JP6942921B2 - 細胞における代謝産物の産生及びモニタリング - Google Patents
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Description
本願は、2015年4月13日に提出された米国仮出願第62/146,478号に基づく優先権を主張するものであり、あらゆる目的のため、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国エネルギー省の委託番号DE−FG02−02ER63445の国庫支援により行われた。米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
特定の態様によれば、センサーの代謝産物への結合によって細胞による蛍光分子の産生がもたらされる本明細書に記載の蛍光モニタリング方法において、公知のセンサー/代謝産物の組み合わせを使用することができる。例示的な公知のセンサー/代謝産物の組み合わせには、以下の表1に示すものが含まれる。他の組み合わせは当該技術分野において公知である。
本明細書に記載の方法は、細胞によって発現される検出可能なレポーターの検出及び測定を利用する。検出可能なレポーターの例としては、蛍光分子又は蛍光タンパク質が挙げられる。蛍光レポーターの例としては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Shaner et al., Nature methods, Vol. 2, No. 12, pp. 905-909 (2005)において同定されたものが挙げられる。当業者に公知の蛍光レポーターの例としては、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J−Red、DsRed−monomer、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、EYFP、Emerald、EGFP、CyPet、mCFPm、Cerulean、及びT−Sapphireなどが挙げられる。
センサー及びその結合代謝産物を使用する本開示の選択方法は、特定の表現型を示す細胞を生存させる。本明細書に記載の方法は、標的化合物又は代謝産物に応答して毒素に対する解毒剤を産生する細胞を選択するための解毒剤/毒素系を利用する。大量の標的化合物又は代謝産物を産生する細胞の選択は、細胞の集団(典型的には最大100億)を抗生物質で処理することによって達成される。大量の標的化合物又は代謝産物に応答して解毒剤を産生する場合にのみ、細胞は生き残ることができる。最も多い量の標的化合物又は代謝産物を産生する細胞は、わずかに少ない量の標的化合物又は代謝産物を産生する細胞よりも速く増殖し、集団が引き継がれるであろう。結果として、標的化合物又は代謝産物の産生に優れた細胞の新しい培養物が得られる。特定の態様によれば、微生物は、毒素に対する解毒剤をコードする1又は複数の外来性核酸を含むように遺伝子改変される。解毒剤と毒素の組み合わせは当業者に公知であり、それらの例としては、SDSとtolC、コリシンとtolC(陰性選択)、カナマイシンとカナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールとクロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ、アンピシリンとβラクタマーゼ、テトラサイクリンとテトラサイクリン排出ポンプtetA、塩化ニッケルとテトラサイクリン排出ポンプtetA(陰性選択)、及び5−フルオロオロチン酸とURA3(陰性選択)が挙げられる。形質転換された微生物は、適切な条件下で解毒剤を発現させることが意図されている。
化学物質及び試薬
すべての試薬は、特に明記しない限り、Sigma社(ミズーリ州、セントルイス)から入手した。抗生物質及びIPTGは、Gold Biotechnology社(ミズーリ州、セントルイス)から入手した。アンヒドロテトラサイクリン(aTC)はClontech社(カリフォルニア州、マウンテンビュー)から入手した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ミックスは、Kapa Biosystems社(マサチューセッツ州、ウィルミントン)から購入した。エリスロマイシン及びaTCはエタノールに溶解したが、ナリンゲニンはジメチルスルホキシドに溶解した。他の全ての誘導物質を脱イオン水に溶解した。
プラスミド構築
ギブソン等温アセンブリ法(その全体が参照により本明細書に組み込まれるGibson, D.G., Young, L., Chuang, R.Y., Venter, J.C., Hutchison, C.A., 3rd and Smith, H.O. (2009) Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods, 6, 343-345を参照)を用いてプラスミドを構築し、DH5αエレクトロコンピテント細胞(マサチューセッツ州、イプスウィッチ、New England Biolabs社)に形質転換した。すべての標準的な誘導プラスミドは、強力なターミネーターであるrrnB(その全体が参照により本明細書に組み込まれるOrosz, A., Boros, I. and Venetianer, P. (1991) Analysis of the complex transcription termination region of the Escherichia coli rrnB gene. European journal of biochemistry / FEBS, 201, 653-659を参照)に続いて、誘導性プロモーター及びsfGFPの発現を駆動する(その全体が参照により本明細書に組み込まれるPedelacq, J.D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T.C. and Waldo, G.S. (2006) Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature biotechnology, 24, 79-88を参照)強力なg10 RBS(その全体が参照により本明細書に組み込まれるOlins, P.O., Devine, C.S., Rangwala, S.H. and Kavka, K.S. (1988) The T7 phage gene 10 leader RNA, a ribosome-binding site that dramatically enhances the expression of foreign genes in Escherichia coli. Gene, 73, 227-235を参照)「tttaactttaagaaggagatatacat」(配列番号1)を含んでいた(ネイティブRBSを使用したCdaRの場合を除く)。GFPの後には、proBプロモーター(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるDavis, J.H., Rubin, A.J. and Sauer, R.T. (2011) Design, construction and characterization of a set of insulated bacterial promoters. Nucleic acids research, 39, 1131-1141を参照)を先頭とする転写ターミネーター及び転写制御因子の発現を促進する強力なRBS「gaaataaggaggtaatacaa」(配列番号2)が続いた。それぞれの誘導系は、高コピープラスミド及び低コピープラスミドで実施した。高コピーpJKR−Hプラスミドは、pUC19複製開始点及びpUC19由来のβラクタマーゼ抗生物質耐性マーカー(マサチューセッツ州、イプスウィッチ、New England Biolabs社)を用いて構築した。低コピーpJKR−Lプラスミドは、アメリカ培養細胞系統保存機関から得られたpSC101(ATCC#37032)からのpUC複製開始点をSC101複製開始点(repAを含む)で置き換えた以外は同じ方法で構築した。MphR誘導系の場合、エリスロマイシン耐性カセットeryRもまた含まれていた。転写制御因子及びその同族プロモーターの配列を表2に示す。プラスミドMphR−p15a−SPEC−mCherry及びAcuR−colA−KAN−CFPは、pJKR−H−CdaRとの互換性維持のために設計された。これら両方のプラスミドにおいて、抗生物質耐性遺伝子及び複製開始点をp15a−aadA及びcolA−kanRに置き換えた。それぞれのMIOX酵素の配列及び生物名を表3に示す。構成的プロモーターP2(その全体が参考として本明細書に組み込まれるMutalik, V.K., Guimaraes, J.C., Cambray, G., Lam, C., Christoffersen, M.J., Mai, Q.A., Tran, A.B., Paull, M., Keasling, J.D., Arkin, A.P. et al. (2013) Precise and reliable gene expression via standard transcription and translation initiation elements. Nat Methods, 10, 354-360を参照)及びg10 RBSの下流に各酵素をクローニングして、pJKR−MIOX変異体を作製した。これらの発現プラスミドは、維持のためにcolAの複製開始点及びカナマイシン耐性遺伝子を使用した。配列及びプラスミドは、Addgene社で入手可能である(プラスミド番号62557−62570)。
誘導及び毒性
誘導アッセイでは、pJKRプラスミドで形質転換し、カルベニシリンで維持したDH5α細胞を使用した。各誘導評価実験のために、細胞を一晩増殖させて飽和状態とした後、新鮮なLB培地に1:100希釈し、200RPM、37℃でインキュベートした。4時間後、150μlの対数期細胞を96ウェルプレートに移し、ストック誘導物質を添加して所望の誘導濃度範囲とした。3つの別個のウェルに接種し、それぞれの誘導レベルに対して適切な量の誘導化学物質を独立して添加した。同じ設定(励起485/20、発光528/20、37℃、及び高速振とう)を使用して、同じBiotek社(バーモント州、ウィノスキー)HTプレートリーダーで測定した。蛍光及び吸光度を10分間毎に15時間測定した。蛍光を任意単位(AFU)で測定し、光学濃度を吸光度(OD)で決定した。標準化蛍光は、所与の測定について蛍光を光学濃度で割ることによって決定した。バックグラウンド自己蛍光の測定を行うために、pUC19で形質転換した対照株を含む5つの独立したウェルを含めた。90分後に蛍光を観察するように改変した同じプロトコールを用いて、フェノール及び関連化合物によるTtgRバイオセンサーの誘導を評価した。
数学的モデリング
GFP発現率は、式ΔGFP/ODを用いて各時点で算出した。Scipyを用いて、Hill関数を用い、対応する誘導物質濃度に対する最大GFP発現率の非線形最小二乗フィッティングを行った。
フローサイトメトリー
評価するプラスミドを含むD5Hα細胞を一晩飽和まで増殖させ、1mLの選択的LB培地中に1:100希釈し、900RPM、37℃で、96ウェルディープウェルブロック中でインキュベートした。4時間後、誘導物質を所望の最終濃度まで加え、再度を15時間インキュベートした。誘導された培養物を冷リン酸緩衝食塩水(PBS)中に1:100希釈し、LSRFortessaフローサイトメーター(カリフォルニア州、サンノゼ、BD Biosciences社)で評価するまで氷上に保った。各サンプルにつき少なくとも100,000の事象が収集された。デブリ及び凝集細胞を避けるために、前方散乱及び側方散乱でゲーティングを行った。視覚化のためにデータをFloJoに、その後の分析のためにMathematicaにエクスポートした。
グルカレート産生
蛍光によるグルカレート産生の観察のために、pJKR−H−CdaR及びpJKR−MIOXで二重に形質転換したBL21 DE3(マサチューセッツ州、イプスウィッチ、New England Biolabs社)細胞を、飽和培養物からカルベニシリン及びカナマイシン選択LBに1:100希釈した。4時間後、細胞を3連で96ウェルプレートに移し、50mMのミオイノシトールを培地に添加した。Biotek社HPプレートリーダーを用いて、37℃で高速振とうしながら15分間隔で48時間、蛍光及び吸光度(600nm)を測定した。
蛍光レポーターによる代謝産物の同定
以下のセンサー、すなわち、AcuR、CdaR、MphR、及びTtgRを調べた。AcuRは、ロドバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)(Sullivan, M.J., Curson, A.R., Shearer, N., Todd, J.D., Green, R.T. and Johnston, A.W. (2011) Unusual regulation of a leaderless operon involved in the catabolism of dimethylsulfoniopropionate in Rhodobacter sphaeroides. PloS one, 6, e15972参照)において、ジメチルスルホニオプロピオネート(DMSP)の異化反応を制御するためにアクリレートに結合する。CdaRは、一部の二塩基酸、すなわち、グルカレート、ガラクタレート、及びグリセラートに応答して転写を制御することが示されている、大腸菌由来の転写活性化因子である(Monterrubio, R., Baldoma, L., Obradors, N., Aguilar, J. and Badia, J. (2000) A common regulator for the operons encoding the enzymes involved in D-galactarate, D-glucarate, and D-glycerate utilization in Escherichia coli. J Bacteriol, 182, 2672-2674を参照)。MphRは、エリスロマイシン、並びにジョサマイシン及びアジスロマイシンなどの他のマクロライド系抗生物質の存在下で転写を媒介する(Noguchi, N., Takada, K., Katayama, J., Emura, A. and Sasatsu, M. (2000) Regulation of transcription of the mph(A) gene for macrolide 2’-phosphotransferase I in Escherichia coli: characterization of the regulatory gene mphR(A). J Bacteriol, 182, 5052-5058を参照)。MphRは大腸菌のマクロライド耐性株において最初に同定され、その後、哺乳動物(Kramer, B.P., Viretta, A.U., Daoud-El-Baba, M., Aubel, D., Weber, W. and Fussenegger, M. (2004) An engineered epigenetic transgene switch in mammalian cells. Nature biotechnology, 22, 867-870及びWeber, W., Fux, C., Daoud-el Baba, M., Keller, B., Weber, C.C., Kramer, B.P., Heinzen, C., Aubel, D., Bailey, J.E. and Fussenegger, M. (2002) Macrolide-based transgene control in mammalian cells and mice. Nature biotechnology, 20, 901-907を参照)及び微生物(Mohrle, V., Stadler, M. and Eberz, G. (2007) Biosensor-guided screening for macrolides. Analytical and bioanalytical chemistry, 388, 1117-1125を参照)の導入遺伝子の活性化の両方で使用されている。シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)において、TtgRは、ナリンゲニン、フロレチン、及びゲニステインなどのフラボノイドに応答する多剤排出ポンプの発現を制御し(Teran, W., Felipe, A., Segura, A., Rojas, A., Ramos, J.L. and Gallegos, M.T. (2003) Antibiotic-dependent induction of Pseudomonas putida DOT-T1E TtgABC efflux pump is mediated by the drug binding repressor TtgR. Antimicrobial agents and chemotherapy, 47, 3067-3072を参照)、哺乳動物の導入遺伝子の活性化にも使用されている(Rossger, K., Charpin-El-Hamri, G. and Fussenegger, M. (2013) A closed-loop synthetic gene circuit for the treatment of diet-induced obesity in mice. Nature communications, 4, 2825を参照)。AcuR、MphR、及びTtgRは、TetR転写抑制因子ファミリーのメンバーである。比較のために制御因子TetR及びAraCが含まれる。
センサー直交性
各バイオセンサーの交差反応性は、以下の誘導化合物、すなわち、アクリレート、アラビノース、グルカレート、エリスロマイシン、aTC、ナリンゲニン、IPTG、ラムノース、クミン酸、並びに溶媒であるDMSO及びエタノールを含むパネルを用いて評価した。その他の点で評価されない誘導化合物は、将来のバイオセンサー実施のための上位互換性を提供するために含まれた。その同族誘導物質を除いて、評価された化合物のいずれに応答するセンサーも観察されなかった。図6を参照。クミン酸、グルカレート、及びアクリレートは、すべてカルボキシレートを特徴とするが、それぞれのセンサーにより区別される。TtgRは、クロラムフェニコールなどの多くの同様の分子に結合するが、クミン酸によって活性化されない。クロラムフェニコールによるTtgR活性化により、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼによって維持されるプラスミドと同時にTtgRを含む操作系が排除される。
代謝フラックスモニタリングのためのセンサー
ミオイノシトールからのグルカレートの産生をモニタリングするためにCdaRバイオセンサーを使用した。グルカレートは、ナイロン及び他のプラスチックの再生可能な代替物としてバイオマスから製造することができる(Werpy, T.a.P., G. (2004) In Energy, U. S. D. o. (ed.)を参照)が、これまでのところ、ミオイノシトールをグルクロン酸(glucuronate)に変換するミオイノシトールオキシゲナーゼ(MIOX)の活性によって高力価は制限されている(Moon, T.S., Yoon, S.H., Lanza, A.M., Roy-Mayhew, J.D. and Prather, K.L. (2009) Production of glucaric acid from a synthetic pathway in recombinant Escherichia coli. Applied and environmental microbiology, 75, 589-595を参照)。グルクロン酸は、速効性酵素グルクロン酸デヒドロゲナーゼ(Udh)によって順にグルカレートに酸化される。CdaRバイオセンサー、構成的に発現されるUdh遺伝子、及び5つの構成的に発現されるMIOXオルソログのライブラリーを含むプラスミドを共形質転換することにより、大腸菌においてより高いグルカレート力価を生じる酵素が同定された。4つのMIOX変異体は、16時間後に蛍光で20倍の範囲を産生した(図8を参照)。バイオセンサーの読み取りが酵素のグルカレート産生の可能性を予測するものであったかどうかを調べるために、質量分析法を用いて実際のグルカレート力価を測定した。グルカレート力価は蛍光とよく相関しており(図8参照)、ハイスループット開発及び酵素活性の最適化におけるバイオセンサーの使用を可能にする。ハツカネズミ(Mus musculus)MIOXオルソログは最も高い蛍光及び力価を生じた。ハツカネズミ変異体とわずか45%の同一性しか有さないフラボバクテリウム・ジョンソニエ(Flavobacterium johnsonia)MIOXオルソログから非常に類似したグルカレート力価及びバイオセンサー応答が得られた。
フェノールのセンサーとしてのTtgR
フェノールは重要な商品化学物質であり、新規の生産ルートにより経済的及び環境的利益がもたらされ得る。ベンゼンのフェノールへの酵素的変換においていくつかの成功が示されているが(Farinas, E.T., Alcalde, M. and Arnold, F. (2004) Alkene epoxidation catalyzed by cytochrome P450 BM-3 139-3. Tetrahedron, 60, 525-528及びKarich, A., Kluge, M., Ullrich, R. and Hofrichter, M. (2013) Benzene oxygenation and oxidation by the peroxygenase of Agrocybe aegerita. AMB Express, 3, 5を参照)、これらの酵素は低いkcatで機能し、フェノールを望ましくない副生成物であるカテコールに酸化し続ける場合がある。TtgRバイオセンサー株の別個の集団を、0.1%フェノール、0.1%カテコール、及び最大0.4%のベンゼンと共にインキュベートした。図9に示されるように、フェノールのみがセンサーを活性化し、フェノール産生の副産物ではなく、フェノールに対するTtgRの選択的応答を示した。この態様に従い、フェノール産生は、TtgRセンサーを用いて、個々の細胞における蛍光タンパク質又は抗生物質選択マーカーの発現に結びつけられる。
3−ヒドロキシプロピオネートの間接的検出
3−ヒドロキシプロピオン酸(3−HP)は、例えばアクリレートの製造における重要な市販試薬である。ある態様によれば、細胞を遺伝子改変して3−HPを産生することができるが、3−HPの公知の転写センサーは存在しない。本明細書に記載の方法によれば、細胞を遺伝子改変して、3−HPを転写センサーを有するエフェクター分子に変換する。図14は、グルコースからの3−HPへのある生物学的経路及び3−HPを転写因子を有するエフェクター分子に変換するために使用される酵素反応を示す模式図である。
蛍光レポーターの産生を誘導するprpRに基づいた3−HPバイオセンサーを用いた代謝産物のリアルタイム観察
3−HP産生は、prpRに基づいた3−HPバイオセンサーを用いてリアルタイムでモニタリングした。図20Aに示されるように、3−HP産生経路は、マロニル−CoAの内因性の生合成及びクロロフレクサス・アウランティアカス(Chloroflexus aurantiacus)の炭素固定経路由来の二機能性酵素マロニル−CoA還元酵素(mcr)からなる。Mcrはマロニル−CoAの変換、すなわち、2分子のNADPH+を消費することで、最初にマロン酸セミアルデヒドへ、次に3HPへの変換を触媒し、マロニル−CoAを脂肪酸生合成から分離する。グルコースから3HPへのこの経路は以前に公開されており、mcr単独の発現で60mg/Lの力価を達成した(Rathnasingh, C., Raj, S.M., Lee, Y., Catherine, C., Ashok, S. and Park, S. (2012) Production of 3-hydroxypropionic acid via malonyl-CoA pathway using recombinant Escherichia coli strains. Journal of biotechnology, 157, 633-640を参照)。力価は、マロニル−CoA及びNADPH+の利用可能性をそれぞれ増大させる、ACC複合体及びpntABの過剰発現により180mg/Lに増加した。3HP産生に利用可能なマロニル−CoAの量は、遺伝的操作よりもむしろ脂肪酸阻害剤セルレニンの使用によって増加した。脂肪酸生合成は、マロニル−CoAの主要なシンク(sink)であり、異種発現させたmcrよりもはるかに速い速度で機能する。セルレニンはfabB及びfabFの活性を阻害するので、セルレニン濃度を増加させると、脂肪酸生合成速度が低下し、利用可能なマロニル−CoAの濃度が高くなる。各3−HPの実施において、バイオセンサーヘルパー酵素であるpcs及びpcsΔ3/achは構成的に発現され、mcrはIPTGの添加により条件的に発現された。
蛍光レポーターの生産を誘導するacuRに基づいた3−HPバイオセンサーを用いた代謝産物のリアルタイム観察
図20Dに示されるように、acuRに基づいた3−HPバイオセンサーを使用して、3−HPの産生をリアルタイムでモニタリングした。acuRバイオセンサーは、異化産物抑制の影響を受けず、グルコースからの3−HPの産生を観察するために使用することができる。Mcrは、acuRに基づいたバイオセンサーと同時発現され、12時間蛍光が観察された。IPTG又はセルレニンなしで、50mMグルコースと共にインキュベートされた細胞は、バックグラウンドレベルから区別できない蛍光を生じた。グルコース及びIPTGと共にインキュベートされた細胞は、蛍光の顕著な増加を示した。IPTG及びセルレニンの両方を使用した場合に、最も著しい蛍光の増加が観察された。グルコース、IPTG、及びセルレニンを用いた3−HPの産生により、他の2つの培養条件のいずれよりも高いGFP発現率及びエンドポイント蛍光値が得られた。エンドポイント測定により、グルコース、IPTG、及びセルレニンと共にインキュベートした場合、mcr−細胞に対して、mcr+細胞の蛍光が8倍増加することが明らかとなる(図20Eを参照)。グルコース及びIPTGとのインキュベーションにより、2倍の増加が得られる。グルコース単独でのインキュベーションでは、mcrを欠く細胞と比較して、わずか20%の蛍光が増加するのみである。
蛍光レポーターの産生を誘導するcdaRに基づいたグルカレートバイオセンサーを用いたグルカレートのリアルタイム観察
細胞内のグルカレートの産生をリアルタイムで観察した。図21Aに示されるように、IPTG誘導性ミオイノシトール−1−リン酸シンターゼ(Ino1、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae))、ミオイノシトールオキシゲナーゼ(MIOX、ハツカネズミ(Mus musculus))、及びウロン酸脱水素酵素(Udh、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens))のグルカレート生合成経路と共に、蛍光分子の産生を制御するグルカートバイオセンサーcdaRを含むように、細胞を遺伝子改変した。グルカレートバイオセンサーは、細胞内で産生されたグルカレートの量に比例した蛍光応答を生じた。代表的な例では、同一の生産条件(遺伝的特徴、培地組成)は維持されたが、外来的に添加される前駆体分子は変更された。生合成経路がさらに進んだ(すなわち、より少ない反応によってグルカレートから分離された)化合物により、グルカレート形成速度がより速くなった。図21Bに示されるように、グルカレート自体の添加によりGFP産生の速度が最も速くなり、最終的に蛍光の量が最も高くなった。グルカレートに対する蛍光応答は、生合成経路を有するバイオセンサー株及び有さないバイオセンサー株において観察された。図21Cに示されるように、他の外来的に供給された分子はいずれも、グルカレート生合成経路を欠くバイオセンサー株において蛍光応答をもたらさなかった。バイオセンサー及び生合成経路の両方を含む株では、グルクロン酸を培地に添加すると、蛍光応答がグルカレートに約90分遅れ、最終的にグルカレートの80%であるエンドポイント蛍光が達成された。このことは、グルクロン酸の蛍光応答に60分遅れる、ミオイノシトールの添加による結果とは対照的である。ミオイノシトールの添加によって達成されるエンドポイント蛍光は、グルクロン酸添加のわずか20%である。図21Bに示されるように、50mMグルコースを添加した培地は、実験の期間内に蛍光応答をもたらさなかった。
蛍光レポーターの産生を誘導するbenMに基づいたムコン酸バイオセンサーを用いたムコン酸のリアルタイム観察
細胞中のムコン酸の産生をリアルタイムで観察した。細胞は、蛍光分子の産生を制御するムコン酸バイオセンサーbenM及びアシネトバクター・バイリイ(Acinetobacter baylyi)由来のLysR型転写制御因子を含むように遺伝子改変された(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるCraven, S.H., Ezezika, O.C., Haddad, S., Hall, R.A., Momany, C. and Neidle, E.L. (2009) Inducer responses of BenM, a LysR-type transcriptional regulator from Acinetobacter baylyi ADP1. Mol Microbiol, 72, 881-894を参照)。この仕組みは、benMが抗生物質耐性遺伝子の発現を制御する、以前に記載されたムコン酸の人為選択に類似している(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるRaman, S., Rogers, J.K., Taylor, N.D. and Church, G.M. (2014) Evolution-guided optimization of biosynthetic pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 111, 17803-17808を参照)。リアルタイム観察のための種々のムコン産生速度を達成するために、ムコン酸は、Draths及びFrost(それぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Niu, W., Draths, K.M. and Frost, J.W. (2002) Benzene-free synthesis of adipic acid. Biotechnology progress, 18, 201-211及びDraths, K.M. and Frost, J.W. (1994) Environmentally Compatible Synthesis of Adipic Acid from D-Glucose. Journal of the American Chemical Society, 116, 399-400を参照)により開発された生合成経路を実施することにより、ある範囲の前駆体分子から産生された。図23Aに示されるように、この経路は、3つの異種酵素を用いて、芳香族アミノ酸生合成の中間体である3−デヒドロシキミ酸(DHS)をシス,シス−ムコン酸に変換する。内因性代謝からの分岐点は、DHS脱水酵素(アシネトバクター・バイリイ、quiC)によって触媒されてプロトカテク酸を生じ、プロトカテク酸は次にプロトカテク酸デカルボキシラーゼ(クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumonia)、aroY)によってカテコールに脱炭酸されて、カテコール1,2−ジオキシゲナーゼ(アシネトバクター・バイリイ、catA)によりムコン酸に酸化される。経路中間体DHS、プロトカテク酸、及びカテコールについて急速な蛍光応答が観察されたが、図23Bに示されるようにムコン酸産生がグルコースから開始した場合には遅い応答が観察された。ムコン酸生合成経路が存在しない場合は、いずれの中間体に対しても蛍光応答は観察されなかった。DHSにより他の経路中間体と同様の速さの応答が生じるという観察により、芳香族アミノ酸生合成との競合が、これらの条件下でムコン酸産生の速度を制限しないことが示唆される。対照的に、グルコースの添加に起因してGFP発現の速度が遅くなることは、使用される遺伝的背景において十分な内因性DHS供給を達成することが制限され得ることを示す。このことは、芳香族アミノ酸生合成における転写レベル及びアロステリックレベルの両方に存在する負のフィードバックと一致する。負のフィードバックは、芳香族アミノ酸の存在下でDHAP(DHSの前駆体、結果としてムコン酸)の産生を調整するように設計されている。ムコン酸生合成のために最適化された株は、産生阻害に欠陥があるaroFのフィードバック耐性突然変異体を過剰発現する。DHSプールを増大させることを目的とする他の遺伝子改変には、aroEのノックアウト、及びaroB及びtktAの過剰発現が含まれる(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるNiu, W., Draths, K.M. and Frost, J.W. (2002) Benzene-free synthesis of adipic acid. Biotechnology progress, 18, 201-211を参照)。
実施例11〜16で用いられる方法
実施例11〜16について、以下の方法及び材料を使用した。
すべての試薬は、特に明記しない限り、Sigma社から入手した。抗生物質及びIPTGはGold Biotechnology社から入手した。PCR混合物は、Kapa Biosystems社から購入した。3−ヒドロキシプロピオネートは、Tronto Research Chemicals社から購入した。セルレニンはCayman Chemical社から購入し、エタノールに溶解した。アクリル酸は、阻害剤として200ppmのMEHQを用いて室温で保存し、使用直前に希釈した。すべての細胞培養添加物を脱イオン水に溶解して、適切な作業濃度とした。
ギブソン等温アセンブリ法(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるGibson, D.G., Young, L., Chuang, R.Y., Venter, J.C., Hutchison, C.A., 3rd and Smith, H.O. (2009) Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods, 6, 343-345を参照)を用いてプラスミドを構築し、New England Biolabs社から購入したDH5αエレクトロコンピテント細胞にクローニングした。産物分子の生合成はBL21(DE3)又はDH5αのいずれかで行った。prpRに基づいた3HPバイオセンサーは、2プラスミド系として実施された。第1のプラスミドは、β−ラクタム耐性を与えるpBR322複製開始点上のメチルクエン酸応答性転写因子prpRの制御下でGFPuvを発現するpPro24−GFP(Addgene社 プラスミド#18880)である。第2のプラスミド(pJKR−PCS)は、酵素プロピオニル−CoAシンターゼが、カナマイシン耐性を与えるColA複製開始点上の構成的プロモーターproDの制御下にあるように構築した。acuRに基づいた3−HPバイオセンサーは、2種のプラスミドから構成されている。第1のプラスミドは、β−ラクタム耐性を与えるpUC複製開始点上のアクリレート応答性転写因子であるacuRの制御下でsfGFPを発現する、以前に特徴付けられている高コピーアクリレートバイオセンサーpJKR−H−acuR(Addgene社 プラスミド#62567)である。第2のプラスミドは、PCSが1400番目のアミノ酸と1401番目のアミノ酸との間で切断されるようなpJKR−PCSに由来する。続いて、アシネトバクター・バイリイ由来の酵素アクリリル−CoA加水分解酵素を、P2構成的プロモーター(その全体が参照により本明細書に組み入れられるMutalik, V.K., Guimaraes, J.C., Cambray, G., Lam, C., Christoffersen, M.J., Mai, Q.A., Tran, A.B., Paull, M., Keasling, J.D., Arkin, A.P. et al. (2013) Precise and reliable gene expression via standard transcription and translation initiation elements. Nat Methods, 10, 354-360を参照)の制御下でプラスミドにクローニングした。得られたプラスミドはpJKR−PCSfrag−ACHとよばれる。pJKR−MCRとよばれる3−HP生合成プラスミドは、クロロフレクサス・アウランティアカス由来のマロニル−CoA還元酵素が、スペクチノマイシン耐性を有するp15a複製開始点上のLacIの制御下でpLlacOプロモーター(Lutz, R. and Bujard, H. (1997) Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic acids research, 25, 1203-1210を参照)によって発現されるように構築した。グルカレートバイオセンサーは、β−ラクタム耐性を与えるpUC複製開始点上のグルカレート応答性転写因子cdaRの制御下でsfGFPを発現する、以前に特徴付けられているプラスミドpJKR−H−cdaR(Addgene社 プラスミド#62557)である。グルカレート生合成経路は、カナマイシン耐性を与えるp15a複製開始点上のIPTG制御されたT7プロモーターから共シストロン性にMIOX遺伝子、Ino1遺伝子、及びUdh遺伝子を発現する単一のプラスミドpJKR−GA−EXP上に実施された。ハツカネズミ由来のMIOX及びサッカロマイセス・セレビシエ由来のIno1を、大腸菌発現のために最適化されたコドンで合成した。Udhは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのゲノムDNA(ATCC#33970D−5)から得た。ムコン酸バイオセンサーは、スペクチノマイシン耐性を与えるpUCの複製開始点上のムコン酸応答性転写因子benM(アシネトバクター・バイリイ)の制御下に、sfGFPを用いて構築した。BenMはproBプロモーターで構成的に発現された(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるDavis, J.H., Rubin, A.J. and Sauer, R.T. (2011) Design, construction and characterization of a set of insulated bacterial promoters. Nucleic acids research, 39, 1131-1141を参照)。発現標準化のためのオプションを提供するために、RFP mKate2は、P11(32)プロモーターから構成的に発現された(参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMutalik, V.K., Guimaraes, J.C., Cambray, G., Lam, C., Christoffersen, M.J., Mai, Q.A., Tran, A.B., Paull, M., Keasling, J.D., Arkin, A.P. et al. (2013) Precise and reliable gene expression via standard transcription and translation initiation elements. Nat Methods, 10, 354-360を参照)。得られたプラスミドをpJKR−H−benMとよぶ。ムコン酸生合成経路は、βラクタム耐性を与えるp15a複製開始点上のIPTG誘導性T7プロモーターから共シストロン性に発現される生合成遺伝子のコドン最適化変異体を有する単一プラスミドとして構築した。
プラスミドpPro24−GFP及びプラスミドpJKR−PCS、又はプラスミドpJKR−H−acuR及びプラスミドpJKR−PCSfrag−ACHで二重に形質転換されたDH5α細胞を、3−HP濃度増加に暴露し、GFP発現についてモニタリングした。細胞を一晩飽和まで増殖させた後、新鮮なLB培地に1:100希釈し、200RPM、37℃でインキュベートした。4時間後、150μlの対数期細胞を96ウェルプレートに移し、3HPを適切な最終濃度まで加えた。それぞれの接種及び誘導は3連で実施した。バイオセンサーの活性化が実際にヘルパープラスミドの存在に依存していることを明らかにするために、バイオセンサーヘルパープラスミドを欠く株を含めた。エンドポイント測定の場合、Biotek社のHTプレートリーダー(励起485/20、発光528/20)での3−HP添加の16時間後に蛍光を測定した。高速振盪し10分の測定間隔で、同じプレートリーダー上で、37℃で16時間にわたって、時間経過データを収集した。蛍光を光学濃度で標準化した。誘導倍率は、現在の誘導レベルで得られる蛍光を誘導なしで得られる蛍光で割ることによって決定した。エラーバーは、平均値の標準誤差から算出された95%信頼区間を表す。
prpR及びacuRに基づいた3−HPバイオセンサーのためのプラスミドを含むDH5α細胞をプラスミドpJKR−MCRで形質転換した。これらの産生株を一晩増殖させ、新鮮なLB培地に1:100に逆希釈し、200RPM、37℃でインキュベートした。4時間後、150μlの対数期細胞を96ウェルプレートに移し、3−HP産生条件に暴露した。prpRに基づいたバイオセンサー生産株を、LB中の1mM IPTG及び20μg/mlセルレニンと共に及びこれらなしでインキュベートした。acuRに基づいたバイオセンサー産生株を、50mMのグルコース、並びに1mMのIPTG及び20μg/mlのセルレニンの異なる組み合わせと共にインキュベートした。増殖−標準化蛍光を、上記のようにBiotek社のHTプレートリーダーで観察した。12時間後にエンドポイント測定を行った。3−HP産生力価は、液体クロマトグラフィー及び質量分析(LC/MS)によって決定した。力価測定に使用した株は、産生プラスミドpJKR−MCRのみを含んでいた。一晩培養したものを、96ウェルブロック中、1mM IPTG、20μg/mlセルレニン、及び50mMグルコースが添加された1mLのLBに1:100で接種した。産生は、900RPM、37℃で16時間行った後、上清を単離し、LC/MSのために0.2μmで濾過した。すべての産生は3連で設定した。エラーバーは、平均値の標準誤差から算出された95%信頼区間を表す。
グルカレート産生のモニタリングは、pJKR−H−cdaR及びpJKR−GA−EXPで二重に形質転換されたBL21細胞で行った。pJKR−H−cdaR単独で形質転換したBL21を対照として用いた。一晩培養したものを、5g/Lのグルコースを添加したDavis培地に1:100に逆希釈した。200RPM、37℃で4時間インキュベートした後、150μlの対数期細胞を96ウェルプレートに移し、記載した経路中間体と共に1mM IPTGに曝露した。経路中間体の添加後の8時間、標準化蛍光が観察された。エンドポイント測定は8時間後に行った。力価測定のためのグルカレート産生を、pJKR−GA−EXPで形質転換したBL21中で行った。一晩培養したものを、1mM IPTG及び特定濃度の経路中間体を添加した1mLのLBに1:100で接種した。96ウェルブロック中で、900RPM、37℃で8時間産生を行い、その後、上清を単離しLC/MSのために0.2μmで濾過した。すべての産生は3連で設定した。エラーバーは、平均値の標準誤差から算出された95%信頼区間を表す。
ムコン酸の産生のモニタリングは、pJKR−H−benM及びムコン酸産生プラスミドで二重に形質転換されたBL21細胞で行った。一晩培養したものを一晩増殖させた後、LBに1:100希釈し、200RPM、37℃でインキュベートした。4時間後、150μlの対数期細胞を96ウェルプレートに移し、プレートリーダーでモニタリングした。1時間後、特定濃度の経路中間体を三連で加え、蛍光モニタリングを再開した。エンドポイント測定は、中間体の添加の5時間後に行った。ムコン酸産生プラスミドのみで形質転換した株を用いて産生力価を決定した。一晩培養したものを、特定濃度の経路中間体を添加した1mLのLBに1:100で接種した。900RPM、37℃で5時間、96ウェルブロック中で産生を行った。上清中のムコン酸の量をHPLCにより決定した。すべての産生は3連で設定した。エラーバーは、平均値の標準誤差から算出された95%信頼区間を表す。
本発明の態様は以下を含む。
付記1
微生物の集団を提供すること、
ここで、前記微生物の集団は、レポーターをコードする外来性DNAを含むように遺伝子改変されており、
前記微生物の集団は、発現すると微生物による前記レポーターの発現を制御するセンサー生体分子をコードする外来性DNAを含むように遺伝子改変されており、
前記微生物の集団は、前記センサーの代謝産物結合パートナーを産生するための遺伝子又は遺伝子群をコードする外来性DNAを含むように遺伝子改変されており、
前記微生物は前記代謝産物結合パートナーを産生し、産生された代謝産物結合パートナーは前記センサーに結合して、産生された代謝産物の濃度に依存した態様で前記レポーターの発現を誘導する;及び
前記レポーターの検出により微生物の集団をスクリーニングして微生物のサブセットを同定すること、
を含む、代謝産物の産生のための微生物のサブセットを選択する方法。
付記2
前記レポーターが蛍光タンパク質である、付記1に記載の方法。
付記3
前記レポーターが、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J−Red、DsRed−monomer、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、EYFP、Emerald、EGFP、CyPet、mCFPm、Cerulean、T−Sapphire、Firefly(FLuc)、改変Firefly(Ultra−Clo)、Click beetle(CBLuc)、Sea pansy(RLuc)、Copepod crustacean(GLuc)、及びOstracod crustacean(CLuc)からなる群から選択される、付記1に記載の方法。
付記4
前記スクリーニングが、蛍光活性化細胞選別、顕微鏡観察、マイクロタイタープレートアッセイ、エマルジョンアッセイ、マイクロ流体アッセイ、プルダウンアッセイ、又はルシフェラーゼハイスループットスクリーニングによって行われる、付記1に記載の方法。
付記5
前記センサー生体分子及び前記代謝産物結合パートナーが、cdaR/グルカル酸、ttgR/ナリンゲニン、btuBリボスイッチ/コバラミン、mphR/マクロライド、tetR/テトラサイクリン誘導体、benM/ムコン酸、alkS/中鎖n−アルカン、xylR/キシロース、araC/アラビノース、gntR/グルコン酸塩、galS/ガラクトース、trpR/トリプトファン、qacR/ベルベリン、rmrR/フィトアレキシン、cymR/クミン酸、melR/メリビオース、rafR/ラフィノース、nahR/サリチル酸塩、nocR/ノパリン、clcR/クロロ安息香酸、varR/ヴァージニアマイシン、rhaR/ラムノース、PhoR/リン酸塩、MalK/リンゴ酸塩、GlnK/グルタミン、レチノイン酸受容体/レチノイン酸、エストロゲン受容体/エストロゲン、及びエクジソン受容体/エクジソンからなる群から選択されるペアである、付記1に記載の方法。
付記6
前記微生物のサブセットを遺伝子改変して前記代謝産物の産生に直接的又は間接的に影響する遺伝子又は遺伝子群を変化させること、及び、
前記レポーターを検出することによって微生物のサブセットをスクリーニングして微生物のさらなるサブセットを同定すること、
をさらに含む、付記1に記載の方法。
付記7
タンパク質をコードする遺伝子の微生物による発現を制御するセンサー生体分子をコードする外来性DNAを含むように微生物を遺伝子改変すること、及び
前記センサーに対応する代謝産物を産生するための遺伝子又は遺伝子群をコードする外来性DNAを含むように前記微生物を遺伝子改変することを含み、
ここで、前記微生物は前記代謝産物を産生し、産生された代謝産物は前記センサーに結合して、産生された代謝産物の濃度に依存した態様でタンパク質の発現を誘導し、
前記センサーはAcuRであり、前記代謝産物はアクリレートであるか、又は、
前記センサーはttgRであり、前記代謝産物はフェノールである、
代謝産物に対応するセンサー生体分子を含むように微生物を改変する方法。
付記8
前記微生物が、前記タンパク質をコードする外来性DNAを含むように遺伝子改変される、付記7に記載の方法。
付記9
前記タンパク質が蛍光タンパク質である、付記8に記載の方法。
付記10
前記タンパク質が、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J−Red、DsRed−monomer、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、EYFP、Emerald、EGFP、CyPet、mCFPm、Cerulean、T−Sapphire、Firefly(FLuc)、改変Firefly(Ultra−Clo)、Click beetle(CBLuc)、Sea pansy(RLuc)、Copepod crustacean(GLuc)、及びOstracod crustacean(CLuc)からなる群から選択される、付記8に記載の方法。
付記11
前記タンパク質が毒素に対する解毒剤である、付記8に記載の方法。
付記12
前記タンパク質が、SDSとtolC、コリシンとtolC、カナマイシンとカナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールとクロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ、アンピシリンとβラクタマーゼ、テトラサイクリンとテトラサイクリン排出ポンプtetA、塩化ニッケルとテトラサイクリン排出ポンプtetA、及び5−フルオロオロチン酸とURA3の解毒剤と毒素の組み合わせからなる群から選択される、毒素に対する解毒剤である、付記8に記載の方法。
付記13
微生物であって、
ここで、前記微生物は、タンパク質をコードする遺伝子の前記微生物による発現を制御するセンサー生体分子をコードする外来性DNAを含むように遺伝子改変されており、
前記微生物は、代謝産物を産生するための遺伝子又は遺伝子群をコードする外来性DNAを含むように遺伝子改変されており、
前記微生物は前記代謝産物を産生し、産生された代謝産物は前記センサー生体分子に結合して、産生されたアクリレートの濃度に依存した態様で前記タンパク質の発現を誘導し、
前記センサーはAcuRであり、前記代謝産物はアクリレートであるか、又は
前記センサーはttgRであり、前記代謝産物はフェノールである、微生物。
付記14
前記微生物が、前記タンパク質をコードする外来性DNAを含むように遺伝子改変されている、付記13に記載の微生物。
付記15
前記タンパク質が蛍光タンパク質である、付記14に記載の方法。
付記16
前記タンパク質が、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J−Red、DsRed−monomer、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、EYFP、Emerald、EGFP、CyPet、mCFPm、Cerulean、T−Sapphire、Firefly(FLuc)、改変Firefly(Ultra−Clo)、Click beetle(CBLuc)、Sea pansy(RLuc)、Copepod crustacean(GLuc)、及びOstracod crustacean(CLuc)からなる群から選択される、付記14に記載の方法。
付記17
前記タンパク質が毒素に対する解毒剤である、付記14に記載の方法。
付記18
前記タンパク質が、SDSとtolC、コリシンとtolC、カナマイシンとカナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールとクロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ、アンピシリンとβラクタマーゼ、テトラサイクリンとテトラサイクリン排出ポンプtetA、塩化ニッケルとテトラサイクリン排出ポンプtetA、及び5−フルオロオロチン酸とURA3の解毒剤と毒素の組み合わせからなる群から選択される、毒素に対する解毒剤である、付記14に記載の方法。
付記19
タンパク質をコードする遺伝子の微生物による発現を制御するprpRセンサー生体分子をコードする外来性DNAを含むように微生物を遺伝子改変すること、
3−ヒドロキシプロピオン酸を産生して3−ヒドロキシプロピオン酸を2−メチルクエン酸に変換するための遺伝子又は遺伝子群をコードする外来性DNAを含むように前記微生物を遺伝子改変することを含み、
ここで、前記微生物は前記2−メチルクエン酸を産生し、産生された2−メチルクエン酸は前記prpRセンサーに結合して、2−メチルクエン酸の濃度に依存した態様でタンパク質の発現を誘導する、
代謝産物に対応するセンサー生体分子を含むように微生物を改変する方法。
付記20
前記微生物が、タンパク質をコードする外来性DNAを含むように遺伝子改変されている、付記19に記載の方法。
付記21
前記タンパク質が蛍光タンパク質である、付記19に記載の方法。
付記22
前記タンパク質が、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J−Red、DsRed−monomer、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、EYFP、Emerald、EGFP、CyPet、mCFPm、Cerulean、T−Sapphire、Firefly(FLuc)、改変Firefly(Ultra−Clo)、Click beetle(CBLuc)、Sea pansy(RLuc)、Copepod crustacean(GLuc)、及びOstracod crustacean(CLuc)からなる群から選択される、付記19に記載の方法。
付記23
前記タンパク質が毒素に対する解毒剤である、付記19に記載の方法。
付記24
前記タンパク質が、SDSとtolC、コリシンとtolC、カナマイシンとカナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールとクロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ、アンピシリンとβラクタマーゼ、テトラサイクリンとテトラサイクリン排出ポンプtetA、塩化ニッケルとテトラサイクリン排出ポンプtetA、及び5−フルオロオロチン酸とURA3の解毒剤と毒素の組み合わせからなる群から選択される、毒素に対する解毒剤である、付記19に記載の方法。
付記25
微生物であって、
ここで、前記微生物は、タンパク質をコードする遺伝子の前記微生物による発現を制御するprpRセンサー生体分子をコードする外来性DNAを含むように遺伝子改変されており、
前記微生物は、3−ヒドロキシプロピオン酸を産生して3−ヒドロキシプロピオン酸を2−メチルクエン酸に変換するための遺伝子又は遺伝子群をコードする外来性DNAを含むように遺伝子改変されており、
前記微生物は前記2−メチルクエン酸を産生し、産生された2−メチルクエン酸は前記prpRセンサー生体分子に結合して、産生された2−メチルクエン酸の濃度に依存した態様でタンパク質の発現を誘導する、微生物。
付記26
前記微生物が、タンパク質をコードする外来性DNAを含むように遺伝子改変されている、付記25に記載の微生物。
付記27
前記タンパク質が蛍光タンパク質である、付記25に記載の方法。
付記28
前記タンパク質が、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J−Red、DsRed−monomer、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、EYFP、Emerald、EGFP、CyPet、mCFPm、Cerulean、T−Sapphire、Firefly(FLuc)、改変Firefly(Ultra−Clo)、Click beetle(CBLuc)、Sea pansy(RLuc)、Copepod crustacean(GLuc)、及びOstracod crustacean(CLuc)からなる群から選択される、付記25に記載の方法。
付記29
前記タンパク質が毒素に対する解毒剤である、付記25に記載の方法。
付記30
前記タンパク質が、SDSとtolC、コリシンとtolC、カナマイシンとカナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールとクロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ、アンピシリンとβラクタマーゼ、テトラサイクリンとテトラサイクリン排出ポンプtetA、塩化ニッケルとテトラサイクリン排出ポンプtetA、及び5−フルオロオロチン酸とURA3の解毒剤と毒素の組み合わせからなる群から選択される、毒素に対する解毒剤である、付記25に記載の方法。
付記31
タンパク質をコードする遺伝子の微生物による発現を制御するacuRセンサー生体分子をコードする外来性DNAを含むように微生物を遺伝子改変すること、
3−ヒドロキシプロピオン酸を産生して3−ヒドロキシプロピオン酸をアクリレートに変換するための遺伝子又は遺伝子群をコードする外来性DNAを含むように前記微生物を遺伝子改変することを含み、
ここで、前記微生物は前記アクリレートを産生し、産生されたアクリレートは前記acuRセンサーに結合して、アクリレートの濃度に依存した態様でタンパク質の発現を誘導する、
代謝産物に対応するセンサー生体分子を含むように微生物を改変する方法。
付記32
前記微生物が、タンパク質をコードする外来性DNAを含むように遺伝子改変されている、付記31に記載の方法。
付記33
前記タンパク質が蛍光タンパク質である、付記31に記載の方法。
付記34
前記タンパク質が、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J−Red、DsRed−monomer、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、EYFP、Emerald、EGFP、CyPet、mCFPm、Cerulean、T−Sapphire、Firefly(FLuc)、改変Firefly(Ultra−Clo)、Click beetle(CBLuc)、Sea pansy(RLuc)、Copepod crustacean(GLuc)、及びOstracod crustacean(CLuc)からなる群から選択される、付記31に記載の方法。
付記35
前記タンパク質が毒素に対する解毒剤である、付記31に記載の方法。
付記36
前記タンパク質が、SDSとtolC、コリシンとtolC、カナマイシンとカナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールとクロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ、アンピシリンとβラクタマーゼ、テトラサイクリンとテトラサイクリン排出ポンプtetA、塩化ニッケルとテトラサイクリン排出ポンプtetA及び5−フルオロオロチン酸とURA3の解毒剤と毒素の組み合わせからなる群から選択される、毒素に対する解毒剤である、付記31に記載の方法。
付記37
微生物であって、
ここで、前記微生物は、タンパク質をコードする遺伝子の前記微生物による発現を制御するacuRセンサー生体分子をコードする外来性DNAを含むように遺伝子改変されており、
前記微生物は、3−ヒドロキシプロピオン酸を産生して3−ヒドロキシプロピオン酸をアクリレートに変換するための遺伝子又は遺伝子群をコードする外来性DNAを含むように遺伝子改変されており、
前記微生物は前記アクリレートを産生し、産生されたアクリレートは前記acuRセンサー生体分子に結合して、産生されたアクリレートの濃度に依存した態様で前記タンパク質の発現を誘導する、微生物。
付記38
前記微生物が、前記タンパク質をコードする外来性DNAを含むように遺伝子改変されている、付記37に記載の微生物。
付記39
前記タンパク質が蛍光タンパク質である、付記37に記載の方法。
付記40
前記タンパク質が、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J−Red、DsRed−monomer、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、EYFP、Emerald、EGFP、CyPet、mCFPm、Cerulean、T−Sapphire、Firefly(FLuc)、改変Firefly(Ultra−Clo)、Click beetle(CBLuc)、Sea pansy(RLuc)、Copepod crustacean(GLuc)、及びOstracod crustacean(CLuc)からなる群から選択される、付記37に記載の方法。
付記41
前記タンパク質が毒素に対する解毒剤である、付記37に記載の方法。
付記42
前記タンパク質が、SDSとtolC、コリシンとtolC、カナマイシンとカナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールとクロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ、アンピシリンとβラクタマーゼ、テトラサイクリンとテトラサイクリン排出ポンプtetA、塩化ニッケルとテトラサイクリン排出ポンプtetA及び5−フルオロオロチン酸とURA3の解毒剤と毒素の組み合わせからなる群から選択される、毒素に対する解毒剤である、付記37に記載の方法。
Claims (8)
- 蛍光タンパク質をコードする遺伝子の微生物による発現を制御する転写因子であるセンサー生体分子をコードする外来性DNAを含むように微生物を遺伝子改変すること、及び
前記センサー生体分子に対応する代謝産物を産生するための遺伝子又は遺伝子群をコードする外来性DNAを含むように前記微生物を遺伝子改変することを含み、
ここで、前記微生物は前記代謝産物を産生し、産生された代謝産物は前記センサー生体分子に結合して、産生された代謝産物の濃度に依存した態様で前記蛍光タンパク質の発現を誘導し、
前記センサー生体分子はttgRであり、前記代謝産物はフェノールである、
代謝産物に対応し且つ転写因子であるセンサー生体分子を含むように微生物を改変する方法。 - 前記蛍光タンパク質が、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J−Red、DsRed−monomer、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、EYFP、Emerald、EGFP、CyPet、mCFPm、Cerulean、及びT−Sapphireからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 微生物であって、
ここで、前記微生物は、蛍光タンパク質をコードする遺伝子の前記微生物による発現を制御する転写因子であるセンサー生体分子をコードする外来性DNAを含むように遺伝子改変されており、
前記微生物は、代謝産物を産生するための遺伝子又は遺伝子群をコードする外来性DNAを含むように遺伝子改変されており、
前記微生物は前記代謝産物を産生し、産生された代謝産物は前記センサー生体分子に結合して、産生された代謝産物の濃度に依存した態様で前記蛍光タンパク質の発現を誘導し、
前記センサー生体分子はttgRであり、前記代謝産物はフェノールである、微生物。 - 前記蛍光タンパク質が、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J−Red、DsRed−monomer、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、EYFP、Emerald、EGFP、CyPet、mCFPm、Cerulean、及びT−Sapphireからなる群から選択される、請求項3に記載の微生物。
- 蛍光タンパク質をコードする遺伝子の微生物による発現を制御するprpRセンサー生体分子をコードする外来性DNAを含むように微生物を遺伝子改変すること、
3−ヒドロキシプロピオン酸を産生して3−ヒドロキシプロピオン酸を2−メチルクエン酸に変換するための遺伝子又は遺伝子群をコードする外来性DNAを含むように前記微生物を遺伝子改変することを含み、
ここで、前記微生物は前記2−メチルクエン酸を産生し、産生された2−メチルクエン酸は前記prpRセンサー生体分子に結合して、2−メチルクエン酸の濃度に依存した態様で前記蛍光タンパク質の発現を誘導する、
代謝産物に対応し且つ転写因子であるセンサー生体分子を含むように微生物を改変する方法。 - 前記蛍光タンパク質が、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J−Red、DsRed−monomer、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、EYFP、Emerald、EGFP、CyPet、mCFPm、Cerulean、及びT−Sapphireからなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 微生物であって、
ここで、前記微生物は、蛍光タンパク質をコードする遺伝子の前記微生物による発現を制御するprpRセンサー生体分子をコードする外来性DNAを含むように遺伝子改変されており、
前記微生物は、3−ヒドロキシプロピオン酸を産生して3−ヒドロキシプロピオン酸を2−メチルクエン酸に変換するための遺伝子又は遺伝子群をコードする外来性DNAを含むように遺伝子改変されており、
前記微生物は前記2−メチルクエン酸を産生し、産生された2−メチルクエン酸は前記prpRセンサー生体分子に結合して、産生された2−メチルクエン酸の濃度に依存した態様で前記蛍光タンパク質の発現を誘導する、微生物。 - 前記蛍光タンパク質が、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J−Red、DsRed−monomer、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、EYFP、Emerald、EGFP、CyPet、mCFPm、Cerulean、及びT−Sapphireからなる群から選択される、請求項7に記載の微生物。
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