WO2004046366A2

WO2004046366A2 - Verfahren zur mikrobiellen herstellung von stoffwechselprodukten

Info

Publication number: WO2004046366A2
Application number: PCT/DE2003/003826
Authority: WO
Inventors: Axel Niebisch; Michael Bott
Original assignee: Forschungszentrum Jülich GmbH
Priority date: 2002-11-19
Filing date: 2003-11-19
Publication date: 2004-06-03
Also published as: WO2004046366A3; DE10254074A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Stoffwechselprodukten. Durch das erfindungsgemässe Verfahren ist es nunmehr möglich, die Synthese von ATP gezielt zu beeinflussen und damit auch die Synthese von Stoffwechselprodukten zu steuern. Die Erfindung betrifft ein für Cytochrom aa3 Oxidase kodierendes Gen ctaF aus Corynebacterium glutamicum. Das ctaF Gen kodiert für ein Protein, welches die Funktion einer vierten Untereinheit der Cytochrom aa3 Oxidase aufweist.

Description

B e s c h r e i b u n g

Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von StoffWechselprodukten

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von StoffWechselprodukten.

Corynebacterium glutamicum ( C. glutamicum) , ein gram positives Bodenbakterium mit einem hohen G+C Gehalt (54 mol%) , wird für die industrielle Produktion von

Aminosäuren, insbesondere zur Produktion von L-Glutamat und L-Lysin eingesetzt. Der Syntheseweg dieser Aminosäuren, der Zentralstoffwechsel, welcher die relevanten Vorstufen bereitstellt sowie der Kohlenstoff-Fluss und der Stickstoff-Fluss dieses Organismus ist intensiv untersucht worden [1] .

Die Zusammensetzung und ernergetische Effizienz der Atmungskette bei coryneformen Bakterien wurde in den letzten Jahren sowohl genetisch als auch biochemisch intensiv untersucht.

Atmende Organismen können ATP durch oxidative Phospho- rylierung synthetisieren. Dabei werden die bei der Oxi- dation von Substraten enstehenden Reduktionsäquivalente (H oder Elektronen) in die membranständige Atmungskette eingeschleust und die Elektronen letztendlich auf Sauerstoff oder andere terminale Elektronen-Akzeptoren übertragen. Energieerzeugende und energieverbrauchende Stoffwechselwege sind über ATP und das elektrochemische Protonenpotential bzw. das elektrochemische Natrium- ionen-Potential als universelle zelluläre Energieformen miteinander gekoppelt. Die Synthese von ATP kann entweder über Substratstufenphosphorylierung oder durch Elektronentransportphosphorylierung erfolgen. Der Aufbau des elektrochemischen Protonenpotentials erfolgt durch die Atmungskette oder die Hydrolyse von ATP durch die membranständige F₀Fι-ATP-Synthase . Die Komponenten der Atmungskette sind Enzyme, die i.d.R. kovalent oder nicht-kovalent gebundene niedermolekulare Gruppen enthalten, z. B. Flavine (Flavoproteine) , Eisen-Schwefel- Zentren (Eisen-Schwefel-Proteine) und Häm-Gruppen (Cytochrome) . Ein weiterer essentieller Bestandteil von Atmungsketten sind Chinone, d. h. niedermolekulare, membranständige Elektronen- und Protonenüberträger, wie z. B. Ubichinon und Menac inon.

Die Atmungskette von C. glutamicum weist mehrere De- hydrogenasen auf, die für den Elektronentransfer zum Intermembranpool des Menachinon-9 [2] verantwortlich sind sowie mindestens zwei Wege für die Reoxidation des Menachinons aufweist, wobei ein Weg der Reoxidation mit Hilfe der Cytochrom d-Oxidase erfolgt und der zweite Weg mit Hilfe des Cytochrom bc Komplexes und der Cy- tochrom aa₃ Oxidase erfolgt. Letztere spielen eine bedeutende Rolle für das Wachstum der Organismen, da Mutanten mit fehlendem Cji-Komplex oder fehlender Cytochrom aa₃ Oxidase deutliche Wachstumsdefekte aufweisen [2] . Der Cytochrom bc Komplex wird durch die Gene qrcrCAB kodiert [2,3] . Dem gcrC Gen vorgeschaltet sind die Gene für die Untereinheit II (ctaC) und III (ctaE) der Cytochrom aa₃ Oxidase [2,3], wobei der Cytochrom bcj_ Komplex und die Cytochrom aa₃ Oxidase, codiert durch ctaC- DE, vermutlich einen Superkomplex bilden [2] . Einzelheiten betreffend die Atmungskette in C. glutamicum mit den entsprechenden Genen sind auch der WO 02/22799 A2 zu entnehmen. Das u.a. durch die Reaktionen der Atmungskette gewonnene ATP ist der universelle Überträger chemischer Energie zwischen energieerzeugenden und energievebrauchen- den Reaktionen und bedient so heterogene Prozesse wie die Synthese von Bausteinen und Makromolekülen. Energieerzeugende und energieverbrauchende Stoffwechselwege können u. a. über den Energiehaushalt der Zelle bzw. ihren ATP-Gehalt gesteuert werden und damit über die Funktionen der Atmungskette.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, mit dem der Stoffwechsel von Zellen reguliert werden kann .

Den Erfindern ist es in überraschender Weise gelungen, das Gen zu identifizieren, das für eine bisher unbekannte vierte Untereinheit der Cytochrom aa₃-Oxidase codiert. Es ist weiterhin Aufgabe der Erfindung Mikroorganismen bereit zu stellen, deren Stoffwechsel ge- zielt regulierbar ist.

Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen. Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 7 wird die Aufgabe weiterhin erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 7 angegebenen Merkmalen. Die Aufgabe wird ebenso ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 8 und 9 erfindungsgemäß gelöst mit den im kenn- zeichnenden Teil des Anspruchs 8 und 9 angegebenen Merkmalen. Durch das Verfahren ist es nunmehr möglich, die Synthese von ATP durch Elektronentransportphosphorylierung sowie den Aufbau des elektrochemischen Protonenpotentials über die Atmungskette gezielt zu beeinflussen und damit eine Steuerung der Synthese von Stoffwechselprodukten zu ermöglichen. So kann beispielsweise die mikrobielle Produktion von Stoffwechselprodukten wie beispielsweise Aminosäuren (L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Arginin) , organischen Säuren (Essigsäure, Citronen- säure, Isocitronensäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Ketoglutarsäure, Brenztraubensäure, Apfel- säure) , Vitaminen, Nukleosiden, Nukleotiden und ein- oder mehrwertiger Alkohole durch Einstellung einer geeigneten Energieladung positiv beeinflußt werden. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Polynukleotide als Hybridisierungssonden zum Auffinden von RNA, cDNA und DNA sowie zur Isolation von Nukleinsäuren, Polynukleo- tiden oder Genen verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Stoffwechselprodukten, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man folgende Schritte durchführt :

a) Fermentation der das gewünschte Stoffwechselprodukt produzierenden Bakterien, in denen man die für die vierte Untereinheit der Cytochtom aa₃ O- xidase codierende Gensequenz ctaF abschwächt oder zusammen mit einem Gen oder mehreren Genen aus der Gruppe ctaC, ctaD, ctaE, qcrA, qcrB , qcrC verstärkt . b) Anreicherung des gewünschten Stoffwechselprodukts im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und

c) Isolieren des entsprechenden Stoffwechselpro- dukts.

Die Bezeichnung „abgeschwächt" beinhaltet die Abschwä- chung der Synthese und der Expression im Vergleich zur natürlichen Synthese bzw. Expression der für die vierte Untereinheit der Cytochtom aa₃ Oxidase codierenden Gensequenz (ctaF) . Der verwendete Begriff „natürlich" soll dabei die Eigenschaften umfassen, die genetisch nicht veränderte Mikroorganismen, d.h. Wildtypstämme aufweisen. Weiterhin ist unter der Bezeichnung „abgeschwächt" die vollständige Deletion der für die vierte Untereinheit der Cytochtom aa₃ Oxidase codierenden Gensequenz ctaF zu verstehen.

Durch die „Abschwächung" der ctaF Gensequenz kann keine aktive Cytochrom aa₃ Oxidase gebildet werden. Die Reoxidation des Menachinons über den Weg des Cytochrom bc Komplexes und die Cytochom aa₃ Oxidase ist damit nicht mehr möglich. Die Reoxidation kann nur noch über den Weg der Cytochrom d-Oxidase erfolgen. Durch diese „Abschwächung" kann die Funktion der Atmungskette ge- zielt gesteuert werden und so auch der davon abhängige Stoffwechsel in gewünschter Weise beeinflußt werden.

Unter dem Begriff „verstärkt" ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Erhöhung der Genexpression eines Gens oder mehrerer Gene aus der Gruppe ctaC, ctaD, ctaE, ctaF , qcrA, qcrB, qrcC gegenüber dem entspre- chend nicht genetisch veränderten Mikroorganismus zu verstehen. Eine besonders vorteilhafte Ausführung des Verfahrens umfaßt dabei die Verstärkung aller Gene der vorgenannten Gruppe .

Zur Erzielung einer erhöhten Genexpression (Überexpression) kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden. Ferner kann die Promotor- und/oder Regulationsregion und/oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, entsprechend so verändert werden, daß die Expression mit erhöhter Rate erfolgt. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zu- sätzlich möglich die Expression im Verlaufe der fermen- tativen Herstellung der StoffWechselprodukte zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im

Chromosom integriert und amplifiziert sein. Weiterhin kann auch die Stabilität der exprimierten Polypeptide selbst erhöht sein oder durch die Verhinderung des Abbaus des Proteins verstärkt werden. Alternativ kann ferner eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.

Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al . [17], bei Guerrero et al . [18], oder Tsuchiya und Morinaga [19] .

Durch die Verstärkung eines Gens oder mehrerer Gene aus der Gruppe ctaC, ctaD, ctaE, ctaF , qcrA, qcrB , qrcC wird eine positive Beeinflussung der Atmungskette, insbesondere der durch das ctaF codierten Cytochtom aa₃ Oxidase erreicht. Diese wird sowohl in ihrer Stabilität als auch in ihrer Wirkungsweise zusammen mit anderen Komponenten der Atmungskette durch die Ausbildung ihrer vierten Untereinheit beeinflußt. So kommt es, wie weiter unten beschrieben, beispielsweise zu deutlichen Wachstumsdefekten, wenn das ctaF Gen deletiert wird. Durch die „Verstärkung" der Gene aus der oben genannten Gruppe kann gezielt die Reoxidation des Menachinons über den Cytochrom ei Komplex und die Cytochrom aa₂ Oxidase gefördert werden.

Die erfindungsgemäß hergestellten genetisch veränderten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch - Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulauf erfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Herstellung der StoffWechselprodukte kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel [20] oder im Lehrbuch von Storhas [21] beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschrei- bungen von Kulturmedien verschiedenener Mikroorganismen sind beispielsweise in [22] enthalten.

Unter „produzierenden Bakterien" sind im Sinne der vorliegenden Erfindung Corynebacterium glutamicum-Stämme oder homologe Mikroorganismen zu verstehen, die durch klassische und/oder molekulargenetische Methoden derart verändert sind, daß ihr Stoffwechselfluß verstärkt in die Richtung der Biosynthese der gewünschten Stoffwech- selprodukte läuft. Beispielsweise sind bei diesen Bakterien ein oder mehrere Gen(e) und/oder die korrespondierenden Enzyme, die an entscheidenden und entsprechend komplex regulierten Schlüsselpositionen des Stoffwechselweges (Flaschenhals) stehen, in ihrer Regulation verändert oder sogar dereguliert. Die vorliegende Erfindung umfaßt hierbei sämtliche bereits bekannten Produktionsstämme, bevorzugt der Gattung Corynebacteri- um oder homologer Organismen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Übertragung eines Gens oder mehrerer Gene aus der Gruppe ctaC, ctäD , ctaE, ctaF , qcrh, qcrB , qrcC in ein Wirtssystem. Dies schließt auch die Übertragung eines erfindungsgemäßen Genkonstrukts oder Vektors in ein Wirtssystem ein. Diese Übertragung von DNA in eine Wirtszelle erfolgt nach gentechnischen Methoden. Als bevorzugtes Verfahren sei hier die Transformation und besonders bevorzugt die Übertragung von DNA durch Elektroporation genannt.

Als besonders geeignet haben sich homologe Mikroorganismen erwiesen. Unter homologen Mikroorganismen sind Organismen zu verstehen, die alle einer verwandten Fa- milie angehören. Erfindungsgemäß sind hierunter Coryne- bacterianeae zu verstehen, in die die aus coryneformen Bakterien isolierten Gensequenzen der oben beschriebenen Gruppe eingebracht werden bzw. in denen das ctaF Gen abgeschwächt wird. Stellvertretend für einen geeig- neten homologen Mikroorganismus sei das Bakterium Cory- nebacterium glutamicum und bevorzugt der Stamm ATCC13032 genannt. Als Kulturmedium ist je nach Anforderungen ein Komplexmedium wie z. B. LB Medium oder auch ein Mineralsalzmedium, wie z. B. CGXII-Medium geeignet. Nach entsprechender Kultivierung kann die Bakteriensuspension geerntet und zur weiteren Untersuchung, beispielsweise zur Transformation oder zur Iso- lierung von Nukleinsäuren nach gängigen Methoden eingesetzt werden. Diese Vorgehensweise kann analog auch auf andere coryneforme Bakterienstämme angewendet werden. Dabei werden als Wirtssysteme Bakterien der Gattung Corynebacterium bevorzugt. Innerhalb der Gattung Coryne- bacterium wird besonders die Art Corynebacterium glutamicum und innerhalb der Gattung Brevibacterium besonders die Art Brevibacterium flavum bevorzugt. Zu den Vertretern dieser Gattungen zählen zum einen Stämme, die in ihren Eigenschaften als Wild Typ charakterisiert sind. Hier sind beispielsweise Corynebacterium glutami cum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 14752, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium me- lassecola ATCC 17965, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, zu nennen.

Darüber hinaus schließt die vorliegende Erfindung auch produzierende Bakterienstämme ein, die sich beispielsweise als Aminosäureproduktionsstämme auszeichnen. Diese können z. B. ausgehend von Wildtypstämmen durch klassische (chemische oder physikalische) oder gentechnische Methoden hergestellt werden. Beispiele für erfindungsgemäß geeignete Stämme sind u. a. Corynebacterium glutamicum ATCC 21586, Corynebacterium glutamicum KY 10150, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032ΔpanBC. Ferner sind erfindungsgemäß auch diejenigen Produkti- onsstämme geeignet, die dem Fachmann allgemein aus mikrobiellen Herstellungsverfahren bekannt sind. Die vorliegende Erfindung wird durch die ausgewählten Bei- spiele an Mikroorganismen näher charakterisiert, jedoch nicht limitiert.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Ver- fahren zum Auffinden von RNA, cDNA und DNA, um Nukleinsäuren, beziehungsweise Polynukleotide oder Gene zu isolieren, dadurch gekennzeichnet, daß man die für die vierte Untereinheit der Cytochrom aa₃ Oxidase codierende Gensequenz ctaF als Hybridisierungssonde einsetzt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen genetisch veränderten Mikroorganismus in dem die für die vierte Untereinheit der Cytochrom aa₃ Oxidase (ctaF) codierende Gensequenz abgeschwächt ist.

Ebenso umfaßt die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus enthaltend ein Gen oder mehrere Gene aus der Gruppe ctaC, ctaD, ctäE, ctaF , qcrA, qcr , grcC in replizierbarer Form, welche im Vergleich zum Wild Typ Mikroorganismus verstärkt sind.

Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Figuren zeigen modellhaft die, an der Atmungskette beteiligten Komponenten, mit den zugehörigen Genen sowie experimentelle Ergebnisse der durchgeführten Methoden mit dem ctaF Gen:

Es zeigt:

FIG. 1. Darstellung der Genomregion von C. glutamicum mit der Genregion für den bei Komplex (gcrABC) und die Cytochrom aa₃ Oxidase (ctaCE) und dem ctaF Gen ohne ctaD. Die DNA Regionen, die in den Stämmen 13032Δgcr und 13032ΔctaF deletiert wurden, sind ebenso eingezeichnet wie die Fragmente in den Plasmiden pJCl-gcrB_St und den entsprechenden Derivaten sowie im Plasmid pBM20-QXA.

FIG. 2: SDS-Polyacrylamid Gel Analyse des Cytochrom bc_± Komplexes und des Cytochrome aa₃ Einzel Komplexes sowie des Superkomplexes aus C. glutamicum, aufgereinigt durch Affinitäts Chromatographie mit StrepTactin Sepha- rose mittels QcrB_st (Derivat des Cytochrom b mit C-terminaler Strep-Tag II) oder CtaD_st (Derivat der Untereinheit I der Cytochrom aa₃ Oxidase mit einem C-terminalen Strep-Tag II) . Die Proteine wurden denaturiert, mit Hilfe eines 8-16% Tris-HCl Gradienten-Gels (Biorad) aufgetrennt und mit Coomassie Blau gef rbt. Spur 1, Cytochrom aa₃ Oxidase (7.2 μg Protein) aufgereinigt aus Stamm ΔQ-D_s ; Spur 2, Cytochrome bcχ-aa₃ Su- perkomplex aufgereinigt aus Stamm ΔC-D_st (4.7 μg) ; Spur 3, Cytochrom bcχ-aa Superkomplex aufgereinigt aus Stamm Δθ_-B_St (5.7 μg) ; Spur 4, Cytochrome , cX Komplex aufgereinigt aus Stamm ΔC-B_St (4.3 μg) .

FIG. 3: Absolute Redox-Differenzspektren von reduzierten intakten Zellen von C. glutamicum ATCC13032 (Wild

Typ) , 13032ΔctaD, und 13032ΔctaF. Die Zellen wurden vor Aufnahme der Spektren bei Raumtemperatur in 100 mM Tris-HCl Puffer (pH 7.5) resuspendiert, auf eine op- tische Dichte von 200 bei 600 nm eingestellt und durch Zugabe von Dithionit reduziert. Relevante Unterschiede der einzelnen Cytochrom-Muster sind durch Pfeile markiert. X = Wellenlänge (nm) ; Y = Absorption

FIG. 4: Sequenzvergleich des CtaF Proteins mit unter- schiedlichen Spezies anderer Actinomyceten. Mutmaßliche Transmembran Helices werden durch Linien und Ziffern markiert. Aminosäuren, die in mindestens 5 Sequenzen identisch sind, werden mit schwarzer Schattierung markiert. Konservierte Aminosäure-Austauschbereiche werden grau schattiert dargestellt. Die Bezeichnungen der Bakterien wurden wie folgt abgekürzt: Cgi , C. glutamicum (NCgl2114) ; Cdi , C. diphtheriae (NC_002935) ; tu, Myco- bacterium tuberculosis (Rv2199c) ; Mbo, M. bovis (NC_002945) ; Mle, M. leprae (ML0876) ; Sco, Streptomcy- ces coelicolor (NP_626410) ; Tfu, Thermobifida fusca (Tfus_p_278) .

Fig. 5: Sequenzprotokoll

SeQ ID No 1 : CtaC Aminosäuresequenz SeQ ID No 2: ctaC codierende Nukleotidsequenz

SeQ ID No 3 : CtaD Aminosäuresequenz

SeQ ID No 4 : ctaD codierende Nukleotidsequenz

SeQ ID No 5 : CtaE Aminosäuresequenz

SeQ ID No 6 : ctaE codierende Nukleotidsequenz SeQ ID No 7: CtaF Aminosäuresequenz

SeQ ID No 8 : ctaF codierende Nukleotidsequenz

SeQ ID No 9 : QcrA Aminosäuresequenz

SeQ ID No 10: qcrA codierende Nukleotidsequenz SeQ ID No 11: QcrB Aminosäuresequenz

SeQ ID No 12 : qcrB codierende Nukleotidsequenz

SeQ ID No 13 : QcrC Aminosäuresequenz SeQ ID No 14: qcrC codierende Nukleotidsequenz

SeQ ID No 15: P20 Aminosäuresequenz

SeQ ID No 16: p20 codierende Nukleotidsequenz

SeQ ID No 17: P24 Aminosäuresequenz

SeQ ID No 18: p24 codierende Nukleotidsequenz SeQ ID No 19: P29 Aminosäuresequenz

SeQ ID No 20: p29 codierende Nukleotidsequenz

Im Folgenden sollen die verwendeten Methoden beschrie- ben werden.

1. Kultivierung der verwendeten Mikroorganismen

In Tab. 1 und Tab. 2 sind die verwendeten Organismenstämme und Plasmide aufgelistet. Corynebacterium glutamicum wurde bei 30°C entweder in Luria Bertani (LB) Medium (Sambrook et al . 1989) oder in Brain Heart Infusion (BHI) Medium (Difco Laboratories, Detroit, USA) mit 2% (w/v) Glucose oder in CGXII Minimal Medium mit 4% Glucose als Kohlenstoff- und Energiequelle (Keilhauer et al . 1993) kultiviert. Falls erforderlich wurde Kanamycin (25 μg/ml) zugegeben. Escherichia coli (E. coli) wurde bei 37°C in LB Medium kultiviert. Gegebenenfalls wurde Kanamycin (50 μg/ml) oder Ampicillin (100 μg/ml) zugegeben.

Für die Präparation rekombinanter DNA wurde Enzyme der Firma Röche Diagnistics oder New England Biolabs einge- setzt. Die eingesetzten Oligonukleotide wurde von MWG Biotech (Ebersber) bezogen und sind in Tab. 2 aufgelistet . Klonierungsverfahren wurden nach bekannten Standardverfahren durchgeführt [8] .

2. Aufreinigung des Cytochrom hc₁ Komplexes

Die Aufreinigung des Cytochrom bei Komplexes, ein QcrB Derivat mit C-terminaler Strep Tag II [6] wurde wie folgt durchgeführt: Das gesamte ctaE-gcrCAB Genkluster mit der vermeintlichen Promotorregion wurde mittels PCR (Polymerase Chain Reaction) amplifiziert (Expand High Fidelity PCR System, Röche Diagnostics) . Dabei wurde ein reverser Primer mit Codons für StrepTag II (WSHPQFEK) und zwei vorangestellten Alanin Codons eingesetzt. Das daraus erhaltene 5,0-kb Fragment wurde in den E . coli-C .glutamicum Shuttle Vektor pJCl hineinklo- niert, wobei die durch Primer induzierten Xbal und Sall Restriktionsschnittstellen verwendet wurden. Das resultierende Plasmid pJCl-gcrB_st kodiert für ein QcrB Derivat mit zehn zusätzlichen Resten am C-Terminus (berechnetes Molekulargewicht 61,1 kDa) . Zur Aufreinigung des Cytochrom aa₃ Komplexes wurde in ähnlicher Weise ein

CtaD Derivat mit einem C-terminalen StrepTag II hergestellt mit dem Unterschied, daß nur die monocistroni- schen ctaD Gene mit ihrem nativen Promotor mittels PCR amplifiziert wurden. Das resultiernde 2,0-kb Fragment wurde über die Xbal Schnittstelle in den Vektor pJCl hineinkloniert, so daß daraus das pJCl-ctaD_st Plasmid resultierte. Das modifizierte CtaD Protein enthielt zehn zusäzliche Reste am C-Terminus (berechnetes Molekulargewicht 66,3 kDA) . Jedes der beiden Plasmide wurde in C. glutamicum 13032ActaD und 13032Δqcr mittels Elektroporation [8] eingebracht.

3. Membran-Isolation

10 g Zellmasse (Feuchtgewicht) wurden in 15 ml 100 mM Tris/HCl, pH 7,5 mit 5 mM MgS0₄ und 10 mg/1 Lysozyme suspendiert. Nach 45 min Inkubation bei 37°C wurde der Protease Inhibitor Phenylmethansulfonylfluorid (1 mM) zugegeben. Es wurde ein Zellaufschluß durchgeführt, in dem die Suspension 5 mal bei 207 MPa durch eine French- Press (SLM Aminco) geleitet wurde. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 27000 x g für 20 min entfernt. Der Überstand (zellfreier Extrakt) wurde für 90 min bei 150000 x g erneut zentifugiert . Der Rückstand mit der Cytoplasmamembran wurde in 10 mM Tris/HCl bei pH 7,5 resuspendiert (60-80 mg Protein/ml) und erneut für 90 min bei 150000 x g zentrifugiert . Die Membransubstanz wurde in einem kleinen Volumen des verwendeten Puffers mit 10% (v/v) Glycerin resuspendiert und bei -20°C gelagert .

4. Auf einigung der Protein Komplexe

Die gewaschene Membransubstanz wurde auf eine Protein- konzentration von 5 mg/ml in 100 mM Tris-HCl, enthaltend 50 μg/ml Eiweiß Avidin (Sigma) , eingestellt. Zur Isolation der Membranproteine wurde eine 10%ige (w/v) wässrige Lösung von n-Dodecyl-ß-D-Maltosid (Biomol) zugegeben, so daß sich eine Endkonzentration von 2 g Do- decylmaltosid/ g Protein einstellte. Nach 45 Minuten Inkubation auf Eis unter langsamem Rühren wurde die Probe für 20 min bei 180000 x g ultrazentrifugiert . Der Überstand wurde auf eine StrepTactin Sepharose Säule gegeben mit einem Säulenvolumen von 2 ml (IBA, Göttin- gen) und mit 100 mM Tris-HCL Puffer (pH 7,5) und 0,025% (W/v) Dodecylmaltosid equilibriert . Die Säule wurde mit 9 ml eines Puffers aus 100 mM Tris -HCl Puffer (pH 7,5), 100 mM NaCl , 2 mM MgS04 und 0,025% (w/v) Dodecylmaltosid gewaschen. Spezifisch gebundene Proteine wur- den mit dem selben Puffer und zusätzlich 2,5 mM

D-Desthiobiotin (Sigma) und 10% (v/v) Glycerin eluiert .

5. Protein Identifizierung durch Peptid-Massen- Fingerprinting

Die durch SDS-PAGE aufgetrennten und mit Coomassie Blue gefärbten Proteine wurden nach bekannter Methode [9] durch Peptid-Massen-Fingerprinting nach Verdau mit Trypsin (Promega) oder mit Cyanogen Bomid [10] identifiziert. Peptidmassen Datenbanken wurden eingesetzt, um lokal einen Ausschnitt des 3312 C. glutamicum Poteins zu suchen. Diese Datenbank wurde durch die Degussa AG

(Frankfurt) zur Verfügung gestellt.

6. Enzym Untersuchung

Die N,N,N' ,N"-Tetramethyl-p-Phenylendiamin (TMPD) Oxidase Aktivität wurde spektrophotometrisch bei 562 nm in Luft gesättigtem 100 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,5), der 200 μM TMPD enthielt, bei 25°C gemessen. Für die Berechnung der Aktivität wurde ein Extinktions Koeffizient von 10,5 mM^"1cm^"1 eingesetzt [4] . Eine Einheit der Enzymaktivität entspricht der Menge von 1 μmol TMPD welches in einer Minute oxidiert wird. 7. Dif erenz-Spektroskopie

Dithionit-reduzierte minus Ferricyanid-oxidierte Differenzspektren wurden bei Raumtemperatur mit einem Jasco V560 Spektrophotometer, welches mit einem Silicium- Photodioden- Detektor für trübe Proben ausgestattet war, durchgeführt [11] . Dabei wurde eine Küvette mit einem 5 mm breiten Detektionsfenster eingesetzt. Die Proteinkonzentration wurde mit dem Bicinchoninsäure (BCA) Protein-Assay [14] und Rinderserum-Albumin als Standard durchgeführt. Der Häm-Gehalt wurde aus den

Differenz Spektren durch folgende Wellenlängepaare und Absorptionskoeffizienten (mM^_1cm^"1) bestimmt: Häm a, Δε 650-soo nm = 11,6 [12] ; Häm b, Δε_5S2-5₇7nm = 22; Häm c Δε 552-

_{5 0}nm = 19,1 [13] .

Ausführungsbeispiele: a. Isolation des Cytochrom Jcι-aa₃ Superkomplexes

Zur Aufreinigung des bc_x Komplexes und der Cytochrom aa₃ Oxidase wurden Membranen der komplementierten Stämme ΔQ-Bst und ΔC-Dsτ isoliert und die nach Solubilisie- rung mit Dodecylmaltosid erhaltenen Proteine der Affinitätschromatographie mit StrepTactin Sepharose unterzogen. Nach dem Waschen wurden die spezifisch gebundenen Proteine mit Desthiobiotin eluiert und mittels SDS- Page analysiert. Überraschenderweise wiesen die Prote- inmuster der beiden Stämme ΔQ-B_St (Fig. 2, Spur 3) und ΔC-D_ST (Fig. 2, Spur 2) eine hohe Ähnlichkeit auf mit 8 Proteinbanden und scheinbar identischem Molekulargewicht. Die in Fig. 2 bis auf das 17-kDA-Protein (P17) dargestellte Identität der Proteine wurde mit Hilfe des Peptid-Mass-Fingerprinting wie oben beschrieben und ei- ner MALDI (matrix-assisted laser desorption ionizati- on) -TOF (time of light) Massensprektrometrie nachgewiesen. Für die Proteinbanden mit einem Molekulargewicht von 52 kDa bzw. 29 kDa wurde nachgewiesen, daß sie aus jeweils zwei unterschiedlichen Proteinen bestehen. Insgesamt konnten 10 Proteine nachgewiesen werden. Neben den bereits bekannten Untereinheiten des bc Komplexes (QcrA, QcrB, QcrC) bzw. der Cytochrom aa₃ Oxidase (CtaC, CtaD, CtaE) wurden 4 weitere Proteine mit einem Molekulargewicht von 29 kDa (P 29) , 24 kDa (P24) , 20 kDa (P20) und 19 kDa (P19) nachgewiesen. Diese können jeweils den Proteinen NCgl2611 (Cgl2664) , NCgl2177 (Cgl2226) , NCgll970 (Cgl2017) und NCgl2114 (Cgl2194) zugeordnet werden. Diese NCgl-Nummern entsprechen der Nomenklatur der öffentlich zugänglichen NCBI (National Center for Biotechnology Information) bzw. die in den Klammern verwendeten Nummern der Nomenklatur der DDBJ (DNA Data Bank of Japan) Datenbanken. Der Fachmann weiß, daß das komplette Genom von C. glutamicum aus allgemein zugänglichen Datenbanken identifizierbar ist (wie z. B. NCBI) und durch Techniken der Genklonierung, z. B. unter Einsatz der Polymerasekettenreaktion (PCR) klonierbar ist .

b. Aufreinigung der Cytochrom aa₃ Oxidase als Einzel- komplex

Um die Cytochrom aa₃ Oxidase als Einzelkomplex und nicht als Superkomplex zusammen mit dem bc₁ Komplex aufzureinigen, wurde das Plasmid pJCl-ctaD_st in C. glu- tamicum 13032Δgcr transferiert. Der daraus resultierende ΔQ-D_st-Stamm wies infolge der fehlenden Qcr Gene dieselben Wachstumsdefekte wie der 13032Δgcr Stamm auf und bildete sowohl Wild-Typ CtaD als auch Strep-Tagged CtaD. Das Eluat der StrepTactin Affinitätschromatographie enthielt vier Proteine (Fig.2, Spur 1), die als CtaD, CtaC, CtaE und P19 identifiziert wurden. Es wurde eine TMPD Oxidaseaktivität der isolierten Cytochrom aa₃ Oxidase von 0,34 U/mg ermittelt sowie ein Turn- Over Wert von 1,1 TMPD oxidiert / aa₃ s^'1 . In Folge des fehlenden Cytochrom c . wurde eine 10-fach geringere Oxidaseaktivität gegenüber der Aktivität des Superkom- plexes ermittelt.

c. Beweis der vierten Untereinheit der Cytochrom aa₃ Oxidase

Um die Bedeutung der Proteine P29, P24, P20 und P19 für die Atmungskette und die Bildung des bc -aa₃-Superkomplexes nachzuweisen, wurden die entsprechenden Gene aus dem Chromosom von C. glutamicum deletiert. Die daraus entstandenen Stämme wurden mit ΔC2611, ΔC2177, ΔC1970 und ΔC2114 bezeichnet. Die ersten drei Stämme wiesen keine deutlichen Unterschiede im Wachstumsverhalten oder in der Bildung des a- , b- , und c-Typ Cytochroms auf. Offenbar sind die Proteine P29, P24, und P20 nicht essentiell für die Bildung und die Aktivität des bc - aa₃-Abzweigs der Atmungskette bzw. die Funktion und die Interaktion des bc_x-aa₃ Superkomplexes.

Im Gegensatz dazu führte die Deletion des Gens NCgl2114, welches für das P19 Protein codiert, zum Phä- notyp des 13032ΔctaD Stammes. So war das Wachstum deutlich beeinträchtigt, Cytochrom a war nahezu nicht im Spektrum der Dithionit-reduzierten Zellen vorhanden und der Gehalt an Cytochrom war deutlich geringer als im Wild Typ (Fig.3) . Das P19 Protein ist daher essentiell für die Bildung einer aktiven Cytochrom aa₃ Oxidase. Das Protein P19 wurde nur bei der Aufreinigung des Superkomplexes oder der isolierten Cytochrom aa₃ Oxidase nachgewiesen, nicht jedoch bei der Aufreinigung des isolierten bei Komplexes (Fig.2) . Das Protein P19 wird auf Grund der Interaktion mit den Untereinheiten der Cytochtom aa₃ Oxidase mit aufgereinigt und kann daher zur bisher noch nicht bekannten vierten Untereinheit der Cytochtom aa₃ Oxidase aus C. glutamicum gezählt werden.

Das Protein P19 besteht aus 143 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 15,5 kDA. Es weist drei hydrohobe Regionen auf, und zwar im Bereich der Aminosäuren 7-27, 40-60, sowie 97-130, wodurch drei oder vier Trans- membranhelices gebildet werden. Die erste Transmembran- helix dient vermutlich als Teil eines Signalpeptids . Der in Fig. 4 dargestellte Sequenzvergleich zeigt, daß das für das P19 Protein codierende Gen ctaF mit korrespondierenden Genen aus der Gruppe der Actinomycetales Homologien aufweist: C. diphtheriae 68% Identität; My- cobakterien 38-39% Identität; S. coelicolor 39% Identität und Thermobifida fusca 33% Identität. Bei all die- sen Organismen sind die korrenpondierenden Gene den

Genclustern des ctaC oder des ctaD nachgeschaltet. Im Fall von S. coelicolor und T. fusca werden diese kor- renspondierenden Gene zusammen transkribiert . Daraus kann geschlossen werden, daß die mit dem P19 Protein homologen Sequenzen die vierte Untereinheit der Cytochrom aa₃ Oxidase in Actinomyceten repräsentieren. Tab. 1: Verwendete Bakterienstämme und Plasmide

Stamm/Plasmid Relevante Charakteristik Quelle

ATCC23032 Wild Typ , Biotin-auxotroph [7]

13032ActaD In-frame Deletion der ctaD Gene , [2 ] codierend für Untereinheit I der Cytochrom aa₃ Oxidase

13032Δgcr Deletion der qcrCAB Gene codierend, [2 ] für die drei Untereinheiten des hc_x Komplexes

ΔC-D_st 13032ΔctaD mit pJCl- ctaZ3_st Diese Arbeit

ΔC-B_st 13032ΔctaD mit pJCl- gcrB_st Diese Arbeit

ΔQ-B_st 13032Δgcr mit pJCl-gcrB_st Diese Arbeit

ΔQ-D_st 13032Δgcr mit pJCl- ctaD_st Diese Arbeit

ΔQ-B_st-C67S 13032Δgcr mit pJCl -gcrB_st-C67S Diese Arbeit

ΔQ-B_st-C177S 13032Δgcr mit pJCl -gcrB_st-C177S Diese Arbeit

ΔCgl970 In-frame Deletion des Gens NCgll941 Diese Arbeit

ΔCg2114=ΔctaF In-frame Deletion des Gens NCgl2114 Diese Arbeit

ΔCg2177 In-frame Deletion des Gens NCgl2145 Diese Arbeit

ΔCg2611 In-frame Deletion des Gens NCgl2574 Diese Arbeit

Plasmide pJCl Kan^R; E. coli-C. glutamicum Shuttle [IS] Vektor pJCl-ctaD_St Kan^R; Expressions Plasmid für Diese Arbeit Strep-tagged CtaD; ctaD exprimiert durch eigenen nativen Promotor und 10 zusätzlichen Codons am 3 ^v -Ende (AAWSHPQFEK) pJCl-gcrB_St Kan^R; Expressionsplasmid für Strep- Diese Arbeit Tagged QcrB; ctaE- qcrCAB exprimiert mit eigenem nativen Promoter; gcrB mit 10 zusätzlichen Codons am 3 ^λ - Ende (AAWSHPQFEK) pBM20-QXA Amp^R; pUC-BM20 Derivativ mit 2.0-kb Diese Arbeit Z al-Apal Fragment aus pJCl-gcr-3_st; verwendet für Site-directed Muta- genese

Tab . 2 : Verwendete Oligonucleotide

Primer Sequenz (5^x-»3^λ)

Primer für die Konstruktion von pJCl - ctaD_st and pJCl- qcrBst ctaD_st-for ACTTCTAGATGACTGAACCTGGCAGCGACC c aDs_t-rev TGATCTAGATTACTTCTCGAACTGTGGGTGGGACCAAGCTGCGCG

GCTGGAGTCAGATGCAAG gcrB_st-for ACTTCTAGATAGGGTTGAGCATTTTGTC gcrB_st-rev AGTGTCGACTTACTTCTCGAACTGTGGGTGGGACCAAGCTGCGTT

CTTGCCCTCATTCTTGTC

Primer für die Konstruktion von Deletionsmutanten

ΔCgl970-l GACTCTAGAATCTTCGCAGCATCGGTTCC

ΔCgl970-2 CCCATCCACTAAACTTAAACACGTGTGGGAGGAACCAGCCAC

ΔCgl970-3 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCTGCGTGCTGCAGATTCTGCG

ΔCgl970-4 GATGTCGACGTTGTTGATGCCCAGGCACTG

ΔCg2114-1 GACTCTAGATAACCCAATTCACGGCAACTC

ΔCg2114-2 CCCATCCACTAAACTTAAACAGTACATGAGTTTTGCTGAAGACTTC

ΔCg2114-3 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCTCAACCTTCAGTACGGCGTGC

ΔCg2114-4 GATGTCGACCTTCCGGGAACTTTTCGTA

ΔCg2177-l GACTCTAGAGGATTCCCGTGCGGCTGGTCT

ΔCg2177-2 CCCATCCACTAAACTTAAACATTTACACCCGAGACTACGTACCA

ΔCg2177-3 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCCATTCGGTCCGGGATACCGC

ΔCg2177-4 GATGTCGACGGTTCTAACGATTTTCGCCGTC

ΔCg2611-l GACTCTAGATAGCCAACGCTTCGCCCAAGTCATG

ΔCg2611-2 CCCATCCACTAAACTTAAACACTTCACGGATTCGTCCTCCATTGG

ΔCg2611-3 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGAGGTCGGCGGAGACACTGCAG

ΔCg2611-4 GTCGTCGACAGCTGCGGTGCGCTCAGCG TAB. 3: Aufreinigung des Cytochrom bc_x -aa₃- Superkomplexes aus Membranen von C. glutamicum ΔQ-B_st und ΔC-D_St

Die Chinol Oxidase Aktivität wurde mittels DMNH₂ (2,3- Dimethyl-1, 4-Naphtoquinone in reduzierter Form) als Substrat durch Messung der Sauerstoffaufnähme mittels einer Clark-Sauerstoffelektode bestimmt. Eine Einheit (U) entspricht 1 μmol 0₂-A.ufnähme pro Minute. Die Turn- over Nummer (TN) wurden berechnet als Elektronentrans¬

10 fer pro Cytochrom aa pro Sekunde. Die in den Klammern angegebenen Werte wurde berechnet als Elektronentransfer pro Cytochrom b pro Sekunde. N.d. = nicht bestimmt

Aufreinigungsschritt Protein Chinol Oxidase Aktivität mg U U/mg TN (s^_1) Ausbeute (%)

Membranen aus 44.7 32.3 0. .72 n.d. 100

Stamm ΔQ-B_st

Dodecylmaltosid Extrakt 15.3 14.5 0. .95 314 45

StrepTactin Sepharose 0.64 1.7 2, .70 220 5.4

Eluat

Membranen aus 42.3 33.5 0. .79 n.d. 100

Stamm ΔC-D_st

Dodecylmaltosid Extrakt 17.9 15.2 0. .85 365 45

StrepTactin Sepharose 0.50 1.5 2. .96 93 4.4

Eluat (152) Literatur

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Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e

1. Verfahren zur Herstellung von Stoffwechselprodukten, dadurch gekennzeichnet , daß man folgende Schritte durchführt :

d) Fermentation der das gewünschte Stoffwechselprodukt produzierenden Bakterien, in denen man die für die vierte Untereinheit der Cytochtom aa₃ 0- xidase codierende Gensequenz ctaF abschwächt o- der zusammen mit einem Gen oder mehreren Genen aus der Gruppe ctaC, ctaD, ctaE, qcrA, qcrB, qcrC verstärkt .

e) Anreicherung des gewünschten Stoffwechselprodukts im Medium oder in den Zellen der Bakteri- en, und

f) Isolieren des entsprechenden Stoffwechselprodukts .

2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennz ei chnet , daß das StoffWechselprodukt eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennze i chne t , daß das Stoffwechselprodukt eine organische Säure vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe Essigsäure, Citronensäure, Isocitronensäure, Milchsäure, Bern- steinsäure, Fumarsäure, Ketoglutarsäure, Brenztrau- bensäure und Äpfelsäure ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Stoffwechselprodukt ein Vitamin ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Stoffwechselprodukt ein Nukleosid oder Nukle- otid ist .

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das StoffWechselprodukt ein ein- oder mehrwertiger Alkohol ist .

7. Verfahren zum Auffinden von RNA, cDNA und DNA, um Nukleinsäuren, beziehungsweise Polynukleotide oder Gene zu isolieren, dadurch gekennzeichnet , daß man die für die vierte Untereinheit der Cytochrom aa₃ Oxidase codierende Gensequenz ctaF einsetzt.

8. Mikroorganismus in dem die für die vierte Untereinheit der Cytochrom aa₃ Oxidase codierende Gensequenz (ctaF) abgeschwächt ist.

9. Mikroorganismus enthaltend ein oder mehrere Gene aus der Gruppe ctaC, ctaD, ctaE, ctaF, qcrA, qcrB, qcrC in replizierbarer Form, welche im Vergleich zum Wild Typ Mikroorganismus verstärkt sind.