JP4284840B2 - コリネ型細菌のカルバモイルリン酸シンセターゼ遺伝子及びｌ−アルギニンの製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コリネ型細菌のカルバモイルリン酸シンセターゼ及びその遺伝子に関する。同遺伝子は、カルバモイルリン酸シンセターゼ又はそのサブユニットの製造、又はＬ−アルギニン生産菌又は核酸生産菌の育種等に利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
カルバモイルリン酸シンセターゼは、炭酸、ＡＴＰ及びグルタミンからカルバモイルリン酸を生成する反応を触媒する酵素である。この反応によって生じるカルバモイルリン酸は、Ｌ−アルギニン生合成経路においてオルニチンからシトルリンを生成する反応に必要なカルバモイル基のソースとなっている。また、アスパラギン酸とカルバモイルリン酸から生成するカルバモイルアスパラギン酸は、ウリジン−５’−モノホスフェートをはじめとするピリミジン生合成系の中間体である。
【０００３】
カルバモイルリン酸シンセターゼは、２つのサブユニットからなり、エシェリヒア属細菌やバチルス属細菌では、それらのサブユニットはcarA、carBの両遺伝子によってコードされることが知られている。
【０００４】
しかし、コリネ型細菌では、カルバモイルリン酸シンセターゼの活性や酵素についての知見はなく、その遺伝子も知られていなかった。
【０００５】
ところで、エシェリヒア・コリ由来のcarA、carB、argI及びarg boxの各遺伝子を搭載したプラスミドを導入されたエシェリヒア・コリの形質転換株は、カルバモイルリン酸シンセターゼの基質となるグルタミンを添加して培養した場合には細胞内のＬ−アルギニン濃度は、対照のベクターのみを導入した株と同じであるが、カルバモイルリン酸とともにArgIの基質となるオルニチンをグルタミンと同時に添加した場合、細胞内のＬ−アルギニン濃度が対照株よりも高くなることが報告されている（Malamy M. et al., Applied Environmental Microbiology, 63(1), 33 (1997)）。このことから、Ｌ−アルギニン生成の律速点はオルニチンの供給にあることが示唆された。
オルニチン供給の律速点としては、Ｌ−アルギニン生合成系の調節酵素であるＮ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ（ArgA）の可能性が高いと考えられた。エシェリヒア・コリのＬ−アルギニン生合成系では、ArgAが最終生成物Ｌ−アルギニンによりフィードバック阻害を受けている。
フィードバック阻害解除型ArgAをコードするargA遺伝子をプラスミドで増幅した株では、グルタミンのみの添加でも、グルタミン及びオルニチンの両方を添加して培養したときと同様に、細胞内Ｌ−アルギニン濃度が上昇した。しかし、グルタミン、又はグルタミン及びオルニチンのどちらを添加して培養した場合でも、さらにcarA及びcarBの両遺伝子を増幅しても、さらなる上昇はみられなかった（Malamy M. et al., Applied Environmental Microbiology, 64(5), 1805 (1998)）。
【０００６】
しかし、コリネ型細菌由来のカルバモイルリン酸シンセターゼについては、これをコードする遺伝子を利用して、微生物のＬ−アルギニン生産能を高める試みは報告されていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、コリネ型細菌のカルバモイルリン酸シンセターゼ及びそれをコードする遺伝子を提供すること、及び、当該遺伝子を利用して微生物によるＬ−アルギニンの製造方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明者は鋭意研究を行った結果、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株から、エシェリヒア・コリのcarB欠失株を用いてcarA遺伝子及びcarB遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１） 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ断片。
（Ａ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（Ｂ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチド。
（２） 下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ断片。
（Ｃ）配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（Ｄ）配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むカルバモイルリン酸シンセターゼの小サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチド。
（３） 配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、カルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチドをコードするＤＮＡ断
片。
（４） 下記（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチド、及び（ｃ）又は（ｄ）に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ断片。
（ａ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチド。
（ｃ）配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｄ）配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むカルバモイルリン酸シンセターゼの小サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチド。
【００１０】
（５）配列番号１記載の塩基配列において塩基番号２８３〜１４６１からなる塩基配列を含む（１）記載のＤＮＡ断片。
（６） 配列番号１記載の塩基配列において塩基番号１４７０〜４８０８からなる塩基配列を含む（２）記載のＤＮＡ断片。
（７） 配列番号１記載の塩基配列において塩基番号２８３〜４８０８からなる塩基配列を含む（３）記載のＤＮＡ断片。
【００１１】
（８）下記（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチド、及び（ｃ）又は（ｄ）に示すポリペプチドからなるタンパク質。
（ａ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチド。
（ｃ）配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｄ）配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むカルバモイルリン酸シンセターゼの小サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチド。
（９） （１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡ断片で形質転換されたコリネ型細菌。
（１０） 細胞中のカルバモイルリン酸シンセターゼ活性が増強され、かつＬ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌。
（１１） 前記カルバモイルリン酸シンセターゼ活性の増強が、前記コリネ型細菌細胞内のカルバモイルリン酸シンセターゼをコードするＤＮＡのコピー数を高めること、又は、細胞内の同遺伝子の発現を増強するように発現調節配列を改変することによるものである（１０）記載のコリネ型細菌。
（１２） 前記ＤＮＡが、（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡ断片である（１１）記載のコリネ型細菌。
（１３） （１０）〜（１２）のいずれかに記載のコリネ型細菌を培地に培養し、該培地中にＬ−アルギニンを生成蓄積せしめ、該培地からＬ−アルギニンを採取することを特徴とするＬ−アルギニンの製造法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、プラスミドなどのベクターを用いて作製したコリネ型細菌の染色体ＤＮＡライブラリーから、carA又はcarBを欠損した微生物、例えば、エシェリヒア・コリRC50（carA50, tsx-273, λ-, rpsL135(strR), malT1(λR), xylA7, thi-1, Mol. Gen. Genet. 133, 299 (1974)）、エシェリヒア・コリJEF8（thr-31, ΔcarB, relA-, metB1, Mol. Gen. Genet., 133, 299 (1974)）を用いて選択することによって取得することができる。carA又はcarBを欠損した微生物は、Ｌ−アルギニン及びウラシル要求性を示すので、同微生物を染色体ＤＮＡライブラリーで形質転換し、前記栄養要求性を相補するクローンを選択し、得られた形質転換体から組換えベクターを回収すれば、carA又はcarBを含むＤＮＡ断片が得られる。
【００１３】
染色体ＤＮＡライブラリーを調製するためのコリネ型細菌としては、特に制限されないが、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌、具体的には例えばブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの野生株等が挙げられる。コリネ型細菌の染色体ＤＮＡは、例えば斎藤、三浦の方法（Biochem.Biophys.Acta.,72,619,(1963)）、K. S. Kirbyの方法（Biochem.J.,64,405,(1956)）等の方法により調製することができる。
【００１４】
染色体ＤＮＡライブラリーは、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解し、得られるＤＮＡ断片をエシェリヒア・コリ細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結し、組換えＤＮＡを作製し、エシェリヒア・コリに導入することによって得られる。ベクターは、通常遺伝子のクローニングに用いられるベクターであれば特に制限されず、pUC19、pUC18、pUC118、pUC119等のプラスミドベクター、λファージＤＮＡなどのファージベクターが使用できる。また、エシェリヒア・コリとコリネ型細菌の双方の菌体内で自律複製可能なベクターを用いてもよい。そのようなベクターは、エシェリヒア・コリ用ベクターと、ブレビバクテリウムラクトファーメンタムのクリプティックプラスミドであるpAM330（特開昭58-67699号公報参照）を結合することによって構築することができる。
【００１５】
エシェリヒア・コリとコリネ型細菌の双方の菌体内で自律複製可能なベクターとして具体的には、pSAC4（実施例参照）及びpHK4（特開平5-7491号公報参照）等が挙げられる。pHK4を保持するエシェリヒア・コリHB101は、エシェリヒア・コリ AJ13136と命名され、１９９５年８月１日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5186として寄託されている。
【００１６】
エシェリヒア・コリの形質転換は、D.A.Morrisonの方法（Methods in Enzymology, 68, 326, 1979）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(1970)）等により行うことができる。また、染色体ＤＮＡライブラリーの作製、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、後述のＰＣＲ、オリゴヌクレオチドの作製、ハイブリダイゼーション等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
【００１７】
上記のようにして得られるcarA及びcarBを含むＤＮＡ断片の塩基配列を、配列表の配列番号１に示す。この配列中には、２つのオープンリーディングフレーム（ORF）（塩基番号283〜1461、及び塩基番号1756〜4809）が存在する。上流側のORFがcarA、下流側のORFがcarBである。各々のORFによってコードされるアミノ酸配列を、配列番号２及び３に示す。本発明において、carAによってコードされるペプチドを小サブユニット、carBによってコードされるペプチドを大サブユニットという。尚、配列表には、carAのコード領域は塩基番号283〜285のGTGを開始コドンとして示したが、これは、メチオニン、またはフォルミルメチオニンを表すものである。
【００１８】
本発明のカルバモイルリン酸シンセターゼの小サブユニットは、配列番号２においてアミノ酸番号１〜３９３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。また、本発明のカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットは、配列番号３においてアミノ酸番号１〜１１１３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００１９】
本発明において、小サブユニットをコードするＤＮＡは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異を含むアミノ酸配列からなるものであっても、大サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチドをコードするものであってもよい。
【００２０】
また、本発明の大サブユニットをコードするＤＮＡは、配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異を含むアミノ酸配列からなるものであっても、小サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼシ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチドをコードするものであってもよい。あるいは、配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異を含むアミノ酸配列からなり、カルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
【００２１】
さらに、小サブユニットもしくは大サブユニット又はこれらの両方に変異を含むカルバモイルリン酸シンセターゼをコードするＤＮＡも、本発明のＤＮＡに含まれる。
【００２２】
ここで「１若しくは数個」とは、１〜１０個である。
【００２３】
上記のような小サブユニット又は大サブユニットと実質的に同一のペプチドをコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、小サブユニット及び／又は大サブユニットをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び小サブユニット及び／又は大サブユニットをコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００２４】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、小サブユニット又は大サブユニットを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含まれる。
【００２５】
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物のカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を調べることにより、カルバモイルリン酸シンセターゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。カルバモイルリン酸シンセターゼ活性は、既知の方法（Journal of Genral Microbiology136, 1177-1183 (1990)）に従って測定することができる。また、変異を有する小サブユニット及び／又は大サブユニットをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号２８３〜１４６１からなる塩基配列、又は塩基番号１４７０〜４８０８からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、カルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、カルバモイルリン酸シンセターゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２６】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、コリネ型細菌の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含まれる。
プローブとして、配列番号１に示す塩基配列の一部の配列を使用することができる。そのようなプローブは、配列番号１に示す塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって、調製することができる。プローブとして約３００ｂｐの長さのＤＮＡ断片を用いる場合は、ハイブリダイゼーションの洗浄の条件は、例えば５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである。
【００２７】
本発明のＤＮＡは、その塩基配列が明らかとなったので、同塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet., 5,185 (1989)参照）によりコリネ型細菌染色体ＤＮＡから増幅することによって、又は同塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによりコリネ型細菌染色体ＤＮＡライブラリーから、選択することによって、取得することができる。ＰＣＲに用いるプライマーの塩基配列は、５’側プライマーとしては配列番号１の塩基番号２８３よりも上流部分、好ましくは、塩基番号１８５よりも上流部分、３’側プライマーとしては塩基番号４８０８よりも下流の部分に相当する配列を、それぞれ適宜選択すればよい。
【００２８】
本発明のＤＮＡを発現させるための宿主としては、エシェリヒア・コリ、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、ブレビバクテリウム・フラバム等のコリネ型細菌をはじめとする種々の細菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の真核細胞が挙げられる。これらの宿主に本発明のＤＮＡを導入するには、発現させようとする宿主の種類に応じたベクターに本発明のＤＮＡを挿入して得られる組換えベクターで、宿主細胞を形質転換すればよい。これらの操作は、遺伝子組換え技術において当業者によく知られた方法で実施することができる。具体的には、例えば、前述のエシェリヒア・コリの形質転換に用いられる方法、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）、コリネ型細菌に有用な電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）等が挙げられる。
【００２９】
上記のような宿主に導入するＤＮＡとしては、carA、carBのいずれを含むＤＮＡでもよく、これらを両方含むＤＮＡであってもよい。また、これらの遺伝子の発現を効率的に実施するために、carAまたはcarBの上流に、宿主細胞内で働くｌａｃ、ｔｒｐ、ＰL等のプロモーターを連結してもよい。
【００３０】
上記にような形質転換体を、carA又はcarBが発現する条件で培養することにより、カルバモイルリン酸シンセターゼ又はそのサブユニットを生成させることができる。また、本発明のＤＮＡは、Ｌ−アルギニン生産菌又はウラシル等の核酸生産菌の育種に利用することができる。すなわち、本発明のＤＮＡ、特にcarA及び／又はcarBを導入された形質転換体は、非形質転換体に比べてカルバモイルリン酸シンセターゼ活性が上昇する。その結果、Ｌ−アルギニン、又はウラシル等の核酸の生産能が向上する。
【００３１】
＜２＞本発明のＬ−アルギニンの製造法
カルバモイルリン酸シンセターゼ活性が増強され、かつＬ−アルギニン生産能を有する微生物を培地に培養し、該培地中にＬ−アルギニンを生成蓄積せしめ、該培地からＬ−アルギニンを採取することにより、Ｌ−アルギニンを効率よく製造することができる。
Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物として具体的には、コリネ型細菌、バチルス属細菌、セラチア属細菌、エシェリヒア属細菌、サッカロマイセス属又はキャンディダ属に属する酵母が挙げられる。これらの中ではコリネ型細菌が好ましい。
【００３２】
バチルス属細菌としてはバチルス・サブチリスが、セラチア属細菌としてはセラチア・マルセッセンスが、エシェリヒア属細菌としてはエシェリヒア・コリが、サッカロマイセス属酵母としてはサッカロマイセス・セレビシエが、キャンディダ属酵母としてキャンディダ・トロピカリスが挙げられる。
【００３３】
アルギニン生産能を有する微生物としては、5-アザウラシル、6-アザウラシル、2-チオウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-アザシトシン、6-アザシトシン等に耐性なバチルス・サブチリス、アルギニンヒドロキサメート、2-チオウラシルに耐性なバチルス・サブチリス、アルギニンヒドロキサメート及び6-アザウラシルに耐性なバチルス・サブチリス（特開昭49-1268191号参照）、
ヒスチジンアナログ又はトリプトファンアナログに耐性なバチルス・サブチリス（特開昭52-114092号参照）、
メチニオン、ヒスチジン、スレオニン、プロリン、イソロイシイン、リジン、アデニン、グアニンまたはウラシル（またはウラシル前駆体）の少なくとも一つに要求性を有するバチルス・サブチリス変異株（特開昭52-99289号参照）、
アルギニンヒドロキサメートに耐性なバチルス・サブチリス（特公昭51-6754号参照）、
コハク酸要求性又は核酸塩基アナログに耐性なセラチア・マルセッセンス（特開昭58-9692号）、
アルギニン分解能を欠損し、アルギニンのアンタゴニスト及びカナバニンに耐性を有し、リジンを要求するセラチア・マルセッセンス（特開昭52-8729号参照）、
argA遺伝子を導入されたエシェリヒア・コリ（特開昭57-5693号参照）、
アルギニン、アルギニンヒドロキサメート、ホモアルギニン、Ｄ−アルギニン、カナバニン耐性、アルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシル耐性のサッカロマイセス・セレビシエ（特開昭53-143288号参照）、及び
カナバニン耐性のキャンディダ・トロピカリス（特開昭53-3586号参照）、が挙げられる。
【００３４】
また、コリネ型細菌は、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
【００３５】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００３６】
Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌としては、Ｌ−アルギニン生産能を有するものであれば特に制限されないが、例えば、コリネ型細菌野生株；サルファ剤、２−チアゾールアラニン又はα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有するコリネ型細菌；２−チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−トリプトファン要求性を有するコリネ型細菌（特開昭５４−４４０９６号）；ケトマロン酸、フルオロマロン酸又はモノフルオロ酢酸に耐性を有するコリネ型細菌（特開昭５７−１８９８９号）；アルギニノールに耐性を有するコリネ型細菌（特開昭６２−２４０７５号）；Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体）に耐性を有するコリネ型細菌（特開平２−１８６９９５号）等が挙げられる。
【００３７】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11169（FERM BP-6892）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12092（FERM BP-6906）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11336（FERM BP-6893）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345（FERM BP-6894）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12430（FERM BP-2228）
【００３８】
AJ11169株及びAJ12092株は特開昭５４−４４０９６号記載の２−チアゾールアラニン耐性株、AJ11336株は特公昭６２−２４０７５号記載のアルギニノール耐性及びサルファダイアジン耐性を有する株、AJ11345株は特公昭６２−２４０７５号記載のアルギニノール耐性、２−チアゾールアラニン耐性、サルファグアニジン耐性、及びヒスチジン要求性を有する株、及びAJ12430株は特開平２−１８６９９５号記載のオクチルグアニジン耐性及び２−チアゾールアラニン耐性を有する株である。
【００３９】
上記のようなＬ−アルギニン生産能を有する微生物の細胞中のカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を増強するには、例えば前記微生物細胞内のカルバモイルリン酸シンセターゼをコードするＤＮＡのコピー数を高めることによって行うことができる。またカルバモイルリン酸シンセターゼ活性の増強は、上記の遺伝子増幅による以外に、カルバモイルリン酸シンセターゼをコードするＤＮＡの発現調節配列をカルバモイルリン酸シンセターゼをコードするＤＮＡの発現が増強するように改変することによっても達成される。具体的には、染色体ＤＮＡ上又はプラスミド上のカルバモイルリン酸シンセターゼをコードする遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換する（特開平1-215280号公報参照）。例えば、コリネ型細菌の細胞内で機能するプロモーターのうち強力なものとしては、大腸菌のｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター等がある（Y.Morinaga,M.Tsuchiya,K.Miwa and K.Sano,J.Biotech.,5,305-312(1987)）。また、コリネバクテリウム属細菌のｔｒｐプロモーターも好適なプロモーターである（特開昭62-195294号公報）。これらのプロモーターへの置換により、gdh遺伝子の発現が強化されることによってカルバモイルリン酸シンセターゼ活性が増強される。発現調節配列の改変は、カルバモイルリン酸シンセターゼをコードするＤＮＡのコピー数を高めることと組み合わせてもよい。さらに、カルバモイルリン酸シンセターゼの酵素タンパク質に変異が導入され、同酵素の比活性が高くなるようにすることによっても、細胞中のカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を増強することができる。
【００４０】
カルバモイルリン酸シンセターゼをコードするＤＮＡとしては、例えば前記ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのcarAもしくはcarB又はこれらの両方の遺伝子が挙げられる。
【００４１】
カルバモイルリン酸シンセターゼをコードするＤＮＡを微生物に導入するためのベクターとしては、同微生物細胞内で自律複製可能なベクターが挙げられる。具体的には、前述のエシェリヒア・コリ細胞内で自律複製可能なベクター、又は、エシェリヒア・コリとコリネ型細菌の双方の菌体内で自律複製可能なベクターが挙げられる。
【００４２】
上記のようにして得られる、カルバモイルリン酸シンセターゼ活性が増強され、かつＬ−アルギニン生産能を有する微生物を培養するのに使用する培地は、微生物を用いたアミノ酸の発酵生産に従来より用いられてきた周知の培地を用いてかまわない。つまり、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。
【００４３】
炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００４４】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００４５】
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ1、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００４６】
培養は好気的条件下で１〜７日間実施するのがよく、培養温度は２４℃〜３７℃、培養中のｐＨは５〜９がよい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。発酵液からのＬ−アルギニンの採取は通常イオン交換樹脂法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００４７】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【実施例１】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのcarA及びcarBのクローニング
【００４８】
＜１＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869の染色体DNAの調製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869をT-Y培地（Bacto-trypton（Difco）1%、Bacto-yeast extract（Difco）0.5%、NaCl 0.5%（pH7.2））100mlに接種し、温度31.5℃で８時間培養し、培養物を得た。この培養物を3,000r.p.m.で15分間、遠心分離処理して湿潤菌体0.5gを得た後、該菌体から斎藤、三浦の方法（Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)）により染色体ＤＮＡを得た。次いで、この染色体ＤＮＡ60μg及び制限酵素Sau3AI、３ユニットを10mMトリス−塩酸緩衝液（50mM NaCl、10mM MgSO4及び1mMジチオスレイトール含有（pH 7.4））におのおの混合し、温度37℃で30分間反応させた。反応液を常法により、フェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理してSau3AIで消化されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869の染色体ＤＮＡ断片50μgを得た。
【００４９】
＜２＞プラスミドベクターＤＮＡを利用したブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869の遺伝子ライブラリーの作製
エシェリヒア・コリとコリネ型細菌の双方の菌体内で自律複製可能なプラスミドベクターＤＮＡとして、pSAC4を用いた。pSAC4は、以下のようにして作製した。エシェリヒア・コリ用ベクターpHSG399（宝酒造(株)）をコリネ型細菌で自律複製可能にするために、既に取得されているコリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドpHM1519(Miwa, k. et al., Agric. Biol. Chem., 48 (1984) 2901-2903)由来の複製起点（特開平5-7491号公報）を導入した。具体的には、pHM1519を制限酵素BamHIおよびKpnIで消化し、複製起点を含む遺伝子断片を取得し、得られた断片を宝酒造(株)製Blunting kitを用いて平滑末端化した後、 SalIリンカー（宝酒造(株)製）を用いて、pHSG399のSalIサイトに挿入し、pSAC4を得た。
【００５０】
pSAC4 20μg及び制限酵素BamHI 200ユニットを50mMトリス−塩酸緩衝液（100mM NaCl及び10mM硫酸マグネシウム含有(pH7.4)）に混合し、温度37℃で２時間反応させて消化液を得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理した。この後、プラスミドベクター由来のＤＮＡフラグメントが再結合することを防止するため、Molecular Cloning 2nd editon（J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p1.56 (1989)）の方法で バクテリアルアルカリホスファターゼ（Bacterial Alkaline Phosphatase）処理により、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常法によりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処理を行った。
【００５１】
このBamHIで消化されたpSAC4を1μg、実施例１で得られたSau3AIで消化されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869の染色体ＤＮＡ断片を1μg、及び２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）製）を、66mM塩化マグネシウム、10mMジチオスレイトール及び10mM ATPを含有する66mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）に添加し、温度16℃で16時間反応し、ＤＮＡを連結させた。次いで該ＤＮＡ混合物で、常法によりエシェリヒア・コリ DH5を形質転換し、これを170μg/mlのクロラムフェニコールを含むＬ寒天培地上にまき、約20,000個のコロニーを得、遺伝子ライブラリーとした。
【００５２】
＜３＞エシェリヒア・コリcarB欠失株(JEF8)の形質転換
エシェリヒア・コリのcarB欠失株JEF8（thr-31, ΔcarB, relA-, metB1, Mol. Gen. Genet., 133, 299 (1974)）を、常法により上記遺伝子ライブラリーの組換えDNA混合物で形質転換した。約15000株の形質転換体をCm耐性株として得た。これらの形質転換体をアルギニンもウラシルも含まない最小培地（グルコース5g/L, Na2HPO4 12.8g/L, KH2PO4 3g/L, NaCl 0.5g/L NH4Cl 1g/L, Ｌ−スレオニン40μg/ml, Ｌ−メチオニン40μg/ml）およびＬ−アルギニンは含まずウラシル50μg/mlのみを含む最小培地にレプリカし、アルギニン及びウラシル要求性が回復した株、又はアルギニン要求性が回復した株をスクリーニングした。アルギニン要求性が回復した株は、アルギニン及びウラシルの両方の要求性が回復した。これらの株の一つが保持するプラスミドをp19、同株をJEF8/p19と命名した。p19の構造を図１に示す。
【００５３】
エシェリヒア・コリJEF8/p19は、エシェリヒア・コリAJ13574と命名され、１９９９年１月２８日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託され、受託番号FERM P-17180が付与され、２０００年１月６日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6989が付与されている。
【００５４】
＜４＞アルギニン及びウラシル要求性を相補するプラスミドの取得
JEF8/p19より常法に従いプラスミドを調製し、JEF8株を再形質転換した。得られた形質転換体は、Ｌ−アルギニン及びウラシルを含まない最小培地で生育可能であり、Ｌ−アルギニン及びウラシル両方の要求性が回復していることから，これらのプラスミド上にはエシェリヒア・コリのcarB欠損によるＬ−アルギニン及びウラシル要求性を相補する遺伝子が存在することが判った。
さらに、このプラスミドをエシェリヒア・コリのcarA変異株RC50（carA50, tsx-273, λ-, rpsL135(strR), malT1(λR), xylA7, thi-1, Mol. Gen. Genet. 133, 299 (1974)）に導入した。プラスミド導入株がアルギニン及びウラシルを含まない最小培地で生育可能であったことから、このプラスミド上にエシェリヒア・コリのcarA変異によるＬ−アルギニン及びウラシル要求性を相補する遺伝子も含まれていることが判った。
【００５５】
＜５＞p19の塩基配列の解析
p19に含まれるDNA断片のうち、ベクターのマルチクローニングサイトのHindIII側から挿入DNA断片中にあるHindIIIサイトまでの約4.8Kbの塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、Rohdamin Terminator Cycle Sequencing Kit（ABI社製）を用い、Sangerの方法に従った。得られた塩基配列は配列表の配列番号１に示す通りである。この遺伝子の上流領域に存在するコンセンサス配列の解析から、この配列中には２つのオープンリーディングフレーム（283番目のGから1461番目のAまでのオープンリーディングフレームと1756番目のGから4809番目のTまでのオープンリーディングフレーム）が存在することが推定された。転写を制御するプロモーター領域としては162番目(TGCATA)〜194番目(TATAAT)、185番目(TGCATA)〜213番目(TAAACT)、203番目(TTGAAT)〜230番目(TATCAA)、または224番目(TTATCA)〜251番目(TAAAAA)が考えられる。
【００５６】
これらのオープンリーディングフレームにコードされ得るアミノ酸配列を塩基配列とともに示した。また、それぞれのアミノ酸配列を配列番号２及び３に示した。これらのアミノ酸配列をもとにタンパク質のデータベース(GenBank CDS)でホモロジー検索を行ったところ、5'側のオープンリーディングフレームはエシェリヒア・コリ、バチルス・サブチリス等のcarA遺伝子産物と相同性が高く（約４０％）、3'側のオープンリーディングフレームは既知のエシェリヒア・コリ、バチルス・ステアロサーモフィルス等のcarB遺伝子産物と相同性が高い（約４０〜５０％）ことから、これらのオープンリーディングフレームがそれぞれcarA、carBをコードしていることが示唆された。
【００５７】
＜６＞carA、carBのコリネ型細菌野生株への導入
p19を、ブレビバクテリウム・フラバム野生株2247（AJ14067）に、電気パルス法(特開平2-207791号）を用いて導入した。形質転換体は、5μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｇプレート培地（ポリペプトン10g、酵母エキス10g、グルコース5g、NaCl 5g、寒天15gを純水1Lに含む。pH 7.2）にてクロラムフェニコール耐性株として選択し、2247/p19を得た。
【００５８】
【実施例２】
carA、carBを導入したコリネ型細菌によるＬ−アルギニンの生産
＜１＞シャトルベクターの作製
はじめに、コリネ型細菌にcarA、carB遺伝子を導入するプラスミドとして、エシェリシア・コリと、コリネ型細菌の双方の菌体中で自律複製可能な新規なプラスミドベクターを作製した。
【００５９】
まず、ストレプトコッカス・フェカリスの薬剤耐性遺伝子を持つベクターを構築した。ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺伝子を、同遺伝子を含む公知のプラスミドからPCRにより増幅した。ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている（Trieu-Cuot,P. and Courvalin,P.:Gene 23（3）, 331-341（1983））。この配列を基に配列番号４および５に示すプライマーを合成し、pDG783（Anne-Marie Guerout- Fleury et al., Gene, 167, 335-337(1995)）を鋳型としてPCRを行ない、カナマイシン耐性遺伝子とそのプロモーターを含むDNA断片を増幅した。
【００６０】
上記DNA断片を宝酒造社製のSUPREC02にて精製した後、制限酵素HindIIIとHincIIで完全分解し平滑末端化した。平滑末端化は宝酒造社製のBlunting Kitにより行なった。このDNA断片と、配列番号６および７に示すプライマーを用いてpHSG399(S.Takeshita et al : Gene 61,63-74(1987)参照)を鋳型としてPCRを行って得られた増幅産物を精製し平滑末端化したDNA断片とを、混合し連結した。連結反応は宝酒造社製 DNA ligation kit ver2にて行なった。連結したDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造社製）を形質転換し、IPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド）10μg/ml、X-Gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D−ガラクトシド）40μg/ml及びカナマイシン25μg/mlを含むL培地（バクトトリプトン10g/L、バクトイーストエキストラクト5g/L、NaCl 5g/L、寒天15g/L、pH7.2）に塗布し、一晩培養後、出現した青色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。
【００６１】
形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、105頁、培風館、1992年）を用いてプラスミドを調製し、制限酵素地図を作成し、図２に示す制限酵素地図と同等であるものをpK1と名付けた。このプラスミドはエシェリヒア・コリ中にて安定に保持され、宿主にカナマイシン耐性を付与する。また、lacZ'遺伝子を含むため、クローニングベクターに適している。
【００６２】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869より抽出したプラスミドpAM330(特開昭58-67699号公報参照)を制限酵素HindIIIで完全分解したのち平滑末端化し、これと、上記pK1を制限酵素BsaAIで完全分解したものを、連結した。連結後のDNAを用いてブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869を形質転換した。形質転換の方法は、電気パルス法（特開平2-207791号参照）を用いた。形質転換体の選択は、カナマイシン25μg/mlを含むM-CM2Bプレート(ポリペプトン10g/L、酵母エキス10g/L、NaCl 5g/L、ビオチン10μg/L、寒天15g/L、pH7.2)にて行った。二晩培養後、コロニーを釣り上げ単コロニー分離し、形質転換体とした。形質転換体からプラスミドDNAを調製し、制限酵素地図を作成し、図３に示す制限酵素切断地図と同一の制限酵素地図を持つものをpSFK6と命名した。このプラスミドは、エシェリシア・コリとコリネ型細菌中で自律複製でき、宿主にカナマイシン耐性を付与する。
【００６３】
＜２＞carA、carB遺伝子のコリネ型細菌への導入及びＬ−アルギニンの生産
上記pSFK6をSmaI及びHindIIIで消化した。これに、JEF8/p19より常法に従いプラスミドを調製したプラスミドp19を制限酵素XbaIで消化した後、宝酒造(株)製Blunting kitを用いて平滑末端処理し、さらに制限酵素HindIIIで消化して得たcarA、carB遺伝子断片を連結して、carA、carB遺伝子を含み、かつ、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドpcarABを得た。
【００６４】
pcarABを、ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345及びAJ11336に、電気パルス法(特開平2-207791号）を用いて導入した。形質転換体を、25μg/mlのカナマイシンを含むを含むM-CM2Bプレート(ポリペプトン10g/L、酵母エキス10g/L、グルコース 5g/L、NaCl 5g/L、寒天15g/L、pH7.2) にてカナマイシン耐性株として選択した。対照として、AJ11345及びAJ11336にpSFK6を同様にして導入し、形質転換体を得た。
【００６５】
上記の各形質転換体を、グルコース0.5g/dl、ポリペプトン 1g/dl、酵母エキス 1g/dl、NaCl 0.5g/dl、クロラムフェニコール 5μg/lを含む寒天培地にぬりつけ、31.5℃で20時間培養して得た菌体１エーゼを、グルコース4g/dl、硫酸アンモニウム6.5g/dl、KH2PO4 0.1g/dl、MgSO4 0.04g/dl、FeSO4 0.001g/dl、MnSO4 0.01g/dl、VB1 5μg/dl、ビオチン5μg/dl、大豆加水分解物（N量として）45mg/dlを含む培地に植菌し、フラスコにて31.5℃で50時間振とう培養を行った。各菌株のＬ−アルギニン酸の生成量を表１に示した。
carA、carB遺伝子を導入した株では、ベクターのみを導入した株に比べてＬ−アルギニン生産能が向上した。
【００６６】
【表１】
【００６７】
【発明の効果】
本発明により、カルバモイルリン酸シンセターゼを構成するサブユニットをコードする遺伝子が提供される。同遺伝子は、カルバモイルリン酸シンセターゼ又はそのサブユニットの製造、又はＬ−アルギニン生産菌又は核酸生産菌の育種等に利用することができる。また、本発明により、Ｌ−アルギニンを効率よく製造することができる。
【００６８】
【配列表】
【００６９】
【００７０】
【００７１】
【００７２】
【００７３】
【００７４】
【００７５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 carA遺伝子及びcarB遺伝子を含むプラスミドp19の構造を示す図。
【図２】プラスミドpK1の構築過程を示す図。
【図３】プラスミドpSFK6の構築過程を示す図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、コリネ型細菌のカルバモイルリン酸シンセターゼ及びその遺伝子に関する。同遺伝子は、カルバモイルリン酸シンセターゼ又はそのサブユニットの製造、又はＬ−アルギニン生産菌又は核酸生産菌の育種等に利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
カルバモイルリン酸シンセターゼは、炭酸、ＡＴＰ及びグルタミンからカルバモイルリン酸を生成する反応を触媒する酵素である。この反応によって生じるカルバモイルリン酸は、Ｌ−アルギニン生合成経路においてオルニチンからシトルリンを生成する反応に必要なカルバモイル基のソースとなっている。また、アスパラギン酸とカルバモイルリン酸から生成するカルバモイルアスパラギン酸は、ウリジン−５’−モノホスフェートをはじめとするピリミジン生合成系の中間体である。
【０００３】
カルバモイルリン酸シンセターゼは、２つのサブユニットからなり、エシェリヒア属細菌やバチルス属細菌では、それらのサブユニットはcarA、carBの両遺伝子によってコードされることが知られている。
【０００４】
しかし、コリネ型細菌では、カルバモイルリン酸シンセターゼの活性や酵素についての知見はなく、その遺伝子も知られていなかった。
【０００５】
ところで、エシェリヒア・コリ由来のcarA、carB、argI及びarg boxの各遺伝子を搭載したプラスミドを導入されたエシェリヒア・コリの形質転換株は、カルバモイルリン酸シンセターゼの基質となるグルタミンを添加して培養した場合には細胞内のＬ−アルギニン濃度は、対照のベクターのみを導入した株と同じであるが、カルバモイルリン酸とともにArgIの基質となるオルニチンをグルタミンと同時に添加した場合、細胞内のＬ−アルギニン濃度が対照株よりも高くなることが報告されている（Malamy M. et al., Applied Environmental Microbiology, 63(1), 33 (1997)）。このことから、Ｌ−アルギニン生成の律速点はオルニチンの供給にあることが示唆された。
オルニチン供給の律速点としては、Ｌ−アルギニン生合成系の調節酵素であるＮ−アセチルグルタミン酸シンセターゼ（ArgA）の可能性が高いと考えられた。エシェリヒア・コリのＬ−アルギニン生合成系では、ArgAが最終生成物Ｌ−アルギニンによりフィードバック阻害を受けている。
フィードバック阻害解除型ArgAをコードするargA遺伝子をプラスミドで増幅した株では、グルタミンのみの添加でも、グルタミン及びオルニチンの両方を添加して培養したときと同様に、細胞内Ｌ−アルギニン濃度が上昇した。しかし、グルタミン、又はグルタミン及びオルニチンのどちらを添加して培養した場合でも、さらにcarA及びcarBの両遺伝子を増幅しても、さらなる上昇はみられなかった（Malamy M. et al., Applied Environmental Microbiology, 64(5), 1805 (1998)）。
【０００６】
しかし、コリネ型細菌由来のカルバモイルリン酸シンセターゼについては、これをコードする遺伝子を利用して、微生物のＬ−アルギニン生産能を高める試みは報告されていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、コリネ型細菌のカルバモイルリン酸シンセターゼ及びそれをコードする遺伝子を提供すること、及び、当該遺伝子を利用して微生物によるＬ−アルギニンの製造方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明者は鋭意研究を行った結果、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株から、エシェリヒア・コリのcarB欠失株を用いてcarA遺伝子及びcarB遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１） 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ断片。
（Ａ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（Ｂ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチド。
（２） 下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ断片。
（Ｃ）配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（Ｄ）配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むカルバモイルリン酸シンセターゼの小サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチド。
（３） 配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、カルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチドをコードするＤＮＡ断
片。
（４） 下記（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチド、及び（ｃ）又は（ｄ）に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ断片。
（ａ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチド。
（ｃ）配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｄ）配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むカルバモイルリン酸シンセターゼの小サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチド。
【００１０】
（５）配列番号１記載の塩基配列において塩基番号２８３〜１４６１からなる塩基配列を含む（１）記載のＤＮＡ断片。
（６） 配列番号１記載の塩基配列において塩基番号１４７０〜４８０８からなる塩基配列を含む（２）記載のＤＮＡ断片。
（７） 配列番号１記載の塩基配列において塩基番号２８３〜４８０８からなる塩基配列を含む（３）記載のＤＮＡ断片。
【００１１】
（８）下記（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチド、及び（ｃ）又は（ｄ）に示すポリペプチドからなるタンパク質。
（ａ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチド。
（ｃ）配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｄ）配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むカルバモイルリン酸シンセターゼの小サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチド。
（９） （１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡ断片で形質転換されたコリネ型細菌。
（１０） 細胞中のカルバモイルリン酸シンセターゼ活性が増強され、かつＬ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌。
（１１） 前記カルバモイルリン酸シンセターゼ活性の増強が、前記コリネ型細菌細胞内のカルバモイルリン酸シンセターゼをコードするＤＮＡのコピー数を高めること、又は、細胞内の同遺伝子の発現を増強するように発現調節配列を改変することによるものである（１０）記載のコリネ型細菌。
（１２） 前記ＤＮＡが、（１）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡ断片である（１１）記載のコリネ型細菌。
（１３） （１０）〜（１２）のいずれかに記載のコリネ型細菌を培地に培養し、該培地中にＬ−アルギニンを生成蓄積せしめ、該培地からＬ−アルギニンを採取することを特徴とするＬ−アルギニンの製造法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、プラスミドなどのベクターを用いて作製したコリネ型細菌の染色体ＤＮＡライブラリーから、carA又はcarBを欠損した微生物、例えば、エシェリヒア・コリRC50（carA50, tsx-273, λ-, rpsL135(strR), malT1(λR), xylA7, thi-1, Mol. Gen. Genet. 133, 299 (1974)）、エシェリヒア・コリJEF8（thr-31, ΔcarB, relA-, metB1, Mol. Gen. Genet., 133, 299 (1974)）を用いて選択することによって取得することができる。carA又はcarBを欠損した微生物は、Ｌ−アルギニン及びウラシル要求性を示すので、同微生物を染色体ＤＮＡライブラリーで形質転換し、前記栄養要求性を相補するクローンを選択し、得られた形質転換体から組換えベクターを回収すれば、carA又はcarBを含むＤＮＡ断片が得られる。
【００１３】
染色体ＤＮＡライブラリーを調製するためのコリネ型細菌としては、特に制限されないが、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌、具体的には例えばブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの野生株等が挙げられる。コリネ型細菌の染色体ＤＮＡは、例えば斎藤、三浦の方法（Biochem.Biophys.Acta.,72,619,(1963)）、K. S. Kirbyの方法（Biochem.J.,64,405,(1956)）等の方法により調製することができる。
【００１４】
染色体ＤＮＡライブラリーは、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解し、得られるＤＮＡ断片をエシェリヒア・コリ細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結し、組換えＤＮＡを作製し、エシェリヒア・コリに導入することによって得られる。ベクターは、通常遺伝子のクローニングに用いられるベクターであれば特に制限されず、pUC19、pUC18、pUC118、pUC119等のプラスミドベクター、λファージＤＮＡなどのファージベクターが使用できる。また、エシェリヒア・コリとコリネ型細菌の双方の菌体内で自律複製可能なベクターを用いてもよい。そのようなベクターは、エシェリヒア・コリ用ベクターと、ブレビバクテリウムラクトファーメンタムのクリプティックプラスミドであるpAM330（特開昭58-67699号公報参照）を結合することによって構築することができる。
【００１５】
エシェリヒア・コリとコリネ型細菌の双方の菌体内で自律複製可能なベクターとして具体的には、pSAC4（実施例参照）及びpHK4（特開平5-7491号公報参照）等が挙げられる。pHK4を保持するエシェリヒア・コリHB101は、エシェリヒア・コリ AJ13136と命名され、１９９５年８月１日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5186として寄託されている。
【００１６】
エシェリヒア・コリの形質転換は、D.A.Morrisonの方法（Methods in Enzymology, 68, 326, 1979）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(1970)）等により行うことができる。また、染色体ＤＮＡライブラリーの作製、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、後述のＰＣＲ、オリゴヌクレオチドの作製、ハイブリダイゼーション等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
【００１７】
上記のようにして得られるcarA及びcarBを含むＤＮＡ断片の塩基配列を、配列表の配列番号１に示す。この配列中には、２つのオープンリーディングフレーム（ORF）（塩基番号283〜1461、及び塩基番号1756〜4809）が存在する。上流側のORFがcarA、下流側のORFがcarBである。各々のORFによってコードされるアミノ酸配列を、配列番号２及び３に示す。本発明において、carAによってコードされるペプチドを小サブユニット、carBによってコードされるペプチドを大サブユニットという。尚、配列表には、carAのコード領域は塩基番号283〜285のGTGを開始コドンとして示したが、これは、メチオニン、またはフォルミルメチオニンを表すものである。
【００１８】
本発明のカルバモイルリン酸シンセターゼの小サブユニットは、配列番号２においてアミノ酸番号１〜３９３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。また、本発明のカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットは、配列番号３においてアミノ酸番号１〜１１１３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００１９】
本発明において、小サブユニットをコードするＤＮＡは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異を含むアミノ酸配列からなるものであっても、大サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチドをコードするものであってもよい。
【００２０】
また、本発明の大サブユニットをコードするＤＮＡは、配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異を含むアミノ酸配列からなるものであっても、小サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼシ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチドをコードするものであってもよい。あるいは、配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異を含むアミノ酸配列からなり、カルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
【００２１】
さらに、小サブユニットもしくは大サブユニット又はこれらの両方に変異を含むカルバモイルリン酸シンセターゼをコードするＤＮＡも、本発明のＤＮＡに含まれる。
【００２２】
ここで「１若しくは数個」とは、１〜１０個である。
【００２３】
上記のような小サブユニット又は大サブユニットと実質的に同一のペプチドをコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、小サブユニット及び／又は大サブユニットをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び小サブユニット及び／又は大サブユニットをコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００２４】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、小サブユニット又は大サブユニットを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含まれる。
【００２５】
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物のカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を調べることにより、カルバモイルリン酸シンセターゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。カルバモイルリン酸シンセターゼ活性は、既知の方法（Journal of Genral Microbiology136, 1177-1183 (1990)）に従って測定することができる。また、変異を有する小サブユニット及び／又は大サブユニットをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号２８３〜１４６１からなる塩基配列、又は塩基番号１４７０〜４８０８からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、カルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、カルバモイルリン酸シンセターゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２６】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、コリネ型細菌の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含まれる。
プローブとして、配列番号１に示す塩基配列の一部の配列を使用することができる。そのようなプローブは、配列番号１に示す塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって、調製することができる。プローブとして約３００ｂｐの長さのＤＮＡ断片を用いる場合は、ハイブリダイゼーションの洗浄の条件は、例えば５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである。
【００２７】
本発明のＤＮＡは、その塩基配列が明らかとなったので、同塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet., 5,185 (1989)参照）によりコリネ型細菌染色体ＤＮＡから増幅することによって、又は同塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによりコリネ型細菌染色体ＤＮＡライブラリーから、選択することによって、取得することができる。ＰＣＲに用いるプライマーの塩基配列は、５’側プライマーとしては配列番号１の塩基番号２８３よりも上流部分、好ましくは、塩基番号１８５よりも上流部分、３’側プライマーとしては塩基番号４８０８よりも下流の部分に相当する配列を、それぞれ適宜選択すればよい。
【００２８】
本発明のＤＮＡを発現させるための宿主としては、エシェリヒア・コリ、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、ブレビバクテリウム・フラバム等のコリネ型細菌をはじめとする種々の細菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の真核細胞が挙げられる。これらの宿主に本発明のＤＮＡを導入するには、発現させようとする宿主の種類に応じたベクターに本発明のＤＮＡを挿入して得られる組換えベクターで、宿主細胞を形質転換すればよい。これらの操作は、遺伝子組換え技術において当業者によく知られた方法で実施することができる。具体的には、例えば、前述のエシェリヒア・コリの形質転換に用いられる方法、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）、コリネ型細菌に有用な電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）等が挙げられる。
【００２９】
上記のような宿主に導入するＤＮＡとしては、carA、carBのいずれを含むＤＮＡでもよく、これらを両方含むＤＮＡであってもよい。また、これらの遺伝子の発現を効率的に実施するために、carAまたはcarBの上流に、宿主細胞内で働くｌａｃ、ｔｒｐ、ＰL等のプロモーターを連結してもよい。
【００３０】
上記にような形質転換体を、carA又はcarBが発現する条件で培養することにより、カルバモイルリン酸シンセターゼ又はそのサブユニットを生成させることができる。また、本発明のＤＮＡは、Ｌ−アルギニン生産菌又はウラシル等の核酸生産菌の育種に利用することができる。すなわち、本発明のＤＮＡ、特にcarA及び／又はcarBを導入された形質転換体は、非形質転換体に比べてカルバモイルリン酸シンセターゼ活性が上昇する。その結果、Ｌ−アルギニン、又はウラシル等の核酸の生産能が向上する。
【００３１】
＜２＞本発明のＬ−アルギニンの製造法
カルバモイルリン酸シンセターゼ活性が増強され、かつＬ−アルギニン生産能を有する微生物を培地に培養し、該培地中にＬ−アルギニンを生成蓄積せしめ、該培地からＬ−アルギニンを採取することにより、Ｌ−アルギニンを効率よく製造することができる。
Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物として具体的には、コリネ型細菌、バチルス属細菌、セラチア属細菌、エシェリヒア属細菌、サッカロマイセス属又はキャンディダ属に属する酵母が挙げられる。これらの中ではコリネ型細菌が好ましい。
【００３２】
バチルス属細菌としてはバチルス・サブチリスが、セラチア属細菌としてはセラチア・マルセッセンスが、エシェリヒア属細菌としてはエシェリヒア・コリが、サッカロマイセス属酵母としてはサッカロマイセス・セレビシエが、キャンディダ属酵母としてキャンディダ・トロピカリスが挙げられる。
【００３３】
アルギニン生産能を有する微生物としては、5-アザウラシル、6-アザウラシル、2-チオウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-アザシトシン、6-アザシトシン等に耐性なバチルス・サブチリス、アルギニンヒドロキサメート、2-チオウラシルに耐性なバチルス・サブチリス、アルギニンヒドロキサメート及び6-アザウラシルに耐性なバチルス・サブチリス（特開昭49-1268191号参照）、
ヒスチジンアナログ又はトリプトファンアナログに耐性なバチルス・サブチリス（特開昭52-114092号参照）、
メチニオン、ヒスチジン、スレオニン、プロリン、イソロイシイン、リジン、アデニン、グアニンまたはウラシル（またはウラシル前駆体）の少なくとも一つに要求性を有するバチルス・サブチリス変異株（特開昭52-99289号参照）、
アルギニンヒドロキサメートに耐性なバチルス・サブチリス（特公昭51-6754号参照）、
コハク酸要求性又は核酸塩基アナログに耐性なセラチア・マルセッセンス（特開昭58-9692号）、
アルギニン分解能を欠損し、アルギニンのアンタゴニスト及びカナバニンに耐性を有し、リジンを要求するセラチア・マルセッセンス（特開昭52-8729号参照）、
argA遺伝子を導入されたエシェリヒア・コリ（特開昭57-5693号参照）、
アルギニン、アルギニンヒドロキサメート、ホモアルギニン、Ｄ−アルギニン、カナバニン耐性、アルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシル耐性のサッカロマイセス・セレビシエ（特開昭53-143288号参照）、及び
カナバニン耐性のキャンディダ・トロピカリス（特開昭53-3586号参照）、が挙げられる。
【００３４】
また、コリネ型細菌は、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
【００３５】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００３６】
Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌としては、Ｌ−アルギニン生産能を有するものであれば特に制限されないが、例えば、コリネ型細菌野生株；サルファ剤、２−チアゾールアラニン又はα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有するコリネ型細菌；２−チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−トリプトファン要求性を有するコリネ型細菌（特開昭５４−４４０９６号）；ケトマロン酸、フルオロマロン酸又はモノフルオロ酢酸に耐性を有するコリネ型細菌（特開昭５７−１８９８９号）；アルギニノールに耐性を有するコリネ型細菌（特開昭６２−２４０７５号）；Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体）に耐性を有するコリネ型細菌（特開平２−１８６９９５号）等が挙げられる。
【００３７】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11169（FERM BP-6892）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12092（FERM BP-6906）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11336（FERM BP-6893）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345（FERM BP-6894）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12430（FERM BP-2228）
【００３８】
AJ11169株及びAJ12092株は特開昭５４−４４０９６号記載の２−チアゾールアラニン耐性株、AJ11336株は特公昭６２−２４０７５号記載のアルギニノール耐性及びサルファダイアジン耐性を有する株、AJ11345株は特公昭６２−２４０７５号記載のアルギニノール耐性、２−チアゾールアラニン耐性、サルファグアニジン耐性、及びヒスチジン要求性を有する株、及びAJ12430株は特開平２−１８６９９５号記載のオクチルグアニジン耐性及び２−チアゾールアラニン耐性を有する株である。
【００３９】
上記のようなＬ−アルギニン生産能を有する微生物の細胞中のカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を増強するには、例えば前記微生物細胞内のカルバモイルリン酸シンセターゼをコードするＤＮＡのコピー数を高めることによって行うことができる。またカルバモイルリン酸シンセターゼ活性の増強は、上記の遺伝子増幅による以外に、カルバモイルリン酸シンセターゼをコードするＤＮＡの発現調節配列をカルバモイルリン酸シンセターゼをコードするＤＮＡの発現が増強するように改変することによっても達成される。具体的には、染色体ＤＮＡ上又はプラスミド上のカルバモイルリン酸シンセターゼをコードする遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換する（特開平1-215280号公報参照）。例えば、コリネ型細菌の細胞内で機能するプロモーターのうち強力なものとしては、大腸菌のｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター等がある（Y.Morinaga,M.Tsuchiya,K.Miwa and K.Sano,J.Biotech.,5,305-312(1987)）。また、コリネバクテリウム属細菌のｔｒｐプロモーターも好適なプロモーターである（特開昭62-195294号公報）。これらのプロモーターへの置換により、gdh遺伝子の発現が強化されることによってカルバモイルリン酸シンセターゼ活性が増強される。発現調節配列の改変は、カルバモイルリン酸シンセターゼをコードするＤＮＡのコピー数を高めることと組み合わせてもよい。さらに、カルバモイルリン酸シンセターゼの酵素タンパク質に変異が導入され、同酵素の比活性が高くなるようにすることによっても、細胞中のカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を増強することができる。
【００４０】
カルバモイルリン酸シンセターゼをコードするＤＮＡとしては、例えば前記ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのcarAもしくはcarB又はこれらの両方の遺伝子が挙げられる。
【００４１】
カルバモイルリン酸シンセターゼをコードするＤＮＡを微生物に導入するためのベクターとしては、同微生物細胞内で自律複製可能なベクターが挙げられる。具体的には、前述のエシェリヒア・コリ細胞内で自律複製可能なベクター、又は、エシェリヒア・コリとコリネ型細菌の双方の菌体内で自律複製可能なベクターが挙げられる。
【００４２】
上記のようにして得られる、カルバモイルリン酸シンセターゼ活性が増強され、かつＬ−アルギニン生産能を有する微生物を培養するのに使用する培地は、微生物を用いたアミノ酸の発酵生産に従来より用いられてきた周知の培地を用いてかまわない。つまり、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。
【００４３】
炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００４４】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００４５】
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ1、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００４６】
培養は好気的条件下で１〜７日間実施するのがよく、培養温度は２４℃〜３７℃、培養中のｐＨは５〜９がよい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。発酵液からのＬ−アルギニンの採取は通常イオン交換樹脂法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００４７】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【実施例１】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのcarA及びcarBのクローニング
【００４８】
＜１＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869の染色体DNAの調製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869をT-Y培地（Bacto-trypton（Difco）1%、Bacto-yeast extract（Difco）0.5%、NaCl 0.5%（pH7.2））100mlに接種し、温度31.5℃で８時間培養し、培養物を得た。この培養物を3,000r.p.m.で15分間、遠心分離処理して湿潤菌体0.5gを得た後、該菌体から斎藤、三浦の方法（Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)）により染色体ＤＮＡを得た。次いで、この染色体ＤＮＡ60μg及び制限酵素Sau3AI、３ユニットを10mMトリス−塩酸緩衝液（50mM NaCl、10mM MgSO4及び1mMジチオスレイトール含有（pH 7.4））におのおの混合し、温度37℃で30分間反応させた。反応液を常法により、フェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理してSau3AIで消化されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869の染色体ＤＮＡ断片50μgを得た。
【００４９】
＜２＞プラスミドベクターＤＮＡを利用したブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869の遺伝子ライブラリーの作製
エシェリヒア・コリとコリネ型細菌の双方の菌体内で自律複製可能なプラスミドベクターＤＮＡとして、pSAC4を用いた。pSAC4は、以下のようにして作製した。エシェリヒア・コリ用ベクターpHSG399（宝酒造(株)）をコリネ型細菌で自律複製可能にするために、既に取得されているコリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドpHM1519(Miwa, k. et al., Agric. Biol. Chem., 48 (1984) 2901-2903)由来の複製起点（特開平5-7491号公報）を導入した。具体的には、pHM1519を制限酵素BamHIおよびKpnIで消化し、複製起点を含む遺伝子断片を取得し、得られた断片を宝酒造(株)製Blunting kitを用いて平滑末端化した後、 SalIリンカー（宝酒造(株)製）を用いて、pHSG399のSalIサイトに挿入し、pSAC4を得た。
【００５０】
pSAC4 20μg及び制限酵素BamHI 200ユニットを50mMトリス−塩酸緩衝液（100mM NaCl及び10mM硫酸マグネシウム含有(pH7.4)）に混合し、温度37℃で２時間反応させて消化液を得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理した。この後、プラスミドベクター由来のＤＮＡフラグメントが再結合することを防止するため、Molecular Cloning 2nd editon（J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p1.56 (1989)）の方法で バクテリアルアルカリホスファターゼ（Bacterial Alkaline Phosphatase）処理により、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常法によりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処理を行った。
【００５１】
このBamHIで消化されたpSAC4を1μg、実施例１で得られたSau3AIで消化されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869の染色体ＤＮＡ断片を1μg、及び２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）製）を、66mM塩化マグネシウム、10mMジチオスレイトール及び10mM ATPを含有する66mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）に添加し、温度16℃で16時間反応し、ＤＮＡを連結させた。次いで該ＤＮＡ混合物で、常法によりエシェリヒア・コリ DH5を形質転換し、これを170μg/mlのクロラムフェニコールを含むＬ寒天培地上にまき、約20,000個のコロニーを得、遺伝子ライブラリーとした。
【００５２】
＜３＞エシェリヒア・コリcarB欠失株(JEF8)の形質転換
エシェリヒア・コリのcarB欠失株JEF8（thr-31, ΔcarB, relA-, metB1, Mol. Gen. Genet., 133, 299 (1974)）を、常法により上記遺伝子ライブラリーの組換えDNA混合物で形質転換した。約15000株の形質転換体をCm耐性株として得た。これらの形質転換体をアルギニンもウラシルも含まない最小培地（グルコース5g/L, Na2HPO4 12.8g/L, KH2PO4 3g/L, NaCl 0.5g/L NH4Cl 1g/L, Ｌ−スレオニン40μg/ml, Ｌ−メチオニン40μg/ml）およびＬ−アルギニンは含まずウラシル50μg/mlのみを含む最小培地にレプリカし、アルギニン及びウラシル要求性が回復した株、又はアルギニン要求性が回復した株をスクリーニングした。アルギニン要求性が回復した株は、アルギニン及びウラシルの両方の要求性が回復した。これらの株の一つが保持するプラスミドをp19、同株をJEF8/p19と命名した。p19の構造を図１に示す。
【００５３】
エシェリヒア・コリJEF8/p19は、エシェリヒア・コリAJ13574と命名され、１９９９年１月２８日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託され、受託番号FERM P-17180が付与され、２０００年１月６日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6989が付与されている。
【００５４】
＜４＞アルギニン及びウラシル要求性を相補するプラスミドの取得
JEF8/p19より常法に従いプラスミドを調製し、JEF8株を再形質転換した。得られた形質転換体は、Ｌ−アルギニン及びウラシルを含まない最小培地で生育可能であり、Ｌ−アルギニン及びウラシル両方の要求性が回復していることから，これらのプラスミド上にはエシェリヒア・コリのcarB欠損によるＬ−アルギニン及びウラシル要求性を相補する遺伝子が存在することが判った。
さらに、このプラスミドをエシェリヒア・コリのcarA変異株RC50（carA50, tsx-273, λ-, rpsL135(strR), malT1(λR), xylA7, thi-1, Mol. Gen. Genet. 133, 299 (1974)）に導入した。プラスミド導入株がアルギニン及びウラシルを含まない最小培地で生育可能であったことから、このプラスミド上にエシェリヒア・コリのcarA変異によるＬ−アルギニン及びウラシル要求性を相補する遺伝子も含まれていることが判った。
【００５５】
＜５＞p19の塩基配列の解析
p19に含まれるDNA断片のうち、ベクターのマルチクローニングサイトのHindIII側から挿入DNA断片中にあるHindIIIサイトまでの約4.8Kbの塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、Rohdamin Terminator Cycle Sequencing Kit（ABI社製）を用い、Sangerの方法に従った。得られた塩基配列は配列表の配列番号１に示す通りである。この遺伝子の上流領域に存在するコンセンサス配列の解析から、この配列中には２つのオープンリーディングフレーム（283番目のGから1461番目のAまでのオープンリーディングフレームと1756番目のGから4809番目のTまでのオープンリーディングフレーム）が存在することが推定された。転写を制御するプロモーター領域としては162番目(TGCATA)〜194番目(TATAAT)、185番目(TGCATA)〜213番目(TAAACT)、203番目(TTGAAT)〜230番目(TATCAA)、または224番目(TTATCA)〜251番目(TAAAAA)が考えられる。
【００５６】
これらのオープンリーディングフレームにコードされ得るアミノ酸配列を塩基配列とともに示した。また、それぞれのアミノ酸配列を配列番号２及び３に示した。これらのアミノ酸配列をもとにタンパク質のデータベース(GenBank CDS)でホモロジー検索を行ったところ、5'側のオープンリーディングフレームはエシェリヒア・コリ、バチルス・サブチリス等のcarA遺伝子産物と相同性が高く（約４０％）、3'側のオープンリーディングフレームは既知のエシェリヒア・コリ、バチルス・ステアロサーモフィルス等のcarB遺伝子産物と相同性が高い（約４０〜５０％）ことから、これらのオープンリーディングフレームがそれぞれcarA、carBをコードしていることが示唆された。
【００５７】
＜６＞carA、carBのコリネ型細菌野生株への導入
p19を、ブレビバクテリウム・フラバム野生株2247（AJ14067）に、電気パルス法(特開平2-207791号）を用いて導入した。形質転換体は、5μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｇプレート培地（ポリペプトン10g、酵母エキス10g、グルコース5g、NaCl 5g、寒天15gを純水1Lに含む。pH 7.2）にてクロラムフェニコール耐性株として選択し、2247/p19を得た。
【００５８】
【実施例２】
carA、carBを導入したコリネ型細菌によるＬ−アルギニンの生産
＜１＞シャトルベクターの作製
はじめに、コリネ型細菌にcarA、carB遺伝子を導入するプラスミドとして、エシェリシア・コリと、コリネ型細菌の双方の菌体中で自律複製可能な新規なプラスミドベクターを作製した。
【００５９】
まず、ストレプトコッカス・フェカリスの薬剤耐性遺伝子を持つベクターを構築した。ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺伝子を、同遺伝子を含む公知のプラスミドからPCRにより増幅した。ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている（Trieu-Cuot,P. and Courvalin,P.:Gene 23（3）, 331-341（1983））。この配列を基に配列番号４および５に示すプライマーを合成し、pDG783（Anne-Marie Guerout- Fleury et al., Gene, 167, 335-337(1995)）を鋳型としてPCRを行ない、カナマイシン耐性遺伝子とそのプロモーターを含むDNA断片を増幅した。
【００６０】
上記DNA断片を宝酒造社製のSUPREC02にて精製した後、制限酵素HindIIIとHincIIで完全分解し平滑末端化した。平滑末端化は宝酒造社製のBlunting Kitにより行なった。このDNA断片と、配列番号６および７に示すプライマーを用いてpHSG399(S.Takeshita et al : Gene 61,63-74(1987)参照)を鋳型としてPCRを行って得られた増幅産物を精製し平滑末端化したDNA断片とを、混合し連結した。連結反応は宝酒造社製 DNA ligation kit ver2にて行なった。連結したDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造社製）を形質転換し、IPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド）10μg/ml、X-Gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D−ガラクトシド）40μg/ml及びカナマイシン25μg/mlを含むL培地（バクトトリプトン10g/L、バクトイーストエキストラクト5g/L、NaCl 5g/L、寒天15g/L、pH7.2）に塗布し、一晩培養後、出現した青色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。
【００６１】
形質転換株からアルカリ法（生物工学実験書、日本生物工学会編、105頁、培風館、1992年）を用いてプラスミドを調製し、制限酵素地図を作成し、図２に示す制限酵素地図と同等であるものをpK1と名付けた。このプラスミドはエシェリヒア・コリ中にて安定に保持され、宿主にカナマイシン耐性を付与する。また、lacZ'遺伝子を含むため、クローニングベクターに適している。
【００６２】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869より抽出したプラスミドpAM330(特開昭58-67699号公報参照)を制限酵素HindIIIで完全分解したのち平滑末端化し、これと、上記pK1を制限酵素BsaAIで完全分解したものを、連結した。連結後のDNAを用いてブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869を形質転換した。形質転換の方法は、電気パルス法（特開平2-207791号参照）を用いた。形質転換体の選択は、カナマイシン25μg/mlを含むM-CM2Bプレート(ポリペプトン10g/L、酵母エキス10g/L、NaCl 5g/L、ビオチン10μg/L、寒天15g/L、pH7.2)にて行った。二晩培養後、コロニーを釣り上げ単コロニー分離し、形質転換体とした。形質転換体からプラスミドDNAを調製し、制限酵素地図を作成し、図３に示す制限酵素切断地図と同一の制限酵素地図を持つものをpSFK6と命名した。このプラスミドは、エシェリシア・コリとコリネ型細菌中で自律複製でき、宿主にカナマイシン耐性を付与する。
【００６３】
＜２＞carA、carB遺伝子のコリネ型細菌への導入及びＬ−アルギニンの生産
上記pSFK6をSmaI及びHindIIIで消化した。これに、JEF8/p19より常法に従いプラスミドを調製したプラスミドp19を制限酵素XbaIで消化した後、宝酒造(株)製Blunting kitを用いて平滑末端処理し、さらに制限酵素HindIIIで消化して得たcarA、carB遺伝子断片を連結して、carA、carB遺伝子を含み、かつ、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドpcarABを得た。
【００６４】
pcarABを、ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345及びAJ11336に、電気パルス法(特開平2-207791号）を用いて導入した。形質転換体を、25μg/mlのカナマイシンを含むを含むM-CM2Bプレート(ポリペプトン10g/L、酵母エキス10g/L、グルコース 5g/L、NaCl 5g/L、寒天15g/L、pH7.2) にてカナマイシン耐性株として選択した。対照として、AJ11345及びAJ11336にpSFK6を同様にして導入し、形質転換体を得た。
【００６５】
上記の各形質転換体を、グルコース0.5g/dl、ポリペプトン 1g/dl、酵母エキス 1g/dl、NaCl 0.5g/dl、クロラムフェニコール 5μg/lを含む寒天培地にぬりつけ、31.5℃で20時間培養して得た菌体１エーゼを、グルコース4g/dl、硫酸アンモニウム6.5g/dl、KH2PO4 0.1g/dl、MgSO4 0.04g/dl、FeSO4 0.001g/dl、MnSO4 0.01g/dl、VB1 5μg/dl、ビオチン5μg/dl、大豆加水分解物（N量として）45mg/dlを含む培地に植菌し、フラスコにて31.5℃で50時間振とう培養を行った。各菌株のＬ−アルギニン酸の生成量を表１に示した。
carA、carB遺伝子を導入した株では、ベクターのみを導入した株に比べてＬ−アルギニン生産能が向上した。
【００６６】
【表１】
【発明の効果】
本発明により、カルバモイルリン酸シンセターゼを構成するサブユニットをコードする遺伝子が提供される。同遺伝子は、カルバモイルリン酸シンセターゼ又はそのサブユニットの製造、又はＬ−アルギニン生産菌又は核酸生産菌の育種等に利用することができる。また、本発明により、Ｌ−アルギニンを効率よく製造することができる。
【００６８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 carA遺伝子及びcarB遺伝子を含むプラスミドp19の構造を示す図。
【図２】プラスミドpK1の構築過程を示す図。
【図３】プラスミドpSFK6の構築過程を示す図。
Claims (11)
- 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ断片。
（Ａ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（Ｂ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチド。 - 下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ断片。
（Ｃ）配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（Ｄ）配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むカルバモイルリン酸シンセターゼの小サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチド。 - 配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、カルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチドをコードするＤＮＡ断片。
- 下記（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチド、及び（ｃ）又は（ｄ）に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ断片。
（ａ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチド。
（ｃ）配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｄ）配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するカルバモイルリン酸シンセターゼの小サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチド。 - 配列番号１記載の塩基配列において塩基番号２８３〜１４６１からなる塩基配列を含む請求項１記載のＤＮＡ断片。
- 配列番号１記載の塩基配列において塩基番号１４７０〜４８０８からなる塩基配列を含む請求項２記載のＤＮＡ断片。
- 配列番号１記載の塩基配列において塩基番号２８３〜４８０８からなる塩基配列を含む請求項３記載のＤＮＡ断片。
- 下記（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチド、及び（ｃ）又は（ｄ）に示すポリペプチドからなるタンパク質。
（ａ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチド。
（ｃ）配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｄ）配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むカルバモイルリン酸シンセターゼの小サブユニットとともにカルバモイルリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチド。 - 請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡ断片で形質転換されたコリネ型細菌。
- 細胞内のカルバモイルリン酸シンセターゼをコードするＤＮＡのコピー数を高めること、又は、細胞内の同ＤＮＡの発現を増強するように発現調節配列を改変することによって、細胞中のカルバモイルリン酸シンセターゼ活性が増強され、かつＬ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌であって、前記ＤＮＡが、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡ断片であるコリネ型細菌。
- 請求項１０に記載のコリネ型細菌を培地に培養し、該培地中にＬ−アルギニンを生成蓄積せしめ、該培地からＬ−アルギニンを採取することを特徴とするＬ−アルギニンの製造法。
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