JPH0856668A - 新規dna断片 - Google Patents

新規dna断片

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JPH0856668A
JPH0856668A JP6199814A JP19981494A JPH0856668A JP H0856668 A JPH0856668 A JP H0856668A JP 6199814 A JP6199814 A JP 6199814A JP 19981494 A JP19981494 A JP 19981494A JP H0856668 A JPH0856668 A JP H0856668A
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dna
val
ala
glu
dna fragment
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JP6199814A
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Inventor
Tomoko Man
朋子 満
Yoko Asai
陽子 浅井
Miki Kobayashi
幹 小林
Hideaki Yugawa
英明 湯川
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Mitsubishi Chemical Corp
Original Assignee
Mitsubishi Chemical Corp
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 コリネ型細菌、例えば、ブレビバクテリウム
・フラバムMJ−233由来のDnak蛋白質をコード
する遺伝子を含むDNA断片。 【効果】 本発明のDNA断片は、目的蛋白質の活性の
増大、ライフの延長、生成・分泌量の増加等を目的とす
る微生物の遺伝子工学的育種改良に利用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、熱ショック蛋白質の一
つであるDnaK蛋白質をコードする遺伝子を含むDN
A断片に関する。生物の細胞、組織等を熱ショック等の
ストレスにさらした時に誘導される一群の熱ショック蛋
白質は、細胞内蛋白質の折りたたみ、会合、膜透過、分
解等の過程に分子シャペロン(介添え役)として働き、
細胞をストレスから守り、恒常性を維持するうえで重要
な役割を果たしている[蛋白質核酸酵素、37巻、15
号、ページ1(1992)]。これら熱ショックタンパ
ク質の中で、DnaK蛋白質は、細胞内蛋白質の折りた
たみ、蛋白質の分解等に関与していることが知られてお
り、このDnaK蛋白質をコードする遺伝子は、蛋白質
の生産等への利用が期待されている。
【0002】
【従来の技術】一群の熱ショック蛋白質をコードする遺
伝子のなかでDnaK蛋白質をコードする遺伝子(以下
これを「dnaK遺伝子」ということがある)は、原核
生物では、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)由
来の遺伝子〔プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユナイテッド・ス
テイツ・オブ・アメリカ(Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA)、81巻、ページ848(198
4)〕、バチルス・サチルス(Bacillus subtilis)由
来の遺伝子〔ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nu
cleic Acid Research)、15巻、
ページ3923(1987)〕等が単離されている。し
かしながら、産業上重要な細菌であるコリネ型細菌由来
のdnaK遺伝子についての従来の報告例は、本発明者
等の知る限りない。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、コリネ型細
菌由来のdnaK遺伝子の提供を目的としてなされたも
のである。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、熱ショック蛋白
質の1つであるdnaK遺伝子を含むDNA断片がある
種のコリネ型細菌から単離可能であることを見い出し、
本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、コリネ型
細菌由来のDnaK蛋白質をコードする遺伝子(dna
K遺伝子)を含むDNA断片である。
【0005】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。本発明の「DnaK蛋白質をコードする遺伝子(d
naK遺伝子)」とは、「熱ショック蛋白質一種であっ
て、細胞内蛋白質の折りたたみ、蛋白質の分解等に関与
する蛋白質をコードする遺伝子DNA」を意味するもの
である。
【0006】本発明のdnaK遺伝子を含むDNA断片
(以下、これを「A断片」と略称することがある)は、
その塩基配列が決定された後においては合成することも
可能であるが、通常は微生物からクローニングされ、そ
の供給源となる微生物として、コリネ型細菌、例えば、
ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavu
m ) MJ−233(FERM BP−1497)、ブレ
ビバクテリウム・アンモニアゲネス(Brevibacterium a
mmoniagenes )ATCC6871、同ATCC1374
5、同ATCC13746、ブレビバクテリウム・デバ
リカタム(Brevibacterium devaricatum)ATCC14
020、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
(Brevibacterium lactofermentum )ATCC1386
9、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacter
ium glutamicum)ATCC31831等を用いることが
できる。
【0007】これらの供給源微生物からA断片を調製す
るための基本操作の一例を述べれば次のとおりである。
A断片は、上記コリネ型細菌、例えば、ブレビバクテリ
ウム・フラバム(Brevibacterium flavum )MJ−23
3(FERM BP−1497)株の染色体上に存在
し、この染色体の中から、以下に述べる方法で分離・取
得することができる。
【0008】先ず、ブレビバクテリウム・フラバムMJ
−233株の培養物から染色体DNAをそれ自体既知の
通常用いられる斉藤・三浦の方法〔バイオケミカ・バイ
オフィジカ・アクタ(Biochemica et Biophysica Acta
)72巻、ページ619〜629(1963)〕等で
抽出する。この染色体を鋳型として、前記エシェリヒア
・コリ、バチルス・サチルス由来dnaK遺伝子の共通
領域塩基配列をプライマーとして用いるPCR〔Polyme
rase Chain Reaction;Michael A.Innis 、PCR・プ
ロトコールズ(PCR Protocols ) (1990) Academic Pres
s Inc.〕で該遺伝子DNA断片を増幅する。
【0009】ここで、PCRとは、DNAポリメラーゼ
がプライマーを必要とすることを利用した特定DNA断
片の増幅法である。その原理は、共通領域の塩基配列部
に設定した2つのプライマー(オリゴヌクレオチド)と
4つのデオキシヌクレオチド三りん酸〔dNTPS;dATP 、
dCTP、dGTP及びdTTP〕を用い、二本鎖DNAの一鎖を鋳
型として、DNAポリメラーゼにより、2つのプライマ
ーで挟まれた部分の二本鎖が合成されるというものであ
る。実際の方法は、各至適温度および時間の条件下で熱
変性によるDNAの一本鎖化(デナチュレーション)、
プライマーの鋳型DNAへのアニーリング、DNAポリ
メラーゼによる相補鎖DNAの合成(エクステンショ
ン)を1サイクルとして、これを必要回数繰り返し特定
のDNA断片を増幅する。
【0010】本発明においては、プライマーとして、前
記エシェリヒア・コリ及びバチルス・サチルス由来dn
aK遺伝子の共通領域塩基配列の中から15〜40me
r、好ましくは15〜23merの塩基配列、例えば下
記(a−1)及び(b−1)で示される配列を設計し合
成した。 (a−1)GGIATYGAYY TIGG 15 (b−1)TTIGTIATIS IYTGICKYTT IGC 23 (配列中、RはA又はG、YはC又はTを示し、ここで
Aはアデニン、Gはグアニン、Cはシトシン、Tはチミ
ン、Iはデオキシイノシンを示す。) 上記プライマーは、例えば、アプライト・バイオシステ
ムズ(Applied Biosystems)社製394DNA/RNA
シンセサイザー(Synthesizer)を用いて合成することが
できる。
【0011】PCRにおけるプライマーの量は反応当た
り、0.05〜0.5μM、好ましくは0.25μMを
用いる。PCRの条件は、デナチュレーション工程が9
4℃で30〜60秒、好ましくは60秒、アニーリング
工程が55℃で30〜120秒、好ましくは55℃で1
20秒、エクステンション工程は72℃で60〜180
秒、好ましくは72℃で120秒であり、これらの工程
を1サイクルとして、25〜40サイクル、好ましくは
30サイクル行う。
【0012】かくして、大きさが約0.13kbのdn
aK遺伝子部分DNA断片を増幅することができる。増
幅DNA断片は、アガロースゲル電気泳動を用いて検出
することができる。
【0013】ここで、増幅DNA断片、制限酵素切断D
NA断片等の各DNA断片の大きさは、分子量マーカー
DNA断片との同一アガロースゲル上での泳動距離で描
かれる標準線に基づき、算出することができる。なお、
本発明における各DNA断片の大きさの決定において、
1kb以上の断片の大きさについてはλ−HindII
I digest(宝酒造製)をマーカーに用いて1%
アガロースゲル電気泳動によって得られる結果を採用
し、約0.1kbから1kb未満の断片の大きさについ
てはpHYマーカー(宝酒造製)を用いて1〜4%アガ
ロースゲル電気泳動によって得られる結果を採用した。
【0014】一方、上記のブレビバクテリウム・フラバ
ムMJ−233の染色体DNAをPCRで増幅すること
により得られる大きさが約0.13kbのdnaK遺伝
子部分DNA断片については、その塩基配列をプラスミ
ドpGEM−Tベクター(PROMEGA 製)を用いるジデオ
キシヌクレオチド酵素法(dideoxy chain termination
法) 〔Sanger F. et al. 、プロシーディング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proceedi
ng of National Academy of Science )、74巻、ペー
ジ5463(1977)〕により決定することができ
る。
【0015】このようにして決定した上記約0.13k
bのDNA断片の塩基配列について他種の微生物、例え
ば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli) 、バチル
ス・サチルス(Bacillus subtilis) 等の遺伝子のアミノ
酸配列との相同性から推定したアミノ酸配列は、後記配
列表の配列番号1に示す配列を有するものであり、43
個のアミノ酸をコードする129の塩基対から構成され
るdnaK遺伝子の部分DNA断片である。
【0016】次に、このdnaK遺伝子部分DNA断片
をプローブとして用い、ブレビバクテリウム・フラバム
MJ−233染色体由来のDNAバンクからハイブリダ
イゼーション法によりdnaK全遺伝子をスクリーニン
グすることができる。
【0017】まず、ブレビバクテリウム・フラバムMJ
−233の培養物から染色体DNAを抽出する。この染
色体DNAを適当な制限酵素、例えば、Sau3AIを
用いて部分分解する。得られる様々な大きさ(9〜23
kb)のDNA断片をラムダファージベクター、例え
ば、λFixII(東洋紡績製)に挿入し、ライブラリ
ーを作成する。このファージベクターを用いてエシェリ
ヒア・コリ、例えば、エシェリヒア・コリP2392
〔Ausubel et al.、ヌクレイック・アシッド・リサーチ
(Nucleic Acids Reserch)、7巻、ページ1513−1
523(1979)〕に感染させプラークを作らせた
後、上記dnaK遺伝子部分DNA断片をプローブとし
て用いるプラークハイブリダイゼーションを行う。上記
ハイブリダイゼーションによりdnaK遺伝子部分DN
A断片とハイブリダイズしたファージDNAを抽出し、
挿入DNA断片を制限酵素HindIIIで切り出すこ
とにより大きさが7.0kbのA断片を取得することが
できる。
【0018】このようにして得られるA断片の1つは、
上記ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233染色体
DNAを制限酵素HindIIIの完全分解により切断
して得られる大きさが約7.0kbのDNA断片を挙げ
ることができる。この約7.0kbのdnaK遺伝子を
含むDNA断片を、各種の制限酵素で切断したときの認
識部位数および切断断片の大きさを下記第1表に示す。
【0019】
【表1】 第1表 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ(kb) BamHI 2 5.0、1.4、0.6 EcoRI 1 5.5、1.5 KpnI 1 6.4、0.6 PstI 5 3.2、1.8、1.0、 0.7、0.2、0.1
【0020】ここで、上記A断片に含まれるdnaK遺
伝子の機能は次のように確認することができる。先ず、
A断片を、エシェリヒア・コリ内でプラスミドの複製増
殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクタ
ー、例えばpUC19(宝酒造製)に導入し、このプラ
スミドを用いてdnaK遺伝子が欠損した高温感受性変
異を有するエシェリヒア・コリCG333[ジャーナル
・オブ・バクテリオロジー(J.Bacterio
l)、175巻、10号、ページ3328−3331
(1993)]を形質転換する。この形質転換株を温度
43℃で培養し、生育菌株の有無を観察する。エシェリ
ヒア・コリCG333は、dnaK遺伝子が欠損してお
り通常43℃では生育できず、この温度感受性変異の導
入DNA断片による相補性を調べることにより、容易に
dnaK遺伝子の機能を確認することができる。
【0021】一方、上記A断片の塩基配列は、例えば、
ジオキシヌクレオチド酵素法(dideoxychain terminati
on法)〔Sanger、F. et al. 、プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Procee
ding of National Academy of Science )、74巻、ペ
ージ5463(1977)〕を用いて決定することがで
き、その塩基配列中に存在するオープンリーディングフ
レームからdnaK遺伝子を確認することができる。上
記約7.0kbのDNA断片中に存在が確認されたdn
aK遺伝子の塩基配列を後記配列表の配列番号2に示
す。
【0022】上記の塩基配列を包含する本発明のdna
K遺伝子を含むDNA断片は、天然のコリネ型細菌染色
体DNAから分離されたもののみならず、通常用いられ
るDNA合成装置、例えば、アプライド・バイオシステ
ムズ(Applied Biosystems)社製394DNA/RNAシ
ンセサイザーを用いて合成されたものであってもよい。
【0023】また、前記の如くブレビバクテリウム・フ
ラバムMJ−233の染色体DNAから取得される本発
明のdnaK遺伝子を含むDNA断片は、該遺伝子によ
り発現されるDnaK蛋白質の機能を実質的に損なうこ
とがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換
されていてもよく又は削除されていてもよく、或いは新
たに塩基が挿入されていてもよく、塩基配列の一部が転
位されているものであってもよく、さらに該遺伝子にハ
イブリダイズし得るDNA断片であってもよく、これら
の誘導体のいずれもが、本発明のdnaK遺伝子を含む
DNA断片に包含されるものである。
【0024】前述のように熱ショック等のストレス時に
誘導される一群の熱ショック蛋白質は、細胞内蛋白質の
折りたたみ、会合、膜透過、分解等の過程に分子シャペ
ロンとして働き、細胞をストレスから守り、恒常性を維
持するうえで重要な役割を果たしている。熱ショック蛋
白質の一つであるDnaK蛋白質は、蛋白質の細胞内の
折りたたみ、会合、分解等に関与していることが知られ
ており、宿主細胞内で、特定の蛋白質を高発現させる場
合、この性質を利用できる。すなわち、本発明のdna
K遺伝子を含むDNA断片を用いて、目的蛋白質の活性
化を助け、ライフを延長、あるいは目的蛋白質が分泌蛋
白質の場合には、膜上の組込み・透過装置への運搬を効
率化し、目的蛋白質の生成・分泌量を増加させることが
可能である。
【0025】
【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例により更に具体的に説明する。 実施例1 ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233
由来のA断片のクローン化
【0026】(A)ブレビバクテリウム・フラバムMJ
−233の全DNAの抽出 ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233(FERM
BP−1497)菌体を、白金耳にて10mlの半合
成培地A培地〔組成:尿素2g、(NH4 2SO4
7g、K2 HPO4 0. 5g、KH2 PO4 0.5
g、MgSO40.5g、FeSO4 ・7H2 O 6m
g、MnSO4 ・4〜6H2 O 6mg、酵母エキス
2. 5g、カザミノ酸5g、ビオチン200μg、塩酸
チアミン200μg及びグルコース20gを蒸留水1l
に溶解〕に植菌し、30〜33℃で12〜16時間振盪
培養(前培養)した。次にA培地100mlに前培養液
を2%植菌し、31℃で10〜16時間振盪して対数増
殖期後期まで培養した。この培養液を遠心分離(5,0
00×g、10分間、15〜20℃)し菌体を集めた。
【0027】得られた菌体を10mg/mlの濃度にな
るよう、10μg/mlリゾチーム、NaCl−20m
Mトリス緩衝液(pH8.0)及び1mM EDTA・
2Naを含む水溶液(各成分の濃度は最終濃度である)
に懸濁した。次にプロテナーゼKを最終濃度が100μ
g/mlになるように添加し、37℃で1時間保温し
た。さらにドデシル硫酸ナトリウムを終濃度が0.5%
になるように添加し、50℃で6時間保温して溶菌し
た。この溶菌液に、等量のフェノール/クロロホルム溶
液を添加し、室温で10分間ゆるやかに振盪した後、全
量を遠心分離(3,800×g、15分間、15〜20
℃)し、上清画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウ
ムを0.3Mとなるよう添加した後、2倍量のエタノー
ルをゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在
するDNAをガラス棒でまきとり、70%エタノールで
洗浄した後、風乾した。得られたDNAに10mMトリ
ス緩衝液(pH7.5)、1mM EDTA・2Naを
含む水溶液5mlを加え、4℃で一晩静置し、鋳型DN
AとしてPCRに使用した。
【0028】(B)プライマーの選択 dnaK遺伝子はエシェリヒア・コリ、バチルス・サチ
ルス由来のものがよく研究されており、塩基配列が決定
されている[プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユナイテッド・ス
テイツ・オブ・アメリカ(Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA)、81巻、ページ848(198
4)及びヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucl
eicAcid Research)、15巻、ページ
3923(1987)参照]。
【0029】これら2種の微生物間で保存されている領
域、特にDNA塩基配列においても特に保存されている
領域を検討し、下記の1対のプライマー(a−1)及び
(b−1)を選択し、アプライド・バイオシステムズ
(Applied Biosystems)社製394DNA/RNAシン
セサイザー(synthesizer )を用いて合成した。 (a−1)GGIATYGAYY TIGG 15 (b−1)TTIGTIATIS IYTGICKYTT IGC 23 (配列中、RはA又はG、YはC又はTを示し、ここで
Aはアデニン、Gはグアニン、Cはシトシン、Tはチミ
ン、Iはデオキシイノシンを示す。)
【0030】(C)PCR 実際のPCRは、パーキンエルマーシータス社製のDN
Aサーマルサイクラーを用い、反応試薬としてレコンビ
ナント・タックDNA・ポリメラーゼ・タカラ・タック
(Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq)(宝酒
造製)を用いて下記の条件で行った。 反応液: (10×)PCR緩衝液 10μl 1.25mM dNTP混合液 16μl 鋳型DNA MgCl2 10μl(DNA 含有量1μM以下) 上記(B)項で作成したプライマー 各々1μl(最終濃度0.25μM) レコンビナント・タックDNA・ポリメラーゼ 0.5μl 滅菌蒸留水 61.5μl 以上を混合し、この100μlの反応液をPCRにかけ
た。 PCRサイクル: デナチュレーション過程:94℃ 60秒 アニーリング過程:37℃ 120秒 エクステンション過程:72℃ 180秒 以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
【0031】(D)反応物の検出 上記(C)項で得られた反応液10μlを2%アガロー
スゲルにより電気泳動を行い、約129bpのDNA断
片を検出した。
【0032】(E)増幅断片のクローン化 上記(C)項で得た反応液3μlとPCR産物クローニ
ングベクターpGEM−Tベクター(PROMEGA社
より市販)1μlを混合し、T4DNAリガーゼ10
×)緩衝液1μl、T4DNAリガーゼ1unitの各
成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、15℃で
3時間反応させ、結合させた。
【0033】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、53巻、ペ
ージ159(1970)〕によりエシェリヒア・コリJ
M109(宝酒造製)を形質転換し、アンピシリン50
mgを含む培地〔トリプトン10g、イースト・エキス
トラクト5g、NaCl 5g及び寒天16gを蒸留水
11に溶解〕に塗抹した。
【0034】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素BamHIにより切断し、挿入断片を確認
した。この結果、プラスミドpGEM−Tの長さ3.0
kbのDNA断片に加え、長さ約129bpの挿入DN
A断片が認められた。
【0035】実施例2 増幅断片の塩基配列の決定 実施例1の(E)項で得られた大きさが約129bpの
増幅断片について、その塩基配列をジデオキシヌクレオ
チド酵素法(dideoxychain termination法)〔Sanger、
F.et al.、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス(Proceeding of National A
cademy of Science )、74巻、ページ5463(19
77)〕により決定した。
【0036】塩基配列決定の結果、該挿入断片は大腸
菌、枯草菌由来のdnaK遺伝子の一部(PCRに使用
したプライマーによって挟まれる領域)と高いホモロジ
ーを示し、ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233
由来のdnaK遺伝子の一部をクローニングしたことを
確認した。
【0037】実施例3 ブレビバクテリウム・フラバム
MJ−233由来のdnaK遺伝子を含むDNA断片の
クローン化 上記実施例1の(A)項で得たブレビバクテリウム・フ
ラバムMJ−233の全DNA溶液の90μlを、制限
酵素Sau3AI 5unitsを用い、37℃で10
分間反応させ部分分解した。この分解DNAとλFix
II/XhoIパーシャル・フィル−イン・ベクター・
キット(Partial Fill-In Vector Kit)及びクレノウ・
フラグメント(Klenow fragment )(東洋紡績製)を用
いて、プロトコールに従いライブラリーを作成した。
【0038】次に、λDNAライブラリーファージ溶液
(2〜5×104 pfu; SM緩衝液希釈)とエシェリ
ヒア・コリP2392(東洋紡績製)の培養液を当量混
合し37℃で15分間保温した。これに50℃にて保温
しておいた3〜4mlのλ培地(トリプトン10g、イ
ースト・エクストラクト5g、NaCl 5g、MgS
4 ・7H2 O 2g及び寒天5gを蒸留水1lに溶
解)を加えλプレート(トリプトン10g、NaCl
5g、MgSO4 ・7H2 O 2g、及び、寒天10g
を蒸留水1lに溶解)に均一に塗布し、37℃で12〜
16時間培養した。
【0039】この培地上に形成されたプラークをニトロ
セルロースフィルター上に吸着させ、NaOH 20g
及びNaCl 87.5gを蒸留水に溶解し、1lとし
た溶液、及びトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
121.2g及びNaCl30gを蒸留水に溶解し、6
NのHClでpH7.0に調整して1lとした溶液をそ
れぞれ浸した濾紙上に、フィルターを順次5分間ずつの
せて処理した。このフィルターを風乾後、80℃にて2
時間乾熱処理を行いDNAを固定した。上記PCR法で
得たdnaK部分DNA断片をプローブとし、上記で作
成したフィルターでプラークハイブリダイゼーションを
行った。この時プローブは、ランダムラベリングキット
(宝酒造製)を用いて作製した。プラーク・ハイブリダ
イゼーションは、常法〔モレキュラー・クローニング
(Molecular Cloning )、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory
)刊(1989)〕の通り行った。
【0040】この結果、陽性のプラークを選択すること
ができ、そこからファージDNAを抽出して、制限酵素
HindIIIより切り出される大きさが約7.0kb
の挿入断片を確認した。これを、プラスミドpMW11
8のHindIII部位に挿入し、dnaK遺伝子全領
域の確認に用いた。この大きさが約7.0kbのDNA
断片を各種の制限酵素で切断したときの認識部位数およ
び切断断片の大きさは前記表1に示したとおりであっ
た。その制限酵素切断点地図を図1に示す。
【0041】実施例4 dnaK遺伝子全領域の確認 実施例3で得られた大きさが約7.0kbのDNA断片
上に存在するdnaK遺伝子の存在部位を特定するため
に、下記の操作により塩基配列を決定した。
【0042】大きさが約7.0kbのDNA断片溶液1
4μlを、制限酵素Sau3AI5unitsを用い、
37℃で1〜5分間反応させ部分分解した。一方クロー
ニングベクターpUC118(宝酒造より市販)を制限
酵素BamHIで切断し、脱リン酸化処理をした。この
ベクターと先程の部分分解DNA断片とを混合し、50
mMトリス緩衝液(pH7.6)、10mMジチオスレ
イトール、1mMATP、10mM MgCl2 およ
びT4DNAリガーゼ1unitの各成分(各成分の濃
度は最終濃度である)を添加し、16℃で10時間反応
させ結合させた。
【0043】上記と同様に大きさが約7.0kbのDN
A断片溶液14μlを、制限酵素TaqI 50uni
tsを用い、5〜8分間反応させ部分分解した。クロー
ニングベクターpUC118は制限酵素AccIで切断
し、脱リン酸化処理を行い上記と同様にして部分分解D
NA断片と結合させた。上記で得られたプラスミド混液
を用い、塩化カルシウム法〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology
) 、53巻、ページ159(1970)〕によりエシ
ェリヒア・コリJM109(宝酒造製)を形質転換し、
アンピシリン50μg/mlを含む培地〔トリプトン1
0g、イースト・エキストラクト5g、NaCl 5g
および寒天16gを蒸留水1lに溶解〕に塗末した。
【0044】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドDNAを抽出して、その塩基
配列を、pUC118(宝酒造製)を用いるジデオキシ
ヌクレオチド法(dideoxy chain terminator法)〔Sang
er F. et al.、プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス(Proceeding of Nati
onal Academy of Science )、74巻、ページ5463
(1977)〕により次のとおり決定した。
【0045】培養液より抽出したプラスミドDNAをカ
タリスト800モレキュラー・バイオロジー・ラボステ
ーション;アプライド・バイオシステム社製(CATALYST
800Moleculer Biology Labostation;Applied Biosyst
ems社製)を用いてプロトコールに従い反応させ、37
3A DNAシーケンサー(Applied Biosystems社製)
により各々のプラスミドの挿入DNA断片の塩基配列を
決定した。そしてこれら個々の配列の連結はシーケンス
解析ソフト インヘリット(INHERIT ;Applied Biosys
tems社製)を用いて行い全塩基配列を決めた。
【0046】その塩基配列中のオープン・リーディング
・フレーム(ORF)の存在から、dnaK遺伝子DN
Aは後期配列表の配列番号2に示す塩基配列を有する6
19個のアミノ酸をコードする1857塩基対より構成
されることが明かとなった。前記大きさが約7.0kb
のDNA断片中のORF(dnaK遺伝子)の存在位置
を図1中に示す。
【0047】
【発明の効果】本発明のdnaK遺伝子を含むDNA断
片を組込んだ形質転換株は、微生物細胞内で特定の蛋白
質の発現と同時にDnaK蛋白質を発現させた場合、目
的蛋白質の活性の増大、ライフの延長等が期待できる。
また、目的蛋白質が分泌蛋白質の場合には、膜上の組込
み・透過装置への運搬を効率化し、目的蛋白質の生成・
分泌量を増加させることが可能である。
【0048】
【配列表】
配列番号:1 配列の長さ:129 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:ブレビバクテリウム・ フラバム 株名:MJ-233 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置:1−129 特徴を決定した方法:E 配列 ACG ACG AAC TCT GTG GTT TCA GTA CTT GAA GGC GGC GAG CCA GTA GTT 48 Thr Thr Asn Ser Val Val Ser Val Leu Glu Gly Gly Glu Pro Val Val 1 5 10 15 ATC GCA AAC GCA GAA GGC TCA CGC ACC ACC CCT TCC GTC GTT GCA TTC 96 Ile Ala Asn Ala Glu Gly Ser Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ala Phe 20 25 30 GAA AAG AAC GGT GAA GTT CTG GTC GGC CAG TCC 129 Glu Lys Asn Gly Glu Val Leu Val Gly Gln Ser 35 40
【0049】配列番号:2 配列の長さ:1857 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:ブレビバクテリウム・フラバム 株名:MJ-233 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置:1−1857 特徴を決定した方法:E 配列 ATG GGA CGT GCA GTA GGA ATT GAC CTT GGA ACC ACC AAC TCT GTG GTT 48 Met Gly Arg Ala Val Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Val Val 1 5 10 15 TCA GTA CTT GAA GGC GGC GAG CCA GTA GTT ATC GCA AAC GCA GAA GGC 96 Ser Val Leu Glu Gly Gly Glu Pro Val Val Ile Ala Asn Ala Glu Gly 20 25 30 TCA CGC ACC ACC CCT TCC GTC GTT GCA TTC GCA AAG AAC GGT GAA GTT 144 Ser Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ala Phe Ala Lys Asn Gly Glu Val 35 40 45 CTG GTC GGC CAG TCC GCT AAG AAC CAG GCA GTT ACC AAC GTT GAC CGC 192 Leu Val Gly Gln Ser Ala Lys Asn Gln Ala Val Thr Asn Val Asp Arg 50 55 60 ACC ATT CGC TCC GTC AAG CGC CAC ATC GGC ACT GAC TGG TCC GTT GCT 240 Thr Ile Arg Ser Val Lys Arg His Ile Gly Thr Asp Trp Ser Val Ala 65 70 75 80 ATC GAC GAC AAA AAC TAC ACC TCA CAG GAA ATC TCG GCT CGT ACC CTG 288 Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Thr Ser Gln Glu Ile Ser Ala Arg Thr Leu 85 90 95 ATG AAG CTG AAG CGC GAC GCT GAA GCG TAC CTG GGC GAG GAC GTT ACC 336 Met Lys Leu Lys Arg Asp Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Glu Asp Val Thr 100 105 110 GAT GCT GTT ATT ACC GTT CCT GCA TAC TTT GAG GAC TCG CAG CGT CAG 384 Asp Ala Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Glu Asp Ser Gln Arg Gln 115 120 125 CA ACC AAG GAA GCT GGC CAG ATC GCG GGA CTC AAC GTT CTT CGT ATT 432 Ala Thr Lys Glu Ala Gly Gln Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile 130 135 140 GTT AAC GAG CCA ACC GCG GCC GCA CTT GCA TAC GGT CTT GAG AAG GGC 480 Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Glu Lys Gly 145 150 155 160 GAG CAG GAG CAG ACC ATC CTG GTA TTC GAC CTC GGT GGC GGT ACC TTC 528 Glu Gln Glu Gln Thr Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe 165 170 175 GAC GTC TCC CTC CTG GAG ATT GGT GAC GGT GTT GTT GAA GTT CGT GCA 576 Asp Val Ser Leu Leu Glu Ile Gly Asp Gly Val Val Glu Val Arg Ala 180 185 190 ACC TCC GGC GAC AAC GAG CTC GGT GGC GAC GAC TGG GAT CAG CGT ATC 624 Thr Ser Gly Asp Asn Glu Leu Gly Gly Asp Asp Trp Asp Gln Arg Ile 195 200 205 GTT GAC TGG CTG GTA GAG AAG TTC CAG TCC TCC AAC GGC ATT GAC CTG 672 Val Asp Trp Leu Val Glu Lys Phe Gln Ser Ser Asn Gly Ile Asp Leu 210 215 220 ACT AAG GAC AAG ATG GCC CTG CAG CGT CTG CGT GAG GCA GCT GAG AAG 720 Thr Lys Asp Lys Met Ala Leu Gln Arg Leu Arg Glu Ala Ala Glu Lys 225 230 235 240 GCA AAG ATC GAG CTG TCC TCT TCC CAG AGT GCA AAC ATC AAC CTT CCT 768 Ala Lys Ile Glu Leu Ser Ser Ser Gln Ser Ala Asn Ile Asn Leu Pro 245 250 255 TAT ATC ACC GTT GAT GCA GAC AAG AAC CCA CTG TTC TTG GAT GAG ACC 816 Tyr Ile Thr Val Asp Ala Asp Lys Asn Pro Leu Phe Leu Asp Glu Thr 260 265 270 CTT TCC CGT GCA GAG TTC CAG CGC ATC ACC CAG GAC CTC CTG GAT CGC 864 Leu Ser Arg Ala Glu Phe Gln Arg Ile Thr Gln Asp Leu Leu Asp Arg 275 280 285 ACC AAG ACT CCT TTC AAC CAG GTT GTT AAG GAC GCT GGC GTG TCC GTT 912 Thr Lys Thr Pro Phe Asn Gln Val Val Lys Asp Ala Gly Val Ser Val 290 295 300 TCC GAG ATC GAC CAC GTT GTT CTC GTC GGT GGT TCC ACC CGT ATG CCT 960 Ser Glu Ile Asp His Val Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Met Pro 305 310 315 320 GCT GTT ACC GAA CTG GTC AAG GAA CTG ACC GGT GGA CGT GAG CCA AAC 1008 Ala Val Thr Glu Leu Val Lys Glu Leu Thr Gly Gly Arg Glu Pro Asn 325 330 335 AAG GGT GTT AAC CCA GAT GAG GTA GTT GCA GTT GGT GCA GCA CTT CAG 1056 Lys Gly Val Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Val Gly Ala Ala Leu Gln 340 345 350 GCT GGT GTT CTC CGT GGC GAG GTC AAG GAT GTT CTT CTT CTT GAC GTC 1104 Ala Gly Val Leu Arg Gly Glu Val Lys Asp Val Leu Leu Leu Asp Val 355 360 365 ACC CCA CTG TCC CTC GGC ATT GAG ACC AAG GGT GGG GTG ATG ACC AAG 1152 Thr Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Lys Gly Gly Val Met Thr Lys 370 375 380 CTC ATC GAG CGT AAC ACC ACC ATC CCA ACC AAG CGT TCC GAG ACC TTC 1200 Leu Ile Glu Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Lys Arg Ser Glu Thr Phe 385 390 395 400 ACC ACC GCA GAA GAC AAC CAG CCT TCT GTT CAG ATC CAG GTA TTC CAG 1248 Thr Thr Ala Glu Asp Asn Gln Pro Ser Val Gln Ile Gln Val Phe Gln 405 410 415 GGC GAG CGT GAA ATC GCA ACC GCC AAC AAG CTG CTC GGA TCC TTC GAG 1296 Gly Glu Arg Glu Ile Ala Thr Ala Asn Lys Leu Leu Gly Ser Phe Glu 420 425 430 CTC GGC GGC ATC GCA CCT GCA CCA CGT GGC GTC CCA CAG ATC GAG GTC 1344 Leu Gly Gly Ile Ala Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val 435 440 445 ACT TTC GAC ATC GAC GCT AAC GGC ATC GTC CAC GTC ACC GCA AAG GAC 1392 Thr Phe Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Val His Val Thr Ala Lys Asp 450 455 460 AAG GGC ACT GGT AAG GAA AAC ACC ATC ACC ATT CAG GAC GGC TCC GGT 1440 Lys Gly Thr Gly Lys Glu Asn Thr Ile Thr Ile Gln Asp Gly Ser Gly 465 470 475 480 CTG TCC CAG GAT GAA ATT GAT CGC ATG ATC AAG GAT GCT GAA GCG CAC 1488 Leu Ser Gln Asp Glu Ile Asp Arg Met Ile Lys Asp Ala Glu Ala His 485 490 495 GCT GAT GAG GAC AAG AAG CGC CGC GAG GAG CAG GAA GTC CGC AAC AAC 1546 Ala Asp Glu Asp Lys Lys Arg Arg Glu Glu Gln Glu Val Arg Asn Asn 500 505 510 GCT GAG TCC CTG GTT TAC CAG ACC CGC AAG TTC GTT GAA GAG AAC TCC 1584 Ala Glu Ser Leu Val Tyr Gln Thr Arg Lys Phe Val Glu Glu Asn Ser 515 520 525 GAG AAG GTC TCC GAA GAC CTC AAG GCA AAG GTC GAA GAG GCA GCC AAG 1632 Glu Lys Val Ser Glu Asp Leu Lys Ala Lys Val Glu Glu Ala Ala Lys 530 535 540 GGT GTT GAA GAA GCA CTC AAG GGC GAG GAC CTC GAG GCA ATC AAG GCT 1680 Gly Val Glu Glu Ala Leu Lys Gly Glu Asp Leu Glu Ala Ile Lys Ala 545 550 555 560 GCA GTT GAG AAG CTG AAC ACC GAG TCC CAG GAA ATG GGT AAG GCT ATC 1728 Ala Val Glu Lys Leu Asn Thr Glu Ser Gln Glu Met Gly Lys Ala Ile 565 570 575 TAC GAG GCT GAC GCT GCT GCT GGT GCA ACC CAG GCT GAC GCA GGT GCA 1776 Tyr Glu Ala Asp Ala Ala Ala Gly Ala Thr Gln Ala Asp Ala Gly Ala 580 585 590 GAA GGC GCT GCA GAT GAC AAT GTT GTT GAC GCT GAA GTT GTC GAA GAC 1824 Glu Gly Ala Ala Asp Asp Asn Val Val Asp Ala Glu Val Val Glu Asp 595 600 605 GAC GCA GCT GAC AAT GGT GAG GAT AAG AAG TAA 1857 Asp Ala Ala Asp Asn Gly Glu Asp Lys Lys *** 610 615
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の、大きさが約7.0kbのdnaK遺
伝子を含むDNA断片の制限酵素切断点地図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:13) C12R 1:13) (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央8丁目3番1号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 コリネ型細菌由来のDnaK蛋白質をコ
    ードする遺伝子を含むDNA断片。
  2. 【請求項2】 コリネ型細菌がブレビバクテリウム・フ
    ラバム (Brevibacterium flavum)MJ−233である請
    求項1記載のDNA断片。
  3. 【請求項3】 大きさが約7.0kbであり、両末端に
    制限酵素HindIII認識部位を有し、下記表に記載
    する制限酵素で切断した場合、下記表に記載する認識部
    位数と切断断片の大きさを示す請求項3記載のDNA断
    片。 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ(kb) BamHI 2 5.0、1.4、0.6 EcoRI 1 5.5、1.5 KpnI 1 6.4、0.6 PstI 5 3.2、1.8、1.0、 0.7、0.2、0.1
  4. 【請求項4】 配列表の配列番号2に記載ののアミノ酸
    配列で示されるDnaK蛋白質をコードする遺伝子を含
    むDNA断片。
  5. 【請求項5】 配列表の配列番号2に記載のDNA塩基
    配列で示されるDnaK蛋白質をコードする遺伝子を含
    むDNA断片。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996026289A1 (fr) * 1995-02-20 1996-08-29 Ajinomoto Co., Inc. Micro-organisme tolerant a la contrainte et procede de production de produit de fermentation

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO1996026289A1 (fr) * 1995-02-20 1996-08-29 Ajinomoto Co., Inc. Micro-organisme tolerant a la contrainte et procede de production de produit de fermentation

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