CN112851787B - 一种快速检测3-磷酸甘油酸（3pg）的方法及其使用的生物传感器 - Google Patents

一种快速检测3-磷酸甘油酸（3pg）的方法及其使用的生物传感器 Download PDF

Info

Publication number
CN112851787B
CN112851787B CN201911387305.1A CN201911387305A CN112851787B CN 112851787 B CN112851787 B CN 112851787B CN 201911387305 A CN201911387305 A CN 201911387305A CN 112851787 B CN112851787 B CN 112851787B
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
leu
val
asp
ile
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911387305.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112851787A (zh
Inventor
张大伟
丁冬芹
柏丹阳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Original Assignee
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS filed Critical Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority to CN201911387305.1A priority Critical patent/CN112851787B/zh
Publication of CN112851787A publication Critical patent/CN112851787A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112851787B publication Critical patent/CN112851787B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种快速检测3‑磷酸甘油酸(3PG)的方法及使用的生物传感器。本发明的发明人对现有的T0蛋白进行突变，制备了可与3PG结合且与3PG的亲和力高于T0蛋白的蛋白质，并用这些蛋白质制备可以快速检测待测菌株生产3PG能力的生物传感器。该生物传感器可以用于筛选生产3PG或3PG的下游产物的菌株。本发明在微生物研究及改造方面将具有重要的应用前景。

Description

一种快速检测3-磷酸甘油酸（3PG）的方法及其使用的生物传 感器
本发明涉及一种快速检测3-磷酸甘油酸(3PG)的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
微生物合成途径利用廉价的可再生资源可生产众多有价值的代谢产物，如药品、饲料、塑料等。识别代谢途径潜在的限速步骤对调控目标产物的代谢流具有非常重要的指导意义，特别是检测代谢途径中的关键酶或者中间代谢物对代谢途径改造及评价至关重要。3-磷酸甘油酸(Glycerate-3-P，3PG)是生物细胞中常见的分子之一，也是糖酵解与卡尔文循环过程中的中间产物。同时，3PG作为甘油酸的磷酸衍生物，也是丝氨酸合成的一个重要中间体1，而丝氨酸又是合成色氨酸必不可少的前体物质2，由此可见，3PG在代谢网络中占据及其重要的地位。因此建立对3PG的检测方法对很多有价值的代谢产物的生产具有重要意义。因此，建立一种快速检测3PG的方法对众多有价值的代谢产物的生产具有重要意义。
生物传感器具有稳定性好，易于操作等有点，并且在筛选中具有高通量鉴别小分子的优势，为昂贵的体外筛选提供了廉价的替代品。另外，计算机改造及优化蛋白技术的不断成熟也为生物传感器的开发提供了重要的技术支持。
发明内容
本发明的目的是快速检测3PG。
本发明首先保护蛋白质，为C1)或C2)或C3)：
C1)氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的蛋白质；
C2)将C1)所示的蛋白质氨基酸序列中第19位和第207位的氨基酸残基进行置换，得到的蛋白质；
C3)在C1)或C2)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
所述蛋白质可满足(X1)和/或(X2)：
(X1)可与3PG结合；
(X2)“所述蛋白质与3PG”的亲和力高于“氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的T0蛋白”与3PG”的亲和力。
所述(X1)中，所述蛋白质可与3PG结合具体可为所述蛋白质可与3PG特异结合。
所述C2)中，第19位的L置换为P，所述第207位的V置换为A。
编码上述任一所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。所述核酸分子可以是 DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与上述任一所述蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或 95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为向表达载体或克隆载体插入所述核酸分子得到的重组质粒。
所述重组微生物为将所述重组载体导入出发微生物得到的重组菌。
所述出发微生物可为大肠杆菌。所述大肠杆菌具体可为菌株MG1655及DH5α。
所述转基因细胞系可为将所述重组载体转化受体细胞获得的。
本发明还保护上述任一所述蛋白质、上述任一所述核酸分子、或、含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系的应用，可为Y1)-Y6)中的至少一种：
Y1)检测3PG；
Y2)制备用于检测3PG的生物传感器；
Y3)检测菌株生产3PG的能力；
Y4)评价菌株生产3PG下游产物的能力；
Y5)制备生产3PG或3PG下游产物的生物材料；
Y6)生产3PG或3PG的下游产物。
本发明检测3PG的生物传感器，包括表达盒；所述表达盒从上游至下游依次包括启动子、融合基因和终止子；
所述融合基因包括编码上述任一所述蛋白质的核酸分子和编码标记蛋白的基因。
上述任一所述标记蛋白可为荧光蛋白、抗性蛋白或毒素蛋白。在本发明的一个实施例中，所述荧光蛋白具体可为荧光蛋白GFPmut2。
上述任一所述启动子可为诱导型启动子或组成型启动子。在本发明的一个实施例中，启动子具体为tac启动子(tac启动子属于诱导型启动子)，tac启动子需要诱导剂IPTG诱导启动。
所述融合基因中，编码上述任一所述蛋白质的核酸分子和编码标记蛋白的基因通过连接肽的编码基因偶联；所述连接肽由5-30个(如5-18个、18-30个、5个、18个或30个)氨基酸组成。所述连接肽的氨基酸序列具体如SEQ ID NO:2所示。
上述任一所述生物传感器可为含有所述表达盒的质粒。在本发明的一个实施例中，所述生物传感器具体可为传感器质粒Tg01和Tg02中的任一种。
本发明还保护上述任一所述生物传感器的应用，为Y1)、Y3)、Y4)、Y5)或Y6)：
Y1)检测3PG；
Y3)检测菌株生产3PG的能力；
Y4)评价菌株生产3PG下游产物的能力；
Y5)制备生产3PG或3PG下游产物的生物材料；
Y6)生产3PG或3PG的下游产物。
上述任一所述Y5)中，生物材料可为菌株。
上述任一所述3PG下游产物可为丝氨酸、琥珀酸和芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)或其下游次级代谢产物(如脱氧紫色杆菌素、苯丙酮酸、多巴胺、黑色素)等。
所述培养条件中，诱导培养初始，诱导剂(如IPTG)的浓度可为0.5-1.5mM(如0.5-1.0mM、 1.0-1.5mM、0.5mM、1.0mM或1.5mM)。诱导培养具体可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、 35℃、37℃或39℃)诱导5-9h(如5-7h、7-9h、5h、7h或9h)。
本发明的发明人经过大量实验，对现有的T0蛋白进行突变，制备了一系列可与3PG结合且与3PG的亲和力高于T0蛋白的蛋白质，并用这些蛋白质制备可以快速检测待测菌株生产3PG能力的生物传感器。该生物传感器可以用于筛选与生产3PG或3PG的下游产物的菌株。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为传感器质粒Tp01对3PG的响应效果。
图2为传感器质粒Tg01的图谱。
图3为传感器质粒Tg01，Tg02和Tg03对3PG的响应效果。
图4为Tg1.0蛋白对3PG梯度的响应效果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
T0蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
荧光蛋白GFPmut2记载于如下文献中：Cormack，B.P.，Valdivia，R.H.&Falkow，S.FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein(GFP).Gene 173，33-38(1996).
p15ASI载体记载于如下文献中：Fang，H.et al.Metabolic engineering ofEscherichia coli for de novo biosynthesis of vitamin B12.Naturecommunications 9，4917(2018).
实施例1、传感器质粒Tp01的构建和测试
一、传感器质粒Tp01的构建
用于生物传感器的配体结合蛋白应与配体具有高度的亲和力和特异性。人源HGPRT蛋白对 PRPP的Km值很低(<0.1mM)。通过随机突变，Hemalatha等获得了一个HGPRT突变体F36L，该突变体进一步降低了对PRPP的Km(<1μM)(Raman，J.，Sumathy，K.，Anand，R.P.&Balaram， H.A non-active site mutation in human hypoxanthine guaninephosphoribosyltransferase expands substrate specificity.Archives ofbiochemistry and biophysics 427，116-122 (2004).)。因此，本发明的发明人在人源HGPRT蛋白的基础上，引入了F36L突变点，将突变后的蛋白命名为T0蛋白。T0蛋白作为配体结合蛋白。
1、将T0蛋白进行密码子优化并进行基因合成，基因合成时在T0蛋白的3’端加上18个氨基酸(KESGSVSSEQLAQFRSLD)作为连接肽(即linker)，基因合成后克隆至载体pUC57-Kan(金唯智生物科技有限公司)。得到重组质粒pUC57-T0。
2、以重组质粒pUC57-T0模板，采用引物T0-F和引物T0-R组成的引物对进行PCR扩增，得到约746bp的T0片段。
3、将荧光蛋白GFPmut2进行基因合成并克隆至载体pUC57-Kan上，得到重组质粒pUC57-GFPmut2。
4、以重组质粒pUC57-GFPmut2模板，采用引物GFPmut2-F和引物GFPmut2-R组成的引物对进行PCR扩增，得到约766bp的GFPmut2片段。
5、以p15ASI载体为模板，采用引物p15-ver-F和引物p15-ver-R组成的引物对进行PCR扩增，得到约3866bp的质粒骨架p15ASI-Gibson。
6、将T0片段、GFPmut2片段和质粒骨架p15ASI-Gibson进行Gibson assembly，得到传感器质粒Tp01。
将传感器质粒Tp01进行测序。测序结果表明，传感器质粒Tp01中含有特异DNA分子，特异 DNA分子中包括T0蛋白的编码基因(简称T0基因)、连接肽(即linker)的编码基因和荧光蛋白GFPmut2的编码基因(即GFPmut2基因)。
连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
引物T0-F、引物T0-R、引物GFPmut2-F、引物GFPmut2-R、引物p15-ver-F和引物p15-ver-R 的核苷酸序列见表1。
表1
引物名称 核苷酸序列(5’-3’)
引物T0-F TTAAGAAGGAGATATACATATGGCCACCCGTAGCCCGGG
引物T0-R GTTCTTCTCCTTTACTCATGTCAAGTGAGCGGAATTGAG
引物GFPmut2-F TCAATTCCGCTCACTTGACATGAGTAAAGGAGAAGAACT
引物GFPmut2-R GGGATCCGAATTCCTGCAGCTATTTGTATAGTTCATCC
引物p15-ver-F TGAACTATACAAATAGCTGCAGGAATTCGGATCCC
引物p15-ver-R CGGGCTACGGGTGGCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG
各个质粒的相关性质见表2。
表2
菌株或质粒 相关性质
菌株MG1655 F<sup>-</sup>λ<sup>-</sup>ilvG-rfb-50rph-1
重组菌MG1655-Tp01 MG1655衍生菌株，含有Tp01
载体pUC57-Kan ColE1 ori；kanR；Lac/laco启动子
p15ASI载体 p15A ori；CmR；Tac和lacUV5启动子
传感器质粒Tp01 p15ASI衍生质粒，插入P<sub>Tac</sub>-T0-GFPmut2
重组质粒pUC57-T0 pUC57衍生质粒，插入T0蛋白
重组质粒pUC57-GFPmut2 pUC57衍生质粒，插入GFPmut2蛋白
二、传感器质粒Tp01的测试
1、将传感器质粒Tp01转入菌株MG1655的感受态，得到重组菌MG1655-Tp01。
菌株MG1655和重组菌MG1655-Tp01的相关性质见表2。
2、完成步骤1后，将重组菌MG1655-Tp01的单克隆接种于装有5mL含30mg/L氯霉素的LB液体培养基的96孔板，37℃、800rpm过夜培养，得到种子液。
3、完成步骤2后，将100μL种子液转接至5ml含30mg/L氯霉素的M9液体培养基，37℃、 800rpm培养，得到OD600nm为0.2-0.4的培养菌液。
4、完成步骤3后，向培养菌液中加入IPTG，得到培养体系1；培养体系1中IPTG的浓度为 1mM。向培养菌液中加入IPTG和PRPP，得到培养体系2；培养体系2中IPTG的浓度为1mM，PRPP 的浓度为0.5mM。向培养菌液中加入IPTG和3PG，得到培养体系3；培养体系3中IPTG的浓度为 1mM，E4P的浓度为5mM。PRPP可以结合T0蛋白，作为对照。
5、完成步骤4后，取培养体系1、培养体系2、培养体系3或培养菌液，37℃诱导5-9h。然后测定荧光强度(AFU)和在600nm处的吸光度值(OD600)，计算AFU和OD600的比值。
检测结果见图1。结果表明，与PRPP相比，传感器质粒Tp01对3PG没有响应。由此可见， T0蛋白对3PG没有结合能力。
实施例2、3PG传感器质粒的构建及测试
一、3PG结合蛋白的获得
本发明的发明人在蛋白T0的基础上，将配体3PG对接并匹配到结合口袋区域，通过计算手段对配体周围残基进行模拟突变，并评估突变效果，以稳定配体并增加结合为主要参考手段，通过计算优化，获得蛋白G8，G25，G74。
蛋白G8的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。将蛋白G8进行密码子优化并进行基因合成，得到蛋白G8的编码基因(即G8基因)。
蛋白G25的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。将蛋白G25进行密码子优化并进行基因合成，得到蛋白G25的编码基因(即G25基因)。
蛋白G74的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。将蛋白G74进行密码子优化并进行基因合成，得到蛋白G74的编码基因(即G74基因)。
二、传感器质粒Tg01的构建
1、将G8基因克隆至载体pUC57-Kan上，得到重组质粒pUC57-G8。
2、以重组质粒pUC57-G8为模板，采用引物G8-F和引物G8-R组成的引物对进行PCR扩增，得到约746bp的G8片段。
3、以传感器质粒Tp01为模板，采用引物G8-ver-F和引物G8-ver-R组成的引物对进行PCR 扩增，得到约4584bp的质粒骨架Tp01-Gibson1。
4、将G8片段和质粒骨架Tp01-Gibson1进行Gibson assembly，得到传感器质粒Tg01。
传感器质粒Tg01的图谱见图2中a。
与传感器质粒Tp01相比，传感器质粒Tg01的唯一不同在于将T0基因替换为了G8基因。
三、传感器质粒Tg02的构建
1、将G25基因克隆至载体pUC57-Kan上，得到重组质粒pUC57-G25。
2、以重组质粒pUC57-G25模板，采用引物G25-F和引物G25-R组成的引物对进行PCR扩增，得到约747bp的G25片段。
3、以传感器质粒Tp01为模板，采用引物G25-ver-F和引物G25-ver-R组成的引物对进行PCR 扩增，得到约4584bp的质粒骨架Tp01-Gibson2。
4、将G25片段和质粒骨架Tp01-Gibson2进行Gibson assembly，得到传感器质粒Tg02。
传感器质粒Tg02的图谱见图2中b。
与传感器质粒Tp01相比，传感器质粒Tg02的唯一不同在于将T0基因替换为了G25基因。
传感器质粒Tg02的图谱见图2中b。
四、传感器质粒Tg03的构建
1、将G74基因克隆至载体pUC57-Kan上，得到重组质粒pUC57-G74。
2、以重组质粒pUC57-G74模板，采用引物G74-F和引物G74-R组成的引物对进行PCR扩增，得到约747bp的G74片段。
3、以传感器质粒Tp01为模板，采用引物G74-ver-F和引物G74-ver-R组成的引物对进行PCR 扩增，得到约4584bp的质粒骨架Tp01-Gibson3。
4、将G74片段和质粒骨架Tp01-Gibson3进行Gibson assembly，得到传感器质粒Tg03。
传感器质粒Tg03的图谱见图2中c。
与传感器质粒Tp01相比，传感器质粒Tg03的唯一不同在于将T0基因替换为了G74基因。
传感器质粒Tg03的图谱见图2中c。
3PG传感器质粒构建所用引物的核苷酸序列见表3。
表3
引物名称 核苷酸序列(5’-3’)
引物G8-F TTTAAGAAGGAGATATACATATGGCCACCCGCAGTCCGGG
引物G8-R ACACGCTGCCTGATTCCTTCGCTTTGTATTTGGCCTTGC
引物G8-ver-F CAAGGCCAAATACAAAGCGAAGGAATCAGGCAGCGTGTC
引物G8-ver-R CCGGACTGCGGGTGGCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG
引物G25-F TTAAGAAGGAGATATACATATGGCCACCCGTAGCCCGGG
引物G25-R CACGCTGCCTGATTCCTTGGCTTTATATTTGGCCTTAC
引物G25-ver-F AAGGCCAAATATAAAGCCAAGGAATCAGGCAGCGTGTC
引物G25-ver-R CGGGCTACGGGTGGCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG
引物G74-F TTAAGAAGGAGATATACATATGGCCACCCGCAGCCCGGG
引物G74-R ACGCTGCCTGATTCCTTGGCTTTGTACTTGGCTTTGC
引物G74-ver-F AGCCAAGTACAAAGCCAAGGAATCAGGCAGCGTGTC
引物G74-ver-R CCGGGCTGCGGGTGGCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG
各个菌株及质粒的相关性质见表4：
表4
菌株或质粒 相关性质
菌株MG1655 F-λ<sup>-</sup>ilvG-rfb-50rph-1
MG1655-Tg01 MG1655衍生菌株，含有Tg01
MG1655-Tg02 MG1655衍生菌株，含有Tg02
MG1655-Tg03 MG1655衍生菌株，含有Tg03
传感器质粒Tg01 p15ASI衍生质粒，插入P<sub>Tac</sub>-G8-GFPmut2
传感器质粒Tg02 p15ASI衍生质粒，插入P<sub>Tac</sub>-G25-GFPmut2
传感器质粒Tg03 p15ASI衍生质粒，插入P<sub>Tac</sub>-G74-GFPmut2
五、传感器质粒Tg01、Tg02和Tg03的测试。
1、将传感器质粒Tg01转入菌株MG1655的感受态，得到重组菌，命名为MG1655-Tg01。
2、完成步骤1后，将单克隆接种于装有5mL含30mg/L氯霉素的LB液体培养基中，37℃、 800rpm过夜培养，得到种子液。
3、完成步骤2后，将100μL种子液转接至5mL含30mg/L氯霉素的M9液体培养基，37℃、 800rpm培养，得到OD600nm为0.2-0.4的培养菌液。
4、完成步骤3后，向培养菌液中加入IPTG，得到培养体系1；培养体系1中IPTG的浓度为1mM。向培养菌液中加入IPTG和3PG，得到培养体系2；培养体系2中IPTG的浓度为1mM，3PG的浓度为10mM。
5、完成步骤4后，取培养体系1、培养体系2或培养菌液，37℃诱导5-9h，然后测定荧光强度(AFU)和在600nm处的吸光度值(OD600)，计算AFU和OD600的比值。
按照上述步骤2-5，将MG1655-Tg01替换为MG1655-Tg02、MG1655-Tg03，其它步骤均不变，得到相应的AFU/OD600。
检测结果见图3。结果表明，传感器质粒Tg01和Tg03显示出一定的3PG响应度，传感器质粒Tg02则对3PG无响应。
实施例3、Tg1.0蛋白的筛选及其对3PG梯度的响应
一、G8突变库的构建
1、将G8蛋白用TIANDZ即时易错PCR试剂盒v 1.3进行突变建库，得到G8突变蛋白库，具体步骤参照TIANDZ即时易错PCR试剂盒v 1.3的说明书进行。
易错PCR反应体系具体见表5，易错PCR Mix、易错PCR专用dNTP、MnCl2(5mM)、dGTP、PCR 引物(10μM each)和Taq DNA聚合酶(5U/μL)均为TIANDZ即时易错PCR试剂盒v 1.3中的组件。目的DNA模板为G8基因。
表5
成分 体积(μL) 体积(μL) 体积(μL)
易错PCR Mix 3 3 3
易错PCR专用dNTP 3 3 3
MnCl<sub>2</sub>(5mM) 2.5 4 4
dGTP 0 1 2
G8基因(10ng/μL) 1 1 1
PCR引物(10μM each) 1 1 1
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.5 0.5 0.5
补水至 30 30 30
易错PCR反应程序为：94℃3min；94℃1min，45℃1min，72℃1min，40个循环。
2、完成步骤1后，将G8突变蛋白库与GFPmut2通过overlap融合到一块，并通过Gibson-assemble与质粒骨架p15ASI-Gibson连接形成质粒突变库G8-GFPmut2，然后转入菌株 DH5α的感受态并涂布于含有氯霉素抗性的LB固体平板上，由所有的单菌落组成G8突变库。
随机挑取20个单菌落，进行E30蛋白DNA测序。测序结果显示，突变率为0-4个突变/kb。
二、G8突变库筛选
对步骤一构建的G8突变库进行两轮流式筛选。具体如下：
1、第一轮筛选
(1)刮取G8突变库的菌落并置于装有10mL含30mg/L氯霉素的LB液体培养基的摇瓶(规格为100mL)中，然后加入IPTG和E4P，得到培养体系；培养体系中，IPTG的浓度为1mM，3PG的浓度为3mM。
(2)取步骤(1)得到的培养体系，37℃、200rpm过夜培养，然后用1×PBS缓冲液稀释100倍，之后流式分选，收集荧光激活率最高的0.03％细胞。
2、第二轮筛选
将第一轮筛选收集的细胞转接至含30mg/L氯霉素和1mM IPTG的LB液体培养基，37℃、 200rpm过夜培养，然后用1×PBS缓冲液稀释100倍，之后流式分选，收集荧光激活率最低的 3.81％细胞。
3、将第二轮筛选收集的细胞在LB液体培养基中进行复苏，然后涂布于耐氯霉素的固体培养基上，培养，之后对固体培养基上的单菌落进行验证。
(1)将单菌落接种于装有500μL含30mg/L氯霉素的LB液体培养基的96孔板中，37℃、 800rpm过夜培养，然后以1:50比例转接入两个装有200μL含30mg/L氯霉素的M9液体培养基的细胞培养板中，37℃培养。
(2)待细胞培养至OD600nm为0.2-0.4，一个培养板中添加终浓度为1mM的IPTG和终浓度为3mM的3PG，另一个培养板中只添加终浓度为1mM的IPTG。之后37℃继续培养5-9h，通过多功能酶标仪进行AFU(激发483nm，发射525nm)和OD600测定。
根据测定结果，挑选AFU/OD600(即AFU和OD600的比值)最高的一株菌(命名为DH5α-D4) 进行基因测序。测序结果表明，MG1655-F9的E30蛋白存在两个点突变L19P和V207A，将突变后的G8蛋白命名为Tg1.0蛋白。
Tg1.0蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。与G8蛋白相比，Tg1.0蛋白的唯一区别在于引入了L19P和V207A突变点。
三、Tg1.0蛋白对3PG梯度的响应
1、将MG1655-D4或MG1655-Tg01的单克隆接种于5mL含30mg/L氯霉素的LB液体培养基， 37℃、200rpm过夜培养，得到培养菌液1。
2、完成步骤1后，将100μL培养菌液1转接至5mL含30mg/L氯霉素的M9液体培养基，37℃、 200rpm培养，得到OD600nm为0.2-0.4的培养菌液2。
3、完成步骤2后，向培养菌液2中加入IPTG，得到培养体系1；培养体系1中IPTG的浓度为 1mM。向培养菌液2中加入IPTG和E4P，得到培养体系2；培养体系2中IPTG的浓度为1mM，3PG 的浓度为2.5mM、5mM、10mM。
4、完成步骤3后，取培养体系1、培养体系2或培养菌液2，37℃诱导5-9h,然后测定荧光强度(AFU)和在600nm处的吸光度值(OD600)，计算AFU和OD600的比值。
检测结果见图4。结果表明，Tg1.0蛋白对E4P的响应提高到2倍，E4P浓度和“AFU和OD600的比值”线性相关。
参考文献：
1.Zhang,X.,Xu,G.,Shi,J.,Koffas,M.A.G.&Xu,Z.Microbial Production of l-Serine from Renewable Feedstocks.Trends in biotechnology 36,700-712 (2018).
2.Chen,L.&Zeng,A.P.Rational design and metabolic analysis ofEscherichia coli for effective production of L-tryptophan at highconcentration.Applied microbiology and biotechnology 101,559-568(2017).
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种快速检测3-磷酸甘油酸（3PG）的方法及其使用的生物传感器
<130> 20191220
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 218
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Thr Arg Ser Pro Gly Val Val Ile Ser Asp Asp Glu Pro Gly
1 5 10 15
Tyr Asp Leu Asp Leu Phe Cys Ile Pro Asn His Tyr Ala Glu Asp Leu
20 25 30
Glu Arg Val Leu Ile Pro His Gly Leu Ile Met Asp Arg Thr Glu Arg
35 40 45
Leu Ala Arg Asp Val Met Lys Glu Met Gly Gly His His Ile Val Ala
50 55 60
Leu Cys Val Leu Lys Gly Gly Tyr Lys Phe Phe Ala Asp Leu Leu Asp
65 70 75 80
Tyr Ile Lys Ala Leu Asn Arg Asn Ser Asp Arg Ser Ile Pro Met Thr
85 90 95
Val Asp Phe Ile Arg Leu Lys Ser Tyr Cys Asn Asp Gln Ser Thr Gly
100 105 110
Asp Ile Lys Val Ile Gly Gly Asp Asp Leu Ser Thr Leu Thr Gly Lys
115 120 125
Asn Val Leu Ile Val Glu Asp Ile Ile Asp Thr Gly Lys Thr Met Gln
130 135 140
Thr Leu Leu Ser Leu Val Arg Gln Tyr Asn Pro Lys Met Val Lys Val
145 150 155 160
Ala Ser Leu Leu Val Lys Arg Thr Pro Arg Ser Val Gly Tyr Lys Pro
165 170 175
Asp Phe Val Gly Phe Glu Ile Pro Asp Lys Phe Val Val Gly Tyr Ala
180 185 190
Leu Asp Tyr Asn Glu Tyr Phe Arg Asp Leu Asn His Val Cys Val Ile
195 200 205
Ser Glu Thr Gly Lys Ala Lys Tyr Lys Ala
210 215
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 2
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 3
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 3
Met Ala Thr Arg Ser Pro Gly Val Val Ile Ser Asp Asp Glu Pro Gly
1 5 10 15
Tyr Asp Leu Asp Leu Phe Cys Ile Pro Asn His Tyr Ala Glu Asp Leu
20 25 30
Glu Arg Val Leu Ile Pro His Gly Leu Ile Met Asp Arg Thr Glu Arg
35 40 45
Leu Ala Arg Asp Val Met Lys Glu Met Gly Gly His His Ile Val Ala
50 55 60
Leu Cys Ile Leu Tyr Met Ala Tyr Lys Phe Phe Ala Asp Leu Leu Asp
65 70 75 80
Tyr Ile Lys Ala Leu Asn Arg Asn Ser Asp Arg Ser Ile Pro Met Thr
85 90 95
Val Asp Phe Ile Arg Leu Lys Val Tyr Cys Asn Asp Gln Ser Thr Gly
100 105 110
Asp Ile Lys Val Ile Gly Gly Asp Asp Leu Ser Thr Leu Thr Gly Lys
115 120 125
Asn Val Leu Ile Val Phe Asp Met Leu Asp Thr Gly Met Leu Met Gln
130 135 140
Thr Leu Leu Ser Leu Val Arg Gln Tyr Asn Pro Lys Met Val Lys Val
145 150 155 160
Ala Ser Trp Leu Val Val Arg Thr Pro Arg Ser Val Gly Tyr Lys Pro
165 170 175
Asp Phe Val Gly Phe Glu Ile Pro Asp Lys Ile Leu Val Gly Tyr Ala
180 185 190
Val Met Tyr Asn Glu Tyr Phe Leu Asp Leu Asn His Leu Cys Val Ile
195 200 205
Ser Glu Thr Gly Lys Ala Lys Tyr Lys Ala
210 215
<210> 4
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 4
Met Ala Thr Arg Ser Pro Gly Val Val Ile Ser Asp Asp Glu Pro Gly
1 5 10 15
Tyr Asp Leu Asp Leu Phe Cys Ile Pro Asn His Tyr Ala Glu Asp Leu
20 25 30
Glu Arg Val Leu Ile Pro His Gly Leu Ile Met Asp Arg Thr Glu Arg
35 40 45
Leu Ala Arg Asp Val Met Lys Glu Met Gly Gly His His Ile Val Ala
50 55 60
Leu Cys Leu Leu Gly Gly Ala Tyr Ile Ile Phe Ala Asp Leu Leu Asp
65 70 75 80
Tyr Ile Lys Ala Leu Asn Arg Asn Ser Asp Arg Ser Ile Pro Met Thr
85 90 95
Val Asp Phe Ile Arg Ile Lys Met Val Cys Asn Asp Gln Ser Thr Gly
100 105 110
Asp Ile Lys Val Ile Gly Gly Asp Asp Leu Ser Thr Leu Thr Gly Lys
115 120 125
Asn Val Leu Ile Val Ile Asp Leu Ile Tyr Leu Gly Lys Val Leu Gln
130 135 140
Thr Leu Leu Ser Leu Val Arg Gln Tyr Asn Pro Lys Met Val Lys Val
145 150 155 160
Ala Ser Leu Met Val Lys Arg Thr Pro Arg Ser Val Gly Tyr Lys Pro
165 170 175
Asp Phe Val Gly Phe Glu Ile Pro Asp Lys Phe Leu Val Gly Tyr Asp
180 185 190
Met Leu Tyr Asn Glu Tyr Phe Leu Asp Leu Asn His Val Cys Val Ile
195 200 205
Ser Glu Thr Gly Lys Ala Lys Tyr Lys Ala
210 215
<210> 5
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 5
Met Ala Thr Arg Ser Pro Gly Val Val Ile Ser Asp Asp Glu Pro Gly
1 5 10 15
Tyr Asp Leu Asp Leu Phe Cys Ile Pro Asn His Tyr Ala Glu Asp Leu
20 25 30
Glu Arg Val Leu Ile Pro His Gly Leu Ile Met Asp Arg Thr Glu Arg
35 40 45
Leu Ala Arg Asp Val Met Lys Glu Met Gly Gly His His Ile Val Ala
50 55 60
Leu Cys Leu Leu Asp Gly Ser Tyr Lys Ala Phe Ala Asp Leu Leu Asp
65 70 75 80
Tyr Ile Lys Ala Leu Asn Arg Asn Ser Asp Arg Ser Ile Pro Met Thr
85 90 95
Val Asp Phe Ile Leu Leu Lys Phe Arg Leu Asn Asp Gln Ser Thr Gly
100 105 110
Asp Ile Lys Val Ile Gly Gly Asp Asp Leu Ser Thr Leu Thr Gly Lys
115 120 125
Asn Val Leu Ile Val Glu Asp Leu Ile Val Thr Gly Lys Leu Met Gln
130 135 140
Thr Leu Leu Ser Leu Val Arg Gln Tyr Asn Pro Lys Met Val Lys Val
145 150 155 160
Ala Ser Leu Met Val Lys Arg Thr Pro Arg Ser Val Gly Tyr Lys Pro
165 170 175
Asp Phe Val Gly Phe Glu Ile Pro Asp Lys Phe Val Val Gly Tyr Gln
180 185 190
Leu Ile Tyr Asn Glu Tyr Phe Arg Asp Leu Asn His Val Cys Val Ile
195 200 205
Ser Glu Thr Gly Lys Ala Lys Tyr Lys Ala
210 215
<210> 6
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 6
Met Ala Thr Arg Ser Pro Gly Val Val Ile Ser Asp Asp Glu Pro Gly
1 5 10 15
Tyr Asp Pro Asp Leu Phe Cys Ile Pro Asn His Tyr Ala Glu Asp Leu
20 25 30
Glu Arg Val Leu Ile Pro His Gly Leu Ile Met Asp Arg Thr Glu Arg
35 40 45
Leu Ala Arg Asp Val Met Lys Glu Met Gly Gly His His Ile Val Ala
50 55 60
Leu Cys Ile Leu Tyr Met Ala Tyr Lys Phe Phe Ala Asp Leu Leu Asp
65 70 75 80
Tyr Ile Lys Ala Leu Asn Arg Asn Ser Asp Arg Ser Ile Pro Met Thr
85 90 95
Val Asp Phe Ile Arg Leu Lys Val Tyr Cys Asn Asp Gln Ser Thr Gly
100 105 110
Asp Ile Lys Val Ile Gly Gly Asp Asp Leu Ser Thr Leu Thr Gly Lys
115 120 125
Asn Val Leu Ile Val Phe Asp Met Leu Asp Thr Gly Met Leu Met Gln
130 135 140
Thr Leu Leu Ser Leu Val Arg Gln Tyr Asn Pro Lys Met Val Lys Val
145 150 155 160
Ala Ser Trp Leu Val Val Arg Thr Pro Arg Ser Val Gly Tyr Lys Pro
165 170 175
Asp Phe Val Gly Phe Glu Ile Pro Asp Lys Ile Leu Val Gly Tyr Ala
180 185 190
Val Met Tyr Asn Glu Tyr Phe Leu Asp Leu Asn His Leu Cys Ala Ile
195 200 205
Ser Glu Thr Gly Lys Ala Lys Tyr Lys Ala
210 215

Claims (8)

1.蛋白质，为C1）或C2）或C3）：
C1）氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的蛋白质；
C2）将C1）所示的蛋白质氨基酸序列中第19位和第207位的氨基酸残基进行置换，第19位的L置换为P、第207位的V置换为A得到的蛋白质；
C3）在C1）或C2）所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.含有权利要求2所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
4.权利要求1所述蛋白质、权利要求2所述核酸分子或权利要求3所述表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系的应用，为Y1）-Y4）中的至少一种：
Y1）检测3PG；
Y2）制备用于检测3PG的生物传感器；
Y3）检测菌株生产3PG的能力；
Y4）评价菌株生产3PG下游产物的能力。
5.一种用于检测3PG的生物传感器，包括表达盒；所述表达盒从上游至下游依次包括启动子、融合基因和终止子；
所述融合基因包括编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子和编码标记蛋白的基因；
所述标记蛋白为荧光蛋白。
6.如权利要求5所述的生物传感器，其特征在于：所述融合基因中，编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子和编码标记蛋白的基因通过连接肽的编码基因偶联；所述连接肽由5-30个氨基酸组成。
7.如权利要求5或6所述的生物传感器，其特征在于：所述生物传感器为含有权利要求5或6所述表达盒的质粒。
8.权利要求5至7任一所述的生物传感器的应用，为Y1）、Y3）或Y4）：
Y1）检测3PG；
Y3）检测菌株生产3PG的能力；
Y4）评价菌株生产3PG下游产物的能力。
CN201911387305.1A 2019-12-27 2019-12-27 一种快速检测3-磷酸甘油酸（3pg）的方法及其使用的生物传感器 Active CN112851787B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911387305.1A CN112851787B (zh) 2019-12-27 2019-12-27 一种快速检测3-磷酸甘油酸（3pg）的方法及其使用的生物传感器

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911387305.1A CN112851787B (zh) 2019-12-27 2019-12-27 一种快速检测3-磷酸甘油酸（3pg）的方法及其使用的生物传感器

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112851787A CN112851787A (zh) 2021-05-28
CN112851787B true CN112851787B (zh) 2021-10-22

Family

ID=75996076

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911387305.1A Active CN112851787B (zh) 2019-12-27 2019-12-27 一种快速检测3-磷酸甘油酸（3pg）的方法及其使用的生物传感器

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112851787B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107974451A (zh) * 2017-06-27 2018-05-01 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种应答3-脱氢莽草酸的生物传感器及其应用
CN109679886A (zh) * 2017-10-18 2019-04-26 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种基于生物传感器的高通量筛选方法
CN110283764A (zh) * 2019-04-19 2019-09-27 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种半胱氨酸单细胞生物传感器的构建及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107974451A (zh) * 2017-06-27 2018-05-01 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种应答3-脱氢莽草酸的生物传感器及其应用
CN109679886A (zh) * 2017-10-18 2019-04-26 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种基于生物传感器的高通量筛选方法
CN110283764A (zh) * 2019-04-19 2019-09-27 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种半胱氨酸单细胞生物传感器的构建及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112851787A (zh) 2021-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230227895A1 (en) Methods for High-Throughput Labelling and Detection of Biological Features in Situ Using Microscopy
Karimova et al. Protein-protein interaction between Bacillus stearothermophilus tyrosyl-tRNA synthetase subdomains revealed by a bacterial two-hybrid system
US10836798B2 (en) Amino acid-specific binder and selectively identifying an amino acid
CN110724702B (zh) 一种丙酮酸(pyr)的特异性生物传感器及其应用
US6333154B1 (en) Bacterial multi-hybrid system and applications thereof
US20210324353A1 (en) Recombinant kod polymerase
JP7256280B2 (ja) 熱安定性が向上したＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体及びそのシーケンシングにおける応用
CN113061591A (zh) 一种新型萤火虫萤光素酶突变体、其制备方法和应用
Shimada et al. Novel regulator P gr R for switch control of peptidoglycan recycling in E scherichia coli
CN110592131B (zh) 麦芽糖转录激活因子MalR的突变体文库构建筛选及其应用
CN113354745B (zh) 一种组合物及规模化生产成纤维细胞生长因子的方法
CN112851787B (zh) 一种快速检测3-磷酸甘油酸（3pg）的方法及其使用的生物传感器
Yumerefendi et al. Library-based methods for identification of soluble expression constructs
CN108866057B (zh) 一种大肠杆菌压力响应型启动子及其制备方法
CN112831482B (zh) 一种快速检测prpp的方法及其使用的生物传感器
CN112898434B (zh) 一种快速检测待测菌株生产e4p能力的方法及其使用的生物传感器
CN112608876B (zh) 一种生物素化Curli蛋白的活细胞标记方法及其应用
CN111575251B (zh) 一种用于达托霉素生物合成的dptC1突变体的构建
CN114214308A (zh) 一种经半理性改造提升活性的腈水解酶突变体
CN114163506A (zh) 施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白在介导同源重组上的应用
EP3448873B1 (en) Engineered fha domains
CN117165551A (zh) 一种甲硫氨酸腺苷转移酶突变体及其应用
CN111349623B (zh) 9°n dna聚合酶突变体
CN116144686A (zh) 一种细菌体内靶向蛋白酰基化修饰方法
Lee et al. Improving the growth rate of Escherichia coli DH5α at low temperature through engineering of GroEL/S chaperone system

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant