KR20230136408A - 카르바모일 인산 합성효소 라지 서브유닛 변이체 및 이를 이용한 l-오르니틴 생산 방법 - Google Patents

카르바모일 인산 합성효소 라지 서브유닛 변이체 및 이를 이용한 l-오르니틴 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 카르바모일 인산 합성효소 라지 서브유닛 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 변이체 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물 및 이를 이용한 L-오르니틴 생산 방법에 관한 것이다.

Description

카르바모일 인산 합성효소 라지 서브유닛 변이체 및 이를 이용한 L-오르니틴 생산 방법{Microorganism producing L-amino acid and L-amino acid production method using the same}
본 출원은 카르바모일 인산 합성효소 라지 서브유닛 변이체 및 이를 이용한 L-오르니틴 생산 방법에 관한 것이다.
미생물을 이용한 L-아미노산을 생산하는 과정에서 ATP는 생합성 효소들의 cofactor로써 사용되거나 세포 성장 및 다양한 활성 유지 대사과정에 사용되는 중요한 물질이다.
카르바모일 인산(Carbamoyl-phosphate)은 피리미딘 생합성 경로 및 아르기닌 생합성 경로에 사용되는 중간 대사물이다. 카르바모일 인산 합성효소(Carbamoyl-phosphate synthetase)는 바이카르보네이트(bicarbonate)를 카르바모일 인산으로 전환하는 효소로, 카르바모일 인산 생성시 2분자의 ATP와 질소 공여체로써 1분자의 글루타민을 사용한다. 글루타민은 글루탐산을 기질로 하여 글루타민 합성효소에 의해 생성되며, 이 과정에서 1분자의 ATP가 소모된다.
이와 관련하여, 대장균에 피드백 저해가 탈감작되고 높은 활성을 유지하는 변이형 카르바모일 인산 합성효소 도입 시 L-아르기닌, 시트룰린 및 피리미딘 유도체의 생산능 증가하는 것이 보고된 바 있다(특허문헌 1).
그러나, 세포 내 과도한 카르바모일 인산 형성은 세포 독성을 일으킨다는 보고가 있다(비특허문헌 1). 카르바모일 인산은 매우 불안정한 물질이며 카르바모일 인산에서 자연적으로 전환되는 시아네이트(cyanate)는 세포독성을 일으킬 수 있다.
따라서, 미생물에서 카르바모일 인산 합성효소의 활성을 조절하여 세포 내에 적정 수준의 카르바모일 인산을 유지하고 ATP의 불필요한 낭비를 방지 및 에너지 균형을 조절할 수 있다면 L-아미노산 생산능을 향상시킬 수 있다.
JP 2003-093083 A
Charlier et al., Amino Acids. 2018; 50(12): 1647-1661.
본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 799번째 위치에 상응하는 아미노산이 아이소류신, 류신 또는 발린으로 치환; 918번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신 또는 발린으로 치환; 1079번째 위치에 상응하는 아미노산이 아이소류신, 류신 또는 발린으로 치환; 또는 이들의 조합을 포함하는, 코리네박테리움 속(the genus of Corynebacterium) 유래 카르바모일 인산 합성효소 라지 서브유닛(Carbamoyl phosphate synthase large subunit, CarB) 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이체; 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이체; 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-오르니틴 생산 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 출원이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 출원의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 출원의 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 799번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환; 918번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환; 1079번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환; 또는 이들의 조합을 포함하는, 코리네박테리움 속(the genus of Corynebacterium) 유래 카르바모일 인산 합성효소 라지 서브유닛(Carbamoyl phosphate synthase large subunit, CarB) 변이체를 제공한다.
본 출원의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 799번째 또는 918번째 또는 1079번째에 상응하는 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 치환 전 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 또는 상기 변이체는 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged amino acid)을 갖는, 치환 전 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된, 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 i) 799번째 위치에 상응하는 아미노산이 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 아스파르트산, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산으로 치환, ii) 918번째 위치에 상응하는 아미노산이 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 아스파르트산, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산으로 치환, 또는 iii) 1079번째 위치에 상응하는 아미노산이 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산으로 치환된 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 i) 799번째 위치에 상응하는 아미노산이 알라닌, 아이소류신, 류신 및 발린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산으로 치환, ii) 918번째 위치에 상응하는 아미노산이 알라닌, 아이소류신, 류신 및 발린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산으로 치환, 또는 iii) 1079번째 위치에 상응하는 아미노산이 알라닌, 아이소류신, 류신 및 발린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산으로 치환된 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
보다 더욱 구체적으로, 본 출원의 변이체는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11 또는 서열번호 13 또는 서열번호 15 또는 서열번호 17 또는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23 또는 서열번호 25로 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다.
본 출원의 변이체는 상기 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11 또는 서열번호 13 또는 서열번호 15 또는 서열번호 17 또는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23 또는 서열번호 25로 기재된 아미노산 서열에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 기준으로 799번 위치에 상응하는 아미노산이 알라닌, 아이소류신, 류신 및 발린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산이거나, 918번 위치에 상응하는 아미노산이 알라닌, 아이소류신, 류신 및 발린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산이거나, 및/또는 1079번 위치에 상응하는 아미노산이 알라닌, 아이소류신, 류신 및 발린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산이고, 상기 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 변이체에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이체도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 출원의 변이체의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.
예를 들면, 전하를 띠는 곁사슬(electrically charged amino acid)을 갖는 아미노산 중 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘을, 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하고; 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged side chain)을 갖는 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 글루타민을 포함하는 것으로 분류할 수 있다.
본 출원에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)되어 상기 변이체의 변이 전 아미노산 서열과 상이하나 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 폴리펩티드의 특성을 평가하여 동정(identify)될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 변이 전 폴리펩티드에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이형 폴리펩티드, 변이된 단백질, 변이 및 변이체 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 목적상 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 799번 위치에 상응하는 아미노산인 글루탐산이 알라닌, 아이소류신, 류신 및 발린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산으로 치환되거나, 918번 위치에 상응하는 아미노산인 글루탐산이 알라닌, 아이소류신, 류신 및 발린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산으로 치환되거나, 및/또는 1079번 위치에 상응하는 아미노산인 트레오닌이 알라닌, 아이소류신, 류신 및 발린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산으로 치환된, 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11 또는 서열번호 13 또는 서열번호 15 또는 서열번호 17 또는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23 또는 서열번호 25로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 변이체의 N-말단에는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이동(translocation)에 관여하는 시그널(또는 리더) 서열이 컨쥬게이트 될 수 있다. 또한 상기 변이체는 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
본 출원에서 용어, '상동성 (homology)' 또는 '동일성 (identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ET AL/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
본 출원의 일 예로, 본 출원의 변이체는 L-오르니틴 생산능이 증가된 것일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 변이체는 카르바모일 인산 합성효소 활성을 갖는 야생형 폴리펩티드에 비해 L-오르니틴 생산능이 증가되도록 하는 활성을 가질 수 있다.
본 출원에서 용어, "카르바모일 인산 합성효소(Carbamoyl-phosphate synthetase)"은 바이카르보네이트(bicarbonate)를 카르바모일 인산(Carbamoyl-phosphate)으로 전환하는 효소를 의미한다.
상기 카르바모일 인산 합성효소는 카르바모일 인산 합성효소 스몰 서브유닛(Carbamoyl phosphate synthase small subunit, CarA) 및 카르바모일 인산 합성효소 라지 서브유닛(Carbamoyl phosphate synthase large subunit, CarB)로 이루어질 수 있으며, CarA 또는 CarB의 아미노산 서열은 공지의 데이터베이스인 NCBI의 Genebank 등에서 얻을 수 있다.
일 예로, 본 출원의 CarB는 미생물로부터 유래하는 것일 수 있다. 상기 미생물은, 구체적으로 코리네박테리움 속 미생물로부터 유래하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae) 등으로부터 유래하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 CarB의 변이체를 제공할 수 있다.
다른 일예로, 본 출원의 CarB의 아미노산은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 유래 ANU33812.1일 수 있으나, 다양한 유래의 CarB 활성을 갖는 단백질을 포함하는 것은 자명하다.
본 출원의 목적상, 본 출원의 변이체는 카르바모일 인산 합성효소 라지 서브유닛 변이체, 즉 CarB 변이체일 수 있다.
상기 CarB는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스인 미국국립보건원 진뱅크(NIH GenBank)에서 얻을 수 있다. 본 출원에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 상기 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 출원의 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
본 출원에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.
예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 1과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 1의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.
이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needleman 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11 또는 서열번호 13 또는 서열번호 15 또는 서열번호 17 또는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23 또는 서열번호 25로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 출원의 일 예로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8 또는 서열번호 10 또는 서열번호 12 또는 서열번호 14 또는 서열번호 16 또는 서열번호 18 또는 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24 또는 서열번호 26의 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8 또는 서열번호 10 또는 서열번호 12 또는 서열번호 14 또는 서열번호 16 또는 서열번호 18 또는 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24 또는 서열번호 26의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다.
본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8 또는 서열번호 10 또는 서열번호 12 또는 서열번호 14 또는 서열번호 16 또는 서열번호 18 또는 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24 또는 서열번호 26의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 4 또는 서열번호 6 또는 서열번호 8 또는 서열번호 10 또는 서열번호 12 또는 서열번호 14 또는 서열번호 16 또는 서열번호 18 또는 서열번호 20 또는 서열번호 22 또는 서열번호 24 또는 서열번호 26의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 상기 상동성 또는 동일성을 갖는 서열에서, 서열번호 1의 799번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은 알라닌, 아이소류신, 류신 및 발린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있고, 서열번호 1의 918번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은 알라닌, 아이소류신, 류신 및 발린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있으며, 서열번호 1의 1079번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은 알라닌, 아이소류신, 류신 및 발린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 6% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다. 상기 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에서 발현시키기 위한 발현 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원에서 용어, "미생물(또는, 균주)"는 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩티드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.
본 출원의 균주는 본 출원의 변이체, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 및 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 균주; 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 변형된 균주; 본 출원의 변이체, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 균주 (예컨대, 재조합 균주); 또는 본 출원의 변이체 활성을 갖는 균주 (예컨대, 재조합 균주)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 하나의 예로, 본 출원의 균주는 L-오르니틴 생산능을 가진 균주일 수 있다.
본 출원의 미생물은 L-오르니틴 생산능이 향상된 것일 수 있다.
본 출원의 균주는 자연적으로 카르바모일 인산 합성효소 또는 L-오르니틴 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 모균주에 본 출원의 변이체 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터)가 도입되거나 및/또는 L-오르니틴 생산능이 부여된 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 본 출원의 균주는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 본 출원의 변이체를 발현하는 세포 또는 미생물로서, 본 출원의 목적상 본 출원의 균주는 본 출원의 변이체를 포함하여 L-오르니틴을 생산할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 균주는 천연의 야생형 미생물 또는 L-오르니틴을 생산하는 미생물에 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입됨으로써 카르바모일 인산 합성효소 라지 서브유닛 변이체가 발현되어, L-오르니틴 생산능이 증가된 재조합 균주일 수 있다. 상기 L-오르니틴 생산능이 증가된 재조합 균주는, 천연의 야생형 미생물 또는 카르바모일 인산 합성효소 비변형 미생물 (즉, 야생형 카르바모일 인산 합성효소(서열번호 1)를 발현하는 미생물 또는 변이형(서열번호 3 또는 서열번호 5 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9 또는 서열번호 11 또는 서열번호 13 또는 서열번호 15 또는 서열번호 17 또는 서열번호 19 또는 서열번호 21 또는 서열번호 23 또는 서열번호 25) 단백질을 발현하지 않는 미생물)에 비하여 L-오르니틴 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그 예로, 상기 L-오르니틴 생산능의 증가 여부를 비교하는 대상 균주인, 카르바모일 인산 합성효소 비변형 미생물은 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 균주, L-오르니틴 생산 균주로 알려진 ArgF 단백질의 활성이 약화된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 균주, ArgR 단백질의 활성이 약화된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 L-오르니틴 생산능에 비하여 약 1% 이상, 구체적으로는 약 1% 이상, 약 2.5% 이상, 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 16% 이상, 약 17% 이상, 약 18% 이상, 약 19% 이상 또는 약 20% 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 200% 이하, 약 150% 이하, 약 100% 이하, 약 50% 이하, 약 40% 이하, 약 30% 이하, 약 20% 이하 또는 약 15% 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 생산능에 비해 +값의 증가량을 갖는 한, 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물에 비하여, L-오르니틴 생산능이 약 1.01배 이상, 약 1.02배 이상, 약 1.03배 이상, 약 1.05배 이상, 약 1.06배 이상, 약 1.07배 이상, 약 1.08배 이상, 약 1.09배 이상, 약 1.10배 이상, 약 1.15배 이상, 약 1.16배 이상, 약 1.17배 이상, 약 1.18배 이상, 약 1.19배 이상 또는 약 1.20배 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 10배 이하, 약 5배 이하, 약 3배 이하, 또는 약 2배 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 본 명세서에 기재된 카르바모일 인산 합성효소 라지 서브유닛 변이체가 도입되지 않거나 도입되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 "변형 전 균주", "변형 전 미생물", "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 예로, 본 출원의 미생물은 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 예로, 본 출원의 재조합 미생물은, L-아미노산 생합성 경로 내 단백질 일부의 활성이 추가적으로 강화되거나, L-아미노산 분해 경로 내 단백질 일부의 활성이 추가적으로 약화되어 L-아미노산 생산능이 강화된 미생물일 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 미생물은 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 서브유닛 F(Ornithine carbamoyltransferase subunit F, ArgF)의 활성이 추가로 약화되거나, 이를 코딩하는 argF 유전자가 추가로 결손된 미생물 및/또는 아르기닌 억제자(Arginine repressor, ArgR)의 활성이 추가로 약화되거나, 이를 코딩하는 argR 유전자가 추가로 결손된 미생물일 수 있다.
상기 ArgF 또는 ArgR의 아미노산 서열은 공지의 데이터베이스인 NCBI의 Genebank 등에서 얻을 수 있다. 일 예로, 본 출원의 ArgF의 아미노산 서열은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 유래 ANU33618.1(서열번호 48) 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, ArgR의 아미노산 서열은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 유래 ANU33619.1(서열번호 53) 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 다양한 유래의 ArgF 또는 ArgR 활성을 갖는 단백질을 포함하는 것은 자명하다.
다만, 상기 ArgF 및/또는 ArgR 단백질 활성의 약화 또는 argF 및/또는 argR 유전자의 결손은 한 가지 예로서 이에 제한되지 않으며, 본 출원의 미생물은 다양한 공지의 L-아미노산 생합성 경로의 단백질 활성이 강화되거나 분해 경로의 단백질 활성이 약화된 미생물일 수 있다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드의 활성의 "약화"는 내재적 활성에 비하여 활성이 감소되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 약화는 불활성화(inactivation), 결핍(deficiency), 하향조절(down-regulation), 감소(decrease), 저하(reduce), 감쇠(attenuation) 등의 용어와 혼용될 수 있다.
상기 약화는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 폴리펩티드 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 폴리펩티드의 활성에 비해 감소 또는 제거된 경우, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유전자의 발현 저해 또는 폴리펩티드로의 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 폴리펩티드 활성 정도 및/또는 농도(발현량)가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 전혀 이루어지지 않은 경우, 및/또는 폴리뉴클레오티드의 발현이 되더라도 폴리펩티드의 활성이 없는 경우 역시 포함할 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주, 야생형 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "불활성화, 결핍, 감소, 하향조절, 저하, 감쇠"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성에 비하여 낮아진 것을 의미한다.
이러한 폴리펩티드의 활성의 약화는, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다(예컨대, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드의 활성의 약화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전체 또는 일부의 결손;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형;
3) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열의 변형(예컨대, 아미노산 서열 상의 1 이상의 아미노산의 삭제/치환/부가);
4) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 핵산염기 서열 상의 1 이상의 핵산염기의 삭제/치환/부가);
5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입;
7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가;
8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE); 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
예컨대,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자 일부 또는 전체의 결손은, 염색체 내 내재적 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 전체의 제거, 일부 뉴클레오티드가 결실된 폴리뉴클레오티드로의 교체 또는 마커 유전자로 교체일 수 있다.
상기 2) 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형은, 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절영역(또는 발현조절서열) 상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 3) 및 4)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은 폴리펩티드의 활성을 약화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 없도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열 내 변이를 도입하여 종결 코돈을 형성시킴으로써, 유전자의 발현을 저해하거나 약화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 낮은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입은 예를 들어 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]을 참고할 수 있다.
상기 7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가는 mRNA 번역을 불가능하게 하거나 속도를 저하시키는 것일 수 있다.
또한, 상기 8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE)는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 전사체에 상보적인 안티센스 뉴클레오티드를 만들어 활성을 약화하는 것일 수 있다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드의 활성의 "강화"는, 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 활성화, 강화, 상향조절, 과발현, 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "강화", "상향조절", "과발현" 또는 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 강화는 외래의 폴리펩티드를 도입하거나, 내재적인 폴리펩티드의 활성 강화 및/또는 농도(발현량)를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩티드의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩티드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩티드로부터 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 폴리펩티드의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩티드의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드의 활성의 강화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역을 활성이 강력한 서열로 교체;
3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
4) 폴리펩티드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형;
5) 폴리펩티드 활성이 강화도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 강화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);
6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터의 숙주세포 내로의 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 또는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.
상기 2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일 예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 CJ1 내지 CJ7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터, yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 높은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기 서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 폴리펩티드의 활성을 강화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 증가하도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주세포 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩티드가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
상기 7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩티드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.
이와 같은 폴리펩티드 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩티드의 활성 또는 농도 발현량이 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩티드의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩티드로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위 (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드 및 L-오르니틴 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-오르니틴 생산 방법을 제공한다.
본 출원의 L-오르니틴 생산 방법은 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 벡터를 포함하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "배양"은 본 출원의 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미생물에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 본 출원의 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
구체적으로, 코리네박테리움 속 미생물에 대한 배양 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 출원의 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에서 배양온도는 20 내지 45℃, 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에 의하여 생산된 L-오르니틴은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
본 출원의 L-오르니틴 생산 방법은, 본 출원의 미생물을 준비하는 단계, 상기 미생물을 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 L-오르니틴 생산 방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로부터 L-오르니틴을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 L-오르니틴을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 L-오르니틴을 회수할 수 있다.
또한, 본 출원의 L-오르니틴 생산 방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 L-오르니틴 생산 방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 방법에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 균주 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드; 이를 배양한 배지; 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 L-오르니틴 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 조성물은 L-아미노산 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물의 L-오르니틴 생산 용도를 제공한다.
상기 카르바모일 인산 합성효소, 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 균주, 배지 및 L-오르니틴 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 변이체가 도입된 미생물은 기존 비변형 미생물에 비해 L-오르니틴 생산능이 증대될 수 있다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
실시예 1: carB 유효변이 도입 벡터 제작
L-오르니틴 생산능을 증가시키기 위하여, CarB의 아미노산 서열에서 특정 위치(서열번호 1에서 799, 918 또는 1079번째)의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 CarB 변이체를 제작하였다.
먼저, carB 유전자에 유효변이를 도입하기 위해, carB 유전자의 단백질 서열상 799번째 글루탐산을 발린과 유사한 크기와 화학적 특성을 고려한 아미노산 4종(알라닌, 아이소류신, 류신, 발린)으로 치환하기 위한 벡터를 제작하였다.
알라닌으로 치환하기 위한 벡터 제작을 위해 야생형 C. glutamicum ATCC 13869의 게놈을 주형으로 서열번호 27과 28의 프라이머 쌍을 이용하여 homologous recombinant A arm을, 서열번호 29와 30의 프라이머 쌍을 이용하여 homologous recombinant B arm을 증폭시켰다. 이와 마찬가지로, 아이소류신 치환 벡터 제작을 위해 서열번호 27과 28의 프라이머 쌍 및 서열번호 31과 30의 프라이머 쌍을 이용해 homologous recombinant A arm 및 B arm을 증폭시켰으며, 류신 치환 벡터 제작을 위해 서열번호 27과 28의 프라이머 쌍 및 서열번호 32와 31의 프라이머 쌍을 이용해 homologous recombinant A arm 및 B arm을 증폭시켰으며, 발린 치환 벡터 제작을 위해 서열번호 27과 28의 프라이머 쌍 및 서열번호 33과 30의 프라이머 쌍을 이용해 homologous recombinant A arm 및 B arm을 증폭시켰다. 이후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 수득하였고, 이를 pDCM2-carB(E799A), pDCM2-carB(E799I), pDCM2-carB(E799L), pDCM2-carB(E799V) 라고 명명하였다.
carB 유전자의 단백질 서열상 918번째 글루탐산을 아미노산 4종 (알라닌, 아이소류신, 류신, 발린)으로 치환하기 위한 벡터를 제작하였다.
알라닌으로 치환하기 위한 벡터 제작을 위해 야생형 C. glutamicum ATCC 13869의 게놈을 주형으로 서열번호 34와 35의 프라이머 쌍을 이용하여 homologous recombinant A arm을, 서열번호 36과 37의 프라이머 쌍을 이용하여 homologous recombinant B arm을 증폭시켰다. 이와 마찬가지로, 아이소류신 치환 벡터 제작을 위해 서열번호 34와 35의 프라이머 쌍 및 서열번호 38과 37의 프라이머 쌍을 이용해 homologous recombinant A arm 및 B arm을 증폭시켰으며, 류신 치환 벡터 제작을 위해 서열번호 34와 35의 프라이머 쌍 및 서열번호 39와 37의 프라이머 쌍을 이용해 homologous recombinant A arm 및 B arm을 증폭시켰으며, 발린 치환 벡터 제작을 위해 서열번호 34와 35의 프라이머 쌍 및 서열번호 40과 37의 프라이머 쌍을 이용해 homologous recombinant A arm 및 B arm을 증폭시켰다. 이후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 수득하였고, 이를 순서대로 pDCM2-carB(E918A), pDCM2-carB(E918I), pDCM2-carB(E918L), pDCM2-carB(E918V) 라고 명명하였다.
유전자 carB의 단백질 서열상 1079번째 트레오닌을 아미노산 4종 (알라닌, 아이소류신, 류신, 발린)으로 치환하기 위한 벡터를 제작하였다.
알라닌으로 치환하기 위한 벡터 제작을 위해 야생형 C. glutamicum ATCC 13869의 genome을 주형으로 서열번호 41과 42의 프라이머 쌍을 이용하여 homologous recombinant A arm을, 서열번호 43과 44의 프라이머 쌍을 이용하여 homologous recombinant B arm을 증폭시켰다. 이와 마찬가지로, 아이소류신 치환 벡터 제작을 위해 서열번호 41과 42의 프라이머 쌍 및 서열번호 45와 44의 프라이머 쌍을 이용해 homologous recombinant A arm 및 B arm을 증폭시켰으며, 류신 치환 벡터 제작을 위해 서열번호 41과 42의 프라이머 쌍 및 서열번호 46과 44의 프라이머 쌍을 이용해 homologous recombinant A arm 및 B arm을 증폭시켰으며, 발린 치환 벡터 제작을 위해 서열번호 41과 42의 프라이머 쌍 및 서열번호 47과 44의 프라이머 쌍을 이용해 homologous recombinant A arm 및 B arm을 증폭시켰다. 이후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 수득하였고, 이를 순서대로 pDCM2-carB(T1079A), pDCM2-carB(T1079I), pDCM2-carB(T1079L), pDCM2-carB(T1079V) 라고 명명하였다.
실시예 1에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.
서열번호 서열명 서열(5'-> 3')
27 P18 CGGTACCCGGGGATCCTCTTGAGCTCTCCCGCGTC
28 P19 GATGTGTTCCATGACGCCC
29 P20 GGCGTCATGGAACACATCGCAGAAGCCGGCATTCACTC
30 P21 ATGCCTGCAGGTCGACCGCGGTTAGCCACGGTCAC
31 P22 GGCGTCATGGAACACATCATCGAAGCCGGCATTCACTC
32 P23 GGCGTCATGGAACACATCCTCGAAGCCGGCATTCACTC
33 P24 GGCGTCATGGAACACATCGTCGAAGCCGGCATTCACTC
34 P25 CGGTACCCGGGGATCCGGAGATTGTCTACGATGAG
35 P26 CTTCACAGCGATTGGAGCG
36 P27 GCTCCAATCGCTGTGAAGGCAGCAGTGTTGCCGTTCAAC
37 P28 ATGCCTGCAGGTCGACCTGACAACGCCCTCACGCAG
38 P29 GCTCCAATCGCTGTGAAGATCGCAGTGTTGCCGTTCAAC
39 P30 GCTCCAATCGCTGTGAAGCTCGCAGTGTTGCCGTTCAAC
40 P31 GCTCCAATCGCTGTGAAGGTCGCAGTGTTGCCGTTCAAC
41 P32 CGGTACCCGGGGATCCCAAGGATCTCCAAGATGAG
42 P33 GATCAGTGGAACACCCACG
43 P34 GTGGGTGTTCCACTGATCGCAACTGTCCAGGGTGTCAC
44 P35 ATGCCTGCAGGTCGACCTCCCCTGCCGTGTTGCTC
45 P36 GTGGGTGTTCCACTGATCATCACTGTCCAGGGTGTCAC
46 P37 GTGGGTGTTCCACTGATCCTCACTGTCCAGGGTGTCAC
47 P38 GTGGGTGTTCCACTGATCGTCACTGTCCAGGGTGTCAC
실시예 2: L-오르니틴 생산 미생물의 제작
L-오르니틴 생산 미생물을 제작하기 위하여 ArgF(ANU33618.1, 서열번호 48)의 단백질 서열 55번에 위치한 세린을 종결코돈으로 치환하는 벡터를 제작하였다. 야생형 C. glutamicum ATCC13869의 게놈을 주형으로 서열번호 49와 50의 프라이머 쌍을 이용하여 homologous recombinant A arm을, 서열번호 51과 52의 프라이머 쌍을 이용하여 homologous recombinant B arm을 증폭하였다. 이후 상기와 동일한 방법으로 플라스미드를 수득하였고, 이를 pDCM2-argF(S55*)라고 명명하였다.
L-오르니틴 생산능이 더 향상된 미생물을 제작하기 위하여 ArgR(ANU33619.1, 서열번호 53)의 단백질 서열 47번에 위치한 글루탐산을 종결코돈으로 치환하는 벡터를 제작하였다. 야생형 C. glutamicum ATCC 13869의 게놈을 주형으로 서열번호 54와 55의 프라이머 쌍을 이용하여 homologous recombinant A arm을, 서열번호 56과 57의 프라이머 쌍을 이용하여 homologous recombinant B arm을 증폭하였다. 이후 상기와 동일한 방법으로 플라스미드를 수득하였고, 이 플라스미드를 pDCM2-argR(E47*)라고 명명하였다.
실시예 2에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 2와 같다.
서열번호 서열명 서열(5'-> 3')
49 P4 CGGTACCCGGGGATCCTGACCCCAGGCAAGCACGG
50 P5 GAAGCGAGTACGAGTTTAAGTCTTATC
51 P6 AAACTCGTACTCGCTTCTCC
52 P7 ATGCCTGCAGGTCGACCGGCGCCGGCAACCTCGTC
54 P8 CGGTACCCGGGGATCCCTCGTGCGGAATTCGTGGAG
55 P9 ATCCAGCAGCAATTCAGACA
56 P10 CTGAATTGCTGCTGGATTAAGGCATCGATATCACCCA
57 P11 ATGCCTGCAGGTCGACCCTTCATTTTAAGTTCCTTG
상기에서 제작한 pDCM2-argF(S55*) 벡터를 이용하여 야생형 C. glutamicum ATCC 13869를 전기천공법 (Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545)으로 형질 전환한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 argF의 164번째 염기서열이 사이토신(cytosine, c)에서 아데닌(adenine, a)으로 치환되어 55번째 단백질 서열이 종결코돈으로 치환된 미생물을 수득하였다. 해당 유전자가 삽입된 위치를 포함한 인접 부위를 증폭할 수 있는 서열번호 49와 52의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 및 염기서열 분석을 수행하였고, 해당 유전적 조작을 확인하였다. 이렇게 수득한 미생물을 C. gl::argF* 로 명명하였다.
C. gl::argF*에서 오르니틴 생산이 더욱 향상된 미생물을 제작하기 위해 pDCM2-argR(E47*)벡터를 이용하여 상기와 같은 방법으로 미생물을 수득하였다. 해당 유전자가 삽입된 위치를 포함한 인접 부위를 증폭할 수 있는 서열번호 54와 57의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 및 염기서열 분석을 수행하였고, 해당 유전적 조작을 확인하였다. 이렇게 수득한 미생물을 C. gl::argF*_argR*로 명명하였다.
실시예 3: L-오르니틴 생산주 기반 carB 변이주 제작
L-오르니틴 생산주 기반 carB 단백질 서열 799번째 글루탐산에 대한 변이주 제작을 위해 상기 실시예 1에서 제작한 pDCM2-carB(E799A), pDCM2-carB(E799I), pDCM2-carB(E799L), pDCM2-carB(E799V) 벡터를 실시예 2에서 제작한 C. gl::argF*_argR*에 전기천공법으로 형질 전환한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 글루탐산이 각각 알라닌, 아이소류신, 류신, 발린으로 치환된 미생물을 수득하였다. 해당 유전자가 삽입된 위치를 포함한 인접 부위를 증폭할 수 있는 서열번호 27과 30의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 및 염기서열 분석을 수행하였고, 해당 유전적 조작을 확인하였다. 수득한 미생물을 각각 C. gl::argF*_argR*_carB(E799A), C. gl::argF*_argR*_carB(E799I), C. gl::argF*_argR*_carB(E799L), C. gl::argF*_argR*_carB(E799V)로 명명하였다.
L-오르니틴 생산주 기반 carB 단백질 서열 918번째 글루탐산에 대한 변이주 제작을 위해 상기 실시예 5에서 제작한 pDCM2-carB(E918A), pDCM2-carB(E918I), pDCM2-carB(E918L), pDCM2-carB(E918V) 벡터를 실시예 2에서 제작한 C. gl::argF*_argR*에 전기천공법으로 형질 전환한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 글루탐산이 각각 알라닌, 아이소류신, 류신, 발린으로 치환된 미생물을 수득하였다. 해당 유전자가 삽입된 위치를 포함한 인접 부위를 증폭할 수 있는 서열번호 34와 37의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 및 염기서열 분석을 수행하였고, 해당 유전적 조작을 확인하였다. 수득한 미생물을 각각 C. gl::argF*_argR*_carB(E918A), C. gl::argF*_argR*_carB(E918I), C. gl::argF*_argR*_carB(E918L), C. gl::argF*_argR*_carB(E918V)로 명명하였다.
L-오르니틴 생산주 기반 carB 단백질 서열 1079번째 트레오닌에 대한 변이주를 제작을 위해 상기 실시예 5에서 제작한 pDCM2-carB(T1079A), pDCM2-carB(T1079I), pDCM2-carB(T1079L), pDCM2-carB(T1079V) 벡터를 실시예 2에서 제작한 C. gl::argF*_argR*에 전기천공법으로 형질 전환한 후, 2차 교차 과정을 거쳐 글루탐산이 각각 알라닌, 아이소류신, 류신, 발린으로 치환된 미생물을 수득하였다. 해당 유전자가 삽입된 위치를 포함한 인접 부위를 증폭할 수 있는 서열번호 41과 44의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 및 염기서열 분석을 수행하였고, 해당 유전적 조작을 확인하였다. 수득한 미생물을 각각 C. gl::argF*_argR*_carB(T1079A), C. gl::argF*_argR*_carB(T1079I), C. gl::argF*_argR*_carB(T1079L), C. gl::argF*_argR*_carB(T1079V)로 명명하였다.
실시예 4: carB 변이주 L-오르니틴 생산능 비교
상기 실시예 3에서 제작한 C. gl::argF*_argR*_carB(E799A), C. gl::argF*_argR*_carB(E799I), C. gl::argF*_argR*_carB(E799L), C. gl::argF*_argR*_carB(E799V), C. gl::argF*_argR*_carB(E918A), C. gl::argF*_argR*_carB(E918I), C. gl::argF*_argR*_carB(E918L), C. gl::argF*_argR*_carB(E918V), C. gl::argF*_argR*_carB(T1079A), C. gl::argF*_argR*_carB(T1079I), C. gl::argF*_argR*_carB(T1079L), C. gl::argF*_argR*_carB(T1079V) 미생물과 대조미생물인 야생형 C. glutamicum ATCC 13869, C. gl::argF*_argR* 미생물을 아래와 같은 생산배지를 이용하여 배양하여, 균체량, L-오르니틴 생산능을 비교하였다.
먼저, 종 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 각 미생물을 접종하고, 30℃에서 16시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 생산 배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 33℃에서 40 시간 동안 200 rpm에서 진탕 배양하였다.
<종배지 (pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 0.1 mg, 티아민 HCl 1 mg, 칼슘-판토텐산 22 mg, 니코틴아미드 2 mg (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 7.0)>
원당 50 g, (NH4)2SO4 25 g, 효모추출물 1 g, KH2PO4 0.55 g, MgSO4·7H2O 0.6 g, L-아르기닌 0.2 g, 바이오틴 0.9 mg, 티아민 염산염 4.5 mg, 칼슘-판토텐산 4.5 mg, 니코틴아미드 30 mg, MnSO4 9 mg, FeSO4 9 mg, ZnSO4 0.45 mg, CuSO4 0.45 mg, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
상기 실험은 3번 반복되었으며, 배양 결과(평균값)는 하기 표 3에 나타내었다. L-오르니틴 수율은 오르니틴 농도/소모당으로 산출하였으며, 농도 증가율은 L-오르니틴 수율은 오르니틴 농도/소모당으로 산출하였으며, 농도 증가율은 (실험군이 생산한 L-오르니틴 농도-대조군(야생형 C. glutamicum ATCC 13869 균주가 생산한 L-오르니틴 농도))/대조군(야생형 C. glutamicum ATCC 13869 균주가 생산한 L-오르니틴 농도)으로 산출하였다.
균 주 OD562 소모당 (g/L) L-오르니틴 농도 (g/L) L-오르니틴 수율(%) L-오르니틴 농도 증가율(%)
대조군 미생물 야생형 C. glutamicum ATCC 13869 95.8 50.0 0.0 0.0 -
C. gl::argF*_argR* 41.4 50.0 17.4 34.8 17
799번째 글루탐산 치환 미생물 C. gl::argF*_argR*_carB(E799A) 44.2 50.0 16.3 32.6 16
C. gl::argF*_argR*_carB(E799I) 42.7 50.0 18.7 37.4 19
C. gl::argF*_argR*_carB(E799L) 43.6 50.0 20.1 40.2 20
C. gl::argF*_argR*_carB(E799V) 43.2 50.0 19.2 38.4 19
918번째 글루탐산 치환 미생물 C. gl::argF*_argR*_carB(E918A) 41.2 50.0 14.5 29.0 15
C. gl::argF*_argR*_carB(E918I) 43.9 50.0 17.3 34.6 17
C. gl::argF*_argR*_carB(E918L) 45.1 50.0 17.9 35.8 18
C. gl::argF*_argR*_carB(E918V) 43.6 50.0 17.8 35.6 18
1079번째 트레오닌 치환 미생물 C. gl::argF*_argR*_carB(T1079A) 43.1 50.0 16.9 33.8 17
C. gl::argF*_argR*_carB(T1079I) 44.0 50.0 18.2 36.4 18
C. gl::argF*_argR*_carB(T1079L) 43.0 50.0 18.7 37.4 19
C. gl::argF*_argR*_carB(T1079V) 44.8 50.0 19.6 39.2 20
상기 표 3에 나타난 바와 같이, C. gl::argF*_argR*_carB(E799I), C. gl::argF*_argR*_carB(E799L), C. gl::argF*_argR*_carB(E799V), C. gl::argF*_argR*_carB(E918L), C. gl::argF*_argR*_carB(E918V), C. gl::argF*_argR*_carB(T1079I), C. gl::argF*_argR*_carB(T1079L), C. gl::argF*_argR*_carB(T1079V)는 대조미생물인 C. gl::argF*_argR*와 비교하여 증가된 생산능 및 수율을 보였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Microorganism producing L-amino acid and L-amino acid production method using the same <130> KPA211442-KR <160> 57 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1113 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CarB <400> 1 Met Pro Lys Arg Ser Asp Ile Asn His Val Leu Val Ile Gly Ser Gly 1 5 10 15 Pro Ile Val Ile Gly Gln Ala Cys Glu Phe Asp Tyr Ser Gly Thr Gln 20 25 30 Ala Cys Arg Val Leu Lys Glu Glu Gly Leu Arg Val Thr Leu Ile Asn 35 40 45 Ser Asn Pro Ala Thr Ile Met Thr Asp Pro Glu Met Ala Asp His Thr 50 55 60 Tyr Val Glu Pro Ile Glu Pro Glu Tyr Ile Asp Lys Ile Phe Ala Lys 65 70 75 80 Glu Ile Glu Gln Gly His Pro Ile Asp Ala Val Leu Ala Thr Leu Gly 85 90 95 Gly Gln Thr Ala Leu Asn Ala Ala Ile Gln Leu Asp Arg Leu Gly Ile 100 105 110 Leu Glu Lys Tyr Gly Val Glu Leu Ile Gly Ala Asp Ile Asp Ala Ile 115 120 125 Glu Arg Gly Glu Asp Arg Gln Lys Phe Lys Asp Ile Val Thr Thr Ile 130 135 140 Gly Gly Glu Ser Ala Arg Ser Arg Val Cys His Asn Met Asp Glu Val 145 150 155 160 His Glu Thr Val Ala Glu Leu Gly Leu Pro Val Val Val Arg Pro Ser 165 170 175 Phe Thr Met Gly Gly Leu Gly Ser Gly Leu Ala Tyr Asn Thr Glu Asp 180 185 190 Leu Glu Arg Ile Ala Gly Gly Gly Leu Ala Ala Ser Pro Glu Ala Asn 195 200 205 Val Leu Ile Glu Glu Ser Ile Leu Gly Trp Lys Glu Phe Glu Leu Glu 210 215 220 Leu Met Arg Asp Thr Ala Asp Asn Val Val Val Ile Cys Ser Ile Glu 225 230 235 240 Asn Val Asp Ala Leu Gly Val His Thr Gly Asp Ser Val Thr Val Ala 245 250 255 Pro Ala Leu Thr Leu Thr Asp Arg Glu Phe Gln Lys Met Arg Asp Gln 260 265 270 Gly Ile Ala Ile Ile Arg Glu Val Gly Val Asp Thr Gly Gly Cys Asn 275 280 285 Ile Gln Phe Ala Ile Asn Pro Val Asp Gly Arg Ile Ile Thr Ile Glu 290 295 300 Met Asn Pro Arg Val Ser Arg Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Ala Thr 305 310 315 320 Gly Phe Pro Ile Ala Lys Met Ala Ala Lys Leu Ala Ile Gly Tyr Thr 325 330 335 Leu Asp Glu Ile Thr Asn Asp Ile Thr Gly Glu Thr Pro Ala Ala Phe 340 345 350 Glu Pro Thr Ile Asp Tyr Val Val Val Lys Ala Pro Arg Phe Ala Phe 355 360 365 Glu Lys Phe Val Gly Ala Asp Asp Thr Leu Thr Thr Thr Met Lys Ser 370 375 380 Val Gly Glu Val Met Ser Leu Gly Arg Asn Tyr Ile Ala Ala Leu Asn 385 390 395 400 Lys Ala Leu Arg Ser Leu Glu Thr Lys Gln Gln Gly Phe Trp Thr Lys 405 410 415 Pro Asp Glu Phe Phe Ala Gly Glu Arg Ala Thr Asp Lys Ala Ala Val 420 425 430 Leu Glu Asp Leu Lys Arg Pro Thr Glu Gly Arg Leu Tyr Asp Val Glu 435 440 445 Leu Ala Met Arg Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Leu Tyr Glu Ala Ser 450 455 460 Ser Ile Asp Pro Trp Phe Leu Ala Glu Leu Glu Ala Leu Val Gln Phe 465 470 475 480 Arg Gln Lys Leu Val Asp Ala Pro Phe Leu Asn Glu Asp Leu Leu Arg 485 490 495 Glu Ala Lys Phe Met Gly Leu Ser Asp Leu Gln Ile Ala Ala Leu Arg 500 505 510 Pro Glu Phe Ala Gly Glu Asp Gly Val Arg Thr Leu Arg Leu Ser Leu 515 520 525 Gly Ile Arg Pro Val Phe Lys Thr Val Asp Thr Cys Ala Ala Glu Phe 530 535 540 Glu Ala Lys Thr Pro Tyr His Tyr Ser Ala Tyr Glu Leu Asp Pro Ala 545 550 555 560 Ala Glu Ser Glu Val Ala Pro Gln Thr Glu Arg Glu Lys Val Leu Ile 565 570 575 Leu Gly Ser 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Val Tyr Leu Ala Gly Val Met Glu His Ile Glu Glu 785 790 795 800 Ala Gly Ile His Ser Gly Asp Ser Ala Cys Ala Leu Pro Pro Met Thr 805 810 815 Leu Gly Ala Gln Asp Ile Glu Lys Val Arg Glu Ala Thr Lys Lys Leu 820 825 830 Ala Leu Gly Ile Gly Val Gln Gly Leu Met Asn Val Gln Tyr Ala Leu 835 840 845 Lys Asp Asp Ile Leu Tyr Val Ile Glu Ala Asn Pro Arg Ala Ser Arg 850 855 860 Thr Val Pro Phe Val Ser Lys Ala Thr Gly Val Asn Leu Ala Lys Ala 865 870 875 880 Ala Ser Arg Ile Ala Val Gly Ala Thr Ile Lys Asp Leu Gln Asp Glu 885 890 895 Gly Met Ile Pro Thr Glu Tyr Asp Gly Gly Ser Leu Pro Leu Asp Ala 900 905 910 Pro Ile Ala Val Lys Glu Ala Val Leu Pro Phe Asn Arg Phe Arg Arg 915 920 925 Pro Asp Gly Lys Thr Leu Asp Thr Leu Leu Ser Pro Glu Met Lys Ser 930 935 940 Thr Gly Glu Val Met Gly Leu Ala Asn Asn Phe Gly Ala Ala Tyr Ala 945 950 955 960 Lys Ala Glu Ala Gly Ala Phe Gly Ala Leu Pro Thr Glu Gly Thr Val 965 970 975 Phe Val Thr Val Ala Asn Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ile Leu Pro Ile 980 985 990 Gln Arg Leu Ala 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agatgaaccc acgtgtgtct cgttcctccg cgctggcatc caaggcaacg 960 ggcttcccaa ttgccaagat ggctgccaag ctggctatcg gatacaccct ggatgagatc 1020 accaacgaca tcactggtga aaccccagct gcgtttgagc ccaccatcga ctacgtcgtg 1080 gtcaaggccc cacgctttgc tttcgagaag tttgtcggcg ctgatgacac tttgaccacc 1140 accatgaagt ccgtcggtga ggtcatgtcc ctgggccgta actacattgc agcactgaac 1200 aaggcactgc gttccctgga aaccaagcag cagggtttct ggaccaagcc tgatgagttc 1260 ttcgcagggg agcgcgctac cgataaggca gctgttctgg aagatctcaa gcgcccaacc 1320 gaaggccgcc tctacgacgt tgagctggca atgcgccttg gcgcaagcgt ggaagaactc 1380 tacgaagcat cttctattga tccttggttc ctcgccgagc ttgaagctct cgtgcagttc 1440 cgccagaagc tcgttgacgc accattcctc aacgaagatc tcctgcgcga agcaaagttc 1500 atgggtctgt ccgacctgca gatcgcagcc cttcgcccag agttcgctgg cgaagacggc 1560 gtacgcacct tgcgtctgtc cctaggcatc cgcccagtat tcaagactgt ggatacctgt 1620 gcagcagagt ttgaagctaa gactccgtac cactactccg catacgagct ggatccagca 1680 gctgagtctg aggtcgcacc acagactgag cgtgaaaagg tcctgatctt gggctccggt 1740 ccaaaccgca tcggccaggg catcgagttc gactattcct gtgttcacgc agctcttgag 1800 ctctcccgcg tcggctacga aactgtcatg gtcaactgca acccagagac cgtgtccacc 1860 gactacgaca ccgctgaccg cctgtacttc gagccactga ccttcgaaga cgtcatggag 1920 gtctaccacg ctgaggcgca gtccggcacc gtcgcaggtg ttatcgtcca gcttggtggc 1980 cagactcctc tgggcttggc agatcgtttg aagaaggctg gcgtccctgt cattggtacc 2040 tccccagagg caatcgacat ggctgaggac cgtggcgagt tcggtgcact gctgaaccgc 2100 gagcagcttc ctgctccagc attcggcacc gcaacctctt tcgaagaggc tcgcacagta 2160 gccgatgaga tcagctaccc agtgctggtt cgcccttcct acgtcttggg tggccgtggc 2220 atggagattg tctacgatga ggcttccctc gaggattaca tcaaccgcgc aactgagttg 2280 tcttctgacc acccagtgct ggttgaccgc ttcctggaca acgctattga gatcgacgtc 2340 gacgcactgt gcgacggcga cgaagtctac ctggcgggcg tcatggaaca catcgaggaa 2400 gccggcattc actccggtga ctccgcatgt gcacttcctc caatgacttt gggcgcacag 2460 gacatcgaga aggtccgcga agcaaccaag aagctggctc tgggcatcgg cgtacagggc 2520 ctgatgaacg tccagtacgc actcaaggac gacatcctct acgtcatcga ggcaaaccca 2580 cgtgcatccc 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gagctctccc gcgtc 35 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P19 <400> 28 gatgtgttcc atgacgccc 19 <210> 29 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P20 <400> 29 ggcgtcatgg aacacatcgc agaagccggc attcactc 38 <210> 30 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P21 <400> 30 atgcctgcag gtcgaccgcg gttagccacg gtcac 35 <210> 31 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P22 <400> 31 ggcgtcatgg aacacatcat cgaagccggc attcactc 38 <210> 32 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P23 <400> 32 ggcgtcatgg aacacatcct cgaagccggc attcactc 38 <210> 33 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P24 <400> 33 ggcgtcatgg aacacatcgt cgaagccggc attcactc 38 <210> 34 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P25 <400> 34 cggtacccgg ggatccggag attgtctacg atgag 35 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P26 <400> 35 cttcacagcg attggagcg 19 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P27 <400> 36 gctccaatcg ctgtgaaggc agcagtgttg ccgttcaac 39 <210> 37 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P28 <400> 37 atgcctgcag gtcgacctga caacgccctc acgcag 36 <210> 38 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P29 <400> 38 gctccaatcg ctgtgaagat cgcagtgttg ccgttcaac 39 <210> 39 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P30 <400> 39 gctccaatcg ctgtgaagct cgcagtgttg ccgttcaac 39 <210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P31 <400> 40 gctccaatcg ctgtgaaggt cgcagtgttg ccgttcaac 39 <210> 41 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P32 <400> 41 cggtacccgg ggatcccaag gatctccaag atgag 35 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P33 <400> 42 gatcagtgga acacccacg 19 <210> 43 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P34 <400> 43 gtgggtgttc cactgatcgc aactgtccag ggtgtcac 38 <210> 44 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P35 <400> 44 atgcctgcag gtcgacctcc cctgccgtgt tgctc 35 <210> 45 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P36 <400> 45 gtgggtgttc cactgatcat cactgtccag ggtgtcac 38 <210> 46 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P37 <400> 46 gtgggtgttc cactgatcct cactgtccag ggtgtcac 38 <210> 47 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P38 <400> 47 gtgggtgttc cactgatcgt cactgtccag ggtgtcac 38 <210> 48 <211> 319 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ArgF <400> 48 Met Thr Ser Gln Pro Gln Val Arg His Phe Leu Ala Asp Asp Asp Leu 1 5 10 15 Thr Pro Ala Glu Gln Ala Glu Val Leu Thr Leu Ala Ala Lys Leu Lys 20 25 30 Ala Ala Pro Phe Ser Glu Arg Pro Leu Glu Gly Pro Lys Ser Val Ala 35 40 45 Val Leu Phe Asp Lys Thr Ser Thr Arg Thr Arg Phe Ser Phe Asp Ala 50 55 60 Gly Ile Ala His Leu Gly Gly His Ala Ile Val Val Asp Ser Gly Ser 65 70 75 80 Ser Gln Met Gly Lys Gly Glu Thr Leu Gln Asp Thr Ala Ala Val Leu 85 90 95 Ser Arg Tyr Val Glu Ala Ile Val Trp Arg Thr Tyr Ala His Ser Asn 100 105 110 Phe His Ala Met Ala Glu Thr Ser Thr Val Pro Leu Val Asn Ser Leu 115 120 125 Ser Asp Asp Leu His Pro Cys Gln Ile Leu Ala Asp Leu Gln Thr Ile 130 135 140 Val Glu Asn Leu Ser Pro Glu Glu Gly Pro Ala Gly Leu Lys Gly Lys 145 150 155 160 Lys Ala Val Tyr Leu Gly Asp Gly Asp Asn Asn Met Ala Asn Ser Tyr 165 170 175 Met Ile Gly Phe Ala Thr Ala Gly Met Asp Ile Ser Ile Ile Ala Pro 180 185 190 Glu Gly Phe Gln Pro Arg Ala Glu Phe Val Glu Arg Ala Glu Lys Arg 195 200 205 Gly Gln Glu Thr Gly Ala Lys Val Val Val Thr Asp Ser Leu Asp Glu 210 215 220 Val Ala Gly Ala Asp Val Val Ile Thr Asp Thr Trp Val Ser Met Gly 225 230 235 240 Met Glu Asn Asp Gly Ile Asp Arg Thr Thr Pro Phe Val Pro Tyr Gln 245 250 255 Val Asn Asp Glu Val Met Ala Lys Ala Asn Asp Gly Ala Ile Phe Leu 260 265 270 His Cys Leu Pro Ala Tyr Arg Gly Lys Glu Val Ala Ala Ser Val Ile 275 280 285 Asp Gly Pro Ala Ser Lys Val Phe Asp Glu Ala Glu Asn Arg Leu His 290 295 300 Ala Gln Lys Ala Leu Leu Val Trp Leu Leu Ala His Gln Pro Arg 305 310 315 <210> 49 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P4 <400> 49 cggtacccgg ggatcctgac cccaggcaag cacgg 35 <210> 50 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P5 <400> 50 gaagcgagta cgagtttaag tcttatc 27 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P6 <400> 51 aaactcgtac tcgcttctcc 20 <210> 52 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P7 <400> 52 atgcctgcag gtcgaccggc gccggcaacc tcgtc 35 <210> 53 <211> 171 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ArgR <400> 53 Met Ser Leu Gly Ser Thr Pro Ser Thr Pro Glu Asn Leu Asn Pro Val 1 5 10 15 Thr Arg Thr Ala Arg Gln Ala Leu Ile Leu Gln Ile Leu Asp Lys Gln 20 25 30 Lys Val Thr Ser Gln Val Gln Leu Ser Glu Leu Leu Leu Asp Glu Gly 35 40 45 Ile Asp Ile Thr Gln Ala Thr Leu Ser Arg Asp Leu Asp Glu Leu Gly 50 55 60 Ala Arg Lys Val Arg Pro Asp Gly Gly Arg Ala Tyr Tyr Ala Val Gly 65 70 75 80 Pro Val Asp Ser Ile Ala Arg Glu Asp Leu Arg Gly Pro Ser Glu Lys 85 90 95 Leu Arg Arg Met Leu Asp Glu Leu Leu Val Ser Thr Asp His Ser Gly 100 105 110 Asn Ile Ala Met Leu Arg Thr Pro Pro Gly Ala Ala Gln Tyr Leu Ala 115 120 125 Ser Phe Ile Asp Arg Val Gly Leu Lys Glu Val Val Gly Thr Ile Ala 130 135 140 Gly Asp Asp Thr Val Phe Val Leu Ala Arg Asp Pro Leu Thr Gly Lys 145 150 155 160 Glu Leu Gly Glu Leu Leu Ser Gly Arg Thr Thr 165 170 <210> 54 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P8 <400> 54 cggtacccgg ggatccctcg tgcggaattc gtggag 36 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P9 <400> 55 atccagcagc aattcagaca 20 <210> 56 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P10 <400> 56 ctgaattgct gctggattaa ggcatcgata tcaccca 37 <210> 57 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P11 <400> 57 atgcctgcag gtcgaccctt cattttaagt tccttg 36

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 799번째 위치에 상응하는 아미노산이 아이소류신, 류신 또는 발린으로 치환; 918번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신 또는 발린으로 치환; 1079번째 위치에 상응하는 아미노산이 아이소류신, 류신 또는 발린으로 치환; 또는 이들의 조합을 포함하는, 코리네박테리움 속(the genus of Corynebacterium) 유래 카르바모일 인산 합성효소 라지 서브유닛 변이체.
  2. 제1항의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 799번째 위치에 상응하는 아미노산이 아이소류신, 류신 또는 발린으로 치환; 918번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신 또는 발린으로 치환; 1079번째 위치에 상응하는 아미노산이 아이소류신, 류신 또는 발린으로 치환; 또는 이들의 조합을 포함하는, 카르바모일 인산 합성효소 라지 서브유닛 변이체; 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 미생물은 L-오르니틴 생산능을 가지는, 미생물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 미생물은 추가적으로 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제(ArgF)의 활성이 약화된 것인, 미생물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 미생물은 추가적으로 아르기닌 억제자(ArgR)의 활성이 약화된 것인, 미생물.
  7. 제3항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것인, 미생물.
  8. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 799번째 위치에 상응하는 아미노산이 아이소류신, 류신 또는 발린으로 치환; 918번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신 또는 발린으로 치환; 1079번째 위치에 상응하는 아미노산이 아이소류신, 류신 또는 발린으로 치환; 또는 이들의 조합을 포함하는, 카르바모일 인산 합성효소 라지 서브유닛 변이체; 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-오르니틴 생산 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 미생물은 추가적으로 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제(ArgF)의 활성이 약화된 것인, 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 미생물은 추가적으로 아르기닌 억제자(ArgR)의 활성이 약화된 것인, 방법.
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