CN109679886A - 一种基于生物传感器的高通量筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于生物传感器的高通量筛选方法，属于高通量筛选技术领域。本发明通过采用液滴包埋含生物传感器细胞方式，对代谢物小分子3‑脱氢莽草酸细胞工厂进行高通量筛选，实现了3‑脱氢莽草酸高产菌株的高效富集，相比生物传感器结合流式细胞仪的单细胞水平筛选方法，本发明一方面利用液滴内细胞可扩增富集特性，将单细胞间荧光信号差异扩大N倍至细胞群体间差异；另一方面，利用液滴隔离单细胞及其分泌产物的特性，排除其他细胞及分泌产物影响，还原细胞与其分泌至胞外代谢物真实交流反馈；通过以上改进有效提高了有益阳性克隆菌株的筛选灵敏性，提高了有益阳性克隆菌株的富集效率。

Description

一种基于生物传感器的高通量筛选方法
技术领域
本发明属于高通量筛选领域，涉及一种利用液滴包埋含有生物传感器细胞，实现对产代谢物小分子化合物细胞工厂高通量筛选的方法。
背景技术
近年来，随着代谢工程和合成生物学的不断发展，越来越多高效的微生物细胞工厂得以构建，用以高效合成高附加值代谢物小分子化合物，包括氨基酸、蛋白、有机酸、芳香族化合物等，相比传统化学合成，构建微生物细胞工厂合成代谢物小分子化合物不仅绿色环保，其在降低企业生产成本提高企业竞争力方面发挥着与日俱增的作用，因此以微生物细胞工厂合成高附加值小分子化合物代表了一种发展趋势。
与此同时，作为一种有力的微生物细胞工厂高通量筛选工具，基因编码型生物传感器通过其感应部分感应胞内目标小分子化合物浓度并做出正相关性应答，最终以信号检测平台可检测信号(如荧光信号)呈现出来。因此其可借助包括流式细胞仪、酶标仪等高通量筛选平台对相应细胞工厂突变库进行高通量筛选，以获得目的性状细胞工厂，促进目标代谢小分子化合物微生物细胞工厂改造工程。而且一系列基因型生物传感器已成功应用于相应细胞工厂高通量筛选，提高其代谢小分子化合物合成能力，例如琥珀酸盐，丁醇，氨基酸(如L-酪氨酸，L-亮氨酸，L-精氨酸)和其他高附加值代谢物(如黄酮，内酰胺)。
目前，利用基因型生物传感器进行小分子化合物合成细胞工厂突变库的高通量筛选主要基于流式细胞仪筛选，其特点在于主要检测单细胞胞内荧光信号。尽管生物传感器感应胞内目标小分子化合物以及流式细胞仪检测单细胞内荧光信号均达到相对较高灵敏度，荧光信号背景干扰，荧光信号易引入误差，差异较小细胞单细胞水平不易识别分选等因素却很大程度限制了阳性突变体的筛选效率；另外，包括氨基酸、芳香族化合物等具有重要应用价值的代谢物小分子化合物均属于分泌性小分子化合物，其特征在于小分子化合物在胞内积累量较少，大部分化合物将分泌到胞外。而基于流式细胞仪的单细胞筛选，其细胞均来自于混合细胞的均质环境，即不同细胞合成的小分子化合物分泌到胞外中和形成均质浓度环境，破环了细胞与其自身分泌的代谢小分子化合物真实的交流反馈。以上两方面在一定程度上影响着筛选获得阳性突变体的准确性、灵敏性及有效性。
发明内容
本发明为了解决以上问题，通过采用近年来快速发展的微液滴包埋技术，其通过微液滴将单细胞等包埋形成独立的微反应室，排除其他细胞或物质的干扰，为实时观测细胞代谢以及物质反应提供了更多可能，因此在高通量筛选酶、蛋白、细胞方面发挥着与日俱增的作用。
本发明提供了一种代谢物小分子化合物细胞工厂的高通量筛选方法。
本发明所提供的代谢物小分子化合物细胞工厂的高通量筛选方法，具体可包括如下步骤(I)-(V)：
(I)构建应答代谢物小分子化合物的基因型生物传感器；
(II)构建含有步骤(I)所述基因型生物传感器的产目标代谢物小分子化合物的细胞工厂；
(III)利用诱变技术对步骤(II)所述细胞工厂进行诱变，建立突变库；
(IV)采用微液滴对步骤(III)中所建立的突变库进行单细胞包埋、培养；
(V)对步骤(IV)所述的包含单细胞的微液滴进行高通量筛选。
其中，步骤(I)所述的基因型生物传感器包含应答目标代谢物小分子元件部分及荧光蛋白报告基因部分，功能完整的生物传感器具有应答目标代谢物小分子并以荧光信号报告信号表达差异方式表现出来；所述代谢物小分子化合物包括氨基酸、酶、有机酸、芳香族化合物等自然存在微生物细胞工厂可以表达合成的小分子化合物及人工设计并以微生物细胞工厂可以表达合成的小分子化合物。
步骤(II)中所述细胞工厂选自下组宿主细胞：原核细胞(如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌)、低等真核细胞(如酵母细胞)、高等真核细胞(如植物细胞)。优选地，所述细胞工厂为原核细胞(如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌)，优选地，所述细胞工厂为大肠杆菌。
步骤(III)中所述诱变技术包括物理诱变，化学诱变，生物诱变；优选地，所述诱变技术为物理诱变；优选地，所述诱变技术为常压室温等离子体诱变技术。
步骤(IV)中所述微液滴包括油包水、水包油等方式形成的可以将微生物细胞工厂及其分泌的代谢物小分子化合物稳定隔离、培养的封闭环境。
步骤(V)中所述高通量筛选包括液滴微流控、液滴激活分选等高通量筛选平台通过对液滴激光激发与荧光等信号识别进行高通量分析和筛选；优选地，所述高通量筛选为液滴微流筛选。
由于上述方法不受代谢物小分子化合物种类的限制，因此，该方法可应用于任何产代谢物小分子化合物细胞工厂的高通量筛选。
在本发明的一个实施例中，所述代谢物小分子化合物具体为3-脱氢莽草酸。
本发明提供了产3-脱氢莽草酸细胞工厂的高通量筛选方法。
本发明所提供的产3-脱氢莽草酸细胞工厂的高通量筛选方法，包括如下步骤(I)-(V)：
(I)构建应答3-脱氢莽草酸的基因型生物传感器；
(II)构建含有步骤(I)所述基因型生物传感器的产3-脱氢莽草酸的细胞工厂；
(III)利用诱变技术对步骤(II)所述细胞工厂进行诱变，建立突变库；
(IV)采用微液滴对步骤(III)中所建立的突变库进行单细胞包埋、培养；
(V)对步骤(IV)所述的包含单细胞的微液滴进行高通量筛选。
步骤(I)中，所述基因型生物传感器包含调控基因cusR的启动子和调控基因cusR，调控基因cusR的表达与3-脱氢莽草酸浓度变化呈正相关，调控基因cusR启动子用于启动调控基因cusR的表达；具体地，所述基因型生物传感器由调控基因cusR的启动子和调控基因cusR、连接序列、荧光蛋白报告基因顺序构成；优选地，所述调控基因cusR的核苷酸序列为SEQ IDNO：1所示的多核苷酸；所述调控基因cusR启动子的核苷酸序列为SEQ IDNO：2所示的多核苷酸；优选地，所述荧光蛋白报告基因为绿色荧光蛋白报告基因。
步骤(II)中，所述细胞工厂为原核细胞(如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌)；优选地，所述细胞工厂为大肠杆菌。
步骤(III)中，所述诱变技术包括物理诱变，化学诱变，生物诱变；优选地，所述诱变技术为物理诱变；优选地，所述诱变技术为常压室温等离子体诱变技术。
步骤(IV)中，所述微液滴包括油包水、水包油等方式形成的可以将微生物细胞工厂及其分泌的代谢物小分子化合物稳定隔离、培养的封闭环境。
步骤(V)中，所述高通量筛选包括液滴微流控、液滴激活分选等高通量筛选平台通过对液滴激光激发与荧光等信号识别进行高通量分析和筛选；优选地，所述高通量筛选为液滴微流筛选。
本发明提供了高产3-脱氢莽草酸突变菌株。
本发明所提供的高产3-脱氢莽草酸突变菌株通过本发明第二点所述方法筛选获得，其与出发菌株相比，3-脱氢莽草酸的合成能力显著提高。
本发明提供了高产3-脱氢莽草酸突变菌株在发酵生产3-脱氢莽草酸中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.相比流式细胞仪的单个细胞荧光信号检测，本发明所采用的液滴包埋含有生物传感器单细胞筛选方法则以液滴为单位，基于液滴内细胞繁殖扩增，利用生物传感器可以实现对液滴内来自于同一母本的细胞工厂群体荧光信号检测，即相比于区分单细胞间荧光信号差异，液滴间荧光信号差异则因液滴内细胞扩增而放大；同时，进行摇瓶培养模拟微液滴包埋生物传感器细胞放大信号差异实验：采用合成3-脱氢莽草酸能力有差异的菌株WJ60P(弱)和M9(强)作为实验菌株，经相同条件发酵培养8h，定点取样并分别测定两者在0.25OD600、0.5OD600和1OD600浓度下荧光信号差异，结果显示，两株菌株菌群间的荧光信号差异与菌体浓度成正比例关系，对比0.25OD600浓度的荧光差异，1OD600浓度条件下两株菌株菌群间的荧光信号差异提高约4倍，说明液滴内细胞培养过程中细胞数量的扩增有益于将菌株间的荧光信号差异从1个单细胞水平放大至N个细胞的菌群水平，进而可以提高突变菌株间荧光信号差异因而液滴荧光信号检测将更为灵敏；
2.对于分泌型代谢物小分子化合物，由于分泌至胞外小分子化合物限制在独立液滴内，液滴内胞外小分子化合物均来自液滴内细胞，与其他细胞合成分泌的代谢物小分子化合物实现隔离，排除其他细胞及代谢物干扰，同时也避免了分泌至细胞外小分子化合物在溶液中扩散导致的高产细胞周边小分子化合物浓度降低的弊端。因而生物传感器应答信号更为准确，也将更为接近候选菌株生产分泌型物质的实际信号，进行摇瓶培养模拟微液滴包埋生物传感器细胞反馈机制实验：采用合成3-脱氢莽草酸能力有差异的菌株WJ60P(弱)和M9(强)作为实验菌株，经相同条件发酵培养8h、11h、14h，结果显示，在发酵8h-14h区间，荧光信号在菌株WJ60P及M9中均呈增长趋势，并在11h-14h区间趋于稳定，说明菌株胞内3-脱氢莽草酸浓度达到一定浓度后增速放缓，对比两株菌在最适差异区域(8h和11h数据)的荧光信号增加值，可以得出相比于WJ60P，菌株M9内荧光信号强度区间增加值提高约43％。综合比较结果表明胞外的3-脱氢莽草酸的大量累积会对胞内3-脱氢莽草酸浓度存在一定影响，即胞外累积的分泌型代谢物小分子浓度与胞内分泌型代谢物小分子浓度存在一定反馈影响机制，相较于低浓度，高浓度胞外小分子浓度将更益于胞内代谢物小分子浓度的积累，进而影响胞内生物传感器感应荧光信号强度，而本发明所采用的液滴包埋含有生物传感器单细胞策略可通过隔离单细胞及其胞外的分泌型代谢物小分子达到还原分泌型代谢物小分子化合物胞内胞外的真实反馈调节平衡，利于消除了流式分选混合细胞过程中引入的其他细胞及代谢物干扰，因此将有利于更准确的筛选获得合成小分子化合物高产菌株。
附图说明
图1微液滴包埋生物传感器细胞有益性原理图
图2微液滴包埋生物传感器细胞放大信号差异模拟实验结果
图3微液滴包埋生物传感器细胞反馈模拟实验结果
图4生物传感器重组质粒pET30aR图谱
图5ARTP致死曲线
图6液滴培养荧光信号观测
图7基于液滴包埋细胞和生物传感器对产3-脱氢莽草酸菌株突变库进行筛选；
图8细胞基于流式胞内荧光检测和生物传感器对产3-脱氢莽草酸菌株突变库进行筛选；
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：摇瓶培养模拟微液滴包埋生物传感器细胞放大信号差异实验
由于试管或摇瓶发酵中的细胞均来自于同一母本细胞，其与液滴内单细胞包埋、繁殖机理一致，为此，我们以摇瓶培养单细胞模拟微液滴包埋生物传感器细胞放大信号差异，具体设计如下：以3-脱氢莽草酸(3-dehydroshikimic acid，DHS)合成能力差异菌株WJ60P(弱)和M9(强)作为实验菌株，相同条件下，对两菌株进行摇瓶发酵培养，起始接菌浓度：0.1OD600，培养基：NBS，温度：37℃，转速：220rpm，发酵培养8h，定点取样，样品经PBS洗涤两次重悬至1OD600，然后依次梯度稀释至0.5OD600及0.25OD600，每梯度浓度取200μL样品至96孔板，进行酶标仪荧光检测(图2)，激发波长/发射波长分别为：480nm/520nm，荧光检测结果显示，在相同发酵时间条件下，两株菌株菌群间的荧光信号差异随着浓度的增大而增大，且相较于0.25OD600浓度的荧光差异，1OD600浓度条件下两株菌株菌群间的荧光信号差异提高约4倍，说明液滴内细胞培养过程中细胞数量的扩增有益于将菌株间的荧光信号差异从1个单细胞水平放大至N个细胞的菌群水平，进而可以提高突变菌株间荧光信号差异，以上结果表明液滴包埋含有生物传感器单细胞筛选方法可应用于合成代谢物小分子微生物细胞工厂的筛选工作，其对于提高相应高通量筛选的灵敏性及效率具有一定促进作用(其原理见图1)。
实施例2：摇瓶培养模拟微液滴包埋生物传感器细胞反馈机制实验
为模拟微液滴包埋生物传感器细胞反馈机制，我们以3-脱氢莽草酸合成能力差异菌株WJ60P(弱)和M9(强)作为实验菌株，相同条件下，对两菌株进行摇瓶发酵培养，检测观察两株菌株生长及荧光信号强度变化，对比生物传感器在两株菌株内的应答荧光信号值，验证分泌型小分子化合物胞外反馈对生物传感器感应影响。本实验中起始接菌浓度：0.1OD600，培养基：NBS，温度：37℃，转速：220rpm，发酵培养8h、11h、14h，定点取样，样品经PBS洗涤两次重悬至1OD600，每梯度浓度取200μL样品至96孔板，进行酶标仪荧光检测(图3)，激发波长/发射波长分别为：480nm/520nm，荧光检测结果显示，在发酵8h-14h区间，荧光信号在菌株WJ60P及M9中均呈增长趋势，并在11h-14h区间趋于稳定，说明菌株胞内3-脱氢莽草酸浓度达到一定浓度后趋于稳定，对比两株菌在最适差异区域(8h和11h数据)的荧光信号增加值，可以得出相比于WJ60P，菌株M9内荧光信号强度区间增加值提高约43％。综合比较结果表明胞外的3-脱氢莽草酸的大量累积会对胞内3-脱氢莽草酸浓度存在一定影响，即胞外累积的分泌型代谢物小分子浓度与胞内分泌型代谢物小分子浓度存在一定反馈影响机制，相较于低浓度，高浓度胞外小分子浓度将更益于胞内代谢物小分子浓度的积累，进而影响胞内生物传感器感应荧光信号强度，因而本发明所采用的液滴包埋含有生物传感器单细胞策略可通过隔离单细胞及其胞外分泌型代谢物小分子达到还原分泌型代谢物小分子化合物胞内胞外的真实调节平衡，消除了流式分选混合细胞过程中引入的其他细胞及代谢物干扰，有利于提高不同突变菌株间荧光信号强度差异，提高相应高通量筛选的灵敏性(其原理见图1)。
实施例3：开发构建应答代谢小分子化合物3-脱氢莽草酸的基因型生物传感器
为构建应答代谢小分子化合物3-脱氢莽草酸的基因型生物传感器，首先，我们以不产3-脱氢莽草酸菌株E.coli ATCC 8739发酵培养12h转录组为参照，对实验组理性构建的产3-脱氢莽草酸工程菌株发酵12h和20h的转录组样品进行分析，结合RT-qPCR验证，挖掘了正相关应答3-脱氢莽草酸浓度变化的转录调控因子基因cusR，并以基因cusR及其启动子为核心部分，采用编码序列为5’-ggtggtggtggttctggtggtggtggatccggtggcggtggttct-3’的15个氨基酸短肽作为连接序列连接带有启动子的感应基因cusR及绿色荧光蛋白报告基因，组成3-脱氢莽草酸应答功能基因片段，进一步将该功能基因片段与质粒pET30a进行双酶切连接，上下游双酶切位点分别为EcoRI和HindIII，将功能片段插入pET30a载体的多克隆位点，构建获得生物传感器重组质粒pET30aR(图4)，该生物传感器重组质粒抗性标记基因为Kan，荧光蛋白报告基因的编码序列与调控基因cusR的编码序列通过连接序列连接并共同被调控基因cusR的启动子控制进行共表达。
实施例4：构建包含3-脱氢莽草酸生物传感器的细胞工厂
首先以产3-脱氢莽草酸工程菌株M9为对象，采用氯化钙法制备其感受态细胞，具体操作流程如下：
1)从新活化的菌株M9平板上挑取单菌落接种于3mL LB液体培养中，温度：37℃、转速：220rpm，培养时间：12h；
2)以1％的接菌量转接至30mL的LB液体培养基中，温度：37℃、转速：220rpm，培养至OD600＝0.5左右；
3)将摇瓶和50mL离心管并放于冰上，冰浴30min；
4)在超净台中将冰浴的菌液全部转入50mL预冷的离心管中，温度：4℃，转速：5000rpm，离心10min；
5)超净台中弃去上清，加入30mL的0.1mol/L氯化钙溶液，轻轻重悬细胞，温度：4℃，转速：5000rpm，离心机中离心10min；
6)重复步骤5)。
7)在超净台中弃去上清，加入100μL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，轻轻重悬细胞冰上放置片刻后，完成菌株M9的感受态细胞制备。
然后，采用热击转化法对菌株进行传感器载体的转化，转化筛选流程如下：
1)取制备好的菌株M9感受态50μL放在冰上冰浴30min；
2)取200ng左右的传感器质粒pET30aR加入1)中感受态Eppendorf管中，轻弹Eppendorf管混匀，冰浴30min；
3)将2)中冰浴后的Eppendorf管置于恒温水浴锅中，42℃条件下热击90s，然后立即放置冰上，冰浴2min；
4)向Eppendorf管中加入500μL的LB培养基，温度：37℃，转速：200rpm，复苏培养1h；
5)取适量已转化的感受态细胞加到含卡那抗生素的LB琼脂培养基上，均匀涂布，温度：37℃，倒置平板，过夜培养，初步筛选出阳性克隆，挑取单菌落经培养后，采用酶切验证、质粒测序和荧光显微镜观察三种方式对传感器载体进行验证，获得载有生物传感器载体pET30aR的菌株M9-sensor。
实施例5：采用ARTP技术对包含3-脱氢莽草酸生物传感器的细胞工厂进行诱变建立突变库
首先准备诱变处理样品：挑取菌株M9-sensor单菌落于LB试管，转速：220rpm，卡那抗性，温度：37℃，过夜培养；1％接菌量转接至新鲜LB试管，转速：220rpm，卡那抗性，温度：37℃，培养至OD600约0.8左右，离心收集菌体，生理盐水洗涤两次后重悬至1OD600，取10μL进行诱变。
然后对样品进行ARTP诱变处理，绘制致死曲线，确定最适诱变时间，操作条件如下：输入功率：120W，照射间距：2mm，气流量：10L/min，设定处理时间：0s、10s、12s、15s、20s、25s；诱变处理后，用990μL新鲜LB培养基洗涤铁片上的菌，稀释合适倍数后涂平板，为了减少涂布带来的误差，每个梯度做3平行，37℃过夜培养，计算致死率，绘制致死曲线(图5)。
根据现代育种理论，当致死率在90-95％之间时，突变库中突变体正向突变概率最大诱变菌株，因此按照上述ARTP操作对菌株M9-sensor进行诱变处理，诱变时间为15s，然后用990μL新鲜LB培养基洗涤铁片上的细胞，获得菌株M9-sensor有效突变库。
实施例6：采用微液滴对突变库细胞进行单细胞包埋、培养
取菌株M9-sensor ARTP诱变库100μL至1mL LB培养基中进行复苏富集培养，转速：220rpm，温度：37℃，培养时间：3h，然后以起始接菌量：0.1OD600转接至NBS培养基，体积：10mL，转速：220rpm，温度：37℃，发酵培养10h，取样2mL，样品12000rpm条件下离心1min，用相同体积PBS缓冲液洗涤两次后，NBS培养基重悬菌体并稀释到0.1OD600，进行液滴包埋；包埋流速为水相/油相为80/200μL/h，然后进行液滴静置培养：温度：37℃，时间：12h，此时基于生物传感器感应反馈的信号，液滴间信号差异明显，液滴内细胞数量合适(图6)，适合分选。
实施例7：采用液滴微流控平台对液滴进行筛选并评价
进行液滴分选，设置分选阈值≥99.5％，筛选高荧光信号强度液滴500个，分选获得的菌株进行LB平板涂布培养，抗性：卡那，培养温度：37℃，培养时间：14h，然后对分选库进行复苏培养；将平板中菌落冲洗至LB液体培养基：220rpm、37℃条件下培养1h，然后以上述相同操作对分选库发酵培养、液滴分选以及平板培养，然后从平板长出的菌落中任意挑取54个单菌落进行摇瓶发酵评价：挑取筛选平板中单菌落，培养基：LB，体积：2mL，转速：220rpm，温度：37℃，过夜富集培养，然后以起始接菌量：0.1OD600进行转接，培养基：NBS，体积：10mL，转速：220rpm，温度：37℃，培养24h，并在24h取样1mL，通过HPLC分析分选菌株3-脱氢莽草酸合成能力(图7)，结果显示在随机挑选的54株菌株中，相对于出发菌株M9-Sensor在24h的DHS合成量2.02g/L，DHS合成能力提高的菌株数量为28株，正向富集比例为52％，其中DHS合成能力最高菌株24h的DHS合成量2.61g/L，相比于出发菌株M9-Sensor，DHS合成能力增幅29％。
实施例8：采用流式细胞仪结合生物传感器对产3-脱氢莽草酸细胞工厂进行筛选
取菌株M9-Sensor ARTP诱变库100μL至1mL LB培养基中进行复苏富集培养，转速：220rpm，温度：37℃，培养时间：3h，然后以起始接菌量：0.1OD600转接至NBS培养基，体积：10mL，转速：220rpm，温度：37℃，摇瓶培养10h，取样2mL，样品12000rpm条件下离心1min，用相同体积PBS缓冲液洗涤两次后，PBS缓冲液重悬菌体并稀释到适宜浓度，进行流式分选，设置分选阈值≥99.5％，筛选高荧光信号强度突变菌株1000株菌，分选获得的菌株进行LB平板涂布培养，抗性：卡那，培养温度：37℃，培养时间：14h，然后对分选库进行复苏培养；将平板中菌落冲洗至LB液体培养基：220rpm，37℃条件下培养1h，然后以上述相同操作对分选库摇瓶培养、流式分选以及平板培养，然后从平板长出的菌落中任意挑取60个单菌落进行摇瓶发酵评价；挑取筛选平板中单菌落，培养基：LB，体积：2mL，转速：220rpm，温度：37℃，过夜富集培养，然后以起始接菌量：0.1OD600进行转接，培养基：NBS，体积：10mL，转速：220rpm，温度：37℃，培养24h，并在24h取样1mL，通过HPLC分析分选菌株3-脱氢莽草酸合成能力(图8)，结果显示在随机挑选的60株菌株中，相对于出发菌株M9-Sensor在24h的DHS合成量2.02g/L，DHS合成能力提高的菌株数量为24株，正向富集比例为40％，其中DHS合成能力最高菌株24h的DHS合成量2.51g/L，相比于出发菌株M9，DHS合成能力增幅24％。
综合两者比较，可知以相同突变库为前提，相对于流式结合生物传感器筛选，利用本发明的基于液滴包埋细胞和生物传感器的高通量筛选方法对产3-脱氢莽草酸菌株突变库进行筛选，不仅使阳性高产DHS突变菌正向富集比例提高12％，同时DHS合成能力最优者的DHS合成能力提高5％，并结合模拟实验结果理论验证该高通量筛选方法有益性，充分说明基于液滴结合生物传感器的小分子化合物细胞工厂筛选方法不仅可以通过液滴内细胞富集达到细胞间荧光信号的放大效应，从而提高阳性突变体筛选灵敏性和准确性，同时针对分泌型小分子化合物，通过液滴包埋相应生物传感器细胞形成独立微环境，使得细胞与胞外自身分泌的小分子化合物平衡及反馈更精确，进而提高小分子化合物菌株突变库筛选效率。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种基于生物传感器的高通量筛选方法
<130> 2010
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 684
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 1
atgaaactgt tgattgtcga agatgaaaag aaaaccggag aatacttgac caaagggtta 60
accgaagccg gttttgtggt cgatttggcc gacaacgggc tgaatggcta ccatctggcg 120
atgaccggtg attatgatct gataatcctc gatattatgc tgccggacgt gaacggctgg 180
gatatcgtgc gcatgttacg ctccgccaat aaagggatgc cgattctgtt gcttaccgcg 240
cttggcacca ttgaacatcg cgtcaagggg ctggagttgg gggcagatga ctacctggtg 300
aagccattcg cttttgctga actgctggcg cgggtgcgca cattactgcg gcgcggggcg 360
gcggtgatta tcgaaagtca gtttcaggtt gccgatttga tggtcgatct cgtcagccgc 420
aaagtcaccc gcagcggcac gcgcatcact ttgaccagta aagagtttac tctgctggag 480
ttcttccttc gccatcaggg cgaagtgctg ccccgctcgc ttatcgcctc gcaggtatgg 540
gacatgaatt ttgacagcga taccaatgct attgatgtgg cggtgaagcg gctgcgcggc 600
aaaatcgaca acgactttga gccgaagcta attcagaccg tgcgcggcgt gggttacatg 660
cttgaggtgc cggatggtca gtaa 684
<210> 2
<211> 271
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 2
ggctgagtga gaactgctgc ggcacgggca ttgccggacg ctgataatcc ggtgccagtg 60
aacaaccggt tagcgcaagg gccacacaaa atggcagaag tttacaagga gacataggct 120
cataatttct ggtgatttta taccgccaac tttactcgcc aggctctgat tttccggtga 180
caggaaaatg acaaaattgt cattttgcca ataagcgatt gccatctgat cccgctactc 240
tagaattgcc cgggcaacat gcggaggaaa t 271

Claims (10)

1.一种产代谢物小分子化合物细胞工厂的高通量筛选方法，所述方法包括以下步骤(I)-(V)：
(I)构建应答代谢物小分子化合物的基因型生物传感器；
(II)构建含有步骤(I)所述基因型生物传感器的产目标代谢物小分子化合物的细胞工厂；
(III)利用诱变技术对步骤(II)所述细胞工厂进行诱变，建立突变库；
(IV)采用微液滴对步骤(III)中所建立的突变库进行单细胞包埋、培养；
(V)对步骤(IV)所述的包含单细胞的微液滴进行高通量筛选。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述代谢物小分子化合物包括芳香族化合物、酶、有机酸，氨基酸；优选地，所述代谢物小分子化合物为芳香族化合物；更优选地，所述芳香族化合物为3-脱氢莽草酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述基因型生物传感器包含荧光蛋白报告基因部分，并具有应答目标代谢物小分子化合物的功能；优选地，所述目标代谢物小分子化合物为3-脱氢莽草酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述应答3-脱氢莽草酸的基因型生物传感器由调控基因cusR的启动子和调控基因cusR、连接序列、荧光蛋白报告基因顺序构成。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述调控基因cusR的核苷酸序列为SEQ IDNO：1所示的多核苷酸；所述调控基因cusR的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示的多核苷酸；所述荧光蛋白报告基因为绿色荧光蛋白报告基因。
6.根据权利要求1-5所述的任一方法，其特征在于，所述细胞工厂为原核细胞、真核细胞；优选地，所述细胞工厂为原核细胞；优选地，所述原核细胞为大肠杆菌。
7.根据权利要求1-6所述的任一方法，其特征在于，所述高通量筛选方包括液滴微流控、液滴激活分选等高通量筛选平台通过对液滴激光激发与荧光等信号识别进行高通量分析和筛选。优选地，所述高通量筛选方法为液滴微流控筛选。
8.根据权利要求1-7所述的任一方法，其特征在于，所述诱变技术包括物理诱变，化学诱变，生物诱变；优选地，所述诱变技术为物理诱变；优选地，所述物理诱变为常压室温等离子体诱变技术。
9.权利要求1-8所述的任一方法获得的高产3-脱氢莽草酸突变菌株。
10.权利要求9所述菌株在发酵生产3-脱氢莽草酸中的应用。
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