JP3738449B2 - コリネバクテリウム属細菌由来の新規遺伝子及びその利用 - Google Patents
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Description
産業上の利用分野
本発明は、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−リジンに代表されるＬ−アミノ酸等の物質の発酵生産に用いられるコリネバクテリウム属細菌の育種と利用に関する。
従来の技術
コリネバクテリウム属細菌をビオチン量を制限した培地で培養すると同細菌は著量のＬ−グルタミン酸を生産する。一方、コリネバクテリウム属細菌をビオチンが過剰量存在する培地中で培養すると同細菌はＬ−グルタミン酸を生産しないが、この培養条件でも培地に界面活性剤またはペニシリンを添加すると、同細菌の生育は抑制され、同細菌は著量のＬ−グルタミン酸を生産するようになることが知られている。
すなわち、コリネバクテリウム属細菌を用いてＬ−グルタミン酸を生産するには次のいずれかの手段が有効である。
１．培地中のビオチン濃度を最適以下（suboptimal）にする。
奥村真二、都河竜一郎、角田俊直、北井淳夫：日本農芸化学会誌，36, 197-203（1962)参照。
２．ビオチンが十分量存在する条件で培地に界面活性剤を添加する。
I.Shiio, H.Otsuka, N.Atsuya : J. Biochem., 53, 333-340（1963)及びK.Takinami, H.Okada, T.Tsunoda : Agr. Biol. Chem., 27, 853-863（1963)参照。
３．ビオチンが十分量存在する条件で培地にペニシリンを添加する。
米国特許第3,080,297号、特公昭37-1695号及び渋川満、栗間理夫、岡部節三、大沢岳義：Amino Acid and Nucleic Acid, 17, 61-65（1968)参照。
それらの作用機作については、以下の通り考察されている。
ビオチン制限によるＬ−グルタミン酸生成の場合、ビオチンが脂肪酸合成系のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの補酵素になっていること、及び、オレイン酸を初めとする不飽和脂肪酸及びその誘導体にはビオチン代替作用が認められることなどの事実より、細胞膜の脂肪酸組成に影響を与えることでＬ−グルタミン酸の細胞膜透過性が変化する事が主要因であろうと考えられている(I.Shiio,S.Otsuka,M.Takahashi:J.Biochem.,51,56-62(1962),I.Shiio,K.Narui,N.Yahaba,M.Takahashi:J.Biochem.,51,109-111(1962))。
また、界面活性剤又はペニシリン添加によるＬ−グルタミン酸生成の場合も、細胞表層の構造変化による細胞質膜透過性の変化と結び付けて考えられてきた(I.Shiio,S.Otsuka,N.Katsuya:J.Biochem.,53,333-340(1963))。
上記のようにＬ−グルタミン酸生成は細胞膜透過性と結び付けて議論されてきたが、しかしながらその関連性を直接的に証明する知見は得られていなかった。
すなわち、ビオチンの制限または界面活性剤もしくはペニシリンの添加がどの様な作用機作を通じてコリネバクテリウム属細菌のＬ−グルタミン酸の生産性を改善することにつながるのか不明な点が多かった。
さらに、これら作用機作を解明する上で重要な鍵となると思われる遺伝子レベルの情報もなかった。
発明の詳細な説明
本発明の課題は、コリネバクテリウム属細菌が有するＬ−グルタミン酸の生成機構、具体的には、コリネバクテリウム属細菌が有するＬ−グルタミン酸の生成機構における界面活性剤添加の作用機作を解明し、得られた知見を基にしてコリネバクテリウム属に属するＬ−グルタミン酸等の生産菌を育種改良することである。
そこで本発明の具体的課題は、コリネバクテリウム属細菌のＬ−グルタミン酸生成機構を遺伝子レベルで解明することにあり、コリネバクテリウム属細菌由来の界面活性剤耐性に関与する遺伝子を単離し、得られた遺伝子をコリネバクテリウム属に属するＬ−グルタミン酸等の生産菌の育種及びＬ−グルタミン酸等の生産に応用することである。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、コリネバクテリウム属細菌のＬ−グルタミン酸生産に関与すると思われる遺伝子の存在を突き止め（以下、この遺伝子をｄｔｓＲ遺伝子、同遺伝子がコードする蛋白質をＤＴＳＲ蛋白と称する。）、さらに本遺伝子の有用な用途を見いだすことより、本発明を完成するに至らしめた。
本発明は以下の通りである。
(1)コリネバクテリウム属細菌に由来し、該細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する蛋白質をコードする遺伝子。
(2)前記蛋白質のアミノ酸配列が、配列表配列番号２で示されるアミノ酸配列のうちアミノ酸番号３７〜５４３からなるアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列においてコリネバクテリウム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性に実質的に影響を与えないアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入を有するアミノ酸配列を含む上記(1)記載の遺伝子。
(3)配列表配列番号１に示される塩基配列の467番目から1987番目に至る配列またはこれと実質的に同一の塩基配列を有する上記(1)記載の遺伝子。
(4)上記(1)、(2)又は(3)記載の遺伝子とコリネバクテリウム属細菌で機能するベクターが連結されて得られる組換えＤＮＡ。
(5)上記(4)記載の組換えＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属細菌。
(6)上記(4)記載の組換えＤＮＡを保有し、かつＬ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属細菌を液体培地に培養し、培養液中にＬ−リジンを生成蓄積させ、これを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造法。
(7)上記(1)、(2)又は(3)記載の遺伝子の塩基配列中に、この塩基配列によってコードされる蛋白質がコリネバクテリウム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性が正常に機能しないような１又は２以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位が生じた遺伝子。
(8)上記(7)記載の遺伝子とコリネバクテリウム属細菌で機能するベクターが連結されて得られる組換えＤＮＡ。
(9)染色体上に存在する上記(1)、(2)又は(3)記載の遺伝子またはそのプロモーターの塩基配列中に１又は２以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位が生じたことにより、コリネバクテリウム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性を有する蛋白質が正常に機能していないコリネバクテリウム属細菌。
(10)染色体上に存在する上記(1)、(2)又は(3)記載の遺伝子またはそのプロモーターの塩基配列中に１又は２以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位が生じたことにより、コリネバクテリウム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性を有する蛋白質が正常に機能しておらず、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネバクテリウム属細菌を液体培地に培養し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、これを採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明にいうコリネバクテリウム属細菌とは、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bargeys Manual of Determinative Bacteriology）第８版５９９頁（１９７４）に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合されたブレビバクテリウム属細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255（1981)）を含み、またコリネバクテリウム属細菌と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。このようなコリネバクテリウム属細菌のうち、以下に述べるようなＬ−グルタミン酸生産性細菌として知られているものが本発明においては、最も好ましいものである。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・インマリオフィルム
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
具体的には、下記の菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ １３８７０
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ １５８０６
コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ １５９９１
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０６０
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ＡＴＣＣ １４０２０
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ＡＴＣＣ １３８６９
コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ １５９９０
コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ １７９６５
ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ＡＴＣＣ １４０６６
ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ＡＴＣＣ １４０６８
ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ １３８２５
ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ １３８２６
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ １９２４０
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受けることができる。すなわち、各微生物ごとに対応する登録番号が付与されており、この登録番号を引用して分譲を受けることができる。各微生物に対応する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
本発明に関する界面活性剤は、ビオチンが十分量存在する条件で、ペニシリンと同様にコリネバクテリウム属細菌にＬ−グルタミン酸の生成を促す作用を持つものであり、各種の非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤が存在する（山田浩一、高橋穣二、中村淳二：発酵工学会誌，20,348-350（1962)、宇田川清、阿部重雄、木下祝郎：発酵工学会誌，40, 614-619（1962)）。また、非イオン性界面活性剤の中でも、Tween60（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート(polyoxyethylene sorbitan monostearate)）及びTween40（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート(polyoxyethylene sorbitan monopalmitate)）にはペニシリン様効果がある（I.Shiio,S.Otsuka,N.Katsuya:J. Biochem., 53, 333-340（1963)）。また、Ｃ3からＣ18の遊離飽和脂肪酸そのものでも同様の効果がある（K.Takinami,H.Okada,T.Tsunoda:Agr. Biol. Chem., 28, 114-118(1964)）。本発明の実施例で使用したものはTween40である。
＜１＞コリネバクテリウム属細菌由来の界面活性剤耐性に関与する遺伝子の単離コリネバクテリウム属細菌由来の界面活性剤耐性に関与する遺伝子を単離するには、例えば下記の操作により行うことができる。
(1)界面活性剤に対する感受性が向上したコリネバクテリウム属に属する界面活性剤感受性変異株を取得し、
(2)野生型コリネバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡの各種断片を、コリネバクテリウム属細菌で機能するベクターと連結して各種組換えＤＮＡを作成し、
(3)各種組換えＤＮＡをコリネバクテリウム属に属する界面活性剤感受性変異株に導入して形質転換を行い、
(4)形質転換株の中から界面活性剤感受性が失われた株を選択し、
(5)界面活性剤感受性が失われた形質転換株より組換えＤＮＡを回収し、
(6)ベクターに連結されている野生型コリネバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡ断片の構造を解析する。
こうして得られる野生型コリネバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡ断片には、コリネバクテリウム属細菌由来の界面活性剤耐性に関与する遺伝子が含まれている。同遺伝子は、少なくとも、界面活性剤を含む培地でコリネバクテリウム属細菌がＬ−グルタミン酸を培地中に蓄積する機構に関与するものである。また、ペニシリン添加やビオチン制限による培地中のＬ−グルタミン酸の蓄積にも共通に関与する。
界面活性剤に対する感受性が向上したコリネバクテリウム属に属する界面活性剤感受性変異株とは、野生型のコリネバクテリウム属細菌の生育に影響を与えない濃度の界面活性剤が存在する培地中で生育が悪くなるコリネバクテリウム属に属する変異株をいう。例えば界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテートの場合、コリネバクテリウム属に属する界面活性剤感受性変異株は０．１〜１mg/dlの濃度の上記界面活性剤が培地中に添加されると生育が野生株と比較して悪くなる。一方、野生型のコリネバクテリウム属細菌は０．１〜１mg/dlの濃度の上記界面活性剤が添加された培地中でも生育に大きな変化はみられない。本変異株を培養し界面活性剤を添加してＬ−グルタミン酸を生産する場合において、必要とされる界面活性剤の濃度は通常の場合より低下している。界面活性剤感受性変異株の細胞の状態は、野生株の細胞が界面活性剤にさらされているときの状態に近いものと思われる。
コリネバクテリウム属に属する界面活性剤感受性変異株を取得するには、特開昭５０−１２６８７７号公報（特公昭５２−２４５９３号公報）に記載される方法を用いることができる。
コリネバクテリウム属に属する界面活性剤感受性変異株としては、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＪ１１０６０が挙げられる。同株は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−３６７８が付与されている。
野生型コリネバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡの各種断片の調製法は以下の通りである。すなわち、野生型コリネバクテリウム属細菌を液体培地に培養し、集めた細胞から斎藤らの方法（H.Saito and K.Miura Biochem. Biophys. Acta 72, 619（1963)）に従い染色体ＤＮＡを回収する。回収した染色体ＤＮＡを制限酵素を用いて切断する。制限酵素として４塩基認識型の酵素を用いてＤＮＡを不完全分解する条件で反応を行うことによって多様なＤＮＡ断片が調製できる。
コリネバクテリウム属細菌で機能するベクターとは、例えばコリネバクテリウム属細菌で自律複製できるプラスミドである。具体的に例示すれば、以下のものが挙げられる。
ｐＡＭ ３３０ 特開昭５８−６７６９９号公報参照
ｐＨＭ １５１９ 特開昭５８−７７８９５号公報参照
ｐＡＪ ６５５ 特開昭５８−１９２９００号公報参照
ｐＡＪ ６１１ 同 上
ｐＡＪ １８４４ 同 上
ｐＣＧ １ 特開昭５７−１３４５００号公報参照
ｐＣＧ ２ 特開昭５８−３５１９７号公報参照
ｐＣＧ ４ 特開昭５７−１８３７９９号公報参照
ｐＣＧ １１ 同 上
コリネバクテリウム属細菌で機能するベクターと、野生型コリネバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡの各種断片とを連結して各種組換えＤＮＡを調製するには、あらかじめ制限酵素を用いてベクターを切断する。染色体ＤＮＡを切断するときに用いる制限酵素と同じものにより切断し、または染色体ＤＮＡの各種切断の切断面に相補する切断面を生じる制限酵素を用いて切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
各種組換えＤＮＡをコリネバクテリウム属に属する界面活性剤感受性変異株に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159（1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and young,F.E., Gene, 1, 153（1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111（1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398（1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929（1978)）も応用できる。
プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチリスにおいて使用されている方法でも充分高い形質転換頻度を得ることができるが、特開昭５７−１８３７９９号公報に開示されるように、コリネバクテリウム属細菌細胞のプロトプラストをポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコールの一方及び二価金属イオンに接触させた状態でＤＮＡをとり込ませる方法も利用できる。ポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコールの代りに、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、フィコール、ブルロニックＦ６８（セルバ社）などの添加によってもＤＮＡのとり込みを促進させることができる。本発明の実施例で用いた形質転換の方法は、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）である。
形質転換株の中から界面活性剤感受性が失われた株を選択する方法を以下に例示する。
コリネバクテリウム属細菌の野生株の染色体ＤＮＡを制限酵素Sau3AＩで部分消化して得られる約４〜６Ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を、エシェリヒア・コリとコリネバクテリウム属細菌の双方で自立複製可能なプラスミドベクターと連結して組換えＤＮＡを製造し、これをエシェリヒア・コリ ＤＨ５のコンピテントセル（宝酒造（株）製）に導入する。形質転換株を培養して、コリネバクテリウム属細菌野生株の遺伝子ライブラリーとする。
当該遺伝子ライブラリーに含まれる組換えＤＮＡを用い、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１１０６０を形質転換し、得られる形質転換体を、一旦、界面活性剤を含まないＭ−ＣＭ２Ｇ寒天プレート（グルコース５ｇ、ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、ＤＬ−メチオニン０．２ｇ、寒天１５ｇ及びクロラムフェニコール４ｍｇを純水１Ｌに含む。ｐＨ７．２）に塗布して数万個のコロニーを形成させる。当該コロニーを３０ｍｇ／Ｌの界面活性剤（Tween40）を含むＭ−ＣＭ２Ｇプレートにレプリカし、界面活性剤含有Ｍ−ＣＭ２Ｇプレート上で良好な生育を示すものを取得することにより、界面活性剤感受性を失った株を取得できる。
界面活性剤感受性が失われた形質転換株より組換えＤＮＡを回収する方法は、野生型コリネバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡの調製方法と同じである。すなわち、形質転換株を液体培地に培養し、集めた細胞から斎藤らの方法（H.Saito and K.Miura Biochem. Biophys. Acta 72, 619（1963)）に従い組換えＤＮＡを回収できる。
ベクターに連結されている野生型コリネバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡ断片の構造解析は以下のようにして行う。塩基配列決定の常法であるダイデオキシ法により染色体ＤＮＡ断片の全塩基配列を決定し、ＤＮＡの構造解析を行い、エンハンサー、プロモーター、オペレーター、ＳＤ配列、リーダーペプチド、アテニュエーター、開始コドン、終始コドン、オープン・リーディング・フレームなどの存在位置を決定する。
コリネバクテリウム属細菌由来の界面活性剤耐性に関与する遺伝子はｄｔｓＲ遺伝子であり、配列表の配列番号１に示される塩基配列の467〜469番目のＡＴＧから1985〜1987番目のＣＴＧにいたる配列を少なくとも有する。この遺伝子によりコードされ得るアミノ酸配列を、配列表の配列番号１及び２に示す。前記467〜469番目のＡＴＧの上流にさらにＡＴＧ（ヌクレオチド番号359〜361）が同一フレームで存在し、このＡＴＧが開始コドンである可能性は否定できないが、この遺伝子の上流領域に存在するコンセンサス配列の解析から前記467〜469番目のＡＴＧが開始コドンであると推定される。すなわち、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうちアミノ酸番号３７〜５４３からなるアミノ酸配列が、ＤＴＳＲ蛋白のアミノ酸配列であると推定される。本願明細書及び請求の範囲においてＤＴＳＲ蛋白のアミノ酸配列及びｄｔｓＲ遺伝子の塩基配列について言及している場合、これらは467〜469番目のＡＴＧを開始コドンとして記載されていることがあるが、359〜361番目のＡＴＧが開始コドンである可能性も考慮されたい。例えば、コリネバクテリウム属細菌にｄｔｓＲ遺伝子を導入してその発現を強化しようとする場合、配列番号１に示す塩基配列のうちヌクレオチド番号467〜1987からなる配列を発現させればよいと考えられるが、ヌクレオチド番号359〜466を含めて配列番号１に示す塩基配列のコード領域及び上流領域をコリネバクテリウム属細菌に導入すれば、いずれのＡＴＧが開始コドンであってもＤＴＳＲ蛋白を正しく発現させることができることは当業者に容易に理解されるであろう。尚、ｄｔｓＲ遺伝子が菌体内で発現する際、開始コドンによってコードされるＮ末端のＭｅｔはアミノペプチダーゼによって切断される場合もある。
データベースの検索により、配列番号１に示される塩基配列を有するｄｔｓＲ遺伝子及びそれにコードされるＤＴＳＲ蛋白は新規であることが確認された。ＤＴＳＲ蛋白と相同性がある蛋白質としては、Proc. Nati. Acad. Sci. USA.,, 83, 8049-8053（1986)、Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 83, 4864-4868（1986)及びGene, 122, 199-202（1992)において、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ(PCC)蛋白質βサブユニットとして記載されている蛋白質がある。しかしながら、これらの文献のいずれにも当該蛋白質がグルタミン酸生産性に関与することを示唆する記載はない。
プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼは、α−ケトグルタル酸を２−ハイドロキシグルタル酸、プロピオニルＣｏＡ、Ｄ−メチルマロニルＣｏＡ、Ｌ−メチルマロニルＣｏＡを経てスクシニルＣｏＡに変換する代謝経路のうちの一反応を触媒する酵素であり、同代謝経路はＴＣＡサイクルにおいてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼに触媒される反応をバイパスする経路のようである。また、特筆すべきはプロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼはビオチンを補酵素とする酵素であり、このことも界面活性剤添加法によるグルタミン酸生成とビオチン制限法におけるグルタミン酸生成とを結び付けるものである。
＜２＞組換えＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属細菌の調製
上記＜１＞で得られるコリネバクテリウム属細菌由来の界面活性剤耐性に関与するｄｔｓＲ遺伝子を含む組換えＤＮＡをインビトロで調製し、これをコリネバクテリウム属細菌に導入することにより、ＤＴＳＲ蛋白の細胞内濃度が上昇しているコリネバクテリウム属細菌を調製することができる。通常行われる手段は、細胞内のｄｔｓＲ遺伝子の発現の強化あるいはｄｔｓＲ遺伝子のコピー数の上昇である。
細胞内のｄｔｓＲ遺伝子の発現を強化するには、強力なプロモーターの下流にｄｔｓＲ遺伝子を連結すればよい。ｄｔｓＲ遺伝子としては、配列番号２に示すアミノ酸配列のうちアミノ酸番号３７〜５４３からなるアミノ酸配列をコードする塩基配列が挙げられる。さらに具体的には、配列番号１に示される塩基配列のうちヌクレオチド番号467〜1987からなる塩基配列及びこれと実質的に同一の塩基配列が挙げられる。ここで実質的に同一な塩基配列とは、コードされるタンパクが、前記ヌクレオチド番号467〜1987からなる塩基配列によってコードされるタンパクと、コリネバクテリウム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性において実質的に同一であることをいう。これらの塩基配列において、コードされるＤＴＳＲ蛋白は、コリネバクテリウム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性に実質的に影響を与えないアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入を有していてもよい。
コリネバクテリウム属細菌の細胞内で機能するプロモーターのうち強力なものとしては、エシェリヒア・コリのｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔｒｐプロモーターが存在する（Y.Morinaga,M.Tsuchiya,K.Miwa and K.Sano,J. Biotech., 5, 305-312(1987)）。また、コリネバクテリウム属細菌のｔｒｐプロモーターも好適なプロモーターである（特開昭６２−１９５２９４号公報）。
ｄｔｓＲ遺伝子を含むＤＮＡとプロモーターを含むＤＮＡをそれぞれ調製し、両者をインビトロで連結する。ＤＮＡの切断及び連結はそれぞれ制限酵素及びリガーゼを用いる。連結して得られる組換えＤＮＡはコリネバクテリウム属細菌の細胞に導入される。導入方法は上記＜１＞に記したものと同様の方法が利用可能である。
コリネバクテリウム属細菌細胞内に、強力なプロモーターとｄｔｓＲ遺伝子からなる組換えＤＮＡを導入するには、コリネバクテリウム属細菌細胞内で機能するベクターを用いる必要がある。ベクターとして＜１＞に記したものを用いると、組換えＤＮＡは染色体外に保持される。組換えＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に保持させる場合には、特開平５−７４９１号公報に開示される温度感受性プラスミドをベクターとして利用し、非許容温度で細胞を培養して相同組換えを起こさせる。
こうして得られた、強力なプロモーターとｄｔｓＲ遺伝子からなる組換えＤＮＡが導入されたコリネバクテリウム属細菌は、ｄｔｓＲ遺伝子の発現が強化され、細胞内のＤＴＳＲ蛋白の濃度が上昇している。
ｄｔｓＲ遺伝子のコピー数を上昇させるには、同遺伝子を含むＤＮＡを多コピーのプラスミドに連結してこれをコリネバクテリウム属細菌細胞に導入する。多コピーのプラスミドの例は＜１＞に記したものである。
あるいは、コリネバクテリウム属細菌染色体ＤＮＡ上に多く存在する配列を標的に利用して相同組換えを生じせしめる方法もある。コリネバクテリウム属細菌染色体ＤＮＡ上に多く存在する配列の例は、コリネバクテリウム属細菌の転移因子の両端に存在するインサーション配列がある。同配列と同配列を利用して相同組換えを行う方法は国際公開パンフレットＷＯ９３／１８１５１号に開示されている。
こうして得られた、ｄｔｓＲ遺伝子のコピー数が上昇したコリネバクテリウム属細菌は、ｄｔｓＲ遺伝子の発現が強化され、細胞内のＤＴＳＲ蛋白の濃度が上昇している。
＜３＞組換えＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属細菌を用いたＬ−リジンの生産
従来より種々の人工変異株がＬ−リジン生産菌として用いられており、これらを宿主として本発明の組換えＤＮＡを保有させることによりそのＬ−リジン生産能を向上させることができる。このような人工変異株としては次のようなものがある。Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン（以下、「ＡＥＣ」と略記する）耐性変異株、その生育にＬ−ホモセリンのようなアミノ酸を必要とする変異株（特公昭４８−２８０７８号、特公昭５６−６４９９号）、ＡＥＣに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第３７０８３９５号及び第３８２５４７２号）、ＤＬ−α−アミノ−εカプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸アナログ、サルファ剤、キノイド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株、オキザロ酢酸脱炭酸酵素または呼吸系酵素阻害剤に耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭５０−５３５８８号、特開昭５０−３１０９３号、特開昭５２−１０２４９８号、特開昭５３−９３９４号、特開昭５３−８６０８９号、特開昭５５−９７８３号、特開昭５５−９７５９号、特開昭５６−３２９９５号、特開昭５６−３９７７８号、特公昭５３−４３５９１号、特公昭５３−１８３３号）、イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジン生産変異株（特開昭５５−９７８４号、特開昭５６−８６９２号）、フルオロピルビン酸または３４℃以上の温度に対して感受性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭５５−９７８３号、特開昭５３−８６０９０号）、エチレングリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウムまたはコリネバクテリウムの変異株（米国特許第４４１１９９７号参照）等。
具体的には、以下のような株を例示することができる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２０３１（ＦＥＲＭ−ＢＰ２７７、特開昭６０−６２９９４号公報）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ３９１３４（特開昭６０−６２９９４号公報）
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＪ３４６３（ＦＥＲＭ−Ｐ１９８７、特公昭５１−３４４７７号公報）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２４３５（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２９４、米国特許第5,304,476号）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２５９２（ＦＥＲＭ ＢＰ−３２３９、米国特許第5,304,476号）
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＪ１２５９６（ＦＥＲＭ ＢＰ−３２４２、米国特許第5,304,476号）
上記＜２＞の方法に従い、これらのＬ−リジン生産菌に本発明の組換えＤＮＡを導入して得られるコリネバクテリウム属細菌は、細胞内のＤＴＳＲ蛋白の濃度が上昇しており、著量のＬ−リジンを生産する能力を有する。
使用するＬ−リジン生産用の培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地である。
粉加水分解物などの糖類、エタノールやイノシトールなどのアルコール類、酢酸、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ1などの要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。
培養は好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜７に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
発酵液からのＬ−リジンの採取は通常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
＜４＞ＤＴＳＲ蛋白が正常に機能しないコリネバクテリウム属細菌の調製
上記＜１＞に示した通り、ｄｔｓＲ遺伝子はコリネバクテリウム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する遺伝子として取得された。従って、過剰量のビオチンの存在下においてＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネバクテリウム属細菌野生株がＬ−グルタミン酸を生成するようになる濃度の界面活性剤を添加してもｄｔｓＲ遺伝子を増幅させた株ではＬ−グルタミン酸を生成しなくなることが予測された。そこで、界面活性剤を添加するＬ−グルタミン酸生産においてｄｔｓＲ遺伝子増幅の効果を後述の実施例に示す方法で調べた結果、予想通りＬ−グルタミン酸生成の著しい抑制が観察された。また、同様にビオチン制限法及び過剰量のビオチン存在下でのペニシリン添加法によるＬ−グルタミン酸生産においても、ｄｔｓＲ遺伝子の増幅は生産の抑制につながることが確認された。これらの結果は、ｄｔｓＲ遺伝子が界面活性剤に対する耐性を付与するだけでなく、Ｌ−グルタミン酸生成に重要な働きを持つ遺伝子であることを示す。
そこで、逆に細胞内のｄｔｓＲ遺伝子に変異を起こし、ＤＴＳＲ蛋白の細胞内濃度または活性を低下させることにより、Ｌ−グルタミン酸の生産能を向上させ、特にビオチンが過剰に存在する条件においても界面活性剤や抗生物質のようなビオチン作用抑制物質の添加なしにＬ−グルタミン酸を生成することができるものと期待された。そこで、野生株のｄｔｓＲ遺伝子が破壊された株を作成し、Ｌ−グルタミン生産能を評価した結果、後述の実施例に示す通り、ｄｔｓＲ遺伝子破壊株は野生株がほとんどＬ−グルタミン酸を生成しない量のビオチンが存在する条件においても著量のＬ−グルタミン酸を生成することが確認された。
ｄｔｓＲ遺伝子に変異が起こった株は、化学薬剤を用いて変異を誘導する方法でも、遺伝子組換えによる育種方法でも取得可能である。しかし、遺伝子の取得がなされている場合は、遺伝子組換え法を用い相同組換え法により当該遺伝子の破壊が容易に実現される。相同組換えによる遺伝子破壊は既に確立しており直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度感受性プラスミドを用いる方法などが利用できる。
具体的には、部位特異的変異法（Kramer, W. and Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154, 350（1987)）や次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等の化学薬剤による処理（Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270(1978)）によって、ｄｔｓＲ遺伝子のコーディング領域またはプロモーター領域の塩基配列の中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせ、このようにして改変または破壊した遺伝子を染色体上の正常な遺伝子と置換することにより遺伝子産物であるＤＴＳＲ蛋白の活性を低下ないし消失させるかｄｔｓＲ遺伝子の転写を低下ないし消失させることができる。
部位特異的変異法は、合成オリゴヌクレオチドを用いる方法であり、任意の限定された塩基対だけに、任意の置換、欠失、挿入、付加または逆位を導入できる手法である。この方法を利用するには、まず、クローン化され、ＤＮＡ塩基配列が決定されている目的遺伝子を持つプラスミドを変性させて一本鎖を調製する。次に、変異を起こさせたい部分に相補的な合成オリゴヌクレオチドを合成するが、この時合成オリゴヌクレオチドを完全に相補的な配列にせず、任意の塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位を持つようにしておく。この後一本鎖ＤＮＡと任意の塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位を持つ合成オリゴヌクレオチドをアニールさせ、さらにＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントとＴ４リガーゼを用いて完全な２本鎖プラスミドを合成し、これをエシェリヒア・コリのコンピテントセルに導入する。このようにして得られた形質転換体の幾つかは、任意の塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位が固定された遺伝子を含むプラスミドを持っている。遺伝子の変異を導入し、改変または破壊することができる同様な手法には、リコンビナントＰＣＲ法（PCR Technology, Stockton press（1989)）がある。
また、化学薬剤処理を用いる方法は、目的の遺伝子を含むＤＮＡ断片を直接次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等で処理することによりＤＮＡ断片中にランダムに塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を持つ変異を導入する方法である。所望の変異が導入されているかどうかは、変異処理したＤＮＡ断片で界面活性剤変異株を形質転換し、得られた形質転換体の界面活性剤に対する耐性の有無を確認すればよい。この際、コリネバクテリウム属細菌が通常生育可能な温度範囲で高温と低温の両方で界面活性剤存在下での生育を調べ、低温では生育可能だが高温では生育が抑制されるような形質転換体を選択することにより、温度感受性となった変異型遺伝子を取得することもできる。
このようにして取得した変異が導入されて改変または破壊された遺伝子をコリネバクテリウム属細菌の染色体上の正常な遺伝子と置換する方法としては、相同性組換えを利用した方法（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press（1972);Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196(1985)）がある。相同性組換えは、染色体上の配列と相同性を有する配列を持つプラスミド等が菌体内に導入されると、ある頻度で相同性を有する配列の箇所で組換えを起こし、導入されたプラスミド全体を染色体上に組み込む。この後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こすと、再びプラスミドが染色体上から抜け落ちるが、この時組換えを起こす位置により変異が導入された遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちることもある。このような菌株を選択することにより、塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を持つ変異が導入されて改変または破壊された遺伝子が染色体上の正常な遺伝子と置換された菌株を取得することができる。
＜５＞ＤＴＳＲ蛋白が正常に機能しないコリネバクテリウム属細菌を用いたＬ−グルタミン酸の生産
上述したように、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネバクテリウム属細菌であって、ＤＴＳＲ蛋白の細胞内濃度または活性が低下した株、すなわちＤＴＳＲ蛋白が正常に機能しない株は、Ｌ−グルタミン酸の生産能が向上し、特にビオチンが過剰に存在する条件においても界面活性剤や抗生物質のようなビオチン作用抑制物質の添加なしにＬ−グルタミン酸を生成することができる。
Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネバクテリウム属細菌を育種してＤＴＳＲ蛋白が正常に機能しない変異株を得る場合、出発材料としてはコリネバクテリウム属のグルタミン酸生産性野性株またはこれから誘導された変異株が挙げられる。このような変異株としては、例えば、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２４７５（ＦＥＲＭ−ＢＰ２９２２、米国特許第5,272,067号公報）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２４７６（ＦＥＲＭ−ＢＰ２９２３、米国特許第5,272,067号公報）
ブレビバクテリウム・フラバム ＡＪ１２４７７（ＦＥＲＭ−ＢＰ２９２４、米国特許第5,272,067号公報）
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＪ１２４７８（ＦＥＲＭ−ＢＰ２９２５、米国特許第5,272,067号公報）
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ２１４９２
等がある。
Ｌ−グルタミン酸の生産に使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地である。
炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースや澱粉加水分解物などの糖類、エタノールやイノシトールなどのアルコール類、酢酸、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ1などの要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。
培養は好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
また、得られたｄｔｓＲ遺伝子破壊株に界面活性剤やペニシリンを添加したり、ビオチンを制限したりすることによりグルタミン酸収率を更に向上させることも出来る場合がある。
発酵液からのＬ−グルタミン酸の採取は通常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、界面活性剤無添加あるいは添加培地における、ＡＪ１１０６０／ｐＤＴＲ６（ｄｔｓＲ遺伝子増幅株）及びＡＪ１１０６０／ｐＳＡＣ４（コントロール）の生育を示したものである。
ｐＤＴＲ６導入株では界面活性剤存在下においても生育可能になっていることが示される。
○：ｐＤＴＲ６導入株、界面活性剤無添加
□：ｐＳＡＣ４導入株、界面活性剤無添加
●：ｐＤＴＲ６導入株、界面活性剤添加
■：ｐＳＡＣ４導入株、界面活性剤添加
図２は、界面活性剤の濃度を変えて添加した培地における、ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＨＳＧＸ−Ｋ△Ｅ（欠失変異型ｄｔｓＲ遺伝子増幅株）、ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＤＴＲ６（ｄｔｓＲ遺伝子増幅株）、及びＡＴＣＣ１３８６９／ｐＳＡＣ４（コントロール）の生育を示したものである。
○：ｐＳＡＣ４導入株
△：ｐＨＳＧＸ−Ｋ△Ｅ導入株
▲：ｐＤＴＲ６導入株
図３は、ビオチンを３００μｇ／Ｌ又は３μｇ／Ｌ含む培地におけるＡＪ１１０６０／ｐＤＴＲ６及びＡＪ１１０６０／ｐＳＡＣ４の生育曲線を示す。ＡＪ１１０６０／ｐＤＴＲ６（ｄｔｓＲ遺伝子増幅株）のビオチン要求量が低下したことを示すものである。
○：ｐＤＴＲ６導入株、ビオチン３００μｇ／ｌ
□：ｐＳＡＣ４導入株、ビオチン３００μｇ／ｌ
●：ｐＤＴＲ６導入株、ビオチン３μｇ／ｌ
■：ｐＳＡＣ４導入株、ビオチン３μｇ／ｌ
好適な実施例の説明
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
実施例１
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９（コリネバクテリウム属細菌の野生株）の染色体ＤＮＡの調製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９をＴ−Ｙ培地（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ（Ｄｉｆｃｏ）１％、Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）０．５％、ＮａＣｌ０．５％（ｐＨ７．２））１００ｍｌに接種し、温度３１．５℃で８時間培養し、培養物を得た。この培養物を3,000r.p.m.で１５分間、遠心分離処理し湿潤菌体０．５ｇを得た後、該菌体から斎藤、三浦の方法（Biochem. Biophys. Acta., 72, 619（1963)）により染色体ＤＮＡを得た。次いで、この染色体ＤＮＡ６０μｇ及び制限酵素Sau3AＩ、３ユニットを１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4及び１ｍＭ ジチオスレイトール含有（ｐＨ ７．４））におのおの混合し、温度３７℃で３０分間反応させた。反応終了液を常法により、フェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理してSau3AＩで消化されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ断片５０μｇを得た。
実施例２ プラスミドベクターＤＮＡを利用したブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９の遺伝子ライブラリーの作製
エシェリヒア・コリとコリネバクテリウム属細菌の双方の菌体内で自律複製可能なプラスミドベクターＤＮＡ（ｐＳＡＣ４）２０μｇ及び制限酵素BamHＩ２００ユニットを５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ硫酸マグネシウム含有（ｐＨ７．４））に混合し、温度３７℃で２時間反応させて消化液を得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理した。この後、プラスミドベクター由来のＤＮＡフラグメントが再結合することを防止するため、Molecular Cloning 2nd editon（J.Sambrook,E.F.Fritsch and T.Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p1.56（1989)）の方法でバクテリアルアルカリホスファターゼ（Bacterial Alkaline Phosphatase）処理により、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常法によりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処理を行った。
このBamHＩで消化されたｐＳＡＣ４を１μｇ、実施例１で得られたSau3AＩで消化されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ断片を１μｇ、及び２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）製）を、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール及び１０ｍＭ ＡＴＰを含有する６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、温度１６℃で１６時間反応し、ＤＮＡを連結させた。次いで該ＤＮＡ混合物で、常法によりエシェリヒア・コリ ＤＨ５を形質転換し、これを１７０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬ寒天培地上にまき、約20,000個のコロニーを得、遺伝子ライブラリーとした。
実施例３ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１１０６０の形質転換
上記で述べた約20,000個のコロニーより、組換えＤＮＡの回収を行なった。回収の方法は上記に示した斎藤、三浦の方法に従った。
５０のバッチに分けた組換えＤＮＡ混合物を電気パルス法を用いた形質転換の常法（特開平２−２０７７９１号公報）に従い、界面活性剤に対する感受性が上昇した変異株ＡＪ１１０６０株に導入した。形質転換体をグルコース添加寒天Ｌ培地上に接種し、３１．５℃で静置培養を行ない、約20,000個の形質転換体を出現させた。次にこれらの形質転換体を界面活性剤３０ｍｇ／ｌを含む同プレートにレプリカし、この中で界面活性剤に対して耐性を示し上記プレート上で生育可能であった株を数株得た。
実施例４ ｄｔｓＲ遺伝子を多コピーで保持する株の界面活性剤に対する耐性化の検定
生育した数株からそれぞれ組換えＤＮＡを抽出し、同ＤＮＡを用いてＡＪ１１０６０株を再形質転換した。ここでも界面活性剤に対して耐性を示した株を得た。この株が保持していた組換えＤＮＡをｐＤＴＲ６と命名し、それらのプラスミドが運ぶ界面活性剤に耐性を与える遺伝子をｄｔｓＲと命名した。このプラスミドを導入したＡＪ１１０６０菌は、３ｇ／Ｌの界面活性剤を添加した液体培地での生育阻害が抑制されている（図１）。
実施例５ ＤＮＡの調製
上記で得られた組換えＤＮＡを含有するＡＪ１１０６０／ｐＤＴＲ６から常法に従いプラスミドを調製し、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９に導入した。得られたエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９／ｐＤＴＲ６をトリプトン１％、酵母エキス０．５％及びＮａＣｌ０．５％からなる培地２０ｍｌに温度３７℃で２４時間前培養し、得られた培養液２０ｍｌを上記と同じ組成の培地１ｌに接種し、温度３７℃で３時間培養したのち、０．２ｇのクロラムフェニコールを添加し、更に同一温度で２０時間培養を行い、培養液を得た。次いで、この培養液を3,000r.p.m.で１０分間遠心処理して湿潤菌体各２ｇを得、これを２０ｍｌの２５％ショ糖を含有する３５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁したのち、更にこれにリゾチーム（シグマ社製）１０ｍｇ、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）８ｍｌ及び２０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液８ｍｌを各々添加し、温度６０℃で３０分間保温処理し、溶菌液を得た。この溶菌液に、５Ｍ ＮａＣｌ溶液１３ｍｌを添加し、温度４℃で１６時間処理した後、15,000r.p.m.で３０分間遠心分離した。得られた上清液を、常法によりフェノール抽出処理及びエタノール沈澱処理を行いＤＮＡを沈澱させた。
この沈澱物を減圧乾燥処理した後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）６ｍｌに溶解し、さらにこれに塩化セシウム６ｇ及びエチジウムブロマイド（１９ｍｇ／ｍｌ）０．２ｍｌを添加し、39,000r.p.m.で４２時間超遠心分離機を用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行い、ＤＮＡを単離した。又更に、ｎ−ブタノールを使用してエチジウムブロマイドを除去した後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析を行い純化された組換えＤＮＡ ｐＤＴＲ６を約５００μｇを得た。なお、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９／ｐＤＴＲ６には、プライベートナンバーＡＪ１２９６７が付与されている。同株は１９９４年２月２２日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４１６８として受託され、１９９５年２月９日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４９９４が付与されている。
実施例６ ｄｔｓＲ遺伝子を含有するＤＮＡの塩基配列の解析
実施例５で得られた組換えＤＮＡを用い塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定は、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオケミカル社製）を用いSangerの方法に従って行った。得られたｄｔｓＲ遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列は配列表の配列番号１に示す通りである。この配列中に存在する最も長いオープン・リーディング・フレームは、配列番号１に示す塩基配列のうち359番目のＡから1987番目のＧまでの塩基配列であったが、この遺伝子の上流領域に存在するコンセンサス配列の解析から467〜469番目のＡＴＧが開始コドンであると推定された。359番目のＡから1987番目のＧまでのオープン・リーディング・フレームによりコードされ得るアミノ酸配列を塩基配列とともに配列表配列番号１に示した。さらに、アミノ酸配列のみを配列表配列番号２に示す。467〜1987番目の塩基配列によりコードされる蛋白質をＤＴＳＲ蛋白とした。
蛋白質のＮ末端にあるメチオニン残基は翻訳後ペプチダーゼの働きにより除去されることがよく知られている。これは、Ｎ末端のメチオニンは翻訳開始コドンであるＡＴＧに由来するため、蛋白質本来の機能とは無関係であることが多いためである。本願発明のＤＴＳＲ蛋白の場合にもメチオニン残基の除去が生じている可能性がある。
塩基配列、アミノ酸配列おのおのについて既知の配列との相同性比較を行った。用いたデータベースはＥＭＢＬ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴである。その結果、配列表配列番号１に示される遺伝子及びそれにコードされる蛋白質は新規であることが確認された。
実施例７ ｄｔｓＲ遺伝子が界面活性剤耐性に関与することの確認
ｄｔｓＲ遺伝子の塩基配列の決定によりオープン・リーディング・フレームが確認されＤＴＳＲ蛋白の存在が示唆されたが、この領域に真に界面活性剤に耐性を与える遺伝子が存在していることを確かめるために、このオープン・リーディング・フレーム内の遺伝子の一部をインフレームで欠失させた配列表配列番号１記載の遺伝子断片がコリネバクテリウム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性を持つかどうかを調べた。
具体的には、ｐＤＴＲ６をXbaＩ及びKpnＩで消化しｄｔｓＲ遺伝子を含む断片を取得し、この遺伝子断片をXbaＩ及びKpnＩで処理したプラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造（株）製）とＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）製）を用いて結合させ、プラスミドｐＨＳＧＸ−Ｋを取得した。ｄｔｓＲ遺伝子内には配列表配列番号１の７６６番目と１３６６番目の２箇所にEco52Ｉで消化される部位が存在する。そこで、ｐＨＳＧＸ−ＫをEco52Ｉで完全消化した後自己結合させ、Eco52Ｉ断片の６００塩基対を欠失したｄｔｓＲ遺伝子を含むプラスミドｐＨＳＧＸ−Ｋ△Ｅを作成した。すなわち、ｐＨＳＧＸ−Ｋ△Ｅ上のｄｔｓＲ遺伝子は中央部分をインフレームで欠失した構造になっている。
次に、ｐＨＳＧＸ−Ｋ△Ｅをコリネバクテリウム属細菌で自律複製可能にするために、既に取得されているコリネバクテリウム属細菌内で自律複製可能なプラスミドｐＨＭ１５１９（K.Miwa et.al., Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）由来の複製開始点（特界平５−００７４９１号公報）をｐＨＳＧＸ−Ｋ△Ｅに上にただ一つ存在するKpnＩ切断部位に導入した。具体的には、ｐＨＭ１５１９を制限酵素BamHＩ及びKpnＩで消化し、複製起点を含む遺伝子断片を取得し、得られた断片を宝酒造（株）製Blunting kitを用い平滑末端化した後、KpnＩリンカー（宝酒造（株）製）を用いてｐＨＳＸ−Ｋ△ＥのKpnＩ部位に挿入し、ｐＫＣＸ−Ｋ△Ｅを取得した。また、対照としてｐＨＳＧ３９９を用い、そのSalＩ部位に同様にSalＩリンカー（宝酒造（株）製）を用いｐＨＭ１５１９の複製起点を挿入したｐＳＡＣ４も作製した。ｐＫＣＸ−Ｘ△ＥとｐＳＡＣ４とを上記の電気パルス法を用いてそれぞれコリネバクテリウム属細菌野生株であるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９に導入し、界面活性剤に対する耐性度をそれぞれ調べた。方法としては、Ｍ−ＣＭ２Ｇ液体培地にポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテートを０〜１０ｍｇ／ｄｌ添加しそれぞれの生育度を調べた。
その結果、この欠失型ｄｔｓＲ遺伝子は界面活性剤に対する耐性を付与する機能を失っていることが示された（図２）。
実施例８ ｄｔｓＲ遺伝子増幅株を用いたビオチン制限法によるＬ−グルタミン酸の生産
ＡＪ１１０６０／ｐＤＴＲ６株を用いてビオチン制限法によるＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下の様に行った。４ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＭ−ＣＭ２Ｇプレート培地にて培養して得たＡＪ１１０６０／ｐＤＴＲ６株の菌体を、グルコース８０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３０ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩２００μｇ、ビオチン６０μｇ、クロラムフェニコール４ｍｇ及びＣａＣＯ3 ５０ｇを純水１Ｌ中に含む培地（ＫＯＨを用いてｐＨ７．０に調整されている）に接種し３１．５℃にて２０時間培養した。得られた培養物を、ビオチンを添加していないこと以外は同じ組成の培地（以下、「ビオチン制限培地」という）に５％量接種し、３１．５℃にて約２０時間培養した。
ＡＪ１１０６０／ｐＤＴＲ６株をビオチン制限培地で培養した際、形成される菌体量当たりのビオチンの要求量を考察した（図３）。コントロールとしてＡＪ１１０６０／ｐＳＡＣ４株を上記と同様にして培養した。
ＡＪ１１０６０／ｐＤＴＲ６株は、形成される菌体量がコントロールに比べて上昇しており、菌体量当たりのビオチンの要求量がＡＪ１１０６０／ｐＳＡＣ４株に比較して低減されていた。
実施例９ ｄｔｓＲ遺伝子増幅株によるＬ−リジン生産
コリネバクテリウム属細菌に属するＬ−リジン生成菌ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２４３５（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２９４）にｐＤＴＲ６を電気パルス法により導入し、以下に示す培地で培養しＬ−リジンを生成させた。
４ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＭ−ＣＭ２Ｇプレート培地にて培養して得た菌体を、グルコース１００ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３０ｇ、ＦｅＳＯ4７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4 ７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩２００μｇ、ビオチン３００μｇ、クロラムフェニコール４ｍｇ及びＣａＣＯ3 ５０ｇを純水１Ｌ中に含む培地（ＫＯＨを用いてｐＨは７．０に調整されている）において３２℃にて４０時間培養した。なお、ｐＤＴＲ６の代わりにｐＳＡＣ４を同様にして導入した株を比較として用いた。その結果を表５に示す。
ｐＤＴＲ６を導入した株ではＬ−リジン生産性が明らかに向上していた。
参考例１ ｄｔｓＲ遺伝子増幅株の界面活性剤添加法によるＬ−グルタミン酸の生産
ＡＪ１１０６０株はビオチン作用抑制物質である界面活性剤を添加することにより、高濃度のビオチン存在下でもＬ−グルタミン酸を著量生成するが、ｄｔｓＲ遺伝子増幅株は界面活性剤に対する耐性度が上昇しているため、界面活性剤を添加してもグルタミン酸の生成が抑制されることが考えられた。そこでＡＪ１１０６０／ｐＳＡＣ４株及びＡＪ１１０６０／ｐＤＴＲ６株を用いて界面活性剤添加法によるＬ−グルタミン酸の生産培養を以下の様に行った。４ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＭ−ＣＭ２Ｇプレート培地にて培養して得た菌体を、グルコース８０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３０ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩２００μｇ、ビオチン３００μｇ、クロラムフェニコール４ｍｇ、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート３．０ｇ及びＣａＣＯ3 ５０ｇを純水１ｌ中に含む培地（ＫＯＨを用いてｐＨは８．０に調整されている）において３１．５℃にて２０時間培養した。
培養終了後、培養液中に生成蓄積したＬ−グルタミン酸の量を測定した。得られた収率を表１に示す。
ｄｔｓＲ遺伝子を増幅することによりＬ−グルタミン酸の収率は大きく低下した。このことは、ＤＴＳＲ蛋白が界面活性剤添加法によるＬ−グルタミン酸の生産に深く関与することを示すものである。
参考例２ ｄｔｓＲ遺伝子増幅株を用いたペニシリン添加法によるＬ−グルタミン酸の生産
参考例１の培地においてポリオキシエチレンソルビタンンモノパルミテートの代わりにペニシリンＧを３０ユニット添加した培地を使用したこと以外は参考例１と同様にして、ＡＪ１１０６０／ｐＳＡＣ４株及びＡＪ１１０６０／ｐＤＴＲ６株を用いてペニシリン添加法によるＬ−グルタミン酸の生産培養を行った。その結果を表２に示す。
ｄｔｓＲ遺伝子を増幅することによりＬ−グルタミン酸の収率は大きく低下した。このことは、ＤＴＳＲ蛋白が、界面活性剤添加法によるＬ−グルタミン酸の生産と同様、ペニシリン添加法によるＬ−グルタミン酸の生産にも関与することを示している。
実施例１０ ｄｔｓＲ遺伝子破壊の作成
ｄｔｓＲ遺伝子の増幅によりＬ−グルタミン酸生成が抑制されたことから、逆にｄｔｓＲ遺伝子を破壊することによりＬ−グルタミン酸収率を向上させることが期待された。遺伝子破壊株は、特開平５−７４９１号に示される温度感受性プラスミドを用いた相同組換え法により取得した。
具体的には、実施例７記載のｐＨＳＧＸ−Ｋ△ＥのKpnＩ認識部位に、コリネバクテリウム型細菌で自己複製可能なプラスミドから取得した自己複製能が温度感受性になった変異型の複製起点を導入し、プラスミドｐＫＴＣＸ−Ｋ△Ｅを作成した。
このｐＫＴＣＸ−Ｋ△Ｅを野生株であるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９に電気パルス法を用いて導入し、特開平５−７４９１号公報記載の方法で染色体上のｄｔｓＲ遺伝子を欠損型に置換した。具体的にはＡＴＣＣ１３８６９／ｐＫＴＣＸ−Ｋ△Ｅを５０μｇ／ｍｌのオレイン酸を含むＭ−ＣＭ２Ｇ液体培地で２５℃にて６時間振とう培養した後、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール及び５０μｇ／ｍｌのオレイン酸を含むＭ−ＣＭ２Ｇ培地上に撒き、３４℃でコロニーを形成した株をプラスミド組み込み株として取得した。次にこの株から３４℃でクロラムフェニコールに対して感受性になった株をレプリカ法により取得した。この感受性株の染色体を常法により取得し、サザンハイブリダイゼーション法により染色体上のｄｔｓＲ遺伝子の構造を調べ、ｄｔｓＲ遺伝子が欠失型に置換されていることを確認し△Ｅ株と命名した。
実施例１１ △Ｅ株のＬ−グルタミン酸生産能の評価
ＡＴＣＣ１３８６９株、ＡＪ１１０６０株及び△Ｅ株のＬ−グルタミン酸の生産培養を以下の様に行った。５０μｇ／ｍｌのオレイン酸を含むＭ−ＣＭ２Ｇプレート培地にて培養してリフレッシュを行い、リフレッシュされた同株を、グルコース８０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３０ｇ、ＦｅＳＯ4７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩２００μｇ、ビオチン３００μｇ、Tween 80（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(polyoxyethylene sorbitan monooleate)）１ｇ及びＣａＣＯ3 ５０ｇを純水１Ｌ中に含む培地（ＫＯＨを用いてｐＨは８．０に調整されている）において３１．５℃にて２０時間培養した。その結果を表３に示す。
野生株及びＡＪ１１０６０株は、培地中に存在する過剰量のビオチンの存在によりＬ−グルタミン酸の蓄積が認められなかったのに対し、△Ｅ株はＬ−グルタミン酸を良好に生成蓄積した。
産業上の利用可能性
本発明のｄｔｓＲ遺伝子は、Ｌ−グルタミン酸の発酵生産に用いられるコリネバクテリウム属細菌において、Ｌ−グルタミン酸の生産に重要な働きを持つ遺伝子であり、Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属細菌において同遺伝子を増幅することによりＬ−リジンの生産能を向上させることができる。また、グルタミン酸生産能を有するコリネバクテリウム属細菌においては、同遺伝子を破壊することによりグルタミン酸生産能が向上させることができる。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：2855
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：GenomicDNA
配列の特徴
特徴を表わす記号：CDS
存在位置：359..1987
配列
配列番号：２
配列の長さ：543
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
本発明は、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−リジンに代表されるＬ−アミノ酸等の物質の発酵生産に用いられるコリネバクテリウム属細菌の育種と利用に関する。
従来の技術
コリネバクテリウム属細菌をビオチン量を制限した培地で培養すると同細菌は著量のＬ−グルタミン酸を生産する。一方、コリネバクテリウム属細菌をビオチンが過剰量存在する培地中で培養すると同細菌はＬ−グルタミン酸を生産しないが、この培養条件でも培地に界面活性剤またはペニシリンを添加すると、同細菌の生育は抑制され、同細菌は著量のＬ−グルタミン酸を生産するようになることが知られている。
すなわち、コリネバクテリウム属細菌を用いてＬ−グルタミン酸を生産するには次のいずれかの手段が有効である。
１．培地中のビオチン濃度を最適以下（suboptimal）にする。
奥村真二、都河竜一郎、角田俊直、北井淳夫：日本農芸化学会誌，36, 197-203（1962)参照。
２．ビオチンが十分量存在する条件で培地に界面活性剤を添加する。
I.Shiio, H.Otsuka, N.Atsuya : J. Biochem., 53, 333-340（1963)及びK.Takinami, H.Okada, T.Tsunoda : Agr. Biol. Chem., 27, 853-863（1963)参照。
３．ビオチンが十分量存在する条件で培地にペニシリンを添加する。
米国特許第3,080,297号、特公昭37-1695号及び渋川満、栗間理夫、岡部節三、大沢岳義：Amino Acid and Nucleic Acid, 17, 61-65（1968)参照。
それらの作用機作については、以下の通り考察されている。
ビオチン制限によるＬ−グルタミン酸生成の場合、ビオチンが脂肪酸合成系のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの補酵素になっていること、及び、オレイン酸を初めとする不飽和脂肪酸及びその誘導体にはビオチン代替作用が認められることなどの事実より、細胞膜の脂肪酸組成に影響を与えることでＬ−グルタミン酸の細胞膜透過性が変化する事が主要因であろうと考えられている(I.Shiio,S.Otsuka,M.Takahashi:J.Biochem.,51,56-62(1962),I.Shiio,K.Narui,N.Yahaba,M.Takahashi:J.Biochem.,51,109-111(1962))。
また、界面活性剤又はペニシリン添加によるＬ−グルタミン酸生成の場合も、細胞表層の構造変化による細胞質膜透過性の変化と結び付けて考えられてきた(I.Shiio,S.Otsuka,N.Katsuya:J.Biochem.,53,333-340(1963))。
上記のようにＬ−グルタミン酸生成は細胞膜透過性と結び付けて議論されてきたが、しかしながらその関連性を直接的に証明する知見は得られていなかった。
すなわち、ビオチンの制限または界面活性剤もしくはペニシリンの添加がどの様な作用機作を通じてコリネバクテリウム属細菌のＬ−グルタミン酸の生産性を改善することにつながるのか不明な点が多かった。
さらに、これら作用機作を解明する上で重要な鍵となると思われる遺伝子レベルの情報もなかった。
発明の詳細な説明
本発明の課題は、コリネバクテリウム属細菌が有するＬ−グルタミン酸の生成機構、具体的には、コリネバクテリウム属細菌が有するＬ−グルタミン酸の生成機構における界面活性剤添加の作用機作を解明し、得られた知見を基にしてコリネバクテリウム属に属するＬ−グルタミン酸等の生産菌を育種改良することである。
そこで本発明の具体的課題は、コリネバクテリウム属細菌のＬ−グルタミン酸生成機構を遺伝子レベルで解明することにあり、コリネバクテリウム属細菌由来の界面活性剤耐性に関与する遺伝子を単離し、得られた遺伝子をコリネバクテリウム属に属するＬ−グルタミン酸等の生産菌の育種及びＬ−グルタミン酸等の生産に応用することである。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、コリネバクテリウム属細菌のＬ−グルタミン酸生産に関与すると思われる遺伝子の存在を突き止め（以下、この遺伝子をｄｔｓＲ遺伝子、同遺伝子がコードする蛋白質をＤＴＳＲ蛋白と称する。）、さらに本遺伝子の有用な用途を見いだすことより、本発明を完成するに至らしめた。
本発明は以下の通りである。
(1)コリネバクテリウム属細菌に由来し、該細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する蛋白質をコードする遺伝子。
(2)前記蛋白質のアミノ酸配列が、配列表配列番号２で示されるアミノ酸配列のうちアミノ酸番号３７〜５４３からなるアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列においてコリネバクテリウム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性に実質的に影響を与えないアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入を有するアミノ酸配列を含む上記(1)記載の遺伝子。
(3)配列表配列番号１に示される塩基配列の467番目から1987番目に至る配列またはこれと実質的に同一の塩基配列を有する上記(1)記載の遺伝子。
(4)上記(1)、(2)又は(3)記載の遺伝子とコリネバクテリウム属細菌で機能するベクターが連結されて得られる組換えＤＮＡ。
(5)上記(4)記載の組換えＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属細菌。
(6)上記(4)記載の組換えＤＮＡを保有し、かつＬ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属細菌を液体培地に培養し、培養液中にＬ−リジンを生成蓄積させ、これを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造法。
(7)上記(1)、(2)又は(3)記載の遺伝子の塩基配列中に、この塩基配列によってコードされる蛋白質がコリネバクテリウム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性が正常に機能しないような１又は２以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位が生じた遺伝子。
(8)上記(7)記載の遺伝子とコリネバクテリウム属細菌で機能するベクターが連結されて得られる組換えＤＮＡ。
(9)染色体上に存在する上記(1)、(2)又は(3)記載の遺伝子またはそのプロモーターの塩基配列中に１又は２以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位が生じたことにより、コリネバクテリウム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性を有する蛋白質が正常に機能していないコリネバクテリウム属細菌。
(10)染色体上に存在する上記(1)、(2)又は(3)記載の遺伝子またはそのプロモーターの塩基配列中に１又は２以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位が生じたことにより、コリネバクテリウム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性を有する蛋白質が正常に機能しておらず、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネバクテリウム属細菌を液体培地に培養し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、これを採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明にいうコリネバクテリウム属細菌とは、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bargeys Manual of Determinative Bacteriology）第８版５９９頁（１９７４）に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合されたブレビバクテリウム属細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255（1981)）を含み、またコリネバクテリウム属細菌と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。このようなコリネバクテリウム属細菌のうち、以下に述べるようなＬ−グルタミン酸生産性細菌として知られているものが本発明においては、最も好ましいものである。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・インマリオフィルム
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
具体的には、下記の菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ １３８７０
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ １５８０６
コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ １５９９１
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０６０
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ＡＴＣＣ １４０２０
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ＡＴＣＣ １３８６９
コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ １５９９０
コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ １７９６５
ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ＡＴＣＣ １４０６６
ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ＡＴＣＣ １４０６８
ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ １３８２５
ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ １３８２６
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ １９２４０
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受けることができる。すなわち、各微生物ごとに対応する登録番号が付与されており、この登録番号を引用して分譲を受けることができる。各微生物に対応する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
本発明に関する界面活性剤は、ビオチンが十分量存在する条件で、ペニシリンと同様にコリネバクテリウム属細菌にＬ−グルタミン酸の生成を促す作用を持つものであり、各種の非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤が存在する（山田浩一、高橋穣二、中村淳二：発酵工学会誌，20,348-350（1962)、宇田川清、阿部重雄、木下祝郎：発酵工学会誌，40, 614-619（1962)）。また、非イオン性界面活性剤の中でも、Tween60（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート(polyoxyethylene sorbitan monostearate)）及びTween40（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート(polyoxyethylene sorbitan monopalmitate)）にはペニシリン様効果がある（I.Shiio,S.Otsuka,N.Katsuya:J. Biochem., 53, 333-340（1963)）。また、Ｃ3からＣ18の遊離飽和脂肪酸そのものでも同様の効果がある（K.Takinami,H.Okada,T.Tsunoda:Agr. Biol. Chem., 28, 114-118(1964)）。本発明の実施例で使用したものはTween40である。
＜１＞コリネバクテリウム属細菌由来の界面活性剤耐性に関与する遺伝子の単離コリネバクテリウム属細菌由来の界面活性剤耐性に関与する遺伝子を単離するには、例えば下記の操作により行うことができる。
(1)界面活性剤に対する感受性が向上したコリネバクテリウム属に属する界面活性剤感受性変異株を取得し、
(2)野生型コリネバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡの各種断片を、コリネバクテリウム属細菌で機能するベクターと連結して各種組換えＤＮＡを作成し、
(3)各種組換えＤＮＡをコリネバクテリウム属に属する界面活性剤感受性変異株に導入して形質転換を行い、
(4)形質転換株の中から界面活性剤感受性が失われた株を選択し、
(5)界面活性剤感受性が失われた形質転換株より組換えＤＮＡを回収し、
(6)ベクターに連結されている野生型コリネバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡ断片の構造を解析する。
こうして得られる野生型コリネバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡ断片には、コリネバクテリウム属細菌由来の界面活性剤耐性に関与する遺伝子が含まれている。同遺伝子は、少なくとも、界面活性剤を含む培地でコリネバクテリウム属細菌がＬ−グルタミン酸を培地中に蓄積する機構に関与するものである。また、ペニシリン添加やビオチン制限による培地中のＬ−グルタミン酸の蓄積にも共通に関与する。
界面活性剤に対する感受性が向上したコリネバクテリウム属に属する界面活性剤感受性変異株とは、野生型のコリネバクテリウム属細菌の生育に影響を与えない濃度の界面活性剤が存在する培地中で生育が悪くなるコリネバクテリウム属に属する変異株をいう。例えば界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテートの場合、コリネバクテリウム属に属する界面活性剤感受性変異株は０．１〜１mg/dlの濃度の上記界面活性剤が培地中に添加されると生育が野生株と比較して悪くなる。一方、野生型のコリネバクテリウム属細菌は０．１〜１mg/dlの濃度の上記界面活性剤が添加された培地中でも生育に大きな変化はみられない。本変異株を培養し界面活性剤を添加してＬ−グルタミン酸を生産する場合において、必要とされる界面活性剤の濃度は通常の場合より低下している。界面活性剤感受性変異株の細胞の状態は、野生株の細胞が界面活性剤にさらされているときの状態に近いものと思われる。
コリネバクテリウム属に属する界面活性剤感受性変異株を取得するには、特開昭５０−１２６８７７号公報（特公昭５２−２４５９３号公報）に記載される方法を用いることができる。
コリネバクテリウム属に属する界面活性剤感受性変異株としては、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＪ１１０６０が挙げられる。同株は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−３６７８が付与されている。
野生型コリネバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡの各種断片の調製法は以下の通りである。すなわち、野生型コリネバクテリウム属細菌を液体培地に培養し、集めた細胞から斎藤らの方法（H.Saito and K.Miura Biochem. Biophys. Acta 72, 619（1963)）に従い染色体ＤＮＡを回収する。回収した染色体ＤＮＡを制限酵素を用いて切断する。制限酵素として４塩基認識型の酵素を用いてＤＮＡを不完全分解する条件で反応を行うことによって多様なＤＮＡ断片が調製できる。
コリネバクテリウム属細菌で機能するベクターとは、例えばコリネバクテリウム属細菌で自律複製できるプラスミドである。具体的に例示すれば、以下のものが挙げられる。
ｐＡＭ ３３０ 特開昭５８−６７６９９号公報参照
ｐＨＭ １５１９ 特開昭５８−７７８９５号公報参照
ｐＡＪ ６５５ 特開昭５８−１９２９００号公報参照
ｐＡＪ ６１１ 同 上
ｐＡＪ １８４４ 同 上
ｐＣＧ １ 特開昭５７−１３４５００号公報参照
ｐＣＧ ２ 特開昭５８−３５１９７号公報参照
ｐＣＧ ４ 特開昭５７−１８３７９９号公報参照
ｐＣＧ １１ 同 上
コリネバクテリウム属細菌で機能するベクターと、野生型コリネバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡの各種断片とを連結して各種組換えＤＮＡを調製するには、あらかじめ制限酵素を用いてベクターを切断する。染色体ＤＮＡを切断するときに用いる制限酵素と同じものにより切断し、または染色体ＤＮＡの各種切断の切断面に相補する切断面を生じる制限酵素を用いて切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
各種組換えＤＮＡをコリネバクテリウム属に属する界面活性剤感受性変異株に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159（1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and young,F.E., Gene, 1, 153（1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111（1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398（1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929（1978)）も応用できる。
プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチリスにおいて使用されている方法でも充分高い形質転換頻度を得ることができるが、特開昭５７−１８３７９９号公報に開示されるように、コリネバクテリウム属細菌細胞のプロトプラストをポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコールの一方及び二価金属イオンに接触させた状態でＤＮＡをとり込ませる方法も利用できる。ポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコールの代りに、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、フィコール、ブルロニックＦ６８（セルバ社）などの添加によってもＤＮＡのとり込みを促進させることができる。本発明の実施例で用いた形質転換の方法は、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）である。
形質転換株の中から界面活性剤感受性が失われた株を選択する方法を以下に例示する。
コリネバクテリウム属細菌の野生株の染色体ＤＮＡを制限酵素Sau3AＩで部分消化して得られる約４〜６Ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を、エシェリヒア・コリとコリネバクテリウム属細菌の双方で自立複製可能なプラスミドベクターと連結して組換えＤＮＡを製造し、これをエシェリヒア・コリ ＤＨ５のコンピテントセル（宝酒造（株）製）に導入する。形質転換株を培養して、コリネバクテリウム属細菌野生株の遺伝子ライブラリーとする。
当該遺伝子ライブラリーに含まれる組換えＤＮＡを用い、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１１０６０を形質転換し、得られる形質転換体を、一旦、界面活性剤を含まないＭ−ＣＭ２Ｇ寒天プレート（グルコース５ｇ、ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、ＤＬ−メチオニン０．２ｇ、寒天１５ｇ及びクロラムフェニコール４ｍｇを純水１Ｌに含む。ｐＨ７．２）に塗布して数万個のコロニーを形成させる。当該コロニーを３０ｍｇ／Ｌの界面活性剤（Tween40）を含むＭ−ＣＭ２Ｇプレートにレプリカし、界面活性剤含有Ｍ−ＣＭ２Ｇプレート上で良好な生育を示すものを取得することにより、界面活性剤感受性を失った株を取得できる。
界面活性剤感受性が失われた形質転換株より組換えＤＮＡを回収する方法は、野生型コリネバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡの調製方法と同じである。すなわち、形質転換株を液体培地に培養し、集めた細胞から斎藤らの方法（H.Saito and K.Miura Biochem. Biophys. Acta 72, 619（1963)）に従い組換えＤＮＡを回収できる。
ベクターに連結されている野生型コリネバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡ断片の構造解析は以下のようにして行う。塩基配列決定の常法であるダイデオキシ法により染色体ＤＮＡ断片の全塩基配列を決定し、ＤＮＡの構造解析を行い、エンハンサー、プロモーター、オペレーター、ＳＤ配列、リーダーペプチド、アテニュエーター、開始コドン、終始コドン、オープン・リーディング・フレームなどの存在位置を決定する。
コリネバクテリウム属細菌由来の界面活性剤耐性に関与する遺伝子はｄｔｓＲ遺伝子であり、配列表の配列番号１に示される塩基配列の467〜469番目のＡＴＧから1985〜1987番目のＣＴＧにいたる配列を少なくとも有する。この遺伝子によりコードされ得るアミノ酸配列を、配列表の配列番号１及び２に示す。前記467〜469番目のＡＴＧの上流にさらにＡＴＧ（ヌクレオチド番号359〜361）が同一フレームで存在し、このＡＴＧが開始コドンである可能性は否定できないが、この遺伝子の上流領域に存在するコンセンサス配列の解析から前記467〜469番目のＡＴＧが開始コドンであると推定される。すなわち、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうちアミノ酸番号３７〜５４３からなるアミノ酸配列が、ＤＴＳＲ蛋白のアミノ酸配列であると推定される。本願明細書及び請求の範囲においてＤＴＳＲ蛋白のアミノ酸配列及びｄｔｓＲ遺伝子の塩基配列について言及している場合、これらは467〜469番目のＡＴＧを開始コドンとして記載されていることがあるが、359〜361番目のＡＴＧが開始コドンである可能性も考慮されたい。例えば、コリネバクテリウム属細菌にｄｔｓＲ遺伝子を導入してその発現を強化しようとする場合、配列番号１に示す塩基配列のうちヌクレオチド番号467〜1987からなる配列を発現させればよいと考えられるが、ヌクレオチド番号359〜466を含めて配列番号１に示す塩基配列のコード領域及び上流領域をコリネバクテリウム属細菌に導入すれば、いずれのＡＴＧが開始コドンであってもＤＴＳＲ蛋白を正しく発現させることができることは当業者に容易に理解されるであろう。尚、ｄｔｓＲ遺伝子が菌体内で発現する際、開始コドンによってコードされるＮ末端のＭｅｔはアミノペプチダーゼによって切断される場合もある。
データベースの検索により、配列番号１に示される塩基配列を有するｄｔｓＲ遺伝子及びそれにコードされるＤＴＳＲ蛋白は新規であることが確認された。ＤＴＳＲ蛋白と相同性がある蛋白質としては、Proc. Nati. Acad. Sci. USA.,, 83, 8049-8053（1986)、Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 83, 4864-4868（1986)及びGene, 122, 199-202（1992)において、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ(PCC)蛋白質βサブユニットとして記載されている蛋白質がある。しかしながら、これらの文献のいずれにも当該蛋白質がグルタミン酸生産性に関与することを示唆する記載はない。
プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼは、α−ケトグルタル酸を２−ハイドロキシグルタル酸、プロピオニルＣｏＡ、Ｄ−メチルマロニルＣｏＡ、Ｌ−メチルマロニルＣｏＡを経てスクシニルＣｏＡに変換する代謝経路のうちの一反応を触媒する酵素であり、同代謝経路はＴＣＡサイクルにおいてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼに触媒される反応をバイパスする経路のようである。また、特筆すべきはプロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼはビオチンを補酵素とする酵素であり、このことも界面活性剤添加法によるグルタミン酸生成とビオチン制限法におけるグルタミン酸生成とを結び付けるものである。
＜２＞組換えＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属細菌の調製
上記＜１＞で得られるコリネバクテリウム属細菌由来の界面活性剤耐性に関与するｄｔｓＲ遺伝子を含む組換えＤＮＡをインビトロで調製し、これをコリネバクテリウム属細菌に導入することにより、ＤＴＳＲ蛋白の細胞内濃度が上昇しているコリネバクテリウム属細菌を調製することができる。通常行われる手段は、細胞内のｄｔｓＲ遺伝子の発現の強化あるいはｄｔｓＲ遺伝子のコピー数の上昇である。
細胞内のｄｔｓＲ遺伝子の発現を強化するには、強力なプロモーターの下流にｄｔｓＲ遺伝子を連結すればよい。ｄｔｓＲ遺伝子としては、配列番号２に示すアミノ酸配列のうちアミノ酸番号３７〜５４３からなるアミノ酸配列をコードする塩基配列が挙げられる。さらに具体的には、配列番号１に示される塩基配列のうちヌクレオチド番号467〜1987からなる塩基配列及びこれと実質的に同一の塩基配列が挙げられる。ここで実質的に同一な塩基配列とは、コードされるタンパクが、前記ヌクレオチド番号467〜1987からなる塩基配列によってコードされるタンパクと、コリネバクテリウム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性において実質的に同一であることをいう。これらの塩基配列において、コードされるＤＴＳＲ蛋白は、コリネバクテリウム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性に実質的に影響を与えないアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入を有していてもよい。
コリネバクテリウム属細菌の細胞内で機能するプロモーターのうち強力なものとしては、エシェリヒア・コリのｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔｒｐプロモーターが存在する（Y.Morinaga,M.Tsuchiya,K.Miwa and K.Sano,J. Biotech., 5, 305-312(1987)）。また、コリネバクテリウム属細菌のｔｒｐプロモーターも好適なプロモーターである（特開昭６２−１９５２９４号公報）。
ｄｔｓＲ遺伝子を含むＤＮＡとプロモーターを含むＤＮＡをそれぞれ調製し、両者をインビトロで連結する。ＤＮＡの切断及び連結はそれぞれ制限酵素及びリガーゼを用いる。連結して得られる組換えＤＮＡはコリネバクテリウム属細菌の細胞に導入される。導入方法は上記＜１＞に記したものと同様の方法が利用可能である。
コリネバクテリウム属細菌細胞内に、強力なプロモーターとｄｔｓＲ遺伝子からなる組換えＤＮＡを導入するには、コリネバクテリウム属細菌細胞内で機能するベクターを用いる必要がある。ベクターとして＜１＞に記したものを用いると、組換えＤＮＡは染色体外に保持される。組換えＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に保持させる場合には、特開平５−７４９１号公報に開示される温度感受性プラスミドをベクターとして利用し、非許容温度で細胞を培養して相同組換えを起こさせる。
こうして得られた、強力なプロモーターとｄｔｓＲ遺伝子からなる組換えＤＮＡが導入されたコリネバクテリウム属細菌は、ｄｔｓＲ遺伝子の発現が強化され、細胞内のＤＴＳＲ蛋白の濃度が上昇している。
ｄｔｓＲ遺伝子のコピー数を上昇させるには、同遺伝子を含むＤＮＡを多コピーのプラスミドに連結してこれをコリネバクテリウム属細菌細胞に導入する。多コピーのプラスミドの例は＜１＞に記したものである。
あるいは、コリネバクテリウム属細菌染色体ＤＮＡ上に多く存在する配列を標的に利用して相同組換えを生じせしめる方法もある。コリネバクテリウム属細菌染色体ＤＮＡ上に多く存在する配列の例は、コリネバクテリウム属細菌の転移因子の両端に存在するインサーション配列がある。同配列と同配列を利用して相同組換えを行う方法は国際公開パンフレットＷＯ９３／１８１５１号に開示されている。
こうして得られた、ｄｔｓＲ遺伝子のコピー数が上昇したコリネバクテリウム属細菌は、ｄｔｓＲ遺伝子の発現が強化され、細胞内のＤＴＳＲ蛋白の濃度が上昇している。
＜３＞組換えＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属細菌を用いたＬ−リジンの生産
従来より種々の人工変異株がＬ−リジン生産菌として用いられており、これらを宿主として本発明の組換えＤＮＡを保有させることによりそのＬ−リジン生産能を向上させることができる。このような人工変異株としては次のようなものがある。Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン（以下、「ＡＥＣ」と略記する）耐性変異株、その生育にＬ−ホモセリンのようなアミノ酸を必要とする変異株（特公昭４８−２８０７８号、特公昭５６−６４９９号）、ＡＥＣに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第３７０８３９５号及び第３８２５４７２号）、ＤＬ−α−アミノ−εカプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸アナログ、サルファ剤、キノイド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株、オキザロ酢酸脱炭酸酵素または呼吸系酵素阻害剤に耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭５０−５３５８８号、特開昭５０−３１０９３号、特開昭５２−１０２４９８号、特開昭５３−９３９４号、特開昭５３−８６０８９号、特開昭５５−９７８３号、特開昭５５−９７５９号、特開昭５６−３２９９５号、特開昭５６−３９７７８号、特公昭５３−４３５９１号、特公昭５３−１８３３号）、イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジン生産変異株（特開昭５５−９７８４号、特開昭５６−８６９２号）、フルオロピルビン酸または３４℃以上の温度に対して感受性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭５５−９７８３号、特開昭５３−８６０９０号）、エチレングリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウムまたはコリネバクテリウムの変異株（米国特許第４４１１９９７号参照）等。
具体的には、以下のような株を例示することができる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２０３１（ＦＥＲＭ−ＢＰ２７７、特開昭６０−６２９９４号公報）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ３９１３４（特開昭６０−６２９９４号公報）
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＪ３４６３（ＦＥＲＭ−Ｐ１９８７、特公昭５１−３４４７７号公報）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２４３５（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２９４、米国特許第5,304,476号）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２５９２（ＦＥＲＭ ＢＰ−３２３９、米国特許第5,304,476号）
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＪ１２５９６（ＦＥＲＭ ＢＰ−３２４２、米国特許第5,304,476号）
上記＜２＞の方法に従い、これらのＬ−リジン生産菌に本発明の組換えＤＮＡを導入して得られるコリネバクテリウム属細菌は、細胞内のＤＴＳＲ蛋白の濃度が上昇しており、著量のＬ−リジンを生産する能力を有する。
使用するＬ−リジン生産用の培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地である。
粉加水分解物などの糖類、エタノールやイノシトールなどのアルコール類、酢酸、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ1などの要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。
培養は好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜７に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
発酵液からのＬ−リジンの採取は通常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
＜４＞ＤＴＳＲ蛋白が正常に機能しないコリネバクテリウム属細菌の調製
上記＜１＞に示した通り、ｄｔｓＲ遺伝子はコリネバクテリウム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する遺伝子として取得された。従って、過剰量のビオチンの存在下においてＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネバクテリウム属細菌野生株がＬ−グルタミン酸を生成するようになる濃度の界面活性剤を添加してもｄｔｓＲ遺伝子を増幅させた株ではＬ−グルタミン酸を生成しなくなることが予測された。そこで、界面活性剤を添加するＬ−グルタミン酸生産においてｄｔｓＲ遺伝子増幅の効果を後述の実施例に示す方法で調べた結果、予想通りＬ−グルタミン酸生成の著しい抑制が観察された。また、同様にビオチン制限法及び過剰量のビオチン存在下でのペニシリン添加法によるＬ−グルタミン酸生産においても、ｄｔｓＲ遺伝子の増幅は生産の抑制につながることが確認された。これらの結果は、ｄｔｓＲ遺伝子が界面活性剤に対する耐性を付与するだけでなく、Ｌ−グルタミン酸生成に重要な働きを持つ遺伝子であることを示す。
そこで、逆に細胞内のｄｔｓＲ遺伝子に変異を起こし、ＤＴＳＲ蛋白の細胞内濃度または活性を低下させることにより、Ｌ−グルタミン酸の生産能を向上させ、特にビオチンが過剰に存在する条件においても界面活性剤や抗生物質のようなビオチン作用抑制物質の添加なしにＬ−グルタミン酸を生成することができるものと期待された。そこで、野生株のｄｔｓＲ遺伝子が破壊された株を作成し、Ｌ−グルタミン生産能を評価した結果、後述の実施例に示す通り、ｄｔｓＲ遺伝子破壊株は野生株がほとんどＬ−グルタミン酸を生成しない量のビオチンが存在する条件においても著量のＬ−グルタミン酸を生成することが確認された。
ｄｔｓＲ遺伝子に変異が起こった株は、化学薬剤を用いて変異を誘導する方法でも、遺伝子組換えによる育種方法でも取得可能である。しかし、遺伝子の取得がなされている場合は、遺伝子組換え法を用い相同組換え法により当該遺伝子の破壊が容易に実現される。相同組換えによる遺伝子破壊は既に確立しており直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度感受性プラスミドを用いる方法などが利用できる。
具体的には、部位特異的変異法（Kramer, W. and Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154, 350（1987)）や次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等の化学薬剤による処理（Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270(1978)）によって、ｄｔｓＲ遺伝子のコーディング領域またはプロモーター領域の塩基配列の中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせ、このようにして改変または破壊した遺伝子を染色体上の正常な遺伝子と置換することにより遺伝子産物であるＤＴＳＲ蛋白の活性を低下ないし消失させるかｄｔｓＲ遺伝子の転写を低下ないし消失させることができる。
部位特異的変異法は、合成オリゴヌクレオチドを用いる方法であり、任意の限定された塩基対だけに、任意の置換、欠失、挿入、付加または逆位を導入できる手法である。この方法を利用するには、まず、クローン化され、ＤＮＡ塩基配列が決定されている目的遺伝子を持つプラスミドを変性させて一本鎖を調製する。次に、変異を起こさせたい部分に相補的な合成オリゴヌクレオチドを合成するが、この時合成オリゴヌクレオチドを完全に相補的な配列にせず、任意の塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位を持つようにしておく。この後一本鎖ＤＮＡと任意の塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位を持つ合成オリゴヌクレオチドをアニールさせ、さらにＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントとＴ４リガーゼを用いて完全な２本鎖プラスミドを合成し、これをエシェリヒア・コリのコンピテントセルに導入する。このようにして得られた形質転換体の幾つかは、任意の塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位が固定された遺伝子を含むプラスミドを持っている。遺伝子の変異を導入し、改変または破壊することができる同様な手法には、リコンビナントＰＣＲ法（PCR Technology, Stockton press（1989)）がある。
また、化学薬剤処理を用いる方法は、目的の遺伝子を含むＤＮＡ断片を直接次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等で処理することによりＤＮＡ断片中にランダムに塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を持つ変異を導入する方法である。所望の変異が導入されているかどうかは、変異処理したＤＮＡ断片で界面活性剤変異株を形質転換し、得られた形質転換体の界面活性剤に対する耐性の有無を確認すればよい。この際、コリネバクテリウム属細菌が通常生育可能な温度範囲で高温と低温の両方で界面活性剤存在下での生育を調べ、低温では生育可能だが高温では生育が抑制されるような形質転換体を選択することにより、温度感受性となった変異型遺伝子を取得することもできる。
このようにして取得した変異が導入されて改変または破壊された遺伝子をコリネバクテリウム属細菌の染色体上の正常な遺伝子と置換する方法としては、相同性組換えを利用した方法（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press（1972);Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196(1985)）がある。相同性組換えは、染色体上の配列と相同性を有する配列を持つプラスミド等が菌体内に導入されると、ある頻度で相同性を有する配列の箇所で組換えを起こし、導入されたプラスミド全体を染色体上に組み込む。この後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こすと、再びプラスミドが染色体上から抜け落ちるが、この時組換えを起こす位置により変異が導入された遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちることもある。このような菌株を選択することにより、塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を持つ変異が導入されて改変または破壊された遺伝子が染色体上の正常な遺伝子と置換された菌株を取得することができる。
＜５＞ＤＴＳＲ蛋白が正常に機能しないコリネバクテリウム属細菌を用いたＬ−グルタミン酸の生産
上述したように、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネバクテリウム属細菌であって、ＤＴＳＲ蛋白の細胞内濃度または活性が低下した株、すなわちＤＴＳＲ蛋白が正常に機能しない株は、Ｌ−グルタミン酸の生産能が向上し、特にビオチンが過剰に存在する条件においても界面活性剤や抗生物質のようなビオチン作用抑制物質の添加なしにＬ−グルタミン酸を生成することができる。
Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネバクテリウム属細菌を育種してＤＴＳＲ蛋白が正常に機能しない変異株を得る場合、出発材料としてはコリネバクテリウム属のグルタミン酸生産性野性株またはこれから誘導された変異株が挙げられる。このような変異株としては、例えば、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２４７５（ＦＥＲＭ−ＢＰ２９２２、米国特許第5,272,067号公報）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２４７６（ＦＥＲＭ−ＢＰ２９２３、米国特許第5,272,067号公報）
ブレビバクテリウム・フラバム ＡＪ１２４７７（ＦＥＲＭ−ＢＰ２９２４、米国特許第5,272,067号公報）
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＪ１２４７８（ＦＥＲＭ−ＢＰ２９２５、米国特許第5,272,067号公報）
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ２１４９２
等がある。
Ｌ−グルタミン酸の生産に使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地である。
炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースや澱粉加水分解物などの糖類、エタノールやイノシトールなどのアルコール類、酢酸、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ1などの要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。
培養は好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
また、得られたｄｔｓＲ遺伝子破壊株に界面活性剤やペニシリンを添加したり、ビオチンを制限したりすることによりグルタミン酸収率を更に向上させることも出来る場合がある。
発酵液からのＬ−グルタミン酸の採取は通常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、界面活性剤無添加あるいは添加培地における、ＡＪ１１０６０／ｐＤＴＲ６（ｄｔｓＲ遺伝子増幅株）及びＡＪ１１０６０／ｐＳＡＣ４（コントロール）の生育を示したものである。
ｐＤＴＲ６導入株では界面活性剤存在下においても生育可能になっていることが示される。
○：ｐＤＴＲ６導入株、界面活性剤無添加
□：ｐＳＡＣ４導入株、界面活性剤無添加
●：ｐＤＴＲ６導入株、界面活性剤添加
■：ｐＳＡＣ４導入株、界面活性剤添加
図２は、界面活性剤の濃度を変えて添加した培地における、ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＨＳＧＸ−Ｋ△Ｅ（欠失変異型ｄｔｓＲ遺伝子増幅株）、ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＤＴＲ６（ｄｔｓＲ遺伝子増幅株）、及びＡＴＣＣ１３８６９／ｐＳＡＣ４（コントロール）の生育を示したものである。
○：ｐＳＡＣ４導入株
△：ｐＨＳＧＸ−Ｋ△Ｅ導入株
▲：ｐＤＴＲ６導入株
図３は、ビオチンを３００μｇ／Ｌ又は３μｇ／Ｌ含む培地におけるＡＪ１１０６０／ｐＤＴＲ６及びＡＪ１１０６０／ｐＳＡＣ４の生育曲線を示す。ＡＪ１１０６０／ｐＤＴＲ６（ｄｔｓＲ遺伝子増幅株）のビオチン要求量が低下したことを示すものである。
○：ｐＤＴＲ６導入株、ビオチン３００μｇ／ｌ
□：ｐＳＡＣ４導入株、ビオチン３００μｇ／ｌ
●：ｐＤＴＲ６導入株、ビオチン３μｇ／ｌ
■：ｐＳＡＣ４導入株、ビオチン３μｇ／ｌ
好適な実施例の説明
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
実施例１
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９（コリネバクテリウム属細菌の野生株）の染色体ＤＮＡの調製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９をＴ−Ｙ培地（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ（Ｄｉｆｃｏ）１％、Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）０．５％、ＮａＣｌ０．５％（ｐＨ７．２））１００ｍｌに接種し、温度３１．５℃で８時間培養し、培養物を得た。この培養物を3,000r.p.m.で１５分間、遠心分離処理し湿潤菌体０．５ｇを得た後、該菌体から斎藤、三浦の方法（Biochem. Biophys. Acta., 72, 619（1963)）により染色体ＤＮＡを得た。次いで、この染色体ＤＮＡ６０μｇ及び制限酵素Sau3AＩ、３ユニットを１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4及び１ｍＭ ジチオスレイトール含有（ｐＨ ７．４））におのおの混合し、温度３７℃で３０分間反応させた。反応終了液を常法により、フェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理してSau3AＩで消化されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ断片５０μｇを得た。
実施例２ プラスミドベクターＤＮＡを利用したブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９の遺伝子ライブラリーの作製
エシェリヒア・コリとコリネバクテリウム属細菌の双方の菌体内で自律複製可能なプラスミドベクターＤＮＡ（ｐＳＡＣ４）２０μｇ及び制限酵素BamHＩ２００ユニットを５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ硫酸マグネシウム含有（ｐＨ７．４））に混合し、温度３７℃で２時間反応させて消化液を得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理した。この後、プラスミドベクター由来のＤＮＡフラグメントが再結合することを防止するため、Molecular Cloning 2nd editon（J.Sambrook,E.F.Fritsch and T.Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p1.56（1989)）の方法でバクテリアルアルカリホスファターゼ（Bacterial Alkaline Phosphatase）処理により、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常法によりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処理を行った。
このBamHＩで消化されたｐＳＡＣ４を１μｇ、実施例１で得られたSau3AＩで消化されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ断片を１μｇ、及び２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）製）を、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール及び１０ｍＭ ＡＴＰを含有する６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、温度１６℃で１６時間反応し、ＤＮＡを連結させた。次いで該ＤＮＡ混合物で、常法によりエシェリヒア・コリ ＤＨ５を形質転換し、これを１７０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬ寒天培地上にまき、約20,000個のコロニーを得、遺伝子ライブラリーとした。
実施例３ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１１０６０の形質転換
上記で述べた約20,000個のコロニーより、組換えＤＮＡの回収を行なった。回収の方法は上記に示した斎藤、三浦の方法に従った。
５０のバッチに分けた組換えＤＮＡ混合物を電気パルス法を用いた形質転換の常法（特開平２−２０７７９１号公報）に従い、界面活性剤に対する感受性が上昇した変異株ＡＪ１１０６０株に導入した。形質転換体をグルコース添加寒天Ｌ培地上に接種し、３１．５℃で静置培養を行ない、約20,000個の形質転換体を出現させた。次にこれらの形質転換体を界面活性剤３０ｍｇ／ｌを含む同プレートにレプリカし、この中で界面活性剤に対して耐性を示し上記プレート上で生育可能であった株を数株得た。
実施例４ ｄｔｓＲ遺伝子を多コピーで保持する株の界面活性剤に対する耐性化の検定
生育した数株からそれぞれ組換えＤＮＡを抽出し、同ＤＮＡを用いてＡＪ１１０６０株を再形質転換した。ここでも界面活性剤に対して耐性を示した株を得た。この株が保持していた組換えＤＮＡをｐＤＴＲ６と命名し、それらのプラスミドが運ぶ界面活性剤に耐性を与える遺伝子をｄｔｓＲと命名した。このプラスミドを導入したＡＪ１１０６０菌は、３ｇ／Ｌの界面活性剤を添加した液体培地での生育阻害が抑制されている（図１）。
実施例５ ＤＮＡの調製
上記で得られた組換えＤＮＡを含有するＡＪ１１０６０／ｐＤＴＲ６から常法に従いプラスミドを調製し、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９に導入した。得られたエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９／ｐＤＴＲ６をトリプトン１％、酵母エキス０．５％及びＮａＣｌ０．５％からなる培地２０ｍｌに温度３７℃で２４時間前培養し、得られた培養液２０ｍｌを上記と同じ組成の培地１ｌに接種し、温度３７℃で３時間培養したのち、０．２ｇのクロラムフェニコールを添加し、更に同一温度で２０時間培養を行い、培養液を得た。次いで、この培養液を3,000r.p.m.で１０分間遠心処理して湿潤菌体各２ｇを得、これを２０ｍｌの２５％ショ糖を含有する３５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁したのち、更にこれにリゾチーム（シグマ社製）１０ｍｇ、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）８ｍｌ及び２０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液８ｍｌを各々添加し、温度６０℃で３０分間保温処理し、溶菌液を得た。この溶菌液に、５Ｍ ＮａＣｌ溶液１３ｍｌを添加し、温度４℃で１６時間処理した後、15,000r.p.m.で３０分間遠心分離した。得られた上清液を、常法によりフェノール抽出処理及びエタノール沈澱処理を行いＤＮＡを沈澱させた。
この沈澱物を減圧乾燥処理した後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）６ｍｌに溶解し、さらにこれに塩化セシウム６ｇ及びエチジウムブロマイド（１９ｍｇ／ｍｌ）０．２ｍｌを添加し、39,000r.p.m.で４２時間超遠心分離機を用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行い、ＤＮＡを単離した。又更に、ｎ−ブタノールを使用してエチジウムブロマイドを除去した後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析を行い純化された組換えＤＮＡ ｐＤＴＲ６を約５００μｇを得た。なお、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９／ｐＤＴＲ６には、プライベートナンバーＡＪ１２９６７が付与されている。同株は１９９４年２月２２日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４１６８として受託され、１９９５年２月９日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４９９４が付与されている。
実施例６ ｄｔｓＲ遺伝子を含有するＤＮＡの塩基配列の解析
実施例５で得られた組換えＤＮＡを用い塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定は、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオケミカル社製）を用いSangerの方法に従って行った。得られたｄｔｓＲ遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列は配列表の配列番号１に示す通りである。この配列中に存在する最も長いオープン・リーディング・フレームは、配列番号１に示す塩基配列のうち359番目のＡから1987番目のＧまでの塩基配列であったが、この遺伝子の上流領域に存在するコンセンサス配列の解析から467〜469番目のＡＴＧが開始コドンであると推定された。359番目のＡから1987番目のＧまでのオープン・リーディング・フレームによりコードされ得るアミノ酸配列を塩基配列とともに配列表配列番号１に示した。さらに、アミノ酸配列のみを配列表配列番号２に示す。467〜1987番目の塩基配列によりコードされる蛋白質をＤＴＳＲ蛋白とした。
蛋白質のＮ末端にあるメチオニン残基は翻訳後ペプチダーゼの働きにより除去されることがよく知られている。これは、Ｎ末端のメチオニンは翻訳開始コドンであるＡＴＧに由来するため、蛋白質本来の機能とは無関係であることが多いためである。本願発明のＤＴＳＲ蛋白の場合にもメチオニン残基の除去が生じている可能性がある。
塩基配列、アミノ酸配列おのおのについて既知の配列との相同性比較を行った。用いたデータベースはＥＭＢＬ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴである。その結果、配列表配列番号１に示される遺伝子及びそれにコードされる蛋白質は新規であることが確認された。
実施例７ ｄｔｓＲ遺伝子が界面活性剤耐性に関与することの確認
ｄｔｓＲ遺伝子の塩基配列の決定によりオープン・リーディング・フレームが確認されＤＴＳＲ蛋白の存在が示唆されたが、この領域に真に界面活性剤に耐性を与える遺伝子が存在していることを確かめるために、このオープン・リーディング・フレーム内の遺伝子の一部をインフレームで欠失させた配列表配列番号１記載の遺伝子断片がコリネバクテリウム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性を持つかどうかを調べた。
具体的には、ｐＤＴＲ６をXbaＩ及びKpnＩで消化しｄｔｓＲ遺伝子を含む断片を取得し、この遺伝子断片をXbaＩ及びKpnＩで処理したプラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造（株）製）とＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）製）を用いて結合させ、プラスミドｐＨＳＧＸ−Ｋを取得した。ｄｔｓＲ遺伝子内には配列表配列番号１の７６６番目と１３６６番目の２箇所にEco52Ｉで消化される部位が存在する。そこで、ｐＨＳＧＸ−ＫをEco52Ｉで完全消化した後自己結合させ、Eco52Ｉ断片の６００塩基対を欠失したｄｔｓＲ遺伝子を含むプラスミドｐＨＳＧＸ−Ｋ△Ｅを作成した。すなわち、ｐＨＳＧＸ−Ｋ△Ｅ上のｄｔｓＲ遺伝子は中央部分をインフレームで欠失した構造になっている。
次に、ｐＨＳＧＸ−Ｋ△Ｅをコリネバクテリウム属細菌で自律複製可能にするために、既に取得されているコリネバクテリウム属細菌内で自律複製可能なプラスミドｐＨＭ１５１９（K.Miwa et.al., Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）由来の複製開始点（特界平５−００７４９１号公報）をｐＨＳＧＸ−Ｋ△Ｅに上にただ一つ存在するKpnＩ切断部位に導入した。具体的には、ｐＨＭ１５１９を制限酵素BamHＩ及びKpnＩで消化し、複製起点を含む遺伝子断片を取得し、得られた断片を宝酒造（株）製Blunting kitを用い平滑末端化した後、KpnＩリンカー（宝酒造（株）製）を用いてｐＨＳＸ−Ｋ△ＥのKpnＩ部位に挿入し、ｐＫＣＸ−Ｋ△Ｅを取得した。また、対照としてｐＨＳＧ３９９を用い、そのSalＩ部位に同様にSalＩリンカー（宝酒造（株）製）を用いｐＨＭ１５１９の複製起点を挿入したｐＳＡＣ４も作製した。ｐＫＣＸ−Ｘ△ＥとｐＳＡＣ４とを上記の電気パルス法を用いてそれぞれコリネバクテリウム属細菌野生株であるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９に導入し、界面活性剤に対する耐性度をそれぞれ調べた。方法としては、Ｍ−ＣＭ２Ｇ液体培地にポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテートを０〜１０ｍｇ／ｄｌ添加しそれぞれの生育度を調べた。
その結果、この欠失型ｄｔｓＲ遺伝子は界面活性剤に対する耐性を付与する機能を失っていることが示された（図２）。
実施例８ ｄｔｓＲ遺伝子増幅株を用いたビオチン制限法によるＬ−グルタミン酸の生産
ＡＪ１１０６０／ｐＤＴＲ６株を用いてビオチン制限法によるＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下の様に行った。４ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＭ−ＣＭ２Ｇプレート培地にて培養して得たＡＪ１１０６０／ｐＤＴＲ６株の菌体を、グルコース８０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３０ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩２００μｇ、ビオチン６０μｇ、クロラムフェニコール４ｍｇ及びＣａＣＯ3 ５０ｇを純水１Ｌ中に含む培地（ＫＯＨを用いてｐＨ７．０に調整されている）に接種し３１．５℃にて２０時間培養した。得られた培養物を、ビオチンを添加していないこと以外は同じ組成の培地（以下、「ビオチン制限培地」という）に５％量接種し、３１．５℃にて約２０時間培養した。
ＡＪ１１０６０／ｐＤＴＲ６株をビオチン制限培地で培養した際、形成される菌体量当たりのビオチンの要求量を考察した（図３）。コントロールとしてＡＪ１１０６０／ｐＳＡＣ４株を上記と同様にして培養した。
ＡＪ１１０６０／ｐＤＴＲ６株は、形成される菌体量がコントロールに比べて上昇しており、菌体量当たりのビオチンの要求量がＡＪ１１０６０／ｐＳＡＣ４株に比較して低減されていた。
実施例９ ｄｔｓＲ遺伝子増幅株によるＬ−リジン生産
コリネバクテリウム属細菌に属するＬ−リジン生成菌ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ１２４３５（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２９４）にｐＤＴＲ６を電気パルス法により導入し、以下に示す培地で培養しＬ−リジンを生成させた。
４ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＭ−ＣＭ２Ｇプレート培地にて培養して得た菌体を、グルコース１００ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３０ｇ、ＦｅＳＯ4７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4 ７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩２００μｇ、ビオチン３００μｇ、クロラムフェニコール４ｍｇ及びＣａＣＯ3 ５０ｇを純水１Ｌ中に含む培地（ＫＯＨを用いてｐＨは７．０に調整されている）において３２℃にて４０時間培養した。なお、ｐＤＴＲ６の代わりにｐＳＡＣ４を同様にして導入した株を比較として用いた。その結果を表５に示す。
参考例１ ｄｔｓＲ遺伝子増幅株の界面活性剤添加法によるＬ−グルタミン酸の生産
ＡＪ１１０６０株はビオチン作用抑制物質である界面活性剤を添加することにより、高濃度のビオチン存在下でもＬ−グルタミン酸を著量生成するが、ｄｔｓＲ遺伝子増幅株は界面活性剤に対する耐性度が上昇しているため、界面活性剤を添加してもグルタミン酸の生成が抑制されることが考えられた。そこでＡＪ１１０６０／ｐＳＡＣ４株及びＡＪ１１０６０／ｐＤＴＲ６株を用いて界面活性剤添加法によるＬ−グルタミン酸の生産培養を以下の様に行った。４ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＭ−ＣＭ２Ｇプレート培地にて培養して得た菌体を、グルコース８０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３０ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩２００μｇ、ビオチン３００μｇ、クロラムフェニコール４ｍｇ、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート３．０ｇ及びＣａＣＯ3 ５０ｇを純水１ｌ中に含む培地（ＫＯＨを用いてｐＨは８．０に調整されている）において３１．５℃にて２０時間培養した。
培養終了後、培養液中に生成蓄積したＬ−グルタミン酸の量を測定した。得られた収率を表１に示す。
参考例２ ｄｔｓＲ遺伝子増幅株を用いたペニシリン添加法によるＬ−グルタミン酸の生産
参考例１の培地においてポリオキシエチレンソルビタンンモノパルミテートの代わりにペニシリンＧを３０ユニット添加した培地を使用したこと以外は参考例１と同様にして、ＡＪ１１０６０／ｐＳＡＣ４株及びＡＪ１１０６０／ｐＤＴＲ６株を用いてペニシリン添加法によるＬ−グルタミン酸の生産培養を行った。その結果を表２に示す。
実施例１０ ｄｔｓＲ遺伝子破壊の作成
ｄｔｓＲ遺伝子の増幅によりＬ−グルタミン酸生成が抑制されたことから、逆にｄｔｓＲ遺伝子を破壊することによりＬ−グルタミン酸収率を向上させることが期待された。遺伝子破壊株は、特開平５−７４９１号に示される温度感受性プラスミドを用いた相同組換え法により取得した。
具体的には、実施例７記載のｐＨＳＧＸ−Ｋ△ＥのKpnＩ認識部位に、コリネバクテリウム型細菌で自己複製可能なプラスミドから取得した自己複製能が温度感受性になった変異型の複製起点を導入し、プラスミドｐＫＴＣＸ−Ｋ△Ｅを作成した。
このｐＫＴＣＸ−Ｋ△Ｅを野生株であるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９に電気パルス法を用いて導入し、特開平５−７４９１号公報記載の方法で染色体上のｄｔｓＲ遺伝子を欠損型に置換した。具体的にはＡＴＣＣ１３８６９／ｐＫＴＣＸ−Ｋ△Ｅを５０μｇ／ｍｌのオレイン酸を含むＭ−ＣＭ２Ｇ液体培地で２５℃にて６時間振とう培養した後、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール及び５０μｇ／ｍｌのオレイン酸を含むＭ−ＣＭ２Ｇ培地上に撒き、３４℃でコロニーを形成した株をプラスミド組み込み株として取得した。次にこの株から３４℃でクロラムフェニコールに対して感受性になった株をレプリカ法により取得した。この感受性株の染色体を常法により取得し、サザンハイブリダイゼーション法により染色体上のｄｔｓＲ遺伝子の構造を調べ、ｄｔｓＲ遺伝子が欠失型に置換されていることを確認し△Ｅ株と命名した。
実施例１１ △Ｅ株のＬ−グルタミン酸生産能の評価
ＡＴＣＣ１３８６９株、ＡＪ１１０６０株及び△Ｅ株のＬ−グルタミン酸の生産培養を以下の様に行った。５０μｇ／ｍｌのオレイン酸を含むＭ−ＣＭ２Ｇプレート培地にて培養してリフレッシュを行い、リフレッシュされた同株を、グルコース８０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３０ｇ、ＦｅＳＯ4７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ4７Ｈ2Ｏ ０．０１ｇ、大豆加水分解液１５ｍｌ、サイアミン塩酸塩２００μｇ、ビオチン３００μｇ、Tween 80（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(polyoxyethylene sorbitan monooleate)）１ｇ及びＣａＣＯ3 ５０ｇを純水１Ｌ中に含む培地（ＫＯＨを用いてｐＨは８．０に調整されている）において３１．５℃にて２０時間培養した。その結果を表３に示す。
産業上の利用可能性
本発明のｄｔｓＲ遺伝子は、Ｌ−グルタミン酸の発酵生産に用いられるコリネバクテリウム属細菌において、Ｌ−グルタミン酸の生産に重要な働きを持つ遺伝子であり、Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属細菌において同遺伝子を増幅することによりＬ−リジンの生産能を向上させることができる。また、グルタミン酸生産能を有するコリネバクテリウム属細菌においては、同遺伝子を破壊することによりグルタミン酸生産能が向上させることができる。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：2855
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：GenomicDNA
配列の特徴
特徴を表わす記号：CDS
存在位置：359..1987
配列
配列の長さ：543
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
Claims (6)
- 染色体上に存在する下記（ａ）の遺伝子またはそのプロモーターの塩基配列中に１又は２以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位が生じたことにより、コリネバクテリウム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性を有する蛋白質が正常に機能しておらず、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネバクテリウム属細菌を液体培地に培養し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、これを採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
（ａ）コリネバクテリウム属細菌に由来し、該細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する蛋白質をコードする遺伝子。 - 前記蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列のうちアミノ酸番号３７〜５４３からなるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の製造法。
- 前記遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列の467番目から1987番目に至る配列を含む、請求項１記載の製造法。
- 染色体上に存在する下記（ａ）の遺伝子またはそのプロモーターの塩基配列中に１又は２以上の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位が生じたことにより、コリネバクテリウム属細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する活性を有する蛋白質が正常に機能しておらず、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネバクテリウム属細菌。
（ａ）コリネバクテリウム属細菌に由来し、該細菌に界面活性剤に対する耐性を付与する蛋白質をコードする遺伝子。 - 前記蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列のうちアミノ酸番号３７〜５４３からなるアミノ酸配列を含む、請求項４記載の細菌。
- 前記遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列の467番目から1987番目に至る配列を含む、請求項４記載の細菌。
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