KR20000029006A - Ｌ-호모세린에 대한 내성을 세균 에스케리키아 콜라이에제공하는 단백질을 암호화하는 ｄｎａ, 및 ｌ-아미노산을제조하는 방법 - Google Patents

Ｌ-호모세린에 대한 내성을 세균 에스케리키아 콜라이에제공하는 단백질을 암호화하는 ｄｎａ, 및 ｌ-아미노산을제조하는 방법 Download PDF

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에가시라 구니오
아지노모토 가부시키가이샤
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Abstract

아미노산을 생산하는 능력을 가지며, 단백질 L-호모세린-내성을 갖는 세균을 제조하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 신규한 유전자(rhtB)가 증강된 세균을 배양 배지에서 배양하여 배지내에 아미노산을 생성시키고 축적시키고, 상기 아미노산을 배지로부터 회수한다.

Description

Ｌ-호모세린에 대한 내성을 세균 에스케리키아 콜라이에 제공하는 단백질을 암호화하는 ＤＮＡ, 및 Ｌ-아미노산을 제조하는 방법{DNA coding for protein which confers on bacterium Escherichia coli resistance to L-homoserine, and method for producing L-amino acids}
본 발명은 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 세균을 사용하여 아미노산을 제조하는 방법, 특히 L-호모세린, L-알라닌, L-이소로이신, L-발린 또는 L-트레오닌을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 이. 콜라이 K-12와 관련하여, 고농도의 트레오닌(＞40mg/ml) 또는 호모세린(＞5mg/ml)과 관련된 변이를 갖는 변이체, thrR(본원에서는 rhtA23으로 칭함)을 최소 배지내에서 수득한다[참고 문헌: Astaurova, O. B. et al., Appl. Bioch. and Microbiol., 21, 611-616(1985)]. rhtA23 변이를 기초로 하여, 개선된 트레오닌-생산 균주[참고 문헌: SU 특허 제974817호], 호모세린- 및 글루탐산-생산 균주[참고 문헌: Astaurova et al., Appl. Bioch. and Microbiol., 27, 556-561(1991)]를 수득한다.
또한, 본 발명자들은 rhtA 유전자가 이. 콜라이 염색체 상의 18min에 존재하고 rhtA 유전자가 pexB 및 ompX 유전자 사이의 ORF1과 동일하다는 것을 밝혀내었다. ORF1에 의해 암호화되는 단백질을 발현시키는 단위를 rhtA(rht: resistance to homoserine and threonine(호모세린 및 트레오닌에 대한 내성))로 명명하였다. rhtA 유전자는 SD 서열을 포함한 5'-비암호화 영역, ORF1 및 터미네이터를 포함한다. 또한, 본 발명자들은 야생형 rhtA 유전자를 다복사체 상태에서 클로닝할 경우 이는 트레오닌 및 호모세린에 대한 내성에 관여하고 rhtA 유전자 발현의 증강은 L-라이신, L-발린 또는 L-트레오닌을 생산하는 능력을 갖는 에스케리키아 속에 속하는 세균의 아미노산 생산성을 개선시킨다는 것을 밝혀내었다[참고 문헌: ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457].
본 발명에 이르러, 다복사체 상태에서 호모세린 내성을 제공하는 2개 이상의 상이한 유전자가 rhtA 유전자의 클로닝 동안 이. 콜라이내에 존재한다는 것을 밝혀내었다. 이러한 유전자 중 하나는 rhtA 유전자이나, 이외의 유전자는 밝혀지지 않았다.
본 발명의 목적은 호모세린에 대한 내성에 관련된 신규한 유전자, 및 아미노산, 특히, L-호모세린, L-알라닌, L-이소로이신, L-발린 및 L-트레오닌을 고수율로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 rhtB 유전자의 클로닝, 동정 및 불활성화를 도시한다.
도 2는 RhtB 단백질의 아미노산 서열을 도시한다.
본 발명자들은 이. 콜라이 염색체 상의 86min에서의 영역이 다복사체 벡터에 의해 클로닝시킬 경우 L-호모세린에 대한 내성을 이. 콜라이의 세포에 제공하고, 상기 영역을 증폭시킬 경우, 이. 콜라이의 아미노산 생산성을 rhtA 유전자와 같이 개선시킬 수 있다는 것을 밝혀내었다. 상기 발견을 기초로 하여, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 다음을 제공한다:
(1) 다음 (A) 또는 (B)에서 정의된 바와 같은 단백질을 암호화하는 DNA:
(A) 서열 목록에서 서열 2로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 또는
(B) 서열 목록에서 서열 2로 제시된 아미노산 서열에서 하나 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고 단백질 L-호모세린-내성을 갖는 세균을 생산하는 활성을 갖는 단백질,
(2) 다음 (a) 또는 (b)에서 정의된 바와 같은, (1)에 따른 DNA:
(a) 서열 목록에서 서열 1로 제시된 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오티드 제557번 내지 제1171번에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA; 또는
(b) 엄격한 조건하에 서열 목록에서 서열 1로 제시된 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오티드 제557번 내지 제1171번에 해당하는 뉴클레오티드 서열로 하이브리드화하고 단백질 L-호모세린-내성을 갖는 세균을 제조하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA,
(3) 세균의 L-호모세린 내성이 세균의 세포내에서 (1)의 DNA의 복제수를 증폭시킴으로써 증강되는, 에스케리키아 속에 속하는 세균,
(4) (1)의 DNA가 세균의 세포내의 다복사체 벡터 상에 보유되는 (3)의 세균,
(5) (1)의 DNA가 세균의 세포내의 트랜스포손 상에 보유되는 (3)의 세균,
(6) 아미노산을 생산하는 능력을 갖는 (3) 내지 (5) 중의 하나의 세균을 배양 배지에서 배양하여 아미노산을 배지내에 생성시키고 축적시키는 단계, 및 상기 아미노산을 배지로부터 회수하는 단계를 포함하여, 아미노산을 제조하는 방법, 및
(7) 아미노산이 L-호모세린, L-알라닌, L-이소로이신, L-발린 및 L-트레오닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인 (6)의 방법.
본 발명의 DNA는 "rhtB 유전자"로 칭할 수 있고, rhtB 유전자에 의해 암호화된 단백질은 "rhtB 단백질"로 칭할 수 있고, 세균의 L-호모세린에 대한 내성에 관계하는 RhtB 단백질의 활성(즉, RhtB 단백질 L-호모세린-내성을 갖는 세균을 제조하는 활성)은 "Rh 활성"으로 칭할 수 있고, RhtB 단백질을 rhtB 유전자내에서 암호화하는 구조 유전자는 "rhtB 구조 유전자"로 칭할 수 있다. 용어 " Rh 활성을 증강시킴"은 RhtB 단백질의 분자수를 증가시키거나, RhtB 단백질의 특정 활성을 증가시키거나, RhtB 단백질의 발현 또는 활성 등에 대한 네가티브 조절을 탈감화시킴으로써 호모세린에 대한 내성을 세균에 제공하거나 내성을 증강시킴을 의미한다. 용어 "단백질을 암호화하는 DNA"는 DNA가 이본쇄일 경우 단백질을 암호화하는 쇄 중 하나의 DNA를 의미한다. L-호모세린 내성은 L-호모세린을 세균의 야생형 균주가 증식할 수 없는 농도, 통상적으로 10mg/ml로 함유하는 최소 배지 상에서 세균이 증식하는 특성을 의미한다. 아미노산을 생산하는 능력은 세균이 이의 야생형 균주보다 많은 양의 아미노산을 배지에서 생산하고 축적하는 특성을 의미한다.
본 발명에 따라서, 고농도의 호모세린에 대한 내성을 에스케리키아 속에 속하는 세균에 제공할 수 있다. 에스케리키아 속에 속하는 세균은 증가된 호모세린 내성, 및 아미노산을 생산하고, 상기 아미노산, 특히, L-호모세린, L-알라닌, L-이소로이신, L-발린 또는 L-트레오닌을 고수율로 배지내에 축적하는 능력을 갖는다.
본 발명은 아래에 상세히 설명할 것이다.
＜1＞ 본 발명의 DNA
본 발명의 DNA는 Rh 활성 및 서열 목록에서 서열 2로 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 DNA는 서열 목록에서 서열 1로 제시된 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오티드 제557번 내지 제1171번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA를 예로 들 수 있다.
본 발명의 DNA는 서열 1로 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는, rhtB 유전자의 조절 인자 및 rhtB 유전자의 구조 부위를 포함하는, 세균 에스케리키아 콜라이에 호모세린에 대한 내성을 제공하는 RhtB 단백질을 암호화하는 DNA 단편을 포함한다.
서열 1로 제시된 뉴클레오티드 서열은 GenBank 수탁 번호 M87049의 서열에 대한 서열 보체 부분에 해당한다. 서열 1은 이. 콜라이 염색체 상의 86min에 존재하는, 공지되어 있으나 작용-미지의 ORF(오픈 리딩 프레임)인 f138(GenBank 수탁 번호 M87049의 뉴클레오티드 제61959번 내지 제61543번), 및 이의 5'-플랭킹 및 3'-플랭킹 영역을 포함한다. 5'-플랭킹 영역에 단지 160개의 뉴클레오티드만을 갖는 f138은 호모세린에 대한 내성을 제공하지 않는다. 종결 코돈은 M87049의 제62160번 내지 제61959번(업스트림 ORF f138) 사이에 존재하지 않는다. 따라서, 암호화 영역은 201bp보다 길다. 따라서, RhtB 단백질 및 상기 단백질을 암호화하는 rhtB 유전자는 신규하다.
rhtB 유전자는, 예를 들어, 미니-Mu d5005 파지미드를 사용하는 방법에 따라 K12 또는 W3110과 같은 이. 콜라이의 용원 균주의 용해물을 사용하여 이. 콜라이의 Mucts 용원 균주를 감염시키고[참고 문헌: Groisman, E. A., et al., J. Bacteriol., 168, 357-364(1986)], 플라스미드 DNA를 카나마이신(40㎍/ml) 및 L-호모세린(10mg/ml) 함유 최소 배지 상에서 증식하고 있는 콜로니로부터 분리함으로써 수득할 수 있다. 하기 실시예에서 예시된 바와 같이, rhtB 유전자는 이. 콜라이의 염색체 상의 86min에서 지도화된다. 따라서, rhtB 유전자를 포함하는 DNA 단편은 이. 콜라이의 염색체 상의 86min의 부분에 근접한 영역에 해당하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 콜로니 하이브리드화 또는 PCR(폴리머라제 쇄 반응, 문헌: White, T.J. et al, Trends Genet. 5, 185(1989) 참조)에 의해 이. 콜라이의 염색체로부터 수득할 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 서열 1로 제시된 뉴클레오티드 서열에 따라 고안할 수 있다. 서열 1에서 뉴클레오티드 제557번으로부터의 업스트림 영역 및 뉴클레오티드 제1171번으로부터의 다운스트림 영역에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 PCR용 프라이머로서 사용함으로써, 전체 암호화 영역을 증폭시킬 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 합성은 시판되고 있는 DNA 합성기(예를 들어, Applied Biosystems로부터 제조된 DNA Synthesizer Model 380B)를 사용함으로써 통상적인 방법, 예를 들어, 포스포아미다이트 방법[참고 문헌: Tetrahedron Letters, 22, 1859(1981)]에 의해 수행할 수 있다. 또한, PCR은 Taq DNA 폴리머라제(공급원: Takara Shuzo Co., Ltd.)를 사용하여 시판되고 있는 PCR 장치(예를 들어, Takara Shuzo Co., Ltd.에 의해 제조된 DNA Thermal Cycler Model PJ2000)를 사용함으로써 공급자에 의해 고안된 방법에 따라 수행할 수 있다.
본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA는 하나 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하는 RhtB 단백질을 하나 또는 다수의 위치에서 암호화할 수 있는데, 단, 이와 같이 암호화된 RhtB의 Rh 활성은 저하되지 않는다. 상기한 바와 같은 RhtB 단백질과 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는, 예를 들어, 특정 부위의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하도록 부위-지시된 돌연변이 유발 방법에 의해, 예를 들어, 뉴클레오티드 서열을 변이시킴으로써 수득할 수 있다. 상기한 바와 같이 변이된 DNA는 통상적으로 공지된 변이 처리에 의해 수득할 수 있다. 변이 처리는 RhtB 단백질을 암호화하는 DNA를 시험관내에서, 예를 들어, 하이드록실아민으로 처리하는 방법, 및 미생물, 예를 들어, RhtB 단백질을 암호화하는 DNA를 갖는 에스케리키아 속에 속하는 세균을 자외선 조사 또는 변이 처리에 통상적으로 사용되는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 및 아질산과 같은 변이제로 처리하는 방법을 포함한다.
RhtB 단백질과 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 상기한 바와 같은 시험관 변이 처리에 적용시킨 DNA를 적합한 세포내의 다복사체내에서 발현시키고, 호모세린에 대한 내성을 조사하고 내성을 증가시키는 DNA를 선택함으로써 수득할 수 있다. 또한, 단백질의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 종, 균주, 변이체 또는 변형체간에 경미하게 상이할 수 있어, 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA를 에스케리키아 속에 속하는 L-호모세린-내성 종, 균주, 변이체 및 변형체로부터 수득할 수 있다는 것은 일반적으로 공지되어 있다. 구체적으로, RhtB 단백질과 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는, 예를 들어, 서열 목록에서 서열 1로 제시된 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오티드 제557번 내지 제1171번의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA로 하이브리드화하고 Rh 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 엄격한 조건하에 변이 처리에 적용시킨 에스케리키아 속에 속하는 세균 또는 에스케리키아 속에 속하는 세균의 자연 변이체 또는 변형체로부터 분리함으로써 수득할 수 있다. 본원에서 언급되는 용어 "엄격한 조건"은 소위 특정 하이브리드가 형성되고, 비특이적 하이브리드가 형성되지 않는 조건이다. 수치를 사용하여 상기 조건을 명백하게 표현하는 것은 어렵다. 그러나, 예를 들어, 엄격한 조건은 고도의 상동성을 갖는 DNA, 예를 들어, 각각 70% 이상의 상동성을 갖는 DNA는 하이브리드화하고, 각각 상기한 것보다 낮은 상동성을 갖는 DNA는 하이브리드화하지 않는 조건을 포함한다.
＜2＞ 본 발명의 에스케리키아 속에 속하는 세균
본 발명의 에스케리키아 속에 속하는 세균은 Rh 활성이 증강된 에스케리키아 속에 속하는 세균이다. 에스케리키아 속에 속하는 세균의 예로는 에스케리키아 콜라이가 있다. Rh 활성은, 예를 들어, 세포내에서의 rhtB 구조 유전자의 복제수의 증폭, 또는 RhtB 단백질을 암호화하는 rhtB 구조 유전자를 포함한 DNA 단편이 에스케리키아 속에 속하는 세균내에서 유효하게 작용하는 프로모터 서열과 연결된 재조합 DNA로의 에스케리키아 속에 속하는 세균의 형질전환에 의해 증강시킬 수 있다. Rh 활성은 또한 염색체 상의 rhtB 유전자의 프로모터 서열을 에스케리키아 속에 속하는 세균내에서 유효하게 작용하는 프로모터 서열로 치환시킴으로써 증강시킬 수 있다.
세포내의 rhtB 구조 유전자의 복제수의 증폭은 rhtB 구조 유전자를 보유하는 다복사체 벡터의 에스케리키아 속에 속하는 세균의 세포내로의 도입에 의해 수행할 수 있다. 구체적으로, 복제수는 rhtB 구조 유전자를 보유하는 플라스미드, 파지 또는 트랜스포손[참고 문헌: Berg, D.E. 및 Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417(1983)]의 에스케리키아에 속하는 세균의 세포내로의 도입에 의해 증가시킬 수 있다.
다복사체 벡터의 예로는 플라스미드 벡터, 예를 들어, pBR322, pMW118, pUC19 등, 및 파지 벡터, 예를 들어, λ1059, λBF101, M13mp9 등이 있다. 트랜스포손의 예로는 Mu, Tn10, Tn5 등이 있다.
DNA의 에스케리키아 속에 속하는 세균내로의 도입은, 예를 들어, 문헌[참조: D. M. Morrison, Methods in Enzymology 68, 326(1979)] 또는 수용주 세균 세포를 염화칼슘으로 처리하여 DNA의 투과율을 증가시키는 방법[참고 문헌: Mandel, M. 및 Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159(1970)] 등에 의해 수행할 수 있다.
Rh 활성을 상기한 바와 같은 에스케리키아 속에 아미노산-생산 세균내에서 증가시킬 경우, 생산된 아미노산의 양을 증가시킬 수 있다. Rh 활성을 증가시킬 에스케리키아 속에 속하는 세균으로서는, 목적하는 아미노산을 생산하는 능력을 갖는 균주를 사용한다. 또한, 아미노산을 제공하는 능력은 Rh 활성을 증가시킨 세균에 제공할 수 있다. 에스케리키아 속에 속하는 아미노산-생산 세균의 예는 다음과 같다.
(1) L-트레오닌-생산 세균
에스케리키아 속에 속하는 L-트레오닌-생산 세균의 예로는 균주 MG442[참고 문헌: Guayatiner et al., Genetika(러시아어), 14, 947-956(1978)]를 들 수 있다.
(2) L-호모세린-생산 세균
에스케리키아 속에 속하는 L-호모세린-생산 세균의 예로는 균주 NZ10(thrB)을 들 수 있다. 상기 균주는 기지의 균주 C600(thrB, leuB)[참고 문헌: Appleyard R.K., Genetics, 39m 440-452(1954)]으로부터 Leu+복귀변이체로서 유래한다.
rhtB DNA 단편을 기초로 하여, 신규한 아미노산-생산 균주 이. 콜라이 NZ10/pAL4,pRhtB; 이. 콜라이 MG442/pVIC40,pRhtB; 및 이. 콜라이 MG442/pRhtB를 수득하여 이를 발효에 의한 아미노산 생산에 사용한다.
신규한 균주는 러시안 내셔날 콜렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오가니즘스(Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM))에 1998년 10월 6일자로 기탁되었다(부다페스트 조약을 기초로 한 국제적 기탁에 따라). 균주 이. 콜라이 NZ10/pAL4,pRhtB는 수탁 번호 VKPM B-7658로 기탁되었고; 균주 이. 콜라이 MG442/pRhtB는 수탁 번호 VKPM B-7659로 기탁되었고; 균주 이. 콜라이 MG442/pVIC40,pRhtB는 수탁 번호 VKPM B-7660으로 기탁되었다.
균주 이. 콜라이 NZ10/pAL4,pRhtB(VKPM B-7658)는 다음 배양-형태학 및 생화학 특성을 나타낸다.
세포형태학. 둥근 말단을 갖는 그램-네가티브 약한 운동성 로드형. 길이 사이즈, 1.5 내지 2㎛.
배양 특성:
쇠고기 추출물 아가. 37℃에서의 24시간 성장 후, 평활한 표면, 정가장자리 또는 약간 웨이브진 가장자리, 약간 솟아오른 중앙, 균질한 구조, 페이스트형 밀도, 용이한 유화성을 특징으로 하는, 직경이 1.5 내지 3mm인 원형의 희끄무레한 반투명 콜로니가 생성된다.
루리아 아가. 37℃에서의 24시간 성장 후, 평활한 표면, 균질한 구조, 페이스트형 밀도, 용이한 유화성을 갖는, 직경이 1.5 내지 2.5mm인 희끄무레한 반투명 콜로니가 발현된다.
최소 아가-도핑된 배지 M9. 37℃에서의 40 내지 48시간 성장 후, 회백색을 띄는 반투명한 약간 볼록한 광택성 표면을 갖는, 직경이 0.5 내지 1.5mm인 콜로니가 형성된다.
쇠고기 추출물 브로쓰내에서의 성장. 37℃에서의 24시간 성장 후, 강력하게 균일한 탁함이 나타나고 특유의 냄새가 난다.
생리학 및 생화학적 특성:
쇠고기 추출물 아가내로 찔러 접종시킬 경우 성장한다.
접종된 부위를 통해 우수한 성장이 나타난다.
미생물은 조건적인 혐기 미생물임이 입증된다.
이는 젤라틴을 용해시키지 않는다.
우유 응고를 수반하는 우유 상에서의 우수한 성장을 특색으로 한다.
인돌을 생성시키지 않는다.
온도 조건. 쇠고기-추출물 브로쓰 상에서 20 내지 42℃에서 성장하며, 최적 온도는 33 내지 37℃내에 있다.
배양 배지의 pH치. 6 내지 8의 pH치를 갖는 액체 배지 상에서 성장하며, 최적치는 7.2이다.
탄소원. 글루코스, 프럭토스, 락토스, 만노스, 갈락토스, 크실로스, 글리세롤 및 만니톨 상에서 우수한 성장을 나타내어 산 및 기체를 생성시킨다.
질소원. 암모늄, 질산 염 형태로, 및 특정 유기 화합물로부터의 질소를 동화시킨다.
암피실린, 카나마이신 및 L-호모세린에 대한 내성.
L-트레오닌을 성장 인자로서 사용한다.
플라스미드의 함량. 세포는 암피실린에 대한 내성을 확실하게 하고, 증가된 호모세린 생합성을 유발하는 아스파르테이트 키나제-호모세린 데하이드로게나제 I을 암호화하는 트레오닌 오페론의 유전자 thrA를 보유하는 다복사체 하이브리드 플라스미드 pAL4를 함유한다. 또한, 세포는 카나마이신에 대한 내성을 확실하게 하고 호모세린(10ml/ℓ)에 대한 내성을 제공하는 rhtB 유전자를 보유하는 다복사체 하이브리드 플라스미드 pRhtB를 함유한다.
균주 이. 콜라이 MG442/pRhtB(VKPM B-7659)는 L-이소로이신을 L-트레오닌 대신에 성장 인자로서 사용하는 것을 제외하고는 균주 NZ10/pAL4,pRhtB와 동일한 배양-형태학 및 생화학 특성을 갖는다. 그러나, 균주는 이소로이신의 부재하에 서서히 성장할 수 있다. 또한, 균주의 세포는 카나마이신에 대한 내성을 확실하게 하고 호모세린(10ml/ℓ)에 대한 내성을 제공하는 rhtB 유전자를 보유하는 단지 하나의 다복사체 하이브리드 플라스미드 pRhtB를 함유한다.
균주 이. 콜라이 MG442/pVIC40,pRhtB(VKPM B-7660)는 L-이소로이신을 L-트레오닌 대신에 성장 인자로서 사용하는 것을 제외하고는 균주 NZ10/pAL4,pRhtB와 동일한 배양-형태학 및 생화학 특성을 갖는다. 그러나, 균주는 이소로이신의 부재하에 서서히 성장할 수 있다. 균주의 세포는 스트렙토마이신에 대한 내성을 확실하게 하고 트레오닌 오페론의 유전자를 보유하는 다복사체 하이브리드 플라스미드 pVIC40을 함유한다. 또한, 균주의 세포는 카나마이신에 대한 내성을 확실하게 하고 호모세린(10ml/ℓ)에 대한 내성을 제공하는 rhtB 유전자를 보유하는 다복사체 하이브리드 플라스미드 pRhtB를 함유한다.
＜3＞ 아미노산을 제조하는 방법
상기한 바와 같이 rhtB 유전자의 복제수를 증폭시킴으로써 Rh 활성이 증강되고, 아미노산을 생산하는 능력을 갖는 세균을 배양 배지내에서 배양하고, 아미노산을 배지내에 생성시키고 축적시키고, 상기 아미노산을 배지로부터 회수함으로써 아미노산을 효율적으로 제조할 수 있다. 아미노산의 예로는 바람직하게는 L-호모세린, L-알라닌, L-이소로이신, L-발린 및 L-트레오닌이 있다.
본 발명의 방법에서, 에스케리키아 속에 속하는 세균의 배양, 아미노산의 액체 배지로부터의 수집 및 정제는 세균을 사용한 발효에 의해 아미노산을 제조하는 통상적인 방법과 유사한 방식으로 수행할 수 있다. 배양에 사용된 배지는, 배지가 탄소원 및 질소원 및 미네랄 및, 필요한 경우, 사용된 세균이 성장하는데 필요한 영양원을 적합한 양으로 포함하는 한, 합성 배지 또는 천연 배지일 수 있다. 탄소원은 각종 탄수화물, 예를 들어, 글루코스 및 수크로스, 및 각종 유기산을 포함할 수 있다. 사용된 세균의 동화 능력에 따라, 에탄올 및 글리세롤을 포함한 알콜을 사용할 수 있다. 질소원으로서는, 암모니아, 각종 암모늄 염, 예를 들어, 황산암모늄, 이외의 질소 화합물, 예를 들어, 아민, 천연 질소원, 예를 들어, 펩톤, 대두 수화물 및 분해된 발효성 미생물을 사용한다. 미네랄로서는, 인산일칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘을 사용한다.
배양은 바람직하게는 호기성 조건하의 배양, 예를 들어, 진탕 배양, 및 호기 및 교반 배양이다. 배양 온도는 통상적으로 20 내지 40℃, 바람직하게는 30 내지 38℃이다. 배양의 pH는 통상적으로 5 내지 9, 바람직하게는 6.5 내지 7.2이다. 배양의 pH는 암모니아, 탄산칼슘, 각종 산, 각종 염기 및 완충액으로 조정할 수 있다. 통상적으로, 1 내지 3일간 배양은 표적 아미노산을 배지내에 축적시킨다.
아미노산의 회수는 고형물, 예를 들어, 세포를 배양 후에 원심분리 또는 막여과에 의해 제거한 다음, 표적 아미노산을 이온 교환, 농축 및 결정 분별 방법 등에 의해 수집하고 정제함으로써 수행할 수 있다.
실시예
본 발명은 실시예를 참조로 하여 아래에 보다 구체적으로 설명할 것이다. 실시예에서, 달리 지시하지 않는 한 아미노산은 L-배위이다.
실시예 1: rhtB DNA 단편의 수득
(1) rhtB 유전자의 미니-Mu 파지미드로의 클로닝
아생형 rhtB 유전자를 미니-Mu d5005 파지미드를 사용하여 생체내에서 클로닝시킨다[참고 문헌: Groisman, E. A., et al., J. Bacteriol., 168, 357-364(1986)]. 균주 MG442의 MuCts62 용원소를 공여체로서 사용한다. 갓 제조된 용해물을 사용하여 균주 VKPM B-513의 Mucts 용원성 유도체(Hfr K10 metB)를 감염시킨다. 세포를 메티오닌(50㎍/ml), 카나마이신(40㎍/ml) 및 호모세린(10mg/ml) 함유 M9 글루코스 최소 배지 상에 플레이팅시킨다. 48시간 후에 나타난 콜로니를 선택하여 분리한다. 플라스미드 DNA를 분리하고 이를 사용하여 균주 VKPM B-513을 표준 기술에 의해 형질전환시킨다. 형질전환체를 상기한 바와 같은 카나마이신을 함유하는 L-브로쓰 아가 플레이트 상에서 선택한다. 플라스미드 DNA를 호모세린에 대해 내성인 것으로부터 분리하고, 삽입된 단편의 구조의 제한 지도화에 의해 분석한다. 상이한 염색체 영역에 속하는 2가지 유형의 삽입물이 공여체로부터 클로닝된 것으로 나타난다. 따라서, 다복사체내에 존재하고 호모세린에 대한 내성을 제공하는 2개 이상의 상이한 유전자는 이. 콜라이내에 존재한다. 2가지 유형의 삽입물 중 하나는 이미 보고되어 있는 rhtA 유전자[참고 문헌: ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997]이다. 2가지 유형의 삽입물 중 나머지 가운데, 호모세린에 대한 내성을 제공하는 단편의 최소 길이는 0.8kb이다(도 1).
(2) rhtB 유전자의 동정
삽입 단편을 생거(Sanger)의 디데옥시 쇄 종결 방법에 의해 서열화한다. DNA 쇄 둘다를 이의 전체로 서열화하고 모든 연접을 겹친다. 서열화로 삽입 단편이 이. 콜라이 염색체 상의 86min에 존재하는, 공지되어 있으나 작용-미지의 ORF(오픈 리딩 프레임)인 f138(GenBank 수탁 번호 M87049의 뉴클레오티드 제61543번 내지 제61959번) 및 이의 업스트림 영역 중 201bp(M87049의 서열에서 다운스트림 영역)를 포함한다는 것을 알 수 있다. 5'-플랭킹 영역에 단지 160개의 뉴클레오티드만을 갖는 f138은 호모세린에 대한 내성을 제공할 수 없다. 종결 코돈은 M87049의 제62160번 내지 제61959번 뉴클레오티드 사이의 업스트림 ORF f138에 존재하지 않는다. 또한, 리보좀 결합 부위로 추정되는 서열에 이은 하나의 ATG가 서열내에 존재한다. 보다 큰 ORF(뉴클레오티드 제62160번 내지 제61546번)를 rhtB 유전자로 명명한다. 유전자로부터 추론된 RhtB 단백질은 고도로 소수성이고 5개의 가능한 경막 단편을 함유한다.
실시예 2: 호모세린-생산 균주의 제조
이. 콜라이의 균주 NZ10을 아스파르토키나제-호모세린 데하이드로게나제 I을 암호화하는 thrA 유전자를 삽입한 pBR322 벡터인 플라스미드 pAL4에 의해 형질전환시켜 균주 NZ10/pAL4를 수득한다. 균주 NZ10은 이. 콜라이 균주 C600(thrB, leuB)으로부터 수득한 leuB+-복귀변이된 변이체(thrB)이다[참고 문헌: Appleyard, Genetics, 39, 440-452(1954)].
rhtB 유전자를, 카나마이신 내성 유전자를 암피실린 내성 유전자 대신으로 대체한 공지된 플라스미드 pUC19인 플라스미드 pUK21로 삽입하여[참고 문헌: Vieira, J. 및 Messing, J., Gene, 100, 189-194(1991)] pRhtB를 수득한다.
균주 NZ10/pAL4를 pUK21 또는 pRhtB로 형질전환시켜 균주 NZ10/pAL4,pUK21 및 NZ10/pAL4,pRhtB를 수득한다.
이와 같이 수득된 형질전환체를 50mg/ℓ 및 카나마이신 100mg/ℓ 암피실린 함유 영양 브로쓰내에서 18시간 동안 37℃에서 배양하고, 수득된 배양물 0.3ml를 20×200mm 시험 튜브내의 하기 조성물 및 50mg/ℓ 카나마이신 및 100mg/ℓ 암피실린을 함유하는 발효 배지 3ml로 접종한 다음, 회전 진탕기를 사용하여 46시간 동안 37℃에서 배양한다. 배양 후, 배지내에 축적된 호모세린의 양 및 배지의 560nm에서의 흡광도를 공지된 방법에 의해 측정한다.
발효 배지 조성물(g/L)
글루코스 80
(NH4)2SO422
K2HPO42
NaCl 0.8
MgSO4·7H2O 0.8
FeSO4·7H2O 0.02
MnSO4·5H2O 0.02
티아민 하이드로클로라이드 0.0002
효모 추출물 1.0
CaCO330
(CaCO3는 개별적으로 살균한다.)
결과는 표 1에 제시한다. 표 1에 제시된 바와 같이, 균주 NZ10/pAL4,pRhtB는 rhtB 유전자가 증강되지 않은 균주 NZ10/pAL4 및 NZ10/pAL4,pUK21보다 많은 양의 호모세린을 축적시킨다.
균주 OD560 호모세린의 축적된 양(g/L)
NZ10/pAL4 16.4 3.1
NZ10/pAL4,pUK21 14.3 3.1
NZ10/pAL4,pRhtB 15.6 6.4
실시예 3: pRhtB-도입된 균주를 사용한 알라닌, 발린 및 이소로이신의 생산
이. 콜라이 균주 MG442는 공지된 균주이다[참고 문헌: Gusyatiner, et al., 1978, Genetika(러시아어), 14:947-956].
균주 MG442를 플라스미드 pUK21 및 pRhtB로 형질전환시켜 균주 MG442/pUK21 및 MG442/pRhtB를 수득한다.
이와 같이 수득된 형질전환체를 50mg/ℓ 카나마이신 함유 영양 브로쓰내에서 18시간 동안 37℃에서 배양하고, 수득된 배양물 0.3ml를 20×200mm 시험 튜브내의 50mg/ℓ 카나마이신을 함유하는 실시예 2에 기술한 발효 배지 3ml로 접종한 다음, 회전 진탕기를 사용하여 40시간 동안 37℃에서 배양한다. 배양 후, 배지내에 축적된 알라닌, 발린 및 이소로이신의 양 및 배지의 560nm에서의 흡광도를 공지된 방법에 의해 측정한다.
결과는 표 2에 제시한다. 표 2에 제시된 바와 같이, 균주 MG442/pRhtB는 rhtB 유전자가 증강되지 않은 균주 MG442/pUK21보다 많은 양의 알라닌, 발린 및 이소로이신을 각각 축적시킨다.
균주 OD560 축적된 양(g/L)
알라닌 발린 이소로이신
MG442/pUK21 13.4 0.2 0.2 0.3
MG442/pRhtB 13.7 0.7 0.5 0.5
실시예 4: 트레오닌-생산 균주의 제조
균주 MG442(실시예 3)를 통상적인 형질전환 방법에 의해 공지된 플라스미드 pVIC40(미국 특허 제5,175,107호(1992)]를 도입함으로써 형질전환시킨다. 형질전환체를 0.1mg/ml 스트렙토마이신 함유 LB 아가 플레이트 상에서 선택한다. 이와 같이 신규한 균주 MG442/pVIC40을 수득한다.
균주 MG442/pVIC40을 pUK21 또는 pRhtB로 형질전환시켜 균주 MG442/pVIC40,pUK21 및 MG442/pVIC40,pRhtB를 수득한다.
이와 같이 수득된 형질전환체를 50mg/ℓ 카나마이신 및 100mg/ℓ 스트렙토마이신 함유 영양 브로쓰내에서 18시간 동안 37℃에서 배양하고, 수득된 배양물 0.3ml를 20×200mm 시험 튜브내의 50mg/ℓ 카나마이신 및 100mg/ℓ 스트렙토마이신을 함유하는 실시예 2에 기술한 발효 배지 3ml로 접종한 다음, 회전 진탕기를 사용하여 46시간 동안 37℃에서 배양한다. 배양 후, 배지내에 트레오닌의 축적된 양 및 배지의 560nm에서의 흡광도를 공지된 방법에 의해 측정한다.
결과는 표 3에 제시한다. 표 3에 제시된 바와 같이, 균주 MG442/pVIC40,pRhtB는 rhtB 유전자가 증강되지 않은 균주 MG442/pVIC40 및 MG442/pVIC40,pUK21보다 많은 양의 트레오닌을 축적시킨다.
균주 OD560 트레오닌의 축적된 양(g/L)
MG442/pVIC40 17 13.6
MG442/pVIC40,pUK21 16.3 12.9
MG442/pVIC40,pRhtB 15.2 16.3
실시예 5: 특정 아미노산 및 아미노산 유사체에 대해 내성인 세균 이. 콜라이에 미치는 rhtB 유전자 불활성 및 증폭의 영향
염색체 rhtB 유전자를 불활성화시키기 위해, 플라스미드 pNPZ46을 pUK21 벡터를 기초로 하여 작제한다(도 1). 이는 이. 콜라이 염색체의 86min로부터의 DNA 단편을 rhtB 유전자 및 이의 5'-플랭킹 및 3'-플랭킹 영역과 함께 보유한다. 다음, pNPZ46 플라스미드 rhtB 유전자의 ClaI-Eco47III 단편을, pACYC184 플라스미드의 cat(CmR) 유전자를 함유하는 AsuII-BsrBI 단편 대신으로 대체하여[참고 문헌: Chang 및 Cohen, J. Bacteriol., 134, 1141-1156, 1978] pNPZ47 플라스미드를 제공한다(도 1). 수득된, 삽입에 의해 불활성화된 rhtB 유전자를 이. 콜라이 균주 N99(공지된 균주 W3350의 스트렙토마이신-내성 유도체(Cambell. Virology, 14, 22-23, 1961))의 염색체로 도입하기 위해, 파커(Parker) 및 마리누스(Marinus)의 방법을 사용한다[참고 문헌: Parker, B. 및 Marinus, M. G., Gene, 73, 531-535, 1988]. 불활성 대립유전자의 야생형 대립유전자로의 대체는 파지 P1 형질도입 및 써던 하이브리드화[참고 문헌: Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98, 503-517, 1975]에 의해 입증된다.
다음, 특정 아미노산 및 아미노산 유사체에 대한 초기 균주 N99(rhtB+) 및 pRhtB 플라스미드로 형질전환된 이의 유도체, N99/pRhtB의, 이와 같이 수득된 이. 콜라이 균주 N99 rhtB::cat의 감수성을 시험한다. 회전 진탕기를 사용하여 37℃에서 M9 최소 배지내에서 성장한 균주(109cfu/ml)의 밤새 배양물을 1:100으로 희석시키고 동일한 조건하에 5시간 동안 성장시킨다. 다음, 이와 같이 수득된 대수기 배양물을 희석시키고 약 104개의 생존 세포를 아미노산 또는 유사체의 2배 증가량을 함유하는 M9 아가로 웰-건조된 시험 플레이트에 적용시킨다. 상기 화합물의 최소 억제 농도(MIC)는 40 내지 46시간 배양 후 조사한다. 결과는 표 4에 제시한다.
기질 MIC(㎍/ml)
N99(rhtB+) N99/pRhtB N99rhtB::촉매
1. L-호모세린 250 30000 123
2. L-트레오닌 30000 50000 30000
3. L-세린 5000 10000 5000
4. L-발린 0.5 1 0.5
5. AHVA 50 2000 25
6. AEC 10 25 10
7. 4-아자-DL-로이신 40 100 40
표 4로부터 rhtB의 다복사체가 호모세린뿐만 아니라 트레오닌, 세린, 발린, α-아미노-β-하이드록시발레르산(AHVA), S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(AEC), 및 아자-DL-로이신에 대한 증가된 내성을 세포에 제공한다는 것을 알 수 있다. 대조적으로, rhtB 유전자의 불활성화는 호모세린 및 AHVA에 대한 세포 감수성을 증가시킨다. 코리네박테륨 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 LysE 라이신 유출 수송체에 대한 RhtB 단백질의 상동성에 대한 데이터[참고 문헌: Vrljic et al., Mol. Microbiol., 22, 815-826, 1996]와 관련하여 이러한 결과는 rhtB 유전자 생성물에 대한 유사체 작용을 제시한다. 추정된 유출 수송체, RhtB는 수개의 기질(아미노산)에 대한 특이성을 가지거나, 증폭의 결과로서 비특이적 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 따라, 단백질 L-호모세린-내성을 갖는 세균을 제조하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 신규한 유전자(rhtB)를 제공하고, 상기 세균을 사용하여 아미노산, 특히, L-호모세린, L-알라닌, L-이소로이신, L-발린 및 L-트레오닌을 고수율로 제조할 수 있다.

Claims (7)

  1. (A) 서열 목록에서 서열 2로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 또는 (B) 서열 목록에서 서열 2로 제시된 아미노산 서열에서 하나 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고 단백질 L-호모세린-내성을 갖는 세균을 생산하는 활성을 갖는 단백질로 정의된 바와 같은 단백질을 암호화하는 DNA.
  2. 제1항에 있어서, (a) 서열 목록에서 서열 1로 제시된 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오티드 제557번 내지 제1171번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA; 또는 (b) 엄격한 조건하에 서열 목록에서 서열 1로 제시된 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오티드 제557번 내지 제1171번의 뉴클레오티드 서열로 하이브리드화하고 단백질 L-호모세린-내성을 갖는 세균을 제조하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA로 정의된 바와 같은 DNA.
  3. 세균의 L-호모세린 내성이 제1항에 정의된 바와 같은 DNA의 복제수를 세균의 세포내에서 증폭시킴으로써 증강되는, 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 세균.
  4. 제3항에 있어서, 제1항에 정의된 바와 같은 DNA가 세균의 세포내의 다복사체 상에 보유되는 세균.
  5. 제3항에 있어서, 제1항에 정의된 바와 같은 DNA가 세균의 세포내의 트랜스포손 상에 보유되는 세균.
  6. 아미노산을 생산하는 능력을 갖는 제3항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 세균을 배양 배지에서 배양하여 아미노산을 배지내에 생성시키고 축적시키는 단계, 및 상기 아미노산을 배지로부터 회수하는 단계를 포함하여, 아미노산을 제조하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 아미노산이 L-호모세린, L-알라닌, L-이소로이신, L-발린 및 L-트레오닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인 방법.
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