CN102341504A - 细胞分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种细胞分离方法，其在不使用具有复杂结构的装置的条件下抑制对细胞的物理损伤，而且使借助定量分析和多参数分析的细胞分离、以及利用Hoechst染色等作为指标的细胞分离成为可能。本发明提供了一种细胞分离方法，其包括：判定用笼锁化合物标记的细胞的特性的步骤(S3)；通过仅向具有预定特性的靶细胞照射光来激活标记靶细胞的笼锁化合物的步骤(S4)；及使细胞与对激活的笼锁化合物有亲和力的物质进行接触，并基于该物质与激活的笼锁化合物之间的相互作用来仅从细胞中分离靶细胞的步骤(S5)。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞分离方法。更具体而言，本发明涉及一种通过使用笼锁化合物来仅从细胞群分离具有预定特性的靶细胞的细胞分离方法。
发明背景
从细胞群中分离具有预定特性的靶细胞的细胞分离技术被广泛用于血细胞辨别、基因重组细胞的纯化、细胞表型变化的分析等。迄今沿用的细胞分离技术的例子包括荧光激活细胞分选(FACS)和使用磁性微珠的方法。
例如，在使用FACS来分离表达预定的细胞表面抗原的靶细胞时，使包含经与该抗原特异性结合的荧光标记抗体标记的靶细胞的细胞群流过流动池，接着进行激光束照射。此后，检测从每个细胞照射的荧光以判定细胞的光学特性，由此仅将具有源自经标记荧光物质的光学特性的靶细胞加以物理分离。专利文献1(图7)披露了FACS，其包括流体系统(其将用荧光标记试剂等染色的细胞在流动池中成行排布，并作为液滴释放到流动池外)、光学系统(其用激光束照射细胞以检测散射光和荧光)、和分选系统(其控制所释放的液滴的运动方向)。
例如，在使用磁性微珠来分离表达预定细胞表面抗原的靶细胞时，用与该抗原特异性结合的磁性标记抗体来标记靶细胞。此后，使用磁体来捕捉结合有足够量的磁性标记抗体的靶细胞，使其与未结合磁性标记抗体的细胞(或结合量少的细胞)分离。专利文献2披露了一种用于磁性分离细胞的方法和装置。
现有技术文献
专利文献
[PTL 1]JP-A-2007-46947
[PTL 2]JP-T-2002-515319
发明概述
依照FACS，有可能通过以每秒数千～数万个细胞的高速度判定细胞特性来分离靶细胞。然而，另一方面，为了实施高速度分离，需要使细胞在高压下流过流动池(flow cell)，因此由于形成液滴的喷嘴部分的突然压力变化等而对细胞造成物理损伤。此外，FACS的流体系统和分选系统的结构复杂，是非常昂贵的装置。
依照使用磁性微珠的方法，可以集中处理大量细胞，并且与FACS相比，可以降低对细胞的物理损伤。然而，在此方法中，由于无法对每个细胞检测的光学特性来进行定量分析，从而进行靶细胞的判定，所以例如不可能仅分离以等于或高于一定的基准值表达预定的表面抗原的细胞。此外，在此方法中，因为不能组合分析表面抗原的多种表达状态，所以不可能使用多项参数来分析细胞，也不能通过设门(gating)来分离细胞。另外，在使用磁性微珠的方法中，因为针对细胞表面抗原，使用磁性标记抗体来实施细胞的标记和分离，所以无法基于不能借助抗体标记的细胞特性来分离细胞。不能借助抗体标记的细胞特性的具体例子包括使用Hoechst试剂的核酸荧光染色，和使用Fluo-3试剂的胞内钙的荧光染色。就Hoechst试剂而言显示高排出能力的细胞称作“侧群细胞(SP细胞)”，据说SP细胞具有干细胞特性。使用经Hoechst试剂染色的细胞的荧光强度作为指标进行的SP细胞分离在干细胞研究领域中被广泛实施，但是SP细胞分离不能通过使用磁性微珠的方法来实施。
因此，本发明的主要目的是提供一种细胞分离方法，其不使用具有复杂结构的装置，抑制对细胞的物理损伤，而且使得通过定量分析和多参数分析来实施细胞分离，以及使用Hoechst染色等作为指标来实施细胞分离等成为可能。
为了解决上述问题，本发明提供了一种细胞分离方法，其包括：判定用笼锁化合物(caged compound)标记的细胞的特性的步骤；通过仅向具有预定特性的靶细胞照射光来激活标记于靶细胞的所述笼锁化合物的步骤；及使细胞与对所述激活的笼锁化合物有亲和力的物质进行接触，并基于所述物质与所述激活的笼锁化合物之间的相互作用来仅从所述细胞中分离出所述靶细胞的步骤。
此细胞分离方法包括：例如判定用笼锁生物素标记的细胞的特性的步骤；通过仅向具有预定特性的靶细胞照射光来激活标记于靶细胞的所述笼锁生物素的步骤；及使细胞与链霉抗生物素蛋白进行接触，并基于所述链霉抗生物素蛋白与所述激活的笼锁生物素间的相互作用来仅从所述细胞中分离出所述靶细胞的步骤。
或者，此细胞分离方法包括：例如判定用笼锁荧光素标记的细胞的特性的步骤；通过仅向具有预定特性的靶细胞照射光来激活标记于靶细胞的所述笼锁荧光素的步骤；及使细胞与抗荧光素抗体进行接触，并基于所述抗体与所述激活的笼锁荧光素间的相互作用来仅从所述细胞中分离出所述靶细胞的步骤。
作为上述细胞分离方法的一个变形的例子，本发明还提供了一种细胞分离方法，其包括：判定用笼锁化合物标记的细胞的特性的步骤；通过仅向没有预定特性的非靶细胞照射光来激活标记于非靶细胞的所述笼锁化合物的步骤；及使细胞与对所述激活的笼锁化合物有亲和力的物质进行接触，并基于所述物质与所述激活的笼锁化合物之间的相互作用，来仅从所述细胞中分离除去所述非靶细胞，从而获得靶细胞的步骤。
在这些方法中，作为所述对激活的笼锁化合物有亲和力的物质，使用具有如下所述的亲和力的物质，所述亲和力在光解离性保护基从所述笼锁化合物解离时表现出来。
作为上述两种细胞分离方法的一个变形的例子，本发明还提供了一种细胞分离方法，其包括：判定用笼锁化合物标记的细胞的特性的步骤；通过仅向具有预定特性的非靶细胞照射光来激活标记于非靶细胞的所述笼锁化合物的步骤；及使细胞与对非激活的笼锁化合物有亲和力的物质进行接触，并基于所述物质与所述非激活的笼锁化合物之间的相互作用来仅从所述细胞中分离靶细胞的步骤。
或者，本发明提供了一种细胞分离方法，其包括：判定用笼锁化合物标记的细胞的特性的步骤；通过仅向具有预定特性的靶细胞照射光来激活标记于靶细胞的所述笼锁化合物的步骤；及使细胞与对非激活的笼锁化合物有亲和力的物质进行接触，并基于所述物质与所述非激活的笼锁化合物之间的相互作用来仅从所述细胞中分离除去所述非靶细胞，从而获得靶细胞的步骤。
在这些方法中，作为所述对非激活的笼锁化合物有亲和力的物质，使用具有如下所述的亲和力的物质，所述亲和力在所述笼锁化合物从光解离性保护基解离时丧失。
依照本发明的细胞分离方法可以进一步包括用笼锁化合物标记细胞的步骤。
在本发明中，“笼锁化合物”指其活性位点受到光解离性(光降解性)保护基保护、当光解离性保护基通过光照射从活性位点解离时由无活性状态转换成活性状态的化合物。另外，在本发明中，“笼锁型化合物”指其活性位点被光解离性保护基保护的无活性笼锁化合物，而“解笼锁(uncaged)型化合物”指光解离性保护基由于光照射而解离从而变成了活性状态的笼锁化合物。
此外，在本发明中，笼锁化合物的“活性状态”指笼锁化合物可以与“对激活的笼锁化合物具有亲和力的物质”相互作用的状态。与此相反，“无活性状态”指笼锁化合物不能与该物质相互作用的状态。即，“对激活的笼锁化合物具有亲和力的物质”仅对“解笼锁型化合物”具有亲和力，而对“笼锁型化合物”不展现出亲和力。另一方面，“对非激活的笼锁化合物具有亲和力的物质”仅对“笼锁型化合物”具有亲和力，而对“解笼锁型化合物”不展现出亲和力。
依照本发明，提供了一种细胞分离方法，其在不使用具有复杂结构的装置的情况下抑制对细胞的物理损伤，而且使细胞分离能够通过定量分析和多参数分析来实施及使细胞分离能够使用Hoechst染色等作为指标来实施。
附图简述
图1是显示依照本发明的细胞分离方法的程序的流程图。
图2是显示依照本发明的第一个实施方案的细胞分离方法的程序的示意图。
图3是显示依照本发明的第一个实施方案的细胞分离方法的程序的示意图。
图4是显示依照本发明的第二个实施方案的细胞分离方法的程序的示意图。
图5是显示依照本发明的第二个实施方案的细胞分离方法的程序的示意图。
符号说明
3：抗体
4：柱
5：对解笼锁型化合物22有亲和力的物质(链霉抗生物素蛋白、抗荧光素抗体)
6：磁性物质
7：磁体
11：靶细胞
12：非靶细胞
21：笼锁型化合物(笼锁型生物素、笼锁型荧光素)
22：解笼锁型化合物(解笼锁型生物素、解笼锁型荧光素)
D：容器
F1、F2：激光束
发明详述
在下文中将参照附图来描述本发明的优选实施方案。虽然如下描述的实施方案例示了本发明的代表性实施方案的例子，但是本发明的范围不受实施方案狭窄地解释。将以下列次序进行描述。
1.使用笼锁生物素的细胞分离
(1)笼锁化合物的标记(步骤S1)
(2)荧光物质标记(步骤S2)和特性判定(步骤S3)
(3)解笼锁(步骤S4)
(4)分离(步骤S5)
2.使用笼锁荧光素的细胞分离
(1)笼锁化合物的标记(步骤S1)
(2)荧光物质标记(步骤S2)和特性判定(步骤S3)
(3)解笼锁(步骤S4)
(4)分离(步骤S5)
1.使用笼锁生物素的细胞分离
图1是显示依照本发明的细胞分离方法的程序的流程图。图2和图3是显示依照本发明的第一个实施方案的细胞分离方法的程序的示意图。在下文中，参照图1至3来描述依照第一个实施方案的细胞分离方法的程序。
(1)笼锁化合物标记(步骤S1)
在图1中，以符号S1标示的“笼锁化合物标记步骤”是用笼锁化合物标记细胞的步骤(参见图2(A))。在此步骤中，用笼锁化合物标记包含要分离的靶细胞的所有细胞。
可以通过使用例如结合笼锁化合物的抗体来用笼锁化合物标记细胞。在此情形中，使用这样的抗体：其以存在于包括靶细胞在内的所有细胞的表面上的物质作为抗原。存在于所有细胞表面上的物质的例子包括细胞表面上普遍表达的细胞膜蛋白、和细胞表面上普遍存在的糖链及脂质等。
可以通过使用例如结合笼锁化合物的凝集素来用笼锁化合物标记细胞。在此情况中，使用这样的凝集素，其能结合普遍存在于包括靶细胞在内的所有细胞的表面上的糖链。另外，用笼锁化合物标记细胞的方法没有特别限制，可以使用任何方法，只要所述方法使细胞能够直接或间接地结合笼锁化合物即可。
作为标记细胞的笼锁化合物，例如可以使用笼锁生物素或笼锁荧光素等。作为笼锁化合物，笼锁核苷酸、笼锁肽、笼锁钙螯合剂等是可用的，并且已经有人报告了包括核酸、蛋白质、脂质等笼锁化合物(参见“Biologicallyactive molecules with a“light switch”.”Angew Chem Int Ed Engl.2006年7月24日；45(30)：4900-21)。在本发明中，可以使用任何上述笼锁化合物，没有任何特定限制，只要可以实现本发明的目的。
图2(A)显示了在笼锁化合物标记步骤S1中使用抗体3用笼锁型化合物21标记靶细胞11和非靶细胞12的情况。下面，在本实施方案中，以使用笼锁生物素作为笼锁型化合物21的情况为例加以说明。作为笼锁生物素，有可能使用MeNPOC-生物素、氢醌-生物素等。下面，在本实施方案中，笼锁型化合物21指“笼锁型生物素21”。
(2)荧光物质标记(步骤S2)和特性判定(步骤S3)
在图1中，以符号S3标示的“特性判定步骤”是判定已经用笼锁化合物标记的细胞的特性的步骤(参见图2(B))。在此步骤中，实施已经用笼锁型生物素21标记的细胞的光学特性的检测和判定。
可以使用例如公知的流式细胞仪来检测细胞的光学特性。具体地，使包含靶细胞11和非靶细胞12的样品溶液流过流动池，接着进行激光束F1照射，由此检测从细胞产生的要测量的光。作为要测量的光，可以使用前散射光、侧散射光、瑞利散射、米氏散射等散射光，以及荧光等。将要测量的检测光转化成电信号，并基于电信号来判定每个细胞的特性。
在通过检测从细胞照射的荧光来判定细胞的光学特性时，可以用荧光标记抗体来标记靶细胞11(或非靶细胞12)，之后进行特性判定步骤S3。在图1中，以符号S2标示的“荧光物质标记步骤”是在分离表达预定细胞表面抗原的靶细胞11的情形中，用与该抗原特异性结合的荧光标记抗体来对靶细胞11进行标记的步骤。可以使用与常规的FACS的细胞分离方法相同的步骤实施荧光物质标记步骤S2。此外，可以与笼锁化合物标记步骤S1同时或在笼锁化合物标记步骤S1前实施荧光物质标记步骤S2。
在本实施方案中，对细胞特性是进行光学检测并判定；然而，可以使用例如电学或磁学检测手段来实施细胞特性的检测和判定。在电学或磁学检测细胞特性时，将微电极布置于流动池中，从而测量流过流动池的细胞电阻值、电容值、电感值、阻抗、电极间电场的变化值、或者磁化、磁界变化、磁场变化等。在此情况下，基于细胞的电学或磁学特性来分离细胞。
(3)解笼锁(步骤S4)
在图1中，以符号S4标示的“解笼锁步骤”是通过仅向具有预定特性的靶细胞照射光来激活标记靶细胞的笼锁化合物的步骤(参见图2(C))。在此步骤中，将激光束F2照射到在特性判定步骤S3中已经被判定为具有预定特性的靶细胞11，由此激活标记的笼锁型生物素21。
作为用于激活笼锁化合物的激光束F2，使用具有适合于解离保护笼锁化合物的活性位点的光解离性保护基的波长和强度的激光束。作为激光光源，例如可以使用与公知的流式细胞仪中提供的上述激光束F1的同样的光源，诸如汞灯、氙气灯和各种激光光源(固相激光、气体激光、和半导体激光)。作为激光光源，可以合适地使用小型但是能高输出的巨脉冲激光。
用于检测细胞的光学特性的激光束F1和用于激活笼锁化合物的激光束F2由不同光学系统或相同光学系统构成。另外，可以在不同时机或在基本上相同的时间将激光束F1和F2照射到靶细胞11。在本文中，“基本上相同的时间”意为在流动池中的相同位置处实施激光束F1向靶细胞11和非靶细胞12的照射及激光束F2向已经判定为具有预定特性的靶细胞11的照射。通过根据判定细胞特性所需要的时间来适当地调节流动池中的细胞流速，有可能在基本上相同的时间实施激光束F1和激光束F2的照射。
在照射激光束F2时，由于光解离性保护基从活性位点解离，标记于靶细胞11的笼锁型生物素21从无活性状态转换成活性状态。即，如图2(C)中所显示的，笼锁型生物素21变成“解笼锁型生物素22”。另一方面，因为激光束F2不照射到非靶细胞12，所以标记非靶细胞12的笼锁型生物素21不被激活，而且不发生变化。
图2(D)是示意性显示在解笼锁步骤S4后已经从流动池收集的靶细胞11和非靶细胞12的视图。如该图中所显示的，解笼锁型生物素22已经标记于靶细胞11，并且笼锁型生物素21已经标记于非靶细胞12。
(4)分离(步骤S5)
在图1中，以符号S5标示的“分离步骤”是使细胞与对激活的笼锁化合物有亲和力的物质接触，并基于该物质与激活的笼锁化合物之间的相互作用来仅从细胞中分离靶细胞的步骤(参见图3)。在此步骤中，使经解笼锁型生物素22标记的靶细胞11与对解笼锁型生物素22具有亲和力的链霉抗生物素蛋白5接触。此后，基于解笼锁型生物素22与链霉抗生物素蛋白5之间的相互作用来分离靶细胞11。
具体地，首先，如图3(A)中所显示的，使从流动池收集的靶细胞11和非靶细胞12流过固相化(made into a solid phase)有链霉抗生物素蛋白5的柱4。由于解笼锁型生物素22与链霉抗生物素蛋白5之间的相互作用，经解笼锁型生物素22标记的靶细胞11被保留在柱4中，如图3(B)中所显示的。另一方面，经笼锁型生物素21标记的非靶细胞12不保留在柱4中而通过柱4。由此，能够分离靶细胞11与非靶细胞12。靶细胞11不必通过解笼锁型生物素22与链霉抗生物素蛋白5之间的相互作用而完全捕获并保留在柱4中，只要通过与链霉抗生物素蛋白5之间的相互作用，使靶细胞11和不与链霉抗生物素蛋白5发生相互作用而通过的非靶细胞12之间，在通过柱4的时间上有差异即可。
这里，已经描述了在解笼锁步骤S4中，将激光束F2照射到靶细胞11，将靶细胞11保留在柱4中从而被分离的情形。然而，在依照本实施方案的细胞分离方法中，在解笼锁步骤S4中将激光束F2照射到非靶细胞12也是可以的。在此情况中，由于激活的解笼锁型生物素22与链霉抗生物素蛋白5之间的相互作用，非靶细胞12被保留在柱4中，从而被分离。这样，被笼锁型生物素21标记的靶细胞11照原样通过柱4，并被收集。
本在实施方案中，作为柱4，使用的是已经固相化了链霉抗生物素蛋白的柱。然而，可以使用任何物质作为固相化到柱4中的物质，只要该物质对解笼锁型生物素22具有亲和力即可。此类物质的例子包括抗生物素抗体。在使用其他化合物例如笼锁荧光素等作为笼锁化合物时，将对解笼锁型化合物具有亲和力的物质例如抗荧光素抗体固相化到柱4中。
如上文所描述的，依照本实施方案的细胞分离方法，通过使用常规的流式细胞手段来实施特性判定步骤S3，可以定量、多参数地分析细胞的光学特性。作为分析的结果，可以仅激活已经判定为具有预定特性的靶细胞的笼锁化合物，并从而分离靶细胞。依照本实施方案的细胞分离方法，可以无需使用具有流体系统和分选系统的结构复杂的FACS而分离靶细胞。
在依照本实施方案的细胞分离方法中，通过在从流动池收集细胞后使用柱4来实施分离步骤S5，有可能防止伴随液滴形成的对细胞的物理损伤，而这是使用FACS进行分离的问题之一。此外，在通过FACS分离有风险(诸如有感染之虞)的细胞时，液滴形成过程中产生的气溶胶会引起污染问题，然而在依照本实施方案的细胞分离方法中，没有关于污染的担忧。
2.使用笼锁荧光素的细胞分离
图4和图5是显示依照本发明的第二个实施方案的细胞分离方法的顺序的示意图。在依照第一个实施方案的方法中，在流动池中实施特性判定步骤S3和解笼锁步骤S4。与此相反，依照本实施方案的细胞分离方法的特征在于依靠使用显微镜的成像技术来实施特性判定步骤S3和解笼锁步骤S4。
(1)笼锁化合物标记(步骤S1)
图4(A)示意性显示了笼锁化合物标记步骤S1，其中用笼锁化合物标记容纳于容器D诸如培养皿(Petri dish)中的靶细胞11和非靶细胞12。在笼锁化合物标记步骤S1中，用笼锁化合物标记包括要分离的靶细胞在内的所有细胞。
如第一个实施方案中所描述的，用笼锁化合物标记细胞可以通过使用例如结合笼锁化合物的抗体，或结合笼锁化合物的凝集素来进行。细胞可以是悬浮细胞或贴壁细胞。通过向已经培养了这些细胞的容器D中的培养基中添加抗体等，或者将培养基替换成合适的缓冲溶液后添加抗体溶液，笼锁化合物直接或间接地结合细胞。
图4(A)显示了通过在笼锁化合物标记步骤S1中使用抗体3来用笼锁型化合物21标记靶细胞11和非靶细胞12的情况。在下文中，在本实施方案中，以使用笼锁荧光素作为笼锁型化合物21的情况为例子来进行说明。作为笼锁荧光素，例如，可以使用通过将5-羧基甲氧基-2-硝基苄基(CMNB)添加到荧光素而获得的笼锁荧光素。在下文中，在本实施方案中，笼锁型化合物21指“笼锁型荧光素21”。
(2)荧光物质标记(步骤S2)和特性判定(步骤S3)
图4(B)示意性显示了特性判定步骤S3，其中检测并判定用笼锁型荧光素21标记的细胞的光学特性。
在本实施方案中，通过例如使用显微镜的成像技术来检测细胞的光学特性。具体地，例如通过使用作为照射机构的激光束F1和作为成像机构的显微镜(其包括区域成像装置诸如CCD或CMOS装置)，检测由于激光束F1的照射而从细胞产生的荧光，并将检测到的荧光转化成电信号。基于电信号来判定每个细胞的特性。在此情况中，在特性判定步骤S3之前，可以以与上文所描述(参见荧光物质标记步骤S2)的那样，先用荧光标记抗体来标记靶细胞11(或非靶细胞12)。
在本文中是通过检测荧光来判定细胞的特性。然而，例如也可以基于通过上述成像机构获得的细胞形状来检测并判定细胞的特性。
(3)解笼锁(步骤S4)
图4(C)示意性显示了解笼锁步骤S4，其中将激光束F2照射到在特性判定步骤S3中已经判定为具有预定特性的靶细胞11，由此激活标记的笼锁型荧光素21。
激光束F2的照射机构在显微镜中作为不同或相同的光学系统提供。作为用于激活笼锁化合物的激光束F2，使用具有适合于解离保护笼锁化合物的活性位点的光解离性保护基的波长和强度的激光束。另外，可以在不同时间或在基本上相同的时间将激光束F1和F2照射到靶细胞11。
在照射激光束F2时，由于光解离性保护基从活性位点解离，标记于靶细胞11的笼锁型荧光素21从无活性状态变换成活性状态。即，如图4(C)中所显示的，笼锁型荧光素21变成“解笼锁型荧光素22”。另一方面，因为激光束F2不照射到非靶细胞12，所以标记非靶细胞12的笼锁型荧光素21不被激活，而不发生改变。
图4(D)是示意性显示解笼锁步骤S4后的靶细胞11和非靶细胞12的视图。如该图中所显示的，解笼锁型荧光素22已经标记于靶细胞11，而笼锁型荧光素21已经标记于非靶细胞12。
(4)分离(步骤S5)
图5示意性显示了分离步骤S5，其中使细胞与对所述激活的笼锁化合物有亲和力的物质进行接触，并基于所述物质与所述激活的笼锁化合物之间的相互作用来仅从所述细胞中分离出所述靶细胞。在此步骤中，使经解笼锁型荧光素22标记的靶细胞11与对解笼锁型荧光素22有亲和力的抗荧光素抗体5进行接触。基于解笼锁型荧光素22与抗荧光素抗体5之间的相互作用，分离靶细胞11。
具体地，首先，将结合磁性物质6的抗荧光素抗体5添加至已经从容器D诸如培养皿收集的靶细胞11和非靶细胞12。抗荧光素抗体5特异性结合标记靶细胞11的解笼锁型荧光素22，由此用磁性物质6磁性标记靶细胞11(参见图5(A))。另一方面，因为抗荧光素抗体5不结合用笼锁型荧光素21标记的非靶细胞12，所以未磁性标记非靶细胞12。
在下文中，如图5(B)中所显示的，使靶细胞11和非靶细胞12流过设置有磁体7的柱4。由于磁性物质6与磁体7之间的磁性吸引力而将经磁性标记的靶细胞11保留在柱4中(参见图5(C))。另一方面，未经磁性标记的非靶细胞不被保留在柱4中而通过。由此可以分离靶细胞11与非靶细胞12。靶细胞11通过磁性物质6与磁体7之间的磁性吸引力吸附到柱4的内壁上而完全保留在其中不是必要的，只要在该磁性吸引力的作用下靶细胞11与非靶细胞12通过柱的时间产生差异即可。
这里，已经描述了在解笼锁步骤S4中，将激光束F2照射到靶细胞11，并将靶细胞11保留在柱4中，从而加以分离的情况。然而，在依照本实施方案的细胞分离方法中，还有可能在解笼锁步骤S4中将激光束F2照射到非靶细胞12。在此情况中，由于激活的解笼锁型荧光素22结合抗荧光素抗体5，非靶细胞12被磁性标记，非靶细胞12保留在柱4中，从而被分离。这样，未被磁性标记的靶细胞11通过柱4，从而被分离。
在本实施方案中使用的是笼锁荧光素作为笼锁化合物，但是笼锁化合物不限于笼锁荧光素。在使用与笼锁荧光素不同的笼锁化合物时，使用特异性结合解笼锁型化合物的抗体代替抗荧光素抗体5来磁性标记靶细胞11。
如上文所描述的，依照本实施方案的细胞分离方法，通过使用成像技术来实施特性判定步骤S3，可以定量、多参数地分析细胞的光学特性。作为该分析的结果，可以仅激活已经判定为具有预定特性的靶细胞的笼锁化合物，并分离靶细胞。另外，依照本实施方案的细胞分离方法，可以无需使用具有流体系统和分选系统的结构复杂的FACS而分离靶细胞。
在依照本实施方案的细胞分离方法中，通过在从容器D诸如培养皿收集细胞后使用柱4来实施分离步骤S5，有可能防止伴随液滴形成的对细胞的物理损伤，而这是使用FACS进行分离的问题之一。此外，在通过FACS分离具有风险(诸如关于感染的担忧)的细胞时，此外，在通过FACS分离有风险(诸如有感染之虞)的细胞时，液滴形成过程中产生的气溶胶会引起污染问题，然而，依照本实施方案的细胞分离方法没有关于污染的担忧。
在如上文所描述的依照第一个和第二个实施方案的细胞分离方法中，已经描述了通过使用仅对解笼锁型化合物而不对笼锁型化合物有特异性亲和力的物质(链霉抗生物素蛋白5或抗荧光素抗体5)来分离靶细胞或非靶细胞的例子。然而，在依照本发明的细胞分离方法中当然还可能通过使用仅对笼锁型化合物而不对解笼锁型化合物有特异性亲和力的物质来分离靶细胞或非靶细胞。
例如，作为抗荧光素抗体，制备不结合解笼锁型荧光素，但仅结合笼锁型荧光素的抗体。随后，在解笼锁步骤S4中激活标记于非靶细胞的笼锁型荧光素，而靶细胞保持被解笼锁型荧光素标记。这样，可以仅将靶细胞保留在固相化有抗荧光素抗体的柱中，并分离靶细胞。
工业实用性
依照本发明的细胞分离方法可以广泛用于血细胞辨别、基因重组细胞的纯化、对细胞表型变化的分析等。依照本发明的细胞分离方法可以抑制对细胞的物理损伤，而且使得借助定量或多参数地分析的细胞分离成为可能。因此，该方法特别可用于血液学或干细胞研究领域。
Claims (9)
1.一种细胞分离方法，其包括：
判定用笼锁化合物标记的细胞的特性的步骤；
通过仅向具有预定特性的靶细胞照射光来激活标记于靶细胞的所述笼锁化合物的步骤；及
使细胞与对所述激活的笼锁化合物有亲和力的物质进行接触，并基于所述物质与所述激活的笼锁化合物之间的相互作用来仅从所述细胞中分离出靶细胞的步骤。
2.一种细胞分离方法，其包括：
判定用笼锁化合物标记的细胞的特性的步骤；
通过仅向没有预定特性的非靶细胞照射光来激活标记于非靶细胞的所述笼锁化合物的步骤；及
使细胞与对所述激活的笼锁化合物有亲和力的物质进行接触，并经由基于所述物质与所述激活的笼锁化合物之间的相互作用来仅从所述细胞中分离除去所述非靶细胞，从而获得靶细胞的步骤。
3.依照权利要求1或2的细胞分离方法，其中，使用在光解离性保护基从所述笼锁化合物解离时表现出所述亲和力的物质，作为所述对激活的笼锁化合物有亲和力的物质。
4.一种细胞分离方法，其包括：
判定用笼锁化合物标记的细胞的特性的步骤；
通过仅向具有预定特性的非靶细胞照射光来激活标记于非靶细胞的所述笼锁化合物的步骤；及
使细胞与对非激活的笼锁化合物有亲和力的物质进行接触，并基于所述物质与所述非激活的笼锁化合物之间的相互作用来仅从所述细胞中分离出靶细胞的步骤。
5.一种细胞分离方法，其包括：
判定用笼锁化合物标记的细胞的特性的步骤；
通过仅向具有预定特性的靶细胞照射光来激活标记于靶细胞的所述笼锁化合物的步骤；及
使细胞与对非激活的笼锁化合物有亲和力的物质进行接触，并基于所述物质与所述非激活的笼锁化合物之间的相互作用来仅从所述细胞分离除去所述非靶细胞，从而获得靶细胞的步骤。
6.依照权利要求4或5的细胞分离方法，其中，使用在光解离性保护基从所述笼锁化合物解离时所述亲和力丧失的物质，作为所述对非激活的笼锁化合物有亲和力的物质。
7.依照权利要求3或6的细胞分离方法，其进一步包括：用笼锁化合物标记细胞的步骤。
8.依照权利要求1的细胞分离方法，其包括：
判定用笼锁生物素标记的细胞的特性的步骤；
通过仅向具有预定特性的靶细胞照射光来激活标记靶细胞的所述笼锁生物素的步骤；及
使细胞与链霉抗生物素蛋白进行接触，并基于所述链霉抗生物素蛋白与所述激活的笼锁生物素间的相互作用来仅从所述细胞中分离出所述靶细胞的步骤。
9.依照权利要求1的细胞分离方法，其包括：
判定用笼锁荧光素标记的细胞的特性的步骤；
通过仅向具有预定特性的靶细胞照射光来激活标记于靶细胞的所述笼锁荧光素的步骤；及
使细胞与抗荧光素抗体进行接触，并基于所述抗体与所述激活的笼锁荧光素间的相互作用来仅从所述细胞中分离出所述靶细胞的步骤。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120201 |