CN112014364A - 一种利用超分子荧光微流控技术筛选微生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于超分子荧光体系检测微生物在代谢过程中产生的氨基酸浓度，并联合液滴微流控技术实现高通量筛选微生物的方法。本发明包含如下步骤：(1)在微流控芯片上生成油包水的液滴，在微流控液滴内研究氨基酸对葫芦脲/荧光染料超分子体系的荧光强度的影响；(2)利用液滴微流控技术对微生物进行包裹和培养，然后将葫芦脲/荧光染料注入微流控液滴，根据液滴荧光强度的变化区别不同氨基酸代谢能力的微生物；(3)利用微流控液滴筛选技术，根据每个微流控液滴荧光强度的差异对不同氨基酸代谢能力的微生物进行高通量筛选。本发明在于首次在微流控液滴内研究超分子体系的荧光并应用于检测微生物的代谢产物浓度，并由此建立高通量筛选不同代谢能力的微生物。该检测方法具有灵敏度高，速度快等优点，筛选通量可以达到数百万个液滴每小时。采用本发明的高通量筛选方法，得到了高产目标产物的微生物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种新型的超分子荧光微流控技术实现微生物的高通量筛选方法。
背景技术
2.微生物高通量筛选是指能够自动、快速、高效地针对微生物的机能与产品进行筛选的技术，是工业微生物资源开发和产业化的瓶颈之一。微生物高通量筛选技术利用先进的现代自动化技术和仪器分析技术实现传统诱变筛选过程，具有自动化、标准化、高通量化等特征，大大突破了人工筛选在速度、效率和标准化等方面的限制。然而已经投入使用的各类高通量筛选设备主要是国外公司开发的价格昂贵、操作复杂的大型装备系统，特别是需要以流式细胞仪为主要部件以完成高通量的要求，被筛选对象需要表面或内部具有荧光信号，无法对细胞分泌的代谢产物进行检测、筛选，限制了其应用范围。
3.超分子荧光为分泌的细胞外代谢产物的微生物的检测、筛选提供了简单的方法。超分子荧光是通过自发包含合适的双阳离子荧光染料(例如，MDAP，MDPP或PDI)进入大环葫芦脲的大腔体得到。葫芦脲的残余腔空间允许随后结合芳基官能化分析物，这一过程伴随着净荧光猝灭，超分子荧光强度变化的大小是分析物浓度，结合效率以及猝灭效率的函数，对于单一分析物来说，超分子荧光强度随分析物浓度变化而变化，重要的是，非共价和可逆超分子荧光体系-分析物络合基本上是瞬时的，故而动态响应分析物浓度变化。
4.微流控技术是指使用微管道(尺寸为数十到数百微米)处理或操纵微小流体(体积为纳升到阿升)的系统所涉及的科学和技术，具有微型化、集成化等特征，其中，以液滴为手段的微流控技术因其速度快、体积小，能够创造独立内环境的特点而备受关注。在液滴微流控技术中，每个微液滴都是一个独立的皮升或纳升级的反应容器液滴体积微小，样品消耗量少；尺寸均一，单分散性好；系统封闭，避免交叉污染；试剂混合快，反应速率高；操作精确，可重复性高。传统的微液滴高通量筛选主要采用荧光染料或者细胞的荧光蛋白作为示踪分子，具有标记过程复杂，无法对细胞分泌的代谢产物进行检测、筛选，限制了其应用范围的缺点。因此，本发明主要在这一方法上进行改进，首次采用动态的超分子荧光作为标识物质，应用于微流控液滴中实现高通量筛选代谢氨基酸的微生物。
发明内容
1.针对现有技术中存在的上述不足之处，本发明要解决的技术问题是提供一种利用超分子荧光微流控技术高通量筛选代谢氨基酸的微生物的方法，
1.为了实现本发明的这些目的和其他优点，提供一种利用超分子荧光微流控技术筛选微生物的方法：(1)在微流控液滴内部实施葫芦脲、荧光染料、氨基酸分子的超分子主客体组装反应；(2)利用荧光检测技术，在微流控液滴内部检测超分子荧光；(3)将微生物包裹到微流控液滴后，进行孵育和培养，将超分子荧光体系注入到封装有微生物的微液滴中，根据每个微流控液滴的荧光强度，辨别不同氨基酸代谢能力的微生物；(4)采用荧光分析和微流控液滴分选技术，筛选不同氨基酸代谢能力的微生物。
2.优选的是，在本发明中，所述采用微流控芯片生成的油包水的液滴，油相可以为氟油、硅油、矿物油，水相为溶解有葫芦脲、荧光染料、氨基酸分子的一种或者几种物质。其中所述的葫芦脲为6个重复单元的瓜环葫芦脲分子(CB[6])，7个重复单元的瓜环葫芦脲分子(CB[7])，8个重复单元的瓜环葫芦脲分子(CB[8])；所述荧光染料为双阳离子荧光染料MDAP，MDPP，PDI(结构式见附图2)；所述氨基酸分子为色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。
3.优选的是，在本发明中，所述超分子荧光为荧光染料分子进入到葫芦脲的空腔中消除了染料分子自淬灭的荧光，所述荧光的波长范围在380nm-700nm之间，利用光电倍增管或者雪崩光电二极管等可以把荧光信号转换为电信号的光子探测器进行荧光检测。
4.优选的是，在本发明中，所述微生物包括但不仅限于能够代谢氨基酸的大肠杆菌，酿酒酵母，谷氨酸棒状杆菌，钝齿棒状杆菌等一种或者多种微生物。所述包裹到微流控液滴是指以泊松分布为理论指导，通过对微生物进行稀释，油相包裹水相的方式形成的单分散的单细胞液滴。
5.优选的是，在本发明中，所述注入为将葫芦脲/荧光染料超分子复合物采用微流控液滴注射或其他方法如皮升、微升级别的超分子复合物和微生物液滴的融合。
6.优选的是，在本发明中，所述荧光强度是利用与光子探测器连接的数据采集卡或者示波器等数据采集硬件对荧光进行数据接收和转换，所述不同氨基酸代谢能力是指包裹在微流控液滴内部的一个或者多个微生物在培育过程中代谢的一种或者多种氨基酸。
7.优选的是，在本发明中，所述根据不同的荧光强度，将包裹有微生物的微流控液滴进行高通量筛选，所述高通量筛选的方法包括但不仅限于介电电泳分选等能使微液滴在微流控通道内进行偏转的液滴操作方法。
8.优选的是，在本发明中，所述采用微流控芯片产生油包水的微液滴，实现葫芦脲、荧光染料、氨基酸分子和微生物的包裹、分析、分离等微流控操作。所述微流控芯片材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，玻璃，或者塑料。
9.优选的是，在本发明中，所述葫芦脲与荧光染料的摩尔比为1∶0.1～2，检测分子的浓度范围为大于等于1μM/L。
10.分选出的液滴所包含的微生物为高产目标产物的微生物或单个微生物经过单克隆得到的高产目标产物的微生物群。
11.本发明利用超分子荧光微流控技术高通量筛选代谢氨基酸的微生物的方法与文献报道相比，具有的有益效果是：实验操作简单，检测灵敏度高；其中液滴微流控芯片系统能生成独立的单个液滴微反应小室，将待分析样品(微生物和它的相关目标代谢产物)单独包埋在相互分开、互不干扰的微反应小室中进行检测分析；独立微反应小室具有皮升到纳升的体积，具有检测成本低、速度快、通量高的显著特点；超分子荧光体系实时检测目标产物的浓度，生物相容性好，灵敏度高，可以实现包括大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和酿酒酵母不同类型工业微生物生产目标代谢产物的高效筛选。
附图说明
图1为本发明中超分子荧光体系检测分析物的示意图；
图2为本发明中所涉及的荧光染料结构式；
图3为单细胞包裹示意图；
图4为液滴分选示意图；
图5为超分子荧光随色氨酸浓度变化曲线。
图6为光学设置的示意图
具体实施方式
下边结合附图与具体实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
采用超分子荧光分析微流控液滴内的色氨酸酸浓度；
1.在摩尔比为1∶1的CB[8]与MDPP的超分子荧光超分子溶液中加入不同浓度的色氨酸，利用酶标仪检测超分子溶液的荧光强度。由附图4可知在超分子荧光体系中加入色氨酸，随着色氨酸的加入，体系的荧光逐渐降低，这是由于色氨酸进入到CB8的剩余空腔内，与色氨酸的芳香基团与MDPP产生了π-π堆积，从而产生了荧光淬灭应。
2.配制三组溶液分别为水相(1)：CB[8](5μM)与MDPP(5μM)；水相(2)：CB[8](5μM)，MDPP(5μM)与色氨酸(5μM)；水相(3)：CB[8](5μM)，MDPP(5μM)与色氨酸(10μM)。水相流速为1μL/min，油相流速为3μL/min，生成液滴至1mL注射器内，得到三种不同水相的液滴，液滴直径为30μm。将液滴检测芯片放置于载物台上，调整载物台位置使液滴检测芯片在高速摄像机上清晰成像。设定液滴流速为0.1μL/min，油相流速为2μL/min，将液滴注入液滴检测芯片，打开激光器，设置激光波长为442nm，检测波长为500-520nm，调整液滴检测芯片位置使激光对准液滴检测芯片的通道检测点。打开光电倍增管，在相同激光强度，光电倍增管增益值相同的条件下，打开数据采集卡，打开信号分析处理软件，分别得到三组液滴的荧光强度信号。
实施例2：
采用超分子荧光分析微流控液滴内的大肠杆菌代谢的色氨酸浓度；
将大肠杆菌悬浮液用液体培养基稀释至106个/mL。培养基基本成分为：微量元素0.1％，K2HPO4 2.5％，KH2PO4 0.9％，(NH4)2SO4 0.45％，葡萄糖0.3％，MgSO4 0.01％pH7.2。，选择细胞包裹芯片进行细胞的液滴包裹，设定油相流速3μL/min，大肠杆菌细胞稀释液流速为1μL/min，生成液滴至1mL注射器内，液滴直径为30μm，根据泊松分布，不含细胞液滴比例为0.6065，包埋单细胞液滴比例为0.3033，包埋两个及以上细胞液滴比例为0.0902。将注射器放入37℃恒温箱中培养24小时，将葫芦脲/荧光染料超分子复合物采用微流控皮升注射的方式注入液滴中，按照实施例1的实验过程对液滴进行分析，记录液滴荧光信号。
实施例3：
采用超分子荧光微流控技术的筛选不同色氨酸代谢能力的大肠杆菌；
将液滴检测芯片放置于载物台上，调整载物台位置使液滴检测芯片在高速摄像机上清晰成像。设定液滴流速为0.1μL/min，油相流速为2μL/min，将液滴注入液滴检测芯片，打开激光器，设置激光波长为442nm，检测波长为500-520nm，调整液滴检测芯片位置使激光对准液滴检测芯片的通道检测点。打开光电倍增管，设置信号分析处理软件的触发值、光电倍增管的增益值，波形图显示触发阈值和液滴荧光强度值，在被检测的目标液滴的检测值超过预定的筛选阀值时，自动控制电筛选系统对流经芯片的目标液滴进行筛选。
Claims (9)
1.一种利用超分子荧光微流控技术筛选微生物的方法，其特征在于，(1)在微流控液滴内部实施葫芦脲、荧光染料、氨基酸分子的超分子主客体组装反应；(2)利用荧光检测技术，在微流控液滴内部检测超分子荧光；(3)将微生物包裹到微流控液滴后，进行孵育和培养，将超分子荧光体系注入到封装有微生物的微液滴中，根据每个微流控液滴的荧光强度，辨别不同氨基酸代谢能力的微生物；(4)采用荧光分析和微流控液滴分选技术，筛选不同氨基酸代谢能力的微生物。
2.根据权利要求1所述的微流控液滴，其特征在于：采用微流控芯片生成的油包水的液滴，油相可以为氟油、硅油、矿物油，水相为溶解有葫芦脲、荧光染料、氨基酸分子的一种或者几种物质。其中所述的葫芦脲为6个重复单元的瓜环葫芦脲分子(CB[6])，7个重复单元的瓜环葫芦脲分子(CB[7])，8个重复单元的瓜环葫芦脲分子(CB[8])；所述荧光染料为双阳离子荧光染料MDAP，MDPP，PDI；所述氨基酸分子为色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。
3.根据权利要求1所述的在微流控液滴内部检测超分子荧光，其特征在于：所述超分子荧光为荧光染料分子进入到葫芦脲的空腔中消除了染料分子自淬灭的荧光，所述荧光的波长范围在380nm-700nm之间，利用光电倍增管或者雪崩光电二极管等可以把荧光信号转换为电信号的光子探测器进行荧光检测。
4.根据权利要求1所述的微生物包裹到微流控液滴，其特征在于：所述微生物包括但不仅限于能够代谢氨基酸的大肠杆菌，酿酒酵母，谷氨酸棒状杆菌，钝齿棒状杆菌等一种或者多种微生物。所述包裹到微流控液滴是指以泊松分布为理论指导，通过对微生物进行稀释，油相包裹水相的方式形成的单分散的单细胞液滴。
5.根据权利要求1所述的超分子荧光体系注入到封装有微生物的微液滴中，其特征在于：所述注入为将葫芦脲/荧光染料超分子复合物采用微流控液滴注射或其他方法如皮升、微升级别的超分子复合物和微生物液滴的融合。
6.根据权利要求1所述的根据每个微流控液滴的荧光强度，辨别不同氨基酸代谢能力的微生物，其特征在于：所述荧光强度是利用与光子探测器连接的数据采集卡或者示波器等数据采集硬件对荧光进行数据接收和转换，所述不同氨基酸代谢能力是指包裹在微流控液滴内部的一个或者多个微生物在培育过程中代谢的一种或者多种氨基酸。
7.根据权利要求1所述的荧光分析和微流控液滴分选技术，其特征在于：根据不同的荧光强度，将包裹有微生物的微流控液滴进行高通量筛选，所述高通量筛选的方法包括但不仅限于介电电泳分选等能使微液滴在微流控通道内进行偏转的液滴操作方法。
8.根据权利要求2、3、5、6、7所述的微流控，其特征在于：采用微流控芯片产生油包水的微液滴，实现葫芦脲、荧光染料、氨基酸分子和微生物的包裹、分析、分离等微流控操作。所述微流控芯片材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，玻璃，或者塑料。
9.根据权利要求2所述一种利用超分子荧光微流控技术高通量筛选代谢氨基酸的微生物的方法，其特征在于：所述葫芦脲与荧光染料的摩尔比为1∶0.1～2，检测分子的浓度范围为大于等于1μM/L。
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