JPS6374482A

JPS6374482A - 糖蜜からのエタノ−ル製造に適した細菌

Info

Publication number: JPS6374482A
Application number: JP61221040A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Taguchi; 博田口; Akira Tabata; 田端　亮
Original assignee: NENRIYOUYOU ARUKOOLE KAIHATSU GIJUTSU KENKYU KUMIAI; SHINENERUGII SOGO KAIHATSU KIKO
Current assignee: NENRIYOUYOU ARUKOOLE KAIHATSU GIJUTSU KENKYU KUMIAI; SHINENERUGII SOGO KAIHATSU KIKO
Priority date: 1986-09-19
Filing date: 1986-09-19
Publication date: 1988-04-04
Anticipated expiration: 2010-06-28
Also published as: JPH0759187B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の背景〕産業上の利用分野本発明は、糖蜜からの燃料用アルコール製造に利用しう
る細菌に関する。

従来の技術糖質からの工業的エタノール製造には、従来より酵母か
用いられているが、近年、サイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏ
ｎａｓ　）等の細菌によるエタノール発酵が注目され始
めている。

ザイモモナス属細菌は、酵母と同様に、グルコース１モ
ルからエタノールを約２モル生成するが、エタノールの
生産性が酵母よりもはるかに高く、更に発酵速度も酵母
より大きいことから、本菌を用いたバイオマスからの燃
料用アルコール製造が高い関心を集めている。しかし、
ザイモモナス属細菌は、発酵性糖がグルコース、フラク
トース及びスクロースに限られている等、酵母に比べて
劣る点もある。

また、発酵法による燃料用アルコール製造に使用する糖
質原料としては、ケーンジュース、糖蜜、穀物の糖化液
等が一般的であるが、我が国の代表的糖質原料である糖
蜜は、塩類濃度が高いことから、耐塩性の弱い既存のザ
イモモナス属細菌では、糖蜜からのエタノール生成量は
低い。

したがって、ザイモモナス属細菌を用いた糖蜜からの燃
料用アルコール製造の工業的実用化のためには、耐塩性
等の面で既存のザイモモナス属細菌を凌駕する性質を有
する菌株の取得が必須と考えられる。

〔発明の概要〕

本発明の目的は、耐塩性等の面で既存のザイモモナス属
細菌を凌駕する性質を有する、糖蜜からの燃料用アルコ
ール製造に適した新規な微生物菌株を提供することにあ
る。

本発明者は、耐塩性、発酵温度、糖質化性等の面で既存
のザイモモナス属細菌を凌駕する微生物を自然界に求め
て鋭意探索を続けてきた。その結果、ブラジルで採取し
たサトウキビ搾汁より分離した細菌が、耐塩性において
既存のザイモモナス属細菌より優れていて、糖蜜からの
エタノール生成量が改善されることを見出して本発明を
完成した。

要旨本発明によるザイモモナス・モビリスは、グルコース５
．　０　（ｖ／ｖ　）％、リン酸−カリウム０、　２　
（ｗ／ｖ　）％、酵母エキス１．　０　（ｗ／ｖ　）％
および塩化カリウム２．　０　（ｗ／ｖ　）％より成る
液体培地（ｐＨ６，５）で、初菌数１０”　ｃｅｌｌｓ
　／ルベルで３０℃で３日間静置培養したときに、少な
くとも１．７５　（ｖ／ｖ培養妓）％のエタノールを生
産する、ものである。

このような細菌の具体例は、ザイモモナス・モビリス・
サブスピーシーズ争モビリス　８５３（微工研菌寄第８
９２２号）およびザイモモナス・モビリス舎サブスピー
シーズ・モビリスＢ６９（微工研菌寄第８９２３号）で
ある。

効果本発明細菌は耐塩性にすぐれていて、ＫＣＩ濃度が２．
　０　（ｗ／ｖ　）％である上記の培地においてエタノ
ール生産能が少なくとも１．　７５　（ｗ／ｖ培養液）
％、たとえば少なくとも１．９０％（Ｂ５３株）または
少なくとも１．７５％（８６９株）である。

従来のザイモモナス属細菌が耐塩性の劣るものであった
ことを考えれば（後記実験例参照）、本発明の細菌の強
い耐塩性は思いがけなかったことというべきである。

＝　　４　− 〔発明の詳細な説明〕微生物採取地本発明細菌の具体例であるＢ５３株および８６９株は、
ブラジルで採取したサトウキビ搾汁より本発明者が分離
したものである。

受託番号８５３株および８６９株はいずれも通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託されていて、下記の受託
番号を得ている。

菌　株　　　　　　　受託番号８５３　　　　微工研菌寄第８９２２号Ｂ６９　　　　
微工研菌寄第８９２３号菌学的性質Ｂ５３株および８６９株の菌学的性質の主なものは、下
記の通りである。

１）形態的性質（標準寒天培地１で３０℃、２４時間培
養）（１）菌　形：桿菌（２）大きさ：１．６〜８．０μｍＸ１．２〜１、６μ
ｍ（３）多形性：なしく４）運動性：なしく５）芽　胞：なしく６）ダラム染色性：陰性（７）培養所見：肉汁培地では生育しない。標準培地”
　（ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍｅｄｉｕｍ　）では良好な生
育を示し、寒天平板培養においては、表面は滑らか、周
縁部は金縁に光沢を有する。色は白色〜クリーム色。ゼ
ラチン液化能は陰性。

＊標準寒天培地Ｄ−グルコース　　　　　　２０ｇ／リットル酵母エキ
ス　　　　　　　　１０ｇ／リットル寒　　天　　　　
　　　　　　　２０ｇ／リットル＊＊標準培地（ｓｔａ
ｎｄａｒｄ　ｍｅｄｉｕｍ　）Ｄ−グルコース　　　　
　　２０ｇ／リットル酵母エキス　　　　　　　　１０
ｇ／リットル２）生理学的性質（１）硝酸塩の還元：　認められない（２）脱窒反応：　　　認められない（３）ＭＲテスト：　　陰性（４）ＶＰテスト；　　陽性（５）インドールの生成：　認められない（６）硫化水
素の生成：　　認められない（７）デンプンの加水分解
：認められない（８）クエン酸の利用：　　認められな
い（９）無機態窒素の利用：　アンモニウム塩の形で利
用できる（１０）色素の生成：　　認められない（１１）ウレア
ーゼ：　　陰性（１２）オキシダーゼ：　陰性（１３）カタラーゼ：　　陽性（１４）生育範囲 ■ｐＨ：　生育ｐＨ４，０〜８．５至適ｐＨ５，５〜７．０ ■温度；　生育温度　１５℃〜４０℃ 至適温度　３至適−３５℃ （１５）酸素に対する態度：通性嫌気性（１６）０−　
Ｆテスト：　　発酵的（ＦｅｒＩＩｌｅｎｔａｔ　１ｖ
ｅ）（１７）糖類からの酸及びガスの生成より一グルコ
ース、Ｄ−フルクトース、スクロースより酸及びガスを
生成する。Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マ
ンノース、Ｄ−ガラクトース、麦芽糖、乳糖、トレハロ
ース、Ｄ−ソルビット、Ｄ−マンニット、イノジット、
グリセリン、デンプンより酸及びガスは生成しない。

（１８）糖類の分解生成物；１モルグルコースあるいは
フルクトースより、約２モルのエタノール及び炭酸ガス
を生成する。

（１９）栄養要求性：バントテン酸以１−の菌学的性質から、「バーシーズ・マニュアルφ
オブ・システマティック・バクテリオロジー」第１巻（
１９８４）　　（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏ
ｆ’Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
、　ｖｏｌ、　ｌ　（１９８４）及び「インターナショ
ナル・ジャーナル・オブφシステマティック◆バクテリ
ロオジー」第２６巻、１４６−１５７頁（１９７６）　
　（Ｉｎｔ、　Ｊ、　５ｙｓｔ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　ｖｏｌ、２Ｂ、　ｐ１４Ｂ−
１５７（１９７Ｂ））に従い、水閘はザイモモナス番モ
ビリス・サブスピーシーズ・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎ
ａｓ　ｍｏｂｉｌｉｓ　５ｕｂｓｐ。

ｍｏｂｉＮｓ　）に属する。しかし、水閘と既知のザイ
モモナス・モビリスφサブスピーシーズ・モビリスとは
、電気泳動パターンからみて保有プラスミドが異なり、
また、第１〜２図及び第３〜４表に示す様に耐塩性が異
なる。このため、水閘をザイモモナス◆モビリス・サブ
スピーシーズ・モビリスＢ５３および同Ｂ６Ｑと命名し
た。

培養本発明細菌は、合目的的な任意の培地および培養条件で
培養することによって、増殖させて、所要菌体量を得る
ことができる。

培地および培養条件の具体例の一つは、後記実験例に示
した通りである。

エタノールの生産糖蜜にザイモモナス属細菌を作用させてエタノールを生
産することが公知であることは前記したところであり、
本発明細菌による糖蜜からのエタノールの生産も、使用
菌が耐塩性の本発明菌であることを除けば、従来公知の
方法と木質的には変らない。

なお、本発明細菌か対象とする糖蜜は、ショ糖搾汁から
ショ糖をその晶出が生じなくなるまで十分に回収した後
の母液、すなわち廃糖蜜、が代表的であり、またこのよ
うな糖蜜は塩が濃縮されているから本発明細菌の効果が
最大限に享受できるという点ても適当なものである。し
かし、本発明細菌か対象とする糖蜜は上記のような廃糖
蜜に限定されず、必要に応じて、ショ糖の晶出が未だ可
能であるほどにショ糖を含有するショ糖搾汁濃縮母液ま
たは粗糖濃縮母液、ならびにテンサイ糖についての対応
糖蜜ないし濃縮母液、を包含するものである。−上記の
典型的な糖蜜であるショ糖搾汁廃糖蜜の塩含有量は、た
とえば本多紀元著「アルコールハンドブック」　（醗酵
協会１９６３年刊）に示されている。

実験例実施例ブラジル（サンパウロ州）で採取したサトウキビ搾汁少
量を、下記組成の集積用培地に接種した。

集積用培地組成酵母エキス〔オキソイド社製〕　　　　　１６０％（ｗ／ｖ　）Ｋ
Ｈ２ＰＯ４０，２％（〃）グルコース　　　　　　　　　２．５％（〃）フルクト
ース　　　　　　　２．５％（〃）エタノール　　　　
　　　　　５　、　０　（ｖ／ｖ）％カビシジン（Ｋａ
ｔ）ｉｃｉｄｉｎ）　　　１００ｐｐｍ　　（ｖ／ｖ　
）エリスロマイシン　　　　　　　ｉｐｐｍ　　（〃）
ｐＨ６，２次いで、これを３０℃で２〜３日間培養し、生育及び著
量のガス産生が認められた培養液を、下記組成の分離用
寒天・１也板培地に塗布した。

分離用寒天ｆ板培地酵母エキス〔オキソイド社製〕　　　　　１．０％（ｗ／ｖ　）Ｋ
Ｈ２ＰＯ４０，２％（〃）グルコース　　　　　　　　１．０％（〃）フルクトー
ス　　　　　　　　１．０％（〃）カビシジン　　　　
　　　１００ｐｐＩＩｌ（”　　）寒　　　　天　　　
　　　　　　　　１．５％　（〃）１）Ｈ６，２嫌気条件ドに３０℃で２〜３日間培養し、出現したコロ
ニーをに記寒天平板培地に画線培養し、同様に培養して
、純粋分離を行なった。

純粋分離後、再度、寒天平板培地に塗布するとともに、
顕微鏡観察を行なって、純化を確認した。

上記菌株の形態的性質、各培地−にでの性状及び生理学
的性質は前記の通りであり、本発明者は、これをザイモ
モナス・モビリス・サブスピーシーズ・モビリス　８５
３と命名した。

ザイモモナス・モビリス・サブスピーシーズ・モビリス
　Ｂ６９も、同様にして、ブラジルで採取したサトウキ
ビ搾汁から分離した。

上記試験の結果、本発明の微生物２株は自然界より純粋
に分離された菌株であることか判る。

参考例１実施例で得た菌株を利用して、糖蜜からエタノールを製
造した。なお、培養液からのエタノールの回収は、蒸留
、抽出、膜分離等の公知の手段を用いて行なう。

第１表に組成を示す培地に菌株を接種し、３０℃で２４
時間静置培養した後、この培養液を第２表に組成を示す
培地に１０’　（ｖ／ｖ　）％星接種して、３０℃で２
４時間静置培養する。この培養液を前培養液とする。

この前培養液を、糖濃度２００　ｇ／リットルの糖蜜希
釈液に１０（ｗ／ｖ）％量接種し、３０℃あるいは３７
℃で静置培養する。

培養温度３０℃での糖蜜発酵特性を第１図に、培養温度
３７℃での糖蜜発酵特性を第２図に（糖濃度は、いずれ
も２０（ｗ／ｖ）％）、もろみ中のエタノール濃度を第
３表に示す。

本発明による菌株は、公知のザイモモナス属細菌に比べ
て糖蜜からのエタノール生成速度が大きく、また高温条
件下においても発酵阻害を受けにくい株であることが判
る。

第１表　培地組成酵母エキス　　　　　　１．　０％（ｗ／ｖ　）グルコ
ース　　　　　　２．　０％（〃）ｐＨ未調整第２表　培地組成酵母エキス　　　　　　１．　０％（ｗ／ｖ　）グルコ
ース　　　　　　５．　０％（／ｌ　）ｐＨ未調整（℃）２４　　４８　　７２　　９６　　１２ＯＮＲＲ
Ｌ　　　　３０　０．２０　１．１５　３．８０　４．
８７　５．３６””２３３７０．５０２．５２３．２１
３．６１４．０４ＡＴＣＣ３００，２４０，４０１，９
７３，７５４，５４２９１９１３７０，２０（１，７６
１，７（１２，０４２，００Ｂ５３　　　　３０　０．
４２　３．３２　５．３５　５．７５　５．９０３７　
０．９３　４．３９　５．１９　５．１９　５．２０Ｂ
Ｂ９　　　　３０　０．３Ｂ　　２．８１　５．ＯＢ　
　５．５２　５．８０３７１゜＋９　４．８９　５．０
４　５Ｊ５　５．３３発酵原料：　糖濃度２０　（ｖ／
ｖ）％糖蜜希釈液＊これらの菌株は、いずれもザイモモ
ナス・モビリスに属するものである。

参考例２本発明によるザイモモナス・モビリス８５３株および同
８６９株を、それぞれ、酵母エキス（オキソイド社製）
　１．　０　（ｗ／ｖ　）％、リン酸−カリウム０．　
２　（ｗ／ｖ）％、グルコース２．　０　（ｗ／■）％
、寒天２．０（ν／ｖ）％より成るＲＭ斜而面地（ｐＨ
６，５）に−白金耳植菌し、３０℃で２４時間培養した
。このスラントから同様組成の液体培地（ＲＭ液体培地
）に−白金耳接種し、３０℃で２４　ｎ、ｉ間装置培養
したものを前々培養液とした。この前々培養液を再度、
ＲＭ液体培地１００部（容量）に対して１部（容量）添
加し、３０℃で１８時門静置培養したものを前培養液と
した。

この前培養液を０〜３　（ｗ／ｖ　）％のＫＣＩを含む
グルコース濃度５．０（ν／Ｖ　）％のＲＭ液体培地１
００部（容量）に対して１部（容量）添加して、３０’
Ｃで３回間静置培養した。培養終了後、−１５〜培養液を０．４５μ孔径のフィルターで濾過し、高速液
体クロマトグラフあるいはガスクロマトグラフを用いて
エタノール濃度を測定した。

同様の実験をザイモモナス・モビリスの公知菌であるＮ
ＲＲＬ　　Ｂ−１４０２３株およびＡＴＣＣ２９１９１
株についても行なった。

５回の実験を行なった結果は、次表にまとめた通りであ
る。

＝　　１６　　− 参考例３本例は、本発明８５３株および８６９株と公知菌のＮＲ
ＲＬ　　Ｂ−１４０２３株およびＡＴＣＣ２９１９１株
との差をそれらの保有するプラスミドに着目して検討し
たものである。

各菌株のプラスミドＤＮＡは、Ｂｉｒｎｂｏｉｍおよび
Ｄｏｌｙのアルカリ抽出法（Ｎｕｃｌｅｊｃ　ａｃｉｄ
ｓ　Ｒｅｓ、　７．１５＋３　（１９７９）　）により
調製し、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノー
ル沈殿を行なって精製したのち、ＴＥＩＩ衝ｄ（Ｎ−ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１０ｍＭ士エチ
レンジアミンテトラ酢酸１ｍＭ、ｐＨ８，０）に溶解し
た。

各プラスミドならびにそのＨｉｎｄｕ（■宝酒造）分解
物について、またλＤＮＡ−Ｈｉｎｄｍ／φＸ　１７４
ＲＦ−Ｈａ　ｅｍ分子ｆｉｖ−力−（■ファルマシア）
について、常法に従ってアガロースゲル電気泳動を行な
った。たｖし、プラスミドそのものについての電気泳動
はアガロースゲル濃度０．７％で、プラスミドのＨｉｎ
ｄＩＩＩ分解物および上記マーカーについてのそれは１
．０％で、行なった。

８５３株は約５ｋｂの低分子量のプラスミドと数１０ｋ
ｂ以１−のプラスミドとを有していたのに対して、Ｂ６
９は数１０ｋｂ以ｌ−のプラスミドのみを有していた。

一方、プラスミドをＨｉｎｄｕで消化した切断フラグメ
ントの電気泳動パターンは８５３株および８６９株相互
で明瞭に異なっており、またこれらはタイプカルチャー
のザイモモナス争モビリスＮＲＲＬ　　Ｂ−１４０２３
やＡＴＣＣ２ＱＩＱ１に含まれるプラスミドとも明瞭に
異なっていた。

【図面の簡単な説明】

図面は、４種の菌株についての糖蜜発酵特性を示すグラ
フであって、第１図は発酵温度が３０℃、第２図は同３
７℃の場合を示すものである。出願人代理人　　佐　　藤　　−雄一〜ｎ寸％（Δ／Ｍ）筆Ｖ１ｒ−／θ■ −へ１寸 ζ−−ζ■−−−−−−− ％（Δ／Ｍ）夏組ＩＣ−７θ工

Claims

【特許請求の範囲】１、グルコース５．０（ｗ／ｖ）％、リン酸−カリウム
０．２（ｗ／ｖ）％、酵母エキス１．０（ｗ／ｖ）％お
よび塩化カリウム２．０（ｗ／ｖ）％より成る液体培地
（ｐＨ６．５）で、初菌数１０＾５ｃｅｌｌｓ／ｍｌレ
ベルで３０℃で３日間静置培養したときに、少なくとも
１．７５（ｗ／ｖ培養液）％のエタノールを生産する、
ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂ
ｉｌｉｓ）。２、上記液体培地で初菌数１０＾５ｃｅｌｌｓ／ｍｌレ
ベルで３０℃で３日間静置培養したときに少なくとも１
．９０（ｗ／ｖ培養液）％のエタノールを生産するザイ
モモナス・モビリス・サブスピーシーズ・モビリス　Ｂ
５３（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｉｓｓｕｂｓｐ
．ｍｏｂｉｌｉｓ　Ｂ５３：微工研菌寄第８９２２号）
である、特許請求の範囲第１項記載のザイモモナス・モ
ビリス。３、上記液体培地で初菌数１０＾５ｃｅｌｌｓ／ｍｌレ
ベルで３０℃で３日間静置培養したときに少なくとも１
．７５（ｗ／ｖ培養液）％のエタノールを生産するザイ
モモナス・モビリス・サブスピーシーズ・モビリス　Ｂ
６９（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｌｓｓｕｂｓｐ
．ｍｏｂｉｌｉｓ　Ｂ６９：微工研菌寄第８９２３号）
である、特許請求の範囲第１項記載のザイモモナス・モ
ビリス。