TECHNISCHES GEBIET:
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Die folgende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung eines Fermentationsprodukts. Genauer betrifft
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur fermentativen
Herstellung von nützlichen Substanzen, wie Aminosäuren,
durch Verwendung von Mikroorganismen, und Mikroorganismen
mit einer hinzugefügten Resistenz gegenüber Stress, die
ansonsten die Herstellung von Fermentationsprodukten
hemmen kann.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG:
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Wenn Zellen Stress ausgesetzt sind, wie hoher Temperatur,
hohem osmotischen Druck, metabolitischer Hemmung,
Anwesenheit von Schwermetallen und viraler Infektion, wird
eine Familie von Proteinen, die als Hitzeschockproteine
(im folgenden als "HSP" bezeichnet) bezeichnet werden,
induziert, und innerhalb kürzester Zeit synthetisiert, um
eine Abwehrreaktion gegen Stress hervorzurufen. HSP weisen
eine breite Homologie von prokaryotischen Zellen bis zu
eukaryotischen Zellen auf und sie werden grob in
verschiedene Gruppen unterteilt (HSP 60-Gruppe, HSP 70-
Gruppe, HSP 90-Gruppe, TRiC-Gruppe und andere Gruppe)
(J. P. Hendrick und F. V. Hartl, Annu. Rev. Biochem., 62,
349-384 (1993)).
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Der Mechanismus der der durch HSP gezeigten
Stressresistenz, liegt in der Funktion des HSP zur Bildung
von höhergeordneten Strukturen der Proteine (Faltung der
Proteine). Wenn nämlich ein Protein aufgrund von Stress
denaturiert ist und dadurch unfähig wird, eine korrekte
höhere Struktur auszubilden, bindet HSP an das Protein und
das Protein wird einer Neufaltung in die korrekte höhere
Struktur unterworfen. Somit kann das Protein zu seiner
normalen Funktion zurückkehren.
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Es stellte sich heraus, dass HSP, dessen Funktion die
Bildung von höher geordneten Strukturen der Proteine, wie
oben beschrieben, ist, als molekulare Chaperone nicht nur
für denaturierte Proteine dienen, sondern ebenfalls für
Zellen im normalen Zustand durch das Verfahren der
Proteinfaltung, Assembly, Membrantransport usw..
Entsprechend wurde ihre Wichtigkeit erkannt und überall
gewürdigt (R. J. Ellis et al., Science, 250, 954-959
(1990)). Der Begriff "Chaperon" bedeutet "Unterstützer".
Diese Bezeichnung stammt von der Tatsache, dass HSP an
verschiedene Proteine bindet und seine Funktion aufzeigt.
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Die Expression von HSP ist in Zellen induziert, die Stress
ausgesetzt sind, wie oben beschrieben. Die Induktion ist
normalerweise temporär. Sie kommt schnell zum Stillstand
und ein neuer Gleichgewichtszustand wird erreicht. Es
wurde gezeigt, dass die Induktion von HSP auf
Transkriptionsebene erfolgt (D. C. Cowing et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 80, 2679-2683 (1985); Y. N. Zhou et
al., J. Bacteriol., 170, 3640-3649 (1988)). Es ist
bekannt, dass jedes der HSP-Familiengene eine
Promotorstruktur aufzeigt, die als "Hitzeschockpromotor"
bezeichnet wird und sigma-32 (σ³²), der ein σ (sigma) -
Faktor, der speziell für den Hitzeschockpromotor
funktioniert, ist, ist anwesend. Es ist bekannt, dass σ³²
ein Protein, codiert durch rpoH-Gen, mit einer extrem
kurzen Halbwertszeit von ca. 1 Minute ist und in enger
Beziehung zu der temporären Induktion von HSP steht (D. B.
Straus et al., Nature, 329, 348-351 (1987)). Es wurde
gezeigt, dass die Expressionskontrolle für σ³² selbst auf
Transkriptionsebene und auf Translationsebene erfolgt, die
Hauptkontrolle findet auf Translationsebene statt.
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Die Induktion von HSP durch Hitzeschock wird durch zwei
Mechanismen, das Erhöhung der synthetisierten Menge an 632
und deren Stabilisierung hervorgerufen. Für die Zunahme
der synthetisierten Menge an σ³² wurde gezeigt, dass die
Struktur von σ³² sich aufgrund der Hitze verändert und
dadurch die Translation beschleunigt ist (T. Yura et al.,
Annu. Rev. Microbiol., 47, 321-350 (1993)). Für die
Stabilisierung von σ³² wurde gezeigt, dass HSP (DnaK oder
dergleichen) am Abbau von σ³² teilnimmt, das eine
Feedback-Kontrolle durch HSP-Funktionen vermuten lässt
(K. Tilly et al., Cell, 34, 641-646 (1983); K. Liberek,
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89, 3516-3520 (1994)).
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Von Escherichia coli (E. coli) ist bekannt, dass das
Wachstum der Zellen in Anwesenheit von Stress in Beziehung
steht zu HSP, wie oben beschrieben (J. Meury et al., FEMS
Microbiol. Lett., 113, 93-100 (1993)). Es ist ebenfalls
bekannt, dass die Herstellung von humanem Wachstumshormon
durch dnaK geleistet wird und dass die Sekretion von
Procollagenase durch groE geleistet wird (R. C. Hockney,
Trends in Biotechnology, 12, 456 (1994)).
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JP-A-6-292582 beschreibt die Klonierung vom dnaK-Gen aus
einem thermophilen Mikroorganismus und dessen
Transformation in einen Wirt-Mikroorganismus. N. Kusukawa
und T. Yura berichten über das Hitzeschockprotein GroE von
E. coli und seiner schützenden Schlüsselrolle gegen
thermischen Stress (Genes and Development, Bd. 2, 1988,
Seiten 874 bis 882).
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Weiterhin diskutieren R. A. LaRossa und T. K. Van Dyk die
physiologische Rolle von dnaK- und groE-Stressproteinen
bei der Antwort auf einen Hitzeschock (Molecular
Microbiology, 1991, 5(3), Seiten 529 bis 534).
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Es ist allerdings keine Beziehung zwischen HSP und der
Herstellung von Fermentationsprodukten, wie Aminosäuren
und Nukleinsäuren und dergleichen, bekannt. Für
Coryneformbakterien ist keine Beziehung zwischen HSP und
Wachstum bekannt und es ist ebenfalls keine Beziehung
zwischen HSP und der Produktivität für
Fermentationsprodukte bekannt.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG:
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Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Aufklärung der
Beziehung zwischen HSP und dem Wachstum der
Mikroorganismen und zwischen HSP und der Produktivität von
Fermentationsprodukten, um den Einfluss von Stress, der
die Produktion von Fermentationsprodukten hemmt, zu
erniedrigen, so dass die Produktivität und die Ausbeute
verbessert sind, anstatt dass sie bei der Produktion von
nützlichen Substanzen, wie Aminosäuren, durch Fermentation
erniedrigt sind.
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Als Ergebnis ausführlicher Untersuchungen der Erfinder zur
Erlangung des obigen Ziels wurde gefunden, dass die
Produktivität durch Einführen eines Gens, codierend für
HSP, oder eines Gens, codierend für einen G-Faktor, der
speziell für das HSP-Gen funktioniert, und Erhöhung der
Expression von HSP verbessert werden kann. Somit wurde die
vorliegende Erfindung erreicht.
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Die vorliegende Erfindung liegt nämlich in einem Verfahren
zur Herstellung eines Fermentationsprodukts unter
Verwendung eines Mikroorganismus, umfassend die Schritte
des Kultivierens des Mikroorganismus in einem Medium zur
Herstellung des Fermentationsprodukts und Anreicherung des
Mediums und Sammeln des Fermentationsprodukts, wobei der
Mikroorganismus modifiziert ist durch Einführen von
entweder einem für ein Hitzeschockprotein codierendes Gen
oder Einführen eines für einen σ-Faktor codierenden Gens,
das speziell für dieses Hitzeschockproteingen
funktioniert, um die Expressionsmenge von HSP in den
Zellen zu erhöhen, wobei der Mikroorganismus eine erhöhte
Resistenz gegenüber Stress, der ansonsten die Herstellung
des Fermentationsprodukts einschränken würde, aufzeigt.
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In einem anderen Aspekt liegt die vorliegende Erfindung in
einem Mikroorganismus zur Herstellung eines
Fermentationsprodukts, wobei der Mikroorganismus
modifiziert ist durch Einfügen von entweder einem für ein
Hitzeschockprotein codierenden Gen oder einem für einen
σ-Faktor codierenden Gen, der speziell für das
Hitzeschockproteingen funktioniert, um die exprimierte
Menge des Hitzeschockproteins in den Zellen zu erhöhen,
wobei der Mikroorganismus eine erhöhte Resistenz gegenüber
Stress, der ansonsten die Herstellung des
Fermentationsprodukts einschränken würde, aufzeigt.
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Das Verfahren und der Mikroorganismus gemäss der
vorliegenden Erfindung behandelt verschiedene
Fermentationsprodukte, einschliesslich z. B. Aminosäuren,
wie L-Threonin, L-Lysin, L-Glutaminsäure, L-Leucin,
L-Isoleucin, L-Valin und L-Phenylalanin; Nukleinsäuren
oder Nucleoside, wie Guanylsäure, Inosin und Inosinsäure;
und andere Substanzen, wie Vitamine und Antibiotika.
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In einer bevorzugten Ausführungsform schliesst der Stress
Temperatur, osmotischen Druck des Mediums und eine hohe
Konzentration des Fermentationsprodukts, welche nicht
bevorzugt für das Wachstum des Mikroorganismus sind, ein.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform schliesst das
Gen, welches für das Hitzeschockprotein codiert,
insbesondere groE ein, und das Gen, codierend für den
σ-Faktor, schliesst insbesondere rpoH ein.
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In einer anderen bevorzugten Ausführungsform schliesst der
Mikroorganismus, auf den die vorliegende Erfindung
zutrifft, Bakterien, die zur Gattung Escherichia und
Coryneformbakterien gehören, ein.
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Die vorliegende Erfindung wird im folgenden ausführlicher
beschrieben.
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Das Fermentationsprodukt schliesst solche, hergestellt
durch Mikroorganismen, ein, einschliesslich z. B.
verschiedene L-Aminosäuren, wie L-Threonin, L-Lysin,
L-Glutaminsäure, L-Leucin, L-Isoleucin, L-Valin und
L-Phenylalanin; Nukleinsäuren, wie Guanylsäure, Inosin und
Inosinsäure; und andere Substanzen, wie Vitamine und
Antibiotika. Selbst für den Fall, dass diese Substanzen
bisher nicht unter Verwendung von Mikroorganismen
hergestellt wurden, kann diese Erfindung für solche
Substanzen angewendet werden, die durch Mikroorganismen
hergestellt werden, z. B. als Ergebnis einer erfolgreichen
genetischen Rekombination. Unter den beschriebenen
Substanzen wird das Verfahren bevorzugt auf solche
angewendet, die in das Medium sekretiert werden, um den
osmotischen Druck des Mediums zu erhöhen, insbesondere
solche wie Aminosäuren.
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Es besteht keine spezielle Begrenzung für den
Mikroorganismus, der durch Einführen von mindestens einem
der Gene, codierend für HSP, und dem Gen, codierend für
den σ-Faktor, der speziell für das HSP-Gen funktioniert,
zur Erhöhung der Expressionsmenge von HSP in den Zellen
modifiziert ist, wobei der Mikroorganismus eine erhöhte
Resistenz gegenüber Stress, der ansonsten die Herstellung
des Fermentationsprodukts einschränken würde, aufzeigt,
vorausgesetzt, dass der Mikroorganismus ein solcher ist,
der irgendein Fermentationsprodukt durch Fermentation
herstellt. Der Mikroorganismus schliesst solche ein, die
bisher zur Herstellung von Substanzen verwendet wurden,
einschliesslich z. B. denjenigen, die zur Gattung
Escherichia gehören, Coryneformbakterien, Bakterien, die
zur Gattung Bacillus gehören, und Bakterien, die zur
Gattung Serratia gehören. Ein bevorzugter Mikroorganismus
ist einer, bei dem ein DNA-Fragment, enthaltend einen
Replikationsursprung eines Plasmids, erhalten wird, das
HSP-Gen oder das Gen, codierend für den σ-Faktor, der
spezifisch für das HSP-Gen arbeitet und die Kopienzahl
dieser Gene im Mikroorganismus erhöht werden kann. Die
oben beschriebenen Coryneformbakterien sind eine Gruppe
von Mikroorganismen, wie in Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology, 8. Aufl., Seite 599 (1974),
beschrieben, sie sind aerobe und nicht-säurefeste,
grampositive Stäbchen ohne Sporenbildungsfähigkeit,
einschliesslich Bakterien, die zur Gattung Corynebacterium
gehören, Bakterien, die zur Gattung Brevibacterium
gehören, die bisher zur Gattung Brevibacterium
klassifiziert wurden, aber nun vereinheitlicht wurden als
Bakterien der Gattung Corynebacterium, und Bakterien, die
zur Gattung Brevibacterium gehören, die nahe verwandt sind
mit Bakterien, die zur Gattung Coryneformbacterium
gehören.
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Beispielhafte Mikroorganismen für jedes der
Fermentationsprodukte sind die folgenden. Für L-Threonin
geeignete schliessen z. B. ein: Escherichia coli VKPM
B-3996 (RIA 1867) (siehe US-PS 5 175 107) und
Corynebacterium acetoacidophilum AJ12318 (FERM BP-1172)
(siehe US-PS 5 188 949). Für L-Lysin geeignete schliessen
z. B. ein: Escherichia coli AJ11442 (NRRL B-12185, FERM
BP-1543) (siehe US-PS 4 346 170), Escherichia coli
W3110(tyrA) (dieser Stamm ist erhältlich aus Escherichia
coli W3110(tyrA)/pHATerm (FERM BP-3653) durch Entfernen
des Plasmids pHATerm, siehe WO95/16042), Brevibacterium
lactofermentum AJ12435 (FERM BP-2294) (siehe US-PS
5 304 476) und Brevibacterium lactofermentum AJ3990 (ATCC
31269) (siehe US-PS 4 066 501). Für L-Glutaminsäure
geeignete schliessen z. B. ein: Escherichia coli AJ12624
(FERM BP-3853) (siehe FR-PS 2 680 178), Brevibacterium
lactofermentum AJ12821 (FERM BP-4172) (siehe JP-OS 5 26811
und FR-PS 2 701 489), Brevibacterium lactofermentum
AJ12475 (FERM BP-2922) (siehe US-PS 5 272 067) und
Brevibacterium lactofermentum AJ13029 (FERM BP-5189)
(siehe WO95/01586). Für L-Leucin geeignete schliessen z. B.
ein: Escherichia coli AJ11478 (FERM P-5274) (siehe JP-OS
62-34397) und Brevibacterium lactofermentum AJ3718 (FERM
P-2516) (siehe US-PS 3 970 519). Für L-Isoleucin geeignete
schliessen z. B. ein: Escherichia coli KX141 (VKPM B-4781)
(siehe EP-PS 519 113) und Brevibacterium flavum AJ12149
(FERM BP-759) (siehe US-PS 4 656 135). Für L-Valin
geeignete schliessen z. B. ein: Escherichia coli VL1970
(VKPM B-4411) (siehe EP-PS 519 113) und Brevibacterium
lactofermentum AJ12341 (FERM BP-1763) (siehe US-PS
5 188 948). Für L-Phenylalanin geeignete schliessen z. B.
ein: Escherichia coli AJ12604 (FERM BP-3579) (siehe JP-OS
5-236947 und EP-PS 488 424) und Brevibacterium
lactofermentum AJ12637 (FERM BP-4160) (siehe FR-PS
2 686 898).
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Der für das erfindungsgemässe Verfahren verwendbare
Mikroorganismus schliesst Mikroorganismen, wie sie oben
beschrieben sind, ein, die unter die Definition fallen,
dass der Mikroorganismus modifiziert ist durch Einführen
von entweder einem für ein Hitzeschockprotein codierendes
Gen oder ein für einen σ-Faktor codierendes Gen, der
speziell für dieses Hitzeschockgen funktioniert, um die
Expressionsmenge des Hitzeschockproteins in den Zellen zu
erhöhen, wobei der Mikroorganismus eine erhöhte Resistenz
gegenüber Stress, der ansonsten die Herstellung des
Fermentationsprodukts einschränken würde, aufzeigt. Das in
den Mikroorganismus einfügbare Gen kann irgendein Gen
sein, das für HSP codiert, und ein Gen, das für den
σ-Faktor, der speziell für das HSP-Gen funktioniert,
codiert.
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Der Ausdruck "zur Erhöhung der Expressionsmenge von HSP"
bedeutet die Zunahme der Menge an HSP-Produktion eines
Mikroorganismus, der ursprünglich HSP herstellt, und
schliesst weiterhin ein, dass ein Mikroorganismus, der in
seinem ursprünglichen Zustand normalerweise im
wesentlichen kein HSP exprimiert, verändert wird, um HSP
zu exprimieren. Genauer wird die Erhöhung der
Expressionsmenge von HSP verwirklicht z. B. durch Einfügen
eines fremden oder endogenen HSP-Gens in
Mikroorganismuszellen und deren Expression. Bei einem
solchen Verfahren kann die Kopienzahl des HSP-Gens in
einer Zelle unter Verwendung eines autonom replizierbaren
Vektors in einer mikrobiologischen Zelle erhöht werden,
insbesondere als Vektor ein Plasmid vom Multicopytyp.
Alternativ kann die Expression von HSP ebenfalls effizient
erhöht werden unter Verwendung eines Promotors mit guter
Expressionswirksamkeit zur Erhöhung der Expressionsmenge
pro Einheit HSP-Gen. Alternativ kann HSP ebenfalls erhöht
werden durch Einfügen eines σ-Faktorgens, das speziell als
inhärenter Promotor für das HSP-Gen funktioniert, in die
mikrobiellen Zellen.
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Das für HSP codierende Gen schliesst z. B. ein aroE (Gen
für GroELS), dnaK (Gen für DnaK) und dnaJ (Gen für DnaJ).
Unter diesen ist groE bevorzugt. Der σ-Faktor, der
spezifisch für diese Gene funktioniert, wird beispielhaft
dargestellt durch rpoH, das für σ³² codiert.
Mikroorganismen, von denen diese Gene ursprünglich
stammen, sind nicht besonders beschränkt, vorausgesetzt,
dass jedes der Gene in der Lage ist, in einer
Mikroorganismenzelle zu arbeiten, die zur Gattung
Escherichia oder Coryneformbacterium gehört, und genauer
beispielweise Mikroorganismen, die zur Gattung Escherichia
und Coryneformbacterium gehören.
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Das rpoH-Gen und das groE-Gen von Escherichia coli wurden
mit ihrer Nukleotidsequenz bereits beschrieben (rpoH: J.
Bacteriol., 170, 3479484 (1988); groE: Nature, 333,
330-334 (1988)). Diese Gene können aus den Escherichia
coli-Chromosom mit Hilfe der Amplifikation gemäss PCR
(Polymerasekettenreaktion)-Verfahren unter Verwendung von
Oligonukleotid-Primern, die auf Basis der Sequenz
synthetisiert wurden, amplifiziert werden. Die
Nukleotidsequenzen der Primer zur Amplifizierung des rpoH-
Gens werden beispielhaft durch die SEQ ID Nrn. 1 und 2
gezeigt. Die Nukleotidsequenzen der Primer zur
Amplifikation des groE-Gens werden beispielhaft
dargestellt durch SEQ ID Nrn. 3 und 4.
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Es wurde berichtet, dass das dnaK-Gen und das groE-Gen von
Brevibacterium flavum mittels PCR-Verfahren unter
Verwendung von Primern, hergestellt auf Basis von bei
dnaK-Genen konservierten Aminosäuresequenzen oder den
groß-Genen von Escherichia coli und Bacillus subtilis,
isoliert wurden, und diese Gene sind stark homolog zu den
dnaK-Genen oder groß-Genen von anderen Mikroorganismen
(Abstracts of Lectures in the 1994 Meeting of the
Molecular Biology Society of Japan, Seite 395). Darauf
aufbauend wird erwartet, dass Gene, codierend für andere
HSPs (dnaJ-Gen, rpoH-Gen und dergleichen) ebenfalls eine
hohe Homologie mit jedem der Gene aus Escherichia coli
haben. Daher wurde angenommen, dass es einfach ist, diese
Gene aus Coryneformbacterium mittels
Hybridisierungsverfahren unter Verwendung der für HSP
codierenden Gene aus Escherichia coli oder mittels PCR-
Verfahren unter Verwendung von Sequenzteilen dieser Gene
zu isolieren.
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Um das oben erhaltene Gen in ein Bakterium der Gattung
Escherichia einzuführen, kann z. B. ein DNA-Fragment,
enthaltend dieses Gen, mit einem autonom replizierbaren
DNA-Vektor ligiert werden, um dieses in Bakterienzellen
der Gattung Escherichia einzuführen, und ein erhaltener
rekombinanter Vektor kann zur Transformation der Bakterien
der Gattung Escherichia verwendet werden. Um das oben
beschriebene Gen in einen anderen Mikroorganismus als
einem zur Gattung Escherichia gehörenden einzuführen, kann
ein DNA-Fragment, enthaltend das Gen, mit einem autonom
replizierbaren Vektor in Bakterienzellen eingeführt
werden, und ein erhaltener rekombinanter Vektor kann zur
Transformation des Mikroorganismus verwendet werden.
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Plasmidvektor DNA wird als Vektor DNA, wie sie
erfindungsgemäss verwendet werden kann, bevorzugt. Solche
für Bakterien der Gattung Escherichia geeignete, in die
das Gen eingeführt werden soll, schliessen z. B. pUC19,
pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399 und RSF1010 ein.
Alternativ können Phage DNA-Vektoren verwendet werden. Um
eine effiziente Expression von HSP zu erreichen, ist es
möglich, Promotoren, die in Mikroorganismen arbeiten, zu
verwenden, wie lac, trp und PL, anstelle des inhärenten
Promotors für das HSP-Gen. Um das HSP-Gen oder den α-
Faktor, der speziell für das HSP-Gen funktioniert, in den
Mikroorganismus einzuführen, kann DNA, enthaltend solch
ein Gen, in das Chromosom des Mikroorganismus gemäss einem
Verfahren unter Verwendung eines Transposon eingeführt
werden (D. E. Berg und C. M. Berg, Bio/Technol., 1, 417
(1983)), mit einem Mu-Phagen (JP-OS 2-109985) oder durch
homologe Rekombination (Experiments in Molecular Genetics,
Cold Spring Harbor Lab. (1972)).
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Die erfindungsgemäss verwendbare Vektor-DNA schliesst
Plasmidvektoren, die autonom in Coryneformbacterium
replizieren, ein, einschliesslich z. B. pAM 330 (JP-PS
1-11280) und pHM1519 (siehe JP-OS 58-77895), wenn der
Mikroorganismus, in den das Gen eingeführt werden soll,
ein Coryneformbacterium ist.
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Das Verfahren zur Transformation unterscheidet sich nicht
besonders von bekannten zur Herstellung von Transformanten
von Mikroorganismen. Im Fall von Bakterien der Gattung
Escherichia kann die Transformation z. B. gemäss dem
Verfahren von D. M. Morrison (Methods in Enzymology, 68,
326 (1979)) durchgeführt werden, einem Verfahren zur
Behandlung der Rezipientenzellen mit Calciumchlorid, um
die Permeabilität für die DNA zu erhöhen (M. Mandel und
A. Higa, J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) oder dergleichen.
Coryneformbakterien können gemäss dem Verfahren von Mandel
et al., wie oben genannt, transformiert werden, oder mit
einem Verfahren zur Einführung während der
Proliferationsphase (um sogenannte kompetente Zellen
bereitzustellen), so dass die Zellen DNA inkorporieren
können, wie für Bacillus subtilis berichtet (C. H. Duncan,
G. A. Wilson und F. E. Young, Gene, 1, 153 (1977)).
Alternativ kann rekombinante DNA ebenfalls nach Umwandlung
der DNA-Rezipientenzellen in Protoplasten oder
Sphäroplasten eingeführt werden, diese können einfach
rekombinante DNA einfügen, wie für Bacillus subtilis,
Actinomyces und Hefe bekannt (S. Chang und S. N. Choen,
168, 111 (1979); M. J. Bibb, J. M. Ward und O. A. Hopwood,
Nature, 274, 398 (1978); A. Hinnen, J. B. Hicks und G. R.
Funk, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 1929 (1978)).
Alternativ kann rekombinante DNA in die Bakterien der
Gattung Brevibacterium oder Corynebacterium gemäss einem
elektrischen Impulsverfahren eingeführt werden (Sugimoto
et al., JP-OS 2-207791).
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Gewöhnliche Mikroorganismen unterliegen einer
Wachstumsbeschränkung und Abnahme der Produktivität und
Ausbeute des Fermentationsprodukts, wenn sie aufgrund der
Erhöhung der Kultivierungstemperatur, hohem osmotischen
Druck aufgrund des Fermentationsprodukts oder hoher
Konzentration von Mediumkomponenten oder metabolischen
Abnormalitäten, assoziiert mit der Produktion des
gewünschten Fermentationsprodukts, Stress ausgesetzt sind.
Im Gegensatz dazu ist es möglich, eine zusätzliche
Resistenz gegenüber Stress durch erhöhte Expression von
HSP hinzugegeben. Als Ergebnis ist es möglich, die
Produktivität des Fermentationsprodukts in Umgebungen, in
denen Mikroorganismen unter Stress leiden, wie oben
beschrieben, zu erhöhen. Die Resistenz gegenüber Stress
bedeutet nicht komplette Resistenz und schliesst daher
auch Eigenschaften ein, die den Stresseinfluss
erniedrigen. Sowohl die Wachstumsbeschränkung als auch die
Abnahme der Produktivität und Ausbeute des
Fermentationsprodukts sind nicht notwendigerweise
desensitiviert aufgrund der Genart, die eingeführt werden
soll, und aufgrund des Typs von Wirt-Mikroorganismus. Es
kommt manchmal vor, dass die Ausbeute an
Fermentationsprodukt verbessert ist, obwohl das Wachstum
eingeschränkt ist. Der Stress, gegen den die Resistenz
gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren eingeführt werden
kann, schliesst z. B. ein, Temperatur, osmotischen Druck
eines Mediums und hohe Konzentration an Aminosäure im
Medium, die nicht förderlich ist für das Wachstum der
Mikroorganismen.
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Das Medium zur Fermentationsherstellung, wie es im
erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden kann, kann
ein allgemein bekanntes Medium sein, wie es bisher
verwendet wurde, in Abhängigkeit von den verwendeten
Mikroorganismen. Das heisst, ein gewöhnliches Medium,
enthaltend eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle,
anorganische Ionen und gegebenenfalls andere organische
Komponenten. Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung
ist kein spezielles Medium erforderlich.
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Als Kohlenstoffquelle sind z. B. Zucker, wie Glucose,
Lactose, Galactose, Fructose und Stärkehydrolysate;
Alkohole, wie Glycerin und Sorbitol; und organische
Säuren, wie Fumarsäure, Zitronensäure und Bernsteinsäure,
geeignet. Als Stickstoffquellen sind z. B. anorganische
Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und
Ammoniumphosphat; organischer Stickstoff, wie
Sojabohnenhydrolysat; Ammoniakgas; und wässriges Ammoniak
geeignet.
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Es ist gewünscht, dass es auch organische Spurenelemente
enthält, notwendige Substanzen, wie Vitamin B&sub1;,
L-Homoserin und L-Tyrosin; Hefeextrakt oder dergleichen in
entsprechenden Mengen. Abgesehen davon können, wenn
notwendig, kleine Mengen an Kaliumphosphat,
Magnesiumsulfat, Eisenionen, Magnesiumionen usw. zugegeben
werden.
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Die Kultivierung kann unter allgemein bekannten
Bedingungen, wie sie bisher verwendet werden, in
Abhängigkeit des verwendeten Mikroorganismus durchgeführt
werden. Die Kultivierung wird bevorzugt z. B. unter aeroben
Bedingungen für 16 bis 120 Stunden durchgeführt. Die
Kultivierungstemperatur wird reguliert auf 25 bis 45ºC und
der pH wird während der Kultivierung auf 5 bis 8
reguliert. Für die pH-Einstellung ist es möglich,
anorganische und organische, saure oder alkalische
Substanzen, Ammoniakgas usw. zu verwenden.
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In der vorliegenden Erfindung wird das Metabolitprodukt
aus dem Flüssigmedium nach Beendigung der Kultivierung
gesammelt, ohne dass ein spezielles Verfahren notwendig
ist. Das heisst, die vorliegende Erfindung kann
durchgeführt werden durch Kombination von Verfahren, wie
Ionenaustauscherharz, Präzipitation u. a., wie sie bisher
allgemein bekannt sind.
BESTE MÖGLICHKEIT ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG:
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Die vorliegende Erfindung wird mit Bezug auf die Beispiele
detaillierter beschrieben.
BEISPIEL 1
Herstellung von Plasmiden zur Einführung von rpoH-Gen und
groE-Gen:
(1) Klonierung des rpoH-Gens und groE-Gens:
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Ein rpoH-Gen und ein groß-Gen von Escherichia coli wurden
gemäss dem PCR-Verfahren (Polymerasekettenreaktion)
kloniert. Die beim PCR-Verfahren verwendeten Primer wurden
auf Basis der Sequenz des rpoH-Gens (J. Bacteriol., 170,
3479-3484 (1988)) und des roß-Gens (Nature, 333, 330-334
(1988)) von Escherichia coli, wie sie beschrieben wurden,
synthetisiert. Die Oligonukleotide mit den
Nukleotidsequenzen gemäss SEQ ID Nr. 1 (5'-Seite) und SEQ
ID Nr. 2 (3'-Seite) wurden als Primer zur Amplifizierung
des rpoH-Gens synthetisiert. Die Oligonukleotide mit den
Nukleotidsequenzen gemäss SEQ ID Nr. 3 (5'-Seite) und SEQ
ID Nr. 4 (3'-Seite) wurden als Primer zur Amplifikation
des rhoE-Gens synthetisiert.
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Primer zur Amplifikation des rpoH-Gens:
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5'-Seite: 5'-CGGAACGAAGTTTGATATCA-3' (SEQ ID Nr. 1)
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3'-Seite: 5'-ATCCAGGGTTCTCTGCTTAA-3' (SEQ ID Nr. 2)
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Primer zur Amplifizierung des groE-Gens:
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5'-Seite: 5'-GACGTCGATAGCAGGCCAAT-3' (SEQ ID Nr. 3)
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3'-Seite: 5'-GACGCACTCGCGTCGTCCGT-3' (SEQ ID Nr. 4)
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Die chromosomale DNA wurde aus E. coli K-12 gemäss einem
Verfahren von Saito et al. extrahiert (H. Saito und
K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)) und es
wurde als Template zur Durchführung der PCR unter
Verwendung der oben beschriebenen Oligonukleotide als
Primer verwendet.
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Die Reaktion wurde über 25 Zyklen in der PCR wiederholt.
Jeder Zyklus umfasste Hitzedenaturierung (94ºC, 1 Minute),
Annealen (37ºC, 2 Minuten) und Polymerasereaktion (72ºC, 3
Minuten).
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Beide Enden des erhaltenen, amplifizierten Produkts wurden
mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen DNA-Blunt End-
Bildungskits (hergestellt von Takara Shuzo, Blunting kit),
glattgeschnitten. Danach wurden die Produkte entsprechend
in eine HincII-Stelle eines Plasmidvektors pSTV28
(hergestellt von Takara Shuzo) kloniert, um die Plasmide
pSTV28-rpoH und pSTV28-groE zu erhalten.
(2) Einführen des Replikationsursprungs aus
Coryneformbacterium in das Plasmid, enthaltend rpoH-Gen,
und dem Plasmid, enthaltend rhoE-Gen:
-
Um pSTV28-rpoH in Coryneformbakterien autonom replizierbar
zu machen, wurde ein Replikationsursprung (JP-OS 5-007491)
aus einem bereits erhaltenen Plasmid pHM1519, das autonom
in Coryneformbakterien repliziert (K. Miwa et al., Agric.
Biol. Chem., 48 (1984), 2901-2903), in pSTV28-rpoH
eingeführt. Genauer wurde pHM1519 mit den
Restriktionsenzymen BamHI und KpnI verdaut, um ein DNA-
Fragment, enthaltend den Replikationsursprung, zu
erhalten. Das erhaltene Fragment wurde unter Verwendung
eines DNA-Blunt End-Bildungskit (hergestellt von Takara
Shuzo, Blunting kit) glattgeschnitten und anschliessend
wurde ein KpnI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) mit
den Enden ligiert. Das Fragment wurde in eine KpnI-Stelle
von pSTV28-rpoH eingefügt, um pRPH zu erhalten.
Andererseits wurde ein Plasmid pHSG399 ohne rpoH-Gen als
Kontrolle verwendet. Der Replikationsursprung aus pHM1519
wurde ebenfalls in eine SalI-Stelle des Kontrollplasmids
unter Verwendung eines SalI-Linkers (hergestellt von
Takara Shuzo) eingefügt, um pSAC4 zu erhalten.
BEISPIEL 2
Herstellung von L-Glutaminsäure durch
L-Glutaminsäureproduzierendes Bakterium mit eingefügtem rpoH-Gen:
-
pRPH und pSAC4, wie oben hergestellt, wurden in
Brevibacterium lactofermentum AJ12821 (FERM BP-4172) mit
einer L-Glutaminsäure-produzierenden Fähigkeit eingefügt.
Die L-Glutaminsäure-Produktivität der Transformanten,
enthaltend jeweils die eingeführten Plasmide, wurde
untersucht. Die Plasmide wurden in die Zellen von
Brevibacterium lactofermentum unter Verwendung eines
elektrischen Impulsverfahrens (JP-OS 2-207791) eingefügt.
-
Die die eingefügten Plasmide enthaltenden Transformanten
wurden auf einem Plattenmedium (10 g Polypepton, 10 g
Hefeextrakt, 5 g Glucose, 5 g NaCl und 15 g Agar in 1 l
reinem Wasser, pH 7,2, im folgenden als "CM2G-
Plattenmedium" bezeichnet), enthaltend 4 ug/ml
Chloramphenicol, selektioniert.
-
Die L-Glutaminsäure-Produktivität der erhaltenen
Transformanten wurde wie folgt bestimmt. Jede der
Transformanten wurde auf CM2G-Plattenmedium kultiviert, um
die Zellen aufzufrischen. Jede der aufgefrischten
Transformanten wurde bei 35ºC für 20 Stunden in einem
Medium, enthaltend 80 g Glucose, 1 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,4 g
MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 30 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,01 g FeSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,01 g
MnSO&sub4;·7H&sub2;O, 15 ml Sojabohnenhydrolysatlösung, 200 ug
Thiamin-hydrochlorid, 300 ug Biotin, 4 mg Chloramphenicol
und 50 g CaCO&sub3; in 1 l reinem Wasser (mit KOH auf einen pH
von 8,0 eingestellt), kultiviert. Üblicherweise wird
Brevibacterium lactofermentum bevorzugt bei einer
Kultivierungstemperatur von 31 bis 32ºC kultiviert.
-
Die Bakterienzellkonzentration und die Menge an mit
L-Glutaminsäure angereichertem Medium wurde nach
Kultivierung gemessen. L-Glutaminsäure wurde mit Hilfe
eines Biotech Analyzer AS-210, hergestellt von Asahi
Chemical Industry, quantitativ bestimmt. Die
Bakterienzellkonzentration der Kulturflüssigkeit, mit
0,2 N Salzsäure 51-fach verdünnt, wurde durch Messen der
Absorption bei 660 nm (OD&sub6;&sub6;&sub0;) bestimmt. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 1 gezeigt.
TABELLE 1
-
Wie aus den Ergebnissen ersichtlich, war trotz
eingeschränktem Wachstum die L-Glutaminsäure-Produktivität
des L-Glutaminsäure-produzierenden Bakteriums
Brevibacterium lactofermentum, enthaltend das eingeführte
rpoH-Gen, verbessert.
BEISPIEL 3
Herstellung von L-Lysin durch L-Lysin-produzierendes
Bakterium mit eingefügtem rpoH-Gen:
-
pRPH und pSAC4, wie oben hergestellt, wurden in
Brevibacterium lactofermentum AJ12435 (FERM BP-2294)
eingefügt, dieser zeigt eine Resistenz gegenüber S-(2-
Aminoethyl)-L-cystein auf und hat eine
L-Lysinproduzierende Fähigkeit aufgrund einer Mutation von
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. Die L-Lysin-
Produktivität der Transformanten, die jeweils das
eingefügte Plasmid enthalten, wurden untersucht.
-
Die Plasmide wurden in die Zellen von Brevibacterium
lactofermentum unter Verwendung eines elektrischen
Impulsverfahrens (JP-OS 2-207791) eingefügt.
-
Die die Plasmide enthaltenden Transformanten wurden auf
einem CM2 G-Plattenmedium (enthaltend 10 g Polypepton, 10 g
Hefeextrakt, 5 g Glucose, 5 g NaCl und 15 g Agar in 1
reinem Wasser, pH 7,2), enthaltend 4 ug/ml
Chloramphenicol, selektioniert.
-
Die L-Lysin-Produktivität der erhaltenen Transformanten
wurde wie folgt bestimmt. Jede der Transformanten wurde
auf CM2 G-Plattenmedium kultiviert, um die Zellen
aufzufrischen. Jede der aufgefrischten Transformanten
wurde bei 31,5ºC für 60 Stunden in einem Medium,
enthaltend 100 g Glucose, 1 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,4 g MgSO&sub4;&sub7;H&sub2;O,
30 g (NH4)2SO&sub4;, 0,01 g FeSO&sub4;&sub7;H&sub2;O, 0,01 g MnSO&sub4;-7H&sub2;O,
15 ml Sojabohnenhydrolysatlösung, 200 ug
Thiaminhydrochlorid, 300 ug Biotin, 4 mg Chloramphenicol und 50 g
CaCO&sub3; in 1 l reinem Wasser (mit KOH auf einen pH von 8,0
eingestellt), kultiviert. Die Bakterienzellkonzentration
und die Menge an mit L-Lysin angereichertem Medium wurde
nach Kultivierung gemessen. L-Lysin wurde mit Hilfe eines
Biotech Analyzer AS-210, hergestellt von Asahi Chemical
Industry, quantitativ als L-Lysin-hydrochlorid bestimmt.
Die Bakterienzellkonzentration der Kulturflüssigkeit, mit
0,2 N Salzsäure 51-fach verdünnt, wurde durch Messen der
Absorption bei 660 nm (OD&sub6;&sub6;&sub0;) bestimmt. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 2 gezeigt.
TABELLE 2
-
Wie in Tabelle 2 gezeigt war das Wachstum gut und die
L-Lysin-Produktivität des L-Lysin-produzierenden
Bakteriums von Brevibacterium lactofermentum, enthaltend
das eingefügte rpoll-Gen, war ebenfalls verbessert. Es wird
angenommen, dass dieses Ergebnis durch die Verminderung
des Einflusses von erhöhtem osmotischen Druck aufgrund der
Anreicherung von L-Lysin begründet ist.
BEISPIEL 4
Herstellung von L-Phenylalanin durch
L-Phenylalaninproduzierende Escherichia coli mit eingefügten groE-Gen:
-
pSTV28-groE oder pSTV28, wie oben hergestellt, wurden in
ein Phenylalanin-produzierendes Bakterium, AJ12605 (FERM
BP-3579), gezogen aus Escherichia coli K-12, eingefügt.
Die L-Phenylalanin-Produktivität der Transformanten, die
jeweils das eingefügte Plasmid enthalten, wurden
untersucht.
-
Die Plasmide wurden unter Verwendung eines elektrischen
Impulsverfahrens eingefügt (JP-OS 2-207791). Die
Transformanten mit den enthaltenen Plasmiden wurden auf
einem Plattenmedium (enthaltend 10 g Polypepton, 5 g
Hefeextrakt, 5 g NaCl und 15 g Agar in 1 l reinem Wasser,
pH 7,2; im folgenden als "L-Plattenmedium" bezeichnet),
enthaltend 40 ug/ml Chloramphenicol, selektioniert.
-
Die L-Lysin-Produktivität der erhaltenen Transformanten
wurde wie folgt bestimmt. Jede der Transformanten wurde
auf L-Plattenmedium, enthaltend 40 mg/t Chloramphenicol,
kultiviert, um die Zellen aufzufrischen. Jede der
aufgefrischten Transformanten wurde bei 45ºC für 40
Stunden in einem Medium, enthaltend 20 g Glucose, 29,4 g
Na&sub2;HPO&sub4;, 6 g KH&sub2;PO&sub4;, 1 g NaCl, 2 g NH&sub4;Cl, 10 g
Natriumcitrat, 0,4 g Natriumglutamat, 3 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O,
0,23 g KCl, 2 mg Thiamin-hydrochlorid, 75 mg L-Tyrosin und
40 mg Chloramphenicol in 1 t reinem Wasser (mit KOH auf
einen pH von 7,0 eingestellt), kultiviert. Die
Bakterienzellkonzentration und die Menge an mit
L-Phenylalanin angereichertem Medium wurde nach
Kultivierung gemessen. L-Phenylalanin wurde mit Hilfe
eines Biotech Analyzer AS-210, hergestellt von Asahi
Chemical Industry, quantitativ bestimmt. Die
Bakterienzellkonzentration, mit reinem Wasser 51-fach
verdünnt, wurde durch Messen der Absorption bei 660 nm
(OD&sub6;&sub6;&sub0;) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3
gezeigt.
TABELLE 3
-
Aus den Ergebnissen ist klar, dass die Produktivität von
L-Phenylalanin in E. coli mit eingefügtem groE-Gen
verbessert ist.
BEISPIEL 5
Herstellung von L-Lysin durch L-Lysin-produzierende
Escherichia coli mit eingefügten rpoH-Gen:
-
Escherichia coli W3110 (tyrA)-Stamm wurde als Wirt für die
L-Lysin-Produktion verwendet. W3110 (tyrA)-Stamm ist in
EP-PS 488 424 (1992) ausführlich beschrieben. Sein
Herstellungsverfahren wird aber nachstehend kurz
beschrieben.
-
E. coli W3110 wurde vom National Institute of Genetics
(Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japan) erhalten. Dieser Stamm
wurde auf LB-Platten, enthaltend Streptomycin,
ausplattiert und Stämme, die Kolonien bildeten, wurden
selektioniert, um Streptomycin-resistente Stämme zu
erhalten. Der ausgewählte Streptomycin-resistente Stamm
wurde mit. E. coli K-12 ME8424 gemischt, um eine
Konjugation durch stationäre Kultivierung derselben für 15
Minuten bei 37ºC in einem Komplettmedium (L-Broth: 1%
Bactotrypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl) zu erhalten.
E. coli K-12 ME8424 hat die inhärenten Eigenschaften von
(HfrP045, thi, relAl, tyrA::Tn10, ung-11, nadB) und ist
erhältlich von National Institute of Genetics. Nach der
Konjugation wurde die Kultur über ein Komplettmedium
ausplattiert (L-Broth: 1% Bactotrypton, 0,5%
Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 1,5% Agar), enthaltend
Streptomycin, Tetracyclin und L-Tyrosin, um einen Stamm zu
selektionieren, der Kolonien bildet. Dieser Stamm wurde
als E. coli W3110 (tyrA) bezeichnet.
-
Viele Stämme, die durch Einfügen von Plasmiden in diesen
Stamm gebildet wurden, sind in EP-PS 488 424 (1992)
beschrieben. Zum Beispiel ein Stamm, erhalten durch
Einfügen eines Plasmids pHATerm, der als Escherichia coli
W3110 (tyrA/pHATerm) bezeichnet wurde. Dieser wurde beim
National Institute of Bioscience and Human Technology of
Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi
1-chome, tsukuba-shi, ibaraki-ken, 305 Japan) gemäss
Budapester Vertrag am 16. November 1991 mit der
Hinterlegungsnummer FERM BP-3653 hinterlegt. Escherichia
coli W3110 (tyrA) kann erhalten werden durch Entfernen des
Plasmids pHATerm aus diesem Bakterienstamm mit Hilfe
herkömmlicher Verfahren.
-
Ein Plasmid RSFD80 mit einem Gen für die Lysin-Biosynthese
wurde in Escherichia coli W3110 (tyrA) gemäss dem
Verfahren von Beispiel eingeführt. RSFD80 ist in
WO95/16042 beschrieben und enthält eine DNA, codierend für
Dihydrodipicolinat-Synthase mit desensitivierter
Rückhemmung durch Lysin, und eine DNA, codierend für
Aspartokinase mit desensitivierter Rückhemmung durch
L-Lysin. E. coli JM109, enthaltend das RSFD80-Plasmid,
wurde als AJ12396 bezeichnet und wurde hinterlegt beim
National Institute of Bioscience and Human Technology of
Agency of Institute Science and Technology (1-3, Higashi
1-chome, tsukuba-shi, ibaraki-ken, 305 Japan) am 28.
Oktober 1993 mit der Hinterlegungsnummer FERM P-13936 und
aus der öffentlichen Hinterlegung in eine internationale
Hinterlegung gemäss Budapester Vertrag am 1. November 1994
transferiert mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-4859.
-
Eine Transformante vom W3110 (tyrA)-Stamm, bei dem RSFD80
eingefügt wurde, wurde auf einem Plattenmedium, enthaltend
50 ug/ml Streptomycin, selektioniert.
-
Andererseits wurde ein Plasmid zum Einfügen des rpoH-Gens
wie folgt konstruiert. Das rpoH-Gen wurde mittels PCR-
Verfahren gemäss dem in Punkt (1) von Beispiel 1
beschriebenen Verfahren amplifiziert. Ein erhaltenes
Amplifizierungsprodukt wurde an beiden Enden mit Hilfe
eines kommerziell erhältlichen DNA-BLUNTEND-Bildungskits
(hergestellt von Takara Shuzo, Blunting kit)
glattgeschnitten und dann in eine HincII-Stelle des
Plasmidvektors pMW119 (hergestellt von Wako Pure Chemical
Industries) kloniert, um das Plasmid pMWrpoH zu erhalten.
Dieses Plasmid wurde in Escherichia coli W3110
(tyrA)/RSFD80 gemäss dem oben beschriebenen Verfahren
eingeführt. Eine Transformante, enthaltend das eingefügte
Plasmid, wurde auf einem L-Plattenmedium, enthaltend
50 ug/ml Streptomycin und 50 ug/ml Ampicillin,
selektioniert.
-
Die L-Lysin-Produktivität wurde für Escherichia coli W3110
(tyrA)/RSFD80 und Escherichia coli W3110
(tyrA)/RSFD80+pMWrpoH, wie oben erhalten, bestimmt.
-
Die L-Lysin-Produktivität der erhaltenen Transformanten
wurde wie folgt bestimmt. Die Transformanten wurden auf
L-Plattenmedium kultiviert, um die Zellen aufzufrischen.
Jede der aufgefrischten Transformanten wurde bei 37ºC für
30 Stunden in einem Medium, enthaltend 40 g Glucose, 1 g
KH&sub2;PO&sub4;, 0,01 g MnSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,01 g FeSO&sub4;·7H&sub2;O, 2 g
Hefeextrakt, 0,1 g L-Tyrosin, 1 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O und 25 g
CaCO&sub3; in 1 l reinem Wasser (mit KOH auf pH 7,0
eingestellt) kultiviert. Bei diesem Experiment wurden die
Transformanten ebenfalls im gleichen Medium kultiviert,
mit dem Unterschied, dass anfänglich 40 g/t
L-Lysinhydrochlorid zugegeben wurden. L-Lysin wurde mit Hilfe des
Biotec Analyzer AS 210, hergestellt von Asahi Chemical
Industry, quantitativ bestimmt. Tabelle 4 zeigt die
Zunahme der L-Lysin-Mengen (erhalten durch Abziehen der
Menge an anfänglich zugegebenem L-Lysin von der Menge an
L-Lysin in dem Medium nach Kultivierung) als Mengen an
L-Lysin-hydrochlorid.
TABELLE 4
-
Aus den Ergebnissen ist klar, dass die L-Lysin-
Produktivität in Escherichia coli, enthaltend das
eingefügte rpoH-Gen, selbst in Anwesenheit von hohen
Konzentrationen an L-Lysin, im Vergleich zu dem Stamm,
enthaltend kein eingefügtes rpoH-Gen, verbessert war.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT:
-
Die Beziehung zwischen HSP und dem Wachstum von
Mikroorganismen und zwischen HSP und der Produktivität von
Fermentationsprodukten wurde mit der vorliegenden
Erfindung aufgeklärt. Somit ist es möglich, den Einfluss
von Stress zu erniedrigen und die Verschlechterung der
Produktivität und Ausbeute von Fermentationsprodukten von
nützlichen Substanzen, wie Aminosäuren, zu verbessern.
SEQUENZLISTE
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
-
(i) ANMELDER
-
(A) NAME: Ajinomoto Co., Inc.
-
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG:
-
Stressresistenter Mikroorganismus und Verfahren zur
Herstellung eines Fermentationsprodukts
-
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4
-
(iv) KORRESPONDENZADRESSE
-
(A) NAME: Ajinomoto Co., Inc.
-
(B) STRASSE: Kyobashi 1-chome, 15-1
-
(C) ORT: Chuo-ku
-
(D) BUNDESLAND: Tokyo-to
-
(E) LAND: Japan
-
(F) POSTLEITZAHL: 104
-
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
-
(A) DATENTRÄGER:
-
(B) COMPUTER:
-
(C) BETRIEBSSYSTEM:
-
(D) SOFTWARE:
-
(vi) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
-
(A) ANMELDUNG NR.:
-
(B) ANMELDETAG:
-
(C) KLASSIFIZIERUNG:
-
(vii) DATEN DER PRIORITÄTSANMELDUNG:
-
(A) ANMELDUNG NR.:
-
(B) ANMELDETAG:
-
(viii)ANWALT/VERTRETER INFORMATION:
-
(A) NAME:
-
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER:
-
(C) REFERENZ/AKTENNUMMER:
-
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
-
(A) TELEFON:
-
(B) TELEFAX:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 1
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
-
(A) LÄNGE: 20
-
(B) ART: Nukleinsäure
-
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
-
(D) TOPOLOGIE: linear
-
(ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
-
(A) BESCHREIBUNG: synthetisches Oligonukleotid
-
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 1
-
CGGAACGAAG TTTGATATCA 20
-
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 2
-
(1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
-
(A) LÄNGE: 20
-
(B) ART: Nukleinsäure
-
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
-
(D) TOPOLOGIE: linear
-
(ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
-
(A) BESCHREIBUNG: synthetisches Oligonukleotid
-
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 2
-
ATCCAGGGTT CTCTGCTTAA 20
-
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 3
-
(1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
-
(A) LÄNGE: 20
-
(B) ART: Nukleinsäure
-
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
-
(D) TOPOLOGIE: linear
-
(ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
-
(A) BESCHREIBUNG: synthetisches Oligonukleotid
-
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 3
-
GACGTCGATA GCAGGCCAAT 20
-
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 4
(1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
-
(A) LÄNGE: 20
-
(B) ART: Nukleinsäure
-
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
-
(D) TOPOLOGIE: linear
-
(ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
-
(A) BESCHREIBUNG: synthetisches Oligonukleotid
-
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 4
-
GACGCACTCG CGTCGTCCGT 20