CN104849111B - 基于顺序注射和微流控技术的梯度微液滴阵列的形成方法 - Google Patents

基于顺序注射和微流控技术的梯度微液滴阵列的形成方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于顺序注射和微流控技术的梯度微液滴阵列的形成方法,包括如下步骤:步骤一、利用毛细管吸取稀释液和样品中的一种;步骤二、继续利用毛细管吸取稀释液和试样I中的另一种,保证稀释液和样品直接接触,形成具有轴向浓度梯度的试样区带;步骤三、利用毛细管将所述试样区带点入微孔阵列芯片的特定区域中,在微孔阵列芯片上形成具有不同浓度的试样液滴阵列。本发明具有浓度梯度生成通量高、浓度信息丰富、自动化程度高、样品消耗量低、装置与原理简单等优点。可用于高通量的药物筛选、化合物毒性测定、蛋白质结晶条件筛选、催化剂筛选、酶动力学分析等生化分析和筛选中。

Description

基于顺序注射和微流控技术的梯度微液滴阵列的形成方法
技术领域
本发明涉及的领域为微流控液滴分析与筛选领域,特别涉及一种基于顺序注射和微流控液滴技术的梯度微液滴阵列的形成方法。
背景技术
高通量筛选技术(High Throughput Screening,HTS)利用计算机和自动化机器人技术来完成生化分析所需的复杂液体操作、高灵敏度检测和数据处理,可实现超过10,000样/天的分析通量。由于其强大的筛选和分析功能,高通量筛选技术的应用范围已经从新药研发扩展到生物学、医学、化学等多个科学领域,如结构生物学、组合化学、合成生物学、临床筛查以及各种组学研究中需要大规模生化分析实验的场合,成为这些领域中关键的研究工具。然而,高通量筛选技术一直受到大量假阴性以及假阳性筛选结果的困扰。这是由于,为了提高筛选通量,高通量筛选一般只在单个化合物浓度或配比条件下测定其生物效应。这就导致,一方面,由于大部分物质的生物效应只有在特定的浓度区间才会显现出来,在测定浓度下无活性的化合物便有可能成为假阴性的结果;另一方面,生物分子与配体之间存在复杂的非特异性相互作用,单浓度测定容易带来假阳性的筛选结果。尽管假阳性结果可通过复杂的后续验证实验进行排除,假阴性结果却无法鉴别。
定量高通量筛选(Quantitative High Throughput Screening,qHTS)是一种新型的高通量筛选技术(Inglese J,Auld D S,Jadhav A,et.al.,P.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2006,103,11473)。与传统HTS采用的单浓度测定不同,定量高通量筛选在样品的初筛阶段便测定其在横跨3-5个数量级浓度下的生物活性,从而得到每一种化合物对应的剂量-反应曲线(Dose-Response Curve)。通过对化合物剂量-反应曲线的分析,可理解其产生生物效应的机理,从而有效避免了假阳性和假阴性的问题。并且,在某些应用场合,定量高通量筛选则可直接得到最优化的结果及其浓度条件,从而省去了后续的浓度优化实验。然而,尽管qHTS技术在理念上具有较大的先进性,其在实际应用中却存在挑战,主要体现在:1)qHTS需要通过逐级稀释的方法制备一系列浓度的化合物溶液,即使采用自动化机器人技术,对于超过十万甚至百万样本数量化合物库的筛选系统来说过于费时费力,其筛选通量也大大低于传统HTS方法;2)与传统单点测定相比,qHTS的测定反应数目成比例增加,相应的试样消耗也成比例增加。对于当前众多新型的筛选靶标来说,如原代细胞和膜蛋白等难以获得的生物样品,其筛选成本过高;3)由于反应数目的增加,导致HTS常用的单块96或384孔板一次只能筛选几种或几十种样品,难以满足筛选的需要。
微流控液滴技术(Droplet-based microfluidics)通过对微加工通道中多相流体的控制,实现大批量皮升至纳升级体积的油包水型液滴反应器的高速生成、混合、反应、以及分析鉴定,从而极大降低生化筛选中的试样消耗,并提高通量。因此,液滴技术有可能解决当前定量高通量筛选面临的筛选通量低、耗样量大、装置复杂等问题,成为一种通用型定量高通量筛选技术。
为了在液滴系统内实现定量高通量筛选,目前主要有三种方法可以自动化的生成具有不同试样浓度的液滴,分别为配比法、层流扩散法、和流动注射梯度法。在配比法中(Song H.,Ismagilov R.F.,J.Am.Chem.Soc.2003.125,14613),样品、试剂、和稀释液分别由三条通道引入,并在液滴生成之前完成汇流。通过调节三条通道的相对流速,实现对液滴内样品浓度的动态调节。在层流扩散法中(Damean N.,Olguin L.F.,Hollfelder F.,et.al.,Lab Chip.2009.9,1707),样品和稀释液在通道中层流流动,由于分子扩散,在与流动方向正交方向上形成样品的浓度梯度,最后通过分流的方法形成不同浓度的样品液滴。流动注射梯度法的主要原理是,在连续流动的载流中注入样品,由于对流和分子扩散的作用下形成具有连续轴向浓度梯度的样品区带(Cai L F,Zhu Y,Du G S,et.al.,Anal.Chem.,2012,84,446;Miller O J,El Harrak A,Mangeat T,et.al.,P.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2012,109,378;方群,蔡龙飞,祝莹,一种微流控浓度梯度液滴生成芯片及生成装置及其应用,中国发明专利,申请号:201110347232.0)。该样品区带与酶、底物等试剂混合后,被油相间隔形成具有不同样品浓度的液滴反应器阵列。然而,上述这些方法均存在较大的局限性,主要体现在:1)连续流动系统比较适用于分子水平的筛选体系,比如酶抑制筛选等,却难以用于需要静态培养的筛选体系,比如细胞水平筛选和蛋白质结晶条件筛选;2)连续流系统的检测主要依靠激光诱导荧光等终点检测方法,限制了其在需要实时监测和成像分析筛选系统中的应用;3)当前的系统中,酶和底物等试剂溶液连续注入反应通道中,形成大量空反应液滴,造成了额外的试样浪费;4)连续流液滴系统中,浓度梯度的形成和液滴的生成容易受到液体粘度、温度等因素的影响,导致筛选系统的重现性不高。
在之前的研究中,申请人及其所在的研究组发展了一种高密度液滴阵列筛选方法(方群,祝莹,张云霞,一种具有皮升级精度的自动化微液滴阵列筛选系统的使用方法,中国发明专利,申请号:201210589055.1;Zhu Y,Zhang Y X,Cai L F,Fang Q,Anal.Chem.,2013,85,6723)。该方法的原理是,利用高精度的注射泵结合毛细管取样探针完成皮升级液滴的精确量取,利用二维或三维机械系统完成自动化的样品管和试剂管的快速切换,将微量的试样抽取至毛细管取样探针中形成液滴。然后将毛细管探针移动至微流控芯片的微孔上方,将液滴逐个点样至在芯片微孔中进行长时间静态反应和下一步检测。液滴阵列筛选方法具有液滴体积可控性强、液滴密度高、容易对液滴组成进行标记等优点,具有较强的通用性。然而,为了形成具有不同浓度的样品液滴,仍然需要采用模拟手工操作的逐级稀释的方法制备一系列浓度的样品溶液,然后逐个点样至微孔阵列中。
发明内容
本发明提供了一种基于顺序注射和微流控技术的梯度微液滴阵列的形成方法,该方法在样品取样的过程中自动化形成具有浓度梯度样品区带,然后将样品区带点样至高密度的微孔阵列芯片上,形成具有宽范围浓度梯度的样品液滴,本发明具有浓度梯度生成通量高、浓度信息丰富、自动化程度高、样品消耗量低、装置与原理简单等优点。可用于高通量的药物筛选、化合物毒性测定、蛋白质结晶条件筛选、催化剂筛选、酶动力学分析等生化分析和筛选中。
一种基于顺序注射和微流控技术的梯度微液滴阵列的形成方法,包括如下步骤:
步骤一、利用毛细管吸取稀释液和试样I中的一种;
步骤二、继续利用毛细管吸取稀释液和试样I中的另一种,保证稀释液和试样I直接接触,形成具有轴向浓度梯度的试样区带;
步骤三、利用毛细管将所述试样区带点入微孔阵列芯片的特定区域中,在微孔阵列芯片上形成具有不同浓度的试样液滴阵列。
本发明中,提到的试样是指样品或试剂,在本领域,样品一般是指被分析、测定和筛选的目标物;试剂指为实现对样品的分析、测定和筛选所需使用的化学和生物试剂及其溶液。
本发明使用的装置为基于毛细管的液滴操纵系统,该系统可包括至少一根毛细管、至少一套具有抽取和推出的双向液体驱动能力的驱动系统、至少一个加工有多个微孔或多个特定区域的微孔阵列芯片、多个承载样品,或试剂,或稀释液的储存管和至少一套平移台组成,所述的毛细管的一端与驱动系统相连通,毛细管的另一端作为取样口,即毛细管抽取和推出液体的进出口,微孔阵列芯片和储存管固定于平移台上,或者毛细管的取样口端固定于平移台上。
利用本发明的方法,既可以形成单边浓度梯度的试样液滴阵列,也可是形成双边浓度梯度的试样液滴阵列。作为优选,当在步骤一中先吸取稀释液,在步骤二中继续吸取试样,吸取完成后再吸取稀释液;形成具有轴向双边浓度梯度的试样区带。具体步骤为:
1)移动平移台,使毛细管取样探针的取样口插入装有稀释液的储存管中,利用驱动系统抽取一定体积的稀释液至毛细管通道内;
2)移动平移台,使毛细管取样探针的取样口脱离装有稀释液的储存管;
3)移动平移台,使毛细管的取样口插入装样品或试剂(试样I)的储存管中,利用驱动系统抽取一定体积的样品或者试剂至毛细管通道内,完成样品或试剂的取样操作;
4)移动平移台,使毛细管取样探针的取样口脱离装有样品或者试剂的储存管;
5)移动平移台,再次使毛细管取样探针的取样口插入装有稀释液的储存管中,利用驱动系统抽取一定体积的稀释液至毛细管通道内;在毛细管的通道内,顺序引入的样品或者试剂的区带与流动的稀释液混合,扩散,展宽,形成具有轴向浓度梯度的样品或试剂的区带;
6)移动平移台,使毛细管的取样口脱离装有稀释液的储存管;
7)移动平移台,使毛细管的取样口移入微孔阵列芯片的微孔上方,利用驱动系统将毛细管通道内的样品或试剂区带溶液推出毛细管取样口,按一定的体积将所述溶液逐次点入至微孔阵列芯片上的不同微孔或特定区域中,形成多个液滴,即在微孔阵列芯片上形成具有不同浓度样品或试剂溶液的液滴阵列。
在上述技术方案的基础上,要得到单边浓度梯度的液滴阵列,可以选择如下方案的一种,例如一个优选的梯度微液滴阵列的形成方法是:实施步骤跳过步骤1)和2),直接从步骤3开始,然后顺序执行步骤4)、5)、6)和7),实现单边浓度梯度微液滴阵列的生成。另外一个优选方案是,首先顺序执行步骤1)、2)、3)、4),然后跳过步骤5)和6),再执行步骤7),实现单边浓度梯度微液滴阵列的生成。
本发明中,所述的毛细管材质为石英、或者玻璃、或者金属、或者高分子聚合物;毛细管内径在1微米至5毫米范围内;毛细管管壁厚度在1微米至5毫米范围内;毛细管长度在1毫米至10米范围内;作为优选,采用对毛细管通道的表面进行硅烷化、或者氟烷化、或者聚合物涂层、或者在稀释液中加入动态涂层添加剂的方法对毛细管通道的表面进行钝化处理,以降低表面吸附。
本发明中,作为优选,可采用多根毛细管平行进行的样品或试剂取样、浓度梯度区带的形成和液滴阵列的形成等操作,以提高操作的通量。
本发明中,通过调节双向液体驱动系统抽取和推出液体的流速和时间,控制抽取和推出的稀释液、或样品、或试剂的体积;所述双向液体驱动系统抽取和推出的稀释液、或样品、或试剂的体积范围是100飞升至10毫升;通过改变稀释液抽取体积、样品或试剂的抽取体积、抽取和推出流速、毛细管的内径和长度来调节样品或试剂区带在毛细管通道内形成的浓度梯度的范围。
本发明中,作为优选,步骤一中,毛细管吸取稀释液前,先吸取载流。或者作为进一步优选,在吸取载流后,吸取稀释液或试样I前,再吸取与稀释液或试样I不互溶的气体或者油相,以将液体载流与后续吸入的液体相隔离。
本发明中,微孔阵列芯片上的微孔的深度范围是1微米至5毫米,可容纳液体体积范围是1皮升至100微升;另外一个可选方案是在微孔阵列芯片表面加工具有一定表面积且对液滴具有亲和性的平面区域,一个平面区域的表面积范围是1平方微米至100平方毫米。
本发明中,所述微孔阵列芯片置于湿盒内,或者所述微孔阵列芯片表面覆盖有与液滴不互溶的阻隔层。在进行样品或试剂取样、浓度梯度区带的形成和液滴阵列的形成等操作过程中,将微孔阵列芯片置于高湿度空间(湿盒)内以防止微量液滴的蒸发;另一个优选方案是在微孔阵列芯片上覆盖一层与样品或试剂不互溶的惰性油相,包括矿物油、或者硅油、或者植物油、或者氟油、或者其他类型的油相,油相层的厚度范围为0.1毫米至50毫米。
本发明中,作为优选,包括如下步骤:在所述液滴阵列中的每个液滴中注入试样II,形成液滴反应器,完成样品与试剂的混合、反应,以及后续的分析和筛选。在完成所述的步骤1)至步骤7)的操作形成带有浓度梯度的液滴阵列后,将所述液滴阵列应用于微量化学和生物反应、分析和筛选,当以试样I为样品,试样II为试剂时,其操作步骤是:
a)利用步骤1)至7)方法在微孔阵列芯片上形成具有浓度梯度的多个待反应、或待分析、或待筛选的样品的液滴阵列;
b)在所述液滴阵列中的每个液滴中注入一定体积的试剂,形成液滴反应器,完成样品与试剂的混合、反应,以及后续的分析和筛选。
或者以试样I为试剂,以试样II为样品,将所形成的液滴阵列应用于微量化学和生物反应、分析和筛选时,其又一种操作步骤是:
m)首先在微孔阵列芯片上形成待反应、或待分析、或待筛选的样品液滴阵列;该步骤中,可采用已有的方法点样形成样品液滴阵列;
n)按照上述的操作步骤1)至5),在毛细管的通道内,形成具有轴向浓度梯度的试剂区带;
o)利用驱动系统将毛细管通道内的具有浓度梯度的试剂区带溶液推出毛细管取样口,按一定的体积将所述溶液逐次注入至微孔阵列芯片上的每个样品液滴中,形成液滴反应器,完成试剂与样品的混合、反应、分析和筛选。
作为优选,梯度微液滴阵列的形成过程中,或者预先利用与样品或试剂分子量相同或相似的标准物进行校正。实际试验中,选择可产生荧光、或者吸光度、或者其他可被检测的响应信号的标准物作为模型样品,对所形成的样品或者试剂的液滴阵列中的浓度梯度进行校正;所述的标准物的分子量与待反应、或待分析、或待筛选的样品或者试剂的分子量尽量接近;利用所述的标准物,按照与待反应、或待分析、或待筛选的样品或试剂完全相同的操作步骤生成具有其浓度梯度的液滴阵列,并对液滴内所述标准物的响应信号进行检测;或者将所述的标准物加入在储存管中的待反应、或待分析、或待筛选的样品或试剂溶液,按所述样品或试剂的操作步骤,形成包含有标准物的样品或试剂的浓度梯度的液滴阵列,并对液滴内所述标准物的响应信号进行检测;根据每个液滴内标准物的响应信号分别计算该液滴对应原始标准物溶液的稀释倍数,并以此稀释倍数作为相同操作条件下对应的样品或试剂液滴中样品或试剂的稀释倍数,完成对液滴浓度梯度的校正。
本发明采用的液体驱动系统为具有抽取和推出能力的双向液体驱动系统,包括注射泵、蠕动泵、电渗泵、气压泵。本发明中液滴的检测方法可以采用激光诱导荧光、化学发光、电化学、紫外可见光度、显微成像、质谱等多种方法进行检测。
本发明的优点主要在于:(1)在取样的过程中即完成样品/试剂的浓度梯度形成,操作简单,自动化程度高,通量大;(2)在微孔阵列芯片上形成具有浓度梯度的样品/试剂的液滴阵列,反应和孵育过程静态,具有更好的通用性;(3)利用微液滴进行定量高通量筛选,有效降低了生化筛选的试样消耗,节省了实验成本;(4)浓度梯度可通过调节稀释液体积、驱动流速、样品/试剂进样体积、以及毛细管尺寸等因素进行灵活调节,从而生成横跨1-8个数量级浓度梯度的液滴阵列;(5)形成的浓度梯度微液滴阵列是一种静态的微反应器,对生化反应干扰较低。本发明适用于分子和细胞水平的药物筛选、化合物毒性测定、蛋白质结晶条件筛选、催化剂筛选等各种类型的生化筛选中。
附图说明
图1是基于顺序注射和微流控液滴技术的梯度微液滴阵列的形成方法的原理示意图。
图2是利用顺序注射梯度生成的标准荧光素样品的微液滴阵列图片和对应的曲线图。
图3是利用该方法进行蛋白质结晶条件筛选的操作过程示意图。
图4是基于顺序注射和微流控液滴技术的单边浓度梯度微液滴阵列的形成方法原理示意图。
图5是另外一种基于顺序注射和微流控液滴技术的单边浓度梯度微液滴阵列的形成方法原理示意图。
图6是利用图4所示的方法形成抑制剂的浓度梯度,并进行MMP-9酶的半抑制浓度测定结果图。
图7是利用图4所示的方法形成底物的浓度梯度,并进行MMP-9酶的酶动力学常数测定结果图。
图中:1-毛细管,2-液体驱动系统,3-微孔阵列芯片,4-载流,5-稀释液,6-油相,7-样品/试剂,8-储存管,9-微孔,10-液滴阵列,11-平移台,12-取样口,13-样品/试剂的区带,14-沉淀剂溶液,15-蛋白质溶液,16-结晶反应器。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明:
参照附图,以下将详细描述根据本发明的优选实施例。
实施例1
图1是基于顺序注射和微流控液滴技术的梯度微液滴阵列的形成方法的原理示意图。其具体的操作过程如下:使用毛细管1作为取样探针,将其尾部与液体驱动系统2相连。对毛细管1的取样口12进行拉尖处理来降低取样过程中的交叉污染。对毛细管1的内壁和取样口12的外壁进行氟硅烷化处理来防止样品/试剂在其表面的吸附。在毛细管1中充满低热膨胀系数的液体作为载流4,并完全去除毛细管1和液体驱动系统2中的气泡。在毛细管1的取样口12引入一段与样品/稀释液不互溶的油相6来间隔载流4和稀释液5。将样品/试剂7的储存管和微孔阵列芯片3固定在可三维移动的平移台11上。移动平移台11,使毛细管1取样口12浸入稀释液5的储存管8中定量抽取一定体积的稀释液5进入毛细管1中。再次移动平移台11,使毛细管1的取样口12浸入样品/试剂的储存管8中定量抽取一定体积的样品/试剂7进入毛细管1中。再次移动,使毛细管1取样口12浸入稀释液的储存管8中定量抽取一定体积的稀释液5进入毛细管1中。在抽取稀释液的过程中,毛细管1中的样品/试剂7在稀释液5中扩散形成具有轴向浓度梯度的样品/试剂的区带13。最后,移动平移台11,使毛细管1的取样口12位于微孔9上方。启动液体驱动系统2将毛细管1中的具有浓度梯度的样品/试剂的区带13推出至多个微孔阵列中,形成具有浓度梯度样品/试剂的液滴阵列10。
实施例2
图2是根据图1所述的顺序注射梯度方法,以荧光素钠为模型样品所生成的微液滴阵列荧光图片和对应的曲线图。利用注射泵作为液体驱动装置2,并且在微孔阵列芯片3上覆盖一层矿物油来避免微孔内微量样品的蒸发。启动注射泵,首先在毛细管1中抽取120纳升的50毫摩尔每升硼砂缓冲液作为稀释液,再抽取20纳升的1毫摩尔每升浓度的荧光素钠样品,再抽取60纳升的硼砂缓冲液。在抽取的过程中,荧光素钠在硼砂缓冲液中扩散形成样品区带。然后将毛细管1中的荧光素钠样品区带点样至微孔阵列芯片3上形成液滴阵列10,每个液滴的体积为9纳升,共形成20个液滴。按照以上步骤重复3次,共生成3组液滴阵列。利用荧光成像或者激光诱导荧光检测的方法读取液滴内的荧光强度值。以液滴生成顺序为横坐标,液滴内的荧光强度为纵坐标作图,得到液滴阵列的荧光分布图。采用标准曲线矫正的方法,得到20个液滴的荧光素浓度分布在10纳摩尔每升至70微摩尔每升之间。
实施例3
图3是利用图1所述的顺序注射梯度微液滴阵列方法进行定量高通量蛋白质结晶条件筛选的操作过程示意图。首先在微孔阵列芯片3上覆盖一层矿物油来避免微孔内微量样品的蒸发问题。在沉淀剂溶液的储存管8中抽取一定体积的沉淀剂溶液14,然后推出至微孔9中,每个孔中沉淀剂液滴的体积是2纳升。按照图1所述的方法,依次在毛细管1中抽取50纳升的蛋白质缓冲液、20纳升蛋白质溶液15和50纳升的蛋白质缓冲液,蛋白质溶液15在毛细管中扩散形成具有浓度梯度的蛋白质区带。分别在每个微孔的沉淀剂溶液中注入2纳升的蛋白质区带溶液,混合形成蛋白质结晶反应器16。最后在芯片上覆盖一层透明玻璃片进行密封和长时间的晶体孵育。
实施例4
图4是基于顺序注射和微流控液滴技术的单边浓度梯度微液滴阵列的形成方法原理示意图。其具体的操作过程如下:使用毛细管1作为取样探针,将其尾部与液体驱动系统2相连。对毛细管1的取样口12进行拉尖处理来降低取样过程中的交叉污染。对毛细管1的内壁和取样口12的外壁进行氟硅烷化处理来防止样品/试剂在其表面的吸附。在毛细管1中充满低热膨胀系数的液体作为载流4,并完全去除毛细管1和液体驱动系统2中的气泡。在毛细管1的取样口12引入一段与样品/稀释液不互溶的油相6来间隔载流4和稀释液5。将样品/试剂7的储存管和微孔阵列芯片3固定在可三维移动的平移台11上。移动平移台11,使毛细管1取样口12浸入样品的储存管8中定量抽取一定体积的样品7进入毛细管1中。再次移动,使毛细管1取样口12浸入稀释液的储存管8中定量抽取一定体积的稀释液5进入毛细管1中。在抽取稀释液的过程中,毛细管1中的样品7在稀释液5中扩散形成具有轴向浓度梯度的样品/试剂的区带13。最后,移动平移台11,使毛细管1的取样口12位于微孔9上方。启动液体驱动系统2将毛细管1中的具有浓度梯度的样品/试剂的区带13推出至多个微孔阵列中,形成具有浓度梯度样品的液滴阵列10。
实施例5
图5基于顺序注射和微流控液滴技术形成单边浓度梯度微液滴阵列的另一种形成方法原理示意图。其具体的操作过程如下:使用毛细管1作为取样探针,将其尾部与液体驱动系统2相连。对毛细管1的取样口12进行拉尖处理来降低取样过程中的交叉污染。对毛细管1的内壁和取样口12的外壁进行氟硅烷化处理来防止样品/试剂在其表面的吸附。在毛细管1中充满低热膨胀系数的液体作为载流4,并完全去除毛细管1和液体驱动系统2中的气泡。在毛细管1的取样口12引入一段与样品/稀释液不互溶的油相6来间隔载流4和稀释液5。将样品/试剂7的储存管和微孔阵列芯片3固定在可三维移动的平移台11上。移动平移台11,使毛细管1取样口12浸入稀释液5的储存管8中定量抽取一定体积的稀释液5进入毛细管1中。再次移动平移台11,使毛细管1取样口12浸入样品储存管8中定量抽取一定体积的样品7进入毛细管1中。在抽取样品溶液的过程中,毛细管1中的样品7在稀释液5中扩散形成具有轴向浓度梯度的样品/试剂的区带13。最后,移动平移台11,使毛细管1的取样口12位于微孔9上方。启动液体驱动系统2将毛细管1中的具有浓度梯度的样品/试剂的区带13推出至多个微孔阵列中,形成具有浓度梯度样品/试剂的液滴阵列10。
实施例6
图6是利用图4所述的单边浓度梯度微液滴阵列的形成方法和图3所述的生成组合液滴的方法进行MMP-9酶的半抑制浓度(IC50)的测定结果。首先在微孔阵列芯片3上覆盖2毫米厚度的矿物油来防止微液滴的蒸发。在酶溶液的的存储管8中抽取酶溶液至毛细管1中,然后推出至微孔9中形成酶溶液的液滴阵列,每个液滴的体积是4纳升。清洗毛细管1之后,依次在毛细管1中抽取50纳升的抑制剂Marimastat溶液和50纳升的缓冲液,抑制剂溶液在毛细管中扩散形成具有浓度梯度的抑制剂区带。分别在每个酶溶液微液滴中注入4纳升的抑制剂区带溶液与酶溶液液滴混合。清洗毛细管1之后,在毛细管中吸取一定体积的底物溶液(520MMP FRET Substrate III),再分别注入到每个酶和抑制剂的混合液滴中,进行酶反应。此操作过程分别生成两组阴性和阳性对照的液滴。阴性对照液滴的组成是缓冲液,底物和抑制剂,均为4纳升。阳性对照液滴的组成是酶溶液,底物和缓冲液均为4纳升。通过测定在反应时间在120分钟产物的荧光信号值来表示生成产物的量,数据处理得到信号-对数抑制剂浓度曲线来,从而获得半抑制浓度(IC50)。实验测定得到的Marimastat对MMP-9酶的IC50为3纳摩尔每升,与文献报导的值基本吻合。
实施例7
图7是利用图4所述的单边浓度梯度微液滴阵列的形成方法和图3所述的生成组合液滴的方法进行MMP-9酶的酶动力学常数测定结果。首先在微孔阵列芯片3上覆盖2毫米厚度的矿物油来防止微液滴的蒸发。在酶溶液的存储管8中抽取酶溶液,然后推出至微孔9中形成酶溶液的液滴,每个液滴的体积是4纳升。依次在毛细管1中抽取30纳升的底物溶液(520MMP FRET Substrate III)和50纳升的缓冲液,底物溶液在毛细管中扩散形成具有浓度梯度的底物溶液区带。分别在每个酶溶液液滴中注入4纳升的底物区带溶液,进行酶和底物的混合。将微孔阵列芯片3取下移至恒温37摄氏度的加热台,开始计时,进行实时荧光检测。得到不同时间点液滴内产物的荧光强度,并用标准曲线法,矫正出产物的浓度。根据反应时间和产物浓度,可得到不同微液滴的初始反应速率。最后作底物浓度和反应速率的双倒数曲线,获得米氏常数和最大反应速率。实验测定得到的米氏常数为60.8μM/L,最大反应速率为33nM/L.min,与常规体积酶标板测定得到的数值基本一致(米氏常数为52.9μM/L,最大反应速率为24nM/L.min)。

Claims (8)

1.一种基于顺序注射和微流控技术的梯度微液滴阵列的形成方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一、利用具有抽取与推出双向液体驱动能力的驱动系统驱动毛细管(1)吸取稀释液(5)和试样I中的一种;
步骤二、继续利用所述驱动系统驱动毛细管(1)吸取稀释液(5)和试样I中的另一种,保证稀释液(5)和试样I直接接触,形成具有轴向单边浓度梯度的试样区带;
步骤三、利用所述驱动系统驱动毛细管(1)将所述试样区带沿反向推出点入微孔阵列芯片(3)的特定区域中,在微孔阵列芯片(3)上形成具有不同浓度的试样液滴(10)阵列。
2.根据权利要求1所述的基于顺序注射和微流控技术的梯度微液滴阵列的形成方法,其特征在于,步骤一中,毛细管(1)吸取稀释液(5)前,先吸取载流(4)。
3.根据权利要求2所述的基于顺序注射和微流控技术的梯度微液滴阵列的形成方法,其特征在于,在吸取载流(4)后,吸取稀释液(5)或试样I前,再吸取与稀释液(5)或试样I不互溶的气体或者油相(6)。
4.根据权利要求1所述的基于顺序注射和微流控技术的梯度微液滴阵列的形成方法,其特征在于,所述特定区域为设置在微孔阵列芯片(3)的微孔,或者对液滴具有亲和性的平面区域。
5.根据权利要求1所述的基于顺序注射和微流控技术的梯度微液滴阵列的形成方法,其特征在于,吸取前,对毛细管通道的表面进行钝化处理。
6.根据权利要求1所述的基于顺序注射和微流控技术的梯度微液滴阵列的形成方法,其特征在于,所述微孔阵列芯片(3)置于湿盒内,或者所述微孔阵列芯片(3)表面覆盖有与液滴(10)不互溶的阻隔层。
7.根据权利要求1所述的基于顺序注射和微流控技术的梯度微液滴阵列的形成方法,其特征在于,在微孔阵列芯片(3)的特定区域中加入的试样II,形成液滴反应器,完成试样I与试样II的混合、反应,以及后续的分析和筛选。
8.根据权利要求7所述的基于顺序注射和微流控技术的梯度微液滴阵列的形成方法,其特征在于,梯度微液滴阵列的形成过程中,或者预先利用与试样I或试样II分子量相同或相似的标准物进行校正。
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