CN118006652A - 一种多巴胺生产菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

一种多巴胺生产菌株及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种多巴胺生产菌株及其构建方法与应用，所述菌株缺失了tynA、tyrR、pykF基因，上调了aroGfbr、aroE、tyrAfbr、tyrB、aroP、pdxJ、pdxH基因，异源表达了来源于Corynebacterium glutamicum的cg0898基因、Serratia rubidaea的hpaBC基因，同时所述生产菌携带了质粒PET‑DA02，所述质粒异源表达了来源于Drosophila melanogaster的DmDdc基因；所述菌株通过优化辅因子供给系统，为关键酶多巴脱羧酶的表达提供了充足的辅因子，提高多巴胺生产水平，实现了多巴胺的高效生产。

Description

一种多巴胺生产菌株及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，尤其是一种多巴胺生产菌株及其构建方法与应用。
背景技术
多巴胺（Dopamine）是内源性含氮有机化合物，简称DA，是儿茶酚胺类的一种，分子式为C8H11NO2，为酪氨酸（芳香族氨基酸）在代谢过程中产生的中间产物。多巴胺系统调节障碍则会导致帕金森病、精神分裂症、注意力缺陷多动综合征和垂体肿瘤等疾病的发生，此外，多巴胺还常被用于治疗多种类型的休克病症。
不仅如此，以多巴胺为原料，还可生产如羟基酪醇、红景天苷等高附加值产品，具有非常良好的市场前景。
目前多巴胺的合成方法还是主要集中在化学合成法，如用胡椒乙胺一步水解，或者使用香兰素进行一系列化学反应合成多巴胺。但是由于化学合成法反应复杂，成本高昂且部分原料具有毒性，目前急需一种更加绿色、安全、廉价的多巴胺合成方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种多巴胺生产菌株。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述多巴胺生产菌株的构建方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述多巴胺生产菌株的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种质粒，为质粒PET-DA02，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.18所示。
优选的，上述质粒，携带复制起始位点、卡那霉素抗性基因、trc启动子、终止子等质粒元件，同时携带了来源于Drosophila melanogaster的DmDdc基因。
一种多巴胺生产菌株，为多巴胺基因工程菌DA-14，是在E.coli W3110的基础上进行代谢工程改造获得的，缺失了tynA、tyrR、pykF基因，上调了aroGfbr、aroE、tyrAfbr、tyrB、aroP、pdxJ、pdxH基因，异源表达了来源于Corynebacterium glutamicum 的cg0898基因以及Serratia rubidaea的hpaBC基因，同时携带了上述质粒PET-DA02，所述质粒PET-DA02异源表达了来源于Drosophila melanogaster的DmDdc基因。
优选的，上述多巴胺生产菌株，以E.coli W3110作为底盘菌株，敲除了菌株基因组上的tynA、tyrR、pykF基因；利用trc启动子强化来源于aroGfbr基因转录，并整合到基因组ygaY基因位点；利用trc启动子强化aroE基因转录强度，并整合到基因组ycgh基因位点；利用trc启动子强化tyrAfbr基因转录强度，并整合到基因组yeeP基因位点；利用trc启动子强化tyrB基因转录强度，并整合到基因组yeeL基因位点；利用trc启动子强化aroP基因转录强度，并整合到基因组yjiP基因位点；利用trc启动子强化pdxJ基因转录强度，并整合到基因组rph基因位点；利用trc启动子强化pdxH基因转录强度，并整合到基因组yciQ基因位点；利用trc启动子强化cg0898基因转录强度，并整合到基因组yjgX基因位点；利用trc启动子强化hpaBC基因转录强度，并整合到基因组ylbE基因位点；利用trc启动子强化hpaBC基因转录强度，并整合到基因组ycdN基因位点。
优选的，上述多巴胺生产菌株，是在E.coli W3110的基础上进行代谢工程改造获得的，具体为：利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在基因组上敲除伯胺氧化酶tynA；在基因组上敲除转录调节因子基因tyrR；在基因组上敲除丙酮酸激酶基因pykF；在基因组ygaY位点上整合DAHP合成酶基因aroGfbr；在基因组ycgh位点整合莽草酸脱氢酶基因aroE；在基因组yeeP位点上整合预苯酸脱氢酶基因tyrAfbr；在基因组yeeL位点上整合芳香族氨基转移酶基因tyrB；在基因组Yjip位点上整合芳香族氨基酸转运蛋白基因aroP；在基因组rph位点上整合吡哆醇-5-磷酸合酶基因pdxJ；在基因组yciQ位点上整合吡哆醇 5'-磷酸氧化酶基因pdxH；在基因组yjgX位点上整合吡哆醛 5'-磷酸合酶基因cg0898；在基因组ylbE位点上整合4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因hpaBC；在基因组ycdN位点上整合4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因hpaBC，对其进行双拷贝表达；在PET-28a(+)质粒的基础上敲除其上的lacI基因构建PET-DA01质粒，在PET-DA01质粒的基础导入来源于果蝇的多巴脱羧酶基因DmDdc构建PET-DA02质粒。
优选的，上述多巴胺生产菌株，所述E.coliW3110为E.coliW3110 ATCC 27325。
优选的，上述多巴胺生产菌株，所述trc启动子的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示； tynA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；tyrR基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；pykF基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示；aroGfbr基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；aroE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示；tyrAfbr基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示；tyrB基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示；aroP基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示；pdxJ基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示；pdxH基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.12所示；Cg0898基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.13所示；hpaBC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.14所示。
优选的，上述多巴胺生产菌株，所述质粒PET-DA02携带的终止子（terminator）的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；lacI基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.15所示；DmDdc基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.16所示；质粒PET-DA01的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.17所示；质粒PET-DA02的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.18所示。
上述多巴胺生产菌株的构建方法，在出发菌株E.coliW3110基础上进行定向改造，具体步骤如下：
(1)底盘菌改造：以E.coli W3110为出发菌株，敲除了tynA、tyrR、pykF基因，上调了aroGfbr、aroE、tyrAfbr、tyrB、aroP基因，异源表达了来源于Serratia rubidaea的hpaBC基因；
（2）优化辅因子供给系统：因为多巴脱羧酶具有PLP依赖性，因此加强了pdxJ和pdxH基因并异源表达了来源于Corynebacterium glutamicum的cg0898基因，提高了PLP的合成量，为多巴脱羧酶的表达提供充足的辅因子；
（3）PET-DA02质粒系统：质粒PET-DA02携带复制起始位点、卡那霉素抗性、trc启动子、终止子等质粒元件，以该质粒PET-DA02高效表达了来源于Drosophila melanogaster的DmDdc基因，基因选用trc启动子强化转录。
上述多巴胺生产菌株在发酵生产多巴胺方面的应用。
优选的，上述多巴胺生产菌株的应用，在培养基中进行发酵培养，培养基包括但不限于碳源、氮源、无机盐、维生素等；发酵条件包括发酵温度、发酵pH、发酵溶氧条件、发酵压力、发酵时间等。
优选的，上述多巴胺生产菌株的应用，具体步骤如下：
①斜面培养：取多巴胺生产菌株接种在斜面培养基上，32℃培养12-16h，斜面培养基选用通用LB固体培养基；
②种子培养：使用机械搅拌式发酵罐，培养温度为37℃，通过自动流加氨水溶液维持培养pH在7.0±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30%，当OD600nm为15时达到接种要求；
③发酵培养：使用机械搅拌式发酵罐，发酵接种量为20%，培养温度为37℃，通过自动流加氨水溶液维持培养pH在7.0±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30%，通过流加葡萄糖溶液将罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5 g/L，发酵周期为48 h。
优选的，上述多巴胺生产菌株的应用，所述种子培养中采用的种子培养基为：葡萄糖20 g/L，酵母3 g/L，蛋白胨1 g/L，(NH4)2SO41 g/L，K2HPO4·3H2O 2 g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，柠檬酸1.5 g/L，谷氨酸3g/L，蛋氨酸0.5 g/L，FeSO4·7H2O 10 mg/L，MgSO4·7H2O 10mg/L，其余为水。
优选的，上述多巴胺生产菌株的应用，所述发酵培养中采用的发酵培养基为：酵母粉3.5 g/L，蛋白胨1 g/L，(NH4)2SO42 g/L，K2HPO4·3H2O 2 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，谷氨酸2 g/L，蛋氨酸0.5 g/L，柠檬酸3g/L，MnSO4·7H2O 10 mg/L，FeSO4·7H2O 30 mg/L，其余为水。
上述培养基均可采用标准方法制备获得。
有益效果：
上述多巴胺生产菌株，缺失了tynA、tyrR、pykF基因，上调了aroGfbr、aroE、tyrAfbr、tyrB、aroP、pdxJ、pdxH基因，异源表达了来源于Corynebacterium glutamicum 的cg0898基因、 Serratia rubidaea的hpaBC基因。同时所述生产菌携带了质粒PET-DA02，所述质粒异源表达了来源于Drosophila melanogaster的DmDdc基因；所述菌株通过优化辅因子供给系统，为关键酶多巴脱羧酶的表达提供了充足的辅因子，提高多巴胺生产水平，实现了多巴胺的高效生产，具有优秀的工业应用前景。具体来说：
（1）通过敲除了多tynA基因，减少多巴胺的分解；（2）通过加强aroP基因，使目的产物多巴胺更容易外排；（3）通过加强pdxJ、pdxH，异源引入cg0898基因，提高了PLP的合成量，在工程菌内部为多巴脱羧酶的表达提供了充足的辅因子，不需要外源添加PLP；（4）因为PET-28a(+)质粒上具有lacI基因，因此需要外源添加IPTG才能使其正常表达，考虑到IPTG对菌体生长具有毒性，因此敲除了lacI基因，使质粒在菌体生长过程中无需添加IPTG也可正常表达。
上述多巴胺生产菌株的定向改造方法，通过多巴胺代谢合成途径改造得到的工程菌DA-14采用从头合成的方法，以葡萄糖为碳源，无需添加酪氨酸底物，生产成本低，具有生产速率高，合成效率高，发酵周期短，菌株稳定性高的优点，发酵罐发酵方法生产多巴胺，发酵48h生产多巴胺39.28g/L，大大提高了多巴胺的生产水平，具有很高的经济效益，为实现多巴胺的大规模生产奠定基础，具有良好的工业化前景。
附图说明
图1为多巴胺基因工程菌多巴胺从头合成途径改造过程图。
图2为质粒PET-DA02的结构示意图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100mL中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。
实施例中所用的出发菌株为野生型E.coliW3110ATCC 27325（市售菌株），相应启动子和基因等见序列表。菌株构建过程中用到的引物见表1。
如图1所示，通过下述3个模块构建多巴胺生产菌株：
(1)底盘菌改造：以E.coli W3110为出发菌株，包括敲除了tynA、tyrR、pykF基因，上调了aroGfbr、aroE、tyrAfbr、tyrB、aroP基因，异源表达了来源于Serratia rubidaea的hpaBC基因。
（2）优化辅因子供给系统：因为多巴脱羧酶具有PLP依赖性，因此加强了pdxJ和pdxH基因并异源表达了来源于Corynebacterium glutamicum的cg0898基因，提高了PLP的合成量，为多巴脱羧酶的表达提供充足的辅因子。
（3）PET-DA02质粒系统：PET-DA02质粒携带复制起始位点、卡那霉素抗性、trc启动子、终止子等质粒元件，以该质粒高效表达了来源于Drosophila melanogaster的DmDdc基因，基因选用trc启动子强化转录。
上述基因操作采用的基因编辑方法参照文献（Li Y，Lin Z，Huang C，et al.Metabolic engineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9 meditated genomeediting. Metabolic Engineering，2015，31：13-21.）。该方法涉及的工程质粒pREDCas9、pGRB，其中pREDCas9携带gRNA表达质粒pGRB的消除系统、λ噬菌体的Red重组系统、Cas9蛋白表达系统以及奇霉素抗性（工作浓度：100 mg/L）；pGRB以pUC18为骨架，包括启动子J23100、gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列以及氨节青霉素抗性（工作浓度：100 mg/L）。下列实施例中涉及到的专业名词均可在该文章中解释。本发明所指的“敲除”是指将目的基因失活，“引入”是指将外源基因与启动子、终止子连接后插入到工程菌基因组中。
表1菌株构建过程中所涉及的引物
引物名称 序列号 引物序列（5’-3’）
tynA-U-S SEQ ID NO.19 CGTGTCCACTATTGCTGGGTAA
tynA-U-A SEQ ID NO.20 CCCATTCGGTCGGCATAATGGCGAAATCATCCAGCAACA
tynA-D-S SEQ ID NO.21 TGTTGCTGGATGATTTCGCCATTATGCCGACCGAATGGG
tynA-D-A SEQ ID NO.22 CCGGAGAGGGGTATTATGTTG
tynA-pGRB-U SEQ ID NO.23 AGTCCTAGGTATAATACTAGTTTACTGGCGATATGATTCACGTTTTAGAGCTAGAA
tynA-pGRB-D SEQ ID NO.24 TTCTAGCTCTAAAACGTGAATCATATCGCCAGTAAACTAGTATTATACCTAGGACT
tyrR-U-S SEQ ID NO.25 ATCTTTACGCCGAAGTGCC
tyrR-U-A SEQ ID NO.26 ACCGTCCAGTTGTGTCAGTCTCAACGCCAGATGCTCAC
tyrR-D-S SEQ ID NO.27 GTGAGCATCTGGCGTTGAGACTGACACAACTGGACGGT
tyrR-D-A SEQ ID NO.28 CCTCTCCACTTTCCGTAAC
tyrR-pGRB-U SEQ ID NO.29 AGTCCTAGGTATAATACTAGTACACGTCCTGACCGGTGCGGGTTTTAGAGCTAGAA
tyrR-pGRB-D SEQ ID NO.30 TTCTAGCTCTAAAACCCGCACCGGTCAGGACGTGTACTAGTATTATACCTAGGACT
pykF-U-S SEQ ID NO.31 ATCCTTAGAGCGAGGCACC
pykF-U-A SEQ ID NO.32 CCAGTTCTTTACCCAGACGCAGGATAGCGGCGGTTTTA
pykF-D-S SEQ ID NO.33 TAAAACCGCCGCTATCCTGCGTCTGGGTAAAGAACTGG
pykF-D-A SEQ ID NO.34 GATCGTTCGCTCAAAGAAGC
pykF-pGRB-U SEQ ID NO.35 AGTCCTAGGTATAATACTAGTGACAAACAGGACCTGATCTTGTTTTAGAGCTAGAA
pykF-pGRB-D SEQ ID NO.36 TTCTAGCTCTAAAACAAGATCAGGTCCTGTTTGTCACTAGTATTATACCTAGGACT
ygaY-pGRB-U SEQ ID NO.37 AGTCCTAGGTATAATACTAGTCACTGATGGCGCTGGCATTAGTTTTAGAGCTAGAA
ygaY-pGRB-D SEQ ID NO.38 TTCTAGCTCTAAAACTAATGCCAGCGCCATCAGTGACTAGTATTATACCTAGGACT
ygaY-U-S SEQ ID NO.39 CCTACAAACCACATCGCACATT
ygaY-U-A SEQ ID NO.40 TCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAACACCGAAGCAACCCAAAAGACGGT
ygaY-D-S SEQ ID NO.41 AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATTTGCTTGCCGCTCCACC
ygaY-D-A SEQ ID NO.42 GGAGTAGGGCTTTCCATAGAGTGT
ygaY-aroGfbr-UP SEQ ID NO.43 GGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGAATTATCAGAACGACGA
ygaY-aroGfbr-DN SEQ ID NO.44 CAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTACCCGCGACGCGCTTTTA
ycgh-pGRB-U SEQ ID NO.45 AGTCCTAGGTATAATACTAGTTATGCGTCTGAACGACCGTGGTTTTAGAGCTAGAA
ycgh-pGRB-D SEQ ID NO.46 TTCTAGCTCTAAAACCACGGTCGTTCAGACGCATAACTAGTATTATACCTAGGACT
ycgh-U-S SEQ ID NO.47 TAAACTCGTCAGCGGCACAA
ycgh-U-A SEQ ID NO.48 AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAGGTAGGCGTTTCTGTTGATTCTG
ycgh-D-S SEQ ID NO.49 AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATGCGTGTCGGATTATCGTTCG
ycgh-D-A SEQ ID NO.50 GATTCAGGTTGCCATTTACGC
ycgh-aroE-UP SEQ ID NO.51 ATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGGAAACCTATGCTGTTTT
ycgh-aroE-DN SEQ ID NO.52 CCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTCACGCGGACAATTCCTCC
yeeP-pGRB-U SEQ ID NO.53 AGTCCTAGGTATAATACTAGTAGGCGGTATTCCGTCTGTTCGTTTTAGAGCTAGAA
yeeP-pGRB-D SEQ ID NO.54 TTCTAGCTCTAAAACGAACAGACGGAATACCGCCTACTAGTATTATACCTAGGACT
yeeP-U-S SEQ ID NO.55 GGTCAGGAGGTAACTTATCAGCG
yeeP-U-A SEQ ID NO.56 AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAATGGCAGGGCTCCGTTTT
yeeP-D-S SEQ ID NO.57 AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATGAACTGGATTTTCTTCTGAACCTGT
yeeP-D-A SEQ ID NO.58 ACGATGTCAGCAGCCAGCA
yeeP-tyrAfbr-UP SEQ ID NO.59 AATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGGTTGCTGAATTGACCGCAT
yeeP-tyrAfbr-DN SEQ ID NO.60 CAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTACTGGCGATTGTCATTCG
yeeL-pGRB-U SEQ ID NO.61 AGTCCTAGGTATAATACTAGTAACACAGCAATACGGTACGCGTTTTAGAGCTAGAA
yeeL-pGRB-D SEQ ID NO.62 TTCTAGCTCTAAAACGCGTACCGTATTGCTGTGTTACTAGTATTATACCTAGGACT
yeeL-U-S SEQ ID NO.63 TTCATCGGGACGAGTGGAGA
yeeL-U-A SEQ ID NO.64 TCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACCATAGCATCGCCAATCTGATCGGG
yeeL-D-S SEQ ID NO.65 AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATACCCAAAGGTGAAGATA
yeeL-D-A SEQ ID NO.66 CATTCCCTCTACAGAACTAG
yeeL-tyrB-UP SEQ ID NO.67 CCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCGTGTTTCAAAAAGTTGACGCC
yeeL-tyrB-DN SEQ ID NO.68 TATCTTCACCTTTGGGTATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTT
yjiP-U-S SEQ ID NO.69 GCCATACCGCCAGCAAGAT
yjiP-U-A SEQ ID NO.70 AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAGCAGATATTCCCCTTTCCACC
yjiP-D-S SEQ ID NO.71 AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATGACGGATGACAAACGCAAAGC
yjiP-D-A SEQ ID NO.72 AAAGGCGGATTTTTACTGTGGA
yjiP-aroP-UP SEQ ID NO.73 GTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGATGGAAGGTCAACAGCACGGCG
yjiP-aroP-DN SEQ ID NO.74 CAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTAATGCGCTTTTACGGCTTTGG
yjiP-pGRB-U SEQ ID NO.75 AGTCCTAGGTATAATACTAGTTGGTCGGTAAAGACCCGCGAGTTTTAGAGCTAGAA
yjiP-pGRB-D SEQ ID NO.76 TTCTAGCTCTAAAACTCGCGGGTCTTTACCGACCAACTAGTATTATACCTAGGACT
rph-pGRB-U SEQ ID NO.77 AGTCCTAGGTATAATACTAGTTGCGACGTGCTTCAGGCTGAGTTTTAGAGCTAGAA
rph-pGRB-D SEQ ID NO.78 TTCTAGCTCTAAAACTCAGCCTGAAGCACGTCGCAACTAGTATTATACCTAGGACT
rph-U-S SEQ ID NO.79 ATAGCGCAGGGTACATTCCACT
rph-U-A SEQ ID NO.80 AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACCTTCTTCAATAGAGGCGGTACA
rph-D-S SEQ ID NO.81 AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATTGCCGCAGAGACCGACAT
rph-D-A SEQ ID NO.82 ACAGCGGTTGTGGTGGCA
rph-pdxJ-UP SEQ ID NO.83 GGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGGCTGAATTACTGTTAGG
rph-pdxJ-DN SEQ ID NO.84 TGCTGGAAGCGCGTGGCTAACAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTG
yciQ-U-S SEQ ID NO.85 TTACTTGAAGCATTGGGCGAAC
yciQ-U-A SEQ ID NO.86 AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACCAGTCAAGATGCCAGGGTTC
yciQ-D-S SEQ ID NO.87 AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATGTCTGACAAGAACCAGCAAATCCT
yciQ-D-A SEQ ID NO.88 ATAGCTTCACCGTGGGCATAAC
yciQ-pdxH-UP SEQ ID NO.89 GGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGTCTGATAACGACGAATT
yciQ-pdxH-DN SEQ ID NO.90 TTGATCGTCTTGCACCCTGACAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTG
yciQ-pGRB-U SEQ ID NO.91 AGTCCTAGGTATAATACTAGTACCGGAGAAGAGGGCGACACGTTTTAGAGCTAGAA
yciQ-pGRB-D SEQ ID NO.92 TTCTAGCTCTAAAACGTGTCGCCCTCTTCTCCGGTACTAGTATTATACCTAGGACT
yjgX-U-S SEQ ID NO.93 GGAAGTCAACGGGTTATGCG
yjgX-U-A SEQ ID NO.94 AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAAAAATCACCACGAATACCAGAATC
yjgX-D-S SEQ ID NO.95 AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATACAGTGTCTTCCCTGAGCCG
yjgX-D-A SEQ ID NO.96 GGCGAAGGATACCATCAAGC
yjgX-cg0898-UP SEQ ID NO.97 GTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGACCGAAACTCAAGAAACTTACCAAGCAACCAC
yjgX-cg0898-DN SEQ ID NO.98 ACCACACCGACTCGCCGAGCGCGGCTGGTGACAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCT
yjgX-pGRB-U SEQ ID NO.99 AGTCCTAGGTATAATACTAGTTCGCGACCACCGTAACTGGCGTTTTAGAGCTAGAA
yjgX-pGRB-D SEQ ID NO.100 TTCTAGCTCTAAAACGCCAGTTACGGTGGTCGCGAACTAGTATTATACCTAGGACT
ylbE-U-S SEQ ID NO.101 ACCCAACCTTACGCAACCAG
yblE-U-A SEQ ID NO.102 GAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAATTGTTCGATAACCGCAGCATTG
yblE-D-S SEQ ID NO.103 CTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCGCTGGCGTGCTTTGAACAGGC
yblE-D-A SEQ ID NO.104 GGCGTAACTCAGCAGGCAG
ylbE-hpaBC-UP SEQ ID NO.105 TTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGAAACCAGAAGACTTCCGCGCTGACAACAAACGCCCGTTCA
ylbE-hpaBC-DN SEQ ID NO.106 CAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGCTAATGGATCATCACCGTCA
ylbE-pGRB-U SEQ ID NO.107 AGTCCTAGGTATAATACTAGTACACTGGCTGGATGTGCAACGTTTTAGAGCTAGAA
ylbE-pGRB-D SEQ ID NO.108 TTCTAGCTCTAAAACGTTGCACATCCAGCCAGTGTACTAGTATTATACCTAGGACT
ycdN-U-S SEQ ID NO.109 GATTTTGACGCCACCAACACC
ycdN-U-A SEQ ID NO.110 AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACCAATCCACATCACACAATCCAT
ycdN-D-S SEQ ID NO.111 AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATGAAGGGATTTTTGGCTATCAGGA
ycdN-D-A SEQ ID NO.112 CATATCGTATTCGCCAGGCTG
ycdN-hpaBC-UP SEQ ID NO.113 TTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGAAACCAGAAGACTTCCGCGCTGACAACAAACGCCCGTTCA
ycdN-hpaBC-DN SEQ ID NO.114 CAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGCTAATGGATCATCACCGTCA
ycdN-pGRB-U SEQ ID NO.115 AGTCCTAGGTATAATACTAGTGCGTGGAAATCATCATGGCTGTTTTAGAGCTAGAA
ycdN-pGRB-D SEQ ID NO.116 TTCTAGCTCTAAAACAGCCATGATGATTTCCACGCACTAGTATTATACCTAGGACT
Q-lac-S SEQ ID NO.117 TTACATTAATTGCGTTGCGCCGGGATCTCGACGCTCTC
Q-lac-A SEQ ID NO.118 GAGAGCGTCGAGATCCCGGCGCAACGCAATTAATGTAA
Dmddc-up SEQ ID NO.119 ATGGGTCGCGGATCCGAATTCGCGCGCTTGACAATTAATCAT
Dmddc-dn SEQ ID NO.120 CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTAAGCTTTTACTGTTCTTGTTCCATTT
实施例1
本实施例旨在说明菌株DA-14的具体构建步骤。特别的，实施例中若有同类型基因操作方法，则仅提供1次，并做注释，不再多加赘述。
（1）敲除tynA基因：
①以大肠杆菌W3110基因组为模板，分别以tynA-U-S、tynA-U-A与tynA-D-S、tynA-D-A为引物，通过HS酶PCR扩增获得到上游同源臂和下游同源臂，再以其为模板，通过HS酶重叠PCR获得ΔtynA基因敲除片段，所述基因敲除片段由tynA上游同源臂和tynA下游同源臂组成。
②以tynA-pGRB-U和tynA-pGRB-D为一组引物，通过PCR退火程序构建pGRB-tynA使用的含靶序列的DNA片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pGRB-tynA；
③将步骤①、②中得到的ΔtynA基因敲除片段与pGRB-tynA质粒电转进入E.coliW3110菌株中，经过筛选获得阳性转化子，并命名为DA-01。
（2）敲除tyrR基因：具有（1）中相同的操作方法，不同之处在于，所用引物为tyrR-U-S、tyrR-U-A、tyrR-D-S、tyrR-D-A、tyrR-pGRB-U、tyrR-pGRB-D。感受态细胞为DA-01，获得菌株DA-02。
（3）敲除pykF基因：具有（1）中相同的操作方法，不同之处在于，所用引物为pykF-U-S、pykF-U-A、pykF-D-S、pykF-D-A、pykF-pGRB-U、pykF-pGRB-D。感受态细胞为DA-02，获得菌株DA-03。
（4）在ygaY基因位点使用trc启动子控制aroGfbr基因过表达：
①以大肠杆菌W3110基因组为模板，分别以ygaY-U-S、ygaY-U-A、ygaY-D-S、ygaY-D-A与ygaY-aroGfbr-UP、ygaY-aroGfbr-DN为引物，通过HS酶PCR扩增获得到上游同源臂、下游同源臂、与目的基因片段，再以其为模板，通过HS酶重叠PCR获得trc-ygaY-aroGfbr基因整合片段，所述基因整合片段由ygaY上游同源臂、trc-ygaY-aroGfbr目的基因和ygaY下游同源臂组成。
②以ygaY-pGRB-U和ygaY-pGRB-D为一组引物，通过PCR退火程序构建pGRB-ygaY使用的含靶序列的DNA片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pGRB-ygaY。
③将步骤①、②中得到的trc-ygaY-aroGfbr基因整合片段与pGRB-ygaY质粒电转进入DA-03菌株中，经过筛选获得阳性转化子，并命名为DA-04。
在ycgh基因位点使用trc启动子控制aroE基因过表达：具有（4）中相同的操作方法，不同之处在于，所用引物为ycgh-U-S、ycgh-U-A、ycgh-D-S、ycgh-D-A、ycgh-aroE-UP、ycgh-aroE-DN、ycgh-pGRB-U、ycgh-pGRB-D。感受态细胞为DA-04，获得菌株DA-05。
在yeeP基因位点使用trc启动子控制tyrAfbr基因过表达：具有（4）中相同的操作方法，不同之处在于，所用引物为yeeP-U-S、yeeP-U-A、yeeP-D-S、yeeP-D-A、yeeP-tyrAfbr-UP、yeeP-tyrAfbr-DN、yeeP-pGRB-U、yeeP-pGRB-D。感受态细胞为DA-05，获得菌株DA-06。
在yeeL基因位点使用trc启动子控制tyrB基因过表达：具有（4）中相同的操作方法，不同之处在于，所用引物为yeeL-U-S、yeeL-U-A、yeeL-D-S、yeeL-D-A、yeeL-tyrB-UP、yeeL-tyrB-DN、yeeL-pGRB-U、yeeL-pGRB-D。感受态细胞为DA-06，获得菌株DA-07。
在Yjip基因位点使用trc启动子控制aroP基因过表达：具有（4）中相同的操作方法，不同之处在于，所用引物为Yjip-U-S、Yjip-U-A、Yjip-D-S、Yjip-D-A、Yjip-aroP-UP、Yjip-aroP-DN、Yjip-pGRB-U、Yjip-pGRB-D。感受态细胞为DA-07，获得菌株DA-08。
在rph基因位点使用trc启动子控制pdxJ基因过表达：具有（4）中相同的操作方法，不同之处在于，所用引物为rph-U-S、rph-U-A、rph-D-S、rph-D-A、rph-pdxJ-UP、rph-pdxJ-DN、rph-pGRB-U、rph-pGRB-D。感受态细胞为DA-08，获得菌株DA-09。
在yciQ基因位点使用trc启动子控制pdxH基因过表达：具有（4）中相同的操作方法，不同之处在于，所用引物为yciQ-U-S、yciQ-U-A、yciQ-D-S、yciQ-D-A、yciQ-pdxH-UP、yciQ-pdxH-DN、yciQ-pGRB-U、yciQ-pGRB-D。感受态细胞为DA-09，获得菌株DA-10。
在yjgX基因位点使用trc启动子控制cg0898基因过表达：具有（4）中相同的操作方法，不同之处在于，所用引物为yjgX-U-S、yjgX-U-A、yjgX-D-S、yjgX-D-A、yjgX-cg0898-UP、yjgX-cg0898-DN、yjgX-pGRB-U、yjgX-pGRB-D。感受态细胞为DA-10，获得菌株DA-11。
在ylbE基因位点使用trc启动子控制hpaBC基因过表达：具有（4）中相同的操作方法，不同之处在于，使用红沙雷氏菌（Serratia rubidaea）基因组为模板，获得目的基因片段，所用引物为ylbE-U-S、ylbE-U-A、ylbE-D-S、ylbE-D-A、ylbE-hpaBC-UP、ylbE-hpaBC-DN、ylbE-pGRB-U、ylbE-pGRB-D。感受态细胞为DA-11，获得菌株DA-12。
在ycdN基因位点使用trc启动子控制hpaBC基因双拷贝表达：具有（12）中相同的操作方法，不用之处在于，所用引物为ycdN-U-S、ycdN-U-A、ycdN-D-S、ycdN-D-A、ycdN-hpaBC-UP、ycdN-hpaBC-DN、ycdN-pGRB-U、ycdN-pGRB-D。感受态细胞为DA-12，获得菌株DA-13。
转化质粒PET-DA02得到工程菌DA-14：将完整质粒PET-DA02转化进入DA-13感受态细胞中，转化方法为电转化（也可以是化学转化等方法）得到菌株DA-14。
实施例2
本实施例旨在说明构建可以表达多巴脱羧酶（DmDDC）的PET-DA02质粒的步骤。
如图2所示，具体步骤如下：
①敲除lacI基因：以PET28a(+)质粒基因组为模板，以Q-lac-S和Q-lac-A为引物，通过HS酶PCR反向扩增获得到DNA片段，此时lacI基因已被敲除，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒PET-DA01。
②以果蝇（Drosophila melanogaster）基因组为模板，以Dmddc-up和Dmddc-dn为引物，通过HS酶PCR扩增获得到目的基因片段。
③以BamHⅠ和Hind Ⅲ为限制性酶切位点，酶切PET-DA01质粒，利用重组酶连接线性化载体与DmDdc目的基因片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒PET-DA02。
将步骤③中得到的PET-DA02质粒电转进入菌株DA-13中，经过筛选获得阳性转化子即为菌株DA-14。
实施例3
本实施例旨在说明实施例1所述菌株DA-14在5 L机械搅拌式发酵罐中的发酵步骤，具体步骤如下：
①斜面培养：取多巴胺生产菌株接种在斜面培养基上，32℃培养15h，斜面培养基选用通用LB固体培养基；
②种子培养：使用5 L机械搅拌式发酵罐，培养温度为37℃，通过自动流加25%氨水溶液维持培养pH在7.0±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30%，当OD600nm为15时达到接种要求，采用的种子培养基为：葡萄糖20 g/L，酵母3 g/L，蛋白胨1 g/L，(NH4)2SO41 g/L，K2HPO4·3H2O 2 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，柠檬酸1.5 g/L，谷氨酸3g/L，蛋氨酸0.5 g/L，FeSO4·7H2O 10 mg/L，MgSO4·7H2O 10 mg/L，其余为水。
③发酵培养：使用5 L机械搅拌式发酵罐，发酵接种量为20%，培养温度为37℃，通过自动流加25%氨水溶液维持培养pH在7.0±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30%，通过流加80%葡萄糖溶液将罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5 g/L，发酵周期为48h，采用的发酵培养基为：酵母粉3.5 g/L，蛋白胨1 g/L，(NH4)2SO42 g/L，K2HPO4·3H2O 2 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，谷氨酸2 g/L，蛋氨酸0.5 g/L，柠檬酸3g/L，MnSO4·7H2O 10 mg/L，FeSO4·7H2O 30 mg/L，其余为水。
以野生型E.coli W3110为对照组，经过48h发酵验证，野生型E.coli W3110未能积累多巴胺，实施例1所述菌株DA-14积累了39.28g/L多巴胺，证明了该菌株的有效性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行的菌种改造等改进和润饰均视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种质粒，其特征在于：为质粒PET-DA02，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.18所示。
2.一种多巴胺生产菌株，其特征在于：为多巴胺基因工程菌DA-14，是在E.coli W3110的基础上进行代谢工程改造获得的，缺失了tynA、tyrR、pykF基因，上调了aroGfbr、aroE、tyrAfbr、tyrB、aroP、pdxJ、pdxH基因，异源表达了来源于Corynebacterium glutamicum 的cg0898基因以及Serratia rubidaea的hpaBC基因，同时携带了权利要求1所述质粒PET-DA02，所述质粒PET-DA02异源表达了来源于Drosophila melanogaster的DmDdc基因。
3.根据权利要求2所述的多巴胺生产菌株，其特征在于：以E.coli W3110作为底盘菌株，敲除了菌株基因组上的tynA、tyrR、pykF基因；利用trc启动子强化来源于aroGfbr基因转录，并整合到基因组ygaY基因位点；利用trc启动子强化aroE基因转录强度，并整合到基因组ycgh基因位点；利用trc启动子强化tyrAfbr基因转录强度，并整合到基因组yeeP基因位点；利用trc启动子强化tyrB基因转录强度，并整合到基因组yeeL基因位点；利用trc启动子强化aroP基因转录强度，并整合到基因组yjiP基因位点；利用trc启动子强化pdxJ基因转录强度，并整合到基因组rph基因位点；利用trc启动子强化pdxH基因转录强度，并整合到基因组yciQ基因位点；利用trc启动子强化cg0898基因转录强度，并整合到基因组yjgX基因位点；利用trc启动子强化hpaBC基因转录强度，并整合到基因组ylbE基因位点；利用trc启动子强化hpaBC基因转录强度，并整合到基因组ycdN基因位点。
4.根据权利要求2或3所述的多巴胺生产菌株，其特征在于：所述E.coliW3110为E.coliW3110 ATCC 27325。
5.根据权利要求3所述的多巴胺生产菌株，其特征在于：所述trc启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示； tynA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；tyrR基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；pykF基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示；aroGfbr基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；aroE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示；tyrAfbr基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示；tyrB基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示；aroP基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示；pdxJ基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示；pdxH基因的核苷酸序列如序列表SEQID NO.12所示；Cg0898基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.13所示；hpaBC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.14所示。
6.根据权利要求2所述的多巴胺生产菌株，其特征在于：所述质粒PET-DA02携带的终止子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；DmDdc基因的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.16所示。
7.权利要求2-6之一所述多巴胺生产菌株的构建方法，其特征在于：在出发菌株E.coliW3110基础上进行定向改造，具体步骤如下：
(1)底盘菌改造：以E.coli W3110为出发菌株，敲除了tynA、tyrR、pykF基因，上调了aroGfbr、aroE、tyrAfbr、tyrB、aroP基因，异源表达了来源于Serratia rubidaea的hpaBC基因；
（2）优化辅因子供给系统：加强了pdxJ和pdxH基因并异源表达了来源于Corynebacterium glutamicum的cg0898基因；
（3）PET-DA02质粒系统：质粒PET-DA02高效表达来源于Drosophila melanogaster的DmDdc基因，基因选用trc启动子强化转录。
8.权利要求2-6之一所述多巴胺生产菌株在发酵生产多巴胺方面的应用。
9.根据权利要求8所述的多巴胺生产菌株的应用，其特征在于：具体步骤如下：
①斜面培养：取多巴胺生产菌株接种在斜面培养基上，32℃培养12-16h；
②种子培养：使用机械搅拌式发酵罐，培养温度为37℃，通过自动流加氨水溶液维持培养pH在7.0±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30%，当OD600nm为15时达到接种要求；
③发酵培养：使用机械搅拌式发酵罐，发酵接种量为20%，培养温度为37℃，通过自动流加氨水溶液维持培养pH在7.0±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30%，通过流加葡萄糖溶液将罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5 g/L，发酵周期为48 h。
10.根据权利要求9所述的多巴胺生产菌株的应用，其特征在于：所述种子培养中采用的种子培养基为：葡萄糖20 g/L，酵母3 g/L，蛋白胨1 g/L，(NH4)2SO4 1 g/L，K2HPO4·3H2O2 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，柠檬酸1.5 g/L，谷氨酸3g/L，蛋氨酸0.5 g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MgSO4·7H2O 10 mg/L，其余为水；所述发酵培养中采用的发酵培养基为：酵母粉3.5g/L，蛋白胨1 g/L，(NH4)2SO4 2 g/L，K2HPO4·3H2O 2 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，谷氨酸2 g/L，蛋氨酸0.5 g/L，柠檬酸3g/L，MnSO4·7H2O 10 mg/L，FeSO4·7H2O 30 mg/L，其余为水。
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