KR101743210B1 - 지방산 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 지방산의 제조방법 - Google Patents

지방산 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 지방산의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 지방산 생성능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 지방산의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 지방산 생합성 과정에 관여하는 아세틸-CoA-카르복실라아제를 코딩하는 유전자, 말릭 효소를 코딩하는 유전자 및 티오에스터라아제를 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물 및 이를 배양하여 지방산을 합성시키는 지방산의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른, 지방산 생산능이 향상된 재조합 미생물은 기존의 지방산 유래의 연료 또는 화합물을 생산하기 위한 기술들과 연계되어 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

지방산 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 지방산의 제조방법 { Recombinant Yeast Having Improved Fatty Acid Producing Ability and Method for Producing Fatty Acid }
본 발명은 지방산 생성능을 향상시키기 위해 형질전환된 재조합 미생물 및 이를 이용한 지방산의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 지방산 생합성 과정에 관여하는 아세틸-CoA-카르복실라아제를 코딩하는 유전자, 말릭 효소를 코딩하는 유전자 및 티오에스터라아제를 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물 및 이를 배양하여 지방산을 합성시키는 지방산의 제조방법에 관한 것이다.
바이오매스 유래의 당을 활용할 수 있는 미생물을 이용한 지방산 생산 및 생산량 증대는 지방산 유래의 화학물질을 생산하기 위한 플랫폼 형성을 위해 연구되어 왔다. 지방산(fatty acid)은 1개의 카르복실기(-COOH)를 가지는 탄화수소 사슬의 카르복실산으로 사슬 모양의 1가의 카르복실산을 말한다. 지방을 가수분해하면 생기기 때문에 이러한 이름이 명명되었다. 지방산 분자는 탄화수소 사슬로 이루어져 있는데, 탄화수소는 탄소의 기본 골격에 곁가지로 수소가 연결되어 있고 한쪽 끝에 카르복실기가 결합 되어 있다. 생체 내에서 지방산은 지방산 대사경로에 의해서 분해되거나 합성된다. 지방산 대사경로는 탄소 2개씩의 단위로 지방산을 합성하거나 분해하므로, 자연계에 존재하는 지방산은 거의 대부분이 짝수인 탄소로 되어 있다.
미생물 생체 내에서 글루코즈로부터의 지방산 합성은 아세틸-CoA (acetyl-CoA)에서 시작하여, 그 뒤 탄소 원자가 한 번에 두 개씩 탄화수소사슬에 붙어 사슬이 길어지게 된다. 세포질에서 아세틸-CoA는 ATP 분해를 수반하며 CO2와 결합하여 카르복실화 되어서, 지방산 생합성에 있어 중요한 중간체가 되는 말로닐-CoA(malonyl-CoA)를 생산한다. 이 반응은 아세틸-CoA-카르복실라아제 복합체에 의해 촉매되는데, 이 복합체는 세 개의 효소로 구성되어 있고, 효소 활성을 위해 ATP 뿐만 아니라 Mn2 + 및 바이오틴을 요구한다.
말로닐-CoA의 말로닐 그룹에 있는 세 개의 탄소 원자 중 두 개가 생합성 반응의 각 단계 마다 지방산 사슬에 더해진다. 이 반응은 말로닐-CoA 형성과 마찬가지로 세포질에 있고 막과 결합 되어 있지 않은 다효소 복합체가 필요하다. 개별적인 효소들로 구성되어 있는 이 복합체는 지방산 합성효소를 말한다. 이러한 지방산 합성 효소 복합체의 일부인 아실 운반 단백질(acyl carrier protein; ACP)은 지방산의 탄소 수를 증가시키기 위한 결합에 관여한다.
말로닐-CoA는 아세틸-CoA와 같이 지방산 합성효소에 의해 한 번에 C16의 팔미트산 또는 C18의 스테아르산까지 합성되지만, 이 과정은 아실 운반 단백질(ACP)이 관여한 탈카르복실기, C2단위의 축합, NADPH에 의한 환원이 반복해서 일어나는 복잡한 과정이다.
기존 연구는 지방산 생합성에 관여하는 각각의 효소들을 각자 발현하여 지방산 생산 대사경로의 flux를 증대하는 연구 방향으로 진행되거나, 지방산의 분해 대사경로를 억제하려고 한다.
최근에는 효모의 지방산 생합성 대사경로를 조절하여 지방산 생산량을 향상시키려는 연구가 많이 진행되고 있으며, 대부분 대사경로 상 지방산의 생합성 과정에 직접적으로 관여하는 효소를 과발현하는 정도로 일부 박테리아(특히 E. coli) 및 효모 등에서 주로 연구가 진행되고 있으나, co-factor인 NADPH의 불균형으로 인하여 생산량 증대에 한계가 있다.
이에, 본 발명자들은 지방산 생합성 생산량을 증가시키기 위한 재조합 미생물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 지방산 생합성 과정에서 co-factor의 불균형을 해소하는 경우 지방산 생합성 생산량이 증대한다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 지방산 생산능이 향상된 재조합 미생물을 제공하는데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 아세틸-CoA-카르복실라아제를 코딩하는 유전자, 말릭 효소를 코딩하는 유전자 및 티오에스터라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 제공하는데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 배양하여 지방산을 합성하는 지방산의 제조방법을 제공하는데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아세틸-CoA-카르복실라아제를 코딩하는 유전자, 말릭 효소를 코딩하는 유전자 및 티오에스터라아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 지방산 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 아세틸-CoA-카르복실라아제를 코딩하는 유전자, 말릭 효소를 코딩하는 유전자 및 티오에스터라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 지방산을 합성하는 지방산의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른, 지방산 생산능이 향상된 재조합 미생물은 기존의 지방산 유래의 연료 또는 화합물을 생산하기 위한 기술들과 연계되어 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 사카로마이시스 세레비지에의 지방산 생합성 대사경로를 조절하기 위하여 각 효소를 과발현함으로써 NADPH CYCLE이 원활하게 순환되는 것을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에서 제시된 재조합 벡터 pESC-Trp, pAccI, pMaeI, pCgl1664, pCgl2451, pCgl0091, pAccIMaeI, pAccICgl1664 및 pAccIMaeICgl1664를 재조합한 개열지도를 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명에서 제시된 각 재조합 효모의 지방산 생산량의 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 2에서 제시된 두 개 이상의 효소를 발현하는 재조합 효모로부터 분석한 C16 (팔미트산) 및 C18 (스테아르산)의 조성 분석 결과를 나타낸 것이다.
본 발명에서는 지방산 합성 과정의 co-factor인 NADPH를 재생하는 효소와 지방산 생합성 대사경로 상 효소의 과발현이 서로 미치는 영향을 분석하여 co-factor의 불균형이 해소되었을 때 지방산 생산량이 증가한다는 것을 확인하였다.
본 발명은 일 관점에서, 아세틸-CoA-카르복실라아제를 코딩하는 유전자, 말릭 효소를 코딩하는 유전자 및 티오에스터라아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 지방산 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 사카로마이시스 세레비지에, 대장균, 유산균, 바실러스 세레우스, 코리네박테리움 글루타미쿰으로 이루어진 군에서 선택된 하나인 것을 특징으로 할 수 있으나, TCA cycle, NADPH cycle 및 Fatty Acid elongation 과정으로 이루어진 지방산 생합성 경로를 가지는 미생물이라면 제한 없이 본 발명을 적용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 아세틸-CoA-카르복실라아제는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 말릭 효소는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 티오에스터라아제는 서열번호 4 내지 6 중에서 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 아세틸-CoA-카르복실라아제를 코딩하는 유전자, 말릭 효소를 코딩하는 유전자 및 티오에스터라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서는, 도 2에 기재된 개열지도를 가지는 재조합 벡터를 사용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능 할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.
"발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합 될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나, 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어(recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포 내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 곰팡이 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다.
예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성 있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩 시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위 내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 NSP 단백질의 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 미생물을 배양하여 지방산을 합성하는 지방산의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 지방산은 C16(팔미트산) 및 C18(스테아르산)인 것을 특징으로 할 수 있다.
아울러, 본 발명에서는 재조합 효모의 지방산 생산량을 각각 분석하여 아세틸-CoA-카르복실라아제를 코딩하는 유전자, 말릭 효소를 코딩하는 유전자 및 티오에스터라아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물의 지방산 생산량이 가장 높은 것을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
지방산 생합성 대사경로에 관여하는 효소와 NADPH 를 재생하는 효소를 코딩하는 유전자의 확보 및 벡터에의 도입
지방산의 생합성 대사경로 상 탄소 흐름의 증대를 위하여 아세틸-CoA-카르복실라아제(AccI)를 클로닝하기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 지노믹디엔에이로부터 accI 유전자의 염기서열을 참고로 하여 AccI의 subunit 중 AccBC와 AccD1을 증폭하기 위해 프라이머 accBC-f, accBC-r, accD1-f, accD1-r로 PCR을 수행하였다. 이를 효모의 발현벡터인 pESC-Trp로 각각 도입하여 발현벡터 pAccI를 제작하였다(도 2).
프라이머(accBC-f) 서열번호 7: GGATCCGATGTCAGTCGAGACTAGGAA
프라이머(accBC-r) 서열번호 8: GTCGACTTACTTGATCTCGAGGAGAA
프라이머(accD1-f) 서열번호 9: GCGGCCGCAATGACCATTTCCTCACCTTT
프라이머(accD1-r) 서열번호 10: ACTAGTGCTTACAGTGGCATGTTGCCGT
지방산의 생합성 대사경로 상 지방산의 elongation 과정으로부터 지방산의 생산량을 증대하기 위하여 putative한 티오에스터라아제의 유전자 총 3종을 후보로 선정하였으며 각각 cgl1664, cgl2451, cgl0091을 확보하였다. 이를 증폭하기 위해 프라이머 pCgl1664-f, pCgl1664-r, pCgl2451-f, pCgl2451-r, pCgl0091-f, pCgl0091-r로 PCR을 수행하였다. 이를 효모의 발현벡터인 pESC-Trp로 각각 도입하여 발현벡터를 제작하여, pCgl1664, pCgl2451, pCgl0091 발현 벡터를 제작하였다(도 2).
프라이머(pCgl1664-f) 서열번호 11: GGATCCGATGAAAACTATTGAAGATATTTTGAC
프라이머(pCgl1664-r) 서열번호 12: GTCGACTTAGTCTTTGCGCATCGG
프라이머(pCgl2451-f) 서열번호 13: GGACTTGATGGCAGCCAACAATGT
프라이머(pCgl2451-r) 서열번호 14: GTCGACCTACTTTTCTAGAGCTTCCT
프라이머(pCgl0091-f) 서열번호 15: GGATCCGATGTTTCTCACACTCTCAG
프라이머(pCgl0091-r) 서열번호 16: GTCGACCTAGACGGCGTCGAGA
지방산의 생합성 대사경로 상 불균형을 이루고 있는 NADPH를 재생하기 위한 효소인 말릭 효소를 클로닝하기 위하여 사카로마이시스 세레비지에로부터 효소의 유전자를 확보하였으며, 사카로마이시스 세레비지에 cDNA를 프라이머 pMaeI-f, pMaeI-r로 PCR을 수행하여 말릭 효소 유전자를 증폭하고, 이를 효모의 발현벡터인 pESC-Trp로 각각 도입하여 발현벡터를 제작하였다(도 2).
프라이머(pMaeI-f) 서열번호 17: GGATCCGATGCTTAGAACCAGACTAT
프라이머(pMaeI-r) 서열번호 18: GTCGACCTACAATTGGTTGGTGTGC
하나의 발현벡터로부터 두 가지 이상의 타겟 유전자를 발현하기 위한 발현 벡터 제작
실시예 1에서 확보한 pMaeI으로부터 말릭 효소를 코딩하는 유전자인 maeI을 포함하도록 하여 promoter부터 terminator까지 포함하는 cassette를 프라이머 MaeI cassette-f, MaeI cassette-r를 사용하여 PCR을 통해 증폭하였다. 이를 실시예 1에서 확보한 pAccI에 도입하여 pAccIMaeI의 발현 벡터를 제작하였다.
프라이머(MaeI cassette-f) 서열번호 19: GGTACCGCAGATCCGCTCTAACC
프라이머(MaeI cassette-r) 서열번호 20: GCTAGCCCTACAATTGGTTGGTGTG
실시예 1에서 확보한 pCgl1664로부터 putative 티오에스터라아제를 코딩하는 유전자인 cgl1664를 포함하도록 하여 promoter부터 terminator까지 포함하는 cassette를 프라이머 Cgl1664 cassette-f, Cgl1664 cassette-f를 사용하여 PCR을 통해 증폭하였다. 이를 실시예 1에서 확보한 pAccI에 도입하여 pAccICgl1664의 발현 벡터를 제작하였다.
프라이머(Cgl1664 cassette-f) 서열번호 21: ACTAGTACAATTCTTCGCCAGAGGTTT
프라이머(Cgl1664 cassette-r) 서열번호 22: GTCGACTTAGTCTTTGCGCATCGGAATT
상기 실시예 1에서 확보한 발현 벡터를 효모로 도입하여 확보한 재조합 효모의 지방산 생산량을 각각 분석
실시예 1에서 확보한 발현 벡터는 효모로 Yeastmaker kit을 이용하여 형질전환되었으며, 재조합 효모는 30℃에서 overnight으로 SG-Trp media (Yeast nitrogen base (without ammonium sulfate) 1.7g/L, Amino acid supplement (without Trp) 0.74g/L, Galactose 20g/L)를 기반으로 배양하였으며, 이후 50㎖의 SG-Trp media에 접종하여 72시간 동안 배양하였다. 지방산 생산량 분석시 agilent 7890 GC-FID 기기를 활용하여 2.5mm, 30m의 HP5-MS column을 이용하여 total fatty acid의 생산량을 분석하였으며 분석시 injection volume은 5㎕, injector 온도는 200℃, detector 온도는 300℃로 하였으며 oven은 100℃에서 5분간 대기 후 100℃부터 시작하여 250℃까지 1분에 10℃씩 증가하도록 설정하였다. 250℃에서는 잔여물이 다 나올 수 있도록 10분간 대기하도록 하였다.
상기 실시예 2에서 확보한 발현 벡터를 효모로 도입하여 확보한 재조합 효모의 지방산 생산량을 각각 분석
실시예 2에서 확보한 발현 벡터는 효모로 Yeastmaker kit을 이용하여 형질전환되었으며, 재조합 효모는 30℃에서 overnight으로 SG-Trp media (Yeast nitrogen base (without ammonium sulfate) 1.7g/L, Amino acid supplement (without Trp) 0.74g/L, Galactose 20g/L)를 기반으로 배양되었으며, 이후 50㎖의 SG-Trp media에 접종하여 72시간 동안 배양하였다. 지방산 생산량 분석시 agilent 7890 GC-FID 기기를 활용하여 2.5mm, 30m의 HP5-MS column을 이용하여 total fatty acid의 생산량을 분석하였으며 분석시 injection volume은 5㎕, injector 온도는 200℃, detector 온도는 300℃로 하였으며 oven은 100℃에서 5분간 대기 후 100℃부터 시작하여 250℃까지 1분에 10℃씩 증가하도록 설정하였다. 250℃에서는 잔여물이 다 나올 수 있도록 10분간 대기하도록 하였다.
상기 실시예 4에서 분석한 지방산의 C 16 및 C 18 의 조성을 profiling 함
지방산 생산량 분석시 agilent 7890 GC-FID 기기를 활용하여 2.5mm, 30m의 HP5-MS column을 이용하여 C16 및 C18 조성을 각각 분석하였으며 분석시 injection volume은 5㎕, injector 온도는 200℃, detector 온도는 300℃로 하였으며 oven은 100℃에서 5분간 대기 후 100℃부터 시작하여 250℃까지 1분에 10℃씩 증가하도록 설정하였다. 250℃에서는 잔여물이 다 나올 수 있도록 10분간 대기하도록 하였다. 상기 방법을 활용하여 각각의 C16 및 C18의 양을 정량하여 분석함으로써 조성 분석을 진행하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Recombinant Yeast Having Improved Fatty Acid Producing Ability and Method for Producing Fatty Acid <130> P15-B240 <160> 22 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 591 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Acetyl-CoA Carboxylase AccBC <400> 1 Met Ser Val Glu Thr Arg Lys Ile Thr Lys Val Leu Val Ala Asn Arg 1 5 10 15 Gly Glu Ile Ala Ile Arg Val Phe Arg Ala Ala Arg Asp Glu Gly Ile 20 25 30 Gly Ser Val Ala Val Tyr Ala Glu Pro Asp Ala Asp Ala Pro Phe Val 35 40 45 Ser Tyr Ala Asp Glu Ala Phe Ala Leu Gly Gly Gln Thr Ser Ala Glu 50 55 60 Ser Tyr Leu Val Ile Asp Lys Ile Ile Asp Ala Ala Arg Lys Ser Gly 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ile His Pro Gly Tyr Gly Phe Leu Ala Glu Asn Ala Asp 85 90 95 Phe Ala Glu Ala Val Ile Asn Glu Gly Leu Ile Trp Ile Gly Pro Ser 100 105 110 Pro Glu Ser Ile Arg Ser Leu Gly Asp Lys Val Thr Ala Arg His Ile 115 120 125 Ala Asp Thr Ala Lys Ala Pro Met Ala Pro Gly Thr Lys Glu Pro Val 130 135 140 Lys Asp Ala Ala Glu Val Val Ala Phe Ala Glu Glu Phe Gly Leu Pro 145 150 155 160 Ile Ala Ile Lys Ala Ala Phe Gly Gly Gly Gly Arg Gly Met Lys Val 165 170 175 Ala Tyr Lys Met Glu Glu Val Ala Asp Leu Phe Glu Ser Ala Thr Arg 180 185 190 Glu Ala Thr Ala Ala Phe Gly Arg Gly Glu Cys Phe Val Glu Arg Tyr 195 200 205 Leu Asp Lys Ala Arg His Val Glu Ala Gln Val Ile Ala Asp Lys His 210 215 220 Gly Asn Val Val Val Ala Gly Thr Arg Asp Cys Ser Leu Gln Arg Arg 225 230 235 240 Phe Gln Lys Leu Val Glu Glu Ala Pro Ala Pro Phe Leu Thr Asp Asp 245 250 255 Gln Arg Glu Arg Leu His Ser Ser Ala Lys Ala Ile Cys Lys Glu Ala 260 265 270 Gly Tyr Tyr Gly Ala Gly Thr Val Glu Tyr Leu Val Gly Ser Asp Gly 275 280 285 Leu Ile Ser Phe Leu Glu Val Asn Thr Arg Leu Gln Val Glu His Pro 290 295 300 Val Thr Glu Glu Thr Thr Gly Ile Asp Leu Val Arg Glu Met Phe Arg 305 310 315 320 Ile Ala Glu Gly His Glu Leu Ser Ile Lys Glu Asp Pro Ala Pro Arg 325 330 335 Gly His Ala Phe Glu Phe Arg Ile Asn Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn 340 345 350 Phe Met Pro Ala Pro Gly Lys Ile Thr Ser Tyr Arg Glu Pro Gln Gly 355 360 365 Pro Gly Val Arg Met Asp Ser Gly Val Val Glu Gly Ser Glu Ile Ser 370 375 380 Gly Gln Phe Asp Ser Met Leu Ala Lys Leu Ile Val Trp Gly Asp Thr 385 390 395 400 Arg Glu Gln Ala Leu Gln Arg Ser Arg Arg Ala Leu Ala Glu Tyr Val 405 410 415 Val Glu Gly Met Pro Thr Val Ile Pro Phe His Gln His Ile Val Glu 420 425 430 Asn Pro Ala Phe Val Gly Asn Asp Glu Gly Phe Glu Ile Tyr Thr Lys 435 440 445 Trp Ile Glu Glu Val Trp Asp Asn Pro Ile Ala Pro Tyr Val Asp Ala 450 455 460 Ser Glu Leu Asp Glu Asp Glu Asp Lys Thr Pro Ala Gln Lys Val Val 465 470 475 480 Val Glu Ile Asn Gly Arg Arg Val Glu Val Ala Leu Pro Gly Asp Leu 485 490 495 Ala Leu Gly Gly Thr Ala Gly Pro Lys Lys Lys Ala Lys Lys Arg Arg 500 505 510 Ala Gly Gly Ala Lys Ala Gly Val Ser Gly Asp Ala Val Ala Ala Pro 515 520 525 Met Gln Gly Thr Val Ile Lys Val Asn Val Glu Glu Gly Ala Glu Val 530 535 540 Asn Glu Gly Asp Thr Val Val Val Leu Glu Ala Met Lys Met Glu Asn 545 550 555 560 Pro Val Lys Ala His Lys Ser Gly Thr Val Thr Gly Leu Thr Val Ala 565 570 575 Ala Gly Glu Gly Val Asn Lys Gly Val Val Leu Leu Glu Ile Lys 580 585 590 <210> 2 <211> 543 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Acetyl-CoA Carboxylase AccD1 <400> 2 Met Thr Ile Ser Ser Pro Leu Ile Asp Val Ala Asn Leu Pro Asp Ile 1 5 10 15 Asn Thr Thr Ala Gly Lys Ile Ala Asp Leu Lys Ala Arg Arg Ala Glu 20 25 30 Ala His Phe Pro Met Gly Glu Lys Ala Val Glu Lys Val His Ala Ala 35 40 45 Gly Arg Leu Thr Ala Arg Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Leu Asp Glu Gly 50 55 60 Ser Phe Ile Glu Thr Asp Gln Leu Ala Arg His Arg Thr Thr Ala Phe 65 70 75 80 Gly Leu Gly Ala Lys Arg Pro Ala Thr Asp Gly Ile Val Thr Gly Trp 85 90 95 Gly Thr Ile Asp Gly Arg Glu Val Cys Ile Phe Ser Gln Asp Gly Thr 100 105 110 Val Phe Gly Gly Ala Leu Gly Glu Val Tyr Gly Glu Lys Met Ile Lys 115 120 125 Ile Met Glu Leu Ala Ile Asp Thr Gly Arg Pro Leu Ile Gly Leu Tyr 130 135 140 Glu Gly Ala Gly Ala Arg Ile Gln Asp Gly Ala Val Ser Leu Asp Phe 145 150 155 160 Ile Ser Gln Thr Phe Tyr Gln Asn Ile Gln Ala Ser Gly Val Ile Pro 165 170 175 Gln Ile Ser Val Ile Met Gly Ala Cys Ala Gly Gly Asn Ala Tyr Gly 180 185 190 Pro Ala Leu Thr Asp Phe Val Val Met Val Asp Lys Thr Ser Lys Met 195 200 205 Phe Val Thr Gly Pro Asp Val Ile Lys Thr Val Thr Gly Glu Glu Ile 210 215 220 Thr Gln Glu Glu Leu Gly Gly Ala Thr Thr His Met Val Thr Ala Gly 225 230 235 240 Asn Ser His Tyr Thr Ala Ala Thr Asp Glu Glu Ala Leu Asp Trp Val 245 250 255 Gln Asp Leu Val Ser Phe Leu Pro Ser Asn Asn Arg Ser Tyr Ala Pro 260 265 270 Met Glu Asp Phe Asp Glu Glu Glu Gly Gly Val Glu Glu Asn Ile Thr 275 280 285 Ala Asp Asp Leu Lys Leu Asp Glu Ile Ile Pro Asp Ser Ala Thr Val 290 295 300 Pro Tyr Asp Val Arg Asp Val Ile Glu Cys Leu Thr Asp Asp Gly Glu 305 310 315 320 Tyr Leu Glu Ile Gln Ala Asp Arg Ala Glu Asn Val Val Ile Ala Phe 325 330 335 Gly Arg Ile Glu Gly Gln Ser Val Gly Phe Val Ala Asn Gln Pro Thr 340 345 350 Gln Phe Ala Gly Cys Leu Asp Ile Asp Ser Ser Glu Lys Ala Ala Arg 355 360 365 Phe Val Arg Thr Cys Asp Ala Phe Asn Ile Pro Ile Val Met Leu Val 370 375 380 Asp Val Pro Gly Phe Leu Pro Gly Ala Gly Gln Glu Tyr Gly Gly Ile 385 390 395 400 Leu Arg Arg Gly Ala Lys Leu Leu Tyr Ala Tyr Gly Glu Ala Thr Val 405 410 415 Pro Lys Ile Thr Val Thr Met Arg Lys Ala Tyr Gly Gly Ala Tyr Cys 420 425 430 Val Met Gly Ser Lys Gly Leu Gly Ser Asp Ile Asn Leu Ala Trp Pro 435 440 445 Thr Ala Gln Ile Ala Val Met Gly Ala Ala Gly Ala Val Gly Phe Ile 450 455 460 Tyr Arg Lys Glu Leu Met Ala Ala Asp Ala Lys Gly Leu Asp Thr Val 465 470 475 480 Ala Leu Ala Lys Ser Phe Glu Arg Glu Tyr Glu Asp His Met Leu Asn 485 490 495 Pro Tyr His Ala Ala Glu Arg Gly Leu Ile Asp Ala Val Ile Leu Pro 500 505 510 Ser Glu Thr Arg Gly Gln Ile Ser Arg Asn Leu Arg Leu Leu Lys His 515 520 525 Lys Asn Val Thr Arg Pro Ala Arg Lys His Gly Asn Met Pro Leu 530 535 540 <210> 3 <211> 669 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Malic Enzyme MaeI <400> 3 Met Leu Arg Thr Arg Leu Ser Val Ser Val Ala Ala Arg Ser Gln Leu 1 5 10 15 Thr Arg Ser Leu Thr Ala Ser Arg Thr Ala Pro Leu Arg Arg Trp Pro 20 25 30 Ile Gln Gln Ser Arg Leu Tyr Ser Ser Asn Thr Arg Ser His Lys Ala 35 40 45 Thr Thr Thr Arg Glu Asn Thr Phe Gln Lys Pro Tyr Ser Asp Glu Glu 50 55 60 Val Thr Lys Thr Pro Val Gly Ser Arg Ala Arg Lys Ile Phe Glu Ala 65 70 75 80 Pro His Pro His Ala Thr Arg Leu Thr Val Glu Gly Ala Ile Glu Cys 85 90 95 Pro Leu Glu Ser Phe Gln Leu Leu Asn Ser Pro Leu Phe Asn Lys Gly 100 105 110 Ser Ala Phe Thr Gln Glu Glu Arg Glu Ala Phe Asn Leu Glu Ala Leu 115 120 125 Leu Pro Pro Gln Val Asn Thr Leu Asp Glu Gln Leu Glu Arg Ser Tyr 130 135 140 Lys Gln Leu Cys Tyr Leu Lys Thr Pro Leu Ala Lys Asn Asp Phe Met 145 150 155 160 Thr Ser Leu Arg Val Gln Asn Lys Val Leu Tyr Phe Ala Leu Ile Arg 165 170 175 Arg His Ile Lys Glu Leu Val Pro Ile Ile Tyr Thr Pro Thr Glu Gly 180 185 190 Asp Ala Ile Ala Ala Tyr Ser His Arg Phe Arg Lys Pro Glu Gly Val 195 200 205 Phe Leu Asp Ile Thr Glu Pro Asp Ser Ile Glu Cys Arg Leu Ala Thr 210 215 220 Tyr Gly Gly Asp Lys Asp Val Asp Tyr Ile Val Val Ser Asp Ser Glu 225 230 235 240 Gly Ile Leu Gly Ile Gly Asp Gln Gly Ile Gly Gly Val Arg Ile Ala 245 250 255 Ile Ser Lys Leu Ala Leu Met Thr Leu Cys Gly Gly Ile His Pro Gly 260 265 270 Arg Val Leu Pro Val Cys Leu Asp Val Gly Thr Asn Asn Lys Lys Leu 275 280 285 Ala Arg Asp Glu Leu Tyr Met Gly Asn Lys Phe Ser Arg Ile Arg Gly 290 295 300 Lys Gln Tyr Asp Asp Phe Leu Glu Lys Phe Ile Lys Ala Val Lys Lys 305 310 315 320 Val Tyr Pro Ser Ala Val Leu His Phe Glu Asp Phe Gly Val Lys Asn 325 330 335 Ala Arg Arg Leu Leu Glu Lys Tyr Arg Tyr Glu Leu Pro Ser Phe Asn 340 345 350 Asp Asp Ile Gln Gly Thr Gly Ala Val Val Met Ala Ser Leu Ile Ala 355 360 365 Ala Leu Lys His Thr Asn Arg Asp Leu Lys Asp Thr Arg Val Leu Ile 370 375 380 Tyr Gly Ala Gly Ser Ala Gly Leu Gly Ile Ala Asp Gln Ile Val Asn 385 390 395 400 His Met Val Thr His Gly Val Asp Lys Glu Glu Ala Arg Lys Lys Ile 405 410 415 Phe Leu Met Asp Arg Arg Gly Leu Ile Leu Gln Ser Tyr Glu Ala Asn 420 425 430 Ser Thr Pro Ala Gln His Val Tyr Ala Lys Ser Asp Ala Glu Trp Ala 435 440 445 Gly Ile Asn Thr Arg Ser Leu His Asp Val Val Glu Asn Val Lys Pro 450 455 460 Thr Cys Leu Val Gly Cys Ser Thr Gln Ala Gly Ala Phe Thr Gln Asp 465 470 475 480 Val Val Glu Glu Met His Lys His Asn Pro Arg Pro Ile Ile Phe Pro 485 490 495 Leu Ser Asn Pro Thr Arg Leu His Glu Ala Val Pro Ala Asp Leu Met 500 505 510 Lys Trp Thr Asn Asn Asn Ala Leu Val Ala Thr Gly Ser Pro Phe Pro 515 520 525 Pro Val Asp Gly Tyr Arg Ile Ser Glu Asn Asn Asn Cys Tyr Ser Phe 530 535 540 Pro Gly Ile Gly Leu Gly Ala Val Leu Ser Arg Ala Thr Thr Ile Thr 545 550 555 560 Asp Lys Met Ile Ser Ala Ala Val Asp Gln Leu Ala Glu Leu Ser Pro 565 570 575 Leu Arg Glu Gly Asp Ser Arg Pro Gly Leu Leu Pro Gly Leu Asp Thr 580 585 590 Ile Thr Asn Thr Ser Ala Arg Leu Ala Thr Ala Val Ile Leu Gln Ala 595 600 605 Leu Glu Glu Gly Thr Ala Arg Ile Glu Gln Glu Gln Val Pro Gly Gly 610 615 620 Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Val Pro Arg Asp Phe Asp Glu Cys Leu 625 630 635 640 Gln Trp Val Lys Ala Gln Met Trp Glu Pro Val Tyr Arg Pro Met Ile 645 650 655 Lys Val Gln His Asp Pro Ser Val His Thr Asn Gln Leu 660 665 <210> 4 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Acetyl-CoA Thioesterase Cgl1664 <400> 4 Met Lys Thr Ile Glu Asp Ile Leu Thr Leu Glu Glu Ile Asp Arg Asp 1 5 10 15 Ile Tyr Arg Gly Pro Val Ile Glu Ser Tyr Leu Ala Arg Thr Phe Gly 20 25 30 Gly Gln Val Ala Ala Gln Ala Leu Val Ala Ala Thr His Thr Val Asp 35 40 45 Lys Ala Phe Thr Val His Ser Leu His Gly Tyr Phe Ile Ala Pro Gly 50 55 60 Asp Pro Thr Ala Pro Ala Ile Tyr Leu Val Asp Arg Val Arg Asp Gly 65 70 75 80 Lys Ser Tyr Val Thr Arg Ser Val Arg Gly Ile Gln Asp Gly Glu Val 85 90 95 Ile Phe Ser Met Gln Ala Ser Phe His Arg Gly Asp Glu Gly Ile Glu 100 105 110 His Met Asp Lys Met Arg Lys Val Pro Ala Pro Asp Glu Ile Lys Gly 115 120 125 Thr Val Glu Arg Met Pro Ile Ser Ser Arg Arg Val Leu Asp Glu Trp 130 135 140 Ala Glu Trp Asp Ile Arg Val Ile Pro Gln Asp Gln Leu Glu Leu Ser 145 150 155 160 Asp Phe Thr Ala Thr Glu Gln Ala Val Trp Ile Arg Cys Thr Ala Asp 165 170 175 Leu Pro Asp Asn Pro Thr Phe His Gln Cys Ser Leu Thr Tyr Leu Ser 180 185 190 Asp Met Thr Leu Leu His Ser Ala Leu Val Pro His Pro Gly Glu Lys 195 200 205 Met Gln Met Ala Ser Leu Asp His Ala Val Trp Phe Leu Arg Pro Phe 210 215 220 Arg Val Asp Glu Trp Leu Leu Tyr Asp Gln Arg Ser Pro Ser Ala Ser 225 230 235 240 Ser Gly Arg Ala Leu Thr His Gly Arg Leu Phe Asn Gln Gln Gly Asp 245 250 255 Leu Val Ala Ile Val Asn Gln Glu Gly Met Thr Arg Thr Leu His Glu 260 265 270 Gly Ala Gln Ser Ile Pro Met Arg Lys Asp 275 280 <210> 5 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Acetyl-CoA Thioesterase Cgl2451 <400> 5 Met Ala Ala Asn Asn Val Asn Asp Asp Thr Gln Asn Asn Leu His Val 1 5 10 15 Thr Glu Val Asp Leu Arg Trp Ala Asp Phe Asp Arg Phe Gly His Val 20 25 30 Asn Asn Ala Ala Phe Ile Glu Ile Ala Gln Glu Ala Arg Leu Ala Phe 35 40 45 Ala Glu Asp Gln Phe Arg Glu Arg Gly Tyr Glu Ile Pro Ala Val Phe 50 55 60 Val Arg His Leu Glu Val Asp Tyr Leu Arg Ala Ile Leu Pro Asp Thr 65 70 75 80 Thr Gln Ala Val Val Glu Thr Gln Val Thr Lys Ile Gly Asn Thr Ser 85 90 95 Phe Ser Thr Arg Gln Glu Val Lys Asp Arg Asn Gly Arg Val Cys Cys 100 105 110 Val Val Glu Cys Val Gln Val Ala Val Asn Val Gln Thr Ala Ala Pro 115 120 125 Arg Ser Ile Ser Lys Val Glu Arg Lys Val Leu Thr Ala Val Ala Thr 130 135 140 Asp Glu Val Gln Ser Gln Glu Ala Leu Glu Lys 145 150 155 <210> 6 <211> 259 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Acetyl-CoA Thioesterase Cgl0091 <400> 6 Met Phe Leu Thr Leu Ser Gly Ala Asp Met Ser Ala Leu Ile Lys Gly 1 5 10 15 Ser Gly Pro His His Val Val Val Leu Asn Gly Trp Phe Gly His Ala 20 25 30 Ala Gly Trp Gly Ala Phe Ala Asp Tyr Leu Asp Leu Gly Asn Tyr Thr 35 40 45 Trp His Phe Trp Asp Tyr Arg Gly Tyr Gly Asn Arg Lys Asp Asp Ala 50 55 60 Gly Glu Phe Thr Leu Glu Glu Ile Ser Ala Asp Ile Val Ala Tyr Ile 65 70 75 80 Asp Ser Ile Glu Ala Glu Lys Val Ser Ile Leu Gly His Ser Met Gly 85 90 95 Gly Val Phe Met Gln Lys Val Leu Ala Asp Ser Ala Thr Pro Ile Ala 100 105 110 Ser Leu Val Gly Ile Ser Ala Val Ala Ala Ala Gly Thr Pro Phe Asp 115 120 125 Glu Asp Ser Arg Lys Leu Phe Thr Ser Ala Gly His Asn Pro Asp Ser 130 135 140 Arg Arg Ala Ile Ile Asp Phe Thr Ser Gly Ser Arg Gln Pro Ala Ala 145 150 155 160 Trp Leu Asp Asp Leu Thr Asp Ser Thr Val Gln Asn Ser Thr Pro Glu 165 170 175 Ala Val Glu Lys Tyr Phe Phe Ala Trp Ala Asp Cys Asn Phe Ala Ala 180 185 190 Asp Leu Gly Thr Gln Asp Leu Pro Val Tyr Ile Leu Thr Gly Asp Leu 195 200 205 Asp Pro Ala Val Thr Lys Thr Ala Val Glu Ser Ala Phe Gly Pro Ile 210 215 220 Tyr Gln Asn Leu Thr Val Glu Glu Leu His Asp Val Gly His Tyr Ala 225 230 235 240 Ile Phe Glu His Pro Leu Gly Leu Ala Ala Arg Val Leu Arg Phe Leu 245 250 255 Asp Ala Val <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(accBC-f) 7 <400> 7 ggatccgatg tcagtcgaga ctaggaa 27 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(accBC-r) 8 <400> 8 gtcgacttac ttgatctcga ggagaa 26 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(accD1-f) 9 <400> 9 gcggccgcaa tgaccatttc ctcaccttt 29 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(accD1-r) 10 <400> 10 actagtgctt acagtggcat gttgccgt 28 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(pCgl1664-f) 11 <400> 11 ggatccgatg aaaactattg aagatatttt gac 33 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(pCgl1664-r) 12 <400> 12 gtcgacttag tctttgcgca tcgg 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(pCgl2451-f) 13 <400> 13 ggacttgatg gcagccaaca atgt 24 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(pCgl2451-r) 14 <400> 14 gtcgacctac ttttctagag cttcct 26 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(pCgl0091-f) 15 <400> 15 ggatccgatg tttctcacac tctcag 26 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(pCgl0091-r) 16 <400> 16 gtcgacctag acggcgtcga ga 22 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(pMaeI-f) 17 <400> 17 ggatccgatg cttagaacca gactat 26 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(pMaeI-r) 18 <400> 18 gtcgacctac aattggttgg tgtgc 25 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(MaeI cassette-f) 19 <400> 19 ggtaccgcag atccgctcta acc 23 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(MaeI cassette-r) 20 <400> 20 gctagcccta caattggttg gtgtg 25 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(Cgl1664 cassette-f) 21 <400> 21 actagtacaa ttcttcgcca gaggttt 27 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(Cgl1664 cassette-r) 22 <400> 22 actagtacaa ttcttcgcca gaggttt 27

Claims (8)

  1. 서열번호 1 내지 2 중에서 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 아세틸-CoA-카르복실라아제를 코딩하는 유전자, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 말릭 효소를 코딩하는 유전자 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 티오에스터라아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 지방산 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 다음 단계를 포함하는 지방산의 제조방법
    (a) 제1항의 재조합 미생물을 배양하여 C16 또는 C18 지방산을 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 지방산을 회수하는 단계.
  8. 삭제
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