CN110724702A

CN110724702A - 一种丙酮酸(pyr)的特异性生物传感器及其应用

Info

Publication number: CN110724702A
Application number: CN201911118888.8A
Authority: CN
Inventors: 张大伟; 丁冬芹; 柏丹阳
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2019-11-15
Publication date: 2020-01-24
Anticipated expiration: 2039-11-15
Also published as: CN110724702B

Abstract

本发明公开了一种快速检测丙酮酸(pyruvic acid，PYR)的方法，属于生物传感、分子检测和基因工程技术领域。本发明以来源于大肠杆菌(Escherichia coli K12)的转录调控因子PdhR，绿色荧光蛋白为报告基因构建了PYR特异性的生物传感器，建立了PYR与荧光强度的有效关系，并通过突变建库，筛选出对PYR响应度提高的PdhR突变体R1.0、R1.1和R1.3。该生物传感器在检测PYR及筛选PYR生产菌株及以PYR为前体的代谢产物的微生物方面具有重要的应用前景。

Description

一种丙酮酸(PYR)的特异性生物传感器及其应用

技术领域

本发明涉及一种丙酮酸(pyruvic acid，PYR)的特异性生物传感器及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

微生物合成途径提供了从廉价的可再生资源到有价值代谢产物的平台，如药品和化妆品等的生产。识别代谢途径潜在的限速步骤对调控目标产物的代谢流具有非常重要的指导意义，特别是检测代谢途径中的关键酶或者重要中间代谢物对代谢途径改造及评价至关重要。PYR是糖酵解途径(glycolysis)的产物，是合成苏氨酸和精氨酸等氨基酸和琥珀酸等产品极其重要的前体，同时也是进入三羧酸循环(TCA)的必经之路。因此建立对PYR的检测方法对很多有价值的产品的生产具有重要意义。

现在普遍运用的HPLC、LC-MS和Western blot等检测技术不仅繁琐而且不能及时检测分子浓度。特别是在高通量筛选高产菌株的过程中，代谢物检测大大限制了筛选效率。能够在体内感知和响应代谢物的生物传感器在生物研究和生物技术中有着广泛的应用。生物传感器在筛选中具有高通量鉴别小分子的优势，并且稳定性好，易于操作，为昂贵的体外筛选提供了廉价的替代品。基因编码生物传感器在筛选酶、优化生物合成途径、代谢物浓度测定和小分子触发治疗反应等方面具有潜在的应用价值，因此，配备基于荧光的遗传电路设备的高通量筛选生物传感器具有很好的开发前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是构建一种PYR生物传感器，以满足对PYR检测的需求。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

本发明的第一个目的是提供一种生物传感器，含有启动子P_Ap,PdhR基因、PdhR基因结合位点和编码标记物的基因；所述P_AP上整合调控PdhR基因结合位点的序列，并调控编码标记物的基因表达。

(1)在本发明的一种实施方式中，启动子P_AP、PdhR基因和PdhR基因结合位点位于载体上。

(2)在本发明的一种实施方式中，所述载体为pYR02。

(3)在本发明的一种实施方式中，所述标记物为绿色荧光蛋白。

(4)在本发明的一种实施方式中，编码所述启动子P_AP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述PdhR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述PdhR结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二个目的是在生物传感器质粒pYR02的基础上，对PdhR蛋白进行突变建库筛选，以期筛选出对PYR响应度提高的突变体：

(1)对PdhR蛋白进行易错PCR建库，克隆到载体pYR02上，构建质粒突变库。

(2)将质粒突变库导入到大肠杆菌感受态DH5α中，涂板。

(3)进行三轮流式筛选。第一轮，刮菌于摇瓶中进行培养，加入终浓度为5mM配体PYR，进行流式分选，此次筛选为正向筛选。第二轮，第一轮收集的细胞在含有氨苄抗生素的LB液体培养基中进行扩增，进行流式分选，此次筛选为负向筛选。第三轮，将第二轮收集的细胞在含有氨苄抗生素和5mM配体PYR的LB液体培养基中进行过夜扩增，进行流式分选，此次筛选为正向筛选。

(4)流式分选出的菌在LB液体培养基中进行复苏，并涂布在耐氨苄抗生素的固体培养基中。

(5)对固体培养基上的单菌落进行96孔板验证。挑取单菌落于96深孔板中过夜培养，然后以1:50比例转接入两个含有200μL 1×M9培养基的细胞培养板中。细胞培养至OD～0.2-0.6，一个培养板中添加配体PYR，另一个培养板中则不加PYR。再培养5-7h后，通过多功能酶标仪进行荧光测定。

(6)荧光测定后，相比于对照PdhR，显示较高荧光强度的菌株被挑选出来，进行测序，测序显示三个挑选出的菌株分别有一个点突变分别为：E16D，命名为R1.1，Y3N，命名为R1.2，D45N，命名为R1.3。

(7)对筛选出的菌株进行体外添加PYR梯度实验，建立PYR浓度与荧光强度的关系。

(8)对突变点E16D，Y3N和D45N进行以下组合：E16D+Y3N、E16D+D45N、Y3N+D45N和E16D+Y3N+D45N，并对其进行PYR响应测试。

本发明的第三个目的是在具有不同PYR生产能力的大肠杆菌中验证PYR生物传感器的作用。

(1)本实验室提供了三株具有不同PYR生产能力的大肠杆菌菌株，在发酵30-48h后，PYR的产量分别为0.03g/L、0.07g/L和0.22g/L。

(2)本发明还提供了一种应用上述大肠杆菌发酵生产PYR的方法，将35-38℃、180-220rpm下培养11-12h的大肠杆菌以10％-20％的接种量转入发酵培养基，于35-38℃、180-220rpm条件下发酵30-48h。

本发明还要求保护所述生物传感器在筛选等方面的应用。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1.pYR02质粒图谱。

图2.R1.1突变体构成的生物传感器对胞外添加PYR的响应效果。

图3.R1.2突变体构成的生物传感器对胞外添加PYR的响应效果。

图4.R1.3突变体构成的生物传感器对胞外添加PYR的响应效果。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

实施例1：PYR传感器质粒pYR02的构建

以E.coli MG1655基因组为模板，用引物pdhR-F和pdhR-R扩增带接头的pdhR片段。以ptrc99a质粒为模板，ptrc99a-ver-F1、ptrc99a-ver-R1引物扩增得到带接头的用于Gibson assembly的质粒骨架ptrc99a-Gibson1，与上面的pdhR片段通过Gibson assembly得到质粒pYR01。PhdR核苷酸序列如SEQ NO.2所示。

以pUC57-GFPmut2质粒做模板，用带有启动子P_AP(SEQ NO.1)接头的引物GFPmut2-F、GFPmut2-R扩增带接头的GFPmut2片段。以pYR01质粒为模板，ptrc99a-ver-F2、ptrc99a-ver-R2引物扩增得到带接头的用于Gibson assembly的质粒骨架ptrc99a-Gibson2，与上面的GFPmut2片段通过Gibson assembly得到质粒pYR02，质粒图谱如图1所示。

本部分所用引物如下：

表1构建PYR传感器质粒所用到的引物

本部分所用到的菌株及质粒如下：

表2构建PYR生物传感器所用菌株和质粒

实施例2：对pYR02生物传感器进行测试

将质粒pYR02化转入MG1655感受态中，构建菌株MG1655-pYR02。挑取单菌落于5mL含有氨苄抗生素的LB培养基中，37℃，200rpm过夜培养成种子液，取100μL种子液转接到新鲜的5mL含有氨苄抗生素的LB培养基中，37℃，200rpm培养至OD～0.2-0.6，加入不同浓度的PYR，以达到所需的不同诱导浓度。在诱导5-7h后取200μL测定样品的荧光强度(AFU)和600nm处的吸光度(OD)，结果显示出丙酮酸与单位OD的荧光强度之间一定的线性关系。

实施例3：对PdhR蛋白进行突变建库

PdhR蛋白用TIANDZ即时易错PCR试剂盒v 1.3进行突变建库。具体PCR体系包括：

表3易错PCR反应体系

易错PCR反应程序为：94℃，3min；94℃，1min,45℃，1min,72℃，1min,40个循环。

pdhR通过Gibson-assemble与质粒骨架p15ASI-Gibson3连接形成质粒突变库，化转入感受态DH5α并涂布于含有氨苄抗性的固体平板上。挑取20个单菌落进行测序，20个菌落的sanger测序显示突变率为0-4个突变/kb。

本部分所用引物如下：

表4构建PYR传感器质粒突变库所用到的引物

实施例4：PdhR突变库筛选

对突变库进行三轮流式筛选。第一轮筛选，刮含有突变质粒库的菌落于10mL/100mL摇瓶中进行培养，培养基为含有氨苄抗生素的液体LB，并加入终浓度为5mM的配体PYR，于37℃，200rpm过夜培养后，以1:100比例稀释于1×PBS中进行流式分选，收集荧光激活率最高的0.03％细胞。第二轮筛选，将第一轮收集的细胞在新鲜的含有氨苄抗生素的LB液体培养基中进行扩增，过夜培养后，以1:100比例稀释于1×PBS中进行流式分选，收集荧光激活率最低的3.81％细胞。第三轮筛选，将第二轮收集的细胞在含氨苄抗生素和配体PYR的LB液体培养基中进行过夜扩增后，以1:100比例稀释于1×PBS中进行流式分选，收集荧光激活率最高的0.03％细胞。流式分选出的细胞在LB液体培养基中进行复苏，并涂布在耐氨苄抗生素的固体培养基中。

对固体培养基上的单菌落进行96孔板验证。挑取单菌落于含有LB(氨苄抗生素)培养基的96深孔板中，于37℃，800rpm过夜培养，然后以1:50比例转接入两个含有200μL 1×M9培养基的细胞培养板中。待细胞培养至OD～0.2-0.6，一个培养板中添加终浓度为5mMPYR，另一个培养板中则不加PYR。再培养5-7h后，通过多功能酶标仪(激发483nm，发射525nm)进行AFU和OD测定。测定后，相比于对照，显示出最高荧光强度的若干菌株被挑选出来，进行基因测序，测序显示筛选菌中PdhR蛋白突变分别为E16D，命名为R1.1，Y3N，命名为R1.2，D45N，命名为R1.3。

实施例5：R1.1对PYR梯度的响应

将菌株MG1655-R1.1(PYR01)于5mL含有氯霉素抗性的LB试管中于37℃，200rpm过夜培养。取过夜培养菌液100μL于5mL含有氨苄抗性的1×M9试管中于37℃，200rpm培养至OD～0.2-0.6，加入不同浓度的PYR开始诱导。培养5-7h后测定AFU和OD，结果如图2所示，显示了PYR浓度和荧光强度之间很好的一个线性相关性。

实施例6：R1.2对PYR梯度的响应

将菌株MG1655-R1.2(PYR02)于5mL含有氯霉素抗性的LB试管中于37℃，200rpm过夜培养。取过夜培养菌液100μL于5mL含有氨苄抗性的1×M9试管中于37℃，200rpm培养至OD～0.2-0.6，加入不同浓度的PYR开始诱导。培养5-7h后测定AFU和OD，结果如图3所示，显示了PYR浓度和荧光强度之间很好的一个线性相关性。

实施例7：R1.3对PYR梯度的响应

将菌株MG1655-R1.3(PYR03)于5mL含有氯霉素抗性的LB试管中于37℃，200rpm过夜培养。取过夜培养菌液100μL于5mL含有氨苄抗性的1×M9试管中于37℃，200rpm培养至OD～0.2-0.6，加入不同浓度的PYR开始诱导。培养5-7h后测定AFU和OD，结果如图4所示，显示了PYR浓度和荧光强度之间很好的一个线性相关性。

实施例8：组合突变对PYR响应度的影响

上述突变E16D、Y3N和D45N能够使PdhR对PYR响应度得到提高，为了进一步提高突变体对PYR的响应度，进行了有益位点组合：E16D+Y3N、E16D+D45N、Y3N+D45N和E16D+Y3N+D45N，改造后突变体通过外加PYR进行验证，响应度见表5：

表5突变位点组合对PYR响应效果

实施例9：丙酮酸生产菌株中验证生物传感器的效果

本实验室提供了三株具有不同丙酮酸生产能力的菌株，分别为R1A，R3A和5A。发酵30-48h后，其丙酮酸产量分别为0.03g/L、0.07g/L和0.22g/L。发酵培养基为：20g/L葡萄糖，5g/LKH₂PO₄，5g/LMgSO₄，15g/L(NH₄)₂SO₄，5g/L yeast extract，15mg/L FeSO₄·7H₂O，1.2g/Lbetaine monohydrate。

表6测试PYR生物传感器所用菌株和质粒

将PYR传感器(组合突变E16D+Y3N+D45N)转化入菌株R1A、R3A和R5A中。在35-38℃，180-220rpm下培养11-12h，然后以10％-20％的接种量转入发酵培养基中，于35-38℃，180-200rpm条件下培养30-48h。发酵结束后测定荧光强度，得到一定范围内PYR和单位OD菌体产生的荧光强度减的有效关系。实现了生物传感器对大肠杆菌有效的筛选作用。

表7丙酮酸产量和荧光强度的关系

丙酮酸产量(g/L)	荧光强度
		0.03	2390.32
0.07	2950.21
		0.22	3855.44

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种丙酮酸（PYR）的特异性生物传感器及其应用

<130> 201901112

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 76

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 1

aaaatttatc aaaaagagtg ttgactcaat ggttttacca attgatactt agattcaatg 60

gttttaccaa tttacc 76

<210> 2

<211> 254

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 2

Met Ala Tyr Ser Lys Ile Arg Gln Pro Lys Leu Ser Asp Val Ile Glu

1 5 10 15

Gln Gln Leu Glu Phe Leu Ile Leu Glu Gly Thr Leu Arg Pro Gly Glu

20 25 30

Lys Leu Pro Pro Glu Arg Glu Leu Ala Lys Gln Phe Asp Val Ser Arg

35 40 45

Pro Ser Leu Arg Glu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ala Lys Gly Leu Leu

50 55 60

Leu Arg Arg Gln Gly Gly Gly Thr Phe Val Gln Ser Ser Leu Trp Gln

65 70 75 80

Ser Phe Ser Asp Pro Leu Val Glu Leu Leu Ser Asp His Pro Glu Ser

85 90 95

Gln Tyr Asp Leu Leu Glu Thr Arg His Ala Leu Glu Gly Ile Ala Ala

100 105 110

Tyr Tyr Ala Ala Leu Arg Ser Thr Asp Glu Asp Lys Glu Arg Ile Arg

115 120 125

Glu Leu His His Ala Ile Glu Leu Ala Gln Gln Ser Gly Asp Leu Asp

130 135 140

Ala Glu Ser Asn Ala Val Leu Gln Tyr Gln Ile Ala Val Thr Glu Ala

145 150 155 160

Ala His Asn Val Val Leu Leu His Leu Leu Arg Cys Met Glu Pro Met

165 170 175

Leu Ala Gln Asn Val Arg Gln Asn Phe Glu Leu Leu Tyr Ser Arg Arg

180 185 190

Glu Met Leu Pro Leu Val Ser Ser His Arg Thr Arg Ile Phe Glu Ala

195 200 205

Ile Met Ala Gly Lys Pro Glu Glu Ala Arg Glu Ala Ser His Arg His

210 215 220

Leu Ala Phe Ile Glu Glu Ile Leu Leu Asp Arg Ser Arg Glu Glu Ser

225 230 235 240

Arg Arg Glu Arg Ser Leu Arg Arg Leu Glu Gln Arg Lys Asn

245 250

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 3

caatggtttt accaatt 17

Claims

1.一种生物传感器，其特征在于，含有启动子P_AP、PdhR基因、PdhR基因结合位点和编码标记物的基因；所述P_AP上整合调控PdhR基因结合位点的序列，并调控编码标记物的基因表达；所述PdhR和编码标记物基因转录方向相反。

2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，启动子P_AP、PdhR基因和PdhR基因结合位点位于载体上。

3.根据权利要求1或2所述的生物传感器，其特征在于，所述载体包括ptrc系列质粒。

4.根据权利要求1～3任一所述的生物传感器，其特征在于，所述标记物为荧光蛋白。

5.含有权利要求1～4任一所述生物传感器的菌株。

6.一种构建权利要求1～4任一所述生物传感器的方法，其特征在于，将编码如SEQ IDNO.2所示PdhR基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示的编码启动子P_AP(包含SEQ ID NO.3所示的PdhR结合位点)和标记物基因依次连接到载体ptrc99a上。

7.PdhR蛋白突变体，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或几个氨基酸取代获得的氨基酸序列；所述一个或几个氨基酸取代选自组中的任意一种：E16D，Y3N和D45N，进一步地，包括如下组合之一：E16D+Y3N、E16D+D45N、Y3N+D45N和E16D+Y3N+D45N。

8.编码如权利要求7所述的PdhR突变体的核酸分子。

9.一种筛选产丙酮酸(PYR)的方法，其特征在于，以荧光蛋白为标记物，将PYR生物传感器转入到三株具有不同丙酮酸生产能力的菌株中，培养菌体细胞，检测荧光蛋白表达量，确定PYR生物传感器在筛选丙酮酸菌株中的应用。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述培养是在35-38℃、180-220rpm下培养11-12h后，以10％-20％的接种量转接至发酵培养基，于35-38℃、180-220rpm条件下发酵30-48h。

11.权利要求1～7任一所述的生物传感器在蛋白表达或微生物筛选方面的应用。