CN1732268A - 不具有海藻糖的生产氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及产生氨基酸的方法，所述方法包括培养棒杆菌属或短杆菌属的微生物，其中所述微生物部分或全部缺失otsAB、treZ和treS基因座中的至少一个，并随后从培养基中分离氨基酸。

Description

不具有海藻糖的生产氨基酸的方法
技术领域
对可获得的谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)基因组序列数据的分析导致提出细菌中存在所有三个已知的海藻糖生物合成途径，即从UDP-葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸(OtsA-OtsB途径)、从malto-寡糖或α-1，4-葡聚糖(TreY-TreZ途径)、或从麦芽糖(TreS途径)合成海藻糖。通过染色体缺失失活三条途径中的仅一条，不会对谷氨酸棒杆菌的生长造成严重的影响，而同时失活OtsA-OtsB和TreY-TreZ途径或所有三条途径导致相应突变体不能合成海藻糖，并且不能在含有多种糖底物的基本培养基中有效生长。通过向培养肉汤中加入海藻糖，这种生长缺陷可很大程度地得到逆转。
另外，发现了涉及糖原合酶(GlgA)的从ADP-葡萄糖合成糖原的可能途径。当在糖过量的条件下生长时，发现谷氨酸棒杆菌积聚大量的糖原。染色体glgA基因的插入失活，导致谷氨酸棒杆菌细胞不能积聚糖原，并废除了otsAB背景中的海藻糖合成，这表明通过TreY-TreZ途径产生海藻糖依赖于功能性的糖原生物合成途径。
当在缺乏海藻糖的基本肉汤中生长时，具有失活的OtsA-OtsB和TreY-TreZ途径、不产生海藻糖的突变体，显示出改变的细胞壁脂类组成。在这些条件下，突变体在其细胞壁脂类部分同时缺乏主要的含海藻糖的糖脂，即海藻糖棒杆菌分枝菌酸单酯(monocorynomycolate)(TMCM)和海藻糖棒杆菌分枝菌酸二酯(dicorynomycolate)(TDCM)。我们的结果表明，海藻糖含量少的谷氨酸棒杆菌突变体的细胞壁脂双层的显著改变，可能是在基本培养基中观察到该株生长缺陷的原因。此处报道的谷氨酸棒杆菌中海藻糖生物合成的遗传和生理学剖析的结果，可能与含分枝菌酸的棒状杆菌的全部系统发育组普遍相关。
背景技术
谷氨酸棒杆菌是革兰氏阳性土壤菌，其最初以它可产生和分泌谷氨酸的能力而分离(Kinoshita等.1957)。现在，使用这种微生物遗传改进菌株的工业氨基酸生产方法，用于满足正在增长的氨基酸全球市场，尤其是L-谷氨酸和L-赖氨酸。
在细菌的分类系统中，棒杆菌属和分枝杆菌属、诺卡氏菌属、红球菌属和一些相关的分类单位属于含有分枝菌酸的放线菌群。这些属也是系统发育上相关的。对于革兰氏阳性菌而言不同寻常的是，它们的细胞壁在质膜外含有特征性的疏水层。据显示，该层在棒杆菌的药物和底物渗透性中扮演重要角色。与外层由磷脂和脂多糖组成的革兰氏阴性菌相反，棒杆菌和相关分类单位的外部脂类层的主要成分是分枝菌酸酯。最近显示，棒杆菌细胞的外部疏水屏障表示由与细胞壁供价连接的分枝杆菌酸(mycolate)和非共价连接的糖脂共同组成的脂双层。两个含有海藻糖的棒杆菌分枝杆菌酸酯，即海藻糖棒杆菌分枝菌酸单酯(TMCM)和海藻糖棒杆菌分枝菌酸二酯(TDCM)是该脂双层的主要游离脂类部分。谷氨酸棒杆菌中海藻糖的存在并不仅限于这两个结构成分。作为对高渗压力的反应，在谷氨酸棒杆菌中观察到大量的游离海藻糖。另外，在过量生产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌ATCC 21253株的发酵期间，发现海藻糖是分泌至生长培养基中的副产物之一。
从细菌至植物、昆虫和哺乳动物，已在多种原核和真核生物中发现海藻糖(α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖甙)--广泛分布于自然界的非还原性二糖。海藻糖的生物学角色在不同生物中变化极大。当在细菌中时，它可作为碳源(大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、或在渗透压休克条件下作为可混溶溶质被合成(大肠杆菌)，或扮演结构角色(棒状杆菌科(corynebacteriaceae))。在酵母和丝状真菌中，海藻糖主要作为储备碳水化合物或针对不同压力因素的保护者而贮藏于胞内。在昆虫的一些物种中，积聚海藻糖作为在飞行期间可迅速使用的糖源而被积聚。
在不同生物中观察到海藻糖生物合成的几个可能途径。最丰富的途径，即从UDP-葡萄糖和葡萄糖6-磷酸合成海藻糖(OtsA-OtsB途径)，在原核生物得到广泛的描述，并且是真核生物中唯一已知的途径。该途径的第一个步骤是用UDP-葡萄糖浓缩葡萄糖6-磷酸，这导致海藻糖6-磷酸的形成和UDP的释放。然后，通过海藻糖6-磷酸的脱磷酸化而形成海藻糖。这种生物合成反应机制发现于如大肠杆菌和酵母之类的细菌中。在大肠杆菌，反应由海藻糖6-磷酸合酶(OtsA)和海藻糖6-磷酸磷酸酶(OtsB)催化。两种酶的转录由渗压休克或进入稳定生长期而得到诱导。在酿酒酵母(S.cerevisiae)中，两个反应都由一种酶复合物催化，所述酶复合物由两个催化多肽(TPS1和TPS2)、以及一个在压力条件下负责激活复合物的调节亚单位组成。也在高等真核生物的基因组中鉴定了相应酶的编码区。使用糖原作为起始底物合成海藻糖的备选途径发现于一些细菌和古细菌(archaea)中。在这种情况下，首先通过转糖基作用，将葡聚糖多体还原端的末端α(1→4)糖苷键转变成α(1→1)糖苷键，这导致末端海藻糖苷单位(trehalosyl unit)的形成。随后，通过水解将海藻糖从多体的末端释放。本途径所包括的酶是低聚麦芽糖基海藻糖(maltooligosyltrehalose)合酶(TreY)和低聚麦芽糖基海藻糖水解酶(TreZ)。在一些细菌中发现基于麦芽糖生产海藻糖的其它海藻糖合成途径。在这种情况下，由海藻糖合酶(TreS)催化的单一反应合成海藻糖，所述海藻糖合酶将麦芽糖的α(1→4)糖苷键转变成α(1→1)键，以形成海藻糖(TreS途径)。据显示，虽然TreY和TreS的分子内转糖基活性相近，但是它们在体内不可互相置换，因为它们的底物专一性不同。
除分枝杆菌物种外，在大多数研究的细菌中，仅发现三条生物合成途径中的一条。已通过体外试验显示分枝杆菌属的菌株具有海藻糖合成的所有三条途径。问题是在这些细菌中海藻糖具有什么样的生物角色，以使其生物合成必须具有三倍的覆盖度。同样，如果系统发育上与分枝杆菌相关的棒杆菌含有类似丰富的海藻糖生物合成途径的装置，进行分析也是有意义的。
为回答这些问题，我们搜索了可获得的基因组数据，以鉴定谷氨酸棒杆菌所使用的海藻糖生物合成途径。通过失活编码已确认途径中的酶的染色体基因，我们意图探索海藻糖体内合成中不同途径的角色。同样，通过失活这些基因，我们意图降低或甚至废除海藻糖合成，以揭示谷氨酸棒杆菌中该糖的生理角色。
本发明提供产生氨基酸的方法，优选赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和谷氨酸，所述方法包括培养棒杆菌属或短杆菌属的微生物，其中所述的微生物部分或完全缺乏由otsAB、treZ和treS形成的组中的至少一个基因座，并随后从培养基中分离氨基酸。
本发明优选的实施方案是包括培养棒杆菌或短杆菌属微生物的产生氨基酸的方法，其中所述的微生物部分或完全缺乏otsAB基因座，或otsAB与glgA或glgA和treS基因座的组合。
本发明另一个优选的实施方案是包括培养微生物的产生氨基酸的方法，其中所述的微生物缺乏仅与treZ组合、或与treZ和treS组合的otsAB基因座。
基因座具有下述含义：
glgA：糖原合酶
otsA：海藻糖6-磷酸合酶
otsB：海藻糖6-磷酸磷酸酶
treS：海藻糖合酶
treY：低聚麦芽糖基海藻糖合酶
treZ：低聚麦芽糖基海藻糖水解酶
otsAB代表otsA或otsB或otsA和otsB。
上述基因座编码部分的基因序列是本领域公知的，例如从WO2001/00843 otsA(SEQ ID NO：17)、otsB(SEQ ID NO：1139)、treZ(SEQ IDNO：1145)，或从WO 2002/51231 treS(SEQ ID NO：3)，或从EP 1108790glgA(SEQ ID NO：1238)中获知。
根据本发明，调节在合适的条件下培养可产生氨基酸的棒杆菌属或短杆菌属微生物的海藻糖代谢相关的特异基因，以阻止在所述微生物中合成海藻糖。以这种方式对微生物进行调节，以便所得的调节的微生物缺失otsAB、treZ和treS基因座中的至少一个。缺失可以是部分的或全部的。
部分缺失表示，通过插入、缺失或置换基因座的一个或多个核苷酸，从而改变该基因座的一部分。缺失表示基因座的正常功能已经得到改变。关于特异基因座的部分缺失的微生物表示相关基因座保留一些原始的功能，而完全缺失的微生物表示相关基因座已完全丧失其原始功能。
产生缺失特异基因座的微生物的优选方法是缺失所述基因座的一个或多个核苷酸，直至完全缺失全部基因座。缺失可在相关基因座的编码区或调节区进行，例如在启动子区。
根据本发明的微生物产生海藻糖的能力降低(直至0％)。因而，该微生物关于氨基酸的生产能力得到提高。
材料和方法
菌株、培养基和培养
谷氨酸棒杆菌和用于本研究的质粒列于表1中。加之，大肠杆菌菌株XL1-blue(Bullock等，1987)和S17-1(Simon等，1983)分别用于质粒构建和将整合载体转移至谷氨酸棒杆菌中。限制性缺陷的谷氨酸棒杆菌菌株R163(Liebl等，1989a)用于制备质粒构建体，所述的质粒构建体预先以电穿孔导入该谷氨酸棒杆菌型菌株中。菌株维持在含有根据需要添加抗生素的LB平板上。
为了研究海藻糖合成，谷氨酸棒杆菌在明确的BMC培养基(Liebl等，1989b)上生长，所述BMC培养基添加有不同量的蔗糖或正文中提到的其它碳源。从LB平板上接种至5ml LB、并过夜(30℃、210转/分)生长的细胞用作接种含有5ml BMC肉汤的试管、或含有30ml BMC肉汤的烧瓶的预培养物。主要培养物的接种密度是OD600为0.1-0.2。当需要时，向培养基中加入终浓度为20μg ml-1的卡那霉素。所有培养物在旋转振荡器(30℃、210转/分)上生长。发现超过200转/分的快速振荡对非产生海藻糖的突变体的生长是非常重要的(见正文)。经过不同孵育时间后，取出样品。通过使用Ultrospec 3000分光光度计(Pharmacia，Uppsala，瑞典)测量600nm的OD值，监测培养物的生长。必要的话，在测量之前，将样品稀释至OD值低于0.3。
重组DNA技术
根据Sambrook等(1989)，执行如质粒分离、DNA限制和连接之类的基本方法。限制性内切酶和DNA修饰酶购自MBI Fermentas(St.Leon-Rot，德国)或New England Biolabs(Frankfurt，德国)。在预先用10μg ml-1溶菌酶于37℃处理30分钟后，使用碱抽提法(Birnboim & Doly，1979)，分离谷氨酸棒杆菌质粒DNA。如Lewington等(1987)所述分离谷氨酸棒杆菌基因组DNA。使用Pfu聚合酶(Promega，Mannheim，德国)进行PCR反应。根据制造商的说明书，使用TOPOR克隆试剂盒(Invitrogen，Karlsruhe，德国)将一些PCR产物直接克隆至载体pCR4。
谷氨酸棒杆菌DSM20300的ΔotsAB、ΔtreZ、ΔtreS和glgA∷km突变体的构建
基于携带sacB基因的谷氨酸棒杆菌不能在含有高糖浓度的培养基中生长的两步重组系统(Schaefer等，1994)被用于染色体失活谷氨酸棒杆菌的海藻糖生物合成基因。为了进行每个计划的失活实验，构建可移动的谷氨酸棒杆菌整合载体，所述整合载体含有带有内部缺失的目的基因，因此提供了两个用于重组的同源区。
为失活otsA-otsB基因，分别扩增两个染色体DNA区，并再连接，导致两个基因的符合阅读框的缺失。使用引物tre351_f和tre351_r(表2)，扩增携带完整otsA ORF的1.5kb片段，并克隆至pBluescript KS的EcoRV限制性位点，这导致pBlueKS∷otsA的形成。然后，利用引物otsAB_f和otsAB_r，扩增携带部分otsB的0.65kb区。将用HindIII和SphI切割的PCR产物置换携带otsA的质粒的0.90kb HindIII-SphI片段，这导致otsA的5’部分和otsB基因的3’部分的符合阅读框的融合。使用XbaI，将得到的otsAB ORF克隆至可移动的整合载体pCLiK8.2，以失活谷氨酸棒杆菌的染色体otsAB基因座。
按下述构建可移动的treZ失活质粒：利用引物treZ_f和treZ_r扩增2.5kb treZ片段。利用SalI在treZ中引入内部的0.65kb框内缺失之前，用XbaI切割PCR产物，并克隆至pCLiK3。通过XbaI，将treZ基因克隆至可移动的整合载体pCLiK8.2中。
为进行treS的染色体失活，利用PCR引物treS_f和treS_r扩增后，将该基因克隆至pBluescriptKS。利用EcoRV和StyI消化所得到的质粒，并用Klenow酶处理后，将质粒再连接，这导致在克隆的treS ORF中形成0.65kb的框内缺失。使用XbaI，将截短的基因克隆至可移动的质粒pK18mobsac(Schaefer等，1994)中。
将三个用于失活OtsA-OtsB、TreY-TreZ和TreS途径的最终构建体，转化进大肠杆菌S17-1菌株，并根据Schfer等(1990)所述的方法转移至热应力(heat-stressed)下的谷氨酸棒杆菌中，其中所述的构建体分别命名为pCLiK8.2∷ΔotsAB、pCLiK8.2∷ΔtreZ和pK18ms∷ΔtreS。通过置于含有20μg ml-1卡那霉素的LB平板上，对成功的初次重组体(染色体整合突变体)进行了选择。为从第二次重组事件中选择，将整合突变体置于含有5-10％(w/v)蔗糖的琼脂板上。在一些情况下(见结果)，按2％(w/v)加入海藻糖。
通过一步染色体整合，失活推定的糖原合酶基因(glgA)。为这一目的，使用glg_f和glg_r作为PCR引物，扩增glgA的0.6kb的内部片段。使用其唯一的XbaI位点，将PCR产物克隆至整合载体pCLiK6。如上描述，使用大肠杆菌S17-1转移所得的质粒。整合突变体在添加卡那霉素的LB培养基上选择。
通过Southern印迹分析和特异的PCR反应，检验所获得突变体的基因型。pWLQ2∷otsAB、pWLQ2∷otsA、pWLQ2∷treZ和pWLQ2∷treS的构建
使用谷氨酸棒杆菌—大肠杆菌穿梭表达载体pWLQ2(Liebl等，1992)，构建携带不同海藻糖生物合成基因的表达质粒。将otsA基因在PCR扩增后最初克隆进的pBlueKS∷otsA质粒用于构建携带otsA基因的表达质粒。将携带otsA基因的pBlueKS∷otsA的1.6kb BamHI-SalI片段与利用相同酶切开的pWLQ2连接。在得到质粒(pWLQ2∷otsA)中，otsA基因在Ptac启动子的控制下。为构建pWLQ2∷otsAB，使用引物otsB_f和otsB_r，从谷氨酸棒杆菌染色体上扩增otsB基因。在pCR4-TOPO中克隆PCR产物后，将1kb BamHI片段切下，并插入pWLQ2∷otsA的BamHI位点。在所得到的质粒中命名pWLQ2∷otsAB为，两个ots基因在Ptac启动子的调节下共表达。
为构建pWLQ2∷treZ，将利用引物treZ_f2和treZ_r2产生的2.5kbPCR产物克隆至pCR4-TOPO。然后，利用BamHI切下treZ基因，并再克隆至pWLQ2的BamHI位点。通过限制性分析treZ对Ptac启动子的正确方向，对所获得的质粒进行检查。为构建pWLQ2∷treS，使用引物treS_f3和treS_r3扩增作为2kb片段的谷氨酸棒杆菌染色体treS基因。最初克隆至pCR4-TOPO后，将treS基因切下，并使用人工添加的SalI位点再克隆至pWLQ2。分离pWLQ2∷treS质粒，其中treS共线性地朝向所述质粒的Ptac启动子。通常在经过限制性缺限菌株中对它们进行传代，以增加其效率后，所有质粒通过电穿孔(Liebl等，1989a)转化进谷氨酸棒杆菌菌株。菌株在20μg ml-1的卡那霉素选择下生长。通过添加终浓度为1mM的IPTG，诱导启动子Ptac驱动的基因表达。
脂类的分离和分析
如Puech等、(2000)所述分离细胞脂类。如上述(见样品制备)，孵育(在210转/分、30℃生长)约10小时后，收获细胞并进行洗涤。为抽提脂类，将细胞悬于CHCl3/CH3OH[1∶1(v/v)]，并在室温振荡16小时。利用CHCl3/CH3OH[2∶1(v/v)]对残余的细菌残留物再抽提2次，将有机相合并，并在真空离心机中浓缩。通过额外的水[2∶1(v/v)]抽提，移去溶于水的污染物，并将有机相冷冻干燥，以获得粗制的脂类抽提物。将脂类抽提物溶于氯仿，终浓度为50μg μl-1，并经TLC分析。将样品应用于硅胶包被的铝板(type G-60，5×10cm，Merck)，并利用CHCl3/CH3OH/H2O[30∶8/1(v/v)]，在紧密密封的房间中于4℃显影。通过喷洒溶于H2SO4的0.2％(w/v)蒽酮溶液，然后加热(100℃，10-15分钟)，糖脂可得到显现。
在对粗制脂类抽提物皂化后，对脂类抽提物的海藻糖含量进行定量，其中所述的定量根据Liu & Nikaido(1999)，具有以下修改：在水抽提之前，取出样品的等分试样，冷冻干燥，并溶于5％(w/v)氢氧化钾。将样品在100℃孵育1小时，冷却，并通过高-pH HPLC(见下文)，将样品的等分试样直接用于海藻糖的测定。
用于海藻糖和糖原测定的样品制备
将培养物样品(1.5ml)迅速在冰上冷却，并离心(13,000转/分，4℃，15分钟)。所有后续操作在4℃进行。收集上清，并冷冻于-20℃，以用于后续的细胞外海藻糖测定。细胞用BMC培养基洗涤，并且也以沉淀贮藏于-20℃。为将细胞外渗透条件的改变降至最小，用具有相同盐和糖组合物的冰冷却的培养基作为生长培养基用于洗涤。将洗涤细胞的等分试样用于细胞干重的测定。
在500μl 10mM磷酸钠/钾缓冲液(pH6)中，通过超声(40％振幅，0.5秒/循环)将细胞裂解。离心(13,000转/分，4℃，15分钟)移去细胞残渣，并将上清液用于海藻糖和/或糖原的测定。
海藻糖测定
利用来自大肠杆菌的重组海藻糖，使用酶促海藻糖测定法，所述测定法基于将海藻糖定量地酶促水解为两个葡萄糖分子。为这一目的，如DeSmet等(2000)所述过量表达大肠杆菌海藻糖TreA，并进行部分纯化。然后，通过氧化酶/过氧化物酶方法，对葡萄糖进行测定。在具有或不具有重组海藻糖(5U)的90ml 10mM钠/磷酸氢二钾缓冲液pH6中，将5-20μl样品于37℃孵育1小时。通过加入900μl新鲜制备的酶显色(enzyme-color)试剂溶液，测定释放的葡萄糖进行测定，其中所述的酶显色试剂溶液来自于可从商业上获得的葡萄糖检测试剂盒(Sigma 510-DA)。37℃孵育30分钟后，利用分光光度法在λ＝450nm处测量葡萄糖。根据使用和不使用海藻糖处理的样品中葡萄糖含量的差异，计算海藻糖。在高浓度麦芽糖下，即在含有10％(w/v)麦芽糖的BMC肉汤的培养上清中，在测量细胞外海藻糖期间，观察到显著的背景，其中所述的背景是由海藻糖污染了麦芽糖或酶促海藻糖测定非特异性干扰了麦芽糖而导致的。通过无菌麦芽糖BMC样品的酶促测定，对背景进行测定，并从培养物上清液获得的数值中减去。
对于观察到高背景葡萄糖的更复杂的样品(如粗制的细胞抽提物)，使用用于海藻糖测定的层析方法。在这种情况下，使用安装于提供脉冲电流检测器(pulsed amperometric detector)ED40的DX500-HPLC系统(DIONEX)的Carbo-Pak PA1柱，在室温利用高pH离子层析(HPIC)测量海藻糖。将25μl 10倍稀释的粗制抽提物样品应用于此柱。利用溶于150mM氢氧化钠溶液的0-80mM乙酸钠线性梯度，进行洗脱。通过用500mM乙酸钠洗涤10分钟，然后用150mM氢氧化钠平衡10分钟，对柱进行再生。海藻糖作为滞留时间约3.3分钟的单峰被检测。海藻糖的定量是以用确定量的海藻糖标准溶液校准为依据的。
糖原的测定
通过用淀粉葡萄糖苷酶水解，对谷氨酸棒杆菌中细胞内糖原的量进行测定。为这一目的，将粗制细胞抽提物样品(200μl)(按上述制备)与2倍体积的97％(v/v)乙醇混合，沉淀，并利用加热再溶于相同体积的10mM磷酸钠/钾缓冲液(pH6)中。在90ml 100mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)中，将5-50μl样品与淀粉葡萄糖苷酶(60mU，Boehringer Mannheim)于37℃孵育1小时。释放的葡萄糖的量由如上所述的酶促测定。从经淀粉葡萄糖苷酶处理的样品和未经淀粉葡萄糖苷酶处理的对照样品之间葡萄糖浓度的差异，计算糖原的量。
结果
谷氨酸棒杆菌基因组数据的分析
对从原始谷氨酸棒杆菌基因组数据(www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/micr.html，登录号，NC_003450)获得的序列进行筛选，以获得与海藻糖代谢相关的公知基因(概述于表3中)相似的ORF。为最初确定潜在的侯选者，使用建议的基因组注释。另外，以结核分枝杆菌海藻糖合成的酶为依据，进行BLAST搜寻，其中所述的结核分枝杆菌是在系统发育上与棒杆菌相关的人类病原体，并具有所有3个公知的海藻糖生物合成途径(De Smet等，2000)。在谷氨酸棒杆菌中也发现与所有涉及不同途径的5个基因具有高度相似性的ORF。
将ORF CgI2573和CgI2575分别命名为otsA和otsB，因为推定它们编码与OtsA-OtsB途径的海藻糖6-磷酸合酶和海藻糖6-磷酸磷酸酶具有显著相似性的多肽。两个基因被与otsA和otsB相同方向的额外的ORF(CgI2574)分开。加之，两个相同方向的ORF(CgI2571、CgI2572)存在于otsA的上游。最近显示，它们中的一个(CgI2571)编码跨膜苏氨酸输出者(Simic等，2001)。ORF CgI2572和CgI2574的翻译产物与其它蛋白质不具有显著的相似性，因此目前并不清楚它们在谷氨酸棒杆菌中的生理功能。然而，它们与ots基因紧密相邻和它们与这些基因的共线方向表明，它们可能与otsA和otsB共转录，并且扮演与otsA和otsB相关的生理功能。最后，在otsB下游发现相反方向的ORF。其预测的氨基酸序列揭示与转录调节子的LacI家族具有高度的相似性。并不清楚该ORF是否与otsA和otsB基因的调节相关。
利用结核分枝杆菌海藻糖生物合酶的序列，对谷氨酸棒杆菌基因组的BLAST搜寻揭示了两个分别与TreY和TreZ酶显示出显著相似性的ORF--CgI2075和CgI2066，所述TreY和TreZ酶与从糖原合成海藻糖相关。它们在谷氨酸棒杆菌中的染色体组构与其它生物中的类似基因显著不同，在所述其它生物中，两个基因串联在一起，甚至常常互相重叠(Maruta等，1996a-c；Cole等，1998)。虽然定位于谷氨酸棒杆菌染色体的相同区域，但是包含7个ORF、长度为8kb以上的一段序列隔开了该生物的treY和treZ基因。基于可获得的注释和自身序列的比较，不能提出treY和treZ基因与这些ORF之间的生理关系。在酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius)、结核分枝杆菌和节杆菌Q36株中，treY和treZ基因组成了具有命名为treX的第三个基因的操纵子，其中认为所述操纵子在海藻糖生物合成过程中，具有糖原脱支功能(Maruta等，1996c、Maruta等，2000、Cole等，1998)。利用从节杆菌treX株推测的序列对谷氨酸棒杆菌基因组的BLAST搜寻揭示了位于treY基因上游10kb的与不同细菌的糖原脱支酶具有相似性的ORF(CgI2054)(数据未显示)。TreY、treZ和CgI2054在谷氨酸棒杆菌基因组上都具有相同的方向，并且仅仅被数kb互相隔开，这样的事实可能表示这种分布是最初串联基因的基因组内重排的结果。
同样，在谷氨酸棒杆菌中鉴定出与其它细菌的海藻糖合酶基因显著相关的ORF(CgI2250)(表3)。将这一基因命名为treS。直接位于treS(CgI2251；)下游的开放读码框的起始部分与treS ORF的3’末端重叠4bp。在天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)和结核分枝杆菌中也发现与CgI2251高度相似的ORF直接位于treS的下游。在其它细菌，如植物青枯菌(Ralstonia solanacearum)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和微温绿菌(Chlorobium tepidum)中，treS和CgI2251同系物融合在一个ORF中。虽然对这些推定的与CgI2251类似的蛋白质的特性和生理功能一无所知，但是基因组数据表明与海藻糖合酶具有紧密的功能相关性。
为检查糖原作为通过TreY-TreZ途径的海藻糖生物合成底物的可能性，搜索谷氨酸棒杆菌基因组中可能与糖原合成相关的酶的推定基因(Preiss & Greenberg，1964)。发现2个其翻译产物与(推定的)ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(GlgC)和糖原合酶(GlgA)具有高度相似性的ORF--CgI1073和CgI1072(表3)。两个ORF互相毗连，但是方向不同，它们的起始密码子被51bp隔开。另一个ORF(CgI1071)与公知的β-果糖苷酶和果聚糖酶相似，其直接位于glgA基因的下游。发现另一ORF(CgI0401)与(推定的)糖原合酶具有显著的相似性(表3)。然而，由于CgI1072的遗传环境，优选该基因，而不是CgI0401，用于研究其在糖原合成中的角色。
概括地讲，对谷氨酸棒杆菌基因组数据的探究表明存在细菌中观察到的所有三条海藻糖生物合成途径，因此暗示与相关结核分枝杆菌中相同目的的类似基因装置。此外，基因组数据表明了谷氨酸棒杆菌中存在糖原合成途径。为探查多种海藻糖合成途径在谷氨酸棒杆菌生长中的角色，以及阐明中糖原合成和海藻糖产生之间可能的相互关系，设计了一系列的实验。
谷氨酸棒杆菌中游离海藻糖的积聚
在与工业赖氨酸生产相近的条件下，过量生产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌突变体在培养肉汤中积聚的海藻糖达6g/l。使用谷氨酸棒杆菌的模式株，并加入NaCl以增加渗透性，尝试将这种显著的海藻糖积聚和生长培养基中渗透性的变化联系起来未能成功。另一方面，当使用蔗糖，而不是NaCl来调节培养基的渗透性时，观察到细胞外海藻糖的显著长期的增加。
然后谷氨酸棒杆菌模式株在含有两种不同的糖浓度(即0.5％(w/v)蔗糖和10％(w/v)蔗糖)的基本BMC培养基中生长和积聚海藻糖。在低糖培养基的情况下，谷氨酸棒杆菌在OD600约为12时由于底物的限制而停止生长。在这种情况下，培养肉汤中积聚的海藻糖不超过0.1g/l。相反，当在过量的蔗糖中生长时，细菌的最终OD600超过16。在这些条件下，在对数晚期和稳定期，模式株积聚的海藻糖达到0.9g/l。对细胞内海藻糖水平的监测显示，在高糖供应的情况下，达到约20μg海藻糖/mg细胞干重的细胞内水平，该水平约是在低糖供应的情况下最大细胞内海藻糖水平的四倍。在低和高浓度蔗糖的条件下，稳定期细胞的细胞内海藻糖浓度下降至非常低的数值。
细胞外海藻糖的积聚和培养基中的糖过量有关，连同在谷氨酸棒杆菌中出现从糖原或其它葡聚糖(glucopolysaccharide)中产生海藻糖的推定海藻糖基因的知识，促使我们验证存在糖原作为细胞中产生海藻糖的底物的可能性。实际上，使用Brana等(1982)所述的方法，显示当供应过量的蔗糖时，谷氨酸棒杆菌可产生糖原，所述Brana等的方法是基于淀粉葡萄糖苷酶水解后，以糖原作为葡萄糖进行测定。在过量蔗糖的条件下，发现糖原的积聚与海藻糖的积聚相关(图3)。
谷氨酸棒杆菌海藻糖生物合成途径的失活
为确定在谷氨酸棒杆菌海藻糖的体内生物合成中，从基因组数据分析中提出的不同途径的功能，通过对每条途径中的至少一个基因的染色体失活，构建三个突变体。为每一个目标染色体位点构建特异的可移动基因失活载体，并通过如材料和方法中所述的两步同源重组依赖的基因交换策略，将载体用于在谷氨酸棒杆菌DSM20300的染色体中引入缺失。为失活OtsA-OtsB途径，移去2.4kb的染色体片段，这导致截短的otsA和otsB基因的框内融合。在命名为谷氨酸棒杆菌ΔotsAB的此突变体中缺失了otsA基因的70％以上、完整的ORF CgI2574和otsB的95％以上。通过框内缺失treZ基因的645bp片段，实现了TreY-TreZ途径的失活。在不成功的尝试后，放弃了之前失活本途径(treY)的第一个基因的努力，这可能是由于CgI2067开放读码框上这种缺失的极性效应。通过框内缺失treS(直接与第三个生物合成途径相关的唯一基因)的459bp内部片段，失活了提出的谷氨酸棒杆菌中海藻糖合成的第三个途径，即使用麦芽糖作为前体的TreS途径。通过比较由大肠杆菌异源表达所获得的完整和截短酶的体外海藻糖合酶的活性，在这种情况下，可以在置换染色体treS基因之前，证实截短的基因不再编码功能性的海藻糖合酶(数据未显示)。因此，根据每种情况的靶向失活途径，获得三个谷氨酸棒杆菌DSM20300的单一突变体，并命名为ΔotsAB、ΔtreZ和ΔtreS。
基于刚才所述的单一突变体，构建了所有可能的双突变体组合(ΔotsAB/ΔtreZ、ΔotsAB/ΔtreS、ΔtreZ/ΔtreS)和在所有三条海藻糖合成途径中失活的三突变体(ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS)。在构建ΔotsAB/ΔtreZ和ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS突变体的时候，我们面临获得携带预想缺失的第二步(载体切除)重组体的困难。没有获得几乎相等数量的预想缺失变体和克隆，仅获得第二步重组体的较后的型别，其中所述的缺失变体和克隆是由载体整合事件的回复(reversion)而产生的(Schfer等，1994)。向培养基中加入2％(w/v)海藻糖后，该问题得到了克服，其中所述培养基用于基于sacB选择携带第二个重组事件的克隆。这一有趣的观察首次表明了这两个突变体菌株在培养基中没有海藻糖时生长极为困难。
使ΔotsAB/ΔtreZ和ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS突变体菌株中的任何一个在没有海藻糖的液体基本培养基中、在适度的振荡下(约150转/分)进行生长的尝试，显示两个突变体在这些条件下均不能适当地生长。孵育2-3小时后，这些突变体产生迅速沉降于培养管底部的细胞团聚体，这可能导致限制氧和营养的条件并损害突变体的进一步生长。虽然培养搅拌增至210转/分导致生长提高，但是与其它海藻糖合成突变体和模式株比较，携带在OtsA-OtsB和TreY-TreZ途径中都有突变的菌株在基本培养基中生长的能力得到了显著的损害。
在盛有5ml包含10％蔗糖的BMC培养基中，进行测量谷氨酸棒杆菌模式株和突变体的细胞内和细胞外海藻糖积聚的实验。在携带otsAB或treZ突变的突变体中，观察到细胞内海藻糖的浓度下降超过50％，并在同时携带两个突变的突变体中，观察到细胞内海藻糖的完全缺失。同样，与野生型菌株比较，ΔotsAB、ΔtreZ、ΔotsAB/ΔtreS和ΔtreZ/ΔtreS突变体在细胞外海藻糖的积聚上下降显著(20-50％)。在双突变体ΔotsAB/ΔtreZ和三突变体ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS中，未检测到显著量的细胞外海藻糖。相反，与模式株比较，仅在TreS途径失活的突变体显示细胞内海藻糖水平仅有轻微的下降，并且细胞外海藻糖水平几乎没有变化。
对在含蔗糖的基本培养基中生长受到损害的突变体，即ΔotsAB/ΔtreZ和ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS，验证它们在已知谷氨酸棒杆菌利用的不同底物上生长的能力(表4)。为这一目的，将细胞在含有5ml添加有终浓度为1％(w/v)的不同碳源的BMC培养基的试管中生长。在30℃、150转/分进行培养。本文中值得注意的是，谷氨酸棒杆菌DSM20300不能以海藻糖作为唯一碳源和能量进行生长。对大多数试验的糖底物，野生型菌株的最大光密度达到15以上，而突变体菌株的生长表现出显著受损。相反，突变体在乙酸盐或丙酮酸盐上的生长不如在糖底物上的生长受到的影响严重。与野生型菌株比较，在添加海藻糖的蔗糖培养物中，两个突变体的生长仅显示轻微的下降。通过记录的生长曲线，更详细地研究由于海藻糖加入而产生的突变体互补现象。
通过加入海藻糖而产生的ΔotsAB/ΔtreZ和ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS互补
在基本BMC培养基中生长时，突变体ΔotsAB/ΔtreZ和ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS的生长能力受到显著的损害，而当在复合LB培养基上生长时，它们的生长速率与模式株没有显著差异(未显示)。在寻找突变体正常生长所需要的成分或元件时，我们尝试向BMC基本培养基中添加不同的低分子量成分，如渗透压保护剂(osmo-protectant)L-脯氨酸、甜菜碱和海藻糖，显然这些成分或元件存在于LB培养基中，但在基本培养基中缺乏。加入脯氨酸和甜菜碱(20mM)不会提高突变体的生长(数据未显示)，而向BMC培养基中加入2％(w/v)海藻糖导致与野生型对照几乎相同的生长速率和最终的培养物密度。这些数据证明，同时失活OtsA-OtsB和TreY-TreZ途径导致谷氨酸棒杆菌的海藻糖营养缺陷型。ΔotsAB/ΔtreZ和ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS在麦芽糖上的生长
双突变体ΔotsAB/ΔtreZ和三突变体ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS在大多数具有试验底物的基本培养基中显示类似生长行为(表4)，这个事实显示，完整treS基因的存在不会对在这些条件下的生长具有显著影响。考虑到海藻糖合酶(TreS)催化从麦芽糖产生海藻糖，我们研究两个突变体在添加1％(w/v)麦芽糖作为唯一碳源的BMC基本培养基上的生长表型(表4)。当三突变体ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS在本培养基中的生长受到显著的损害时，treS基因依然完整的ΔotsAB/ΔtreZ菌株显示出与野生型菌株相当的生长速率。
此外，检查了在高麦芽糖浓度上生长的两个突变体和模式株的海藻糖细胞内和细胞外积聚。在这些条件下，有趣的是，在突变体ΔotsAB/ΔtreZ中测量的海藻糖细胞内浓度与在模式株中发现的浓度类似，而三突变体ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS没有细胞内海藻糖。与在其它底物(表4)上生长相比，该结果与在麦芽糖上生长的突变体ΔotsAB/ΔtreZ和ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS之间所观察到的差异一致，表明TreS途径可发挥功能，并在仅有麦芽糖时提供足够量的海藻糖用于谷氨酸棒杆菌生长。值得注意的是，两个突变体没有显著的细胞外海藻糖的积聚，这表明，在模式株中，OtsA-OtsB和/或TreY-TreZ途径负责细胞外海藻糖的出现。
ΔotsAB突变体的质粒互补
构建携带otsA基因(pWLQ2∷otsA)和两个ots基因(pWLQ2∷otsAB)的表达质粒，并转化进谷氨酸棒杆菌突变体ΔotsAB/ΔtreZ。检查这些转化体在含1％(w/v)蔗糖，不含海藻糖的BMC培养基中的生长能力。携带otsA和otsB二者的质粒可有效地补偿突变体在这些条件下的生长缺陷。此观察排除了突变体的生长表型是引入染色体的缺失所导致的极性效应的结果，并且也显示ORF CgI2574不是海藻糖产生和在基本培养基中正常生长所比需的，其中所述的ORF CgI2574位于质粒所不提供的染色体上otsA和otsB之间。用pWLQ2∷otsA转化ΔotsAB/ΔtreZ双突变体，导致在1％(w/v)蔗糖的BMC肉汤中的生长得到显著提高，但未导致突变体生长缺陷的完全互补。这一现象的解释可能是不同的，或许是非特异磷酸酶在体内置换了海藻糖磷酸磷酸酶(OtsB)的功能，或是这样的假设，即谷氨酸棒杆菌中海藻糖6-磷酸的存在，而不是海藻糖足够部分恢复细菌生长。
非产生海藻糖的谷氨酸棒杆菌突变体ΔotsAB/ΔtreZ的脂类组成
如此处所示，产生海藻糖的能力受到损害的谷氨酸棒杆菌，显示在基本培养基上的生长受到显著的损害，并且通过向培养基中加入海藻糖可补偿这种生长缺陷。海藻糖对谷氨酸棒杆菌生长的重要性的可能解释是细胞中的结构角色。海藻糖不仅以游离形式而且以棒杆菌分枝菌酸的单酯和二酯的形式发现于谷氨酸棒杆菌，所述棒杆菌分枝菌酸的单酯和二酯在棒杆菌的外部细胞壁透性障上扮演重要的角色(Puech等，2001)。已显示，海藻糖单-(TMCM)和双-(TDCM)棒杆菌分枝菌酸酯是谷氨酸棒杆菌包含非共价结合棒杆菌分枝菌酸酯的脂类部分中的主要成分(Puech等.2000)。我们的结果现在证实，谷氨酸棒杆菌不能合成海藻糖对其细胞壁脂类部分的组成具有显著的影响。
ΔotsAB/ΔtreZ突变体在30ml加入或不加入2％(w/v)海藻糖的含1％(w/v)蔗糖的BMC肉汤中生长。生长10小时后，收获细胞，并如材料和方法中所述，将等量湿细胞用于分离细胞壁脂类。确定来自于添加海藻糖和缺少海藻糖的培养物的突变体细胞的脂类部分的特征，并与从在相同条件下生长的模式株中分离的脂类进行比较。使用由氯仿/甲醇/水溶剂系统研制的硅胶TLC平板分离脂类。基于Puech等(2000)所述的谷氨酸棒杆菌糖脂谱鉴定经蒽酮染色所检测的斑点。当在缺乏海藻糖中生长时，突变体菌株在其细胞壁脂类部分缺乏两个主要的含海藻糖的糖脂。缺少的海藻糖棒杆菌分枝菌酸酯没有被其它不含海藻糖的棒杆菌分枝菌酸酯(如葡萄糖单棒杆菌分枝菌酸酯，即GMCM，发现所述GMCM积聚于csp1失活的谷氨酸棒杆菌突变体，Puech等，2000)所替代。在培养肉汤中存在海藻糖时，ΔotsAB/ΔtreZ突变体可产生海藻糖棒杆菌分枝菌酸酯。然而，与野生型菌株相反，添加海藻糖的突变体含有TMCM作为其主要糖脂，而TDCM缺失。或许，培养基中存在高浓度的海藻糖导致TDCM合成反应平衡向支持TMCM的方向迁移(Schimakata & Minatogawa，2000)。
glgA突变体的构建和特征
培养基中存在过量蔗糖时，谷氨酸棒杆菌可积聚糖原。根据这一观察，在谷氨酸棒杆菌基因组中发现一串开放读码框(CgI1073-CgI1072)，其中所述的开放读码框所预测的翻译产物与一些细菌生物合成糖原的酶或所预测的酶，显示出高度的相似性(表3)。我们决定破坏编码推定的葡萄糖基转移酶的ORF CgI1072，所述葡萄糖基转移酶被怀疑代表糖原合酶(glgA)，为了两个目的：(i)研究含该基因的基因簇是否真正与谷氨酸棒杆菌产生糖原相关，和(ii)查明糖原合成是否在海藻糖产生中扮演重要角色。
pCLiK6∷glgA位点专一的整合进入谷氨酸棒杆菌基因组后，导致CgI1072 ORF的破坏，从而获得命名为glgA∷Km的突变体。突变体不能在蔗糖过量的条件下积聚糖原。通过在突变体ΔotsAB和ΔotsAB/ΔtreS的染色体中破坏CgI1072 ORF，可获得两个另外的突变体。将突变体分别命名为ΔotsAB/glgA∷Km和ΔotsAB/ΔtreS/glgA∷Km。将谷氨酸棒杆菌的突变体ΔotsAB/ΔtreZ和ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS与两个另外缺乏糖原合酶(GlgA)的同源基因突变体比较，未揭示四个突变体菌株之间在无海藻糖的基本培养基中生长的能力和产生以及积聚海藻糖的能力的差异。glgA∷Km和ΔtreZ突变体在ΔotsAB和ΔtsAB/ΔtreS的背景下显示相同表型的事实强烈支持TreZ和GlgA与海藻糖生物合成的一个相同的途径相关。同样地，这些结果提供了谷氨酸棒杆菌中从糖原合成海藻糖的重要性的证据。
讨论
谷氨酸棒杆菌中海藻糖和糖原生物合成途径的遗传解剖以及它们在多种生长条件下的运作
通过对途径中所选择的基因引入缺失，利用染色体诱变失活存在于谷氨酸棒杆菌中的三条海藻糖合成途径的每一条途径，所述三条海藻糖合成途径是基于对可获得的基因组序列数据分析而提出的。具有敲除单一途径的一些突变体显示海藻糖的合成下降，但没有一个突变体完全没有产生海藻糖，这表明谷氨酸棒杆菌中这种二糖的合成不是通过单一途径而实现的，而是基于两个或多个可能协同调节的途径。双突变体的随后构建显示，OtsA-OtsB或OtsA-OtsB途径单独可充分确保以满足细菌所需要的水平合成海藻糖，其中在所述的双突变体中所提出的三条海藻糖合成途径中，仅有一条是有效的。只要突变的细菌具有此两条生物合成途径中的一条，甚至分泌至细胞外的海藻糖也不会显著下降。另一方面，失活OtsA-OtsB和TreY-TreZ两条途径，导致相应的突变体不能合成海藻糖，并且不能在大多数试验的条件下有效的生长。利用失活了三条海藻糖合成途径的三突变体，获得相同的结果。因此，途径失活实验显示了两条途径的主要作用，其中所述的两条途径涉及谷氨酸棒杆菌体内合成海藻糖的OtsA-OtsB和TreY-TreZ。
还不清楚是否野生型细胞同时使用OtsA-OtsB和TreY-TreZ途径，并且，如果这样，两条途径对产生海藻糖的量的贡献是否是相似的。从能量的观点来看，OtsA-OtsB途径比TreY-TreZ途径更有效。从1mol葡萄糖6-磷酸和1mol UDP-葡萄糖中通过OtsA-OtsB途径合成1mol海藻糖，而通过TreY-TreZ途径产生1mol海藻糖消耗2mole ADP-葡萄糖(用于合成糖原)。如果有人假设所产生的海藻糖主要用于合成细胞壁脂类TDCM和TMCM，并且此目的的前体所需要的是海藻糖磷酸而不是游离海藻糖(也见下文，Shikimakata & Minatogawa，2000)，那么能量平衡甚至更支持OtsA-OtsB途径，因为磷酸化的海藻糖是OtsA-OtsB途径而不是TreY-TreZ途径的中间体。因此，推测仅在能量和底物过量的条件下TreY-TreZ途径比OtsA-OtsB途径优选是合理的。另一方面，我们的结果显示，可作为TreY-TreZ途径的底物的糖原也在低糖供应的条件下出现于谷氨酸棒杆菌中，虽然与在糖过量的条件下的量不相同。同样地，我们观察到，TreY-TreZ途径单独地足够支持谷氨酸棒杆菌的生长，不但在糖过量条件下，而且在低糖条件下(0.5％(w/v)蔗糖，数据未显示)。需要进一步的实验以确定OtsA-OtsB和TreY-TreZ途径中的每一条途径，在不同生长条件下对野生型谷氨酸棒杆菌细胞中海藻糖生物合成的单独贡献。
我们的数据表明，TreS途径在海藻糖合成中仅扮演支持作用。对ΔotsAB/ΔtreZ和ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS突变体的生长和海藻糖积聚特征的分析证明此途径在含麦芽糖的培养基中生长期间与海藻糖合成相关。有趣的是，注意到当野生型菌株和ΔotsAB/ΔtreZ突变体显示相似水平的细胞内海藻糖时，突变体比野生型积聚更少的细胞外海藻糖，其中所述野生型在麦芽糖上生长的细胞外海藻糖水平约与在蔗糖上的相同。目前，不清楚含所有三个功能性海藻糖生物合成途径的野生型菌株在麦芽糖上生长期间是否优先利用TreS途径。然而，当在麦芽糖上生长后，野生型菌株和保留TreS途径作为唯一的海藻糖生物合成途径的突变体之间细胞外海藻糖积聚的差异表明，同样当细菌在过量麦芽糖上生长时，在野生型中其它两条途径对海藻糖合成具有支配作用。
我们的实验表明，当在糖过量的条件下生长时，谷氨酸棒杆菌的模式株积聚显著量的糖原。基因组数据预测，与在其它细菌中观察到的类似，在谷氨酸棒杆菌中存在使用ADP-葡萄糖作为前体的糖原合成途径(Preiss& Greenberg，1965)。使用染色体插入诱变，我们显示，ORF CgI1072(和其邻近的CgI1073)负责谷氨酸棒杆菌中的糖原合成。我们也可将糖原合成与海藻糖合成联系起来，这显示，糖原合成同时受到损害的otsAB突变体(ΔotsAB/glgA∷Km和ΔotsAB/ΔtreS/glgA∷Km)表现出与具有失活TreY-TreZ海藻糖生物合成途径的ΔotsAB突变体(ΔotsAB/ΔtreZ和ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS)相同的生长和海藻糖合成表型。在大多数生长条件下，包括低(1％)蔗糖，观察到糖原合成和OtsA-OtsB途径同时阻断的突变体的生长缺陷，这证实了并不仅在糖过量的生长条件下的从糖原生物合成海藻糖的重要作用。
海藻糖生物合成对谷氨酸棒杆菌的生长生理学和细胞壁脂类组成的影响
仅仅揭示海藻糖合成机制没有给我们其在谷氨酸棒杆菌中的生理作用的直接指示。在大多数试验的底物上生长时，突变体ΔotsAB/ΔtreZ和ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS均显示强烈的海藻糖依赖。这一结果与谷氨酸棒杆菌和相关的棒杆菌(De Smet等，2000)在进化中已经建立三条独立的海藻糖生物合成途径表明这种二糖在这些细菌中的重要性。谷氨酸棒杆菌细胞中海藻糖的一个可能作用是，作为适合的溶质以在渗压休克期间保护细胞，这种功能在其它细菌的海藻糖中已提到(Argüelles等，2000)。在高渗条件下，观察到谷氨酸棒杆菌和乳发酵短杆菌细胞中游离海藻糖的积聚，支持这种假设(Skjerdal等，1996)。当NaCl用于调节培养基的渗透性时，最初用来分析游离海藻糖反应培养基的渗透性变化而在细胞内和细胞外的积聚的实验是不成功的(自己未发表的结果)。仅在生长培养基中存在高糖浓度时，游离海藻糖水平获得显著的增加，这一发现与当由蔗糖而不是由NaCl或谷氨酸诱导的高渗时，观察到在是模式株积聚了显著更高量的海藻糖相应(Skjerdal等，1996)。为进一步说明海藻糖的作用，我们使用海藻糖合成存在缺陷的突变体ΔotsAB/ΔtreZ和ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS。在大多数检验的碳源中，两个突变体不能在缺乏海藻糖的基本培养基中有效地生长。仅添加海藻糖，但不是其它适合的溶质，可恢复突变体的生长。所有这些结果反对这种可能性，即海藻糖在谷氨酸棒杆菌中作为适应渗透性变化的合适的溶质被合成和积聚。细胞内和细胞外海藻糖积聚均显示与培养基中过量的碳源相关，并且发现于对数晚期和稳定期。所有这些海藻糖合成的先决条件使人联想起公知的支持碳和能量贮藏化合物(如其它细菌中的糖原)的条件。在谷氨酸棒杆菌中，如在其它高等生物中所观察到的，以储备化合物贮藏海藻糖自身的可能性是不存在的，因为在稳定期的细胞中，细胞内海藻糖是极低的。海藻糖积聚是棒杆菌细胞中糖原增加的唯一直接结果的可能性与从糖原合成海藻糖的能力受到损害的突变体(ΔtreZ、ΔtreZ/ΔtreS)仍然在细胞内和细胞外均积聚显著量的海藻糖这一事实不符。
谷氨酸棒杆菌突变体ΔotsAB/ΔtreZ和ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS不能适当地在多种条件下生长，并且仅加入海藻糖可恢复生长。这些突变体形成大细胞聚集体的趋势表明它们的生长问题可能与它们的细胞表面或细胞分裂晚期的缺陷有关。这表明，海藻糖在谷氨酸棒杆菌细胞中扮演重要的结构角色。在分枝菌和棒状杆菌中(连同一些其它紧密相关的属)，显示棒杆菌分枝菌酯形式的海藻糖与细胞质膜外的第二透性障相关(Puech等.2001，Sathyamoorthy & Takayama，1987)。ΔotsAB/ΔtreZ突变体的谷氨酸棒杆菌糖脂部分的特征显示，不能合成海藻糖的一个显著的结果是缺乏含有海藻糖的TMCM和TDCM，TMCM和TDCM被认为是谷氨酸棒杆菌外层脂双层的重要组分。海藻糖缺陷突变体的生长困难可能与它们不能形成这种细胞壁脂双层有关。已显示，海藻糖不仅是棒杆菌分枝菌酯代谢最终阶段的基本成分，而且，如海藻糖磷酸，在马初查特棒杆菌(C.matruchotii)的棒杆菌分枝菌酯合成的全部过程中扮演关键作用(Shimakata &Minatogawa，2000)，即表明海藻糖6-磷酸作为新合成的棒杆菌分枝菌酸的受体。然后，产生的TMCN是合成细胞壁、TDCM和游离棒分枝菌酸的所有酯化棒杆菌分枝菌酸(corynomycolate)的普通前体(Shimakata &Minatogawa，2000、Puech等，2000)。因此，基于Shikimakata和Minatogawa(2000)的分枝菌酸(mycolate)生物合成的这种建议，此处所构建的一些谷氨酸棒杆菌突变体不能合成海藻糖或海藻糖6-磷酸，这不但导致含海藻糖的两种糖脂的缺乏，而且导致所有其它棒杆菌分枝菌酯的缺乏。刚才所述的机制可提供出现细胞外海藻糖的解释，在所述的机制中，海藻糖用作棒杆菌分枝菌酸的载体，然后(部分)释放至细胞外部。
有趣的是，注意到在一些底物上(如乙酸盐和丙酮酸盐)缺乏海藻糖的谷氨酸棒杆菌突变体可十分正常地生长，达到与野生型菌株相似的最终培养物密度，这与在糖低物上的生长受到严重损害形成对比。这种现象可用改变的细胞壁脂双层吸收不同的底物的效果可能具有差异来解释。有趣的是，在乙酸盐的情况中，已报导，在与棒杆菌分枝菌酸酸连接的细胞壁中，减少50％便于乙酸盐的吸收(Puech等，2000)。
重要的是，此处报导的谷氨酸棒杆菌中海藻糖生物合成的遗传和生理分析的结果可能与含分枝菌酸的棒杆菌的整个系统发育组普遍相关，其中所述的棒杆菌含若干不同的属，包括医学和生物技术上重要的物种(见Liebl，2001)。需要另外的转录和酶活性研究来揭示海藻糖合成途径的调节。调节研究预计可揭示关于在糖过量的条件下生长期间，谷氨酸棒杆菌积聚的细胞外和细胞内游离海藻糖的生理作用的更多信息。
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表1使用的谷氨酸棒杆菌菌株的列表
菌株 描述
谷氨酸棒杆菌DSM 20300 从DSMZ(Braunschweig，德国)获得的谷氨酸棒杆菌模式株，等于ATCC13032菌株
谷氨酸棒杆菌ΔotsAB 在otsA和otsB基因中具有缺失的谷氨酸棒杆菌DSM 20300(本研究)
谷氨酸棒杆菌ΔtreZ 在treZ基因中具有缺失的谷氨酸棒杆菌DSM20300(本研究)
谷氨酸棒杆菌ΔtreS 在treS基因中具有缺失的谷氨酸棒杆菌DSM20300(本研究)
谷氨酸棒杆菌ΔotsAB/ΔtreZ 在otsA、otsB和treZ基因中具有缺失的谷氨酸棒杆菌DSM 20300(本研究)
谷氨酸棒杆菌ΔotsAB/ΔtreS 在otsA、otsB和treS基因中具有缺失的谷氨酸棒杆菌DSM 20300(本研究)
谷氨酸棒杆菌ΔtreZ/ΔtreS 在treZ和treS基因中具有缺失的谷氨酸棒杆菌DSM 20300(本研究)
谷氨酸棒杆菌ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS 在otsA、otsB、treZ和treS基因中具有缺失的谷氨酸棒杆菌DSM 20300(本研究)
谷氨酸棒杆菌glgA∷Km 具有插入失活glgA的谷氨酸棒杆菌DSM 20300(本研究)
谷氨酸棒杆菌glgA∷Km/ΔotsAB 具有插入失活glgA的谷氨酸棒杆菌ΔotsAB(本研究)
谷氨酸棒杆菌glgA∷Km/ΔotsAB/ΔtreS 具有插入失活glgA的谷氨酸棒杆菌ΔotsAB/ΔtreS(本研究)
谷氨酸棒杆菌ΔotsAB/ΔtreZPWLQ2∷otsA 与携带otsA的表达质粒pWLQ2互补的谷氨酸棒杆菌ΔotsAB/ΔtreZ(本研究)
谷氨酸棒杆菌ΔotsAB/ΔtreZPWLQ2∷otsA 与携带otsA的表达质粒pWLQ2互补的谷氨酸棒杆菌ΔotsAB/ΔtreZ(本研究)
谷氨酸棒杆菌ΔotsAB/ΔtreZPWLQ2∷treZ 与携带treZ的表达质粒pWLQ2互补的谷氨酸棒杆菌ΔotsAB/ΔtreZ(本研究)
谷氨酸棒杆菌ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreSPWLQ2∷treS 与携带treS的表达质粒pWLQ2互补的谷氨酸棒杆菌ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS(本研究)
表2PCR引物。与起始基因序列不同源的区域以斜体所示，仅出现于起始序列，但不出现于引物的区域置于括号内。用于克隆目的的限制性位点以下划线所示。
引物名称  序列
tre351_f  GG G GAT CCA AAA GAC CAC CGC AAA GAA GAC
tre351_r  CC T CTA GAG CAG TAA AGC AAG CGG AAG AA
otsAB_f  GG G CAT GC(A) GTA TGC GGA AAG CGT GCG ATT G
otsAB_r  GG A AGC TTG CCC CAA ATA ACC GCA AAG CCA
 treZ_f  GG T CTA GAG CGT TGG TGT AGG CAT TAA C
 treZ_r  GG T CTA GAC GCA AAA GCC TGG TCA GTT G
 treS_f  GG T CTA GAT GAG GCG AAA GTG GTG AAA G T
 treS_r  GG T CTA GAC ATT CGC GGG ACA ACA CAA T
 glg_f  GGG  TCT AGA GTA TCC ACC AGA GGT TTA CG
 glg_r  GGG  TCT AGA TTA AAT CTT CCG CGT CAT CGA AAG
 otsB_f  GG G GAT CCA AGG TGC CAG GGC TTT AAA G
 otsB_r  GG G GAT CCG GAA CCA GAA GTG GAA TTG G
 treZ_f2  GG G GAT CCC GGG TGA CTT GCA AAA CCT C
 treZ_r2  GG G GAT CCG CAA AAG CCT GGT CAG TTG
 treS_f3  GG G TCG ACA TGA GGC GAA AGT GGT GAA AG
 treS_r3  GG G TCG ACA CAT TCG CGG GAC AAC ACA A
表3预测的谷氨酸棒杆菌的酶与海藻糖生物合成相关所公知的或预测的酶的相似性。使用PBLAST、EXPECT值为10的BLOSUM62矩阵、并具有低复杂性的筛选，利用联机从National Center for BiotechnologyInformation server(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上在线获得的基于BLAST的比较程序，进行数据库的搜寻。
谷氨酸棒杆菌ORF  长度[AA]  名称 匹配序列 登录号 长度[AA]  同一性[％]
CgI2573  485  OtsA 结核分枝杆菌H37RV(OtsA) G70569  500  52％
拟南芥(Arabidopsis thaliana) AAF99834  822  38％
酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(TPS1) S34979  495  38％
大肠杆菌K12(OtsA) P31677  474  29％
CgI 2575  256  OtsB 大肠杆菌K12(OtsB) P31678  266  26％
结核分枝杆菌H37RV(OtsB2) C70972  391  28％
拟南芥 AAC39370  374  28％
 CgI 2075  566  TreZ 结核分枝杆菌H37RV(TreZ) Q10769  580  48％
节杆菌Q36株(Arthrobactersp.Q36) S65770  598  46％
根瘤菌M-11株(Rhizobium sp.MH1) Q53238  596  46％
微黄短杆菌(Brevibacteriumbelvolum) O52520  589  43％
 CgI 2066  811  TreY 结核分枝杆菌H37RV(TreY) H70763  765  44％
节杆菌Q36株(TreY) S65769  775  39％
根瘤菌M-11株(TreY) JC4696  772  39％
微黄短杆菌(TreY) AAB95368  776  37％
 CgI 2250  617  TreS 结核分枝杆菌H37RV(TreS) G70983  601  62％
天蓝色链霉菌A3(2) CAA04607  572  64％
脂肪杆菌R48株(Pimelobactersp.R48) P72235  573  61％
水生栖热菌(Thermus aquaticus) O06458  963  51％
 CgI 1072  409  GlgA 结核分枝杆菌H37Rv B70610  387  59％
天蓝色链霉菌 A3(2)(glgA) CAB50741  387  35％
谷氨酸棒杆菌 BAB97794  418  26％
 CgI 1073  417  GlgC 结核分枝杆菌H37RV(glgC) O05314  404  61％
天蓝色链霉菌 A3(2)(glgC) P72394  399  55％
大肠杆菌K12(glgC) P31678  431  36％
表4双突变体ΔotsAB/ΔtreZ和三突变体ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS与模式株的生长比较。菌株在含5ml BMC肉汤的试管中，于30℃、150转/分生长，其中所述的肉汤中添加特定的不同底物，终浓度为1％(w/v)(除非另有说明)。
碳源 野生型   otsAB/treZ   otsAB/treZ/treS
葡萄糖 +++   +/-   +/-
果糖 +++ + +
蔗糖(1％) +++ +/- +/-
蔗糖(10％) +++ +/- +/-
麦芽糖 +++ +++ +/-
海藻糖(2％) - - -
蔗糖+海藻糖(2％) +++ ++ ++
肌醇 +++ + +
丙酮酸盐 +++ ++ ++
乙酸盐 ++ +(+) +(+)

Claims (7)

1.产生氨基酸的方法，所述方法包括培养棒杆菌属或短杆菌属微生物，其中所述的微生物部分或全部缺失otsAB、treZ和treS基因座中的至少一个，并随后从培养基中分离氨基酸。
2.权利要求1的方法，其中所述的微生物缺失基因座otsAB。
3.权利要求2的方法，其中所述的微生物额外缺失基因座glgA。
4.权利要求3的方法，其中所述的微生物额外缺失基因座treS。
5.权利要求2的方法，其中所述的微生物额外缺失基因座treZ。
6.权利要求5的方法，其中所述的微生物额外缺失基因座treS。
7.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中氨基酸选自赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和谷氨酸。
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