JPH08173162A - 新規ｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 コリネ型細菌由来のＲＮＡポリメラーゼの主
要シグマ因子をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を提
供する。 【構成】 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
の染色体ＤＮＡライブラリ−を作成し、エシェリヒア・
コリ由来およびバシルス・サチルス由来のｒｐｏＤ遺伝
子の共通領域配列をプロ−ブとして用いたサザンハイブ
リダイゼ−ションにより、該菌体由来のＲＮＡポリメラ
ーゼの主要シグマ因子をコードする遺伝子を得る。 【効果】 本発明により提供されるｒｐｏＤ遺伝子を含
むＤＮＡ断片を用いてコリネ型細菌を育種改良すること
により、より強力なプロモーターの解析、開発が可能と
なる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ブレビバクテリウム・
フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕ
ｍ）ＭＪ２３３由来のＲＮＡポリメラーゼの主要シグマ
因子をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＲＮＡポリメラーゼのシグマ因子は大き
く２つのグループに分けることができる。１つは、主要
シグマ因子と呼ばれる、主要プロモ−タ−を認識するタ
ンパク質性因子であり、通常の生理状態下での生育にお
ける全ての必須遺伝子は、主要シグマ因子によって認識
されるプロモーターを持つものと考えられている。一
方、もう１つのシグマ因子のグループは、置換型シグマ
因子と呼ばれ、主要シグマ因子とは異なる一群のプロモ
ーター配列を認識し、特定の条件のもとで主要シグマ因
子と置き換わって機能を発揮するものである。

【０００３】プロモ−タ−は構造遺伝子の発現調節に重
要な役割を果たしているため、主要プロモ−タ−認識能
を有するｒｐｏＤ遺伝子を単離し、そのｒｐｏＤ遺伝子
によってコードされるタンパク質との相互作用を調べる
ことにより、構造遺伝子を高発現させる強力プロモータ
ーの開発が可能となる。ＲＮＡポリメラーゼの主要シグ
マ因子をコードする遺伝子（以下これを「ｒｐｏＤ遺伝
子」と略称する。）については微生物ではエシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来の遺
伝子（Ｎｕｃｌｅｉｃ． ＡｃｉｄｓＲｅｓ． ９，
ｐ．２８８９ （１９８１））、バシルス・サチルス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の遺伝子
（Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０， ｐ．７１７
８， （１９８５））、ストレプトマイセス・セリカラ
ー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏ
ｒ）由来の遺伝子（Ｇｅｎｅ．１０７， ｐ．１４５
（１９９１））、シュードモナス・アルギノーサ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の遺
伝子（ＧｅｎＢａｎｋ， Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｄ９０
１１８）等が単離され、その塩基配列が決定されてい
る。

【０００４】しかしながら、アミノ酸や核酸合成等、産
業上重要な細菌であるブレビバクテリウム属細菌を含む
コリネ型細菌由来のｒｐｏＤ遺伝子の塩基配列について
は、本発明者の知る限り報告例がない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、コリネ型細
菌内で発現可能な、コリネ型細菌由来のｒｐｏＤ遺伝子
を含むＤＮＡ断片の提供を目的としてなされたものであ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、遺伝子組み換えの
手法を駆使することにより、コリネ型細菌からｒｐｏＤ
遺伝子が単離可能であることを見い出し、本発明を完成
するに至った。すなわち、本発明の要旨は、 １．ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ２３３由来のＲＮＡ
ポリメラーゼの主要シグマ因子をコードする遺伝子を含
むＤＮＡ断片、 ２．大きさが約６．５ｋｂであり、両末端にＥｃｏＲＩ
部位を有し、下記表に記載の制限酵素で切断した場合、
下記表に記載する認識部位数と切断断片の大きさを示
す、上記遺伝子を含有するＤＮＡ断片、

【０００７】

【表２】 ────────────────────────────────── 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ────────────────────────────────── ＰｓｔＩ １ １．７， ４．８ ＨｉｎｃＩＩ ２ １．２， １．５， ３．８ ＨｉｎｄＩＩＩ ２ １．５， ２．２， ２．８ ──────────────────────────────────

【０００８】３．配列表の配列番号１のアミノ酸配列で
示される、ＲＮＡポリメラーゼの主要シグマ因子をコー
ドする遺伝子、および ４．配列表の配列番号１の塩基配列で示される、ＲＮＡ
ポリメラーゼの主要シグマ因子をコードする遺伝子に存
する。 かくして本発明によれば、後記配列表の配列番号１記載
のアミノ酸配列で示されるＲＮＡポリメラーゼの主要シ
グマ因子をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が提供さ
れる。以下、本発明につき詳細に説明する。

【０００９】本発明の「ＲＮＡポリメラーゼの主要シグ
マ因子をコードする遺伝子」とは、ＲＮＡポリメラーゼ
のコア酵素に特異的転写開始能を与える因子である主要
シグマ因子をコードする遺伝子、すなわちｒｐｏＤ遺伝
子を意味するものであり、該遺伝子を含むＤＮＡ断片を
「ｒｐｏＤ断片」と略称することがある。

【００１０】（１）ｒｐｏＤ遺伝子の単離 本発明のｒｐｏＤ断片は、その塩基配列が決定された後
においては合成することも可能であるが、通常は、コリ
ネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒ
ｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３
３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）株等の染色体上に存在
し、この染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で切断すること
により生ずる切断断片の中から以下に述べる方法で分
離、取得することができる。

【００１１】（１）−１ 染色体ＤＮＡライブラリーの
作製 まず、上記コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ−２３３を常法（例えば、特開昭５１−１
３０５９２）に従い培養し、培養物から菌体を集め、該
菌体から染色体ＤＮＡを抽出する。染色体ＤＮＡは、公
知の方法（例えば、特開平５−１５３７８号公報 実施
例１（Ａ）記載）等により菌体から容易に抽出すること
ができる。この染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えば
ＥｃｏＲ〓を用いて切り出し、得られたＤＮＡ断片を適
当なクローニングベクター、例えばｐＵＣ１１８（宝酒
造製）に挿入し、このベクターを用いてエシェリヒア・
コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、形質転換体
を取得する。

【００１２】（１）−２ クローンの選択 得られる形質転換体よりプラスミドＤＮＡを抽出し、エ
シェリヒア・コリ由来のｒｐｏＤ遺伝子（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９， ｐ．２８８９
（１９８１））及びバシルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｒｐｏＤ遺伝子（Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０， ｐ．７１７８，
（１９８５））の共通領域配列をプロ−ブとして用いる
サザンハイブリダイセーションにより挿入されたブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株由来のｒｐｏＤ
遺伝子を確認することができる。

【００１３】（２）遺伝子の配列決定 該ｒｐｏＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片の１つとして、上記
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の染色体Ｄ
ＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出すことによって得ら
れる大きさ約６．５ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることがで
きる。この大きさ約６．５ｋｂのｒｐｏＤ断片の塩基配
列は、プラスミドｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９等を用い
るジデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃ
ｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ 法；Ｓａｎｇｅｒ，
Ｆ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７４，５４６３， （１９
７７））により決定することができる。このようにして
決定した上記大きさ約６．５ｋｂのＤＮＡ断片中のｒｐ
ｏＤ遺伝子の配列を配列表の配列番号１に示す。

【００１４】（３）遺伝子の解析 この配列中に存在するオープンリーディングフレームか
ら、該ｒｐｏＤ遺伝子は、配列表の配列番号１記載のア
ミノ酸配列をコードするものであることが明らかとなっ
た。こうして得られたｒｐｏＤ遺伝子の分子量は、該ｒ
ｐｏＤ遺伝子を高発現させ、電気泳動を行うことで確認
する事ができる。さらには既知のｒｐｏＤ蛋白（ＲＮＡ
ポリメラーゼの主要シグマ因子をｒｐｏＤ蛋白と略称す
ることがある。）から準備した抗体（抗ｒｐｏＤ抗体）
を用いたウェスタンブロット法で、抗ｒｐｏＤ抗体との
交差反応を検出すれば、構造及び機能の類似性が確認で
きる（Ｊ．Ｂａｃ． １７２， ｐ．８０， （１９９
０））。

【００１５】本発明におけるｒｐｏＤ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片としては、天然の細菌染色体ＤＮＡ、例えばコリ
ネ型細菌染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、
通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばベックマン社製
システム−１プラス（Ｓｙｓｔｅｍ−１ Ｐｌｕｓ）を
用いて合成されたものであってもよい。また、前記の如
くブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３等の細菌
染色体から取得される本発明のＤＮＡ断片は、ＲＮＡポ
リメラーゼの主要シグマ因子をコードする機能を実質的
に損なうことがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の
塩基と置換されていても、削除されていてもよく、新た
に塩基が挿入されていてもよく、あるいは塩基配列の一
部が転移されているものであってもよく、さらにそれら
の塩基配列にハイブリダイズする塩基配列であってもよ
く、これらの誘導体のいずれもが、本発明のｒｐｏＤ遺
伝子を含むＤＮＡ断片に包含されるものである。

【００１６】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、実施例は本発明の具体的な認識を得る一助
とみなすべきものであり、本発明の範囲を些かなりとも
限定するものではない。

【００１７】実施例１ ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３由来のｒｐｏＤ部分断片のクローン化 （Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９８）菌体を、白金耳にて１０ｍＬの半合
成培地Ａ培地（組成：尿素２ｇ、（ＮＨ₄ ）₂ＳＯ₄
７ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０. ５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．５
ｇ、ＭｇＳＯ₄０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂Ｏ ６ｍ
ｇ、ＭｎＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２.
５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チア
ミン２００μｇ及びグルコース２０ｇを蒸留水１Ｌに溶
解）に植菌し、３０〜３３℃で１２〜１６時間振盪培養
（前培養）した。次にＡ培地１００ｍＬに前培養液を２
％植菌し、３１℃で１０〜１６時間振盪して対数増殖期
後期まで培養した。この培養液を遠心分離（５，０００
×ｇ、１０分間、１５〜２０℃）し、菌体を集めた。

【００１８】得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にな
るよう、１０μｇ／ｍＬリゾチーム、ＮａＣｌ−２０ｍ
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ・
２Ｎａを含む水溶液（各成分の濃度は最終濃度である）
に懸濁した。次にプロテナーゼＫをその最終濃度が１０
０μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温
した。さらにドデシル硫酸ナトリウムをその最終濃度が
０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して
溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホ
ルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した
後、全量を遠心分離（３，８００×ｇ、１５分間、１５
〜２０℃）し、上清画分を分取した。この上清に酢酸ナ
トリウムを０．３Ｍとなるよう添加した後、全液量に対
して２倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエ
タノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきと
り、７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られ
たＤＮＡに１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．５）、１
ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａを含む水溶液５ｍＬを加え、４
℃で一晩静置し、鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲに使用した。

【００１９】（Ｂ）プライマーの選択 ｒｐｏＤ遺伝子はエシェリヒア・コリ由来、バチルス・
サチルス由来のものなど多種において塩基配列が決定さ
れている（Ｎｕｃｌｅｉｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
９， ｐ．２８８９ （１９８１）、及びＪ．Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ．２６０， ｐ．７１７８， （１９８
５）参照）。これら多種の微生物間で保存されている領
域、特にＤＮＡ塩基配列において保存されている領域を
検討し、１対のプライマー（５’側プライマ−：５’−
ＡＴＣＣＡＣＣＡＣＧＴＣＧＣＧＴＡＣＧＴ−３’（配
列表の配列番号２）；３’側プライマ−：５’−ＧＣＧ
ＡＧＣＧＣＡＴＴＣＧＣＣＡＡＡＴＴ−３’（配列表の
配列番号３））を選択し、アプライド・バイオシステム
ズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３９４
ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ
ｒ ）を用いて合成した。

【００２０】（Ｃ）ＰＣＲ 実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製のＤＮ
Ａサーマルサイクラーを用い、反応試薬としてレコンビ
ナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック
（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＴａｑＤＮＡ Ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ ＴａＫａＲａ Ｔａｑ）（宝酒造製）を用
いて下記の条件で行った。 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μＬ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μＬ 鋳型ＤＮＡ １０μＬ（ＤＮ
Ａ 含有量１μＭ以下） 上記（Ｂ）項で作成したプライマー 各々１μＬ（最
終濃度０．２５μＭ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．
５μＬ 滅菌蒸留水 ６１．５μＬ 以上を混合し、この１００μＬの反応液をＰＣＲにかけ
た。

【００２１】ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：３７℃ １２０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １８０秒 以上を１サイクルとし、３０サイクル行った。 （Ｄ）反応物の検出 上記（Ｃ）項で得られた反応液１０μＬを２％アガロー
スゲルにより電気泳動を行い、約０．５ｋｂのＤＮＡ断
片を検出した。 （Ｅ）増幅断片のクローン化 上記（Ｃ）項で得た反応液３μＬとＰＣＲ産物クローニ
ングベクターｐＧＥＭ−Ｔベクター（ＰＲＯＭＥＧＡ社
より市販）１μＬを混合し、（１０×）Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ緩衝液１μＬ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各
成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μＬにして、１５℃で
３時間反応させ、結合させた。

【００２２】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、５３巻、ページ１５９（１９７
０））によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造
製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地
（トリプトン １０ｇ、イースト・エキストラクト５
ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶
解）に塗抹した。

【００２３】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔの長さ３．０ｋｂのＤＮ
Ａ断片に加え、長さ約０．５ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認
められた。

【００２４】実施例２ 増幅断片の塩基配列の決定 実施例１の（Ｅ）項で得られた大きさが約０．５ｋｂの
挿入断片について、その塩基配列をジデオキシヌクレオ
チド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｏｎ法）（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ．ｅｔ ａｌ．、プ
ロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンス（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆ Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ）、
７４巻、ページ５４６３（１９７７））により決定し
た。塩基配列決定の結果、該挿入断片は大腸菌、枯草菌
由来のｒｐｏＤ遺伝子の一部、すなわちＰＣＲに使用し
たプライマーによって挟まれる領域と高いホモロジーを
示し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来
のｒｐｏＤ遺伝子の一部をクローニングしたことを確認
した。

【００２５】実施例３ ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３由来のｒｐｏＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片の
クローン化 上記実施例１の（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３の全ＤＮＡ溶液の９０μＬを、制限
酵素ＥｃｏＲＩ ５ｕｎｉｔｓを用い、３７℃で１０分
間反応させ部分分解した。この分解ＤＮＡとλＺａｐＩ
Ｉ／ＥｃｏＲＩパーシャル・フィル−イン・ベクター・
キット（Ｐａｒｔｉａｌ Ｆｉｌｌ−Ｉｎ Ｖｅｃｔｏ
ｒ Ｋｉｔ）及び、クレノウ・フラグメント（Ｋｌｅｎ
ｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ ）（東洋紡績製）を用いて、
プロトコールに従いλＤＮＡライブラリーを作成した。

【００２６】次に、λＤＮＡライブラリーファージ溶液
（２〜５×１０⁴ ｐｆｕ; ＳＭ緩衝液希釈）とエシェリ
ヒア・コリＰ２３９２（東洋紡績製）の培養液を当量混
合し３７℃で１５分間保温した。これに５０℃にて保温
しておいた３〜４ｍＬのλ培地（トリプトン１０ｇ、イ
ースト・エクストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、ＭｇＳ
Ｏ₄ ・７Ｈ₂Ｏ ２ｇ及び寒天５ｇを蒸留水１Ｌに溶
解）を加えλプレート（トリプトン１０ｇ、ＮａＣｌ
５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ２ｇ及び寒天１０ｇを蒸
留水１Ｌに溶解）に均一に塗布し、３７℃で１２〜１６
時間培養した。

【００２７】この培地上に形成されたプラークをニトロ
セルロースフィルター上に吸着させ、ＮａＯＨ ２０ｇ
及びＮａＣｌ ８７．５ｇを蒸留水に溶解し、１Ｌとし
た溶液に浸した濾紙上に５分間のせて処理した。続い
て、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２１．
２ｇとＮａＣｌ ３０ｇを蒸留水に溶解し、６ＮのＨＣ
ｌでｐＨ７．０に調整して１Ｌとした溶液に浸した濾紙
上に５分間のせて処理し、このフイルターを風乾後、８
０℃にて２時間乾熱処理を行いＤＮＡを固定した。

【００２８】実施例１（Ｃ）に記載のＰＣＲ法で得たｒ
ｐｏＤ部分断片をプローブとし、上記で作成したフィル
ターでプラークハイブリダイゼーションを行った。この
時プローブは、ランダムラベリングキット（宝酒造製）
を用いて作製した。プラークハイブリダイゼーション
は、常法（モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ）、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ）刊（１９８
９））の通り行った。この結果、陽性のプラークを選択
することができ、そこからファージＤＮＡを抽出して、
制限酵素ＥｃｏＲＩより切り出される大きさが６．５ｋ
ｂの挿入断片を確認した。これを、プラスミドｐＵＣ１
１８のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ｒｐｏＤ遺伝子全領域
の確認に用いた。この大きさが６．５ｋｂのＤＮＡ断片
を各種の制限酵素で切断したときの認識部位数および切
断断片の大きさは前記表１に示したとおりであった。そ
の制限酵素切断点地図を図１に示す。

【００２９】実施例４ ｒｐｏＤ遺伝子全領域の確認 実施例３で得られた大きさが６．５ｋｂのＤＮＡ断片上
に存在するｒｐｏＤ遺伝子の存在部位を特定するため
に、下記の操作によりその塩基配列を決定した。大きさ
が６．５ｋｂのＤＮＡ断片溶液１４μＬを、制限酵素Ｓ
ａｕ３ＡＩ ５ｕｎｉｔｓを用い、３７℃で１〜５分間
反応させ部分分解した。一方、クローニングベクターｐ
ＵＣ１１８（宝酒造より市販）を制限酵素ＢａｍＨＩで
切断し、脱リン酸化処理をした。このベクターと先程の
部分分解ＤＮＡ断片とを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ
ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂及びＴ４ＤＮＡリガーゼ
１ｕｎｉｔ の各成分（各成分の濃度は最終濃度であ
る）を添加し、１６℃で１０時間反応させ結合させた。

【００３０】上記と同様に大きさが６．５ｋｂのＤＮＡ
断片溶液１４μＬを、制限酵素ＴａｑＩ ５０ｕｎｉｔ
ｓを用い、５〜８分間反応させ部分分解した。クローニ
ングベクターｐＵＣ１１８は制限酵素ＡｃｃＩで切断
し、脱リン酸化処理を行い上記と同様にして部分分解Ｄ
ＮＡ断片と結合させた。上記で得られたプラスミド混液
を用い、塩化カルシウム法（ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ ） 、５３巻、ページ１
５９（１９７０））によりエシェリヒア・コリＪＭ１０
９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／
ｍＬを含む培地（トリプトン１０ｇ、イーストエキスト
ラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水
１Ｌに溶解）に塗末した。

【００３１】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、カタリスト
８００モレキュラー・バイオロジー・ラボステーショ
ン；アプライド・バイオシステム社製（ＣＡＴＡＬＹＳ
Ｔ ８００ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌ
ａｂｏｓｔａｔｉｏｎ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ社製）を用いてプロトコールに従い反応させた
後、３７３Ａ ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により各々のプラスミドの
挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。そしてこれら個
々の配列の連結はシーケンス解析ソフト インヘリット
（ＩＮＨＥＲＩＴ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ社製）を用いて行い全塩基配列を決めた。その塩基
配列中のオープンリーディングフレームの存在から、ｒ
ｐｏＤ遺伝子は配列表の配列番号１記載の塩基配列を有
することが明かとなった。

【００３２】

【発明の効果】本発明により提供されるｒｐｏＤ遺伝子
を含むＤＮＡ断片を用いてコリネ型細菌を育種改良する
ことにより、構造遺伝子を高発現させることのできる、
強力なプロモーターの解析、開発が可能となる。

【００３３】

【配列表】配列番号 ：１ 配列の長さ：１１１６ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム 株名 ：MJ-233 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置 ：１−１１１６ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG ATA CAG GAC TTC GAC GGC GAT GAC TTC GTA GAC GGC ATC GAA GAC 48 Met Ile Gln Asp Phe Asp Gly Asp Asp Phe Val Asp Gly Ile Glu Asp 1 5 10 15 GAA GAA GAT GAA GAC GGC GTC GAA GCC CTC GGT GAA GAA GGC GAA GAC 96 Glu Glu Asp Glu Asp Gly Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu Gly Glu Asp 20 25 30 GAC GAA GAG GAC GGC TCA TCC GTT TGG GAT GAA GAC GAA TCC GCA ACC 144 Asp Glu Glu Asp Gly Ser Ser Val Trp Asp Glu Asp Glu Ser Ala Thr 35 40 45 CTG CGT CAG GCA CGT AAA GAT GCC GAG CTC ACC GCT TCC GCC GAC TCT 192 Leu Arg Gln Ala Arg Lys Asp Ala Glu Leu Thr Ala Ser Ala Asp Ser 50 55 60 GTT CGC GCT TAC CTG AAG CAA ATC GGT AAA GTT GCC CTG CTG AAC GCT 240 Val Arg Ala Tyr Leu Lys Gln Ile Gly Lys Val Ala Leu Leu Asn Ala 65 70 75 80 GAA CAG GAA GTC TCC CTG GCA AAG CGC ATC GAA GCA GGC CTT TAC GCC 288 Glu Gln Glu Val Ser Leu Ala Lys Arg Ile Glu Ala Gly Leu Tyr Ala 85 90 95 ACC CAC CGC ATG GAG GAA ATG GAA GAA GCT TTC GCA GCC GGT GAC AAG 336 Thr His Arg Met Glu Glu Met Glu Glu Ala Phe Ala Ala Gly Asp Lys 100 105 110 GAC GCG AAA CTC ACC CCA GCC GTC AAG CGT GAC CTC CGC GCC ATC GCT 384 Asp Ala Lys Leu Thr Pro Ala Val Lys Arg Asp Leu Arg Ala Ile Ala 115 120 125 CGT GAC GGC CGC AAG GCG AAA AAC CAC CTC CTG GAA GCC AAC CTT CGT 432 Arg Asp Gly Arg Lys Ala Lys Asn His Leu Leu Glu Ala Asn Leu Arg 130 135 140 CTG GTT GTC TCC CTG GCA AAG CGC TAC ACC GGC CGT GGC ATG GCA TTC 480 Leu Val Val Ser Leu Ala Lys Arg Tyr Thr Gly Arg Gly Met Ala Phe 145 150 155 160 CTG GAC CTC ATC CAG GAA GGC AAC CTC GGT CTG ATT CGT GCC GTA GAG 528 Leu Asp Leu Ile Gln Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu 165 170 175 AAG TTC GAC TAC TCC AAG GGC TAC AAG TTC TCC ACC TAC GCA ACC TGG 576 Lys Phe Asp Tyr Ser Lys Gly Tyr Lys Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp 180 185 190 TGG ATC CGG CAG GCA ATC ACC CGC GCC ATG GGC GAC CAA GCA CGA ACC 624 Trp Met Arg Gln Ala Ile Thr Arg Ala Met Gly Asp Gln Ala Arg Thr 195 200 205 ATC CGT ATC CCA GTC CAC ATG GTT GAA GTG ATC AAC AAA CTT GGT CGC 672 Ile Arg Ile Pro Val His Met Val Glu Val Ile Asn Lys Leu Gly Arg 210 215 220 ATC CAA CGT GAA CTC CTT CAG GAA CTC GGC CGC GAA CCA ACC CCA CAG 720 Ile Gln Arg Glu Leu Leu Gln Glu Leu Gly Arg Glu Pro Thr Pro Gln 225 230 235 240 GAA CTG TCC AAA GAA ATG GAC ATC TCC GAG GAA AAG GTA CTG GAA ATC 768 Glu Leu Ser Lys Glu Met Asp Ile Ser Glu Glu Lys Val Leu Glu Ile 245 250 255 CAG CAG TAC GCC CGC GAA CCA TTC TCC CTG GAC CAA ACC ATC GGC GAC 816 Gln Gln Tyr Ala Arg Glu Pro Phe Ser Leu Asp Gln Thr Ile Gly Asp 260 265 270 GAA GGa GAC AGC CAG CTC GGC GAC TTC ATC GAA GAC TCC GAA GCC GTC 864 Glu Gly Asp Ser Gln Leu Gly Asp Phe Ile Glu Asp Ser Glu Ala Val 275 280 285 GTC GCA GTT GAC GCC GTC TCC TTC ACC CTG CTT GAA GAA CAG TTA CAG 912 Val Ala Val Asp Ala Val Ser Phe Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu Gln 290 295 300 GAC GTC CTA GAG TCC CTC TCC GAA CGT GAA GCC GGC GTG GTT AAA CTC 960 Asp Val Leu Glu Ser Leu Ser Glu Arg Glu Ala Gly Val Val Lys Leu 305 310 315 320 CGC TTC GGA CTC ACC GAC GGA ATG CCA CGC ACT TTA GAC GAA ATC GGC 1008 Arg Phe Gly Leu Thr Asp Gly Met Pro Arg Thr Leu Asp Glu Ile Gly 325 330 335 CAA GTT TAC GGT GTC ACC CGT GAG CGC ATC CGC CAG ATT GAG TCC AAG 1056 Gln Val Tyr Gly Val Thr Arg Glu Arg Ile Arg Gln Ile Glu Ser Lys 340 345 350 ACC ATG TCT AAG CTG CGC CAC CCA TCA CGC TCC CAG GTC CTT CGC GAC 1104 Thr Met Ser Lys Leu Arg His Pro Ser Arg Ser Gln Val Leu Arg Asp 355 360 365 TAC CTG GAC TAA 1116 Tyr Leu Asp 370

【００３４】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：その他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATCCACCACG TCGCGTACGT 20

【００３５】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：その他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCGAGCGCAT TCGCCAAATT 20

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＲＮＡポリメラーゼの主要シグマ因子
をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（６．５ｋｂ，Ｅ
ｃｏＲＩ断片）の制限酵素切断点地図を表す図面であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央八丁目３番１号 三菱化学株式会社筑波研究所内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅ
   ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ２３３由
   来のＲＮＡポリメラーゼの主要シグマ因子をコードする
   遺伝子を含むＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 大きさが約６．５ｋｂであり、両末端に
   ＥｃｏＲＩ部位を有し、下記表に記載の制限酵素で切断
   した場合、下記表に記載する認識部位数と切断断片の大
   きさを示す請求項１記載のＤＮＡ断片。 【表１】 ────────────────────────────────── 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ────────────────────────────────── ＰｓｔＩ １ １．７， ４．８ ＨｉｎｃＩＩ ２ １．２， １．５， ３．８ ＨｉｎｄＩＩＩ ２ １．５， ２．２， ２．８ ──────────────────────────────────
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１のアミノ酸配列で示
   される、ＲＮＡポリメラーゼの主要シグマ因子をコード
   する遺伝子。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号１の塩基配列で示され
   る、ＲＮＡポリメラーゼの主要シグマ因子をコードする
   遺伝子。