO.4所示；所述温敏型复制子Ori101的序列如SEQ IDNO.6所示。

5.携带权利要求1～4任一所述生物传感器的质粒或细胞。

6.根据权利要求5所述的质粒，其特征在于，所述质粒包括pKD46、pGBS-L-CT、pex-glcC、pKD4、pCP20、pGRT-ffs、pGRT-rmpH、pGRT-ymdBC、pGRT-yjiY或pGRT-yibN。

7.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述细胞为大肠杆菌细胞。

8.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，携带权利要求1～3任一所述的生物传感器或权利要求4所述的质粒。

9.根据权利要求8所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌包括E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α、E.coli TOP10中的任一种。

10.权利要求1～4任一所述的生物传感器在筛选代谢乙醇酸或其上下游产物的菌株中的应用。

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