CN112011587A - 一种可擦除并重写的活细胞传感记录系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及合成生物学及生物医药领域，一种可擦除并重写的活细胞传感记录系统及其应用，通过响应环境刺激，产生即时信号与长期信号，根据需要擦除并重写记录的活细胞传感记录系统；所述环境刺激包括环境污染物、小分子化合物和/或疾病标志物；所述即时信号包括荧光蛋白、色素蛋白、显色酶和/或超声气体囊泡；所述长期信号以DNA为记录载体，包括基因组DNA或质粒DNA；所述活细胞为移植有响应环境刺激的生物传感电路，记录元件，报告元件，记录载体的活体细菌。此方法具有扩展到能够在难以接近的环境中执行复杂任务的多功能化生物传感记录系统的巨大潜力。

Description

一种可擦除并重写的活细胞传感记录系统及其应用
技术领域
本发明涉及合成生物学及生物医药领域，具体涉及活细胞传感记录系统及其应用。
背景技术
由于具有耐久性，低成本，环境友好性的特点，活细胞传感器已经被设计并应用于疾病生理标志物，重金属污染物以及其他重要化合物甚至是核酸的检测。传统的活细胞传感器依赖于荧光，显色或发光等报告分子。这些分子的检测需要难以携带的特定检测器进行连续操作。然而，人们感兴趣的许多重要分子事件是稍纵即逝且难以接近的，检测装置的不便利性使得传统的活细胞传感器难以在原始环境中对分子事件进行长期连续的监测和研究。近来，基于DNA写入技术的活细胞传感记录器被创建以捕获瞬时信号，这种新型的活细胞传感器能够将外界刺激记录到细胞群体或个体细胞的DNA中，即使在原信号消失后也能够通过测序技术或蛋白质功能测定等手段方便的获取原始信息。活细胞传感记录器的出现和发展使瞬时分子信息的长期监测成为了可能。早先的工作表明基于重组酶的存储装置能够在活细胞中存储数字信息。然而，这些装置通常需要至少几百个碱基对的特定重组酶识别位点以反转靶DNA，且单向重组酶只能反转一次。因此，这种类型的存储器的可扩展性进一步受到正交重组酶的数量的限制。CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌在进化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，用来对抗噬菌体及其他外源核酸的入侵。近来，基于CRISPR-Cas系统的DNA写入技术被开发并被用作活细胞传感记录器。例如，基于Cas9的记录器用于细胞谱系追踪、哺乳动物细胞异种移植的炎症模型以及强力霉素与IPTG等外源刺激的记录。基于碱基编辑器的记录装置记录病毒、营养物质、抗生素和光照等刺激以及在活细胞中进行生物计算。基于Cas1-Cas2的活细菌传感记录器记录外源信号，如DNA及RNA片段等。
合成生物学与生物医学的快速发展，对活细胞传感记录器的设计和应用提出了更高的要求。一方面，设计并构建能够根据需要人为擦除和重写记录的生物逻辑电路将提高活细胞传感记录器的工作效率及使用寿命，尤其是应用于哺乳动物肠道或其他难以接近和操作的生物学环境中。另一方面，利用基因表达干扰，基因表达激活，基因敲除等策略对活细胞传感记录器进行多功能化设计，例如对外界刺激的即时报告，长期记录以及其他重要的生物学功能(药物释放，生物防护等)是活细胞传感记录器应用于复杂合成生物学、分析化学以及生物医学的基础。因此，尽管DNA写入技术有了巨大的进步，但是，发展多功能化的，持久的和高度可复用的活细胞记录器仍然是生命科学的一大挑战。
发明内容
针对现有活细胞传感记录器功能单一且难以便捷精确重写的不足，本发明设计并构建了一种可擦除并重写的活细胞传感记录系统，通过响应环境刺激，产生即时信号与长期信号，根据需要擦除并重写记录的活细胞传感记录系统；
所述环境刺激包括但不局限于环境污染物、小分子化合物和/或疾病标志物；
所述即时信号包括但不局限于荧光蛋白、色素蛋白、显色酶和/或超声气体囊泡；所述长期信号以DNA为记录载体，包括但不局限于基因组DNA或质粒DNA；
所述活细胞为移植有响应环境刺激的生物传感电路，记录元件，报告元件，记录载体的活体细菌。
进一步的，所述环境污染物是亚砷酸盐。
进一步的，所述小分子化合物是如阿拉伯糖。
进一步的，所述疾病标志物是肠道炎症标志物硫代硫酸盐或连四硫酸盐。
进一步的，所述长期信号以DNA为记录载体，是DNA刻录与蛋白质功能偶联，即DNA刻录可以转换为蛋白质活性的激活或敲除，从而产生可读的DNA测序信号以及蛋白质功能信号。
进一步的，可擦除并重写的活细胞传感记录系统将环境刺激转换为碱基编辑器BE2基因的表达，碱基编辑器与多条sgRNA形成复合物，分别执行干扰报告基因的表达以及DNA刻录的功能，从而将环境刺激进一步转换为报告基因表达活性变化以及DNA单碱基突变以实现环境刺激的即时报告和长期记录。
进一步的，记录系统中记录位点为靶标序列中特定的碱基，该碱基的转变与特定蛋白的功能活性偶联，随着记录过程的进行，细菌群体中该位点碱基的转换(记录)进一步导致特定蛋白(荧光，显色酶或超声气体囊泡等)功能的改变，敲除或翻译激活，从而在DNA和蛋白质层面产生长期可读的信号输出，即通过Sanger测序或功能性蛋白质的活性测定来记录分子事件出现或存在的历史过程。
进一步的，所述的特定蛋白同样可以是特异性的RNA聚合酶(如T7RNA聚合酶)，转录调节因子等，此类蛋白的翻译激活或敲除，能够引起一系列基因表达的激活或抑制，从而将单碱基的突变转化为多基因转录及翻译表达的控制。
进一步的，该系统能够根据需要进行精确的擦除和重写。在系统中，工程菌完成记录环境信号的功能后，在特定刺激的作用下，能够重置细菌群体的生物学状态，从而开始新一轮的记录。
进一步的，擦除和重写方式包括但不局限于：通过单碱基转换敲除(CAG→TAG等)工程化细菌的抗性基因，添加适当浓度的抗生素调整记录菌株与原始菌株的比例，实现记录信息的擦除；通过单碱基转换激活(ACG→ATG等)诱导型启动子控制的细菌毒素蛋白ccdB基因的翻译，添加适当浓度的诱导剂进一步激活ccdB的基因转录，使得ccdB基因的转录和翻译同时激活以使记录细菌自我裂解，实现记录信息的擦除和重写。
进一步的，引发记录状态重置的诱导信号包括但不局限于木糖，阿拉伯糖，药物分子(阿司匹林等)等诱导系统，上述刺激的添加能够重置细菌群体的生物学状态，从而擦除记录信息。
本发明还提出了一种可擦除并重写的活细胞传感记录系统的应用，是用于监测与疾病相关的生理标志物或其他分子。
与现有技术相比，发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明设计的活细胞传感记录系统不仅能够即时报告环境刺激的存在，同时能够以剂量依赖性方式在细菌DNA介质中记录环境刺激，记录信息不仅可以通过DNA测序的方式获取，还可以通过报告基因表达强度的变化直接读取。
(2)本发明设计的活细胞传感记录系统将传感记录器的记录位点与特定蛋白的功能相偶联，从而在DNA和蛋白质层面产生长期可读的生物学信号。
(3)本发明设计的活细胞传感记录系统可以根据需要精确的擦除和重写。这种长期可重写，即时信号(报告基因)和长期信号(DNA刻录)相结合的活细胞传感器记录器设计，具有可以扩展到更复杂的记录系统的潜力，以在传统传感器难以访问的环境中执行复杂的应用，例如监测与疾病相关的生理标志物或其他分子。
附图说明
图1是工程化细菌群体长期可重写的报告和记录环境刺激的示意图及模拟输出结果示意图；
图2是可重写的活细胞传感记录系统的基因电路示意图；
图3是工程化细菌群体长期可重写的报告和记录重金属污染物亚砷酸盐；
图4是工程化细菌群体长期可重写的报告和记录营养物质阿拉伯糖；
图5是工程化细菌检测肠道炎症标志物硫代硫酸盐；
图6是基于细菌毒素蛋白ccdB及温控型启动子的记录信息重置。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
图1是工程化细菌群体长期可重写的报告和记录环境刺激的示意图及模拟输出结果示意图。
符号说明：
图2中，记录位点序列为：
5-TCAGTGCTTTGCTCGTTATC-3′其中下划线碱基为记录位点，
isgRNA序列为：
5-CAUAGAGUUGGACCAGAAUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU-3′，其中下划线序列与靶标序列互补，
ssgRNA序列为：
6-UCAGUGCUUUGCUCGUUAUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU-3′，其中下划线序列与靶标序列互补。
图3和4中，“+”代表添加诱导剂亚砷酸盐/阿拉伯糖，“-”代表去除诱导剂亚砷酸盐/阿拉伯糖，“R”代表添加卡那霉素重置菌群状态。
通过下述实施例将有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容。
以下实施例中所用试剂、材料：重组酶，高保真DNA聚合酶购自上海翊圣生物科技有限公司，限制性核酸内切酶SalI、PacI购自NEB，琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自北京全式金生物，所有DNA、基因片段合成于上海生工生物工程有限公司，链霉素、卡那霉素、L-阿拉伯糖、亚砷酸盐和其他化学品均购自Sigma-Aldrich。pWT-021a，pKD236，pKD237质粒购自美国Addgene，ParsD-ABS-10质粒为本实验室保藏。
实施例1
设计并构建能够长期可重写的报告并记录重金属污染物亚砷酸盐的活细胞传感记录系统。
质粒构建：
将合成的Pj23119-isgRNA-ssgRNA基因片段(上海生工生物工程有限公司)克隆到SalI/PacI双酶切的pWT-021a质粒主链中，构建了质粒模板pWT-021a-Pj23119-isgRNA-ssgRNA。通过引物对P1/P2从pWT-021a-Pj23119-isgRNA-ssgRNA质粒中扩增了BE2-Pj23119-isgRNA-ssgRNA，使用引物P3/P4从质粒pWT-021a扩增抗性基因和质粒骨架，以ParsD-ABS-10质粒为模板，通过引物对P5/P6扩增亚砷酸盐响应元件。通过多片段同源重组构建质粒pWT-As-BE2-isg-ssg。
酶切体系为：5μL Buffer、4μL PacI限制性内切酶、4μL SalI限制性内切酶、30μLpWT-021a质粒、7μL ddH2O。酶切产物进行琼脂糖电泳，用胶回收试剂盒对进行线性质粒回收。
通过PCR扩增目的基因。PCR反应体系为：25μL buffer、20μL ddH2O、1μL dNTP、1μL引物、1μL引物、1μL模板、1μL高保真DNA聚合酶。PCR反应程序为：95℃预变性10分钟，95℃变性20秒，56℃退火30s，72℃延伸1分钟/1000bp，从变性到延伸的过程循环34次，循环结束后72℃延伸5分钟，降温至12℃。PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，使用胶回收试剂盒进行纯化回收。
将得到的酶切质粒和目的片段通过多片段同源重组酶进行连接，重组反应条件为：6μL重组酶、4μL目的基因、2μL酶切质粒混匀后50℃水浴25min，冰上放置5分钟后加入DH5α感受态中，冰上放置30分钟后42℃热激90秒，冰上放置3分钟后加入500μL LB培养液在37℃，220rpm摇床中活化45分钟，涂布在含有50μg/mL硫酸链霉素的LB固体培养基平板中，37℃过夜培养，挑选单克隆送测序，保留测序正确的单克隆即可获得含有pWT-As-BE2-isg-ssg质粒的转化子。
报告基因插入大肠杆菌MG1655基因组：
通过PCR扩增以生成包含50bp的上下同源臂，Ptac-sfGFP(tac启动子表达的超折叠绿色荧光蛋白基因)基因片段、连接序列基因片段以及KanR(卡那霉素抗性基因)选择标记的融合基因片段，其中，编辑位点为sfGFP基因第205位的胞嘧啶，该位点突变为胸腺嘧啶后使得该位置出的谷氨酰胺密码子(CAG)突变为终止密码子(TAG)，进而导致荧光蛋白与卡那霉素抗性蛋白同时失活。将pKD46质粒转化到大肠杆菌MG1655中，将正确的的转化子在含0.2％阿拉伯糖的LB培养基中生长至OD600nm为0.6(30℃，220rpm)。在4℃条件下3000rcf离心10分钟收获培养物，并用预冷的10％甘油洗涤3次(每次3000rcf离心10分钟)以制备感受态细胞。将线性DNA片段在12.5kV/cm的电场强度下电击4毫秒，以转化入感受态细胞，37℃下活化2小时，并使用50mg/ml卡那霉素选择正确的基因组插入单克隆，命名为EPtis。
活细胞生物传感记录系统长期可重写的报告并记录重金属污染物亚砷酸盐：
将质粒pWT-As-BE2-isg-ssg转化入工程菌株EPtis后，对正确的转化子过夜活化后进行连续的传代培养，每代培养12小时，接种量为1/200：第1到第3次传代将培养物接种至含2μM诱导剂亚砷酸盐的液体培养基中；第4到第6次传代将培养物接种至无诱导剂的新鲜液体培养基中；第7到第9次传代将培养物接种至含2μM诱导剂亚砷酸盐的液体培养基中；第十次传代：将培养物接种至含50μg/ml卡那霉素的液体培养基中；然后重复此过程。每代(12h)培养后，将1mL培养物样品以12000g离心2分钟，然后除去上清液。将沉淀物悬浮在1mL磷酸盐缓冲液中，然后将200μL加入96孔透明板和黑色荧光测定孔板中。使用酶标仪读取OD600(在600nm处的吸光度)和荧光(在480nm处激发，在500至600nm处发射)。荧光/OD600显示了在2μM诱导剂亚砷酸盐作用下报告基因的表达情况(图3A)。在50μL系统中使用引物对P7/P8进行PCR扩增后使用引物P9进行测序。使用MATLAB分析获得的色谱图计算sfGFP基因第205位的碱基编辑率(图3B)。实验结果表明，在存在重金属污染物的代次中，菌株荧光显着降低，并且位置205的碱基编辑率持续增加；在非刺激的代次中，荧光回复至较高水平，而碱基编辑率则上升缓慢。在添加卡那霉素的代次中，菌株的荧光和碱基编辑率基本回复至初始状态。在两轮的实验中，菌株具有相似的行为模式。因此，我们设计的活细胞生物传感记录系统能够即时的报告并能够长期的记录重金属污染物亚砷酸盐，而且更重要的是可以擦除并重新记录。
Pj23119-isgRNA-ssgRNA基因片段序列：5′-CTCGTGCATACTGCGTATGATGAGTCGACCGATGAAAACGTCATGCTGCTGACCTCCGACGCGCCCGAGTATAAACCGTGGGCTTTGGTTATCCAGGATAGCAACGGTGAAAATAAGATTAAAATGTTATAAACGGAGCCAATGTACGCAAAAACCCCGCTTCAGCGGGGTTTTTTCGCCAAAAAAAACCCCGCCCTGTCAGGGGCGGGGTTTTTTTTTATGTTGAAAATCTCCTTCTAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACGATAACGAGCAAAGCACTGAGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAGAGGAAATTTAAAATAATTTTCTGTTAATTAAAAAAAACCCCGCCCTGTCAGGGGCGGGGTTTTTTTTTATGTTGAAAATCTCCTTCTAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTATTCTGGTCCAACTCTATGGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAATTGCGTTGCGCACTTAATTAACGGCACTCCTCAGCAAATATA-3′
引物序列：
P1:5′-ATGTCTTCTGAAACCGGTCCG-3′
P2:5′-CAAATAAACGCCATGGGCAT-3′
P3:5′-ATGCCCATGGCGTTTATTTG-3′
P4:5′-GACGTCGATATCTGGCGAAAATGAG-3′
P5:5′-CTCATTTTCGCCAGATATCGACGTCTTAACTGCAAATGTTCTTACTGTCCCC-3′
P6:5′-CCGGACCGGTTTCAGAAGACATATGTTTTTCCTCCTTATAAAGTTAATCTTTAGTTAGT-3′
P7:5′-GGTGTATATGGCGAGCGCAAT-3′
P8:5′-CAGGATATTGCCGTCTTCTTTAAAG-3′
P9:5′-CGAAGAAGGGGTTGAATCGC-3′
实施例2
设计并构建能够长期可重写的报告并记录营养物质阿拉伯糖的活细胞传感记录系统。
质粒构建：
将合成的Pj23119-isgRNA-ssgRNA基因片段(上海生工生物工程有限公司)克隆到SalI/PacI双酶切的pWT-021a质粒主链中，构建了质粒模板pWT-021a-Pj23119-isgRNA-ssgRNA。通过引物对P1/P2从pWT-021a-Pj23119-isgRNA-ssgRNA质粒中扩增了BE2-Pj23119-isgRNA-ssgRNA，使用引物P3/P4从质粒pWT-021a扩增抗性基因和质粒骨架，以pKD46质粒为模板，通过引物对P5/P6扩增阿拉伯糖响应元件。通过多片段同源重组构建质粒pWT-Ara-BE2-isg-ssg。
酶切体系为：5μL Buffer、4μL PacI限制性内切酶、4μL SalI限制性内切酶、30μLpWT-021a质粒、7μL ddH2O。酶切产物进行琼脂糖电泳，用胶回收试剂盒对进行线性质粒回收。
通过PCR扩增目的基因。PCR反应体系为：25μL buffer、20μL ddH2O、1μL dNTP、1μL引物、1μL引物、1μL模板、1μL高保真DNA聚合酶。PCR反应程序为：95℃预变性10分钟，95℃变性20秒，56℃退火30s，72℃延伸1分钟/1000bp，从变性到延伸的过程循环34次，循环结束后72℃延伸5分钟，降温至12℃。PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，使用胶回收试剂盒进行纯化回收。
将得到的酶切质粒和目的片段通过多片段同源重组酶进行连接，重组反应条件为：6μL重组酶、4μL目的基因、2μL酶切质粒混匀后50℃水浴25min，冰上放置5分钟后加入DH5α感受态中，冰上放置30分钟后42℃热激90秒，冰上放置3分钟后加入500μL LB培养液在37℃，220rpm摇床中活化45分钟，涂布在含有50μg/mL硫酸链霉素的LB固体培养基平板中，37℃过夜培养，挑选单克隆送测序，保留测序正确的单克隆即可获得含有pWT-Ara-BE2-isg-ssg质粒的转化子。
报告基因插入大肠杆菌MG1655基因组：
通过PCR扩增以生成包含50bp的上下同源臂，Ptac-sfGFP(tac启动子表达的超折叠绿色荧光蛋白基因)基因片段、连接序列基因片段以及KanR(卡那霉素抗性基因)选择标记的融合基因片段，其中，编辑位点为sfGFP基因第205位的胞嘧啶，该位点突变为胸腺嘧啶后使得该位置出的谷氨酰胺密码子(CAG)突变为终止密码子(TAG)，进而导致荧光蛋白与卡那霉素抗性蛋白同时失活。将pKD46质粒转化到大肠杆菌MG1655中，将正确的的转化子在含0.2％阿拉伯糖的LB培养基中生长至OD600nm为0.6(30℃，220rpm)。在4℃条件下3000rcf离心10分钟收获培养物，并用预冷的10％甘油洗涤3次(每次3000rcf离心10分钟)以制备感受态细胞。将线性DNA片段在12.5kV/cm的电场强度下电击4毫秒，以转化入感受态细胞，37℃下活化2小时，并使用50mg/ml卡那霉素选择正确的基因组插入单克隆，命名为EPtis。
活细胞生物传感记录系统长期可重写的报告并记录营养物质阿拉伯糖：
将质粒pWT-Ara-BE2-isg-ssg转化入工程菌株EPtis后，对正确的转化子过夜活化后进行连续的传代培养，每代培养12小时，接种量为1/200：第1到第3次传代将培养物接种至含0.1％诱导剂阿拉伯糖的液体培养基中；第4到第6次传代将培养物接种至无诱导剂的新鲜液体培养基中；第7到第9次传代将培养物接种至含0.1％诱导剂阿拉伯糖的液体培养基中；第十次传代：将培养物接种至含50μg/ml卡那霉素的液体培养基中；然后重复此过程。每代(12h)培养后，将1mL培养物样品以12000g离心2分钟，然后除去上清液。将沉淀物悬浮在1mL磷酸盐缓冲液中，取200μL分别加入96孔透明板和黑色荧光测定孔板中。使用酶标仪读取OD600(在600nm处的吸光度)和荧光(在480nm处激发，在500至600nm处发射)。荧光/OD600显示了在0.1％诱导剂阿拉伯糖作用下报告基因的表达情况(图4A)。在50μL系统中使用引物对P7/P8进行PCR扩增后使用引物P9进行测序。使用MATLAB分析获得的色谱图计算sfGFP基因第205位的碱基编辑率(图4B)。实验结果表明，在存在营养物质阿拉伯糖的代次中，菌株荧光显着降低，并且位置205的碱基编辑率持续增加；在非刺激的代次中，荧光回复至较高水平，而碱基编辑率则上升缓慢。在添加卡那霉素的代次中，菌株的荧光和碱基编辑率基本回复至初始状态。在两轮的实验中，菌株具有相似的行为模式。因此，我们设计的活细胞生物传感记录系统能够即时的报告并能够长期的记录营养物质阿拉伯糖，而且更重要的是可以擦除并重新记录。
Pj23119-isgRNA-ssgRNA基因片段序列：
5′-CTCGTGCATACTGCGTATGATGAGTCGACCGATGAAAACGTCATGCTGCTGACCTCCGACGCGCCCGAGTATAAACCGTGGGCTTTGGTTATCCAGGATAGCAACGGTGAAAATAAGATTAAAATGTTATAAACGGAGCCAATGTACGCAAAAACCCCGCTTCAGCGGGGTTTTTTCGCCAAAAAAAACCCCGCCCTGTCAGGGGCGGGGTTTTTTTTTATGTTGAAAATCTCCTTCTAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACGATAACGAGCAAAGCACTGAGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAGAGGAAATTTAAAATAATTTTCTGTTAATTAAAAAAAACCCCGCCCTGTCAGGGGCGGGGTTTTTTTTTATGTTGAAAATCTCCTTCTAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTATTCTGGTCCAACTCTATGGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAATTGCGTTGCGCACTTAATTAACGGCACTCCTCAGCAAATATA-3′
引物序列：
P1:5′-ATGTCTTCTGAAACCGGTCCG-3′
P2:5′-CAAATAAACGCCATGGGCAT-3′
P3:5′-ATGCCCATGGCGTTTATTTG-3′
P4:5′-GACGTCGATATCTGGCGAAAATGAGATAAAACGAAAGGCCCAGTC-3′
P5:5′-CTCATTTTCGCCAGATATCGACGTCTTATGACAACTTGACGGCTACATCAT-3′
P6:5′-CGGACCGGTTTCAGAAGACATTTTTTATAACCTCCTTAGAGCTCGAATT-3′
P7:5′-GGTGTATATGGCGAGCGCAAT-3′
P8:5′-CAGGATATTGCCGTCTTCTTTAAAG-3′
P9:5′-CGAAGAAGGGGTTGAATCGC-3′
实施例3
肠道炎症标志物硫代硫酸盐响应的活细胞传感器构建及优化：
硫代硫酸盐为肠道炎症的标志物之一，本实施例通过对响应硫代硫酸盐的多组分系统各元件启动子及RBS序列进行优化，从而获得能够在响应硫代硫酸盐后具有高输出信号强度及高信噪比的生物传感电路。该电路具有进一步发展成为记录和报告肠道炎症标志物的复杂生物传感器的潜力。
质粒构建：
通过引物对P1/P2从pKD236质粒中扩增了Pj23104-thsS片段，通过引物对P3/P4从pKD237质粒中扩增了Pj23105-thsR-CmR-ori片段，通过单片段同源重组构建了质粒pKD-2367。通过引物对P5/P6从pKD2367质粒中扩增了Pj23104-thsS-Pj23105-thsR片段，通过引物对P7/P8从pWT-021a质粒中扩增了SmR-Rep101-pSC101 ori片段，通过单片段同源重组构建了质粒pWT-A，通过引物对P9/P10，P11/P12，以质粒pWT-A为骨架构建了质粒pWT-B，相似的以质粒pWT-B为骨架构建了质粒pWT-C，pWT-CS1R2，pWT-CS1R3，pWT-CS1R4，以质粒pWT-CS1R4为骨架构建了质粒pWT-CS2R4，pWT-CS3R4，pWT-CS4R4，pWT-CS5R4。将质粒pKD236/pKD237，pWT-A，pWT-B，pWT-C，pWT-CS1R2，pWT-CS1R3，pWT-CS1R4，pWT-CS2R4，pWT-CS3R4，pWT-CS4R4，pWT-CS5R4转化入大肠杆菌菌株Nissle 1917中，测试菌株响应硫代硫酸盐的能力。
通过PCR扩增目的基因。PCR反应体系为：25μL buffer、20μL ddH2O、1μL dNTP、1μL引物、1μL引物、1μL模板、1μL高保真DNA聚合酶。PCR反应程序为：95℃预变性10分钟，95℃变性20秒，56℃退火30s，72℃延伸1分钟/1000bp，从变性到延伸的过程循环34次，循环结束后72℃延伸5分钟，降温至12℃。PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，使用胶回收试剂盒进行纯化回收。
重组反应条件为：6μL重组酶、4μL目的基因、2μL质粒骨架片段混匀后50℃水浴25min，冰上放置5分钟后加入DH5α感受态中，冰上放置30分钟后42℃热激90秒，冰上放置3分钟后加入500μL LB培养液在37℃，220rpm摇床中活化45分钟，涂布在含有50μg/mL硫酸链霉素的LB固体培养基平板中，37℃过夜培养，挑选单克隆送测序，保留测序正确的单克隆即可获得正确的转化子。
工程化细菌检测硫代硫酸盐：
将含有各质粒的正确转化子过夜活化后在不诱导或，1mM硫代硫酸钠条件下培养12h，测定菌株荧光表达情况。将1mL培养物样品以12000g离心2分钟，然后除去上清液。将沉淀物悬浮在1mL磷酸盐缓冲液中，然后将200μL加入96孔透明板和黑色荧光测定孔板中。使用酶标仪读取OD600(在600nm处的吸光度)和荧光(在480nm处激发，在500至600nm处发射)。荧光/OD600显示了在1mM诱导剂硫代硫酸钠作用下报告基因的表达情况，结果表明，工程化大肠杆菌能够在炎症标志物硫代硫酸盐存在的情况下产生显著的荧光值变化，含有质粒pWT-CS2R4的菌株具有最高的诱导倍率(58倍)和最强的诱导信号(40000/OD600)(图5)。因此，我们构建和优化的传感器具有记录和报告炎症标志物硫代硫酸盐的潜力。
引物序列：
P1:5′-TCATTTTCGCCAGATATCGACGCAGAAAGGCCCACCCG-3′
P2:5′-GGCCTTTTTAGTTAGAAAGCTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTAT-3′
P3:5′-GCTTTCTAACTAAAAAGGCCTCCCAAAT-3′
P4:5′-TCATTTTCGCCAGATATCGACGCAGAAAGGCCCACCCG-3′
P5:5′-ACTGTCAAGAGGACATCCGGTGCCGGCCAACGTCTCATTTT-3′
P6:5′-TTTGCGTACATTGGCTCCGTTCATTTGTACAGTTCATCCATACCATGC-3′
P7:5′-ACGGAGCCAATGTACGCAAAAAC-3′
P8:5′-ACCGGATGTCCTCTTGACAGT-3′
P9:5′-CTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGCAGAAATATAAAGAACGATCTATTTATCCGCGTAC-3′
P10:5′-CAAATAAACGCCATGGGCAT-3′
P11:5′-ATGCCCATGGCGTTTATTTG-3′
P12:5′-GCTAGCACTGTACCTAGGACTGAGCTAGCCGTCAACTCGAGGTGAAGACGAAAGG-3′
实施例4
基于转录和翻译双重开关的记录重置系统：
ccdB基因为细菌毒素蛋白表达基因，该毒性蛋白能够诱发细菌的自我裂解死亡。本系统的原始工程细菌中，ccdB基因起始密码子(ATG)被苏氨酸密码子(ACG)取代，当系统记录外界刺激时，ccdB基因第二位C被T取代，苏氨酸密码子被逆转为起始密码子ATG，激活ccdB基因翻译。温控诱导系统所控制的基因在37℃下转录抑制，在45℃下高水平转录。在ccdB基因前设置温控诱导系统以控制基因转录，当工程菌记录环境刺激后，部分ccdB基因翻译被激活(记录)，提升培养温度至45℃即可同时激活记录菌株毒素蛋白ccdB基因的转录和翻译，诱导细菌自我裂解。因此在本系统中，未记录或未45℃诱导时对菌株无影响，只有当转录和翻译开关同时开启时能够实现记录细菌的自我裂解(记录的擦除)。
合成的Pj23119-GosgRNA基因片段(上海生工生物工程有限公司)克隆到SalI/PacI双酶切的pWT-021a质粒主链中，构建了质粒模板pWT-021a-Pj23119-GosgRNA。通过引物对P1/P2从pWT-021a-Pj23119-GosgRNA质粒中扩增了BE2-Pj23119-GosgRNA，使用引物P3/P4从质粒pWT-021a扩增抗性基因和质粒骨架，以pKD46质粒为模板，通过引物对P5/P6扩增阿拉伯糖响应元件。通过多片段同源重组构建质粒pWT-Ara-BE2-GosgRNA。
酶切体系为：5μL Buffer、4μL PacI限制性内切酶、4μL SalI限制性内切酶、30μLpWT-021a质粒、7μL ddH2O。酶切产物进行琼脂糖电泳，用胶回收试剂盒对进行线性质粒回收。
通过PCR扩增目的基因。PCR反应体系为：25μL buffer、20μL ddH2O、1μL dNTP、1μL引物、1μL引物、1μL模板、1μL高保真DNA聚合酶。PCR反应程序为：95℃预变性10分钟，95℃变性20秒，56℃退火30s，72℃延伸1分钟/1000bp，从变性到延伸的过程循环34次，循环结束后72℃延伸5分钟，降温至12℃。PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，使用胶回收试剂盒进行纯化回收。
将得到的酶切质粒和目的片段通过多片段同源重组酶进行连接，重组反应条件为：6μL重组酶、4μL目的基因、2μL酶切质粒混匀后50℃水浴25min，冰上放置5分钟后加入DH5α感受态中，冰上放置30分钟后42℃热激90秒，冰上放置3分钟后加入500μL LB培养液在37℃，220rpm摇床中活化45分钟，涂布在含有50μg/mL硫酸链霉素的LB固体培养基平板中，37℃过夜培养，挑选单克隆送测序，保留测序正确的单克隆即可获得含有pWT-Ara-BE2-GosgRNA质粒的转化子。
温控元件及无翻译活性的细菌毒素蛋白ccdB基因插入大肠杆菌MG1655基因组：
通过PCR扩增以生成包含50bp的上下同源臂，温控诱导系统及其控制的无翻译活性(起始密码子ATG被苏氨酸密码子ACG取代)的细菌毒素蛋白基因ccdB以及卡那霉素抗性基因，其中，编辑位点为ccdB基因第2位的胞嘧啶，该位点突变为胸腺嘧啶后使得该位置出的苏氨酸密码子(ACG)突变为起始密码子(ATG)，进而导致ccdB基因的翻译激活。将pKD46质粒转化到大肠杆菌MG1655中，将正确的的转化子在含0.2％阿拉伯糖的LB培养基中生长至OD600nm为0.6(30℃，220rpm)。在4℃条件下3000rcf离心10分钟收获培养物，并用预冷的10％甘油洗涤3次(每次3000rcf离心10分钟)以制备感受态细胞。将线性DNA片段在12.5kV/cm的电场强度下电击4毫秒，以转化入感受态细胞，37℃下活化2小时，并使用50mg/ml卡那霉素选择正确的基因组插入单克隆，命名为MG1655-ACG-ccdB。
基于细菌毒素蛋白ccdB的可重置活细胞生物传感记录系统：
将质粒pWT-Ara-BE2-GosgRNA转化入工程菌株MG1655-ACG-ccdB后，对正确的转化子过夜活化后在0.1％阿拉伯糖诱导条件下培养12h(37℃，220rpm)，将诱导后的培养物以1/200的接种量接种于新鲜培养基中并在不同温度下培养：37℃12h，45℃0h；37℃8h，45℃4h；37℃4h，45℃8h；37℃0h，45℃12h；在50μL系统中使用引物对P7/P8对各培养条件下的培养物进行PCR扩增后使用引物P7进行Sanger测序。使用MATLAB分析获得的色谱图计算ccdB基因第2位碱基的碱基编辑率(图6)。实验结果表明，随着45℃培养时间的延长，发生记录(ccdB基因第二位碱基由C转换为T)的细菌自我裂解，在细菌群体中的比例逐渐降低，达到12h时，记录菌株被完全清除，从而实现记录信息的擦除。因此，基于转录和翻译双重开关的记录系统能够方便精确的重置记录信息。
Pj23119-isgRNA-ssgRNA基因片段序列：
5′-CTCGTGCATACTGCGTATGATGAGTCGACCGATGAAAACGTCATGCTGCTGACCTCCGACGCGCCCGAGTATAAACCGTGGGCTTTGGTTATCCAGGATAGCAACGGTGAAAATAAGATTAAAATGTTATAAACGGAGCCAATGTACGCAAAAACCCCGCTTCAGCGGGGTTTTTTCGCCAAAAAAAACCCCGCCCTGTCAGGGGCGGGGTTTTTTTTTATGTTGAAAATCTCCTTCTAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCTTCTTCACCTTTCGTCCTAGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAATTGCGTTGCGCACTTAATTAACGGCACTCCTCAGCAAATATA-3′
引物序列：
P1:5′-ATGTCTTCTGAAACCGGTCCG-3′
P2:5′-CAAATAAACGCCATGGGCAT-3′
P3:5′-ATGCCCATGGCGTTTATTTG-3′
P4:5′-GACGTCGATATCTGGCGAAAATGAG-3′
P5:5′-CTCATTTTCGCCAGATATCGACGTCTTAACTGCAAATGTTCTTACTGTCCCC-3′
P6:5′-CCGGACCGGTTTCAGAAGACATATGTTTTTCCTCCTTATAAAGTTAATCTTTAGTTAGT-3′
P7:5′-CTGACCACCATGAAGGTGACG-3′
P8:5′-TTATCAGACCGCTTCTGCGT-3′
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可擦除并重写的活细胞传感记录系统，其特征在于，通过响应环境刺激，产生即时信号与长期信号，根据需要擦除并重写记录的活细胞传感记录系统；
所述环境刺激包括环境污染物、小分子化合物和/或疾病标志物；
所述即时信号包括荧光蛋白、色素蛋白、显色酶和/或超声气体囊泡；所述长期信号以DNA为记录载体，包括基因组DNA或质粒DNA；
所述活细胞为移植有响应环境刺激的生物传感电路，记录元件，报告元件，记录载体的活体细菌。
2.根据权利要求1所述的一种可擦除并重写的活细胞传感记录系统，其特征在于，所述环境污染物是亚砷酸盐。
3.根据权利要求1所述的一种可擦除并重写的活细胞传感记录系统，其特征在于，所述小分子化合物是如阿拉伯糖。
4.根据权利要求1所述的一种可擦除并重写的活细胞传感记录系统，其特征在于，所述疾病标志物是肠道炎症标志物硫代硫酸盐或连四硫酸盐。
5.根据权利要求1所述的一种可擦除并重写的活细胞传感记录系统，其特征在于，所述长期信号以DNA为记录载体，是DNA刻录与蛋白质功能偶联，即DNA刻录可以转换为蛋白质活性的激活或敲除，从而产生可读的DNA测序信号以及蛋白质功能信号。
6.根据权利要求1所述的一种可擦除并重写的活细胞传感记录系统，其特征在于，可擦除并重写的活细胞传感记录系统将环境刺激转换为碱基编辑器BE2基因的表达，碱基编辑器与多条sgRNA形成复合物，分别执行干扰报告基因的表达以及DNA刻录的功能，从而将环境刺激进一步转换为报告基因表达活性变化以及DNA单碱基突变以实现环境刺激的即时报告和长期记录。
7.根据权利要求1所述的一种可擦除并重写的活细胞传感记录系统，其特征在于，记录系统中记录位点为靶标序列中特定的碱基，该碱基的转变与特定蛋白的功能活性偶联，随着记录过程的进行，细菌群体中该位点碱基的转换或记录进一步导致特定蛋白功能的改变，敲除或翻译激活，从而在DNA和蛋白质层面产生长期可读的信号输出，即通过测序或功能性蛋白质的活性测定来记录分子事件出现或存在的历史过程。
8.根据权利要求1所述的一种可擦除并重写的活细胞传感记录系统，其特征在于，所述的特定蛋白特异性的RNA聚合酶或转录调节因子，此类蛋白的翻译激活或敲除，能够引起一系列基因表达的激活或抑制，从而将单碱基的突变转化为多基因转录及翻译表达的控制。
9.根据权利要求1所述的一种可擦除并重写的活细胞传感记录系统，其特征在于，所述擦除并重写方式包括通过单碱基转换敲除工程化细菌的抗性基因，添加适当浓度的抗生素调整记录菌株与原始菌株的比例，实现记录信息的擦除；通过单碱基转换激活诱导型启动子控制的细菌毒素蛋白ccdB基因的翻译，添加适当浓度的诱导剂进一步激活ccdB的基因转录，使得ccdB基因的转录和翻译同时激活以使记录细菌自我裂解，实现记录信息的擦除和重写。
10.一种可擦除并重写的活细胞传感记录系统的应用，是用于监测与疾病相关的生理标志物或其他分子。
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