CN116144686A

CN116144686A - 一种细菌体内靶向蛋白酰基化修饰方法

Info

Publication number: CN116144686A
Application number: CN202111383529.2A
Authority: CN
Inventors: 顾阳; 刘彦强; 姜卫红
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2021-11-22
Filing date: 2021-11-22
Publication date: 2023-05-23

Abstract

本发明公开了一种细菌体内靶向蛋白酰基化修饰方法，包括下述步骤：在CRISPR系统中，将酰基转移酶‑dCas12a融合蛋白基因和crRNA基因构建在质粒上，并转入细菌内，通过细菌生长增殖，完成对靶向蛋白的酰基化修饰。本发明的方法拓宽了CRISPR技术的应用范围，实现了靶向蛋白的酰基化修饰。

Description

一种细菌体内靶向蛋白酰基化修饰方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种细菌体内靶向蛋白酰基化修饰方法，具体涉及一种基于CRISPR的细菌体内靶向蛋白酰基化修饰方法。

背景技术

蛋白质翻译后动态共价修饰包括磷酸化、酰基化、甲基化等多种形式，它们与转录调控、翻译调控等方式共同组成了生物体多层次的代谢调控网络，从而对各种生理代谢活动精准调节以应对多变的外界环境。其中，蛋白质赖氨酸乙酰化修饰(PLA)是一种十分重要且广泛存在的蛋白质翻译后修饰方式，它在三界生命系统中非常保守，并在生物体中发挥调控多种重要的生理代谢活动的功能。

为了研究乙酰化修饰的奥秘，人们开发出了多种手段：包括对全局乙酰化水平的干扰(如对乙酰化酶或去乙酰化酶的敲除、过表达)、对关键乙酰化修饰位点的模拟突变、对关键乙酰化位点进行乙酰赖氨酸插入等(Carabetta VJ,Cristea IM.2017.JBacteriol.doi:10.1128/JB.00107-17.)。然而现有的技术无法在细胞内原位靶向修饰蛋白质组进而探究特定蛋白的功能变化及与表型的关联，这大大限制了人们对诸多乙酰化修饰位点的生理功能的理解。近年来，随着CRISPR技术的快速发展，人们利用其能够靶向核酸的特性，通过蛋白融合技术逐步实现了对DNA、RNA、组蛋白的靶向修饰(Vojta A,etal.2016.Nucleic Acids Res.44:5615-28.Liu XM,et al.2019.Nat Chem Biol.15:865-871.Hilton IB,et al.2015.Nat Biotechnol.33:510-7.)。

发明内容

受CRISPR的应用技术进展启发，发明人设想：鉴于原核生物转录和翻译是耦联的，可以通过将乙酰化酶与Cas蛋白融合表达，在crRNA的介导下实现将乙酰化酶在目的蛋白基因附近局部富集，从而对翻译出的蛋白进行靶向乙酰化修饰，再结合表型分析可以快速鉴定出受乙酰化修饰调控的、具有重要生理意义的蛋白。基于该发明构思，发明人根据文献选择了四种原核生物乙酰化酶，分别是肠道沙门菌S.enterica来源的Pat(97.7kDa，NCBI登录号WP_000082639.1)、大肠杆菌E.coli来源的YfiQ(97.7kDa，NCBI登录号WP_000083005.1)、枯草芽孢杆菌B.subtilis来源的AcuA(24.3kDa，NCBI登录号WP_003229296.1)和永达尔梭菌C.ljungdahlii来源的At2(17.6kDa，NCBI登录号ADK13966.1)(Starai VJ,Escalante-Semerena JC.2004.J Mol Biol.340:1005-12.Liang W,et al.2011.Mol Cell.44:160-6.Gardner JG,et al.2006.J Bacteriol.188:5460-8.Zhang L,et al.2020.Mbio.11.)。将这四种乙酰化酶进行了蛋白纯化，通过对目标蛋白Pta(磷酸转乙酰化酶)的乙酰化修饰来进行催化能力比较，印证了本发明构思的可行性，取得了预期效果。

因此，本发明的第一个方面在于提供一种生物体内蛋白翻译后修饰技术，即一种细菌体内靶向蛋白酰基化修饰方法，其包括下述步骤：在CRISPR系统中，将作为酰基化修饰效应元件的酰基转移酶与作为靶向元件的dCas12a融合形成的酰基转移酶-dCas12a融合蛋白的编码基因和crRNA编码基因分别构建在质粒上，并转入细菌内，通过细菌生长增殖，完成对靶向蛋白的酰基化修饰。

上述方法实现了酰基化修饰效应元件与CRISPR靶向元件dCas12a的合二为一，有利于CRISPR系统的构建简单化，便于快速实施对细菌蛋白质组水平的靶向酰基化修饰。

其中，酰基转移酶-dCas12a融合蛋白基因和crRNA编码基因可以分别构建在不同的质粒上，也可以构建在同一个的质粒上。优选地，上述所述酰化酶-dCas12a融合蛋白基因和所述crRNA基因被构建在同一个质粒上。

上述酰基转移酶(或称酰化酶)可以是乙酰基转移酶(或称乙酰化酶)或者丙酰基转移酶(或称丙酰化酶)。

在一种实施方式中，上述酰基转移酶(或称酰化酶)选自下组：肠道沙门菌S.enterica来源的Pat(97.7kDa，NCBI登录号WP_000082639.1)、大肠杆菌E.coli来源的YfiQ(97.7kDa，NCBI登录号WP_000083005.1)、枯草芽孢杆菌B.subtilis来源的AcuA(24.3kDa，NCBI登录号WP_003229296.1)、永达尔梭菌C.ljungdahlii来源的At2(17.6kDa，NCBI登录号ADK13966.1)，在文献Starai VJ,Escalante-Semerena JC.2004.J MolBiol.340:1005-12.Liang W,et al.2011.Mol Cell.44:160-6.Gardner JG,et al.2006.JBacteriol.188:5460-8.Zhang L,et al.2020.Mbio.11.中已有报道。

上述酰基转移酶-dCas12a融合蛋白包括：酰基转移酶、dCas12a、连接这两者的接头(linker)，所述接头(linker)选自下组：氨基酸序列为GGGS(SEQ ID NO:1)的linkerL1，氨基酸序列为GSGEAAAK(SEQ ID NO:2)的linkerL2，氨基酸序列为GSGEAAAKEAAAK(SEQ IDNO:3)的linkerL3，氨基酸序列为GSGEAAAKEAAAKEAAAK(SEQ ID NO:4)的linkerL4，优选氨基酸序列为GSGEAAAK(SEQ ID NO:2)的linkerL2。

从接头的性质而言，四种蛋白linker可划分为短链的柔性linker L1(GGGS)、短链的刚性linker L2(GSGEAAAK)、中链的刚性linker L3(GSG(EAAAK)₂)以及长链的刚性linker L4(GSG(EAAAK)₃)。

至于酰基转移酶-dCas12a融合蛋白的结构即两个主要蛋白的C端、N端位置顺序，可通过具体的融合蛋白中酰基转移酶活性以及dCas12a结合靶基因能力两方面的对比实验予以确定。例如，对于由At2、dCas12a和L2构成的融合蛋白，通过At2乙酰化修饰Pta蛋白能力对比、dCas12a结合靶基因的能力比较，确定了At2在N端，dCas12a在C端，即dCas12a-L2-At2。

上述dCas12a是土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)来源的CRISPR相关核酸酶dCas12a，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5，是土拉弗朗西斯菌来源的Cas12a蛋白的E1006A突变体。该dCas12a仍然保留结合DNA活性，但不具有切割DNA的活性。

在一种实施方式中，上述酰基化是乙酰化，可以由At2催化，以乙酰辅酶A作为乙酰基供体。

在一种实施方式中，上述酰基化是丙酰化，可以由YfiQ催化，以丙酰辅酶A作为丙酰基供体。

上述细菌可以是革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌。

本发明的第二个方面提供了一种用于实施上述细菌体内靶向蛋白酰基化修饰方法的试剂盒，其包括上述细菌体内靶向蛋白酰基化修饰方法中使用的克隆了上述酰基转移酶-dCas12a融合蛋白基因和crRNA编码基因的质粒。

包含上述酰基转移酶-dCas12a融合蛋白基因和crRNA编码基因的质粒的CRISPR/Cas系统可以称为靶向酰基化系统TPA(Targeted protein acylation system)。当酰基化是乙酰化时，TPA是指靶向乙酰化系统，或称靶向乙酰化(修饰)工具。

因此，本发明的上述试剂盒实质上是一种靶向酰基化系统试剂盒，主要包含酰基转移酶-dCas12a融合蛋白基因和crRNA编码基因的质粒。

显然，本发明的试剂盒能够用于实现细菌中靶向蛋白的酰基化、尤其是乙酰化，从而精确地调控细菌中特定基因的转录和表达、调节蛋白质活性、细菌生理过程。

实验证明，与分离的酰基转移酶和dCas12a蛋白相比，酰基转移酶-dCas12a融合蛋白的表达能够实现高效率的靶向蛋白的酰基化修饰。本发明的靶向酰基化修饰系统TPA具有高效性和通用性，有助于快速鉴定出受酰基化修饰调控的、具有重要生理意义的蛋白，并且可直接靶向细菌基因组对目标蛋白进行酰基化修饰，拓宽了CRISPR技术的应用范围。

附图说明

图1显示了的四种乙酰化酶Pat、YfiQ、AcuA和At2催化目标蛋白Pta(磷酸转乙酰化酶)乙酰化修饰反应的免疫印迹照片。图中Kac是Pta乙酰化修饰程度表征(使用乙酰化抗体对修饰后的Pta蛋白进行western blot分析)，Control是底物Pta蛋白量表征(将修饰后的Pta蛋白进行SDS-PAGE电泳分离后，使用考马斯亮蓝染色)。通过乙酰化反应的产物乙酰化western blot定量值Kac与蛋白定量Control的比值(Kac/control)，比较四种备选的乙酰化酶的催化能力。

图2显示了采用不同蛋白接头linker(L1、L2、L3、L4)的At2-dCas12a融合蛋白的结构和催化目标蛋白Pta(磷酸转乙酰化酶)反应的免疫印迹照片。左图为At2-dCas12a融合蛋白的结构示意图，右图为采用不同linker的融合蛋白催化乙酰化反应的酶活性相对于At2的比较结果。

图3显示了采用两种At2-dCas12a融合蛋白dCas12a-L2-At2和At2-L2-dCas12a的结构和催化目标蛋白Pta(磷酸转乙酰化酶)反应的免疫印迹照片。左图为dCas12a-L2-At2和At2-L2-dCas12a的结构示意图，右图为采用两种融合蛋白催化乙酰化反应的酶活性相对于At2的比较结果。

图4显示了采用双质粒CRISPR系统检测At2-dCas12a(无crRNA)、At2-dCas12a-crRNA、dCas12a-crRNA分别对乙酰辅酶A合酶基因acs和RNaseII基因rnb的转录抑制情况。左上图是crRNA靶向基因acs的示意图，右上图是crRNA靶向基因rnb的示意图，其中RBS是核糖体结合位点(ribosomebinding site)。左下图显示了At2-dCas12a(无crRNA)、At2-dCas12a-crRNA、dCas12a-crRNA分别对靶基因acs的转录抑制柱形图，右下图显示了At2-dCas12a(无crRNA)、At2-dCas12a-crRNA、dCas12a-crRNA分别对靶基因rnb的转录抑制柱形图，纵坐标是靶基因的相对表达水平。***,P<0.001，**,P<0.01。

图5显示了分别采用双质粒CRISPR系统检测质粒At2-dCas12a(无crRNA)、At2-dCas12a-crRNA分别靶向乙酰辅酶A合酶基因acs的模板链(TS)和非模板链(NTS)从而对蛋白Acs进行乙酰化修饰的情况。上图是质粒靶向基因acs的模板链(TS)和非模板链(NTS)的示意图。下图是免疫印迹照片。

图6显示了分别采用质粒At2-dCas12a(无crRNA)、dCas12a-crRNA和At2-dCas12a-crRNA分别靶向大肠杆菌基因组的乙酰辅酶A合酶基因acs和RNase II基因rnb从而对蛋白Acs和RNase II进行乙酰化修饰的情况。左上图是质粒靶向基因acs的非模板链(NTS)的示意图；左下图是免疫印迹照片。右上图是质粒靶向基因rnb的非模板链(NTS)的示意图；右下图是免疫印迹照片。

图7显示了分别用靶向Acs的质粒dCas12a-crRNA、At2-dCas12a(无crRNA)和At2-dCas12a-crRNA处理后的大肠杆菌的表型和Acs相对表达水平。左图是生长曲线，纵坐标是菌体浓度，横坐标是培养时间；右图是acs相对表达水平柱形图。n.s.，无显著性。

图8显示了分别用靶向RNase II的质粒dCas12a-crRNA、At2-dCas12a(无crRNA)和At2-dCas12a-crRNA处理后的大肠杆菌的表型和RNase II相对表达水平。左图是生长曲线，纵坐标是菌体浓度，横坐标是培养时间；右图是rnb相对表达水平柱形图。n.s.，无显著性。

图9显示了分别采用质粒At2-dCas12a(无crRNA)、dCas12a-crRNA和At2-dCas12a-crRNA分别靶向大肠杆菌基因组的乙酰辅酶A合酶基因acs从而对蛋白Acs进行乙酰化修饰后，测试菌株的全蛋白乙酰化修饰水平的SDS凝胶电泳照片。图中Kac是使用乙酰化抗体对全蛋白乙酰化水平的western blot分析结果，Control是对全蛋白使用考马斯亮蓝的染色定量分析结果。

图10显示了分别采用包含阴性对照质粒YfiQ-dCas12a(无crRNA)的双质粒系统和包含融合蛋白质粒YfiQ-dCas12a-crRNA的双质粒系统对Acs蛋白进行靶向丙酰化测试的免疫印迹照片。图中KPr是靶标蛋白Acs丙酰化修饰程度表征(使用丙酰化抗体对Acs蛋白进行western blot分析)，Control是Acs蛋白定量表征(将孵育体系中的Acs蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，再通过考染对Acs蛋白进行染色定量分析)。

具体实施方式

为了探索基于CRISPR技术快速鉴定受乙酰化修饰调控的蛋白，发明人构思出酰基转移酶-dCas12a融合蛋白的表达方法。将四种有文献报道的乙酰化酶Pat、YfiQ、AcuA和At2进行了蛋白纯化，对目标蛋白Pta(磷酸转乙酰化酶)的乙酰化修饰来进行催化能力比较。通过衡量催化能力及蛋白大小，选定了永达尔梭菌来源的At2作为乙酰化修饰效应元件，靶向元件选择了土拉弗朗西斯菌Francisella tularensis来源的dCas12a。为了确定蛋白融合的方式，发明人选择了四种蛋白linker，分别是短链的柔性linker L1(GGGS)、短链的刚性linker L2(GSGEAAAK)、中链的刚性linker L3(GSG(EAAAK)₂)以及长链的刚性linker L4(GSG(EAAAK)₃)，通过蛋白融合后At2酶活力比较、蛋白融合后的dCas12a结合靶基因的能力比较，确定了蛋白融合的较佳方式是使用linker L2，At2在N端，dCas12a在C端。

本发明意外地发现，At2通过linker L2与dCas12a融合后，乙酰化修饰酶活力不降反升，高于孤立的乙酰化酶At2。

发明人运用双质粒系统验证靶向乙酰化修饰的可能性。crRNA分别靶向目标蛋白Acs(乙酰辅酶A合酶)的模板链(TS，template strand)和非模板链(NTS，non-templatestrand)，结果表明，在大肠杆菌中靶向乙酰化系统TPA可以实现对目标蛋白的靶向乙酰化修饰，并且靶向于模板链或非模板链对修饰效果影响不大。

发明人还测试了TPA系统直接靶向基因组对目标蛋白的修饰效果。靶基因选择了乙酰辅酶A合酶基因acs和RNaseII基因rnb，结果表明TPA系统依然可以实现对目标蛋白的靶向乙酰化修饰，且可以造成显著的生长表型差异。此外，全蛋白乙酰化水平分析表明，TPA系统并未造成全蛋白乙酰化水平的显著变化，特异性良好。

接着，又测试了TPA系统的通用性，通过模块化更换乙酰化效应元件，将乙酰化酶At2更换为可催化丙酰化修饰的YfiQ，在大肠杆菌中通过双质粒系统证实了靶向丙酰化修饰TPP的有效性。通过以上研究，我们证实了靶向乙酰化修饰系统TPA的有效性和通用性。

上述的CRISPR技术包括但不限于CRISPR-Cas12a原核免疫系统，还适用于其他CRISPR/Cas系统。

在本文中，为了描述简便，有时会将某种蛋白比如At2与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。本领域技术人员根据语境和上下文容易理解它们的含义。例如，对于At2，用于描述酰基转移酶功能或类别时，指的是蛋白质；在作为一种基因描述时，指的是编码该酰基转移酶At2的基因。

类似地，为了描述简便，有时会将RNA比如crRNA与其编码基因名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。本领域技术人员根据语境和上下文容易理解它们的含义。

可以理解，对于酰基转移酶-dCas12a融合蛋白比如dCas12a-L2-At2的编码基因，本领域技术人员可以根据待处理细菌的具体种类比如大肠杆菌进行密码子优化。密码子优化的目的在于，使得这些多肽能够在待处理细胞中实现最佳表达。密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以被用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明目的，而不是对本发明的限制。此外应理解，在阅读了本发明的构思之后，本领域技术人员对其作出的各种改变或调整，均应落入本发明的保护范围内，这些等价形式同样属于本文所附权利要求书限定的范围。

实施例

实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

实施例中，如果对于反应温度或操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(15-30℃)。

材料和方法

实施例中的引物合成、基因合成、核酸测序皆委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠，pH7.2，121℃高温高压灭菌20min。

实施例1：靶向乙酰化TPA系统设计及乙酰化效应元件筛选

1.1利用原核生物转录翻译耦联的特性对靶向乙酰化修饰工具进行了原理设计。该靶向乙酰化工具TPA系统工作原理是，将效应元件乙酰化酶与靶向元件dCas12a蛋白进行融合表达，在相应的crRNA的引导下，靶向于目标蛋白基因上，利用原核生物转录翻译耦联的特性，实现对目标蛋白的靶向乙酰化修饰。所述蛋白质乙酰化修饰由乙酰化酶催化反应。

1.2通过文献调研，选择了具有代表性的四种原核生物乙酰化酶，分别是肠道沙门菌S.enterica来源的Pat(97.7kDa，NCBI登录号WP_000082639.1)、大肠杆菌E.coli来源的YfiQ(97.7kDa，NCBI登录号WP_000083005.1)、枯草芽孢杆菌B.subtilis来源的AcuA(24.3kDa，NCBI登录号WP_003229296.1)和永达尔梭菌C.ljungdahlii来源的At2(17.6kDa，NCBI登录号ADK13966.1)。

1.3以四种菌的基因组DNA为模板，通过PCR扩增分别获得四种乙酰化酶Pat、YfiQ、AcuA和At2的编码基因，并且分别构建到pET-28a表达载体上，将构建的质粒导入BL21(DE3)大肠杆菌中进行异源表达，使用Ni-NAT对表达出的带有6×His标签的蛋白进行纯化，得到四种乙酰化酶Pat、YfiQ、AcuA和At2。

1.4乙酰化酶催化能力比较。选择已报道的可被乙酰化酶催化修饰的永达尔梭菌C.ljungdahlii来源的Pta(磷酸转乙酰化酶)作为目标蛋白，分别将纯化得到的等物质的四种乙酰化酶与之孵育，利用western blot分析Pta蛋白被乙酰化修饰的水平。具体操作方法为：将孵育体系一分为二，一部分经SDS-PAGE凝胶电泳后使用考马斯亮蓝染色进行蛋白定量分析，所使用的软件为ImageJ，具体数值作为Control；另一部分使用乙酰化抗体(PTMBIO，PTM-105RM)进行western blot分析，使用ImageJ软件对免疫印迹条带进行定量分析，具体数值作为Kac；通过Kac/Control的比值来衡量Pta蛋白被乙酰化修饰的程度，进而比较乙酰化酶的催化能力。

四种乙酰化酶的催化能力比较结果如图1所示。由图1可见，乙酰化酶Pat的Kac(使用乙酰化抗体对Pta进行乙酰化程度western blot分析)扫描浓度值(对条带使用ImageJ软件定量)是2.96，Kac/Control比值是2.58(Control为对考染条带的定量值，代表蛋白量)；乙酰化酶At2的Kac扫描浓度值是2.76，Kac/Control比值是2.55，皆稍低于Pat，但高于YfiQ和AcuA。

1.5综合考虑At2的催化能力和分子量偏小的优势，最终选择将其作为乙酰化修饰的效应元件。

靶向元件选择了土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)来源的CRISPR相关核酸酶dCas12a。

实施例2：TPA系统中蛋白融合方式优化

2.1经过研究分析，选定了四种蛋白接头(linker)，分别是短链的柔性linker L1(GGGS)、短链的刚性linker L2(GSGEAAAK)、中链的刚性linker L3(GSG(EAAAK)₂)以及长链的刚性linker L4(GSG(EAAAK)₃)，探究使用不同linker进行蛋白融合后对At2酶活的影响。

按照步骤1.3的方法制备获得At2-dCas12a融合蛋白。融合蛋白催化蛋白Pta乙酰化反应的酶活测定方法参见步骤1.4。

参见图2，左图为At2-dCas12a融合蛋白的结构示意图，At2在N端，dCas12a在C端，两者用linker相连接。右图为采用不同蛋白linker(L1、L2、L3、L4)的融合蛋白催化乙酰化反应的酶活性相对于At2的比较结果，显示了不同linker的适用性优劣。

由图2结果可见，相对于乙酰化酶At2(Kac扫描浓度值设定为1.00，Kac/Control比值设定为1.00)，采用L2连接的融合蛋白dCas12a-L2-At2的Kac扫描浓度值是2.02，Kac/Control比值是2.01，高于L1、L3和L4，结果表明linker L2最佳。

2.2在保持使用linker L2不变的条件下，探索了dCas12a和At2的相对位置对蛋白融合后At2的功能完整性影响。

按照步骤1.3的方法制备获得dCas12a-L2-At2和At2-L2-dCas12a两种融合蛋白。

按照步骤1.4的方法测定这两种融合蛋白催化蛋白Pta乙酰化反应的酶活。

参见图3，相对于乙酰化酶At2(Kac扫描浓度值设定为1.00，Kac/Control比值设定为1.00)，融合蛋白dCas12a-L2-At2的Kac扫描浓度值是4.09，Kac/Control比值是4.11；融合蛋白At2-L2-dCas12a的Kac扫描浓度值是3.18，Kac/Control比值是3.57。

该结果表明，dCas12a和At2蛋白融合的相对位置对At2的催化能力没有显著的影响，但dCas12a-L2-At2的融合蛋白结构相对要好于At2-L2-dCas12a结构。而且，这两种融合蛋白的Kac扫描浓度值和Kac/Control比值都高于孤立的乙酰化酶At2，表明At2与dCas12a的融合提高了At2的乙酰化修饰酶活力。

2.3融合蛋白中dCas12a的功能完整性测试。分别针对大肠杆菌乙酰辅酶A合酶基因acs和RNaseII基因rnb的启动子区设计crRNA，测试融合蛋白对acs和rnb的转录抑制效果。crRNA分别靶向目标蛋白Acs(乙酰辅酶A合酶)的模板链(TS，template strand)。具体操作方法为：

(1)以pACYC-Duet1质粒为出发质粒，用NdeI/XhoI进行双酶切，获得线性化的质粒。

(2)以永达尔梭菌基因组为模板，进行PCR扩增得到at2片段，引物序列为：

正向引物：agtataagaaggagatatacatatgatgataagaagaggaaatataaaagatc，

反向引物：gctcattttggcagcggcttcaccggagccttttttaatttcatacattagataatgcg。

以pUC57-dCas12a质粒(委托金思瑞公司合成)为模板，进行PCR扩增得到dCas12a片段，所用的引物序列为：

正向引物：aattaaaaaaggctccggtgaagccgctgccaaaatgagcatctatcaggagttcg，

反向引物：cagcggtttctttaccagactcgagttagttgttacggttttgaacgaattc。

通过overlaping PCR获得At2-L2-dCas12片段，所用的引物序列为：

正向引物：agtataagaaggagatatacatatgatgataagaagaggaaatataaaagatc，

反向引物：cagcggtttctttaccagactcgagttagttgttacggttttgaacgaattc。

(3)使用试剂盒ClonExpress II one-step cloning kit(Vazyme Biotech Co.,Ltd.,Nanjing,China)，采用大片段组装的方法将上述PCR获得的At2-L2-dCas12a片段与上述线性化的质粒进行连接，再采用42℃热激90s的方式将质粒导入大肠杆菌DH5α的感受态中，然后在含氯霉素(浓度12.5μg/ml)的LB琼脂平板上进行37℃培养，待长出转化子后进行菌落PCR，挑取阳性克隆进行质粒测序，测序正确的质粒即为不带crRNA的对照质粒，最后同样采用热激的方式将对照质粒转入大肠杆菌BW25113感受态中，获得对照菌株At2-dCas12a(无crRNA)。

其他质粒的构建方法与上述类似，只需换用对应的引物即可，此外，在构建不同的crRNA时所采用的酶切位点为NcoI/BamHI。

融合蛋白中dCas12a功能完整性测试的实验结果参见图4，左图显示了At2-dCas12a(无crRNA)质粒、At2-dCas12a-crRNA质粒、dCas12a-crRNA质粒分别对乙酰辅酶A合酶基因acs的转录抑制情况，与阴性对照At2-dCas12a(无crRNA)相比较，At2-dCas12a-crRNA和dCas12a-crRNA都能够显著抑制acs的转录，且At2-dCas12a-crRNA和dCas12a-crRNA对于基因acs的转录抑制效率接近。

右图显示了At2-dCas12a(无crRNA)质粒、At2-dCas12a-crRNA质粒、dCas12a-crRNA质粒分别对RNaseII基因rnb的转录抑制情况，与阴性对照At2-dCas12a(无crRNA)相比较，At2-dCas12a-crRNA和dCas12a-crRNA都能够抑制acs的转录，且At2-dCas12a-crRNA对于基因acs的转录抑制效率高于dCas12a-crRNA，似乎提示融合蛋白dCas12a-L2-At2对于基因rnb的抑制效果要高于单独的dCas12a。

该结果表明，在使用Linker L2作为蛋白linker，At2在融合蛋白N端，dCas12a在C端的融合方式下，dCas12a仍然具有完整的结合靶基因的能力。

实施例3：TPA系统在革兰氏阴性菌中的功能验证及特异性

3.1使用双质粒系统验证TPA系统在大肠杆菌中靶向乙酰化修饰能力。双质粒各自功能如下：一个质粒包含At2-dCas12a融合蛋白以及对应的crRNA两种元件；另一个质粒负责表达被靶向修饰的蛋白，为了方便检测，在其N端添加了6×His标签。靶蛋白选择E.coli自身的Acs(乙酰辅酶A合酶)。同时为了测试靶向模板链(TS)或非模板链(NTS)对靶向乙酰化修饰效果的影响，我们在Acs蛋白基因尾部的TS链和NTS链分别设计了一条crRNA。

双质粒CRISPR系统的构建方法参见步骤2.3。

分别将带有靶向修饰系统的质粒At2-dCas12a(无crRNA)或At2-dCas12a-crRNA和表达目标蛋白基因acs的质粒导入大肠杆菌中，将目标蛋白Acs进行纯化后western blot检测其乙酰化修饰水平。

实验结果参见图5，相对于At2-dCas12a(无crRNA)(Acs-Kac扫描浓度值设定为1.00，Kac/Control比值设定为1.00)，At2-dCas12a-crRNA用于被靶向修饰蛋白表达质粒的非模板链(NTS)的Kac扫描浓度值是2.51，Kac/Control比值是2.54；

At2-dCas12a-crRNA用于模板链(TS)的Kac扫描浓度值是2.72，Kac/Control比值是3.04。

结果表明，TPA系统实现了对Acs蛋白的靶向乙酰化修饰，此外，crRNA靶向于TS链或NTS链对TPA系统的靶向乙酰化修饰能力并无显著的影响。

3.2直接靶向大肠杆菌基因组实现蛋白定向乙酰化修饰。我们选取之前已经报道过的受乙酰化修饰调控的大肠杆菌乙酰辅酶A(Acs)和RNase II作为测试靶点(You D,etal.2014.J Bacteriol.196:3169-78.Song L,et al.2016.Nucleic Acids Research.44:1979-1988.)，通过直接靶向大肠杆菌基因组对该系统进行了测试。

实验方法参见步骤3.1。

在此之前，利用CRISPR/Cas9技术分别在acs和rnb基因的尾部敲入了6×His标签；随后，通过质粒导入靶向乙酰化修饰元件，考量了目标蛋白乙酰化修饰水平变化。

实验结果参见图6至图8，图6中左图显示了TPA系统直接作用于基因组上的acs基因，实现对Acs蛋白的靶向乙酰化修饰。相对于At2-dCas12a(无crRNA)(Acs-His扫描浓度值设定为1.00，Acs-Kac扫描浓度值设定为1.00，Kac/His比值设定为1.00)，At2-dCas12a-crRNA用于大肠杆菌基因组的非模板链(NTS)的Acs-Kac扫描浓度值是1.95，Kac/His比值是2.87；dCas12a-crRNA用于大肠杆菌基因组的非模板链(NTS)的Acs-Kac扫描浓度值是0.56，Kac/His比值是1.02，即靶向元件dCas12a的结果与At2-dCas12a(无crRNA)的结果相当，而融合蛋白+靶向元件crRNA的At2-dCas12a-crRNA对于乙酰辅酶A(Acs)的乙酰化修饰水平显著提升。

图6中右图显示了TPA系统直接作用于基因组上的rnb基因，实现对RNase II蛋白的靶向乙酰化修饰。相对于At2-dCas12a(无crRNA)(RNase II-His扫描浓度值设定为1.00，RNase II-Kac扫描浓度值设定为1.00，Kac/His比值设定为1.00)，At2-dCas12a-crRNA用于大肠杆菌基因组的非模板链(NTS)的RNase II-Kac扫描浓度值是2.09，Kac/His比值是1.74；dCas12a-crRNA用于大肠杆菌基因组的非模板链(NTS)的RNase II-Kac扫描浓度值是1.12，Kac/His比值是0.93，即靶向元件dCas12a的结果与At2-dCas12a(无crRNA)的结果相当，而融合蛋白+靶向元件crRNA的At2-dCas12a-crRNA对于RNase II的乙酰化修饰水平显著提升。

该结果表明，相比于对照菌株，靶向TPA系统实验组的Acs和RNase II的乙酰化修饰水平显著提升。

随后我们又对相应的菌株进行了表型测试，对于Acs，测试培养基为M9培养基，碳源为10mM乙酸钠；对于RNase II，测试培养基为LB培养基。

菌株生长表型测试如图7-8所示，图7中左图显示，用靶向Acs的dCas12a-crRNA质粒处理后的大肠杆菌的生长曲线与At2-dCas12a(无crRNA)相近，而用靶向Acs的At2-dCas12a-crRNA质粒处理后的大肠杆菌的生长明显受到抑制。图7中右图显示，用靶向Acs的At2-dCas12a-crRNA质粒处理后的大肠杆菌中的Acs表达水平与用At2-dCas12a(无crRNA)质粒处理后的大肠杆菌无显著差异。可见，对Acs蛋白靶向乙酰化修饰使得生长显著变差，对应的基因转录水平未见明显改变。

图8中左图显示，用靶向rnb的dCas12a-crRNA质粒处理后的大肠杆菌的生长曲线与At2-dCas12a(无crRNA)相近，而用靶向RNase II的At2-dCas12a-crRNA质粒处理后的大肠杆菌的生长明显受到抑制。图7中右图显示，用靶向RNase II的At2-dCas12a-crRNA质粒处理后的大肠杆菌中的RNase II表达水平与用At2-dCas12a(无crRNA)质粒处理后的大肠杆菌无显著差异。可见，对RNase II蛋白靶向乙酰化修饰使得生长显著变差，对应的基因转录水平未见明显改变。

上述结果表明，当对Acs和RNase II进行靶向乙酰化修饰后，菌株的生长受到了显著的影响；进一步的qPCR结果证实了该生长差异并非来自于转录变化。

3.3TPA靶向乙酰化修饰工具特异性验证。对于步骤3.2中靶向Acs的TPA系统实验组的菌株，测试菌株的全蛋白乙酰化修饰水平。

实验结果参见图9，结果表明，带有靶向乙酰化修饰元件的菌株对应的全蛋白乙酰化修饰水平与仅表达dCas12a的对照菌株相比没有显著的差异；然而，仅表达At2-dCas12a融合蛋白(无crRNA)的菌株的全蛋白乙酰化水平却发生了显著的提升，证明TPA系统未造成全蛋白水平上的乙酰化修饰程度显著变化，具有良好的特异性。

实施例4：通过更换效应元件实现蛋白靶向丙酰化修饰

4.1模块化是合成生物学的重要理念，为了进一步验证靶向乙酰化修饰系统TPA的通用性，我们试想可否将其中的乙酰化修饰效应模块更换为其他的酰基转移酶，从而实现更广泛类型的靶向修饰。经过文献调研，最终我们选择了丙酰化修饰作为探索方向。目前人们已经在大肠杆菌中进行了丙酰化修饰的系统研究，该种修饰主要由YfiQ催化，以丙酰辅酶A作为丙酰基供体(Sun M,et al.2016.J Proteome Res.15:4696-4708.)。

4.2我们将实施例1-3中靶向乙酰化系统的乙酰化效应元件At2更换为丙酰化效应元件YfiQ，并选择了已报道的可以被丙酰化修饰的Acs(乙酰辅酶A)蛋白作为测试对象，在大肠杆菌中使用双质粒系统进行了靶向丙酰化测试。

实验方法参照实施例3.1。所不同的是，用YfiQ蛋白/基因代替At2蛋白/基因。Kpr表示蛋白的丙酰化修饰程度(使用丙酰化抗体(PTM BIO,PTM-203)对目标蛋白进行westernblot分析后，再使用ImageJ软件对目标条带灰度值进行定量。)。

结果如图10所示，相对于阴性对照质粒YfiQ-dCas12a(无crRNA)处理(KPr扫描浓度值设定为1.00，Control扫描浓度值设定为1.00，KPr/Control比值设定为1.00)，融合蛋白质粒YfiQ-dCas12a-crRNA处理后的KPr扫描浓度值是2.61，KPr/Control比值是2.60，对于Acs的丙酰化修饰水平显著提升，实现了对目标蛋白Acs的靶向丙酰化修饰。

综上所述，酰基化修饰效应元件能够与CRISPR靶向元件dCas12a合二为一形成融合蛋白，实现高效率的靶向蛋白的酰基化修饰，该靶向酰基化修饰系统TPA具有高效性和通用性，拓宽了CRISPR技术的应用范围。

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> 一种细菌体内靶向蛋白酰基化修饰方法

<130> SHPI2110487

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Gly Ser Gly Glu Ala Ala Ala Lys

1 5

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Gly Ser Gly Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 4

Gly Ser Gly Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala

1 5 10 15

Ala Lys

<210> 5

<211> 1300

<212> PRT

<213> Francisella tularensis

<400> 5

Met Ser Ile Tyr Gln Glu Phe Val Asn Lys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr

1 5 10 15

Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Glu Asn Ile Lys

20 25 30

Ala Arg Gly Leu Ile Leu Asp Asp Glu Lys Arg Ala Lys Asp Tyr Lys

35 40 45

Lys Ala Lys Gln Ile Ile Asp Lys Tyr His Gln Phe Phe Ile Glu Glu

50 55 60

Ile Leu Ser Ser Val Cys Ile Ser Glu Asp Leu Leu Gln Asn Tyr Ser

65 70 75 80

Asp Val Tyr Phe Lys Leu Lys Lys Ser Asp Asp Asp Asn Leu Gln Lys

85 90 95

Asp Phe Lys Ser Ala Lys Asp Thr Ile Lys Lys Gln Ile Ser Glu Tyr

100 105 110

Ile Lys Asp Ser Glu Lys Phe Lys Asn Leu Phe Asn Gln Asn Leu Ile

115 120 125

Asp Ala Lys Lys Gly Gln Glu Ser Asp Leu Ile Leu Trp Leu Lys Gln

130 135 140

Ser Lys Asp Asn Gly Ile Glu Leu Phe Lys Ala Asn Ser Asp Ile Thr

145 150 155 160

Asp Ile Asp Glu Ala Leu Glu Ile Ile Lys Ser Phe Lys Gly Trp Thr

165 170 175

Thr Tyr Phe Lys Gly Phe His Glu Asn Arg Lys Asn Val Tyr Ser Ser

180 185 190

Asn Asp Ile Pro Thr Ser Ile Ile Tyr Arg Ile Val Asp Asp Asn Leu

195 200 205

Pro Lys Phe Leu Glu Asn Lys Ala Lys Tyr Glu Ser Leu Lys Asp Lys

210 215 220

Ala Pro Glu Ala Ile Asn Tyr Glu Gln Ile Lys Lys Asp Leu Ala Glu

225 230 235 240

Glu Leu Thr Phe Asp Ile Asp Tyr Lys Thr Ser Glu Val Asn Gln Arg

245 250 255

Val Phe Ser Leu Asp Glu Val Phe Glu Ile Ala Asn Phe Asn Asn Tyr

260 265 270

Leu Asn Gln Ser Gly Ile Thr Lys Phe Asn Thr Ile Ile Gly Gly Lys

275 280 285

Phe Val Asn Gly Glu Asn Thr Lys Arg Lys Gly Ile Asn Glu Tyr Ile

290 295 300

Asn Leu Tyr Ser Gln Gln Ile Asn Asp Lys Thr Leu Lys Lys Tyr Lys

305 310 315 320

Met Ser Val Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Thr Glu Ser Lys Ser

325 330 335

Phe Val Ile Asp Lys Leu Glu Asp Asp Ser Asp Val Val Thr Thr Met

340 345 350

Gln Ser Phe Tyr Glu Gln Ile Ala Ala Phe Lys Thr Val Glu Glu Lys

355 360 365

Ser Ile Lys Glu Thr Leu Ser Leu Leu Phe Asp Asp Leu Lys Ala Gln

370 375 380

Lys Leu Asp Leu Ser Lys Ile Tyr Phe Lys Asn Asp Lys Ser Leu Thr

385 390 395 400

Asp Leu Ser Gln Gln Val Phe Asp Asp Tyr Ser Val Ile Gly Thr Ala

405 410 415

Val Leu Glu Tyr Ile Thr Gln Gln Ile Ala Pro Lys Asn Leu Asp Asn

420 425 430

Pro Ser Lys Lys Glu Gln Glu Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Lys Ala

435 440 445

Lys Tyr Leu Ser Leu Glu Thr Ile Lys Leu Ala Leu Glu Glu Phe Asn

450 455 460

Lys His Arg Asp Ile Asp Lys Gln Cys Arg Phe Glu Glu Ile Leu Ala

465 470 475 480

Asn Phe Ala Ala Ile Pro Met Ile Phe Asp Glu Ile Ala Gln Asn Lys

485 490 495

Asp Asn Leu Ala Gln Ile Ser Ile Lys Tyr Gln Asn Gln Gly Lys Lys

500 505 510

Asp Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Asp Asp Val Lys Ala Ile Lys Asp

515 520 525

Leu Leu Asp Gln Thr Asn Asn Leu Leu His Lys Leu Lys Ile Phe His

530 535 540

Ile Ser Gln Ser Glu Asp Lys Ala Asn Ile Leu Asp Lys Asp Glu His

545 550 555 560

Phe Tyr Leu Val Phe Glu Glu Cys Tyr Phe Glu Leu Ala Asn Ile Val

565 570 575

Pro Leu Tyr Asn Lys Ile Arg Asn Tyr Ile Thr Gln Lys Pro Tyr Ser

580 585 590

Asp Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Glu Asn Ser Thr Leu Ala Asn Gly

595 600 605

Trp Asp Lys Asn Lys Glu Pro Asp Asn Thr Ala Ile Leu Phe Ile Lys

610 615 620

Asp Asp Lys Tyr Tyr Leu Gly Val Met Asn Lys Lys Asn Asn Lys Ile

625 630 635 640

Phe Asp Asp Lys Ala Ile Lys Glu Asn Lys Gly Glu Gly Tyr Lys Lys

645 650 655

Ile Val Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro Lys Val

660 665 670

Phe Phe Ser Ala Lys Ser Ile Lys Phe Tyr Asn Pro Ser Glu Asp Ile

675 680 685

Leu Arg Ile Arg Asn His Ser Thr His Thr Lys Asn Gly Ser Pro Gln

690 695 700

Lys Gly Tyr Glu Lys Phe Glu Phe Asn Ile Glu Asp Cys Arg Lys Phe

705 710 715 720

Ile Asp Phe Tyr Lys Gln Ser Ile Ser Lys His Pro Glu Trp Lys Asp

725 730 735

Phe Gly Phe Arg Phe Ser Asp Thr Gln Arg Tyr Asn Ser Ile Asp Glu

740 745 750

Phe Tyr Arg Glu Val Glu Asn Gln Gly Tyr Lys Leu Thr Phe Glu Asn

755 760 765

Ile Ser Glu Ser Tyr Ile Asp Ser Val Val Asn Gln Gly Lys Leu Tyr

770 775 780

Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Ala Tyr Ser Lys Gly Arg

785 790 795 800

Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Lys Ala Leu Phe Asp Glu Arg Asn

805 810 815

Leu Gln Asp Val Val Tyr Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Leu Phe Tyr

820 825 830

Arg Lys Gln Ser Ile Pro Lys Lys Ile Thr His Pro Ala Lys Glu Ala

835 840 845

Ile Ala Asn Lys Asn Lys Asp Asn Pro Lys Lys Glu Ser Val Phe Glu

850 855 860

Tyr Asp Leu Ile Lys Asp Lys Arg Phe Thr Glu Asp Lys Phe Phe Phe

865 870 875 880

His Cys Pro Ile Thr Ile Asn Phe Lys Ser Ser Gly Ala Asn Lys Phe

885 890 895

Asn Asp Glu Ile Asn Leu Leu Leu Lys Glu Lys Ala Asn Asp Val His

900 905 910

Ile Leu Ser Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu Ala Tyr Tyr Thr Leu

915 920 925

Val Asp Gly Lys Gly Asn Ile Ile Lys Gln Asp Thr Phe Asn Ile Ile

930 935 940

Gly Asn Asp Arg Met Lys Thr Asn Tyr His Asp Lys Leu Ala Ala Ile

945 950 955 960

Glu Lys Asp Arg Asp Ser Ala Arg Lys Asp Trp Lys Lys Ile Asn Asn

965 970 975

Ile Lys Glu Met Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Gln Val Val His Glu Ile

980 985 990

Ala Lys Leu Val Ile Glu Tyr Asn Ala Ile Val Val Phe Ala Asp Leu

995 1000 1005

Asn Phe Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr

1010 1015 1020

Gln Lys Leu Glu Lys Met Leu Ile Glu Lys Leu Asn Tyr Leu Val Phe

1025 1030 1035 1040

Lys Asp Asn Glu Phe Asp Lys Thr Gly Gly Val Leu Arg Ala Tyr Gln

1045 1050 1055

Leu Thr Ala Pro Phe Glu Thr Phe Lys Lys Met Gly Lys Gln Thr Gly

1060 1065 1070

Ile Ile Tyr Tyr Val Pro Ala Gly Phe Thr Ser Lys Ile Cys Pro Val

1075 1080 1085

Thr Gly Phe Val Asn Gln Leu Tyr Pro Lys Tyr Glu Ser Val Ser Lys

1090 1095 1100

Ser Gln Glu Phe Phe Ser Lys Phe Asp Lys Ile Cys Tyr Asn Leu Asp

1105 1110 1115 1120

Lys Gly Tyr Phe Glu Phe Ser Phe Asp Tyr Lys Asn Phe Gly Asp Lys

1125 1130 1135

Ala Ala Lys Gly Lys Trp Thr Ile Ala Ser Phe Gly Ser Arg Leu Ile

1140 1145 1150

Asn Phe Arg Asn Ser Asp Lys Asn His Asn Trp Asp Thr Arg Glu Val

1155 1160 1165

Tyr Pro Thr Lys Glu Leu Glu Lys Leu Leu Lys Asp Tyr Ser Ile Glu

1170 1175 1180

Tyr Gly His Gly Glu Cys Ile Lys Ala Ala Ile Cys Gly Glu Ser Asp

1185 1190 1195 1200

Lys Lys Phe Phe Ala Lys Leu Thr Ser Val Leu Asn Thr Ile Leu Gln

1205 1210 1215

Met Arg Asn Ser Lys Thr Gly Thr Glu Leu Asp Tyr Leu Ile Ser Pro

1220 1225 1230

Val Ala Asp Val Asn Gly Asn Phe Phe Asp Ser Arg Gln Ala Pro Lys

1235 1240 1245

Asn Met Pro Gln Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Gly Leu

1250 1255 1260

Lys Gly Leu Met Leu Leu Gly Arg Ile Lys Asn Asn Gln Glu Gly Lys

1265 1270 1275 1280

Lys Leu Asn Leu Val Ile Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Glu Phe Val Gln

1285 1290 1295

Asn Arg Asn Asn

1300

Claims

1.一种细菌体内靶向蛋白酰基化修饰方法，其包括下述步骤：在CRISPR系统中，将酰基转移酶-dCas12a融合蛋白基因和crRNA基因构建在质粒上，并转入细菌内，通过细菌增殖，完成对靶向蛋白的酰基化修饰。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酰化酶-dCas12a融合蛋白基因和所述crRNA基因被构建在同一个质粒上。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酰基转移酶是乙酰基转移酶或者丙酰基转移酶。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酰基转移酶(或称酰化酶)选自下组：肠道沙门菌S.enterica来源的Pat(NCBI登录号WP_000082639.1)、大肠杆菌E.coli来源的YfiQ(NCBI登录号WP_000083005.1)、枯草芽孢杆菌B.subtilis来源的AcuA(NCBI登录号WP_003229296.1)、永达尔梭菌C.ljungdahlii来源的At2(NCBI登录号ADK13966.1)。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酰基转移酶-dCas12a融合蛋白包括：酰基转移酶、dCas12a、连接这两者的接头，所述接头选自下组：氨基酸序列为GGGS(SEQ IDNO:1)的linkerL1，氨基酸序列为GSGEAAAK(SEQ ID NO:2)的linkerL2，氨基酸序列为GSGEAAAKEAAAK(SEQ ID NO:3)的linkerL3，氨基酸序列为GSGEAAAKEAAAKEAAAK(SEQ IDNO:4)的linkerL4，优选氨基酸序列为GSGEAAAK(SEQ ID NO:2)的linkerL2。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述dCas12a是土拉弗朗西斯菌来源的CRISPR相关核酸酶dCas12a，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酰基化是乙酰化，由At2催化，以乙酰辅酶A作为乙酰基供体。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酰基化是丙酰化，由YfiQ催化，以丙酰辅酶A作为丙酰基供体。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细菌是革兰氏阴性菌。

10.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-9中任一项所述方法中使用的质粒。