DE60208450T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Glutamin mittels Fermentation und ein L-Glutamin produzierendes Bakterium - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von L-Glutamin mittels Fermentation und ein L-Glutamin produzierendes Bakterium Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein L-Glutamin-erzeugendes Bakterium, das zu den coryneformen Bakterien gehört, und ein Verfahren zur Erzeugung von L-Glutamin. L-Glutamin ist eine industriell nützliche Aminosäure als Bestandteil von Gewürzen, Leberfunktions-unterstützenden Mitteln, Aminosäuretransfusionen, umfassenden Aminosäurepräparationen usw.
  • VERWANDTER STAND DER TECHNIK
  • Um L-Aminosäure durch Fermentation zu erzeugen, wurden weit verbreitet Verfahren zur Verbesserung von Mikroorganismen durch Züchtung verwendet. D.h., es waren Verfahren für eine Verleihung einer Auxotrophie oder einer Analogresistenz durch Mutation oder einer Verleihung einer Mutation für die Stoffwechselregulation und Verfahren unter Verwendung einer Kombination von diesen bekannt, da die Produktionsfähigkeit von Wildstämmen per se für eine L-Aminosäureproduktion in vielen Fällen extrem niedrig ist. Obwohl L-Glutamin mit einem geeigneten Ertrag durch die vorher erwähnten Verfahren erhalten werden kann ist es unumgänglich, den Fermentationsertrag weiter zu verbessern, um L-Glutamin bei niedrigen Kosten industriell zu erzeugen.
  • Weiterhin leidet die L-Glutaminfermentation auch an einem Problem einer Nebenproduktion von L-Glutaminsäure. Ein Verfahren zur Lösung dieses Problems wird z.B. in der japanischen Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 3-232497 vorgeschlagen. Obwohl die Produktion von L-Glutaminsäure in einem bestimmten Ausmaß durch dieses Verfahren unterdrückt werden kann, gibt es immer noch eine Nebenproduktion von L-Glutaminsäure und der Ertrag an L-Glutamin ist unzureichend.
  • Da solche Verbesserungen der L-Glutamin-erzeugenden Bakterien, wie oben erwähnt, Verfahren einer Behandlung eines Wirts-Bakteriums mit einem Mutagenesemittel oder ähnlichem und Selektion eines Stamms, der eine verbesserte Produktivität für L-Glutamin aus Bakterien, statistisch mit Mutationen versehen, umfassen, benötigen sie viel Arbeit und leiden an etlichen Schwierigkeiten.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung Eigenschaften von coryneformen Bakterien aufzufinden, die eine Verbesserung der L-Glutaminproduktivität und eine Unterdrückung der Nebenproduktion von L-Glutaminsäure bereitstellen und dadurch ein Verfahren zur Erzeugung von L-Glutamin unter Verwendung eines Stammes mit solchen Eigenschaften bereitzustellen.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben intensiv studiert, um die vorstehende Aufgabe zu lösen. Im Ergebnis haben sie festgestellt, dass ein Stamm eines coryneformen Bakteriums, dessen intrazelluläre Glutaminsynthetaseaktivität erhöht war, eine bessere L-Glutamin-erzeugende Aktivität zeigte und die Nebenproduktion von L-Glutaminsäure im Vergleich mit Stämmen, die eine Glutaminsynthetaseaktivität vergleichbar mit derjenigen von Wildstämmen aufweisen, deutlich unterdrücken konnte. Sie stellten weiter fest, dass die Produktionsrate von L-Glutamin durch simultane Verstärkung der Glutaminsynthetaseaktivität und der Glutamatdehydrogenaseaktivität verbessert wurde. Weiterhin isolierten sie erfolgreich ein Gen, das die Glutaminsynthetase kodierte und ein Gen, das die Glutminsynthetase-Adenylyltransferase kodierte und bewirkten so die vorliegende Erfindung.
  • In diesem Hinblick stellten die Erfinder das folgende bereit:
    • (1) Ein coryneformes Bakterium, das eine L-Glutamin-erzeugende Fähigkeit aufweist und so modifiziert wurde, dass die intrazelluläre Glutaminsynthetaseaktivität verstärkt sein würde.
    • (2) Das Bakterium gemäß (1), worin die Glutaminsynthetaseaktivität durch Erhöhung der Expressionsmenge eines Glutaminsynthetasegens verstärkt ist.
    • (3) Das Bakterium gemäß (2), worin die Expressionsmenge des Glutaminsynthetasegens durch eine Erhöhung der Kopiezahl eines Gens, kodierend die Glutaminsynthetase oder Modifikation einer Expressionskontrollsequenz des Gens erhöht ist, so dass die Expression des Gens, kodierend die intrazelluläre Glutaminsynthetase des Bakteriums verstärkt sein würde.
    • (4) Das Bakterium gemäß (1), wobei die Glutaminsynthetaseaktivität durch Defizienz in der Aktivitätskontrolle der intrazellulären Glutaminsynthetase durch Adenylylierung verstärkt ist.
    • (5) Bakterium gemäß (4), worin die Aktivitätskontrolle der intrazellulären Glutaminsynthetase durch Adenylylierung, durch eins oder mehr der folgenden defekt ist: Beherbergung einer Glutaminsynthetase, deren Aktivitätskontrolle durch Adenylylierung defekt ist, Abnahme der Glutaminsynthetase-Adenylyltransferaseaktivitäten in der bakteriellen Zelle und Abnahme der PII-Proteinaktivität in der bakteriellen Zelle.
    • (6) Bakterium gemäß einem der Punkte (1) bis (5), wobei das Bakterium weiter modifiziert wurde, so dass die intrazelluläre Glutamatdehydrogenaseaktivität verstärkt sein würde.
    • (7) Bakterium gemäß (6), wobei die Glutamatdehydrogenaseaktivität durch Erhöhung der Expressionsmenge eines Glutamatdehydrogenasegens verstärkt ist.
    • (8) Bakterium gemäß (7), wobei die Expressionsmenge des Glutamatdehydrogenasegens durch Erhöhung der Kopienzahl des Gens, kodierend die Glutamatdehydrogenase oder Modifikation einer Expressionskontrollsequenz des Gens erhöht ist, so dass die Expression des Gens, kodierend die intrazelluläre Glutamatdehydrogenase des Bakteriums erhöht sein würde.
    • (9) Verfahren zur Erzeugung von L-Glutamin, das die Kultivierung eines Bakteriums gemäß einem der Punkte (1) bis (8) in einem Medium umfasst, um L-Glutamin im Medium zu erzeugen und anzuhäufen und Sammeln des L-Glutamins.
    • (10) DNA, kodierend ein Protein, definiert in den folgenden Punkten (A) und (B): (A) Ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2, (B) ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist, einschließlich einer Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion von einem oder etlichen Aminosäureresten und das eine Glutaminsynthetaseaktivität aufweist.
    • (11) DNA gemäß (10), wobei es sich um eine DNA handelt, definiert in den folgenden (a) oder (b): (a) DNA, enthaltend die Nukleotidsequenz der Nucleotidzahl 659-1996 in der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, (b) eine DNA, die mit der Nucleotidsequenz der Nucleotidzahlen 659-1996 in der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 hybridisierbar ist oder einer Sonde, die aus der Sequenz unter stringenten Bedingungen hergestellt werden kann und ein Protein mit Glutaminsynthetaseaktivität kodiert.
    • (12) DNA, kodierend ein Protein, definiert in den folgenden (C) oder (D): (C) Ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3, (D) ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 aufweist, einschließlich einer Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion von einem oder etlichen Aminosäureresten und das Glutaminsynthetase-Adenylyltransferaseaktivitäten aufweist.
    • (13) DNA gemäß (12), wobei es sich um eine DNA handelt, definiert in den folgenden (c) oder (d): (c) DNA, enthaltend die Nukleotidsequenz der Nucleotidzahl 2006-5200 in der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, (b) eine DNA, die mit der Nucleotidsequenz der Nucleotidzahlen 2006-5200 in der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 hybridisierbar ist oder einer Sonde, die aus der Sequenz unter stringenten Bedingungen hergestellt werden kann und ein Protein mit Glutaminsynthetase-Adenylyltransferaseaktivitäten kodiert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein coryneformes Bakterium gemäß Anspruch 1 bereit.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Nebenproduktion von L-Glutaminsäure unterdrückt und die Produktionseffizienz von L-Glutamin kann bei der Herstellung von L-Glutamin durch Fermentation unter Verwendung dieses coryneformen Bakterium verbessert werden. Weiterhin kann die in der vorliegenden Erfindung offenbarte DNA zum Anzüchten von L-Glutamin-erzeugenden coryneformen Bakterien verwendet werden.
  • BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
  • Hiernach wird die vorliegende Erfindung im Detail erklärt.
  • (1) Coryneforme Bakterien der vorliegenden Erfindung
  • In der vorliegenden Erfindung beinhalten "coryneforme Bakterien" diejenigen, die bis jetzt in der Gattung Brevibacterium klassifiziert werden, jedoch nun in der Gattung Corynebacterium vereint sind (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)) und beinhalten Bakterien, die zur Gattung Brevibacterium gehören, und eng verwandt sind mit der Gattung Corynebacterium. Beispiele für solche coryneforme Bakterien werden unten erwähnt:
    Corynebacterium acetoacidophilum
    Corynebacterium acetoglutamicum
    Corynebacterium alkanolyticum
    Corynebacterium callunae
    Corynebacterium glutamicum
    Corynebacterium lilium
    Corynebacterium melassecola
    Corynebacterium thermoaminogenes
    Corynebacterium herculis
    Brevibacterium divaricatum
    Brevibacterium flavum
    Brevibacterium immariophilum
    Brevibacterium lactofermentum
    Brevibacterium roseum
    Brevibacterium saccharolyticum
    Brevibacterium thiogenitalis
    Brevibacterium ammoniagenes
    Brevibacterium album
    Brevibacterium cerium
    Microbacterium ammoniaphilum
  • Spezifisch können die folgenden Stämme beispielhaft erwähnt werden.
    Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
    Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
    Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
    Corynebacterium callunae ATCC 15991
    Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, 13032, 13060
    Corynebacterium lilium ATCC 15990
    Corynebacterium melassecola ATCC 17965
    Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539)
    Corynebacterium herculis ATCC 13868
    Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
    Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205)
    Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
    Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
    Brevibacterium roseum ATCC 13825
    Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
    Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
    Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871, ATCC 6872
    Brevibacterium album ATCC 15111
    Brevibacterium cerium ATCC 15112
    Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
  • Um diese Stämme zu erhalten, kann man sie sich z.B. von der American Type Cultur Collection (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA) zur Verfügung stellen lassen. D.h., dass jedem Stamm eine Hinterlegungsnummer zugeordnet ist und man kann die Bereitstellung von jedem Stamm unter Verwendung dieser Hinterlegungsnummer beantragen. Die Hinterlegungsnummern korrespondieren zu den Stämmen, die in dem Katalog der American Type Culture Collection angegeben sind. Weiterhin wurde der AJ12340-Stamm am 27. Oktober 1987 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (z.Z. die unabhängige Verwaltungsfirma National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Chue Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi Ibaraki-ken, Japan, Postfach: 305-8566)) als internationale Hinterlegung gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-1539. Der AJ12418-Stamm wurde am 5. Januar 1989 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummern FERM BP-2205.
  • In der vorliegenden Erfindung bedeutet eine "L-Glutamin-erzeugende Fähigkeit" eine Fähigkeit L-Glutamin in einem Medium anzuhäufen, wenn das coryneforme Bakterium der vorliegenden Erfindung im Medium kultiviert wird. Diese L-Glutamin-erzeugende Fähigkeit kann ein Bakterium als Eigenschaft eines Wildstamms von coryneforme Bakterien besitzen oder ihm durch Züchtung verliehen oder bei ihm dieselbe dadurch verstärkt worden sein.
  • Um die L-Glutamin-erzeugende Fähigkeit durch Züchten zu verleihen oder dieselbe zu verstärken, kann ein Verfahren zur Isolation eines 6-Diazo-5-oxo-norleucin-resistenten Stamms (japanische Patentveröffentlichung Nr. 3-232497), ein Verfahren zur Isolation eines Purinanalog-resistenten und/oder Methioninsulfoxid-resistenten Stamms (japanische Patentveröffentlichung Nr. 61-202694), das Isolationsverfahren eines α-Ketomalonsäure-resistenten Stamms (japanische Patentveröffentlichung Nr. 56-151495), das Verfahren der Verleihung einer Resistenz gegenüber einem Peptid, enthaltend Glutaminsäure (japanische Patentveröffentlichung Nr. 2-186994) usw. als spezifische Beispiele für coryneforme Bakterien mit L-Glutamin-erzeugender Fähigkeit, können die folgenden Stämme erwähnt werden, verwendet werden.
    Brevibacterium flavum AJ11573 (FERM P-5492, siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 56-151495)
    Brevibacterium flavum AJ12210 (FERM P-8123, siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 61-202694)
    Brevibacterium flavum AJ12212 (FERM P-8123, siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 61-202694)
    Brevibacterium flavum AJ12418 (FERM-BP-2205, siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 2-186994)
    Brevibacterium flavum DH18 (FERM P-11116, siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 3-232497)
    Corynebacterium melassecola DH344 (FERM P-11117, siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 3-232497)
    Corynebacterium glutamicum AJ11574 (FERM P-5493, siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 56-151495)
  • Die Bezeichnung "modifiziert, so dass die intrazelluläre Glutaminsynthetase (hiernach auch als "GS" bezeichnet)-Aktivität erhöht sein sollte" bedeutet, dass die GS-Aktivität pro Zelle höher geworden ist als die eines nicht-modifizierten Stamms, z.B. eines Wildtyp coryneformen Bakteriums. Es kann z.B. ein Fall erwähnt werden, worin die Zahl der GS-Moleküle pro Zelle ansteigt, ein Fall, worin die GS-spezifische Aktivität pro GS-Molekül ansteigt, usw. Weiterhin kann z.B. als Wildtyp coryneformes Bakterium, das als Vergleichsobjekt dient, z.B. Brevibacterium flavum ATCC 14067 erwähnt werden. Als Ergebnis der Erhöhung der intrazellulären GS-Aktivität wird eine Wirkung erhalten, dass nämlich die Menge der L-Glutaminanhäufung in einem Medium ansteigt, die Wirkung, dass die Nebenproduktion von L-Glutaminsäure abnimmt, usw.
  • Die Verstärkung der GS-Aktivität in einer coryneformen Bakterienzelle kann durch Erhöhung der Expression eines Gens, das GS kodiert, erreicht werden. Die Erhöhung der Expressionsmenge des Gens kann durch Erhöhung der Kopiezahl des Gens, das GS kodiert, erreicht werden. Es kann z.B. eine rekombinante DNA durch Ligation eines Genfragments, das für GS kodiert, mit einem Vektor hergestellt werden, der in dem Bakterium funktioniert, vorzugsweise einem Vektor vom Multikopietyp und in einen Wirt eingeführt werden, der eine L-Glutamin-produzierende Fähigkeit aufweist, um diesen zu transformieren. Alternativ kann die vorher erwähnte rekombinante DNA in ein Wildtyp coryneformes Bakterium zum Erhalt eines Transformanten eingeführt werden und dann kann der Transformant mit einer L-Glutamin-erzeugenden Fähigkeit versehen werden.
  • Als GS-Gen können alle Gene, abstammend von coryneformen Bakterien und Gene, abstammend von anderen Organismen, wie z.B. Bakterien die zur Gattung Escherichia gehören, verwendet werden. Unter diesen werden Gene, die von coryneformen Bakterien abstammen, im Hinblick auf eine einfache Expression bevorzugt.
  • Als GS-kodierendes Gen von coryneformen Bakterien wurde bereits glnA aufgeklärt (FEMS Microbiology Letters, 81-88, 154, 1997). Daher kann ein GS-Gen durch PCR (Polymerasekettenreaktion; siehe White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) erhalten werden, wobei Primer verwendet werden, die basierend auf der Nucleotidsequenz des Gens hergestellt wurden, z.B. die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 4 und 5 erwähnten Primer, und chromosomale DNA eines coryneformen Bakteriums als Matrize. Gene, die GS anderer Mikroorganismen kodieren, können auf ähnliche Weise erhalten werden.
  • Die chromosomale DNA kann aus einem Bakterium, das ein DNA-Donor ist, beispielsweise durch das Verfahren von Saito und Miura (siehe H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Text for Bioengineering Experiments, hergegeben von Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, S. 97-98, Baifukan, 1992) hergestellt werden.
  • Nebenbei gesagt existiert häufig ein Isoenzym für ein Enzym, das an einem Aminosäurebiosynthesesystem beteiligt ist. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben erfolgreich ein Gen, das ein Isoenzym von GS eines coryneformen Bakteriums kodiert, isoliert und kloniert, wobei sie eine Homologie im Hinblick auf die Nucleotidsequenz des vorher erwähnten glnA-Gens verwendet haben. Dieses Gen wird als "glnA2" bezeichnet. Das Verfahren zum Erhalt desselben wird später beschrieben werden. glnA2, wie auch glnA, können für eine Verstärkung der GS-Aktivität von coryneformen Bakterien verwendet werden.
  • Wenn das durch das PCR-Verfahren amplifizierte GS-Gen mit einer Vektor-DNA ligiert wird, die autonom in einer Zelle von Escherichia coli und/oder coryneformen Bakterien replizierbar ist, um eine rekombinante DNA herzustellen und das Produkt dann in Escherichia coli eingeführt wird, wird das darauffolgende Verfahren einfach. Beispiele für einen Vektor, der in einer Zelle von Escherichia coli autonom replizierbar ist, beinhalten pUC19, pUC18, pHSGG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219 usw.
  • Ein Vektor der in coryneformen Bakterien funktioniert, bedeutet z.B. ein Plasmid, das sich in coryneformen Bakterien autonom replizieren kann. Spezifische Beispiele hierfür beinhalten die folgenden.
    pAM330 (siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 58-67699)
    pHM1519 (siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 58-77895)
  • Weiterhin kann, wenn ein DNA-Fragment mit einer Fähigkeit ein Plasmid autonom in coryeformen Bakterien replizierbar zu machen, aus diesen Vektoren entnommen wird und in die vorstehenden Vektoren für Escherichia coli inseriert wird, diese als sogenannter Shuttle-Vektor verwendet werden können, der autonom sowohl in Escherichia coli als auch in coryneformen Bakterien replizierbar ist.
  • Beispiele für solche Shuttle-Vektoren beinhalten die unten erwähnten. Hier sind auch Mikroorganismen angegeben, die die jeweiligen Vektoren beherbergen und die Hinterlegungsnummern bei den internationalen Hinterlegungsstellen sind jeweils in den Klammern angegeben.
    • pAJ655
    Escherichia coli AJ11882 (FERM BP-136) Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135)
    pAJ1844
    Escherichia coli AJ11883 (FERM BP-137) Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136)
    pAJ611
    Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138)
    pAJ3148
    Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC 39137)
    pAJ440
    Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140)
    pHC4
    Escherichia coli AJ12617 (FERM BP-3532)
  • Diese Vektoren können wie folgt von den hinterlegten Mikroorganismen erhalten werden. Mikrobielle Zellen werden nämlich in ihrer exponentiellen Wachstumsphase gesammelt und durch Verwendung von Lysozym und SDS lysiert und bei 30.000 × g zentrifugiert. Der von dem Lysat erhaltene Überstand wird mit Polyethylenglycol versetzt, fraktioniert und durch Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Gleichgewichts-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt.
  • Um eine rekombinante DNA durch Ligation eines GS-Gens und eines Vektors, der in einer Zelle von coryneformen Bakterien funktioniert, herzustellen, wird ein Vektor mit einem Restriktionsenzym verdaut, dass zum Terminus des Gens korrespondiert, das das GS-Gen enthält. Die Ligation wird in der Regel durch Verwendung einer Ligase, wie z.B. T4-DNA-Ligase durchgeführt.
  • Um die rekombinante DNA in einen Mikroorganismus einzuführen, der wie oben beschrieben hergestellt wurde, können alle bekannten Transformationsverfahren, über die bis jetzt berichtet wurde, verwendet werden. Z.B. ist ein Verfahren verwendbar, wobei Empfängerzellen mit Calciumchlorid behandelt werden, um die Permeabilität der DNA zu erhöhen, wie für Escherichia coli K-12 berichtet (Mandel, M. und Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), wie auch ein Verfahren zur Herstellung kompetenter Zellen aus Zellen, die sich in der Wachstumsphase befinden, gefolgt von Einführung der DNA, wie z.B. wie berichtet für Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. und Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)). Zusätzlich ist auch ein Verfahren verwendbar, worin DNA-Empfängerzellen zu Protoplasten gemacht werden oder auch zu Sphäroplasten, die einfach rekombinante DNA aufnehmen, gefolgt von einer Einführung der rekombinanten DNA in die Zellen, was bekanntlich auf Bacillus subtilis, Actinomyceten und Hefen anwendbar ist (Chang, S. und Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. und Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. und Fink, G.R., Proc. Natl. Sci. USA, 75, 1929 (1978)). Die Transformation coryneformer Bakterien kann auch durch das elektrische Pulsverfahren durchgeführt werden (Sugimoto et al., japanische Patentveröffentlichung Nr. 2-207791).
  • Eine Erhöhung der Kopiezahl des GS-Gens kann auch durch die Einführung multipler Kopien des GS-Gens in die chromosomale DNA von coryneformen Bakterien erreicht werden. Um multiple Kopien des GS-Gens in die chromosomale DNA coryneformer Bakterien einzuführen, wird eine homologe Rekombination unter Verwendung einer Sequenz durchgeführt, deren multiple Kopien in der chromosomalen DNA als Ziel existieren. Als Sequenzen, deren multiple Kopien in der chromosomalen DNA existieren, können repititive DNAs, inverse Repeats, die am Ende eines transponierbaren Elements existieren, verwendet werden. Ebenfalls ist es möglich, wie offenbart in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 2-109985, das GS-Gen in ein Transposon einzubauen und es diesem zu ermöglichen transferiert zu werden, um multiple Kopien des Gens in die chromosomale DNA einzuführen.
  • Die Verstärkung der GS-Aktivität kann auch neben der vorher erwähnten Genamplifikation durch Ersatz einer Expressionskontrollsequenz des GS-Gens auf der chromosomalen DNA oder eines Plasmids, wie z.B. ein Promotor, durch einem stärkeren erreicht werden. Z.B. sind der lac-Promotor, trp-Promotor, trc-Promotor usw. als starke Promotoren bekannt. Es ist weiterhin auch möglich eine Nucleotidsubstitution für etliche Nucleotide in einen Promotorbereich für das GS-Gen einzuführen, so dass dieser sich in einen stärkeren verwandelt, wie offenbart in der internationalen Patentveröffentlichung WO 00/18935. Durch eine solche Substitution oder Modifikation des Promotors wird die Expression des GS-Gens verstärkt und so die GS-Aktivität erhöht. Eine solche Modifikation der Expressionskontrollsequenz kann mit einer Erhöhung der Kopiezahl des GS-Gens kombiniert werden.
  • Die Substitution der Expressionskontrollsequenz kann z.B. auf dieselbe Weise wie eine Gensubstitution unter Verwendung eines Temperatur-empfindlichen Plasmids, wie später beschrieben, durchgeführt werden. Beispiele für das Temperatur-empfindliche Plasmid coryneformer Bakterien beinhalten p48K, pSFKT2 (siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 2000-262288 für beide), pHSC4 (siehe französische Patentveröffentlichung Nr. 2667875, 1992 und die japanische Patentveröffentlichung Nr. 5-7491) usw. Diese Plasmide können sich mindestens autonom bei einer Temperatur von 25°C replizieren, können sich jedoch nicht autonom bei einer Temperatur bei 37°C in coryneformen Bakterien replizieren. Obwohl pSFKT2 für die Substitution für die Promotorsequenz des GDH-Gens in dem später erwähnten Beispiel verwendet wurde, kann die Gensubstitution auf ähnliche Weise unter Verwendung von pHSC4 anstelle von pSFKT2 durchgeführt werden. Escherichia coli AJ12571, der pHSC4 beherbergt, wurde am 11. Oktober 1990 beim National Institut of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Internationel Trade and Industry (z.Zt. die unabhängige Verwaltungsfirma National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, PLZ: 305-8566)) hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM P-11763. Dann wurde er gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages am 26. August 1991 übertragen in eine internationale Hinterlegung und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-3524.
  • Die Verstärkung der GS-Aktivität wird gemäß der vorliegenden Erfindung durch die Defizienz in der Regulation durch die Adenylylierung von intrazellulärem GS erreicht, neben einer Basis auf dem Anstieg der Expressionsmenge des GS-Gens, wie oben beschrieben. GS verändert sich durch Adenylylierung eines Tyrosinrests in der Aminosäuresequenz in eine inaktive Form (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 642-649, (58) 1967; J. Biol. Chem., 3769-3771, (243) 1968). Daher kann durch einen Defekt dieser Adenylylierung von GS die intrazelluläre GS-Aktivität erhöht werden. Der Defekt der Adenylylierung, wie hier verwendet, bedeutet nicht nur eine im wesentlichen vollständige Deregulierung durch die Adenylylierung, sondern auch eine Reduktion der Adenylylierung, so dass die intrazelluläre GS-Aktivität verstärkt werden sollte.
  • Die Adenylylierung von GS wird allgemein durch die Adenylyltransferase durchgeführt (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1703-1710, (58) (1967)). Es wurde vorgeschlagen, dass der 405. Tyrosinrest des glnA-Genprodukts in coryneformen Bakterien, der durch die Sequenz von GeneBank-Hinterlegung Y13221 repräsentiert wird, adenylyliert ist (FEMS Microbiology Letters, 303-310, 1999 (173)). Die Inaktivierung durch die Adenylylierung von GS kann durch Einführung einer Mutation in das glnA-Gen gestört werden, so dass der Tyrosinrest durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt würde.
  • Weiterhin kann die Inaktivierung von GS durch Adenylylierung auch dadurch gestört werden, indem die Aktivitäten der intrazellulären Glutminsynthetase-Adenylyltransferase (ATase) reduziert werden. Obwohl eine Adenylyltransferase für coryneforme Bakterien unbekannt war, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung erfolgreich ein Gen isoliert, das die Adenylyltransferase für coryneforme Bakterien kodiert, glnE. Das Verfahren hierfür wird später beschrieben werden.
  • Um die intrazelluläre ATase-Aktivität coryneformer Bakterien zu reduzieren, kann z.B. ein Verfahren zur Behandlung der coryneformen Bakterien mit UV-Bestrahlung oder mit einem Mutagenesemittel verwendet werden, das für eine übliche Mutagenesebehandlung verwendet wird, wie z.B. N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) oder salpetrige Säure und Selektion eines mutierten Stamm, worin die ATase-Aktivität reduziert ist. Coryneforme Bakterien mit reduzierter ATase-Aktivität könnten auch durch Genaufbruch neben der Mutagenesebehandlung erhalten werden. D.h., dass ein coryneformes Bakterium mit einer DNA transformiert werden kann, die ein glnE-Gen enthält, modifiziert unter Deletion einer Teilsequenz des Gens, kodierend für ATase, um keine ATase zu erzeugen, die normal funktioniert (Deletionstyp glnE-Gen), so dass die Rekombination zwischen dem Deletionstyp glnE-Gen und dem glnE-Gen auf dem Chromosom auftreten sollte, um das glnE-Gen auf dem Chromosom zu unterbrechen. Eine solche Genunterbrechung durch Gensubstitution unter Verwendung homologer Rekombination wurde bereits etabliert und es gibt Verfahren unter Verwendung einer linearen DNA, eine Plasmids, das einen temperaturempfindlichen Replikationsursprung enthält, usw.
  • Ein glnE-Gen auf dem Wirts-Chromosom kann durch das Deletionstyp glnE-Gen ersetzt werden, z.B. wie folgt. Eine rekombinante DNA wird nämlich durch Insertion eines temperaturempfindlichen Replikationsursprungs, eines mutierten glnE-Gens und eines Marker-Gens für eine Resistenz gegen ein Arzneimittel, wie Chloramphenicol hergestellt und ein coryneformes Bakterium wird mit der rekombinanten DNA transformiert. Weiterhin wird der Transformant bei einer Temperatur kultiviert, bei der der Temperatur-empfindliche Replikationsursprung nicht wirkt und dann kann der transformierte Stamm in einem Medium kultiviert werden, enthaltend das Arzneimittel um einen transformierten Stamm zu erhalten, worin die rekombinante DNA in die chromosomale DNA eingebaut ist.
  • Bei einem solchen Stamm, worin die rekombinante DNA in die chromosomale DNA, wie oben beschrieben, eingebaut ist, ist das mutierte glnE-Gen mit dem glnE-Gen rekombiniert, das ursprünglich auf dem Chromosom vorlag und die beiden Fusionsgene des chromosomalen glnE-Gens und des Deletionstyps glnE-Gens werden in das Chromosom inseriert, so dass andere Bereiche der rekombinanten DNA (Vektorsegment, Temperatur-empfindlicher Replikationsursprung und Arzneiresiszentmarker) zwischen den beiden Fusionsgenen vorliegen sollten. Daher exprimiert der transformierte Stamm normale ATase, da das normale glnE-Gen in diesem Zustand dominant ist.
  • Um dann nur das Deletionstyp-glnE-Gen auf der chromosomalen DNA zu belassen, wird dann eine Kopie des glnE-Gens zusammen mit dem Vektorsegment (einschließlich dem Temperatur-empfindlichen Replikationsursprung und dem Arzneimittelresistenzmarker) von der chromosomalen DNA durch Rekombination von zwei der glnE-Gene eliminiert. In diesem Fall verbleibt das normale glnE-Gen auf der chromosomalen DNA und das Deletionstyp-glnE-Gen wird aus der chromosomalen DNA ausgeschnitten oder im Gegenteil verbleibt das Deletionstyp-glnE-Gen auf der chromosomalen DNA und das normale glnE-Gen wird aus der chromosomalen DNA ausgeschnitten. In beiden Fällen kann die ausgeschnittene DNA in der Zelle als Plasmid zurückgehalten werden, wenn die Zelle bei einer Temperatur kultiviert wird, bei der der Temperatur-empfindliche Replikationsursprung funktionieren kann. Wenn die Zelle bei einer Temperatur kultiviert wird, bei der der Temperatur-empfindliche Replikationsursprung nicht funktioniert, kann darauffolgend, das glnE-Gen auf dem Plasmid zusammen mit dem Plasmid aus der Zelle eliminiert werden. Dann kann ein Stamm erhalten werden, worin das glnE-Gen unterbrochen ist, indem ein Stamm selektiert wird, worin das Deletionstyp-glnE-Gen auf dem Chromosom zurückgeblieben ist, wobei PCR, Southern-Hybridisierung oder ähnliches verwendet werden.
  • Weiterhin kann die Inaktivierung von GS durch Adenylylierung auch durch Reduktion der intrazellulären Aktivität des PII-Proteins beendet werden. Es ist bekannt, dass das PII-Protein auch an der Adenylylierung von GS durch ATase beteiligt ist. Das PII-Protein ist ein Signaltransferprotein zur Kontrolle der GS-Aktivität und es ist bekannt, dass es durch die Uridylyltransferase (UTase) uridylyliert wird. Das uridylylierte PII-Protein unterstützt die Deadenylylierung von GS durch ATase und das deuridylylierte PII-Protein unterstützt die Adenylylierung von GS durch ATase.
  • Es wird berichtet, dass GS in einem UTase-defizienten Stamm hoch adenylyliert ist (J. Bacteriology, 569-577, (134) 1978). Dieser Phänotyp einer exzessiven Adenylylierung wird durch Mutation des PII-Proteins unterdrückt (J. Bacteriology, 816-822, (164), 1985). D.h., die Inaktivierung von GS durch Adenylylierung kann auch durch Reduktion der PII-Proteinaktivität defekt sein. Die Reduktion der PII-Proteinaktivität bedeutet eine Reduktion der Funktion zur Unterstützung der Adenylylierung durch ATase. Das glnB-Gen, das das PII-Protein von coryneformen Bakterien kodiert, wurde bereits isoliert und es wird vorgeschlagen, dass die Unterdrückung von GS durch die Adenylylierung von GS durch Deletion des Gens defekt ist (FEMS Microbiology Letters, 303-310, (173) 1999).
  • Um die PII-Proteinaktivität coryneformer Bakterien zu reduzieren, kann z.B. ein Verfahren zur Behandlung der coryneformen Bakterien mit UV-Bestrahlung oder mit einem Mutagenesemittel verwendet werden, das für eine übliche Mutagenesebehandlung verwendet wird, wie z.B. N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) oder salpetrige Säure und Selektion eines mutierten Stamms, worin die Aktivität des PII-Proteins reduziert ist. Coryneforme Bakterien mit reduzierter PII-Proteinaktivität können auch durch Genunterbrechung neben der Mutagenesebehandlung erhalten werden. D.h., ein coryneformes Bakterium kann mit einer DNA transformiert werden, die ein glnB-Gen enthält, modifiziert unter Deletion einer Teilsequenz des Gens, kodierend das PII-Protein um kein PII-Protein zu erzeugen, das normal funktioniert (Deletionstyp-glnB-Gen), so das die Rekombination zwischen dem Deletionstyp-glnB-Gen und dem glnB-Gen auf dem Chromosom auftreten sollte, um das glnB-Gen auf dem Chromosom zu unterbrechen. Eine solche Genstörung unter Verwendung homologer Rekombination wurde bereits etabliert und es gibt Verfahren unter Verwendung einer linearen DNA, eines Plasmids, das einen Temperatur-empfindlichen Replikationsursprung enthält usw.
  • Ein glnB-Gen auf dem Wirts-Chromosom kann durch das Deletionstyp glnB-Gen ersetzt werden, z.B. wie folgt. Eine rekombinante DNA wird nämlich durch Insertion eines Temperatur-empfindlichen Replikationsursprungs, eines mutierten glnB-Gens und eines Marker-Gens für eine Resistenz gegen ein Arzneimittel, wie Chloramphenicol hergestellt und ein coryneformes Bakterium wird mit der rekombinanten DNA transformiert. Weiterhin wird der resultierende Transformantenstamm bei einer Temperatur kultiviert, bei der der Temperatur-empfindliche Replikationsursprung nicht wirkt und dann kann der transformierte Stamm in einem Medium kultiviert werden, enthaltend das Arzneimittel um einen transformierten Stamm zu erhalten, worin die rekombinante DNA in die chromosomale DNA eingebaut ist.
  • Bei einem solchen Stamm, worin die rekombinante DNA in die chromosomale DNA, wie oben beschrieben, eingebaut ist, ist das mutierte glnB-Gen mit dem glnB-Gen rekombiniert, das ursprünglich auf dem Chromosom vorlag und die beiden Fusionsgene des chromosomalen glnB-Gens und des Deletionstyps glnB-Gens werden in das Chromosom inseriert, so dass andere Bereiche der rekombinanten DNA (Vektorsegment, Temperatur-empfindlicher Replikationsursprung und Arzneiresiszentmarker) zwischen den beiden Fusionsgenen vorliegen sollten. Daher exprimiert der transformierte Stamm normales PII-Protein, da das normale glnB-Gen in diesem Zustand dominant ist.
  • Um dann nur das Deletionstyp-glnB-Gen auf der chromosomalen DNA zu belassen, wird dann eine Kopie des glnB-Gens zusammen mit dem Vektorsegment (einschließlich dem Temperatur-empfindlichen Replikationsursprung und dem Arzneimittelresistenzmarker) von der chromosomalen DNA durch Rekombination von zwei der glnB-Gene eliminiert. In diesem Fall verbleibt das normale glnB-Gen auf der chromosomalen DNA und das Deletionstyp-glnB-Gen wird aus der chromosomalen DNA ausgeschnitten oder im Gegenteil verbleibt das Deletionstyp-glnB-Gen auf der chromosomalen DNA und das normale glnB-Gen wird aus der chromosomalen DNA ausgeschnitten. In beiden Fällen kann die ausgeschnittene DNA in der Zelle stabil als Plasmid zurückgehalten werden, wenn die Zelle bei einer Temperatur kultiviert wird, bei der der Temperatur-empfindliche Replikationsursprung funktionieren kann. Wenn die Zelle bei einer Temperatur kultiviert wird, bei der der Temperatur-empfindliche Replikationsursprung nicht funktioniert, kann darauffolgend, das glnB-Gen auf dem Plasmid zusammen mit dem Plasmid aus der Zelle eliminiert werden. Dann kann ein Stamm erhalten werden, worin das glnB-Gen unterbrochen ist, indem ein Stamm selektiert wird, worin das Deletionstyp-glnB-Gen auf dem Chromosom zurückgeblieben ist, wobei PCR, Southern-Hybridisierung oder ähnliches verwendet werden.
  • Die Eliminierung der Adenylylierung von GS kann auch durch Kombination von zwei oder drei Punkten einer solchen Mutation von GS erreicht werden, die die vorstehende Adenylylierung eliminieren, die ATase-Aktivität reduzieren und die PII-Proteinaktivität reduzieren sollten.
  • Obwohl die Verstärkung der GS-Aktivität auch durch Eliminierung der Adenylylierung von GS durch ATase realisiert werden kann, kann sie auch durch eine Kombination mit den vorstehenden Mitteln zur Erhöhung der Kopiezahl des GS-Gens oder für eine Modifikation einer Expressionskontrollsequenz erreicht werden.
  • Um effizient L-Glutamin unter Verwendung der coryneformen Bakterien der vorliegenden Erfindung zu erzeugen wird ein Stamm verwendet, der eine erhöhte Glutamatdehydrogenase (hiernach als auch als "GDH" bezeichnet) -Aktivität zusammen mit der erhöhten GS-Aktivität aufweist.
  • Die Bezeichnung "modifiziert, so dass die intrazelluläre GDH-Aktivität erhöht sein sollte" bedeutet, dass die GDH-Aktivität pro Zelle höher geworden ist als die eines nicht-modifizierten Stamms, z.B. eines Wildtyp coryneformen Bakteriums. Es kann z.B. ein Fall erwähnt werden, worin die Zahl der GDH-Moleküle pro Zelle ansteigt, ein Fall, worin die GDH-spezifische Aktivität pro GDH-Molekül ansteigt, usw. Weiterhin kann als Wildtyp coryneformes Bakterium, das als Vergleichsobjekt dient, z.B. Brevibacterium flavum ATCC 14067 erwähnt werden. Als Ergebnis der Erhöhung der intrazellulären GDH-Aktivität kann die Wirkung erhalten werden, dass sich die Kultivierungszeit eines coryneformen Bakteriums mit L-Glutamin-erzeugender Fähigkeit verkürzt.
  • Die Erhöhung der GDH-Aktivität in einer coryneformen bakteriellen Zelle kann durch Erhöhung der Expression eines Gens, kodierend für die GDH, erreicht werden. Die Erhöhung der Expressionsmenge des Gens wird gemäß der vorliegenden Erfindung durch Erhöhung einer Kopiezahl des Gens, kodierend GDH, erreicht. Z.B. kann eine rekombinante DNA durch Ligation eines Genfragments, kodierend GDH, mit einem Vektor hergestellt werden, der in einem Bakterium funktioniert, vorzugsweise einem Multi-Kopietyp-Vektor und diese wird in einen Wirt eingeführt, der eine L-Glutamin-produzierende Fähigkeit aufweist, um ihn zu transformieren. Alternativ kann die vorher erwähnte rekombinante DNA in ein Wildtyp coryneformes Bakterium eingeführt werden, um einen transformierten Stamm zu erhalten und dann wird der erhaltene Transformant mit einer L-Glutamin-erzeugenden Fähigkeit versehen.
  • Als GDH-kodierendes Gen können alle Gene verwendet werden, die von coryneformen Bakterien abstammen und Gene, die von anderen Organismen abstammen, wie z.B. Bakterien, die zur Gattung Escherichia gehören. Unter diesen werden Gene, die von coryneforme Bakterien abstammen, im Hinblick auf eine einfache Expression bevorzugt.
  • Die Nucleotidsequenz eines Gens, das GDH kodiert (gdh-Gen) von coryneformen Bakterien wurde bereits aufgeklärt (Molecular Microbiology, 6 (3), 317-326 (1992)). Daher kann ein GDH-Gen durch PCR unter Verwendung von Primern, die basierend auf der Nucleotidsequenz hergestellt wurden, z.B. der Primer, die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 12 und 13 erwähnt wurden, und chromosomaler DNA von coryneformen Bakterien als Matrize erhalten werden. Gene die GDH kodieren, von anderen Mikroorganismen als coryneformen Bakterien können auf ähnliche Weise erhalten werden.
  • Das gdh-Gen kann in coryneforme Bakterien in ähnlicher Weise eingeführt werden, wie derjenigen, die für das vorher erwähnte GS-Gen verwendet wurde.
  • Bei den coryneformen Bakterien der vorliegenden Erfindung können Aktivitäten von Enzymen, wobei es sich nicht um GS- und GDH-katalysierende Reaktionen der L-Glutaminbiosynthese handelt, erhöht werden. Beispiele für die Enzyme, die Reaktionen des L-Glutaminbiosynthesewegs katalysieren, beinhalten Isocitratdehydrogenase, Aconitathydratase, Citratsynthase, Pyruvatdehydrogenase, Phosphoenolpyruvatcarboxylase, Pyruvatcarboxylase, Pyruvatkinase, Phosphofructokinase usw.
  • Weiterhin können Aktivitäten von Enzymen, die Reaktionen katalysieren, die vom L-Glutaminbiosyntheseweg abzweigen und andere Verbindungen erzeugen als L-Glutamin, reduziert oder eliminiert werden. Beispiele für Enzyme, die solche Reaktionen katalysieren beinhalten Isocitratlyase, α-Ketoglutaratdehydrogenase, Glutamatsynthase usw.
  • (2) Produktion von L-Glutamin unter Verwendung eines Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung
  • Durch Kultivierung eines coryneformen Bakteriums, das wie oben beschrieben erhalten wurde, in einem Medium zur Erzeugung und Anhäufung von L-Glutamin im Medium und Sammeln des L-Glutamins auf dem Medium kann L-Glutamin effizient erzeugt werden und eine Nebenproduktion von L-Glutaminsäure kann unterdrückt werden.
  • Um L-Glutamin unter Verwendung des coryneformen Bakteriums der vorliegenden Erfindung zu erzeugen, kann eine Kultivierung in konventioneller Weise unter Verwendung eines üblichen Mediums, enthaltend eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle und Mineralsalze, wie auch organische Spurenelemente, wie Aminosäuren und Vitamine je nach Bedarf, durchgeführt werden. Es wird entweder ein synthetisches Medium oder ein natürliches Medium verwendet. Alle Arten von Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen können verwendet werden so lange sie von dem Stamm, der kultiviert werden soll, verwendet werden können.
  • Als Kohlenstoffquelle werden Zucker verwendet, wie Glucose, Glycerin, Fructose, Saccharose, Maltose, Mannose, Galactose, Stärkehydrolysat und Melassen und organische Säuren, wie Essigsäure und Zitronensäure und Alkohole, wie Ethanol, die jeweils allein oder in Kombination mit anderen Kohlenstoffquellen verwendet werden können.
  • Als Stickstoffquelle werden Ammoniak, Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat und Ammoniumacetat, Nitratsalze usw. verwendet.
  • Als organische Spurennährstoffe werden Aminosäuren, Vitamine, Fettsäuren, Nucleinsäuren, diejenigen, die diese Substanzen enthalten, wie Pepton, Casaminosäure, Hefeextrakt und Sojaproteinabbauprodukte usw. verwendet. Wenn ein auxotropher Mutant, der eine Aminosäure oder ähnliches für sein Wachstum benötigt, verwendet wird, wird es bevorzugt, den benötigten Nährstoff zu supplementieren.
  • Als Mineralsalze werden Phosphate, Magnesiumsalze, Calciumsalze, Eisensalze, Mangansalze usw. verwendet.
  • Die Kultur wird als belüftete Kultur durchgeführt, während die Fermentationstemperatur auf 20 bis 45°C und der pH auf 5 bis 9 eingestellt wird. Wenn der pH während der Kultivierung abfällt, wird das Medium durch Zugabe von Calciumcarbonat oder eines Alkalis, wie Ammoniakgas, neutralisiert.
  • Eine substantielle L-Glutaminmenge wird in der Kulturbrühe nach 10 bis 120 Stunden einer Kultivierung in der oben beschriebenen Weise angehäuft.
  • Das Sammeln von L-Glutamin aus der Kulturbrühe nach der Kultur kann auf konventionelle Weise geschehen. Z.B. kann L-Glutamin nach Entfernung der Zellen aus der Kulturbrühe durch Konzentration der Brühe zum Kristallisieren von L-Glutamin gesammelt werden.
  • (3) DNA, kodierend für ein Protein mit Glutaminsynthetaseaktivität (glnA2-Gen) und DNA, kodierend für ein Protein mit Glutaminsynthetase- und Adenylyltransferaseaktivitäten (glnE-Gen) gemäß der vorliegenden Erfindung
  • Die erste in der vorliegenden Erfindung verwendete DNA ist ein GS-kodierendes Gen. Die zweite in der vorliegenden Erfindung verwendete DNA ist ein ATase-kodierendes Gen. Diese Gene können von einer chromosomalen DNA-Bibiliothek von Brevibacterium lactofermentum durch Hybridisierung unter Verwendung eines Teilfragments eines bekannten glnA-Gens als Sonde erhalten werden. Das Teilfragment eines bekannten glnA-Gens kann durch PCR-Amplifikation unter Verwendung chromosomaler DNA von Brevibacterium lactofermentum, z.B. Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 als Matrize und den in SEQ ID NO: 18 und 19 dargestellten Primern erhalten werden.
  • Herstellungsverfahren für eine genomische DNA-Bibliothek, Hybridisierung, PCR, Herstellung von Plasmid-DNA, Verdau und Ligation von DNA, Transformation usw. zum Erhalt der DNA der vorliegenden Erfindung und Verstärkung der GS-Aktivität und GDH-Aktivität werden in Sambrook, J., Fritsh, E.F. und Maniatis, T., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21, 1989 beschrieben.
  • Die Nucleotidsequenzen der vorher erwähnten Primer wurden basierend auf der Nucleotidsequenz des glnA-Gens von Corynebacterium glutamicum (GenBank-Hinterlegungsnummer Y13221) entworfen. Unter Verwendung dieser Primer wurde ein DNA-Fragment, enthaltend eine Region, korrespondierend zu den Nucleotidzahlen 1921-2282 des glnA-Gens (GenBank-Hinterlegungsnummer Y13221) erhalten.
  • Beispiele für die Nucleotidsequenz des DNA-Fragments, enthaltend glnA2 gemäß der vorliegenden Erfindung, erhalten wie oben beschrieben, und der Aminosäuresequenz, die durch de Sequenz kodiert werden kann, sind in SEQ ID NO: 1 dargestellt. Weiterhin ist nur eine Aminosäuresequenz eines Proteins mit Glutaminsynthetaseaktivität, kodiert durch glnA2 in SEQ ID NO: 2 dargestellt.
  • Weiterhin wurde in dem vorher erwähnten DNA-Fragment ein weiterer offener Leserahmen direkt stromabwärts vom offenen Leserahmen des glnA2-Gens angetroffen. Basierend auf einem Homologievergleich im Hinblick auf bekannte Sequenzen wurde erwartet, dass dieser ORF ein Gen (glnE), kodierend für ein Protein mit Glutminsynthetase-Adenylyltransferaseaktivitäten (ATase) ist. Nur die Aminosäuresequenz des Proteins mit der ATase-Aktivität ist in SEQ ID NO: 3 dargestellt.
  • Die Nucleotidsequenzen der DNA-Fragmente, enthaltend glnA2 oder glnE gemäß der vorliegenden Erfindung, wurden durch die vorliegende Erfindung aufgeklärt. Daher können sie aus chromosomaler DNA von Brevibacterium lactofermentum durch das PCR-Verfahren unter Verwendung von Primern, erzeugt basierend auf den Nucleotidsequenzen, isoliert werden.
  • Die erste in der vorliegenden Erfindung verwendete DNA kann eine sein, die eine Glutaminsynthetase kodiert, einschließlich einer Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion von einer oder etlichen Aminosäuren an ein oder mehr Stellen, so lange die Glutaminsynthetaseaktivität des kodierten Proteins nicht defekt ist. Obwohl die Zahl von "etlichen" Aminosäuren, wie hier genannt, differiert, abhängig von Position und Art der Aminosäurereste in der dreidimensionalen Struktur des Proteins, kann diese spezifisch 2 bis 90, vorzugsweise 2 bis 50, noch bevorzugter 2 bis 20 betragen.
  • Die zweite in der vorliegenden Erfindung verwendete DNA kann eine sein, die eine Glutminsynthetase-Adenylyltransferase kodiert, einschließlich einer Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion, von ein oder etlichen Aminosäuren an ein oder mehr Stellen, so lange die Glutminsynthetase-Adenylyltransferaseaktivitäten des kodierten Proteins nicht defekt sind. Obwohl die Zahl von "etlichen" Aminosäuren, wie hier genannt, differiert, abhängig von Position oder Art der Aminosäurereste in der dreidimensionalen Struktur des Proteins kann diese spezifisch 2 bis 350, vorzugsweise 2 bis 50, noch bevorzugter 2 bis 20 betragen. Selbst in einem Fall, in dem die Glutaminsynthetase- und Adenylyltransferaseaktivitäten beeinträchtigt sind, fällt eine solche DNA in den Umfang der vorliegenden Erfindung, so lange sie zu einer homologen Rekombination führt.
  • Eine DNA, kodierend das im wesentlichen selbe Protein wie die vorher erwähnten GS oder ATase, kann z.B. durch Modifikation der Nucleotidsequenz von glnA2 oder glnE durch eine ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden, so dass einer oder mehr Aminosäurereste an einer spezifizierten Stelle eine Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion involvieren sollten. Eine wie oben beschriebene modifizierte DNA kann auch durch ein konventionell bekanntes Mutagenesebehandlungsverfahren erhalten werden. Die Mutagenesebehandlung beinhaltet ein Verfahren der Behandlung einer DNA vor der Mutagenesebehandlung in vitro mit Hydroxylamin oder ähnlichem und ein Verfahren zur Behandlung eines Mikroorganismus, wie z.B. der Gattung Escherichia, beherbergend eine DNA vor der Mutagenesebehandlung durch UV-Bestrahlung oder mit einem Mutagenesemittel, das für eine übliche Mutagenesebehandlung verwendet wird, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) und salpetrige Säure.
  • Eine DNA, die im wesentlichen dasselbe Protein wie Glutaminsynthetase oder Glutminsynthetase-Adenylyltransferase kodiert, kann durch Expression einer DNA erhalten werden, die eine Mutation, wie oben beschrieben, aufweist, in einer geeigneten Zelle und Untersuchung der Aktivität des exprimierten Produkts. Eine DNA, die im wesentlichen dasselbe Protein wie GS oder ATase kodiert, kann durch Isolation einer DNA erhalten werden, die mit einer Sonde hybridisierbar ist, die eine Nucleotidsequenz aufweist, umfassend z.B. die Nucleotidsequenz, korrespondierend zu den Nucleotidzahlen 659 bis 1996 oder 2066 bis 5200 der Nucleotidsequenz, wie dargestellt im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 1 unter stringenten Bedingungen und ein Protein mit der Glutaminsynthetaseaktivität oder ein Protein mit der Glutminsynthetase-Adenylyltransferaseaktivität kodiert, aus einer DNA, kodierend die Glutaminsynthetase oder Glutaminsynthetase und Adenylyltransferase mit einer Mutation oder einer Zelle, die diese beherbergt. Die hier bezeichneten "stringenten Bedingungen" sind Bedingungen, unter denen ein sogenanntes spezifisches Hybrid gebildet wird und ein nicht-spezifisches Hybrid nicht gebildet wird. Es ist schwierig diese Bedingungen klar auszudrücken, indem numerische Werte verwendet werden. Die stringenten Bedingungen werden aber beispielhaft durch eine Bedingung dargestellt, bei denen DNAs mit hoher Homologie, z.B. DNAs mit einer Homologie von nicht weniger als 50 % miteinander hybridisieren, jedoch DNAs mit einer niedrigeren Homologie als der obigen nicht miteinander hybridisieren. Alternativ werden die stringenten Bedingungen durch Bedingungen beispielhaft dargestellt, unter denen DNAs miteinander bei einer Salzkonzentration, korrespondierend zu üblichen Waschbedingungen bei der Southern-Hybridisierung, d.h., 1 × SSC, 0,1 % SDS, vorzugsweise 0,1 × SSC, 0,1 % SDS bei 60°C hybridisieren.
  • Als Sonde kann auch eine Teilsequenz der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 verwendet werden. Eine solche Sonde kann durch PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden hergestellt werden, die basierend auf der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 als Primer erzeugt wurden oder eines DNA-Fragments, enthaltend die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 als Matrize. Wenn ein DNA-Fragment mit einer Länge von ungefähr 300 bp als Sonde verwendet wird, bestehen die Waschbedingungen für die Hybridisierung z.B. aus 50°C, 2 × SSC und 0,1 % SDS.
  • Gene, die unter solchen Bedingungen wie oben beschrieben hybridisierbar sind, beinhalten diejenigen mit einem Stopp-Kodon in den Genen und diejenigen, die aufgrund einer Mutation des aktiven Zentrums nicht aktiv sind. Eine solche Mutation kann jedoch einfach durch Ligation jedes Gens mit einem kommerziell erhältlichen Aktivitätsexpressionsvektors entfernt werden und Messung der Glutaminsynthetase oder Glutminsynthetase-Adenylyltransferaseaktivitäten. Die Glutaminsynthetaseaktivität kann z.B. durch das in Methods in Enzymology, Bd. XVIIA, 910-915, ACADEMIC PRESS (1970) beschriebene Verfahren und die Glutminsynthetase-Adenylyltransferaseaktivitäten z.B. durch das in Methods in Enzymology, Bd. XVIIA, 922-923, ACADEMIC PRESS (1970) beschriebene Verfahren gemessen werden. Selbst eine DNA, die die Glutminsynthetase-Adenylyltransferase kodiert, deren Aktivitäten reduziert oder deletiert sind, kann auch in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Spezifische Beispiele für eine DNA, die ein Protein kodiert, das im wesentlichen dasselbe ist wie GS, beinhalten eine DNA, kodierend ein Protein das eine Homologie von vorzugsweise 80 % oder mehr, noch bevorzugter 85 % oder mehr, besonders bevorzugt 90 % oder mehr im Hinblick auf die Aminosäuresequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 2, aufweist und eine GS-Aktivität hat. Spezifische Beispiele für die DNA, kodierend ein Protein, das im wesentlichen dasselbe ist wie ATase, beinhalten eine DNA, kodierend ein Protein das eine Homologie von vorzugsweise 65 % oder mehr, noch bevorzugter 80 % oder mehr, besonders bevorzugt 90 % oder mehr im Hinblick auf die Aminosäuresequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 3 und eine ATase-Aktivität aufweist.
  • BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
  • Hiernach wird die vorliegende Erfindung spezifischer unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben.
  • BEISPIEL 1 (VERGLEICHSBEISPIEL): BEWERTUNG EINES GS-GEN AMPLIFIZIERTEN STAMMS
  • (1) Klonierung des glnA-Gens von coryneformen Bakterien
  • Die glnA-Sequenz von Corynebacterium glutamicum wurde bereits aufgeklärt (FEMS Microbiology Letters, 81-88, (154) 1997). Basierend auf der berichteten Nucleotidsequenz wurden die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 4 und 5 dargestellten Primer synthetisiert und ein glnA-Fragment wurde durch das PCR-Verfahren unter Verwendung chromosomaler DNA von Brevibacterium flavum ATCC 14067 als Matrize amplifiziert.
  • Die chromosomale DNA von Brevibacterium flavum ATCC 14067 wurde unter Verwendung des Bacterial Genome DNA Purification Kits (Advanced Genetic Technologies Corp.) hergestellt. Die PCR wurde für 30 Zyklen durchgeführt, die jeweils aus Reaktionen bei 94°C für 30 Sekunden für die Denaturierung, bei 55°C für 15 Sekunden für das Anhaften und 72°C für 2 Minuten für die Verlängerung unter Verwendung der Pyrobest-DNA-Polymerase (Takara Shuzo) bestanden.
  • Das erzeugte PCR-Produkt wurde auf konventionelle Weise gereinigt, mit dem Restriktionsenzym SalI verdaut, mit pMW219 (Nippon Gene) ligiert, verdaut mit SalI unter Verwendung eines Ligations-Kits (Takara Shuzo) und zur Transformation kompetenter Zellen von Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) verwendet. Die Zellen wurden auf ein L-Medium, enthaltend 10 μg/ml IPTG, 40 μg/ml X-Gal und 25 μg/ml Kanamycin plattiert und über Nacht kultiviert. Dann wurden die aufgetretenen weißen Kolonien entnommen und in einzelne Kolonien zum Erhalt von Transformanten getrennt.
  • Die Plasmide wurden von Transformanten durch das Alkaliverfahren hergestellt und ein Plasmid, in das das glnA-Gen in den Vektor inseriert worden war, wurde als pMW219GS bezeichnet.
  • (2) Konstruktion eines Plasmids mit glnA und einem Replikationsursprung coryneformer Bakterien
  • Weiterhin wurde zur Konstruktion eines Plasmids mit dem glnA-Gen und einem Replikationsursprung coryneformer Bakterien das Plasmid pHK4 (siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 5-7491), enthaltend den Replikationsursprung des Plasmids pHM1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)), das bereits erhalten worden war und in coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist, mit dem Restriktionsenzym BamHI und KpnI zum Erhalt eines Genfragments verdaut, enthaltend den Replikationsursprung. Das erhaltene Fragment wurde unter Verwendung des DNA-Blunt-Ending-Kits (Takara Shuzo) mit glatten Enden versehen und in die KpnI-Stelle von pMW219GS unter Verwendung des KpnI-Linkers (Takara Shuzo) inseriert. Dieses Plasmid wurde als pGS bezeichnet.
  • (3) Einführung von pGS in coryneforme Bakterien und Bewertung der Kultur
  • Ein L-Glutamin-erzeugendes Bakterium, Brevibacterium flavum AJ12418 (FERM BP-2205: siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 2-186994) wurde mit dem Plasmid pGS durch das elektrische Pulsverfahren transformiert (siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 2-207791), um einen Transformanten zu erhalten. Unter Verwendung des erhaltenen Transformanten AJ12418/pGS wurde eine Kultur für eine L-Glutaminproduktion wie folgt durchgeführt.
  • Zellen des durch Kultur auf einem CM2B-Plattenmedium, enthaltend 25 μg/ml Kanamycin erhaltenen AJ12418/pGS-Stammes wurden in ein Medium inokuliert, enthaltend 100 g Glucose, 60 g (NH4)2SO4, 2,5 g KH2PO4, 0,4 g MgSO4·7H2O, 0,01 g FeSO4·7H2O, 350 μg VB1-HCl, 4 μg Biotin, 200 mg Sojahydrolysate und 50 g CaCO3 in 1 1 reines Wasser (mit NaOH auf einen pH von 6,8 eingestellt) und bei 31,5°C unter Schütteln kultiviert, bis der Zucker im Medium verbraucht war.
  • Nach Vervollständigung der Kultur wurde die Menge des angehäuften L-Glutamins in der Kulturbrühe durch Flüssigchromatographie für eine geeignet verdünnte Kulturbrühe bestimmt. CAPCELL PAK C18 (Shiseido) wurde als Säule verwendet und die Probe wurde mit einem Eluent eluiert, enthaltend 0,095 % Phosphorsäure, 3,3 mM Heptansulfonsäure und 5 % Acetonitril in 1 1 destilliertem Wasser. Die angehäufte L-Glutaminmenge wurde, basierend auf der Variation der Absorption bei 210 nm analysiert. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle 1 dargestellt.
  • TABELLE 1
    Figure 00360001
  • Bei dem Stamm, in den pGS eingeführt wurde, war die Anhäufung von L-Glutamin (L-Gln) deutlich verbessert und die Nebenproduktion von L-Glutaminsäure (L-Glu) war deutlich unterdrückt. Durch diese Ergebnisse wurde demonstriert, dass die Erhöhung von GS für eine Verbesserung des Ertrags bei der Produktion von L-Glutamin wirksam war. Die Daten für die enzymatische Aktivität von GS sind in Tabelle 2 von Beispiel 2 dargestellt.
  • BEISPIEL 2 (VERGLEICHSBEISPIEL): BEWERTUNG EINES GS-ADENYLYLIERUNGS-ORTSMODIFIZIERTEN STAMMS
  • (1) Konstruktion eines Adenylylierungs-ortsmodifizierten Plasmids
  • Die Adenylierungsstelle von dem glnA-Gen-Produkts von coryneformen Bakterien wurde bereits aufgeklärt (FEMS Microbiology Letters, 303-310, (173) 1999). Daher wurde ein Adenylylierungs-ortsmodifizierter Stamm durch Ersatz des glnA-Gens auf dem Chromosom durch ein glnA-Gen, dessen Adenylylierungsstelle modifiziert worden war, erhalten. Die spezifischen Verfahren werden unten beschrieben.
  • Zunächst wurde eine PCR unter Verwendung der chromosomalen DNA von Brevibacterium flavum ATCC 14067 als Matrize und den synthetischen DNAs, die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 6 und 7 dargestellt sind, als Primer durchgeführt, um ein Amplifikationsprodukt für die N-terminale Seite des glnA-Gens zu erhalten. Davon getrennt wurde eine PCR unter Verwendung der chromosomalen DNA von Brevibacterium flavum ATCC 14067 als Matrize und den synthetischen DNAs, die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 8 und 9 dargestellt sind als Primer durchgeführt, um ein Amplifikationsprodukt für die C-terminale Seite des glnA-Gens zu erhalten. Da Fehlpaarungen in die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 7 und 8 dargestellten Sequenzen eingeführt worden waren, wurde eine Mutation in den terminalen Bereich von jedem der Amplifikationsprodukte eingeführt. Dann wurde eine PCR unter Verwendung der vorstehenden Genprodukte für die N- und C-terminalen Seiten von glnA, vermischt in äquimolaren Mengen als Matrize und den synthetischen DNAs, die in Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 10 und 11 dargestellt sind, als Primer durchgeführt, um ein glnA-Genfragment zu erhalten, in das eine Mutation eingeführt wurde, wobei ein glnA-Genamplifikationsprodukt erhalten wurde, in das eine Mutation an der Adenylylierungsstelle eingeführt wurde. Das erzeugte PCR-Produkt wurde auf konventionelle Weise gereinigt, mit HincII verdaut und in die HincII-Stelle von pHSG299 (Takara Shuzo) inseriert. Dieses Plasmid wurde als pGSA bezeichnet.
  • (2) Konstruktion eines Adenylylierungsstellen-modifizierten Stamms und Bewertung der Kultur
  • Da das obige pGSA keine Region enthält, die es ihm ermöglicht sich autonom in Zellen von coryneformen Bakterien zu replizieren, wenn eine coryneformes Bakterium mit diesem Plasmid transformiert wird, wird ein Stamm, worin das Plasmid homologe Rekombination in das Chromosom durch eingebaut ist, als Transformant erhalten, obwohl dies mit extrem niedriger Frequenz auftritt.
  • Das L-Glutamin-erzeugende Bakterium, Brevibacterium flavum AJ12418, wurde mit dem Plasmid pGSA mit hoher Konzentration durch das elektrische Pulsverfahren (siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 2-207791) transformiert und die Transformanten wurden unter Verwendung der Kanamycinresistenz als Marker erhalten. Dann wurden diese Transformanten subkultiviert und Stämme, die Kanamycin-empfindlich geworden waren, wurden erhalten. Weiterhin wurden die Sequenzen des glnA-Gens der Kanamycin-empfindlichen Stämme bestimmt und ein Stamm, worin die Adenylylierungsstelle in der Sequenz durch die Region von glnA, abgeleitet von pGSA ersetzt worden war, wurde als QA-1 bezeichnet. Die Kultivierung für die L-Glutaminproduktion wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 (3) beschrieben durchgeführt unter Verwendung der RJ12418-, AG12418/pGS- und QA-1-Stämme. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
  • TABELLE 2
    Figure 00390001
  • Für den QA-1-Stamm wurde eine Verbesserung der L-Glutaminanhäufung im Vergleich mit AJ12418 beobachtet.
  • Die Ergebnisse für die Messung der GS-Aktivität dieser Stämme sind ebenfalls in Tabelle 2 dargestellt. Die GS-Aktivität wurde durch Zugabe einer Rohenzymlösung zu einer Lösung, enthaltend 100 mM Imidazol-HCl (pH 7,0), 0,1 mM NH4Cl, 1 mM MnCl2, 1 mM Phosphoenolbrenztraubensäure, 0,3 mM NADH, 10 U Lactatdehydrogenase, 25 U Pyruvatkinase, 1 mM ATP und 10 mM MSG gemessen und Messung der Variation der Absorption bei 340 nm bei 30°C unter Bezugnahme auf im Journal of Fermentation and Bioengineering, Bd. 70, Nr. 3, 182-184, 1990 beschriebene Verfahren. Für die Messung der Leerprobe wurde die vorstehende Reaktionslösung, ohne MSG, verwendet. Die Rohenzymlösung wurde hergestellt, indem Zellen von der vorher erwähnten Kulturbrühe durch Zentrifugation abgetrennt wurden, Waschen der Zellen mit 100 mM Imidazol-HCl (pH 7,0), Beschallen der Zellen und Entfernung nicht aufgebrochener Zellen und unlöslichen Proteins durch Zentrifugation. Die Proteinkonzentration der Rohenzymlösung wurde mit dem Proteinassay (Bio-Rad) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standardprobe quantifiziert.
  • BEISPIEL 3 (VERGLEICHSBEISPIEL): BEWERTUNG EINES GDH-GEN-AMPLIFIZIERTEN STAMMES
  • (1) Konstruktion des gdh-amplifizierten Stammes und Bewertung der Kultur
  • Die Konstruktion eines Plasmids pGDH, in das das gdh-Gen coryneformer Bakterien kloniert war, wurde wie folgt durchgeführt. Zunächst wurde die chromosomale DNA von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 extrahiert und eine PCR wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA als Matrize und der synthetischen DNAs, die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 12 und 13 dargestellt sind, als Primer durchgeführt. Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit glatten Enden versehen und in die SmaI-Stelle von pHSG399 (Takara Shuzo) inseriert. Dieses Plasmid wurde als pHSG399GDH bezeichnet.
  • Dann. wurde ein Replikationsursprung, abstammend von dem Plasmid pHM1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)), der sich autonom in coryneformen Bakterien replizieren konnte, in die SalI-Stelle von pHSG399GDH eingeführt. Spezifisch wurde das vorher erwähnte pHK4 mit dem Restriktionsenzym BamHI und KpnI verdaut, um ein Genfragment zu erhalten, das den Replikationsursprung enthielt und das erhaltene Fragment wurde mit glatten Enden versehen und in die SalI-Stelle von pHSG399GDH unter Verwendung eines SalI-Linkers (Takara Shuzo) inseriert. Dieses Plasmid wurde als pGDH bezeichnet.
  • Das L-Glutamin-erzeugende Bakterium Brevibacterium flavum AJ12418, wurde mit pGDH zum Erhalt eines Transformanten transformiert. Die Kultivierung zur L-Glutaminproduktion wurde durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren durchgeführt, wobei der erhaltene Transformant AJ12418/pGDH verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Bei dem GDH-verstärkten Stamm nahm der Ertrag an L-Glutamin ab und der Nebenerzeugung von L-Glutaminsäure stieg an, jedoch war die Kultivierungszeit deutlich verkürzt.
  • TABELLE 3
    Figure 00410001
  • BEISPIEL 4: KONSTRUKTION UND BEWERTUNG EINES STAMMS, WORIN GS UND GDH SIMULTAN ERHÖHT SIND
  • (1) (VERGLEICHSBEISPIEL) Konstruktion eines gdh-Promotor-modifizierten Plasmids
  • Chromosomale DNA vom Brevibacterium flavum ATCC 14067 wurde extrahiert und eine PCR wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA als Matrize und der synthetischen DNAs, die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 14 und 15 dargestellt sind, als Primer durchgeführt. Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen StuI und PvuII verdaut und in die SmaI-Stelle von pHSG399 inseriert. Dieses Plasmid wurde mit einem Restriktionsenzym SacI verdaut um ein DNA-Fragment zu erhalten, enthaltend den gdh-Promotor und ein Teilfragment des gdh-Gens und wurde in die SacI-Stelle von pKF19k (Takara Shuzo) inseriert. Dieses Plasmid wurde als pKF19GDH bezeichnet.
  • Eine Mutation wurde in den Promotorbereich unter Verwendung des Mutan-Super-Express-Km (Takara Shuzo) eingeführt. Eine LA-PCR wurde unter Verwendung von pKF19GDH als Matrize, einem Selektionsprimer, angehaftet ans Mutan-Super-Express-Km und einer 5'-Ende phosphorylierten synthetischen DNA, dargestellt im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 16 oder 17, als Primer für die Mutagenese durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde durch Ethanolausfällung gereinigt und kompetente Zellen von Escherichia coli MV1184 (Takara Shuzo) wurden mit dem Produkt zum Erhalt von Transformanten transformiert.
  • Plasmide wurden aus den Transformanten extrahiert und die Sequenzen des gdh-Promotorbereichs wurden bestimmt. Unter diesen wurden diejenigen mit denen in Tabelle 4 dargestellten Sequenzen als pKF19GDH1 und pKF19GDH4 bezeichnet. Es wird erwartet, dass die GDH-Aktivität um ungefähr das 3-fache durch Ersatz der gdh-Promotorsequenz durch diejenige vom pKF19GDH1-Typ verbessert werden kann oder um das ungefähr 5-fache durch Ersatz der gdh-Promotorsequenz durch die vom pKF19GDH4-Typ im Vergleich mit gdh mit einem Promotor vom Wildtyp (siehe internationale Patentveröffentlichung WO 00/18935).
  • Diese Plasmide wurden mit einem Restiktionsenzym SacI verdaut um ein DNA-Fragment, enthaltend den gdh-Promotor und ein Teilfragment des gdh-Gens, zu erhalten und dies wurde in die SacI-Stelle von pSFKT2 (siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 2000-262288) inseriert. Diese Plasmide wurden als pSFKTGDH1 bzw. pSFKTGDH4 bezeichnet. pSFKT2 war ein Derivat des Plasmids pAM330, abgeleitet von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 und ist ein Plasmid, bei dem die autonome Replikation in coryneformen Bakterien temperaturempfindlich geworden ist.
  • TABELLE 4
    Figure 00430001
  • (2) Einführung einer gdh-Promotormutation in das Chromosom
  • Eine Mutation wurde in die gdh-Promotorsequenz auf dem Chromosom wie folgt eingeführt. Zunächst wurde der QA-1-Stamm mit dem Plasmid pSFKTGDH1 bzw. pSFKTGDH4 durch das elektrische Pulsverfahren zum Erhalt eines Transformanten transformiert. Nach der Transformation wurde eine Kultur bei 25°C durchgeführt. Dann wurden diese Transformanten bei 34°C kultiviert und Stämme, die eine Kanamycinresistenz bei 34°C zeigten, wurden selektiert. Da die vorher erwähnten Plasmide sich bei 34°C nicht autonom replizieren können, zeigen nur diejenigen, in die diese Plasmide in das Chromosome durch homologe Rekombination integriert waren, eine Kanamycinresistenz. Weiterhin wurden die Stämme, worin diese Plasmide in das Chromosom integriert worden waren, in Abwesenheit von Kanamycin kultiviert und die Stämme, die Kanamycin-empfindlich wurden, wurden selektiert. Unter diesen wurden Stämme, worin dieselbe Mutation wie bei pSFKTGDH1 oder pSFKTGDH4 in dem gdh-Promotorbereich auf dem Chromosom eingeführt worden war, als QB-1 bzw. QB-4 bezeichnet.
  • (3) (Gemäß der Erfindung) Konstruktion gemäß eines gdh-Gen-amplifizierten Stamms und Messung der GDH-Aktivität
  • Das L-Glutamin-erzeugende Bakterium Brevibacterium flavum QA-1, wurde mit dem Plasmid pGDH, wie beschrieben in Beispiel 3 (2), transformiert, um einen Transformanten zu erhalten. Die Kultivierung für die L-Glutamin-Erzeugung wurde durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren unter Verwendung des Transformanten QR-1/pGDH durchgeführt. Die GDH-Aktivität wurde gemessen, indem eine Rohenzymlösung einer Lösung zugefügt wurde, enthaltend 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 20 mM NH4Cl, 10 mM α-Ketoglutarsäure und 0,25 mM NADPH und Messung der Veränderung der Absorption bei 340 nm unter Bezugnahme auf Mol. Microbiology, 317-326 (6) 1992. Die Rohenzymlösung wurde hergestellt, indem Zellen von der vorher erwähnten Kulturbrühe durch Zentrifugation abgetrennt wurden, Waschen der Zellen mit 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), Beschallung der Zellen und Entfernung nicht aufgebrochener Zellen durch Zentrifugation. Die Proteinkonzentration der Rohenzymlösung wurde mit dem Proteinassay (Bio-Rad) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standardprobe quantifiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.
  • Im Hinblick auf den Ertrag an L-Glutamin zeigten die GDH-Promotor-modifizierten Stämme QB-1 und QB-4 einen hohen Ertrag. Weiterhin zeigte der QA-1/pGDH-Stamm auch einen höheren Ertrag als den mit dem AJ12418-Stamm erhaltenen. Die Kultivierungszeit für den QA-1/pGDH-Stamm war die kürzeste. Die Nebenproduktion von L-Glutaminsäure war bei den QB-1- und QB-4-Stämmen deutlich verbessert. Durch diese Ergebnisse konnte demonstriert werden, dass die simultane Verstärkung von GS und GDH für eine Verbesserung des Ertrags an L-Glutamin und eine Verkürzung der Kultivierungszeit effektiv war.
  • TABELLE 5
    Figure 00450001
  • BEISPIEL 5: ERWERB EINES GENS, KODIEREND DAS ISOZYM VON GS
  • In dem Artikel, der über einen Erwerb von glnA von Corynebakterium glutamicum berichtete (FEMS Microbiol. Letter, 154 (1997) 81-88) wird beschrieben, dass ein ΔglA-unterbrochener Stamm eine Glutaminauxotrophie zeigte und eine GS-Aktivität verlor und es wird auch über Daten berichtet, die Ergebnisse eines Southern-Blots darlegen und eine Existenz eines Isozyms nahe legen. Weiterhin wird in "Amino Acid Fermentation", Japan Science Societies Publication (Gakkai Shuppan Center), S. 232-235 beschrieben, dass es zwei Arten von GS für Corynebacterium glutamicum gibt. Daher wurde es versucht ein Gen zu erhalten, das das zweite GS-Isozym kodierte.
  • (1) HERSTELLUNG EINER SONDE
  • Ein Gen, kodierend ein Isozym von GS (glnA2) wurde durch Koloniehybridisierung erhalten. Zunächst wurde eine PCR unter Verwendung der Primer, die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 18 und 19 dargestellt sind, und chromosomaler DNA von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 als Matrize durchgeführt, um ein Teilfragment des glnA-Gens zu erhalten. Dieses DNA-Fragment wurde unter Verwendung des DIG-High Primer DNA Labeling & Detection Starter Kit I (Boehringer Mannheim) markiert und als Sonde verwendet.
  • (2) KOLONIEHYBRIDISIERUNG
  • Chromosomale DNA des Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869-Stamms wurde extrahiert und teilweise mit dem Restriktionsenzym Sau3AI verdaut und das erhaltene DNA-Fragment wurde in die BamHI-Stelle des Vektors pHSG299 inseriert und verwendet, um den Escherichia coli JM109-Stamm zu transformieren. Der erhaltene Transformant wurde auf Hybond-N+ (Amersham Pharmacia Biotech) transferiert, denaturiert, neutralisiert und mit der in Beispiel 5 (1) hergestellten Sonde hybridisiert, wobei das DIG-High Prime DNA Labeling & Detection Starter Kit I verwendet wurde. Zu diesem Zeitpunkt wurden ein Transformant, der stark und ein Transformant der schwach hybridisierte erkannt. Plasmid-DNAs wurden aus diesen Transformanten hergestellt und die Nucleotidsequenzen der Inserts wurden bestimmt. Im Ergebnis konnten Klone, enthaltend ein Gen, das eine hohe Homologie im Hinblick auf eine bekannte Glutaminsynthetase von coryneformen Bakterien zeigte, erhalten werden. Die gesamte Nucleotidsequenz des Inserts des letzteren ist in Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 1 dargestellt.
  • Die offenen Leserahmen wurden abgeleitet und Aminosäuresequenzen, die von Nucleotidsequenzen abgeleitet wurden, werden im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 2 und 3 dargestellt. Jede dieser Aminosäuresequenzen wurde mit bekannten Sequenzen im Hinblick auf eine Homologie verglichen. Die verwendete Datenbank war Genbank. Im Ergebnis wurde deutlich, dass die durch beide offenen Leserahmen kodierten Aminosäuresequenzen neue Proteine coryneformer Bakterien waren.
  • Die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen wurden unter Verwendung des Genetyx-Mac-Computerprogramms (Software Development, Tokyo) analysiert. Die Homologieanalyse wurde gemäß dem Verfahren von Lipman and Pearson (Science, 227, 1435-1441, 1985) durchgeführt.
  • Die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz zeigte 34,6 %, 65,6 % und 60 % Homologie im Hinblick auf die bereits für GS dargestellte von Corynebacterium glutamicum (FEMS Microbiology Letters, 81-88, (154) 1997), die der GS von Mycobacterium tuberculosis (GenBank-Hinterlegung Z70692) bzw. die für GS von Streptomyces coelicolor (GenBank-Hinterlegung AL136500) (Tabelle 6) und sie erwies sich als ein Isozym der GS coryneformer Bakterien.
  • Andererseits zeigte die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 3 dargestellte Sequenz eine 51,9%ige bzw. 33,4%ige Homologie im Hinblick auf die bereits für ATase von Mycobacterium tuberculosis dargestellte (Genbank-Hinterlegung Z70692) bzw. die der ATase von Streptomyces coelicolor (GenBank-Hinterlegung Y17736) (Tabelle 7) und erwies sich als ATase coryneformer Bakterien. Daher wurde festgestellt, dass in der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nucleotidsequenz der offene Leserahmen, kodierend die Aminosäuresequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 2, glnA2 war und der offene Leserahmen, der die in SEQ ID NO: 3 dargestellte Aminosäuresequenz kodiert, glnE war.
  • TABELLE 6
    Figure 00470001
  • TABELLE 7
    Figure 00480001
  • BEISPIEL 6 (VERGLEICHSBEISPIEL): PRODUKTION VON L-GLUTAMIN DURCH ATase-DEFIZIENTEN STAMM
  • Da das Gen glnE, kodierend die ATase in dem vorher erwähnten Beispiel 5 aufgeklärt wurde, wurde ein glnE-defizienter Stamm aus dem L-Glutamin-erzeugenden Bakterium AJ12418 konstruiert. Das spezifische Verfahren wird unten dargestellt.
  • Zunächst wurde eine PCR unter Verwendung chromosomaler DNA von Brevibacterium flavum ATCC 14067 als Matrize und den synthetischen DNAs gemäß SEQ ID NO: 23 und 24 als Primer durchgeführt, um ein Teilfragment des glnE-Gens zu erhalten. Das erzeugte PCR-Produkt wurde auf konventionelle Weise gereinigt, dann mit glatten Enden versehen und in die HincII-Stelle von pHSG299 (Takara Shuzo) inseriert. Dieses Plasmid wurde als pGLNE bezeichnet. Dann wurde, um eine Teilregion des glnE-Gens in diesem Plasmid zu deletieren, pGLNE mit HincII verdaut und selbst ligiert und das erhaltene Plasmid wurde als pΔGLNE bezeichnet. Dieses Plasmid enthält die Nucleotide 2341 bis 4560 der Nucleotidsequenz, die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, weist jedoch eine Deletion von ungefähr 300 bp von der 3343 HincII-Erkennungsstelle bis zur 3659 HincII-Erkennungsstelle auf.
  • Da das obige pΔGLNE keine Region enthält, die eine autonome Replikation in Zellen coryneformer Bakterien ermöglichen würde, wenn ein coryneformes Bakterium mit dem Plasmid transformiert wird, kann ein Stamm, worin das Plasmid in das Chromosom durch homologe Rekombination integriert ist, als Transformant erzeugt werden, obwohl dies mit extrem niedriger Frequenz auftritt.
  • Das L-Glutamin-erzeugende Bakterium Brevibacterium flavum AJ12418, wurde mit dem Plasmid pΔGLNE mit hoher Konzentration durch das elektrische Pulsverfahren transformiert und Transformanten wurden unter Verwendung der Kanamycinresistenz als Marker erhalten. Dann wurden diese Transformanten subkultiviert, um Stämme zu erhalten, die Kanamycin-empfindlich wurden. Weiterhin wurden chromosomale DNAs der erhaltenen Kanamycin-empfindlichen Stämme extrahiert und eine PCR wurde unter Verwendung jeder chromosomalen DNA als Matrize und der synthetischen DNAs, dargestellt im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 23 und 24, als Primer durchgeführt, um Teilfragmente des glnE-Gens zu erhalten. Ein Stamm, dessen PCR-Produkt nicht das ungefähr 300 bp-Fragment bereitstellte, wenn mit HincII verdaut wurde, wurde als glnE-unterbrochener Stamm bestimmt. Dieser Stamm wurde als QA-T bezeichnet. Die Kultivierung für die L-Glutaminproduktion wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 (3) beschrieben durchgeführt, wobei die AJ12418- und QA-T-Stämme verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt.
  • Der QA-T-Stamm zeigte eine Verbesserung der L-Glutaminanhäufung im Vergleich zu dem AJ12418-Stamm. Die Ergebnisse der Messung der GS-Aktivität dieser Stämme sind ebenfalls in Tabelle 8 dargestellt. Es wurde bestätigt, dass die GS-Aktivität in dem QA-T-Stamm im Vergleich mit dem AJ12418-Stamm verbessert war.
  • TABELLE 8
    Figure 00500001
  • (ERKLÄRUNG DES SEQUENZPROTOKOLLS)
    • SEQ ID NO: 1: glnA2- und glnE-Nucleotidsequenzen
    • SEQ ID NO: 2: glnA2-Aminosäuresequenz
    • SEQ ID NO: 3: glnE-Aminosäuresequenz
    • SEQ ID NO: 4: Primer N für glnA-Amplifikation
    • SEQ ID NO: 5: Primer C für glnA-Amplifikation
    • SEQ ID NO: 6: glnA erster PCR-Primer NN
    • SEQ ID NO: 7: glnA erster PCR-Primer NC
    • SEQ ID NO: 8: glnA erster PCR-Primer CN
    • SEQ ID NO: 9: glnA erster PCR-Primer CC
    • SEQ ID NO: 10: glnA zweiter PCR-Primer N
    • SEQ ID NO: 11: glnA zweiter PCR-Primer C
    • SEQ ID NO: 12: Primer N für gdh-Amplifikation
    • SEQ ID NO: 13: Primer C für gdh-Amplifikation
    • SEQ ID NO: 14: Primer N2 für gdh-Amplifikation
    • SEQ ID NO: 15: Primer C2 für gdh-Amplifikation
    • SEQ ID NO: 16: Primer M1 für gdh-Promotormutation
    • SEQ ID NO: 17: Primer M4 für gdh-Promotormutation
    • SEQ ID NO: 18: Primer N für glnA-Sondenherstellung
    • SEQ ID NO: 19: Primer C für glnA-Sondenherstellung
    • SEQ ID NO: 20: Wildtyp-gdh-Promotorsequenz
    • SEQ ID NO: 21: Mutierte gdh-Promotorsequenz
    • SEQ ID NO: 22: Mutierte gdh-Promotorsequenz
    • SEQ ID NO: 23: Primer N für glnE-Unterbrechung
    • SEQ ID NO: 24: Primer C für glnE-Unterbrechung
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Figure 00620001
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001
  • Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001
  • Figure 00690001
  • Figure 00700001
  • Figure 00710001

Claims (2)

  1. Coryneformes Bakterium, das eine L-Glutamin erzeugende Fähigkeit aufweist und modifiziert wurde, so dass die intrazelluläre Glutaminsynthetaseaktivität und die Glutamatdehydrogenaseaktivität simultan erhöht sind, wobei die Glutamatdehydrogenaseaktivität durch Erhöhung der Kopiezahl eines Gens, codierend für Glutamatdehydrogenase, erhöht ist, und die Glutaminsynthetaseaktivität durch eine Defizienz in der Aktivitätskontrolle der intrazellulären Glutaminsynthetase durch Adenylylierung erhöht ist, wobei die Aktivitätskontrolle der intrazellulären Glutaminsynthetase durch Adenylylierung durch ein oder mehrere der folgenden defizient ist, nämlich dass eine Glutaminsynthetase beherbergt wird, deren Aktivitätskontrolle durch Adenylylierung beeinträchtigt ist, Abnahme der Glutminsynthetase-Adenylyltransferaseaktivitäten in der bakteriellen Zelle und Abnahme der PII-Proteinaktivität in der bakteriellen Zelle, so dass die Produktionsrate von L-Glutamin im Medium verbessert wird.
  2. Verfahren zur Erzeugung von L-Glutamin, das das Kultivieren eines Bakteriums gemäss Anspruch 1 in einem Medium umfasst, um L-Glutamin im Medium zu erzeugen und anzuhäufen, und Sammeln des L-Glutamins.
DE60208450T 2001-02-05 2002-02-05 Verfahren zur Herstellung von L-Glutamin mittels Fermentation und ein L-Glutamin produzierendes Bakterium Expired - Lifetime DE60208450T2 (de)

Applications Claiming Priority (4)

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