WO1996026289A1

WO1996026289A1 - Micro-organisme tolerant a la contrainte et procede de production de produit de fermentation

Info

Publication number: WO1996026289A1
Application number: PCT/JP1996/000287
Authority: WO
Inventors: Eiichiro Kimura; Yoshimi Kikuchi; Yoshio Kawahara; Shinya Goto; Osamu Kurahashi; Tsuyoshi Nakamatsu
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc.
Priority date: 1995-02-20
Filing date: 1996-02-09
Publication date: 1996-08-29
Also published as: JP3861290B2; US6156532A; EP0864654B1; DE69617454D1; US6338956B1; DE69617454T2; EP0864654A4; BR9607342A; EP0864654A1; ES2169225T3; PE18097A1; CN1181785A

Description

明細書ス卜レス耐性微生物及び発酵生産物の製造法

本発明は、発酵生産物の製造法に関し、詳しくは微生物を利用した発酵によるァミノ酸等の有用物質の製造法、及び微生物の生育及び又は発酵生産物の生産を抑制するストレスに対する耐性が付与された微生物に関する。背景技術細胞を高温、高浸透圧、代謝阻害、重金属の存在、ウィルス感染等のストレスにさらすと、ヒートショックタンパク質（以下、「H S P」という）と呼ばれる一群の夕ンパク質が短時間に誘導合成され、ストレスに対する防御反応が起こる。この H S Pは、原核細胞から真核細胞まで広く相同性があり、大きくいくつかのグループ（H S P 60群、 H S P 70群、 H S P 90群、 TR i C群、その他の群）に分けられている（Hendrick, J. P. and Hartl, F. -V. Annu. Rev. B iochem. , 62, 349-384(1993)) 。

H S Pによるストレス耐性のメカニズムは、 H S Pが持つタンパク質の高次構造の形成（タンパク質の折り畳み（folding)) 機能による。すなわち、ス卜レスにより変性し、正しい高次構造がとれなくなったタンパク質に H S Pが結合し、正しい高次構造に折り畳み直す（refolding)ことにより、そのタンパク質の機能を正常に戻すことができる。

このような夕ンパク質の高次構造形成における H S Pの機能は、変性タンパク質に対してだけではなく、正常な状態の細胞においても、タンパク質の折り畳み、会合（assembly) および膜透過（transport)等の過程に分子シャペロンとして働くことが明らかとなりその重要性が認識され、注目を集めている（Ellis, R. J. e t al. , Science, 250. 954-959(1990)) 。シャペロン（chaperon) とは、介添え役を意味し、 H S Pが種々のタンパク質に結合してその機能を発揮することから名付けられた。

H S Pは、上記のようなストレスに細胞がさらされると発現が誘導される。通常、この誘導は一時的であり、まもなく減衰し、新たな定常状態に達する。この H S Pの誘導は、転写レベルで行われることが明らかにされている（Cowing, D.

C. et al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA, 80， 2679-2683(1985), Zhou, Y. N. et al., J. Bacteriol., 170, 3640-3649(1988)) 。一群の H S P遺伝子は、ヒ一トショックプロモーターと呼ばれるプロモーター構造を持ち、このヒートショックプロモーターに特有に機能するひ（シグマ）因子であるシグマ— 3 2 (ひ ³²) が存在することが知られている。ひ ³²は r p o H遺伝子によってコードされる半減期が約 1分と非常に短い夕ンパク質であり、 H S Pの一時的な誘導と密接な関係があることが知られている（Straus, D. B. et al. , Nature, 329, 348-351(1 987)) 。ひ ³²自身の発現調節は転写レベルおよび翻訳レベルで行われることが明らかにされているが、主たる調節は翻訳レベルで行われている。

ヒートショックによる H S Pの誘導は、ひ ³²の合成量の増加と安定化の 2つの機構によるものである。これらのうち、 σ³²の合成量の増加については、ひ ³²の構造が熱により変化し、翻訳が促進されることが既に明らかになつており（Yura,

T. et al. , Annu. Rev. Microbiol. , 47, 321-350(1993)) 、ひ ³²の安定化については、 H S P (D n a K等）がひ ³²の分解に関与することが示されており、 H S Pによるフィードバック制御が働いていると考えられている（Tilly, . et a 1. , Cell, 34, 641-646(1983), Liberek, ， Pro Natl. Acad. Sci. ISA, 89,

3516-3520(1994)) 。

ェシエリヒア ' コリ（Ε· coli) では、ストレス存在下における上記のような Η S Pと細胞の生育との関係（Meury, J. et al. , FEMS Microbiol. Lett.. 113, 93-100(1993)) や、ヒト成長ホルモンの生産に d n a Kが、プロコラゲナーゼの分泌に g r o Eが影響すること（Hockney, R. C.. Trends in Biotechnology 12.

456 (1994)) は知られているが、アミノ酸や核酸等の発酵生産物の生産性と H S Pとの関係は知られていない。さらに、コリネホルム細菌では、 H S Pと生育との関係は知られておらず、 H S Pと発酵生産物の生産性との関係も知られていない。発明の開示本発明は、 H S Pと微生物の生育及び発酵生産物の生産性との関係を明らかにし、アミノ酸等の有用物質の発酵生産において、微生物の生育及びノ又は発酵生産物の生産を抑制するストレスの影響を減少させ、生産性や収率の低下を改善することを課題とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、 H S Pをコードする遺伝子又は H S P遺伝子に特有に機能する σ因子をコードする遺伝子を微生物に導入し、 H S Ρの発現を増強させることによって、生産性や生育を改善させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち本発明は、微生物を培地中に培養し、その培地中に発酵生産物を生成蓄積させ、該発酵生産物を採取する、微生物を利用した発酵生産物の製造法において、前記微生物が、 H S Ρをコードする遺伝子及び H S Ρ遺伝子に特有に機能するひ因子をコードする遺伝子の少なくとも一方が導入されて細胞内における Η S Pの発現量が増強され、微生物の生育及び又は発酵生産物の生産を抑制するストレスに対する耐性が付与されたことを特徴とする方法である。

本発明はまた、発酵生産物を産生する微生物であって、 H S Pをコードする遺伝子及び H S Ρ遺伝子に特有に機能する σ因子をコードする遺伝子の少なくとも一方が導入されて細胞内における H S Ρの発現量が増強され、微生物の生育及び /又は前記発酵生産物の生産を抑制するス卜レスに対する耐性が付与された微生物である。

上記の本発明の方法及び本発明の微生物において、発酵生産物としてはァミノ酸、例えば Lースレオニン、 L一リジン、 L一グルタミン酸、 L—ロイシン、 L 一イソロイシン、 L— 《リン、 L—フエ二ルァラニン；核酸またはヌクレオシド、例えばグァニル酸、イノシン、イノシン酸：その他、ビ夕ミン類、抗生物質等が挙げられる。

また、前記ストレスとしては、微生物の生育に好ましくない温度、培地の浸透圧または高濃度の発酵生産物が挙げられる。

また、ヒートショックタンパク質をコードする遺伝子として具体的には g r o Eが、 σ因子をコードする遺伝子としては r p o Hが挙げられる。

本発明が適用される微生物としては、ェシェリヒア属細菌またはコリネホルム細菌が挙げられる。

以下に、本発明を詳細に説明する。

本発明が適用される発酵生産物としては、微生物を用いた発酵生産により製造されるものであれば特に制限されないが、例えば Lースレオニン、 L 一リジン、 L —グルタミン酸、 L —ロイシン、 L—イソロイシン、 L—バリン、 L —フエ二ルァラニン等の種々の Lーァミノ酸；グァニル酸、イノシン、イノシン酸等の核酸類またはヌクレオシド；ビタミン類、抗生物質など、微生物により生産されるものが挙げられる。また、現在微生物を利用して生産されていない物質であっても、遺伝子組換え等により生産されるようになった物質についても本発明は適用され得る。上記の物質の中では、特にアミノ酸のように、培地中に分泌され、培地の浸透圧を高めるものについては、本発明の方法は好適に適用され得る。

H S Pをコードする遺伝子及び H S P遺伝子に特有に機能するひ因子をコードする遺伝子の少なくとも一方が導入されて細胞内における H S Pの発現量が増強され、微生物の生育及び又は前記発酵生産物の生産を抑制するストレスに対する耐性が付与される微生物としては、発酵により発酵生産物を産生するものであれば特に制限されず、ェシヱリヒア属細菌、コリネホルム細菌、バチルス属細菌、セラチア属細菌等、従来物質生産に用いられてきたものが挙げられる。好ましくは、その微生物において、プラスミドの複製開始起点を含む D N A断片が取得されていて、 H S P遺伝子又は H S P遺伝子に特有な σ因子をコードする遺伝子が機能し、これらの遺伝子のコピー数を上昇させることが可能な微生物である。尚、上記のコリネホルム細菌とは、バージーズ ·マニュアル ·ォブ ·デターミネィテイブ ·ハクテリォロジ一 (Bargey s Manual of Determinative Bacteriology) 第 8版 599頁（1974) に定義されている一群の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を有しない桿菌であり、コリネパクテリゥム属細菌、及び従来プレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリゥム属細菌として統合されたブレビバクテリゥム属細菌、さらにコリネバクテリゥム属細菌と非常に近縁なブレビパクテリゥム属細菌を含む。具体的には、例えば、発酵生産物が Lースレオニンの場合はェシヱリヒア · コリ VKPM B-3996CRIA 1867) (米国特許第 5. 175, 107号参照）、コリネバクテリウム - ァセトァシドフィラム AJ 12318 (FERM BP- 1172) (米国特許第 5, 188， 949号参照）等であり、 L一リジンの場合はェシヱリヒア ' コリ AJ 11442 (NRRL B 12185, FERM

8卩- 1543) (米国特許第4, 346, 170号参照）、ェシエリヒア · コリ W3110(tyrA) (同株はェシヱリヒア ' コリ W3110(tyrA)/pHATerm (FERM BP-3653) からプラスミド p HATennを脱落させることにより得られる。 W0 95/16042国際公開パンフレツト参照）、ブレビパクテリゥム · ラクトフアーメンタム AJ 12435 (FERM BP- 2294) (米国特許第 5, 304, 476号）、ブレビパクテリゥム ' ラクトフアーメンタム AJ3990 (ATCC31 269) (米国特許第 4, 066, 501号参照）等であり、 L一グルタミン酸の場合はェシェリヒア，コリ AJ 12624 (FERM BP- 3853) (フランス特許出願公開第 2, 680, 178号参照）、ブレビパクテリゥム · ラクトフアーメンタム AJ 12821 (FERM BP- 4172) (特開平 5- 26811号、フランス特許出願公開第 2, 701, 489号）、ブレビパクテリゥム ' ラク卜ファーメンタム AJ 12475 (FERM BP- 2922) (米国特許第 5, 272. 067号参照）、ブレビバクテリゥム · ラクトファーメンタム AJ 13029 (FERM BP-5189)(JP 95/01586号国際公開パンフレッ卜参照）等であり、 L一ロイシンの場合はェシヱリヒア ' コリ

AJ 11478 (FERM P-5274) (特公昭 62-34397号参照）、ブレビパクテリゥム · ラク卜フアーメンタム AJ3718 (FERM P-2516) (米国特許第 3， 970, 519号参照）等であり, L—イソロイシンの場合はェシェリヒア · コリ KX141 (VKPM B-4781 ) (欧州特許出願公開第 519， 113号参照）、ブレビパクテリゥム ' フラバム AJ 12149 (FERM BP- 7 59) (米国特許第 4， 656, 135号参照）等であり、 L一バリンの場合はェシエリヒア ' コリ VL1970 (VKPM B- 4411 ) (欧州特許出願公開第 519, 113号参照) 、ブレビパクテリゥム · ラクトファーメンタム AJ 12341 (FERM BP- 1763) (米国特許第 5, 188, 94 8号参照）等であり、 L一フヱニルァラニンの場合は、ェシエリヒア ' コリ AJ 12 604 (FERM BP- 3579) (特開平 5-236947号、欧州特許出願公開第 488, 424号参照) 、ブレビパクテリゥム · ラクトフアーメンタム AJ 12637 (FERM BP- 4160) (フランス特許出願公開第 2, 686, 898号参照）等である。

本発明の方法に用いる微生物は、上記のような微生物であって、 H S Pをコードする遺伝子及び H S P遺伝子に特有に機能するひ因子をコードする遺伝子の少なくとも一方が導入されて細胞内における HS Pの発現量が増強され、微生物の生育及び Z又は前記発酵生産物の生産を抑制するストレスに対する耐性が付与された微生物である。前記微生物に導入される遺伝子は、 H S Pをコードする遺伝子と H S P遗伝子に特有に機能するび因子をコードする遺伝子のいずれか一方でもよく、両方でもよい。

「H S Pの発現量が増強される」とは、もともと H S Pを産生する微生物の H S P産生量が増加することに加えて、 H S Pを本来的には実質的に発現しない微生物が H S Pを発現するようになることも含む意味である。 H S Pの発現量の増強は、具体的には、例えば、外来の又は内在性の（endogenous) の H S P遺伝子を微生物細胞内に導入して発現させることにより実現される。その際、微生物細胞内で自律複製可能なベクター、特にマルチコピー型のプラスミドをベクターとして用いると、 H S P遺伝子の細胞内コピー数を高めることができる。また、発現効率のよいプロモーターを用いて H S P遺伝子当たりの発現量を高めることによっても H S Pの発現を効率的に増強することができる。さらに、 H S P遺伝子固有のプロモーターに特有に機能する σ因子遺伝子を微生物細胞内に導入することによっても、 H S Ρを増強することができる。

H S Ρをコードする遺伝子としては、 g r o E (G r o E L S遺伝子）、 d n a K (D n a K遺伝子）、 d n a J (D n a J遺伝子）等が挙げられるが、これらの中では g r o Eが好ましい。また、これらの遺伝子に特有に機能するひ因子としてはひ ³²をコードする r p o Hが挙げられる。これらの遺伝子の起源となる微生物としては、各々の遺伝子がェシェリヒア属細菌またはコリネホルム細菌細胞中で機能することができるものであれば特に制限されないが、具体的にはェシェリヒア属細菌及びコリネホルム細菌が挙げられる。

ェシヱリヒア · コリの r p o H遺伝子および g r o E遺伝子は、その塩基配列が既に報告されており（ r p o H ： J.Bacteriol.170,3479-3484(1988)、 g r o E ： ature, 333, 330-334(1988)) 、その配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプライマ一を用いた P C R法（ポリメラーゼチェインリアクション）により増幅することによってェシヱリヒア ' コリ染色体から得られる。 r p 0 H遺伝子増幅用のプライマーの塩基配列としては、配列番号 1及び 2に記載の配列が、 g r o E遺伝子増幅用のプライマーとしては、配列番号 3及び 4に記載の配列が挙げられる。

また、ブレビパクテリゥム · フラバムの d n a K遣伝子及び g r o E遺伝子が、ェシヱリヒア ' コリ及びバチルス ·サブチリス由来の d n a K遗伝子間、及び g r o E遺伝子間で保存されているアミノ酸配列を基に作成したプライマーを用いた P CR法により、単離されており、これらの遺伝子は、他の微生物由来の d n a K遺伝子又は g r o E遺伝子と高い相同性を示すことが報告されている（94 年度日本分子生物学会大会講演要旨集第 3 95頁）。この事実から、他の H S P をコードする遺伝子（d n a J遺伝子及び r p o H遺伝子等）についても同様に、ェシエリヒア ' コリ由来の各々の遺伝子と相同性が高いことが予想される。したがって、ェシヱリヒア ' コリ由来の H S Pをコードする遺伝子を用いたハイプリダイゼーションにより、あるいはこれらの遺伝子の一部の配列を用いた P C R法によって、コリネホルム細菌から各々の遺伝子を単離することは容易であると考えられる。

上記のようにして得られた遺伝子をエシリヒア属細菌に導入するには、例えば、上記遺伝子を含む DN A断片をェシエリヒア属細菌細胞内において自律複製可能なベクター DN Aに接続し、得られた組換えベクターでエシュリヒア属細菌を形質転換すればよい。また、上記遺伝子を、ェシエリヒア属細菌以外の微生物に導入するには、その微生物細胞内において自律複製可能なベクター DN Aに上記遺伝子を含む DNA断片を接続し、得られた組換えベクターで前記微生物を形質転換すればよい。

本発明において用いることのできるベクター DN Aとしては、プラスミドべクター DN Aが好ましく、遺伝子が導入される微生物がエシリヒア属細菌の場合には、例えば pUC19、 pUC18、 pBR322、 pHSC299> pHSG399> RSF1010 等が挙げられる。他にもファージ DNAのべクタ一も利用できる。 H S Pの発現を効率的に達成するために、 H S P遺伝子固有のプロモーターに代えて 1 a c、 t r p、 P L 等の微生物内で働くプロモーターを用いてもよい。尚、 H S P遺伝子又は H S P 遺伝子に特有に機能するび因子を微生物に導入するには、これらの遺伝子を含む DNAをトランスポゾン (Berg. D. E. and Berg, C. M.. Bio/Technol. , 1, 417(1983)) 、 Muファージ（特開平 2 - 1 0 9 985 ) または相同性組換え（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)) を用いた方法で前記微生物の染色体に組み込んでもよい。

本発明において用いることのできるベクター D N Aとしては、遣伝子が導入される微生物がコリネホルム細菌の場合には、コリネホルム細菌でき律複製可能なプラスミドベクター、例えば p AM 3 3 0 (特公平 1一 1 1 2 80号公報参照）や、 pHM 1 5 1 9 (特開昭 58 - 77 895号公報参照）等が挙げられる。形質転換の方法は、通常の微生物の形質転換体の作製と特に変わるところはなく、例えばェシエリヒア属細菌の場合には、 D. M. Morrisonの方法（Methods in E nzymology 68， 326 (1979)) あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理して D N Aの透過性を増す方法 (Mandel, . and Higa, A. , J. Mol. Biol. , 53.159(1970)) 等により行うことができる。また、コリネホルム細菌の形質転換は、上記の Mand elらの方法、またはバチルス ·ズブチリスについて報告されている様に細胞が D N Aを取り込み得る様に増殖段階（いわゆるコンビテン卜セル）に導入する方法 (Duncan, C. H. , Wilson, G. A. and Young, F. E.， Gene, 1, 153(1977)) により行うことができる。あるいは、バチルス ' ズブチリス、放線菌類および酵母について知られている様に (Chang, S. and Choen, S. N. , Molec. Gen. , Genet. , 168. lll(1979);Bib b, M. J. , Ward, J. M. and Hopwood, 0. A. , Nature, 274, 398( 1978); Hinnen, A. , Hicks, J. B. and Fink, G. R. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929(1978)) 、 DN A受容菌を組換え DN Aを容易に取り込むプロトプラストまたはスフエロプラストにして組換え DNAを導入することも可能である。さらに、電気パルス法（杉本ら.特開平 2 -207791号公報）によっても、組換え DN Aをブレビバクテリゥム属またはコリネバクテリゥム属細菌に導入することができる。

通常の微生物は、培養温度の上昇、発酵生産物や高濃度の培地成分による高浸透圧、あるいは目的とする発酵生産物の産生に伴う代謝異常等によるス卜レスを受けると、生育が抑制されたり発酵生産物の生産性や収率が低下するか、 H S P の発現を増強させることによって、これらのストレスに対する耐性を付与することができる。その結果、前記のようなストレスを微生物が受ける環境下で、発酵生産物の生産性を向上させることができる。尚、ストレスに対する耐性とは、完全な耐性を意味するものではなく、ス卜レスから受ける影響を減少させる性質も含む。また、導入する遺伝子の種類や宿主微生物の種類によっては、生育の抑制と発酵生産物の生産性や収率の低下の両方が解消されるものとは限らず、生育は抑制されるが発酵生産物の収率が向上する場合がある。本発明の方法により耐性を付与することができるス卜レスとしては、微生物の生育に好ましくない温度、培地の浸透圧、培地中の高濃度のアミノ酸等が挙げられる。

本発明の方法に用いる発酵生産用の培地は、利用される微生物に応じて従来より用いられてきた周知の培地を用いてかまわない。つまり、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。本発明を実施するための特別な培地は必要とされない。

炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクト一ス、フラクトースやでんぶんの加水分解物などの糖類、グリセロールゃソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クェン酸、コハク酸等の有機酸類等を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニゥム、塩化アンモニゥム、リン酸アンモニゥム等の無機アンモニゥム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、ァンモニァ水等を用いることができる。

有機微量栄養源としては、ビタミン B h L —ホモセリン、 L—チロシンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。

培養は、利用される微生物に応じて従来より用いられてきた周知の条件で行つてかまわない。例えば、好気的条件下で 1 6〜 1 2 0時間培養を実施するのがよく、培養温度は 2 5て〜 4 5てに、培養中 p Hは 5〜 8に制御する。尚、 p H調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアル力リ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。

培養終了後の培地液からの代謝産物の採取は、本願発明において特別な方法が必要とされることはない。すなわち、本発明は従来より周知となっているイオン交換樹脂法、沈澱法その他の方法を組み合わせることにより実施できる。発明を実施するための最良の形態以下に、本発明を実施例により更に具体的に説明する。実施例 1 r p o H遺伝子及び _g r o E遺伝子導入用プラスミドの作製

< 1 > r p o H遺伝子および g r o E遺伝子のクローニング

ェシヱリヒア · コリの r p o H遺伝子及び g r o E遺伝子を、 P C R (ポリメラーゼ ·チヱイン · リアクション）法によりクローニングした。 P C R法に用いるプライマ一は、既に報告されているェシヱリヒア · コリの r p o H遺伝子（J. Bacteriol. , 170, 3479-3484(1988)) および g r o E遺伝子 (Nature. 333,330-33 4(1988)) の配列をもとに合成した。 r p 0 H遺伝子の増幅用プライマーとしては. 配列番号 1 (5' 側）及び配列番号 2 ( 3' 側）に示すォリゴヌクレオチドを、 g r o E遺伝子の増幅用プライマーとしては、配列番号 3 ( 5' 側）及び配列番号 4 ( 3' 側）に示すヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを、それぞれ合成した。

( r p o H遺伝子増幅用プライマ一）

5'側： 5' CGGAACGAAGTTTGATATCA-3' (配列番号 1 )

3'側： 5' ATCCAGGGTTCTCTCCTTAA-3' (配列番号 2 )

(g r o E遺伝子増幅用プライマー）

5'側： 5' GACGTCGATAGCAGGCCAAT-3' (配列番号 3 )

3'側： 5' - G ACGC ACTCGCGTCGTCCGT - 3' (配列番号 4 )

E. coli K 12株から斉藤らの方法（Saito. H. and iura, K. , Biochem. Biop hys. Acta. , 72, 619(1963)) により染色体 D N Aを抽出し、これを铸型とし、上記ォリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、 P C R反応を行った。

P CR反応は、熱変性（94°C、 1分）、ァニーリング（ 3 7て、 2分）、及びポリメラ一ゼ反応（ 72て、 3分）からなるサイクルを 2 5サイクル行った。得られた増幅産物の両末端を、市販の DN A末端平滑化キット（宝酒造社製、 Blunting kit) を用いて平滑末端化した後、ベクタープラスミド p S T V 2 8 (宝酒造社製）の H i n c II部位にそれぞれクローニングし、プラスミド p S T V 28— r p o Hおよび p S TV 28 - g r o Eを得た。

< 2 > r p o H遣伝子を含むプラスミドおよび g r o E遺伝子を含むプラスミドへのコリネホルム細菌由来の複製起点の導入

p STV 2 8 - r p o Hを、コリネホルム細菌細胞内で自律複製可能にするために、既に取得されているコリネホルム細菌で自律複製可能なプラスミド p HM 1 5 1 9 (Miwa, k. et. al. , Agric. Biol. Chem. , 48(1984)2901-2903) 由来の複製起点（特開平 5 - 00 74 9 1号公報）を p S TV 28 - r p o Hに導入した。具体的には、 p HM 1 5 1 9を制限酵素 B a mH Iおよび K ρ η Iで消化し、複製起点を含む DNA断片を取得し、得られた断片を DN A末端平滑化キット（宝酒造社製、 B l u n t i n g k i t ) を用いて平滑末端化した後、その末端に K p n I リンカー（宝酒造社製）を連結し、それを p S T V 2 8— r p o Hの K p n I部位に挿入して p R P Hを取得した。また、対照として、 r p o H遺伝子を持たないプラスミド p H S G 3 99を用い、その S a 1 I部位に同様に S a 1 I リンカ一（宝酒造社製）を用いて p HM 1 5 1 9由来の複製起点を挿入して p S A C を取得した。実施例 2 r p o H遺伝子を導入した L一グルタミン酸生産菌による

L一グルタミン酸生産

L—グルタミン酸生成能を有するブレビパクテリゥム · ラクトフアーメンタム A J 1 28 2 1 (F E RM B P— 4 1 7 2 ) に、上記の様にして作製した p R PHと p S A C 4とを導入し、それぞれのプラスミドが導入された形質転換体の L—グル夕ミン酸生産性を評価した。ブレビパクテリゥム ' ラクトフアーメンタム細胞へのプラスミドの導入は、電気パルス法（特開平 2 - 20 77 9 1 ) により行った。

プラスミドが導入された形質転換体は、 4〃 g m 1 のクロラムフエ二コールを含む CM 2 Gプレート培地（ポリぺプトン 1 0 g、酵母エキス 1 0 g、グルコ —ス 5 g、 N a C 1 5 g、寒天 1 5 gを純水 1 Lに含む。 p H 7. 2) にて選択した。

得られた形質転換体の L一グルタミン酸の生産性の評価は以下の様にして行つた。 CM 2 Gプレート培地にて各形質転換体を培養して細胞のリフレッシュを行い、リフレッシュされた各々の形質転換体を、グルコース 80 g、 KH₂P 0₄ 1 g. Mg S O 4 · 7 H2O 0. 4 g、 (N H₄) 2 S O 4 30 g、 F e S 0₄ · 7 H 2O 0. 0 1 g Mn S 0₄ · 7 H2O 0. 0 1 g、大豆加水分解液 1 5 m 1、サイアミン塩酸塩 200 g、ピオチン 300〃 g、クロラムフエ二コール 4 mgおよび C a C0₃ 50 gを純水 1 L中に含む培地（ K 0 Hを用いて p Hは 8. 0に調整されている）中で、 35 °Cで 20時間培養した。尚、ブレビバクテリウム ' ラクトファーメンタムの好適な培養温度は、通常 3 1〜32°Cである。

培養後、菌体濃度、及び培地中に蓄積された L -グルタミン酸の量を測定した。 L—グルタミン酸の定量は、旭化成（株）製バイオテックアナライザー A S— 2 1 0を使用して行った。菌体濃度は、 0. 2 N塩酸で 5 1倍に希釈した培養液の 660 nmにおける吸光度（OD₆₆。）により測定した。結果を表 1に示す。表 1

この結果から明らかなように、 r p 0 H遺伝子を導入されたブレビバクテリゥム ' ラクトフアーメンタム L一グルタミン酸生産菌は、生育は抑制されたが L - グル夕ミン酸生産性が向上した。実施例 3 r p o H遣伝子を導入した L一リジン生産菌による L -リジン生産ブレビパクテリゥム ' ラクトフアーメンタム ATC C 1 3 869から変異誘導された、 S— （2—アミノエチル） — L一システィンに耐性を示し、 L—リジン生成能を有するブレビパクテリゥム ' ラクトフアーメンタム A J 1 24 3 5 (F ERM B P— 2 2 94 ) に、上記の様にして作製した p R P Hと p SAC 4とを導入し、それぞれのプラスミドが導入された形質転換体の L一リジン生産性を評価した。

ブレビパクテリゥム ' ラクトファーメンタム細胞へのプラスミドの導入は、電気パルス法（特開平 2 - 20 779 1 ) により行った。

プラスミドが導入された形質転換体は、 4 g m 1のクロラムフヱニコールを含む CM 2 Gプレート培地（ポリぺプトン 1 0 g、酵母エキス 1 0 g、グルコース 5 g、 N a C 1 5 g、寒天 1 5 gを純水 1 Lに含む。 p H 7. 2 ) にて選択した。

得られた形質転換体の L一リジン生産性の評価は以下の様にして行った。 CM 2 Gプレート培地にて各形質転換体を培養して細胞のリフレツシュを行い、リフレッシュされた各々の形質転換体を、グルコース 1 0 0 g、 KH₂P O₄ l g、 M g S ϋ₄ · 7 H ₂0 0. 4 g、 (NH₄) ₂S0₄ 3 0 g、 F e S 0₄ · 7 H₂0 0. 0 1 g、 Mn S O₄ ' 7 H₂O 0. 0 1 g、大豆加水分解液 1 5 m 1、サイァミン塩酸塩 2 0 0 // g、ピオチン 3 0 0〃 g、クロラムフエ二コール 4 mgおよび C a C 0₃ 5 0 gを純水 1 L中に含む培地（KOHを用いて p Hは 8. 0に調整されている）中で、 3 1. 5°Cで 60時間培養した。培養後、菌体濃度、及び培地中に蓄積された L一リジンの量を測定した。 L一リジンの定量は、旭化成 (株）製バイオテックアナライザー A S— 2 1 0を使用して、 Lーリジン塩酸塩の量として行った。菌体濃度は、 0. 2 N塩酸で 5 1倍に希釈した培養液の 66 0 nmにおける吸光度（OD₆₆。）により測定した。結果を表 2に示す。表 2

表 2に示されるように、 r p o H遺伝子を導入されたブレビパクテリゥム · ラクトフアーメンタム L—リジン生産菌は、生育がよく、 Lーリジン生産性も向上した。この結果は、 L—リジンの蓄積による浸透圧の上昇による影響が緩和された結果であると推定される。実施例 4 g r o E遺伝子を導入した L—フエ二ルァラニン生産性

ェシヱリヒア ' コリによる L—フヱニルァラニン生産ェシヱリヒア ' コリ K 1 2株から育種されたフヱニルァラニン生産菌 A J 1 2 6 04株（F E RM B P— 3 5 79) に、上記の様に作成した p S TV 2 8— g r o Eあるいは p S T V 2 8を導入し、それぞれのプラスミドが導入された形質転換体の L一フエ二ルァラニン生産性を評価した。

プラスミドの導入は、電気パルス法（特開平 2 - 20 7 79 1 ) を用いた。プラスミドが導入された形質転換体は、 4 0〃 g m 1のク口ラムフヱニコールを含む Lプレート培地（ポリぺプトン 1 0 g、酵母エキス 5 g、 N a C 1 5 g、寒天 1 5 gを純水 1 Lに含む。 ρ Η 7· 2 ) にて選択した。

得られた形質転換体の L一フヱニルァラニンの生産性の評価は以下の様にして行った。 4 0mg Lのクロラムフヱニコールを含む Lプレート培地にて培養して細胞のリフレッシュを行い、リフレッシュされた各々の形質転換体を、グルコース 2 0 g、 N a 2 H P 0 29. 4 g、 KH₂P0₄ 6 g、 N a C 1 l g、 H.C 1 2 g、クェン酸ナトリウム 1 0 g、グルタミン酸ナトリウム 0. 4 g、 Mg S 0₄ · 7 H 2 O 3 g、 K C l 0. 2 3 g、サイアミン塩酸塩 2 m g、 L一チロシン 7 5 m gおよびクロラムフエ二コール 4 0 mgを純水 1 L中に含む培地（KOHを用いて p Hは 7. 0に調整されている）中で、 4 5°Cで 4 0時間培養した。培養後、菌体濃度、及び培地中に蓄積された L一フヱニルァラニンの量を測定した。 L—フヱニルァラニンの定量は、旭化成（株）製バイオテックアナライザ一 A S— 2 1 0を使用して行った。菌体濃度は、純水で 5 1倍に希釈した培養液の 6 6 0 nmにおける吸光度（OD_e6。）により測定した。その結果を表 3 に示す。表 3

この結果から、 g r o E遺伝子が導入された E. coliは、 L—フエ -ルァラニン生産性が向上したことが明らかである。実施例 5 r p o H遺伝子を導入した Lーリジン生産性ェシエリヒア · コリ

による Lーリジン生達

Lーリジン生産の宿主には、ェシエリヒア . コリ W3 1 1 0 ( t y r A) 株を用いた。 W3 1 1 0 ( t y r A) 株は、欧州特許公開 9 2年 4 8 8 4 2 4号公報に詳しい記載があるが、その調製方法について簡単にふれると以下の通りである。国立遺伝学研究所（静岡県三島市）より E. coli W3 1 1 0株を人手した。同株をストレブトマイシン含有の L Bプレー卜にまき、コロニーを形成する株を選択してストレプトマイシン耐性株を取得した。選択したストレプトマイシン耐性株と、 E. coli K-12 ME8424株を混合して、完全培地（い Broth：〗％ Bacto tryp ton, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl) で 3 7°Cの条件下、 1 5分間静置培養して接合を誘導した。 E. coli K-12 ME8424株は、（HfrP045， t i, relAl, ΐχτΑ ：: TnlO, ung-1, nadB) の遺伝形質を有し、国立遺伝学研究所より入手できる。その後、培養物を、ストレプトマイシン、テトラサイクリンおよび Lーチロシンを含有する完全培地（L- Broth： \% Bacto trypton, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 1.5% agar) にまき、コロニーを形成する株を選択した。この株を、 E. coli W3 1 10 ( t y r A) 株と命名した。

欧州特許公開 92年 488424号公報には、この菌株にプラスミドを導入して形成される株が多く記載されている。たとえば、プラスミド pHAT e r mを導入して得られる株は、ェシエリヒア · コリ W3 1 1 0 ( t y r A) p H AT e rmと命名され、 1 99 1年 1 1月 1 6日に通商産業省工業技術院生命工学ェ業技術研究所（郵便番号 305 日本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号）に、ブダペスト条約に基づき国際寄託されており、 F ERM B P— 3653の受託番号が付与されている。この菌株からプラスミド pHAT e r mを常法により脱落させることによってェシヱリヒア ' コリ W3 1 1 0 ( t y r A) 株を取得することができる。

このェシヱリヒア. コリ W3 1 1 0 ( t y r A) 株に、リジン生合成遺伝子を持つプラスミド R S F D 80を実施例 4に示した方法で導入した。 R S F D 80 は、 WO 95 1 604 2号国際公開パンフレットに記載されており、 L—リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする DNAと、 L一リジンによるフィードバック阻害が解除されたァスバルトキナーゼをコードする D N Aを含んでいる。 R S FD 80プラスミドを保持する E. coli JM109株は、 A J 1 2396と命名され、 1 993年 1 0月 28日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号 305 日本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号）に受託番号 F E RM P— 1 3936として寄託され、 1 994年 1 1月 1日にブダぺスト条約に基づく国際寄託に移管され、 F E RM

B P— 4 859の受託番号で寄託されている。

R S F D 80が導入された W 3 1 1 0 ( t y r A) 株の形質転換体は、 50〃 g, m lのストレプトマイシンを含むプレート培地にて選択した。

一方、 r p o H遺伝子導入用のプラスミドは次のように構築した。実施例 1の < 1 〉に示した方法により r p oH遺伝子を P CR法により増幅し、得られた増幅産物の両端を市販の DN A末端平滑化キッ卜（宝酒造社製、 B l u n t i n g k i t ) を用いて平滑末端化した後、ベクタープラスミド p MW 1 1 9 (和光純薬社製）の H i n c I I部位にクローニングし、プラスミド p MW r p o Hを得た。このプラスミドは上記の方法によりェシヱリヒア ' コリ W3 1 1 0 ( t y r A) / R S F D 80株へ導入した。プラスミドが導入された形質転換体は 50 μ g / m 1のストレプトマイシンと 50〃 m 1のアンピシリンを含む Lプレ一ト培地にて選択した。

以上のようにして得られたェシェリヒア . コリ W3 1 1 0 ( t y r A) R S FD 80株、ェシエリヒア · コリ W3 1 1 0 ( t y r A) ,'R S FD 80 + pM W r p o H株の L—リジン生産性を評価した。

得られた形質転換体の L一リジン生産性の評価は以下の様にして行った。 Lプレート培地にて培養して細胞のリフレツシュを行い、リフレツシュされた各々の形質転換体を、グルコース 40 g、 KH₂PO₄ l g、 Mn S0₄ ' 7 H₂0 0. 0 1 g、 F e S 0, · 7 H ₂0 0. 0 1 g、酵母エキス 2 g、 Lーチロシン 0. 1 , Mg S 0, · 7 H2O l g、 C a C 0 25 gを純水 1 L中に含む培地（KO Ηを用いて ρ Ηは 7. 0に調整されている）中で 37 °Cで 30時間培養した。この時、 L一リジン塩酸塩を初添で 4 0 g L加えたものについても培養を行った。 Lーリジンの定量を、旭化成（株）製バイオテックアナライザー A S 2 〗 0を使用して行った。表 4に、 Lーリジンの増加量（培養後の培地中の L一リジン量から初添 L一リジン量を引いたもの）を、 L—リジン塩酸塩の量として示した。表 4

L -リジン塩酸塩の生産量（g/L) 菌株初添 L-リジン塩酸塩（g/L)

0 4 0

W3110(tyrA)/RSFD80 9. 1 7 6. 3

3110(tyrA)/RSFD80 + pMWrpoH 9. 22 7. 64 この結果から、 r p o H遺伝子が導入されたェシヱリヒア · コリは高濃度の L 一リジン存在下でも、 r p o H遺伝子が導入されていない菌株より L —リジンの生産性が向上していることが明らかである。産業上の利用可能性本発明により、 H S Pと微生物の生育及び発酵生産物の生産性との関係が明らかにされ、アミノ酸等の有用物質の発酵生産において、ストレスの影響を減少させ、生産性や収率の低下を改善することができる。

配列表

(】）一般情報

(i) 出願人：味の素株式会社

(ϋ) 発明の名称：ストレス耐性微生物及び発酵生産物の製造法 (iii) 配列数： 4

(iv) 連絡先：

(A)宛名味の素株式会社

(B)番地京橋 1丁目 1 5 - 1

(C)市中央区

(D)州東京都

(E)国日本国

(F)Z1P 1 04

(V) コンピュ —タ読取り可能形式

(A)媒体：

(B)コンピュータ

(C)操作システム

(D)ソフトウェア

(vi) 現行出願データ

(A)出願番号

(B)出願日

(C)分類

(viii)代理人事務所情報

(A)名前：

(B)登録番号：

(C)整理番号：

(ix)通信情報

(A)電話番号：

(B)ファクシミリ番号

(2) 配列番号 1に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ： 20

(B) 種類：核酸

(C) 鎖の数：一本鎖

(D) トポロジー：直鎖状

(ii)分子タイプ：他の核酸合成ォリゴヌクレオチド

(xi)配列の説明：配列番号 1 CGGAACGAAG TTTGATATCA 20

(2) 配列番号 2に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ： 20

(B) 種類：核酸

(C) 鎖の数：一本鎖

(D) トポロジー：直鎖状

(ii)分子タイプ：他の核酸合成ォリゴヌクレオチド (xi)配列の説明：配列番号 2

ATCCAGGGTT CTCTGCTTAA 20

(2) 配列番号 3に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ： 20

(B) 種類：核酸

(C) 鎖の数：一本鎖

(D) トポロジー：直鎖状

(ii)分子タイプ：他の核酸合成オリゴヌクレオチド (xi)配列の説明：配列番号 3

GACGTCGATA GCAGGCCAAT 20

(2) 配列番号 4に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ： 20

(B) 種類：核酸

(C) 鎖の数：一本鎖

(D) トポロジー：直鎖状

(ii)分子タイプ：他の核酸合成オリゴヌクレオチド (xi)配列の説明：配列番号 4

GACGCACTCG CGTCGTCCGT 20

Claims

請求の範囲

1 . 微生物を培地中に培養し、その培地中に発酵生産物を生成蓄積させ、該発酵生産物を採取する、微生物を利用した発酵生産物の製造法において、

前記微生物が、ヒートショックタンパク質をコードする遺伝子及びヒートショックタンパク質遺伝子に特有に機能するび因子をコードする遺伝子の少なくとも一方が導入されて細胞内におけるヒートショックタンパク質の発現量が増強され、微生物の生育及び z又は発酵生産物の生産を抑制するストレスに対する耐性が付与されたことを特徴とする方法。

2 . 前記発酵生産物がァミノ酸である請求項 1記載の方法。

3 . 前記ストレスが、微生物の生育に好ましくない温度、培地の浸透圧、または目的とする発酵生産物である請求項 1記載の方法。

4 . ヒートショックタンパク質をコードする遺伝子が、 g r o Eである請求項 1記載の方法。

5 . ひ因子をコードする遺伝子が r p o Hである請求項 1記載の方法。

6 . 前記微生物が、エシリヒア属細菌またはコリネホルム細菌である請求項 1記載の方法。

7 . 発酵生産物を産生する微生物であって、ヒー卜ショックタンパク質をコ一ドする遺伝子及びヒートショックタンパク質遺伝子に特有に機能する σ因子をコードする遺伝子の少なくとも一方が導入されて細胞内におけるヒートショックタンパク質の発現量が増強され、微生物の生育及び又は発酵生産物の生産を抑制するストレスに対する耐性が付与された微生物。