JP2000116390A

JP2000116390A - 大腸菌にｌ―ホモセリンに対する耐性を付与するタンパク質をコ―ドするｄｎａ及びｌ―アミノ酸の製造方法

Info

Publication number: JP2000116390A
Application number: JP11289777A
Authority: JP
Inventors: Livshits Vitaly Arkadievich; ヴィタリー・アルカージエヴィッチ・リヴィシッツ; Pavlovna Zakataeva Nataliya; ナターリヤ・パーヴロヴナ・ザカタエヴァ; Venijaminovich Aryoshin Vladimir; ヴラジーミル・ヴェニヤミノヴィッチ・アリョーシン; Valentinovna Belaryova Ara; アーラ・ヴァレンチーノヴナ・ベラリョーヴァ; Libovna Tokmakova Ilina; イリーナ・リヴォヴナ・トクマコーヴァ
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1998-10-13
Filing date: 1999-10-12
Publication date: 2000-04-25
Also published as: AU4755099A; CA2284850A1; RU2144564C1; US6887691B2; US6303348B1; CN1204254C; SK140899A3; US20020102670A1; EP0994190A3; BR9904955A; ZA996042B; KR20000029006A; US20020058314A1; AU761557B2; US20060014258A1; ID25719A; EP0994190A2; CN1254014A

Abstract

(57)【要約】【課題】ホモセリンに対する耐性に関与する新規な遺
伝子を提供し、さらに該遺伝子を用いてアミノ酸、特に
Ｌ−ホモセリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ
−バリン及びＬ−スレオニンを高収率で製造する方法を
提供する。【解決手段】アミノ酸生産能を有し、かつ、細菌にＬ
−ホモセリンに対する耐性を付与する活性を有するタン
パク質をコードする新規な遺伝子（rhtB）が増強された
エシェリヒア属細菌を培地で培養し、該培養物中にアミ
ノ酸を生成蓄積せしめ、該培養物から前記アミノ酸を採
取する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アミノ酸の製造法
に関し、特に、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−イ
ソロイシン、Ｌ−バリン又はＬ−スレオニンをエシェリ
ヒア属細菌を用いて製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】本発明者らは、エシェリヒア・コリＫ−
１２株において、最小培地中で高濃度のスレオニン（＞
４０ｍｇ／ｍｌ）又はホモセリン（＞５ｍｇ／ｍｌ）に
対する耐性に関与する変異thrR（以下、「rhtA23」とも
いう）を獲得した変異株を取得している（Astaurova,
O. B. et al., Appl. Biochem. and Microbiol., 21,
611-616 (1985)）。rhtA23変異に基づいて、改良された
スレオニン産生株（ロシア特許第974817号）並びにホモ
セリン及びグルタミン酸産生株（Astaurova et al., Ap
pl. Boch. and Microbiol., 27, 556-561 (1991)）が取
得された。

【０００３】さらに本発明者らは、rhtA遺伝子はエシェ
リヒア・コリ染色体の１８分の位置にあり、これがpexB
遺伝子とompX遺伝子の間のＯＲＦ１と同一であることを
つきとめた。そして、同ＯＲＦ１によってコードされる
タンパク質を発現する単位をrhtA（rht：ホモセリンお
よびスレオニン耐性）遺伝子と命名した。すなわち、rh
tA遺伝子は、ＳＤ配列などの５’非コード領域、ＯＲＦ
１及びターミネーターを含む。また、本発明者らは、野
生型rhtA遺伝子をマルチコピーとしてクローン化した場
合には、スレオニン及びホモセリンに対する耐性に関与
することを見出し、さらに、rhtA遺伝子の発現を増強す
ることにより、Ｌ−リジン、Ｌ−バリン又はＬ−スレオ
ニン生産能を有するエシェリヒア属細菌の各々のアミン
酸生産性が向上することを見出している（ABSTRACTS of
17th Internatinal Congress ofBiochemistry and Mol
ecular Biology in conjugatin with 1997 Annual Meet
ing of the American Society for Biochemistry and M
olecular Biology, San Francisco, California August
24-29, 1997, abstract No. 457）。

【０００４】尚、上記のrhtA遺伝子をクローニングする
際に、エシェリヒア・コリには、マルチコピーでホモセ
リン耐性を付与する少なくとも２つの異なる遺伝子が存
在することを見出している。これらのうち一方は、rhtA
遺伝子であるが、他方の遺伝子については明らかにされ
ていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ホモセリン
に対する耐性に関与する新規な遺伝子を提供し、さらに
該遺伝子を用いてアミノ酸、特にＬ−ホモセリン、Ｌ−
アラニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−スレ
オニンを高収率で製造する方法を提供することを課題と
するものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、エシェリヒ
ア・コリ染色体の８６分の領域をマルチコピーベクター
でクローニングすると、エシェリヒア・コリ細胞にホモ
セリン耐性が付与されることを見い出した。さらに、前
記領域を増幅すると、rhtAと同様に、エシェリヒア・コ
リのアミノ酸生産能を向上させることができることを見
い出し、本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち本発明は、下記（１）〜（７）を
提供するものである。（１）以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードす
るＤＮＡ。（Ａ）配列表配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタ
ンパク質。（Ｂ）配列表配列番号２において、１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸
配列からなるタンパク質であって、そのタンパク質を有
する細菌をＬ−ホモセリン耐性にする活性を有するタン
パク質。

【０００８】（２）以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮ
Ａである（１）のＤＮＡ。（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩
基番号５５７〜１１７１からなる塩基配列を有するＤＮ
Ａ。（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩
基番号５５７〜１１７１に相当する塩基配列を有するＤ
ＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
ＤＮＡであって、そのＤＮＡがコードするタンパク質を
有する細菌をＬ−ホモセリン耐性にする活性を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡ。

【０００９】（３）前記（１）又は（２）のＤＮＡの細
胞内のコピー数が増幅されたことにより、前記細菌のＬ
−ホモセリン耐性が増強されたエシェリヒア属細菌。

【００１０】（４）前記（１）又は（２）のＤＮＡが細
胞中のマルチコピーベクター上に保持された（３）の細
菌。

【００１１】（５）前記（１）又は（２）のＤＮＡが細
胞中のトランスポゾン上に保持された（３）の細菌。

【００１２】（６）前記（３）〜（５）のいずれかの細
菌であってアミノ酸生産能を有するものを培地で培養
し、培養物中にアミノ酸を生成蓄積せしめ、該培養物か
ら前記アミノ酸を採取することを特徴とするアミノ酸の
製造法。

【００１３】（７）前記アミノ酸が、Ｌ−ホモセリン、
Ｌ−アラニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−
スレオニンから選ばれることを特徴とする（６）の製造
法。

【００１４】尚、本願発明のＤＮＡを「rhtB遺伝子」、
rhtB遺伝子がコードするタンパク質を「RhtBタンパク
質」、細菌のＬ−ホモセリンに対する耐性に関与するRh
tBタンパク質の活性（すなわち、そのRhtBタンパク質を
有する細菌をＬ−ホモセリン耐性にする活性）を「Rh活
性」ともいう。また、rhtB遺伝子中、RhtBタンパク質を
コードする構造遺伝子を「rhtB構造遺伝子」ともいう。
また、「Rh活性を増強する」とは、細胞内のRhtBタンパ
ク質の分子数を増加させる、RhtBタンパク質の比活性を
上昇させる、RhtBタンパク質の発現や活性に対し、負の
効果を与える機構を解除する等の手段を通じて、ホモセ
リンに対する耐性を細胞に付与すること、あるいは同耐
性の程度を高めることを意味する。「タンパク質をコー
ドするＤＮＡ」とは、ＤＮＡが二本鎖の場合にはそのい
ずれか一方の鎖がタンパク質をコードすることを意味す
る。Ｌ−ホモセリン耐性とは、細菌が、その野生型細菌
が生育できない濃度（通常には１０ｍｇ／ｍｌ）のＬ−
ホモセリンを含む最小培地で生育する性質を意味する。
アミノ酸生産能とは、細菌が、その野生型細菌よりも多
量にアミノ酸を培地中に生成蓄積する性質を意味する。

【００１５】本発明により、エシェリヒア属細菌に高濃
度のホモセリンに対する耐性を付与することができる。
ホモセリンに対する耐性が上昇し、アミノ酸生産能を有
するエシェリヒア属細菌は、アミノ酸、特にＬ−ホモセ
リン、Ｌ−アラニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン又
はＬ−スレオニンを高収率で培地中に蓄積する。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１７】＜１＞本発明のＤＮＡ本発明のＤＮＡは、Rh活性を有し、かつ、配列表配列番
号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし
得る。本発明のＤＮＡとして具体的には、配列表配列番
号１において塩基番号５５７〜１１７１からなる塩基配
列を有するＤＮＡが挙げられる。

【００１８】本発明のＤＮＡは、エシェリヒア・コリに
ホモセリンに対する耐性を付与するRhtBタンパク質をコ
ードし、rhtB遺伝子の調節要素及びrhtB遺伝子の構造部
分を含み、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ断
片を包含する。

【００１９】配列番号１に示す塩基配列は、DDBJ/EMBL/
GenBank accession number M87049の配列の相補鎖の一
部に相当する。配列番号１に示す塩基配列は、エシェリ
ヒア・コリ染色体の８６分の位置に存在する公知かつ機
能未知のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）であ
るf138（M87049の塩基番号61959〜61543）と、その５’
隣接領域及び３’隣接領域とを含む。f138の５’隣接領
域に１６０ヌクレオチドしか含まない配列を有するDNA
断片はホモセリン耐性を付与しない。M87049の塩基番号
62160〜61959（ORF f138の上流）には終始コドンが存在
しない。このため、目的の遺伝子のコード領域はf138よ
り２０１ｂｐ長い。この大きいORF（M87049の塩基番号6
2160〜61543）は、rhtB遺伝子と命名された。したがっ
て、RhtBタンパク質及び同タンパク質をコードする rht
B遺伝子は、新規である。

【００２０】rhtB遺伝子は、例えば、mini-Mu d5005フ
ァージミッドを用いる方法（Groisman, E. A., et al.,
J. Bicteriol., 168, 357-364 (1986)）により、エシ
ェリヒア・コリ、例えばK12株又はW3110株の溶原化株の
溶菌液を用いて、エシェリヒア・コリのMucts溶原化株
に感染させ、カナマイシン（40μg/ml）及びホモセリン
(10 mg/ml)を含む最小培地で生育するコロニーからプラ
スミドＤＮＡを単離することによって得られる。また、
rhtB遺伝子は、後記実施例に示すように、エシェリヒア
・コリ染色体の８６分の位置にマップされたことから、
rhtB遺伝子を含むＤＮＡ断片を、エシェリヒア・コリ染
色体の８６分の位置に近接する領域に相当する配列を有
するオリゴヌクレオチドを用いたコロニーハイブリダイ
ゼーション、又はＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リ
アクション：White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185
(1989)参照））によって得ることができる。また、ＰＣ
Ｒ又はハイブリダイゼーションに用いるオリゴヌクレオ
チドは、配列番号１に示す塩基配列から設計することも
できる。ＰＣＲのプライマーとして、配列番号１におい
て塩基番号５５７よりも上流の領域、及び塩基番号１１
７１よりも下流の領域にそれぞれ対応する塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドを用いると、コード領域全長を
増幅することができる。

【００２１】オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、Ap
plied Biosystems社製ＤＮＡ合成機model 380Bを使用
し、ホスホアミダイト法を用いて（Tetrahedron Letter
s(1981),22,1859参照）常法に従って合成できる。PCR反
応は、宝酒造（株）製DNAサーマルサイクラー PJ2000型
を用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者により指定
された方法に従って行うことができる。

【００２２】本発明のRhtBタンパク質をコードするＤＮ
Ａは、コードされるRhtBタンパク質のRh活性が損なわれ
ない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が
欠失、置換、挿入又は付加されたRhtBタンパク質をコー
ドするものであってもよい。このようなRhtBタンパク質
と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例
えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸
が欠失、置換、挿入又は付加されるように塩基配列を改
変することによって得られる。また、上記のような改変
されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっ
ても取得され得る。突然変異処理としては、RhtBタンパ
ク質をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でイン
ビトロ処理する方法、及びRhtBタンパク質をコードする
ＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射又
はN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NT
G）若しくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられて
いる変異剤によって処理する方法が挙げられる。

【００２３】上記のようにしてインビトロ変異処理した
ＤＮＡを、適当な細胞でマルチコピーで発現させ、その
細胞のホモセリンに対する耐性を調べ、耐性が上昇した
ものを選択することにより、RhtBタンパク質と実質的に
同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ま
た、一般にタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコード
する塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずか
に異なることが知られているので、実質的に同一のタン
パク質をコードするＤＮＡは、エシェリヒア属のＬ−ホ
モセリン耐性の種、株、変異体、変種から得ることが可
能である。

【００２４】具体的には、変異処理したエシェリヒア属
細菌、又はエシェリヒア属細菌の自然突然変異株若しく
は変種から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配
列のうち、塩基番号５５７〜１１７１からなる塩基配列
を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズし、かつ、Rh活性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡを単離することによっても、RhtBタンパク質と
実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られ
る。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわ
ゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイ
ブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に
数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性
が高い核酸同士、例えば７０％以上の相同性を有するＤ
ＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核
酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。

【００２５】＜２＞本発明のエシェリヒア属細菌本発明のエシェリヒア属細菌は、Rh活性が増強されたエ
シェリヒア属細菌である。エシェリヒア属細菌として具
体的には、エシェリヒア・コリが挙げられる。Rh活性
は、例えば、rhtB構造遺伝子の細胞内のコピー数を増幅
すること、又は、RhtBタンパク質をコードするrhtB構造
遺伝子を含むＤＮＡ断片をエシェリヒア属細菌中で効率
よく機能するプロモーター配列に連結して得られる組換
えＤＮＡを用いてエシェリヒア属細菌を形質転換するこ
とによって、増強することができる。また、染色体ＤＮ
Ａ上のrhtB遺伝子のプロモーター配列を、エシェリヒア
属細菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列に置
き換えることによっても、Rh活性を増強することができ
る。

【００２６】rhtB構造遺伝子の細胞内のコピー数の増幅
は、rhtB構造遺伝子を保持するマルチコピーベクターを
エシェリヒア属細菌の細胞に導入することによって行う
ことができる。すなわち、rhtB構造遺伝子を保持するプ
ラスミド、ファージ、トランスポゾン（Berg, D. E. an
d Berg, C. M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)）等をエ
シェリヒア属細菌の細胞に導入することによって行うこ
とができる。

【００２７】マルチコピーベクターとしては、pBR322、
pMW118、pUC19等のプラスミドベクター、λ1059、λBF1
01、M13mp9等のファージベクターが挙げられる。また、
トランスポゾンとしては、Mu、Tn10、Tn5が挙げられ
る。

【００２８】エシェリヒア属細菌へのＤＮＡの導入は、
D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326
(1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理し
てＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,
J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等により行うことができ
る。

【００２９】アミノ酸生産性を有するエシェリヒア属細
菌において、上記のようにしてRh活性を増強すると、そ
のアミノ酸の生産量を増大させることができる。Rh活性
を増強させるエシェリヒア属細菌としては、目的とする
アミノ酸を産生する能力を有する菌株を用いる。また、
Rh活性を有するエシェリヒア属細菌に、アミノ酸生産性
を付与してもよい。以下に、エシェリヒア属に属するア
ミノ酸生産菌を例示する。

【００３０】（１）Ｌ−スレオニン生産菌Ｌ−スレオニン生産性のエシェリヒア属細菌としては、
エシェリヒア・コリ MG442（Gusyatiner et al., Genet
ika(in Russian), 14, 947-956 (1978)参照）が挙げら
れる。

【００３１】（２）ホモセリン生産菌ホモセリン生産性のエシェリヒア属細菌としては、NZ10
株が挙げられる。この株は、公知のC600株(thrB, leuB)
（Appleyard R.K., Genetics, 39, 440-452 (1954)参
照）からLeu⁺復帰変異株として得られたものである。

【００３２】rhtBＤＮＡ断片により、新規なアミノ酸生
産株であるエシェリヒア・コリNZ10/pAL4,pRhtB、エシ
ェリヒア・コリMG422/pVIC40,pRhtB及びエシェリヒア・
コリMG442/pRhtBが得られ、これらは発酵によるアミノ
酸の生産に使用できる。

【００３３】これらの新規株は、ルシアン・ナショナル
・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオ
ルガニズムス（Russian National Collection of Indus
trial Microorganisms；ＶＫＰＭ）に（ブタペスト条約
に基づく国際寄託に従い）１９９８年１０月６日に寄託
されている。エシェリヒア・コリNZ10/pAL4,pRhtB株
は、VKPM B-7658の受託番号、エシェリヒア・コリMG422
/pVIC40,pRhtB株は、VKPM B-7659の受託番号、エシェリ
ヒア・コリMG442/pRhtBは、VKPM B-7660の受託番号が付
与されている。

【００３４】エシェリヒア・コリNZ10/pAL4,pRhtB株（V
KPM B-7658）は、以下の培養的・形態的及び生化学的性
質を示す。

【００３５】細胞形態：グラム陰性、弱運動性で、丸い
端部を有する桿菌。長手方向の大きさは1.5〜2μm。

【００３６】牛肉エキス寒天：37℃で24時間の生育によ
り、丸くやや白い半透明のコロニーが生じる。コロニー
は、直径1.5〜3 mmで、滑らかな表面、一様な又はわず
かに波打った縁を有し、中心はわずかに隆起し、均質な
構造で、ペースト様の軟度であり、容易に乳濁できる。

【００３７】ルリア寒天：37℃で24時間の生育により、
やや白い半透明のコロニーが生じる。コロニーは、直径
1.5〜2.5 mmで、滑らかな表面、均質な構造、ペースト
様の軟度を有し、容易に乳濁できる。

【００３８】寒天添加最小培地Ｍ９：37℃で40〜48時間
の生育により、直径0.5〜1.5 mmのコロニーを生じる。
コロニーは、灰白色であり、半透明で、わずかに凸状
で、光沢のある表面を有する。

【００３９】牛肉エキス培地における生育：37℃で24時
間の生育により、強い均一な曇りを示し、特徴的な臭気
を有する。

【００４０】生理学的及び生化学的特徴：牛肉エキス寒
天への穿刺接種により生育する。接種領域で良好な生育
を示す。微生物は通性嫌気性である。ゼラチンを液化し
ない。ミルクで、ミルク凝固を伴って良好に生育する。
インドールを生成しない。温度条件については、牛肉エ
キス培地において20〜42℃で生育し、至適温度は３３〜
３７℃である。培養培地のｐＨ値については、６〜８の
ｐＨ値を有する液体培地で生育し、至適値は7.2であ
る。炭素源については、グルコース、フルクトース、ラ
クトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、グ
リセロール及びマニトールで良好に生育し、酸をガスを
産生する。窒素源については、アンモニウム、硝酸塩の
形態の窒素を同化し、また有機化合物の一部からも同化
する。アンピシリン、カナマイシン及びＬ−ホモセリン
に対して耐性である。Ｌ−スレオニンは増殖因子として
使用される。

【００４１】プラスミドの内容については、細胞は、ア
ンピシリン耐性を確保し、また、ホモセリン生合成の増
大に寄与するアスパラギン酸キナーゼ−ホモセリンデヒ
ドロゲナーゼＩをコードするスレオニンオペロンのthrA
遺伝子を保持するマルチコピーのハイブリッドプラスミ
ドpAL4を含む。さらに、細胞は、カナマイシン耐性を確
保し、また、ホモセリン（10 mg/l）に対する耐性を付
与するrhtB遺伝子を保持するマルチコピーのハイブリッ
ドプラスミドpRhtBを含む。

【００４２】エシェリヒア・コリMG442/pRhtB株(VKPM B
-7659)は、Ｌ−イソロイシンがＬ−スレオニンの代わり
に増殖因子として使用される他は、NZ10/pAL4,pRhtB株
と同じ培養的・形態的及び生化学的性質を有する。しか
し、イソロイシンなしでは生育は遅い。さらに、本株の
細胞は、カナマイシン耐性を確保し、また、ホモセリン
（10 mg/l）に対する耐性を付与するrhtB遺伝子を保持
するマルチコピーのハイブリッドプラスミドpRhtBのみ
を含む。

【００４３】エシェリヒア・コリMG442/pVIC,pRhtB株(V
KPM B-7660)は、Ｌ−イソロイシンがＬ−スレオニンの
代わりに増殖因子として使用される他は、NZ10/pAL4,pR
htB株と同じ培養的・形態的及び生化学的性質を有す
る。しかし、イソロイシンなしでは生育は遅い。本株の
細胞は、ストレプトマイシン耐性を確保し、また、スレ
オニンオペロンの遺伝子を保持するマルチコピーのハイ
ブリッドプラスミドpVIC40を含む。さらに、本株の細胞
は、カナマイシン耐性を確保し、また、ホモセリン（10
mg/l）に対する耐性を付与するrhtB遺伝子を保持する
マルチコピーのハイブリッドプラスミドpRhtBを含む。

【００４４】＜３＞アミノ酸の製造法上記のようにして、rhtB遺伝子のコピー数が増幅された
ことによりRh活性が増強されたエシェリヒア属細菌であ
ってアミノ酸生産能を有するものを好適な培地で培養
し、該培養物中にアミノ酸を生産蓄積せしめ、該培養物
からアミノ酸を採取することにより、アミノ酸を効率よ
く製造することができる。好適なアミノ酸としては、Ｌ
−ホモセリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−
バリン及びＬ−スレオニンが挙げられる。

【００４５】本発明の製造法におけるエシェリヒア属細
菌の培養および培養液からのアミノ酸の採取、精製等
は、従来の微生物を用いた発酵法によるアミノ酸の製造
法と同様にして行えばよい。培養に使用する培地として
は、炭素源、窒素源、無機物を含有し、必要があれば使
用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するもので
あれば、合成培地でも天然培地でもよい。炭素源として
は、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭
水化物、各種有機酸があげられる。また使用する微生物
の資化性によってはエタノールやグリセロール等のアル
コールを用いることが出来る。窒素源としては、アンモ
ニアや、硫酸アンモニウム等の各種のアンモニウム塩類
や、アミン類その他の窒素化合物や、ペプトン、大豆加
水分解物、発酵菌体分解物等の天然窒素源を用いること
が出来る。無機物としては、燐酸一カリウム、硫酸マグ
ネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガ
ン、炭酸カルシウム等が用いられる。

【００４６】培養は、振盪培養、通気撹拌培養等の好気
的条件下で行うことが好ましく、培養温度は通常２０〜
４０℃で、好ましくは３０〜３８℃の範囲で行う。培地
のｐＨは通常５〜９の範囲であり、６．５〜７．２の範
囲が好ましい。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシ
ウム、各種酸、各種塩基、緩衝液などによって調整する
ことができる。通常、１〜３日の培養によって、培養液
中に目的とするアミノ酸が蓄積する。

【００４７】培養終了後、培養液から菌体などの固形物
を遠心分離や膜分離法で除去し、次いで、イオン交換
法、濃縮法、晶析法等によって目的とするアミノ酸を採
取、精製することが出来る。

【００４８】

【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。実施例においては、特記しない限り、アミ
ノ酸はＬ型である。

【００４９】

【実施例１】 rhtBＤＮＡフラグメントの取得（１）rhtB遺伝子のmini-Muファージミッドへのクロー
ニング mini-Mu d5005ファージミッド（Groisman, E.A., et a
l., J. Bacteriol., 168, 357-364(1986)）を用いて、
野生型のrhtB遺伝子をインビボでクローニングした。MG
442菌株のMuCts62溶原菌を供与菌として用いた。新たに
用意した溶菌液を、VKPM B-513株（Hfr K10 metB）のMu
cts溶原化誘導体に感染させるために、用いた。メチオ
ニン（50μg/ml）、カナマイシン（40μg/ml）およびホ
モセリン（10 mg/ml）を含むＭ９グルコース最小培地に
細胞をプレートした。４８時間後に現れたコロニーを採
取し、単離を行った。プラスミドＤＮＡを分離して、一
般的方法によりVKPM B-513株を形質転換するために用い
た。形質転換体は、上記カナマイシンを含むＬ−ブロー
ス寒天プレートで選択した。プラスミドＤＮＡを、ホモ
セリンに耐性を有するこれらの形質転換体から分離し、
挿入断片の構造の制限酵素マッピングにより解析した。
異なる染色体領域に属する２つのタイプの挿入断片が、
供与菌からクローニングされたことが明らかとなった。
このように、エシェリヒア・コリには、マルチコピーで
ホモセリン耐性を付与する少なくとも２つの異なる遺伝
子が存在する。これらの挿入断片のうち一方は、すでに
報告されているrhtA遺伝子である（ABSTRACTS of 17th
Internatinal Congress of Biochemistry and Molecula
r Biology in conjugatin with 1997 Annual Meeting o
fthe American Society for Biochemistry and Molecul
ar Biology, San Francisco, California August 24-2
9, 1997, abstract No. 457）。他方の挿入断片のう
ち、ホモセリンに対する耐性を与える最短の断片は、
０．８ｋｂであった（図１）。

【００５０】（２）rhtB遺伝子の同定上記挿入断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・
チェイン・ターミネーション法によって決定した。配列
決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行い、切断点は
すべてオーバーラップするようにして行った。その結
果、該挿入断片は、エシェリヒア・コリ染色体の８６分
の位置に存在する公知かつ機能未知のＯＲＦ（オープン
リーディングフレーム）であるf138（GenBank accessio
n number M87049の塩基番号61543〜61959）と、その上
流領域（M87049の配列では下流）２１０ｂｐを含むこと
が明らかとなった。尚、f138の5'隣接領域に１６０ヌク
レオチドしか有しない配列を有するDNA断片は、ホモセ
リンに対する耐性を付与することができなかった。ＯＲ
Ｆ f138の上流（M87049の塩基番号62160〜61959）に
は、終止コドンが存在しない。さらに、この配列には、
リボゾーム結合部位と予想される配列が先行する一個の
ATGコドンが存在する。この一層大きなＯＲＦ（M87049
の塩基番号62160〜61546）がrhtB遺伝子と命名された。
この遺伝子から予想されるタンパク質RhtBは、高度に疎
水性であり、トランスメメンブレン・セグメントである
可能性のある５つの領域を有している。

【００５１】

【実施例２】ホモセリン生産菌の作製エシェリヒア・コリNZ10株を、アスパルトキナーゼ−ホ
モセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子を
pBR322ベクターに挿入したものであるプラスミドpAL4で
形質転換し、NZ10/pAL4株を得た。NZ10株は、エシェリ
ヒア・コリC600株(thrB,leuB)から得られたleuB⁺復帰変
異株（thrB）である（Appleyard, Genetics, 39, 440-4
52(1954)）。

【００５２】一方、公知のプラスミドpUC19のアンピシ
リン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で置換したも
のであるプラスミドpUK21（Vieira, J. and Messing,
J., Gene, 100, 189-194 (1991)）に、rhtB遺伝子を挿
入し、pRhtBを得た。

【００５３】次に、前記NZ10/pAL4株をpUK21又はpRhtB
で形質転換し、NZ10/pAL4,pUK21株及びNZ10/pAL4,pRhtB
株を得た。

【００５４】上記のようにして得られた各形質転換株
を、５０ｍｇ／ｌのカナマイシン及び１００ｍｇ／ｌの
アンピシリンを含むニュートリエントブロスを用いて３
７℃で１８時間培養し、培養液０．３ｍｌを、５０ｍｇ
／ｌのカナマイシン及び１００ｍｇ／ｌのアンピシリン
を含む下記の組成を有する発酵培地３ｍｌを含む２０×
２００ｍｍ試験管に接種し、ロータリーシェーカーで３
７℃、４６時間培養した。培養後、培養液中のホモセリ
ン蓄積量及び５６０ｎｍにおける吸光度を、公知の方法
で測定した。

【００５５】〔発酵培地（ｇ／Ｌ）〕グルコース８０（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ２２Ｋ₂ＨＰＯ₄ ２ＮａＣｌ０．８ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．８ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０２ＭｎＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ０．０２チアミン塩酸塩０．２イーストエキス１．０ＣａＣＯ₃ ３０ＣａＣＯ₃は別殺菌

【００５６】結果を表１に示す。表１に示されるよう
に、NZ10/pAL4,pRhtB株は、rhtB遺伝子を増強していな
いNZ10/pAL4株及びNZ10/pAL4,pUK21株よりも、ホモセリ
ンの蓄積量が多かった。

【００５７】

【表１】

【００５８】

【実施例３】 pRhtB導入株によるアラニン、バリン及
びイソロイシンの生産エシェリヒア・コリMG442菌株は
既知の菌株（Gusyatiner et al., Genetika(in Russia
n), 14, 947-956 (1978)）である。

【００５９】MG442株をプラスミドpUK21及びpRhtBで形
質転換し、MG442/pUK21及びMG442/pRhtB株を得た。

【００６０】上記のようにして得られた形質転換株を、
５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むニュートリエントブ
ロスを用いて３７℃で１８時間培養し、培養液０．３ｍ
ｌを、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む実施例２と同
様の発酵培地３ｍｌを含む２０×２００ｍｍ試験管に接
種し、ロータリーシェーカーで３７℃、４０時間培養し
た。培養後、培養液中のアラニン、バリン及びイソロイ
シンの蓄積量及び５６０ｎｍにおける吸光度を、公知の
方法で測定した。

【００６１】結果を表２に示す。表２に示されるよう
に、MG442/pRhtBは、rhtB遺伝子を増強していないMG442
/pUK21株よりも、アラニン、バリン及びイソロイシンの
各々の蓄積量が多かった。

【００６２】

【表２】

【００６３】

【実施例４】スレオニン生産菌の作製 MG442株（実施例３）を、既知のプラスミドpVIC40（米
国特許第5175107号 (1992)）を通常の形質転換法により
導入することによって形質転換した。形質転換体は、
０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬＢ−寒
天プレートにより選択した。このようにして新規菌株MG
442/pVIC40が得られた。

【００６４】MG442/pVIC40株を、pUK21又はpRhtBで形質
転換し、MG442/pVIC40,pUK21株及びMG442/pVIC40,pRhtB
株を得た。

【００６５】上記のようにして得られた各形質転換株
を、５０ｍｇ／ｌのカナマイシン及び１００ｍｇ／ｌの
ストレプトマイシンを含むニュートリエントブロスを用
いて３７℃で１８時間培養し、培養液０．３ｍｌを、５
０ｍｇ／ｌのカナマイシン及び１００ｍｇ／ｌのストレ
プトマイシンを含む実施例２と同様の発酵培地３ｍｌを
含む２０×２００ｍｍ試験管に接種し、ロータリーシェ
ーカーで３７℃、４６時間培養した。培養後、培養液中
のスレオニン蓄積量及び５６０ｎｍにおける吸光度を、
公知の方法で測定した。

【００６６】結果を表３に示す。表３に示されるよう
に、MG442/pVIC40,pRhtB株は、rhtB遺伝子を増強してい
ないMG442/pVIC40株及びMG442/pVIC40,pUK21株よりも、
スレオニンの蓄積量が多かった。

【００６７】

【表３】

【００６８】

【実施例５】 rhtB遺伝子の不活化及び増幅の、エシェ
リヒア・コリ細菌の数種のアミノ酸及びアミノ酸アナロ
グのに対する耐性への影響染色体rhtB遺伝子を不活化するために、プラスミドpNPZ
46（図１）を、pUK21ベクターに基づいて構築した。こ
れは、rhtB遺伝子並びに5'隣接領域及び3'隣接領域を含
む、エシェリヒア・コリ染色体の８６分のＤＮＡフラグ
メントを保持する。pNPZ46プラスミドのrhtB遺伝子のCl
aI-Eco47IIIフラグメントで、pACYC184プラスミド（Cha
ng and Cohen, J. Bacteriol., 134, 1141-1156 (197
8)）のcat(CM^R)遺伝子を含むAsuII-BsrBIフラグメント
を置換し、pNPZ47プラスミド（図１）を得た。得られ
た、挿入による不活化されたrhtB遺伝子をエシェリヒア
・コリN99株（公知のW3350株のストレプトマイシン耐性
誘導体（Campbell, Virology,14, 22-33 (1961)））の
染色体に導入するために、Parker及びMarinusの方法（P
arker, B. and Marinus, M.G., Gene, 73, 531-535 (19
88)）を用いた。野生型の対立遺伝子の不活化された対
立遺伝子による置換は、ファージP1トランスダクション
及びサザンブロッティング（Southern, E.M., J. Mol.
Biol., 98, 503-517 (1975)）により確認された。

【００６９】上記のように得られたエシェリヒア・コリ
N99 rhtB::cat株、元のN99株（rhtB ⁺）、pRhtBプラスミ
ドで形質転換されたその誘導体であるN99/pRhtBの、数
種のアミノ酸及びアミノ酸アナログに対する感受性を試
験した。ロータリーシェーカーを用いて37℃においてM9
最小培地で生育させた株の一夜培養物（10⁹cfu/ml）を
1:100に希釈し、同条件で５時間生育させた。このよう
に得られた対数期の培養物を希釈し、約10⁴の生存細胞
を、よく乾燥させた、２倍ずつ増加する濃度のアミノ酸
及びアナログを含むM9寒天のプレートに塗布した。これ
らの化合物の最小阻害濃度（MIC）を４０〜４６時間培
養後に調べた。結果を表４に示す。

【００７０】

【表４】

【００７１】表４から明らかなように、rhtBのマルチコ
ピーにより、ホモセリンだけでなく、スレオニン、セリ
ン、バリン、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸（ＡＨ
ＶＡ）、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン
（ＡＥＣ）、及び４−アザ−ＤＬ−ロイシンに対する増
加した耐性も細胞に付与された。rhtB遺伝子の不活化に
より、逆に、ホモセリン及びＡＨＶＡに対する感受性が
増した。これらの結果と、RhtBタンパク質の、コリネバ
クテリウム・グルタミカムのLysEリジン排出トランスポ
ーター（Vrljic et al., Mol. Microbiol., 22, 815-82
6 (1996)）との相同性のデータとが関連することは、rh
tB遺伝子産物の類似の機能を示している。排出トランス
ポーターと推定されるRhtBは数種の基質（アミノ酸）に
特異性を有するか、または、増幅の結果として非特異的
効果を示す可能性がある。

【００７２】

【発明の効果】本発明により、ホモセリンに対する耐性
に関与する新規な遺伝子が提供され、さらに該遺伝子を
用いてアミノ酸、特にＬ−ホモセリン、Ｌ−アラニン、
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−スレオニンを高
収率で製造する方法が提供される。

【００７３】

【配列表】 <110> 味の素株式会社(Ajinomoto Co., Inc.) <120> 大腸菌にＬ−ホモセリンに対する耐性を付与するタンパク質をコードするＤＮＡ及びＬ−アミノ酸の製造方法 <130> P-5826 <150> RU 98118425 <151> 1998-10-13 <160> 2 <210> 1 <211> 1200 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (557)..(1171) <400> 1 agaaataatg tggagatcgc accgcccatc gaatgtgcca gtatatagcg tttacgccac 60 ggaccgggct gaacctcctg ctgccagaat gccgccagat catcaacata atcattaaag 120 cgattaacat gcccgagatg cggatcggct aacaggcgac cggaacgtcc ctgcccgcga 180 tggtcgatga ttaagacatc aaaccccaaa tggaacaggt cataggccag ttccgcatat 240 tttacgtagc tctcaatacg ccccgggcag atgactacca cccggtcatg gtgctgtgcg 300 cgaaaacgga caaagcgcac cggaatgtca tccacaccag taaactctgc ttcatcacgc 360 tgacgccaga aatcagtcag cggtcccatg gtaaaagcag caaacgcgtt ttctcttgtt 420 tcccagtctt tttgctgctg aaacatcggg taatctgcct cttaaaccac gtaaaatcgt 480 tttttttagc gtgcctgaca caacgctgcg acagtagcgt attgtggcac aaaaatagac 540 acaccgggag ttcatc atg acc tta gaa tgg tgg ttt gcc tac ctg ctg aca 592 Met Thr Leu Glu Trp Trp Phe Ala Tyr Leu Leu Thr 1 5 10 tcg atc att tta acg ctg tcg cca ggc tct ggt gca atc aac act atg 640 Ser Ile Ile Leu Thr Leu Ser Pro Gly Ser Gly Ala Ile Asn Thr Met 15 20 25 acc acc tcg ctc aac cac ggt tat ccg gcc ggt ggc gtc tat tgc tgg 688 Thr Thr Ser Leu Asn His Gly Tyr Pro Ala Gly Gly Val Tyr Cys Trp 30 35 40 gct tca gac cgg act ggc gat tca tat tgt gct ggt tgg cgt ggg gtt 736 Ala Ser Asp Arg Thr Gly Asp Ser Tyr Cys Ala Gly Trp Arg Gly Val 45 50 55 60 ggg acg cta ttt tcc cgc tca gtg att gcg ttt gaa gtg ttg aag tgg 784 Gly Thr Leu Phe Ser Arg Ser Val Ile Ala Phe Glu Val Leu Lys Trp 65 70 75 gca ggc gcg gct tac ttg att tgg ctg gga atc cag cag tgg cgc gcc 832 Ala Gly Ala Ala Tyr Leu Ile Trp Leu Gly Ile Gln Gln Trp Arg Ala 80 85 90 gct ggt gca att gac ctt aaa tcg ctg gcc tct act caa tcg cgt cga 880 Ala Gly Ala Ile Asp Leu Lys Ser Leu Ala Ser Thr Gln Ser Arg Arg 95 100 105 cat ttg ttc cag cgc gca gtt ttt gtg aat ctc acc aat ccc aaa agt 928 His Leu Phe Gln Arg Ala Val Phe Val Asn Leu Thr Asn Pro Lys Ser 110 115 120 att gtg ttt ctg gcg gcg cta ttt ccg caa ttc atc atg ccg caa cag 976 Ile Val Phe Leu Ala Ala Leu Phe Pro Gln Phe Ile Met Pro Gln Gln 125 130 135 140 ccg caa ctg atg cag tat atc gtg ctc ggc gtc acc act att gtg gtc 1024 Pro Gln Leu Met Gln Tyr Ile Val Leu Gly Val Thr Thr Ile Val Val 145 150 155 gat att att gtg atg atc ggt tac gcc acc ctt gct caa cgg att gct 1072 Asp Ile Ile Val Met Ile Gly Tyr Ala Thr Leu Ala Gln Arg Ile Ala 160 165 170 cta tgg att aaa gga cca aag cag atg aag gcg ctg aat aag att ttc 1120 Leu Trp Ile Lys Gly Pro Lys Gln Met Lys Ala Leu Asn Lys Ile Phe 175 180 185 ggc tcg ttg ttt atg ctg gtg gga gcg ctg tta gca tcg gcg agg cat 1168 Gly Ser Leu Phe Met Leu Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Ala Arg His 190 195 200 gcg tgaaaaataa tgtcggatgc ggcgtaaac 1200 Ala 205 <210> 2 <211> 205 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Thr Leu Glu Trp Trp Phe Ala Tyr Leu Leu Thr Ser Ile Ile Leu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Pro Gly Ser Gly Ala Ile Asn Thr Met Thr Thr Ser Leu 20 25 30 Asn His Gly Tyr Pro Ala Gly Gly Val Tyr Cys Trp Ala Ser Asp Arg 35 40 45 Thr Gly Asp Ser Tyr Cys Ala Gly Trp Arg Gly Val Gly Thr Leu Phe 50 55 60 Ser Arg Ser Val Ile Ala Phe Glu Val Leu Lys Trp Ala Gly Ala Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Ile Trp Leu Gly Ile Gln Gln Trp Arg Ala Ala Gly Ala Ile 85 90 95 Asp Leu Lys Ser Leu Ala Ser Thr Gln Ser Arg Arg His Leu Phe Gln 100 105 110 Arg Ala Val Phe Val Asn Leu Thr Asn Pro Lys Ser Ile Val Phe Leu 115 120 125 Ala Ala Leu Phe Pro Gln Phe Ile Met Pro Gln Gln Pro Gln Leu Met 130 135 140 Gln Tyr Ile Val Leu Gly Val Thr Thr Ile Val Val Asp Ile Ile Val 145 150 155 160 Met Ile Gly Tyr Ala Thr Leu Ala Gln Arg Ile Ala Leu Trp Ile Lys 165 170 175 Gly Pro Lys Gln Met Lys Ala Leu Asn Lys Ile Phe Gly Ser Leu Phe 180 185 190 Met Leu Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Ala Arg His Ala 195 200 205

【図面の簡単な説明】

【図１】rhtB遺伝子のクローニング、同定および不活化
の説明図である。

【図２】RhtBタンパク質のアミノ酸配列を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ナターリヤ・パーヴロヴナ・ザカタエヴァロシア連邦，モスクワ，113545，１，ドロズニィプロエズド，１インスティテュートオブジェネティックスアンドセレクションオブインダストリアルマイクロオーガニズムズ（ブイエヌアイジェネティカ）内 (72)発明者ヴラジーミル・ヴェニヤミノヴィッチ・アリョーシンロシア連邦，モスクワ，113545，１，ドロズニィプロエズド，１インスティテュートオブジェネティックスアンドセレクションオブインダストリアルマイクロオーガニズムズ（ブイエヌアイジェネティカ）内 (72)発明者アーラ・ヴァレンチーノヴナ・ベラリョーヴァロシア連邦，モスクワ，113545，１，ドロズニィプロエズド，１インスティテュートオブジェネティックスアンドセレクションオブインダストリアルマイクロオーガニズムズ（ブイエヌアイジェネティカ）内 (72)発明者イリーナ・リヴォヴナ・トクマコーヴァロシア連邦，モスクワ，113545，１，ドロズニィプロエズド，１インスティテュートオブジェネティックスアンドセレクションオブインダストリアルマイクロオーガニズムズ（ブイエヌアイジェネティカ）内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を
コードするＤＮＡ。（Ａ）配列表配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタ
ンパク質。（Ｂ）配列表配列番号２において、１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸
配列からなるタンパク質であって、そのタンパク質を有
する細菌をＬ−ホモセリン耐性にする活性を有するタン
パク質。
【請求項２】以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡで
ある請求項１記載のＤＮＡ。（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩
基番号５５７〜１１７１からなる塩基配列を有するＤＮ
Ａ。（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩
基番号５５７〜１１７１からなる塩基配列を有するＤＮ
Ａとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤ
ＮＡであって、そのＤＮＡがコードするタンパク質を有
する細菌をＬ−ホモセリン耐性にする活性を有するタン
パク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】請求項１又は２記載のＤＮＡの細胞内の
コピー数が増幅されたことにより、前記細菌のＬ−ホモ
セリン耐性が増強されたエシェリヒア属細菌。
【請求項４】請求項１又は２記載のＤＮＡが細胞中の
マルチコピーベクター上に保持された請求項３記載の細
菌。
【請求項５】請求項１又は２記載のＤＮＡが細胞中の
トランスポゾン上に保持された請求項３記載の細菌。
【請求項６】請求項３〜５のいずれか一項に記載の細
菌であってアミノ酸生産能を有するものを培地で培養
し、培養物中にアミノ酸を生成蓄積せしめ、該培養物か
ら前記アミノ酸を採取することを特徴とするアミノ酸の
製造法。
【請求項７】前記アミノ酸が、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−
アラニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−スレ
オニンから選ばれる少なくとも一つであることを特徴と
する請求項６記載の製造法。