KR101612101B1 - 계면활성제 내성을 부여하는 조성물 및 그 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 계면 활성제 내성을 부여하는 조성물 및 그 방법에 관한 것이다.

Description

계면활성제 내성을 부여하는 조성물 및 그 방법{A composition which confer tolerance to surfactant and a method thereof}
본 발명은 계면 활성제 내성을 부여하는 조성물 및 그 방법에 관한 것이다.
농업 및 관련 분야에 있어서 여러 가지 목적을 위하여, 다양한 종류의 외래 화학물질로 식물을 처리하는 것이 바람직하다. 많은 외래 화학물질이 식물의 잎(foliage)(예를 들면, 잎(leaf) 및 다른 비목질 지상부)에 적용되고 있고, 적용 지점으로부터 가깝거나 먼 식물 중의 작용부위를 가지고 있다.
잎에 적용되는 외래 화학물질은 자주 양쪽성 물질, 특히 계면활성제(surfactants)로도 알려진 양쪽성 계면활성제(surface-active agents)와 함께 적용되었다. 계면활성제는 많은 방식으로 잎에 적용되는 외래 화학물질의 생물학적 효능에 영향을 미칠 수 있다.
열충격 단백질(이하, 'HSPs'라 함)은 열과 다른 무생물적 스트레스 하에서 축적되는 단백질의 군이다 (Parsell D, Lindquist S. Annu. Rev. Genet. 1993;27:437-96). 식물에는 30 sHSPs 이상이 존재하고(Waters ER, Aevermann BD, Sanders-Reed Z.Cell Stress Chaperones 2008;13:127-42), 그것은 고착성 식물(sessile plant)들에서 중요한 역할을 하는 것 같다. DcHsp17.7는 열 (Malik MK, Slovin JP, Hwang CH, Zimmerman JL. Plant J. 1999;20:89-99), 냉해(Song N, Ahn Y. HortScience 2010;45:469-74), 염분(Song N, Ahn Y. New biotechnol. 2011;28:698-704), 산화, 수분 부족과 같은 여러 스트레스 조건 하에서 축적되었다.
관련 선행특허로 대한민국 공개특허 10-2009-0078825호 등과 같이 열충격 단백질을 억제하거나 조절하는 물질 등과 관련된 특허 등은 존재하나 본 발명에서와 같이 계면활성제에 대한 내성을 부여하는 단백질과 같은 선행특허는 존재하지 않았다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 계면활성제에 대한 내성을 부여하는 물질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 계면활성제에 대한 내성을 부여하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 유효성분으로 포함하는 계면활성제에 대한 내성을 부여하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 나노 물질은 트윈 20 또는 소디움도데실설페이트인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 유전자를 생물체에 형질전환하여 해당 생물체에 계면활성제에 대한 내성을 부여하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것이 바람직하나 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 또는 전좌돌연변이를 유도하여 본 발명에서 목적하고자 하는 효과를 달성한 모든 돌연변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
나노물질들의 분산
본 발명에서는 Tween 20 (El-Temsah YS, Joner EJ. Environ. Toxicol. 2010;27:42-9)을 다중 벽 탄소나노튜브 (이하, 'MWCNTs'라고 함) 및 은 나노입자(이하, 'AgNPs'라고 함)를 함유한 테스트 용액에 첨가하고 초음파를 수행하였다. 본 결과는 Tween 20이 효과적으로 두 나노물질의 응집을 저해한다는 것을 나타내었다(도 1).
당근 잎 조직에 대한 나노물질들의 독성
DcHsp17.7의 발현이 나노물질에 의하여 유도되는지를 조사하기 위하여 당근 잎 조직들을 MWCNT 및 AgNP 용액에 넣었다(200 ㎍/mL 까지). 5 시간 후, 모든 실험된 잎들은 시들었고 MWCNTs의 존재 하에서가 AgNPs의 존재에 비하여 더 심하게 시들었고(도 2), 이것은 나노입자들이 식품에 독성을 가질 수 있다는 것을 시사한다.
MWCNTs 및 AgNPs 에 의한 DcHsp17 . 7 의 발현
본 발명자들은 MWCNTs 및 AgNPs으로 처리한 후 당근에서 DcHsp17.7의 발현을 조사하였다. 스트레스의 부존재에서 잎 조직에서 그 단백질은 발현되지 않았다(도 3). 그러나 나노입자들은 DcHsp17.7의 발현을 촉발하였다. MWCNTs의 존재에세, DcHsp17.7의 레벨은 증가하였고 그 다음 MWCNTs의 농도가 증가함에 따라 감소하였다(도 3A). AgNPs의 존재에서 그 단백질의 레벨은 계속적으로 증가하였다(도 3B). 또한 constitutive하게 발현되는 HSP70 계열의 하나인 Hsc70 레벨은 MWCNT의 농도가 증가함에 따라 점차적으로 감소하였다. AgNPs의 존재하에서, Hsc70의 발현은 100 ㎍/mL 및 그 이상에서는 신속하게 감소하였다. Coomassie 염색은 MWCNTs 및 AgNPs이 당근 잎 조직에서 전체 단백질 프로파일에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 나타내었다.
DcHsp17 .7의 이종적 발현
나노 물질 노출과 관련된 조건 하에서 DcHsp17.7의 기능을 조사하기 위하여, DcHsp17.7 유전자의 코딩 부위를 E. coli (BL21)에 삽입하였다. DcHsp17.7에 대하여 나타난 다클론 항체를 사용한 면역블럿 분석은 IPTG가 DcHsp17.7의 이종적 발현을 성공적으로 유도하였다는 것을 나타내었다(도 4). 그 단백질의 레벨은 MWCNTs 및 AgNPs의 노출 시에 변하지 않고 유지하였다. 본 결과는 형질전환된 대장균에서 이종적으로 발현된 DcHsp17.7의 안정성이 세균 세포에 적용된 무생물학적 스트레스의 타입에 의존한다는 것을 나타낸다.
박테리아 세포 생존률에 대한 계면활성제의 가능한 독성
E. coli 생존률에 대한 계면활성제의 효과를 조사하였다. Tween 20 (0.01%까지)은 벡터 대조군과 이종적으로 DcHsp17.7를 발현하는 형질전환 세포주 모두의 생존률을 각각 89 및 87%로 약간 감소시켰다(도 5A). 또 다른 계면활성제인 SDS는 두 세포주 모두의 세포 생존률을 20% 보다 더 낮게 크게 감소시켰고, 따라서 식물독성을 나타내었다 (도 5B). 그러나, DcHsp17.7를 이종적으로 발현하는 형질전한 세포주는 양 계면활성제의 존재하에서 벡터 대조군과 비교하여 더 높은 생존률의 레벨을 나타내었고, 그것은DcHsp17.7가 계면활성제에 의하여 유도된 독성에 대한 내성을 부여할 수 있다는 것을 시사한다.
나노물질에 대한 DcHsp17 . 7를 이종적으로 발현하는 형질전환 세포의 증가된 내성
벡터 대조군과 DcHsp17.7를 이종적으로 발현하는 형질전환 세포주의 생존률을 MWCNTs 및 AgNPs의 존재에서 조사하였다. 해당하는 비 나노크기 대조군, 활성탄과 은 분말을 먼저 그 세포주에 첨가하였다. 전자는 그 세포 생존률을 약 90%로 약간 낮추었다 (도 6A). 형질전환 및 벡터 대조군 세포주 사이의 생존률의 현저한 차이는 없었다. 후자는 DcHsp17.7를 이종적으로 발현하는 형질전환 세포주 및 벡터 대조군 세포주의 생존률을 각각 88% 및 76%로 낮추었고(도 6B), Ag가 대장균에 독성이 있다는 것을 시사한다.
MWCNTs 및 AgNPs는 세포 생존률을 더 감소시켰다(도 6C & D). 전자는 DcHsp17.7를 이종적으로 발현하는 형질전환 세포주 및 벡터 대조군의 생존률을 가각각 35% 및 29%로 낮추었다. 후자는 DcHsp17.7를 이종적으로 발현하는 형질전환 세포주 및 벡터 대조군의 생존률을 각각 82 및 52%로 낮추었다.
본 결과는 MWCNTs가 박테리아 세포에 대하여 AgNPs 보다 상대적으로 더 세포독성을 가진다는 것을 나타낸다. 그러나, 이종적으로 발현된 DcHsp17.7는 형질전환 대장균에서 두 나노물질 모두에 대한 내성을 줄 수 있다. 이종적으로 발현된 DcHsp17.7의 레벨이 MWCNTs로 변하지 않는 사실(도 4)을 고려하면, MWCNTs에 의한 DcHsp17.7를 발현하는 형질전환 세포주의 감소된 생존률은 그 단백질의 분해에 기인하지 않는 것 같다. DcHsp17.7의 기능은 MWCNTs에 의하여 저해되는 것 같다.
본 발명의 결과는 식물 sHSPs가 발현될 수 있고 계면활성제에 대한 독성을 감소시키는데 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다. 유전공학을 통하여 이 유전자를 식물 및 다른 세균과 같은 생물체에 삽입하여 계면활성제에 대한 내성을 부여할 수 있을 것이다.
도 1은 Tween 20에 의한 나노물질의 분산을 나타낸 그림. (A) 다중 벽 탄소나노튜브 (MWCNTs) 및 (B) 은 나노입자(AgNPs; 각 0.2 g)을 0.05% Tween 20를 포함하는 이중 증류수(200 mL)에 첨가하고 30분간 초음파처리하였다. 그 결과 용액을 200 mL에서 특정 농도로 증류수로 희석하였다. 5 시간 후, Erlenmeyer 플라스크의 상부로부터 사진촬영 함.
도 2는 당근 잎 조직에 대한 나노물질의 식물독성을 나타낸 그림. (A) 다중 벽 탄소나노튜브 (MWCNTs) 및 (B) 은 나노입자 (AgNPs) 스톡 용액( 0.05% Tween 20를 포함하는 이중 증류수 200 mL에 0.2 g)을 제조함. 증류수로 특정 농도로 희석한 후 2-3 월령 당근으로부터 유래한 잎 조직을 5시간 동안 그 용액에 놓고 사진 촬용하였다.
도 3은 나노물질에 의한 DcHsp17.7의 발현을 나타낸 그림. (A) 다중 벽 탄소나노튜브 (MWCNTs) 및 (B) 은 나노입자 (AgNPs)를 5시간 동안 200 ㎍/mL까지 처리한 당근 잎 조직을 제조한 후 추출하여 SDS-PAGE, 17% 및 시금치 Heat shock cognate 70에 대한 다클론 항체 또는 DcHsp17.7에 대한 다클론 항체를 사용한 면역블럿 분석을 수행함. 밴드의 크기는 각각 약 18 및 70 kDa이었다. Coomassie 염색은 양 나노물질의 존재에서 전체 단백질 프로파일 및 동일한 단백질의 로딩을 나타낸다.
도 4는 대장균에서 DcHsp17.7의 이종 발현을 나타낸 그림. DcHsp17.7 유전자를 pET11a 발현 벡터에 삽입하고 E. coli BL21 (DE3)에 넣었다. 오버나잇 세포배양을 실시예에 기재한 것과 같이 수행함. IPTG(Isopropyl 베타-D-1-thiogalactopyranoside) 처리 2 시간 후, (A) 다중 벽 탄소나노튜브 (MWCNTs) 및 (B) 은 나노입자 (AgNPs) 스톡 용액( 0.05% Tween 20를 포함하는 이중 증류수 200 mL에 0.2 g)을 최종 200 ㎍/mL 농도로 첨가하였고, 박테리아 세포를 5시간 동안 계속 배양하였다. 단백질을 초음파 수행하여 추출하고 30 ㎍의 단백질을 SDS-PAGE, 17%를 수행하고, DcHsp17.7에 대한 다클론 항체를 사용한 면역블럿 분석을 수행함. 밴드의 크기는 약 18 kDa이었다. VC, 비변형된 pET11a 발현 벡터를 포함한 벡터 대조군.
도 5는 박테리아 세포 생존률에 대한 계면활성제의 효과. 오버나잇 세포배양을 실시예에 기재한 것과 같이 수행함. IPTG(Isopropyl 베타-D-1-thiogalactopyranoside) 처리 2 시간 후, (A) Tween 20 및 (B) Sodium dodecyl sulfate (SDS)를 최종 0.01% 농도로 첨가하였고, 37 ℃에서 5 시간 동안 교반하면서 배양하였다. 그 다음, 세포를 1:10-6 희석하고 ampicillin을 포함한 고체 Luria Broth (LB) 플레이트에 플레이팅하였다. 오버나잇 배양 후, 생존 콜로니의 수를 계수하고 세포 생존률을 계산하였다. paired t 테스트를 비변형된 pET11a 발현 벡터를 포함한 벡터 대조군과 DcHsp17.7를 이종적으로 발현하는 형질전환 대장균 사이의 세포 생존률 차이를 비교하기 위하여 수행하였다(*P< 0.05;**P< 0.01). 검은 바는 벡터 대조군; 회색 바는 DcHsp17.7를 이종적으로 발현하는 형질전환 대장균.
도 6은 나노물질에 대한 DcHsp17.7를 이종적으로 발현하는 세포의 증가된 내성을 나타낸 그림. 오버나잇 세포배양을 실시예에 기재한 것과 같이 수행함. IPTG(Isopropyl 베타-D-1-thiogalactopyranoside) 처리 2 시간 후, (A) 활성탄소, (B) Ag 분말, (C) 다중 벽 탄소 나노 튜브 (MWCNT), 및 (D) 은 나노입자 (AgNP) 스톡 용액을 최종 100 ㎍/mL 농도로 첨가하였고, 박테리아 세포를 5시간 동안 교반 배양한 후, 그 세포를 1:10-6 희석하고 ampicillin을 포함한 고체 Luria Broth (LB) 플레이트에 플레이팅하였다. 37 ℃에서 오버나잇 배양 후, 생존 콜로니의 수를 계수하고 세포 생존률을 계산하였다. paired t 테스트를 비변형된 pET11a 발현 벡터를 포함한 벡터 대조군과 DcHsp17.7를 이종적으로 발현하는 형질전환 대장균 사이의 세포 생존률 차이를 비교하기 위하여 수행하였다(*P< 0.05;**P< 0.01). 검은 바는 벡터 대조군; 회색 바는 DcHsp17.7를 이종적으로 발현하는 형질전환 대장균.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 나노물질의 분산
Sigma-aldrich (St. Louis, MO) 로부터 구입한 다중벽 탄소 나노 튜브(Multi-Walled CNT, MWCNT) (6-9 nm x 5 ㎛; 지름 = 평균 6.6 nm ) 및 은 나노입자(AgNPs) (지름 <100 nm)를 이중 증류수 200 mL에 0.2 g)에 첨가하고 극-초음파 (420 W, 20 Khz, 전체 30분 동안; 10 s 극 초음파 및 30 s 중지의 반복)을 Sonomasher (S & T Science, Seoul, Korea)를 사용하여 수행하였다. 스톡 용액을 최종 농도 200 ㎍/mL로 희석하였다. 5 시간 후, Erlenmeyer 플라스크(250 mL)의 상부의 사진을 얻었다.
실시예 2:당근 잎 조직에 대한 나노물질들의 독성
당근(Daucus carota L. cv. Mussangochon)을 강도 200 uE·m-2·s-1 형광 램프로부터 온 빛과 상대 습도 60%의 조절된 환경 챔버(19-21 ℃, 8-16 h, 밤-낮)에서 성장시켰다. 2에서 3 월령 당근 식물 유래 잎 조직들을 MWCNT (0.01% Tween 20을 가지는 200 ㎍/mL까지; Khodakovskaya et al., 2011) 및 AgNP 용액 (0.01% Tween 20을 가지는 200 ㎍/mL까지; Stampoulis et al., 2009)에 5시간 처리하고 사진을 촬영하였다.
실시예 3: 나노물질에 의하여 유도된 DcHsp17 .7 축적의 면역 검출
상기 실시예 2에 기재된 것과 같이 MWCNTs 및 AgNPs (5시간 동안 0.01% Tween 20을 가지는 200 ㎍/mL까지)을 처리한 당근 잎 조직을 액체 질소로 즉시 동결하고 분석 때까지 -80 ℃에 저장하였다. MWCNTs 및 AgNPs에 의하여 유도된 DcHsp17.7의 축적을 조사하기 위하여, 당근 조직으로부터 단백질을 추출하여 Bradford 에세이를 수행하여 정량하고, 30 ㎍의 단백질을 SDS-PAGE, 17%를 수행하고, Ahn Y, Claussen K, Zimmerman JL. Plant Sci. 2004;166:901-11에 기재된 것과 같이, DcHsp17.7에 대한 다클론 항체를 사용한 면역블럿 분석을 수행하였다. 시금치의 재조합 Heat shock cognate 70에 대한 다클론 항체(Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY)와 반응하는 constitutive 단백질의 레벨을 동일 조건 하에서 조사하였다. 단백질 밴드의 크기들은 두 항체에 대해서 각각 약 18 및 70 kDa이었다. Coomassie 염색은 동일단 단백질 로딩 이외에 나노물질의 존재에서 전체 단백질 프로파일을 나타내었다. 실험은 조건 당 잎 두개에서 3개를 가지고 3회 수행하고 대표적인 이미지를 보여준다.
실시예 4: DcHsp17 . 7를 이종적으로 발현하는 형질전환 대장균의 제조
DcHsp17.7 유전자(NCBI accession number X53851) pET11a 벡터에 삽입하였다(Kim H, Ahn Y. HortScience 2009;44:866-9). 비변형된 pET11a 발현 벡터를 포함한 벡터 대조군과 pET11a-DcHsp17.7 재조합 벡터를 포함하는 형질전환 대장균 BL21 (DE3)를 오버나잇 배양하고 ampicillin을 포함한 신선한 Luria Broth (LB) 배지로 1:1000로 희석하고 600 nm에서 O.D.가 0.6에 도달할 때까지 계속 배양하였다. 그 후, IPTG를 최종 농도 1 mM로 DcHsp17.7.의 이종 발현을 유도하기 위하여 첨가하였다. 배양 2시간 후, MWCNT 및 AgNP 스톡 용액(1 g/L with 0.05% Tween 20)을 최종 200 ㎍/mL 농도로 첨가하였다. 5 시간 배양 후, 박테리아 단백질들을 극-초음파 (420 W, 20 Khz, 전체 4분 40초 동안; 10 s 극 초음파 및 30 s 중지의 반복)을 사용하여 추출하고 Bradford 에세이를 수행하여 정량화하였다. 박테리아 단백질(30 ㎍ /레인)을 SDS-PAGE (17%)를 수행하고 DcHsp17.7에 대한 다클론 항체를 사용하여 면역블럿 분석을 수행하였다(Song N, Ahn Y. New biotechnol. 2011;28:698-704).
실시예 5:나노 물질 및 계면활성제의 존재에서 박테리아 세포 생존률
상기 실시예와 같이, 비변형된 pET11a 발현 벡터를 포함한 벡터 대조군과 pET11a-DcHsp17.7 재조합 벡터를 포함하는 형질전환 대장균에 대하여 오버나잇 배양, 희석 및 IPTG 처리(2 h)를 수행하였다. 그 후, Tween 20 (El-Temsah YS, Joner EJ. Environ. Toxicol. 2010;27:42-9) 및 SDS (Stampoulis D, Sinha SK, White JC.Environ. Sci. Technol. 2009;43:9473-9)를 최종 농도 0.01%로 첨가하였다. 활성 탄소, Ag 분말, MWCNTs, 및 AgNPs (0.05% Tween 20을 포함하는 이중 증류수 200 mL)에 0.1g) 스톡 용액을 극 초음파를 사용하여 제조하고 두 박테리아 세포주에 최종 100 ㎍/mL 농도로 첨가하였다. 그 후, 그 세포주를 1:10-6,로 희석하여 추가 5시간 동안 배양하고 앰피실린을 포함하는 고체 LB 플레이트에 플레이팅하였다. 오버나잇 배양 후, 생존 콜로니의 수를 계수하고 박테리아 세포 생존률을 계산하였다. paired t 테스트를 비변형된 pET11a 발현 벡터를 포함한 벡터 대조군과 DcHsp17.7를 이종적으로 발현하는 형질전환 대장균 사이의 세포 생존률 차이를 비교하기 위하여 수행하였다.
<110> Sangmyung University Seoul Industry-Academy Cooperation Foundation Protein and Chemical Inc. <120> A composition which confer tolerance to surfactant and a method thereof <130> HY140141 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 158 <212> PRT <213> Daucus carota <400> 1 Met Ser Ile Ile Pro Ser Phe Phe Gly Gly Arg Arg Ser Asn Val Phe 1 5 10 15 Asp Pro Phe Ser Leu Asp Val Trp Asp Pro Phe Lys Asp Phe Pro Leu 20 25 30 Val Thr Ser Ser Gly Ser Glu Phe Gly Lys Arg Asp Cys Ser Val Cys 35 40 45 Gln Tyr Ala His *** Leu Glu Gly Asp Ser Pro Gly Ser Cys Val Gln 50 55 60 Gly Arg Ser Ser Arg Ala Glu Glu Arg Arg Gly Glu Gly Arg Ala Ser 65 70 75 80 Arg Lys Glu Arg Phe Phe Arg Ser Ala Glu Arg Gly Thr Lys Arg Arg 85 90 95 Arg Arg Arg Thr Thr Ser Gly Thr Glu Trp Asn Ala Ala Val Ala Asn 100 105 110 Phe *** Gly Gly Ser Gly Phe Gln Arg Asn Ala Lys Val Asp Glu Val 115 120 125 Lys Ala Ala Met Glu Asn Gly Val Leu Thr Val Thr Val Pro Lys Val 130 135 140 Glu Ile Lys Lys Pro Glu Val Lys Ala Ile Asp Ile Ser Gly 145 150 155 <210> 2 <211> 477 <212> DNA <213> Daucus carota <400> 2 atgtcgatca ttccaagctt ttttggaggc cggagaagca acgttttcga cccattctct 60 cttgatgtat gggatccttt caaagatttt cctcttgtta cctcctctgc gtctgagttc 120 gggaaaagag actgcagcgt ttgtcaatac gcacattgac tggaaggaga ctccccaggc 180 tcatgtgttc aaggccgatc ttccagggct gaagaaagaa gaggtgaagg tagagcttga 240 aggaaggaaa ggttcttcag atcagcggag agaggaacaa agagaaggag gagaagaacg 300 acaagtggca ccgagtggaa cgcagcagtg gcaaatttct gaggaggttc aggcttccag 360 agaaatgcaa aggtggatga ggtgaaagct gctatggaga atggggtgtt gactgttact 420 gttccaaagg tggagatcaa gaagcccgag gtcaaggcca ttgatatttc tggttaa 477

Claims (5)

  1. 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 유효성분으로 포함하는 트윈 20 또는 소디움도데실설페이트에 대한 내성을 부여하는 조성물.
  2. 삭제
  3. 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 유전자를 생물체에 형질전환하여 해당 생물체에 트윈 20 또는 소디움도데실설페이트에 대한 내성을 부여하는 방법.
  4. 삭제
  5. 제 3항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.


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