JPH0856668A - 新規ｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 コリネ型細菌、例えば、ブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ−２３３由来のＤｎａｋ蛋白質をコード
する遺伝子を含むＤＮＡ断片。 【効果】 本発明のＤＮＡ断片は、目的蛋白質の活性の
増大、ライフの延長、生成・分泌量の増加等を目的とす
る微生物の遺伝子工学的育種改良に利用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、熱ショック蛋白質の一
つであるＤｎａＫ蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片に関する。生物の細胞、組織等を熱ショック等の
ストレスにさらした時に誘導される一群の熱ショック蛋
白質は、細胞内蛋白質の折りたたみ、会合、膜透過、分
解等の過程に分子シャペロン（介添え役）として働き、
細胞をストレスから守り、恒常性を維持するうえで重要
な役割を果たしている［蛋白質核酸酵素、３７巻、１５
号、ページ１（１９９２）］。これら熱ショックタンパ
ク質の中で、ＤｎａＫ蛋白質は、細胞内蛋白質の折りた
たみ、蛋白質の分解等に関与していることが知られてお
り、このＤｎａＫ蛋白質をコードする遺伝子は、蛋白質
の生産等への利用が期待されている。

【０００２】

【従来の技術】一群の熱ショック蛋白質をコードする遺
伝子のなかでＤｎａＫ蛋白質をコードする遺伝子（以下
これを「ｄｎａＫ遺伝子」ということがある）は、原核
生物では、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由
来の遺伝子〔プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユナイテッド・ス
テイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、８１巻、ページ８４８（１９８
４）〕、バチルス・サチルス（Bacillus subtilis）由
来の遺伝子〔ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１５巻、
ページ３９２３（１９８７）〕等が単離されている。し
かしながら、産業上重要な細菌であるコリネ型細菌由来
のｄｎａＫ遺伝子についての従来の報告例は、本発明者
等の知る限りない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、コリネ型細
菌由来のｄｎａＫ遺伝子の提供を目的としてなされたも
のである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、熱ショック蛋白
質の１つであるｄｎａＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片がある
種のコリネ型細菌から単離可能であることを見い出し、
本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、コリネ型
細菌由来のＤｎａＫ蛋白質をコードする遺伝子（ｄｎａ
Ｋ遺伝子）を含むＤＮＡ断片である。

【０００５】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。本発明の「ＤｎａＫ蛋白質をコードする遺伝子（ｄ
ｎａＫ遺伝子）」とは、「熱ショック蛋白質一種であっ
て、細胞内蛋白質の折りたたみ、蛋白質の分解等に関与
する蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡ」を意味するもの
である。

【０００６】本発明のｄｎａＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片
（以下、これを「Ａ断片」と略称することがある）は、
その塩基配列が決定された後においては合成することも
可能であるが、通常は微生物からクローニングされ、そ
の供給源となる微生物として、コリネ型細菌、例えば、
ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m ) ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）、ブレ
ビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium a
mmoniagenes ）ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４
５、同ＡＴＣＣ１３７４６、ブレビバクテリウム・デバ
リカタム（Brevibacterium devaricatum）ＡＴＣＣ１４
０２０、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
（Brevibacterium lactofermentum ）ＡＴＣＣ１３８６
９、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacter
ium glutamicum）ＡＴＣＣ３１８３１等を用いることが
できる。

【０００７】これらの供給源微生物からＡ断片を調製す
るための基本操作の一例を述べれば次のとおりである。
Ａ断片は、上記コリネ型細菌、例えば、ブレビバクテリ
ウム・フラバム（Brevibacterium flavum ）ＭＪ−２３
３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）株の染色体上に存在
し、この染色体の中から、以下に述べる方法で分離・取
得することができる。

【０００８】先ず、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡをそれ自体既知の
通常用いられる斉藤・三浦の方法〔バイオケミカ・バイ
オフィジカ・アクタ（Biochemica et Biophysica Acta
）７２巻、ページ６１９〜６２９（１９６３）〕等で
抽出する。この染色体を鋳型として、前記エシェリヒア
・コリ、バチルス・サチルス由来ｄｎａＫ遺伝子の共通
領域塩基配列をプライマーとして用いるＰＣＲ〔Polyme
rase Chain Reaction；Michael A.Innis 、ＰＣＲ・プ
ロトコールズ（PCR Protocols ) (1990) Academic Pres
s Inc.〕で該遺伝子ＤＮＡ断片を増幅する。

【０００９】ここで、ＰＣＲとは、ＤＮＡポリメラーゼ
がプライマーを必要とすることを利用した特定ＤＮＡ断
片の増幅法である。その原理は、共通領域の塩基配列部
に設定した２つのプライマー（オリゴヌクレオチド）と
４つのデオキシヌクレオチド三りん酸〔dNTPS；dATP 、
dCTP、dGTP及びdTTP〕を用い、二本鎖ＤＮＡの一鎖を鋳
型として、ＤＮＡポリメラーゼにより、２つのプライマ
ーで挟まれた部分の二本鎖が合成されるというものであ
る。実際の方法は、各至適温度および時間の条件下で熱
変性によるＤＮＡの一本鎖化（デナチュレーション）、
プライマーの鋳型ＤＮＡへのアニーリング、ＤＮＡポリ
メラーゼによる相補鎖ＤＮＡの合成（エクステンショ
ン）を１サイクルとして、これを必要回数繰り返し特定
のＤＮＡ断片を増幅する。

【００１０】本発明においては、プライマーとして、前
記エシェリヒア・コリ及びバチルス・サチルス由来ｄｎ
ａＫ遺伝子の共通領域塩基配列の中から１５〜４０ｍｅ
ｒ、好ましくは１５〜２３ｍｅｒの塩基配列、例えば下
記（ａ−１）及び（ｂ−１）で示される配列を設計し合
成した。 （ａ−１）ＧＧＩＡＴＹＧＡＹＹ ＴＩＧＧ １５ （ｂ−１）ＴＴＩＧＴＩＡＴＩＳ ＩＹＴＧＩＣＫＹＴＴ ＩＧＣ ２３ （配列中、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴを示し、ここで
Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミ
ン、Ｉはデオキシイノシンを示す。） 上記プライマーは、例えば、アプライト・バイオシステ
ムズ（Applied Biosystems）社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ
シンセサイザー(Synthesizer）を用いて合成することが
できる。

【００１１】ＰＣＲにおけるプライマーの量は反応当た
り、０．０５〜０．５μＭ、好ましくは０．２５μＭを
用いる。ＰＣＲの条件は、デナチュレーション工程が９
４℃で３０〜６０秒、好ましくは６０秒、アニーリング
工程が５５℃で３０〜１２０秒、好ましくは５５℃で１
２０秒、エクステンション工程は７２℃で６０〜１８０
秒、好ましくは７２℃で１２０秒であり、これらの工程
を１サイクルとして、２５〜４０サイクル、好ましくは
３０サイクル行う。

【００１２】かくして、大きさが約０．１３ｋｂのｄｎ
ａＫ遺伝子部分ＤＮＡ断片を増幅することができる。増
幅ＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動を用いて検出
することができる。

【００１３】ここで、増幅ＤＮＡ断片、制限酵素切断Ｄ
ＮＡ断片等の各ＤＮＡ断片の大きさは、分子量マーカー
ＤＮＡ断片との同一アガロースゲル上での泳動距離で描
かれる標準線に基づき、算出することができる。なお、
本発明における各ＤＮＡ断片の大きさの決定において、
１ｋｂ以上の断片の大きさについてはλ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ ｄｉｇｅｓｔ（宝酒造製）をマーカーに用いて１％
アガロースゲル電気泳動によって得られる結果を採用
し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさについ
てはｐＨＹマーカー（宝酒造製）を用いて１〜４％アガ
ロースゲル電気泳動によって得られる結果を採用した。

【００１４】一方、上記のブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡをＰＣＲで増幅すること
により得られる大きさが約０．１３ｋｂのｄｎａＫ遺伝
子部分ＤＮＡ断片については、その塩基配列をプラスミ
ドｐＧＥＭ−Ｔベクター（PROMEGA 製）を用いるジデオ
キシヌクレオチド酵素法(dideoxy chain termination
法) 〔Sanger F. et al. 、プロシーディング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proceedi
ng of National Academy of Science ）、７４巻、ペー
ジ５４６３（１９７７）〕により決定することができ
る。

【００１５】このようにして決定した上記約０．１３ｋ
ｂのＤＮＡ断片の塩基配列について他種の微生物、例え
ば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli) 、バチル
ス・サチルス(Bacillus subtilis) 等の遺伝子のアミノ
酸配列との相同性から推定したアミノ酸配列は、後記配
列表の配列番号１に示す配列を有するものであり、４３
個のアミノ酸をコードする１２９の塩基対から構成され
るｄｎａＫ遺伝子の部分ＤＮＡ断片である。

【００１６】次に、このｄｎａＫ遺伝子部分ＤＮＡ断片
をプローブとして用い、ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３染色体由来のＤＮＡバンクからハイブリダ
イゼーション法によりｄｎａＫ全遺伝子をスクリーニン
グすることができる。

【００１７】まず、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この染
色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えば、Ｓａｕ３ＡＩを
用いて部分分解する。得られる様々な大きさ（９〜２３
ｋｂ）のＤＮＡ断片をラムダファージベクター、例え
ば、λＦｉｘＩＩ（東洋紡績製）に挿入し、ライブラリ
ーを作成する。このファージベクターを用いてエシェリ
ヒア・コリ、例えば、エシェリヒア・コリＰ２３９２
〔Ausubel et al.、ヌクレイック・アシッド・リサーチ
(Nucleic Acids Reserch)、７巻、ページ１５１３−１
５２３（１９７９）〕に感染させプラークを作らせた
後、上記ｄｎａＫ遺伝子部分ＤＮＡ断片をプローブとし
て用いるプラークハイブリダイゼーションを行う。上記
ハイブリダイゼーションによりｄｎａＫ遺伝子部分ＤＮ
Ａ断片とハイブリダイズしたファージＤＮＡを抽出し、
挿入ＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切り出すこ
とにより大きさが７．０ｋｂのＡ断片を取得することが
できる。

【００１８】このようにして得られるＡ断片の１つは、
上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３染色体
ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの完全分解により切断
して得られる大きさが約７．０ｋｂのＤＮＡ断片を挙げ
ることができる。この約７．０ｋｂのｄｎａＫ遺伝子を
含むＤＮＡ断片を、各種の制限酵素で切断したときの認
識部位数および切断断片の大きさを下記第１表に示す。

【００１９】

【表１】 第１表 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＢａｍＨＩ ２ ５．０、１．４、０．６ ＥｃｏＲＩ １ ５．５、１．５ ＫｐｎＩ １ ６．４、０．６ ＰｓｔＩ ５ ３．２、１．８、１．０、 ０．７、０．２、０．１

【００２０】ここで、上記Ａ断片に含まれるｄｎａＫ遺
伝子の機能は次のように確認することができる。先ず、
Ａ断片を、エシェリヒア・コリ内でプラスミドの複製増
殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクタ
ー、例えばｐＵＣ１９（宝酒造製）に導入し、このプラ
スミドを用いてｄｎａＫ遺伝子が欠損した高温感受性変
異を有するエシェリヒア・コリＣＧ３３３［ジャーナル
・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ）、１７５巻、１０号、ページ３３２８−３３３１
（１９９３）］を形質転換する。この形質転換株を温度
４３℃で培養し、生育菌株の有無を観察する。エシェリ
ヒア・コリＣＧ３３３は、ｄｎａＫ遺伝子が欠損してお
り通常４３℃では生育できず、この温度感受性変異の導
入ＤＮＡ断片による相補性を調べることにより、容易に
ｄｎａＫ遺伝子の機能を確認することができる。

【００２１】一方、上記Ａ断片の塩基配列は、例えば、
ジオキシヌクレオチド酵素法（dideoxychain terminati
on法）〔Sanger、F. et al. 、プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Procee
ding of National Academy of Science ）、７４巻、ペ
ージ５４６３（１９７７）〕を用いて決定することがで
き、その塩基配列中に存在するオープンリーディングフ
レームからｄｎａＫ遺伝子を確認することができる。上
記約７．０ｋｂのＤＮＡ断片中に存在が確認されたｄｎ
ａＫ遺伝子の塩基配列を後記配列表の配列番号２に示
す。

【００２２】上記の塩基配列を包含する本発明のｄｎａ
Ｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、天然のコリネ型細菌染色
体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられ
るＤＮＡ合成装置、例えば、アプライド・バイオシステ
ムズ(Applied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシ
ンセサイザーを用いて合成されたものであってもよい。

【００２３】また、前記の如くブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから取得される本発
明のｄｎａＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、該遺伝子によ
り発現されるＤｎａＫ蛋白質の機能を実質的に損なうこ
とがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換
されていてもよく又は削除されていてもよく、或いは新
たに塩基が挿入されていてもよく、塩基配列の一部が転
位されているものであってもよく、さらに該遺伝子にハ
イブリダイズし得るＤＮＡ断片であってもよく、これら
の誘導体のいずれもが、本発明のｄｎａＫ遺伝子を含む
ＤＮＡ断片に包含されるものである。

【００２４】前述のように熱ショック等のストレス時に
誘導される一群の熱ショック蛋白質は、細胞内蛋白質の
折りたたみ、会合、膜透過、分解等の過程に分子シャペ
ロンとして働き、細胞をストレスから守り、恒常性を維
持するうえで重要な役割を果たしている。熱ショック蛋
白質の一つであるＤｎａＫ蛋白質は、蛋白質の細胞内の
折りたたみ、会合、分解等に関与していることが知られ
ており、宿主細胞内で、特定の蛋白質を高発現させる場
合、この性質を利用できる。すなわち、本発明のｄｎａ
Ｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて、目的蛋白質の活性
化を助け、ライフを延長、あるいは目的蛋白質が分泌蛋
白質の場合には、膜上の組込み・透過装置への運搬を効
率化し、目的蛋白質の生成・分泌量を増加させることが
可能である。

【００２５】

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例により更に具体的に説明する。 実施例１ ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
由来のＡ断片のクローン化

【００２６】（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡの抽出 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９７）菌体を、白金耳にて１０ｍｌの半合
成培地Ａ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ₄ ）₂ＳＯ₄
７ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０. ５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．５
ｇ、ＭｇＳＯ₄０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ６ｍ
ｇ、ＭｎＳＯ₄ ・４〜６Ｈ₂ Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス
２. ５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸
チアミン２００μｇ及びグルコース２０ｇを蒸留水１ｌ
に溶解〕に植菌し、３０〜３３℃で１２〜１６時間振盪
培養（前培養）した。次にＡ培地１００ｍｌに前培養液
を２％植菌し、３１℃で１０〜１６時間振盪して対数増
殖期後期まで培養した。この培養液を遠心分離（５，０
００×ｇ、１０分間、１５〜２０℃）し菌体を集めた。

【００２７】得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にな
るよう、１０μｇ／ｍｌリゾチーム、ＮａＣｌ−２０ｍ
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ・
２Ｎａを含む水溶液（各成分の濃度は最終濃度である）
に懸濁した。次にプロテナーゼＫを最終濃度が１００μ
ｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温し
た。さらにドデシル硫酸ナトリウムを終濃度が０．５％
になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌し
た。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶
液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全
量を遠心分離（３，８００×ｇ、１５分間、１５〜２０
℃）し、上清画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウ
ムを０．３Ｍとなるよう添加した後、２倍量のエタノー
ルをゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在
するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで
洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリ
ス緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａを
含む水溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、鋳型ＤＮ
ＡとしてＰＣＲに使用した。

【００２８】（Ｂ）プライマーの選択 ｄｎａＫ遺伝子はエシェリヒア・コリ、バチルス・サチ
ルス由来のものがよく研究されており、塩基配列が決定
されている［プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユナイテッド・ス
テイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、８１巻、ページ８４８（１９８
４）及びヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃＡｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１５巻、ページ
３９２３（１９８７）参照］。

【００２９】これら２種の微生物間で保存されている領
域、特にＤＮＡ塩基配列においても特に保存されている
領域を検討し、下記の１対のプライマー（ａ−１）及び
（ｂ−１）を選択し、アプライド・バイオシステムズ
（Applied Biosystems）社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシン
セサイザー（synthesizer ）を用いて合成した。 （ａ−１）ＧＧＩＡＴＹＧＡＹＹ ＴＩＧＧ １５ （ｂ−１）ＴＴＩＧＴＩＡＴＩＳ ＩＹＴＧＩＣＫＹＴＴ ＩＧＣ ２３ （配列中、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴを示し、ここで
Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミ
ン、Ｉはデオキシイノシンを示す。）

【００３０】（Ｃ）ＰＣＲ 実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製のＤＮ
Ａサーマルサイクラーを用い、反応試薬としてレコンビ
ナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック
（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）（宝酒
造製）を用いて下記の条件で行った。 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ ＭｇＣｌ₂ １０μｌ（DNA 含有量１μＭ以下） 上記（Ｂ）項で作成したプライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程：３７℃ １２０秒 エクステンション過程：７２℃ １８０秒 以上を１サイクルとし、３０サイクル行った。

【００３１】（Ｄ）反応物の検出 上記（Ｃ）項で得られた反応液１０μｌを２％アガロー
スゲルにより電気泳動を行い、約１２９ｂｐのＤＮＡ断
片を検出した。

【００３２】（Ｅ）増幅断片のクローン化 上記（Ｃ）項で得た反応液３μｌとＰＣＲ産物クローニ
ングベクターｐＧＥＭ−Ｔベクター（ＰＲＯＭＥＧＡ社
より市販）１μｌを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１０
×）緩衝液１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各
成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で
３時間反応させ、結合させた。

【００３３】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３巻、ペ
ージ１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪ
Ｍ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０
ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イースト・エキス
トラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水
１１に溶解〕に塗抹した。

【００３４】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素ＢａｍＨＩにより切断し、挿入断片を確認
した。この結果、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔの長さ３．０
ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約１２９ｂｐの挿入ＤＮ
Ａ断片が認められた。

【００３５】実施例２ 増幅断片の塩基配列の決定 実施例１の（Ｅ）項で得られた大きさが約１２９ｂｐの
増幅断片について、その塩基配列をジデオキシヌクレオ
チド酵素法（dideoxychain termination法）〔Sanger、
F.et al.、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Proceeding of National A
cademy of Science ）、７４巻、ページ５４６３（１９
７７）〕により決定した。

【００３６】塩基配列決定の結果、該挿入断片は大腸
菌、枯草菌由来のｄｎａＫ遺伝子の一部（ＰＣＲに使用
したプライマーによって挟まれる領域）と高いホモロジ
ーを示し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
由来のｄｎａＫ遺伝子の一部をクローニングしたことを
確認した。

【００３７】実施例３ ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３由来のｄｎａＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片の
クローン化 上記実施例１の（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３の全ＤＮＡ溶液の９０μｌを、制限
酵素Ｓａｕ３ＡＩ ５ｕｎｉｔｓを用い、３７℃で１０
分間反応させ部分分解した。この分解ＤＮＡとλＦｉｘ
ＩＩ／ＸｈｏＩパーシャル・フィル−イン・ベクター・
キット（Partial Fill-In Vector Kit）及びクレノウ・
フラグメント（Klenow fragment ）（東洋紡績製）を用
いて、プロトコールに従いライブラリーを作成した。

【００３８】次に、λＤＮＡライブラリーファージ溶液
（２〜５×１０4 ｐｆｕ; ＳＭ緩衝液希釈）とエシェリ
ヒア・コリＰ２３９２（東洋紡績製）の培養液を当量混
合し３７℃で１５分間保温した。これに５０℃にて保温
しておいた３〜４ｍｌのλ培地（トリプトン１０ｇ、イ
ースト・エクストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、ＭｇＳ
Ｏ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ２ｇ及び寒天５ｇを蒸留水１ｌに溶
解）を加えλプレート（トリプトン１０ｇ、ＮａＣｌ
５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ２ｇ、及び、寒天１０ｇ
を蒸留水１ｌに溶解）に均一に塗布し、３７℃で１２〜
１６時間培養した。

【００３９】この培地上に形成されたプラークをニトロ
セルロースフィルター上に吸着させ、ＮａＯＨ ２０ｇ
及びＮａＣｌ ８７．５ｇを蒸留水に溶解し、１ｌとし
た溶液、及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
１２１．２ｇ及びＮａＣｌ３０ｇを蒸留水に溶解し、６
ＮのＨＣｌでｐＨ７．０に調整して１ｌとした溶液をそ
れぞれ浸した濾紙上に、フィルターを順次５分間ずつの
せて処理した。このフィルターを風乾後、８０℃にて２
時間乾熱処理を行いＤＮＡを固定した。上記ＰＣＲ法で
得たｄｎａＫ部分ＤＮＡ断片をプローブとし、上記で作
成したフィルターでプラークハイブリダイゼーションを
行った。この時プローブは、ランダムラベリングキット
（宝酒造製）を用いて作製した。プラーク・ハイブリダ
イゼーションは、常法〔モレキュラー・クローニング
（Molecular Cloning ）、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory
）刊（１９８９）〕の通り行った。

【００４０】この結果、陽性のプラークを選択すること
ができ、そこからファージＤＮＡを抽出して、制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩより切り出される大きさが約７．０ｋｂ
の挿入断片を確認した。これを、プラスミドｐＭＷ１１
８のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ｄｎａＫ遺伝子全領
域の確認に用いた。この大きさが約７．０ｋｂのＤＮＡ
断片を各種の制限酵素で切断したときの認識部位数およ
び切断断片の大きさは前記表１に示したとおりであっ
た。その制限酵素切断点地図を図１に示す。

【００４１】実施例４ ｄｎａＫ遺伝子全領域の確認 実施例３で得られた大きさが約７．０ｋｂのＤＮＡ断片
上に存在するｄｎａＫ遺伝子の存在部位を特定するため
に、下記の操作により塩基配列を決定した。

【００４２】大きさが約７．０ｋｂのＤＮＡ断片溶液１
４μｌを、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ５ｕｎｉｔｓを用い、
３７℃で１〜５分間反応させ部分分解した。一方クロー
ニングベクターｐＵＣ１１８（宝酒造より市販）を制限
酵素ＢａｍＨＩで切断し、脱リン酸化処理をした。この
ベクターと先程の部分分解ＤＮＡ断片とを混合し、５０
ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレ
イトール、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ およ
びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分（各成分の濃
度は最終濃度である）を添加し、１６℃で１０時間反応
させ結合させた。

【００４３】上記と同様に大きさが約７．０ｋｂのＤＮ
Ａ断片溶液１４μｌを、制限酵素ＴａｑＩ ５０ｕｎｉ
ｔｓを用い、５〜８分間反応させ部分分解した。クロー
ニングベクターｐＵＣ１１８は制限酵素ＡｃｃＩで切断
し、脱リン酸化処理を行い上記と同様にして部分分解Ｄ
ＮＡ断片と結合させた。上記で得られたプラスミド混液
を用い、塩化カルシウム法〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology
) 、５３巻、ページ１５９（１９７０）〕によりエシ
ェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、
アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む培地〔トリプトン１
０ｇ、イースト・エキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ
および寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解〕に塗末した。

【００４４】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出して、その塩基
配列を、ｐＵＣ１１８（宝酒造製）を用いるジデオキシ
ヌクレオチド法（dideoxy chain terminator法）〔Sang
er F. et al．、プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス（Proceeding of Nati
onal Academy of Science ）、７４巻、ページ５４６３
（１９７７）〕により次のとおり決定した。

【００４５】培養液より抽出したプラスミドＤＮＡをカ
タリスト８００モレキュラー・バイオロジー・ラボステ
ーション；アプライド・バイオシステム社製（CATALYST
800Moleculer Biology Labostation；Applied Biosyst
ems社製）を用いてプロトコールに従い反応させ、３７
３Ａ ＤＮＡシーケンサー（Applied Biosystems社製）
により各々のプラスミドの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を
決定した。そしてこれら個々の配列の連結はシーケンス
解析ソフト インヘリット（INHERIT ；Applied Biosys
tems社製）を用いて行い全塩基配列を決めた。

【００４６】その塩基配列中のオープン・リーディング
・フレーム（ＯＲＦ）の存在から、ｄｎａＫ遺伝子ＤＮ
Ａは後期配列表の配列番号２に示す塩基配列を有する６
１９個のアミノ酸をコードする１８５７塩基対より構成
されることが明かとなった。前記大きさが約７．０ｋｂ
のＤＮＡ断片中のＯＲＦ（ｄｎａＫ遺伝子）の存在位置
を図１中に示す。

【００４７】

【発明の効果】本発明のｄｎａＫ遺伝子を含むＤＮＡ断
片を組込んだ形質転換株は、微生物細胞内で特定の蛋白
質の発現と同時にＤｎａＫ蛋白質を発現させた場合、目
的蛋白質の活性の増大、ライフの延長等が期待できる。
また、目的蛋白質が分泌蛋白質の場合には、膜上の組込
み・透過装置への運搬を効率化し、目的蛋白質の生成・
分泌量を増加させることが可能である。

【００４８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１２９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム・ フラバム 株名：MJ-233 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１−１２９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ACG ACG AAC TCT GTG GTT TCA GTA CTT GAA GGC GGC GAG CCA GTA GTT 48 Thr Thr Asn Ser Val Val Ser Val Leu Glu Gly Gly Glu Pro Val Val 1 5 10 15 ATC GCA AAC GCA GAA GGC TCA CGC ACC ACC CCT TCC GTC GTT GCA TTC 96 Ile Ala Asn Ala Glu Gly Ser Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ala Phe 20 25 30 GAA AAG AAC GGT GAA GTT CTG GTC GGC CAG TCC 129 Glu Lys Asn Gly Glu Val Leu Val Gly Gln Ser 35 40

【００４９】配列番号：２ 配列の長さ：１８５７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム・フラバム 株名：MJ-233 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１−１８５７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG GGA CGT GCA GTA GGA ATT GAC CTT GGA ACC ACC AAC TCT GTG GTT 48 Met Gly Arg Ala Val Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Val Val 1 5 10 15 TCA GTA CTT GAA GGC GGC GAG CCA GTA GTT ATC GCA AAC GCA GAA GGC 96 Ser Val Leu Glu Gly Gly Glu Pro Val Val Ile Ala Asn Ala Glu Gly 20 25 30 TCA CGC ACC ACC CCT TCC GTC GTT GCA TTC GCA AAG AAC GGT GAA GTT 144 Ser Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ala Phe Ala Lys Asn Gly Glu Val 35 40 45 CTG GTC GGC CAG TCC GCT AAG AAC CAG GCA GTT ACC AAC GTT GAC CGC 192 Leu Val Gly Gln Ser Ala Lys Asn Gln Ala Val Thr Asn Val Asp Arg 50 55 60 ACC ATT CGC TCC GTC AAG CGC CAC ATC GGC ACT GAC TGG TCC GTT GCT 240 Thr Ile Arg Ser Val Lys Arg His Ile Gly Thr Asp Trp Ser Val Ala 65 70 75 80 ATC GAC GAC AAA AAC TAC ACC TCA CAG GAA ATC TCG GCT CGT ACC CTG 288 Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Thr Ser Gln Glu Ile Ser Ala Arg Thr Leu 85 90 95 ATG AAG CTG AAG CGC GAC GCT GAA GCG TAC CTG GGC GAG GAC GTT ACC 336 Met Lys Leu Lys Arg Asp Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Glu Asp Val Thr 100 105 110 GAT GCT GTT ATT ACC GTT CCT GCA TAC TTT GAG GAC TCG CAG CGT CAG 384 Asp Ala Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Glu Asp Ser Gln Arg Gln 115 120 125 CA ACC AAG GAA GCT GGC CAG ATC GCG GGA CTC AAC GTT CTT CGT ATT 432 Ala Thr Lys Glu Ala Gly Gln Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile 130 135 140 GTT AAC GAG CCA ACC GCG GCC GCA CTT GCA TAC GGT CTT GAG AAG GGC 480 Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Glu Lys Gly 145 150 155 160 GAG CAG GAG CAG ACC ATC CTG GTA TTC GAC CTC GGT GGC GGT ACC TTC 528 Glu Gln Glu Gln Thr Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe 165 170 175 GAC GTC TCC CTC CTG GAG ATT GGT GAC GGT GTT GTT GAA GTT CGT GCA 576 Asp Val Ser Leu Leu Glu Ile Gly Asp Gly Val Val Glu Val Arg Ala 180 185 190 ACC TCC GGC GAC AAC GAG CTC GGT GGC GAC GAC TGG GAT CAG CGT ATC 624 Thr Ser Gly Asp Asn Glu Leu Gly Gly Asp Asp Trp Asp Gln Arg Ile 195 200 205 GTT GAC TGG CTG GTA GAG AAG TTC CAG TCC TCC AAC GGC ATT GAC CTG 672 Val Asp Trp Leu Val Glu Lys Phe Gln Ser Ser Asn Gly Ile Asp Leu 210 215 220 ACT AAG GAC AAG ATG GCC CTG CAG CGT CTG CGT GAG GCA GCT GAG AAG 720 Thr Lys Asp Lys Met Ala Leu Gln Arg Leu Arg Glu Ala Ala Glu Lys 225 230 235 240 GCA AAG ATC GAG CTG TCC TCT TCC CAG AGT GCA AAC ATC AAC CTT CCT 768 Ala Lys Ile Glu Leu Ser Ser Ser Gln Ser Ala Asn Ile Asn Leu Pro 245 250 255 TAT ATC ACC GTT GAT GCA GAC AAG AAC CCA CTG TTC TTG GAT GAG ACC 816 Tyr Ile Thr Val Asp Ala Asp Lys Asn Pro Leu Phe Leu Asp Glu Thr 260 265 270 CTT TCC CGT GCA GAG TTC CAG CGC ATC ACC CAG GAC CTC CTG GAT CGC 864 Leu Ser Arg Ala Glu Phe Gln Arg Ile Thr Gln Asp Leu Leu Asp Arg 275 280 285 ACC AAG ACT CCT TTC AAC CAG GTT GTT AAG GAC GCT GGC GTG TCC GTT 912 Thr Lys Thr Pro Phe Asn Gln Val Val Lys Asp Ala Gly Val Ser Val 290 295 300 TCC GAG ATC GAC CAC GTT GTT CTC GTC GGT GGT TCC ACC CGT ATG CCT 960 Ser Glu Ile Asp His Val Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Met Pro 305 310 315 320 GCT GTT ACC GAA CTG GTC AAG GAA CTG ACC GGT GGA CGT GAG CCA AAC 1008 Ala Val Thr Glu Leu Val Lys Glu Leu Thr Gly Gly Arg Glu Pro Asn 325 330 335 AAG GGT GTT AAC CCA GAT GAG GTA GTT GCA GTT GGT GCA GCA CTT CAG 1056 Lys Gly Val Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Val Gly Ala Ala Leu Gln 340 345 350 GCT GGT GTT CTC CGT GGC GAG GTC AAG GAT GTT CTT CTT CTT GAC GTC 1104 Ala Gly Val Leu Arg Gly Glu Val Lys Asp Val Leu Leu Leu Asp Val 355 360 365 ACC CCA CTG TCC CTC GGC ATT GAG ACC AAG GGT GGG GTG ATG ACC AAG 1152 Thr Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Lys Gly Gly Val Met Thr Lys 370 375 380 CTC ATC GAG CGT AAC ACC ACC ATC CCA ACC AAG CGT TCC GAG ACC TTC 1200 Leu Ile Glu Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Lys Arg Ser Glu Thr Phe 385 390 395 400 ACC ACC GCA GAA GAC AAC CAG CCT TCT GTT CAG ATC CAG GTA TTC CAG 1248 Thr Thr Ala Glu Asp Asn Gln Pro Ser Val Gln Ile Gln Val Phe Gln 405 410 415 GGC GAG CGT GAA ATC GCA ACC GCC AAC AAG CTG CTC GGA TCC TTC GAG 1296 Gly Glu Arg Glu Ile Ala Thr Ala Asn Lys Leu Leu Gly Ser Phe Glu 420 425 430 CTC GGC GGC ATC GCA CCT GCA CCA CGT GGC GTC CCA CAG ATC GAG GTC 1344 Leu Gly Gly Ile Ala Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val 435 440 445 ACT TTC GAC ATC GAC GCT AAC GGC ATC GTC CAC GTC ACC GCA AAG GAC 1392 Thr Phe Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Val His Val Thr Ala Lys Asp 450 455 460 AAG GGC ACT GGT AAG GAA AAC ACC ATC ACC ATT CAG GAC GGC TCC GGT 1440 Lys Gly Thr Gly Lys Glu Asn Thr Ile Thr Ile Gln Asp Gly Ser Gly 465 470 475 480 CTG TCC CAG GAT GAA ATT GAT CGC ATG ATC AAG GAT GCT GAA GCG CAC 1488 Leu Ser Gln Asp Glu Ile Asp Arg Met Ile Lys Asp Ala Glu Ala His 485 490 495 GCT GAT GAG GAC AAG AAG CGC CGC GAG GAG CAG GAA GTC CGC AAC AAC 1546 Ala Asp Glu Asp Lys Lys Arg Arg Glu Glu Gln Glu Val Arg Asn Asn 500 505 510 GCT GAG TCC CTG GTT TAC CAG ACC CGC AAG TTC GTT GAA GAG AAC TCC 1584 Ala Glu Ser Leu Val Tyr Gln Thr Arg Lys Phe Val Glu Glu Asn Ser 515 520 525 GAG AAG GTC TCC GAA GAC CTC AAG GCA AAG GTC GAA GAG GCA GCC AAG 1632 Glu Lys Val Ser Glu Asp Leu Lys Ala Lys Val Glu Glu Ala Ala Lys 530 535 540 GGT GTT GAA GAA GCA CTC AAG GGC GAG GAC CTC GAG GCA ATC AAG GCT 1680 Gly Val Glu Glu Ala Leu Lys Gly Glu Asp Leu Glu Ala Ile Lys Ala 545 550 555 560 GCA GTT GAG AAG CTG AAC ACC GAG TCC CAG GAA ATG GGT AAG GCT ATC 1728 Ala Val Glu Lys Leu Asn Thr Glu Ser Gln Glu Met Gly Lys Ala Ile 565 570 575 TAC GAG GCT GAC GCT GCT GCT GGT GCA ACC CAG GCT GAC GCA GGT GCA 1776 Tyr Glu Ala Asp Ala Ala Ala Gly Ala Thr Gln Ala Asp Ala Gly Ala 580 585 590 GAA GGC GCT GCA GAT GAC AAT GTT GTT GAC GCT GAA GTT GTC GAA GAC 1824 Glu Gly Ala Ala Asp Asp Asn Val Val Asp Ala Glu Val Val Glu Asp 595 600 605 GAC GCA GCT GAC AAT GGT GAG GAT AAG AAG TAA 1857 Asp Ala Ala Asp Asn Gly Glu Asp Lys Lys *** 610 615

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の、大きさが約７．０ｋｂのｄｎａＫ遺
伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コリネ型細菌由来のＤｎａＫ蛋白質をコ
   ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 コリネ型細菌がブレビバクテリウム・フ
   ラバム (Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３である請
   求項１記載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 大きさが約７．０ｋｂであり、両末端に
   制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を有し、下記表に記載
   する制限酵素で切断した場合、下記表に記載する認識部
   位数と切断断片の大きさを示す請求項３記載のＤＮＡ断
   片。 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＢａｍＨＩ ２ ５．０、１．４、０．６ ＥｃｏＲＩ １ ５．５、１．５ ＫｐｎＩ １ ６．４、０．６ ＰｓｔＩ ５ ３．２、１．８、１．０、 ０．７、０．２、０．１
4. 【請求項４】 配列表の配列番号２に記載ののアミノ酸
   配列で示されるＤｎａＫ蛋白質をコードする遺伝子を含
   むＤＮＡ断片。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号２に記載のＤＮＡ塩基
   配列で示されるＤｎａＫ蛋白質をコードする遺伝子を含
   むＤＮＡ断片。