CN117230098A - 一种左旋多巴生产菌株及其定向改造方法与应用 - Google Patents

一种左旋多巴生产菌株及其定向改造方法与应用 Download PDF

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CN117230098A
CN117230098A CN202311127198.5A CN202311127198A CN117230098A CN 117230098 A CN117230098 A CN 117230098A CN 202311127198 A CN202311127198 A CN 202311127198A CN 117230098 A CN117230098 A CN 117230098A
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Inventor
徐庆阳
李旭
刘韪玮
马零
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Tianjin University of Science and Technology
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Tianjin University of Science and Technology
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Abstract

本发明提供了一种左旋多巴生产菌株的定向改造方法及生产菌株与左旋多巴发酵方法，菌株是通过左旋多巴代谢合成途径改造得到的，左旋多巴生产菌株LDp10能够以葡萄糖为碳源，从头合成左旋多巴，无需添加酪氨酸底物，具有生产速率高，发酵周期短、菌株稳定性高与成本低的优点，为实现左旋多巴的大规模生产奠定基础，通过发酵罐发酵方法利用左旋多巴生产菌株LDp10在机械搅拌式发酵罐中生产左旋多巴，发酵36h生产左旋多巴15g/L，具有良好的工业化前景。

Description

一种左旋多巴生产菌株及其定向改造方法与应用
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，尤其是一种左旋多巴生产菌株及其定向改造方法与应用。
背景技术
左旋多巴(Levodopa)，化学名是3-羟基-L-酪氨酸，是一种白色或类白色结晶性粉末，属于苯丙氨酸类化合物，易溶于稀酸，微溶于水，不溶于乙醇、乙醚或氯仿，无臭，无味，在空气中变黑。是猫豆、黎豆的主要有效活性成分之一，也是目前治疗原发性震颤麻痹症及非药原性震颤麻痹综合症(帕金森氏病)最为常用、有效的药物。据统计，普通人群帕金森病的发病率为0.1％，60岁以上老人的发病率为1％，80岁以上的发病率为2％。随着人口老龄化速度的加快，对左旋多巴的需求将不断增加。
目前，左旋多巴的生产有化学合成、从天然植物中提取以及微生物酶转化法三条主要途径，各条生产途径的概述如下：
化学合成法：1911年人们首次利用3，4-碳酰二氧苯甲醛为原料化学合成多巴，后来人们还利用胡椒醛、香草醛、儿茶酚、酪氨酸来合成L-DOPA。国内还有人用D-麻黄碱拆分N-乙酰-3-(3，4-二甲氧基苯)-DL-丙氨酸来合成L-DOPA。虽用化学法合成多巴的途径有许多，但遇到一个主要的困难是合成出来的产品是D-型和L-型的混合物，将二者分开较为困难，且工艺复杂。由于L-DOPA会引起毒性反应，因此医学上需控制它的旋光度。
从天然植物中中提取的方法：植物中的天然DOPA都是L-型的。1913年就有人从蚕豆籽苗种豆荚中提取天然L-DOPA，1949年从野生植物藜豆中提取L-DOPA。国内于1972年从豆科植物藜豆种子中提取L-DOPA获得成功，1974年商品L-DOPA投放市场。目前主要从猫豆中提取。从植物中提取L-DOPA的缺点是受到原料来源的限制，产量小，质量以及产品收率低，生产成本高，产量不稳定。
微生物酶转化法：90年代初人们开始运用基因工程的手段获取酪氨酸酚解酶(TPL)的基因片段，然后连接到不同的载体中让其在宿主细胞中高效表达。利用微生物酶生物转化法生产左旋多巴，较化学合成、猫豆提取方法，具有生产成本低、工艺相对比较简单等优点，但仍然存在起始原料用量大、原料残留、副产物多且难以去除的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种左旋多巴生产菌株。
本发明所要解决的技术问题在于提供上述左旋多巴生产菌株的定向改造方法。
本发明所要解决的技术问题在于提供上述左旋多巴生产菌株的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种左旋多巴生产菌株的定向改造方法，利用代谢工程手段改造野生型大肠杆菌W3110，对csrA、tyrR、pykF、galP、glk、aroE、tyrAfbr、aroGfbr、tyrB基因的表达强度进行调整，在PETL01质粒的基础上构建可以表达4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因hpaBC的PETL02质粒，其中，在出发菌株E.coli W3110基因组上敲除csrA(碳储存调节因子)基因，使其不表达；继续敲除tyrR(转录调节因子)基因，使其不表达；继续敲除pykF(丙酮酸激酶)基因，使其不表达；在基因组ycdN假基因位点使用BBa_J23101启动子控制galP(半乳糖通透酶)基因过表达；在基因组mbhA假基因位点使用BBa_J23101启动子控制glk(葡萄糖激酶)基因过表达；在基因组ycgh假基因位点使用Ptrc启动子控制aroE(莽草酸脱氢酶)基因过表达；在基因组yeeP假基因位点使用Ptrc启动子控制tyrAfbr(预苯酸脱氢酶)基因过表达；在基因组ygaY假基因位点使用Ptrc启动子控制aroGfbr(DAHP合成酶)基因过表达；在基因组yeeL假基因位点使用Ptrc启动子控制tyrB(芳香族氨基转移酶)基因过表达；PETL01质粒导入hpaBC(4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶)基因。
优选的，上述左旋多巴生产菌株的定向改造方法，所述代谢工程改造方法为CRISPR-Cas9基因编辑技术。
优选的，上述左旋多巴生产菌株的定向改造方法，所述出发菌株为大肠杆菌E.coli W3110，保藏号ATCC 273250。
优选的，上述左旋多巴生产菌株的定向改造方法，其中：
Ptrc启动子具有序列表SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；
BBa_J23101启动子具有序列表SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；
csrA基因，来源于大肠杆菌，具有序列表SEQ ID NO.3所示核苷酸序列；
tyrR基因，来源于大肠杆菌，具有序列表SEQ ID NO.4所示核苷酸序列；
pykF基因，来源于大肠杆菌，具有序列表SEQ ID NO.5所示核苷酸序列；
galP基因，来源于大肠杆菌，具有序列表SEQ ID NO.6所示核苷酸序列；
gl k基因，来源于大肠杆菌，具有序列表SEQ ID NO.7所示核苷酸序列；
aroE基因，来源于大肠杆菌，具有序列表SEQ ID NO.8所示核苷酸序列；
tyrAfbr基因，为大肠杆菌突变后的tyrAfbr基因，具有序列表SEQ ID NO.9所示核苷酸序列，在左旋多巴基因工程菌中使用Ptrc启动子控制tyrAfbr基因过表达，插入位点为yeep假基因位点；
aroGfbr基因，为大肠杆菌突变后的aroGfbr基因，具有序列表SEQ ID NO.10所示核苷酸序列，在左旋多巴基因工程菌中使用Ptrc启动子控制aroGfbr基因过表达，插入位点为ygaY假基因位点；
tyrB基因，来源于大肠杆菌，具有序列表SEQ ID NO.11所示核苷酸序列，在左旋多巴基因工程菌中使用Ptrc启动子控制tyrB基因过表达，插入位点为yeeL假基因位点；
hpaBC基因，来源于E.coliBL21(DE3)，具有序列表SEQ ID NO.12所示核苷酸序列，插入位点为PETL01质粒的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点；
PETL01质粒具PET-28a(+)质粒载体部分特征，并进行了适当修改，去除了LacI基因，该PETL01质粒具有序列表SEQ ID NO.13所示核苷酸序列。
一种左旋多巴生产菌株，是由上述定向改造的方法获得的，其中：
在出发菌株E.coli W3110基因组上敲除csrA基因得到菌株LDp01；
以菌株LDp01为出发菌株，在其基因组上敲除tyrR基因得到菌株LDp02；
以菌株LDp02为出发菌株，在其基因组上敲除pykF基因得到菌株LDp03；
以菌株LDp03为出发菌株，在ycdn假基因位点使用BBa_J23101启动子控制galP基因过表达得到菌株LDp04；
以菌株LDp04为出发菌株，在mbhA假基因位点使用BBa_J23101启动子控制glk基因过表达得到菌株LDp05；
以菌株LDp05为出发菌株，在ycgh假基因位点使用Ptrc启动子控制aroE基因过表达得到菌株LDp06；
以菌株LDp06为出发菌株，在yeeP假基因位点使用Ptrc启动子控制tyrAfbr基因过表达得到菌株LDp07；
以菌株LDp07为出发菌株，在ygaY假基因位点使用Ptrc启动子控制aroGfbr基因过表达得到菌株LDp08；
以菌株LDp08为出发菌株，在yeeL假基因位点使用Ptrc启动子控制tyrB基因过表达得到菌株LDp09；
利用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切PETL01质粒，将线性载体与hpaBC基因连接，得到PETL02质粒；
将PETL02质粒转入菌株LDp09中，得到菌株LDp10，LDp10即为改造成功后的目的菌。
上述左旋多巴生产菌株在生产左旋多巴方面的应用。
优选的，上述左旋多巴生产菌株的应用，是利用发酵方法生产左旋多巴。
优选的，上述左旋多巴生产菌株的应用，发酵罐发酵培养的具体步骤如下：
(1)菌种活化：将菌株从甘油管接至斜面培养基活化培养12h后，接至茄形瓶培养基中继续活化扩大培养10h，培养温度为37℃；
(2)种子培养：将200mL无菌水于超净台火焰附近倒入上述茄形瓶中，使用接种环将菌落刮至无菌水中并打散制备菌悬液，在发酵罐火圈旁将菌悬液接种入发酵种子培养罐中，进行菌种扩大培养；培养温度为37℃，通过自动流加25％氨水溶液维持培养pH在7.0±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为50％，当OD600nm为15时达到接种要求；
(3)发酵培养：接种量为20％，培养温度为37℃，通过自动流加25％氨水溶液维持培养pH在7.0±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为50％，通过流加80％葡萄糖溶液将罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5g/L，发酵周期≤36h。
优选的，上述左旋多巴生产菌株的应用，所述菌株可利用葡萄糖作为底物，高效稳定的从头合成左旋多巴。
优选的，上述左旋多巴生产菌株的应用，所述种子培养中采用的种子培养基为：葡萄糖20g/L，酵母3g/L，蛋白胨1g/L，(NH4)2SO4 1g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，柠檬酸1.5g/L，谷氨酸3g/L，蛋氨酸6g/L，FeSO4·7H2O10mg/L，MgSO4·7H2O 10mg/L，其余为水。
优选的，上述左旋多巴生产菌株的应用，所述发酵培养中采用的发酵培养基为：酵母粉3.5g/L，蛋白胨1g/L，(NH4)2SO4 2g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，谷氨酸2g/L，蛋氨酸0.5g/L，柠檬酸3g/L，MnSO4·7H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O 30mg/L，其余为水。
上述培养基均可采用标准方法制备获得。
有益效果：
上述左旋多巴生产菌株，是通过左旋多巴代谢合成途径改造得到的，左旋多巴生产菌株LDp10以葡萄糖为碳源，无需添加酪氨酸底物，生产成本低，具有生产速率高，发酵周期短，菌株稳定性高的优点，具有很高的经济效益，为实现左旋多巴的大规模生产奠定基础，发酵罐发酵方法利用左旋多巴生产菌株LDp10在机械搅拌式发酵罐中生产左旋多巴，发酵36h时生产左旋多巴15g/L，具有良好的工业化前景。
附图说明
图1为左旋多巴基因工程菌左旋多巴从头合成途径改造过程图。
图2为菌株LDp10发酵生产左旋多巴的产量图。
图3为发酵样品左旋多巴的HPLC色谱图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100mL中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。
实施例中所用的出发菌株为大肠杆菌E.coli W3110，保藏号ATCC 273250，可从天津科技大学代谢工程实验室获得。
实施例1
1.基因编辑的方法
采用的基因编辑方法参照文献(Li Y，Lin Z，Huang C，et al.Metabolicengineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9 meditated genomeediting.Metabolic Engineering，2015，31：13-21.)。该方法涉及的工程质粒pREDCas9、pGRB，其中pREDCas9携带gRNA表达质粒pGRB的消除系统、λ噬菌体的Red重组系统、Cas9蛋白表达系统以及奇霉素抗性(工作浓度：100mg/L)；pGRB以pUC18为骨架，包括启动子J23100、gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列以及氨节青霉素抗性(工作浓度：100mg/L)。下列实施例中涉及到的专业名词均可在该文章中解释。
2.菌株构建过程中用到的引物见表1。
表1菌株构建过程中所涉及的引物
实施例2
本实施例旨在说明敲除基因组csrA基因的步骤。
具体步骤如下：
①以大肠杆菌W3110基因组为模板，分别以csrA-U-S、csrA-U-A与csrA-D-S、csrA-D-A为引物，通过HS酶PCR扩增获得到上游同源臂和下游同源臂，再以其为模板，通过HS酶重叠PCR获得ΔcsrA基因敲除片段，所述基因敲除片段由csrA上游同源臂和csrA下游同源臂组成。
②以csrA-pGRB-U和csrA-pGRB-D为一组引物，通过PCR退火程序构建pGRB-csrA使用的含靶序列的DNA片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pGRB-csrA；
③将步骤①、②中得到的ΔcsrA基因敲除片段与pGRB-csrA质粒电转进入E.coliW3110菌株中，经过筛选获得阳性转化子，并命名为LDp01。
实施例3
本实施例旨在说明敲除基因组tyrR基因的步骤。
具体步骤如下：
①以LDp01基因组为模板，分别以tyrR-U-S、tyrR-U-A与tyrR-D-S、tyrR-D-A为引物，通过HS酶PCR扩增获得到上游同源臂和下游同源臂，再以其为模板，通过HS酶重叠PCR获得ΔtyrR基因敲除片段，所述基因敲除片段由tyrR上游同源臂和tyrR下游同源臂组成。
②以tyrR-pGRB-U和tyrR-pGRB-D为一组引物，通过PCR退火程序构建pGRB-tyrR使用的含靶序列的DNA片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pGRB-tyrR；
③将步骤①、②中得到的ΔtyrR基因敲除片段与pGRB-tyrR质粒电转入LDp01菌株中，经过筛选获得阳性转化子，并命名为LDp02。
实施例4
本实施例旨在说明敲除基因组pykF基因的步骤。
具体步骤如下：
①以LDp02基因组为模板，分别以pykF-U-S、pykF-U-A、pykF-D-S、pykF-D-A为引物，通过HS酶PCR扩增获得到上游同源臂和下游同源臂片段，再以其为模板，通过HS酶重叠PCR获得ΔpykF基因敲除片段，所述基因敲除片段由pykF上游同源臂和pykF下游同源臂组成。
②以pykF-pGRB-U和pykF-pGRB-D为一组引物，通过PCR退火程序构建pGRB-pykF使用的含靶序列的DNA片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pGRB-pykF；
③将步骤①、②中得到的ΔpykF基因敲除片段与pGRB-pykF质粒电转入LDp02菌株中，经过筛选获得阳性转化子，并命名为LDp03。
实施例5
本实施例旨在说明在ycdn假基因位点使用BBa_J23101启动子控制galP基因过表达的步骤。
具体步骤如下：
①以LDp03基因组为模板，分别以ycdn-U-S、ycdn-U-A、ycdn-D-S、ycdn-D-A与ycdn-galP-UP、ycdn-galP-DN为引物，通过HS酶PCR扩增获得到上游同源臂、下游同源臂、与目的基因片段，再以其为模板，通过HS酶重叠PCR获得BBa_J23101-ycdn-galP基因整合片段，所述基因整合片段由ycdn上游同源臂、BBa_J23101-galP目的基因和ycdn下游同源臂组成。
②以ycdn-pGRB-U和ycdn-pGRB-D为一组引物，通过PCR退火程序构建pGRB-ycdn使用的含靶序列的DNA片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pGRB-ycdn。
③将步骤①、②中得到的BBa_J23101-ycdn-galP基因整合片段与pGRB-ycdn质粒电转进入LDp03菌株中，经过筛选获得阳性转化子，并命名为LDp04。
实施例6
本实施例旨在说明在mbhA假基因位点使用BBa_J23101启动子控制glk基因过表达的步骤。
具体步骤如下：
①以LDp04基因组为模板，分别以mbhA-U-S、mbhA-U-A、mbhA-D-S、mbhA-D-A与mbhA-glk-UP、mbhA-glk-DN为引物，通过HS酶PCR扩增获得到上游同源臂、下游同源臂、与目的基因片段，再以其为模板，通过HS酶重叠PCR获得BBa_J23101-mbhA-glk基因整合片段，所述基因整合片段由mbhA上游同源臂、BBa_J23101-glk目的基因和mbhA下游同源臂组成。
②以mbhA-pGRB-U和mbhA-pGRB-D为一组引物，通过PCR退火程序构建pGRB-mbhA使用的含靶序列的DNA片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pGRB-mbhA。
③将步骤①、②中得到的BBa_J23101-mbhA-glk基因整合片段与pGRB-mbhA质粒电转进入LDp04菌株中，经过筛选获得阳性转化子，并命名为LDp05。
实施例7
本实施例旨在说明在ycgh假基因位点使用Ptrc启动子控制aroE基因过表达的步骤。
具体步骤如下：
①以LDp05基因组为模板，分别以ycgh-U-S、ycgh-U-A、ycgh-D-S、ycgh-D-A与ycgh-aroE-UP、ycgh-aroE-DN为引物，通过HS酶PCR扩增获得到上游同源臂、下游同源臂、与目的基因片段，再以其为模板，通过HS酶重叠PCR获得Ptrc-ycgh-aroE基因整合片段，所述基因整合片段由ycgh上游同源臂、Ptrc-ycgh-aroE目的基因和ycgh下游同源臂组成。
②以ycgh-pGRB-U和ycgh-pGRB-D为一组引物，通过PCR退火程序构建pGRB-ycgh使用的含靶序列的DNA片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pGRB-ycgh。
③将步骤①、②中得到的Ptrc-ycdn-aroE基因整合片段与pGRB-ycgh质粒电转进入LDp05菌株中，经过筛选获得阳性转化子，并命名为LDp06。
实施例8
本实施例旨在说明在yeeP假基因位点使用Ptrc启动子控制tyrAfbr基因过表达的步骤。
具体步骤如下：
①以LDp06基因组为模板，分别以yeeP-U-S、yeeP-U-A、yeeP-D-S、yeeP-D-A与yeeP-tyrAfbr-UP、yeeP-tyrAfbr-DN为引物，通过HS酶PCR扩增获得到上游同源臂、下游同源臂、与目的基因片段，再以其为模板，通过HS酶重叠PCR获得Ptrc-yeeP-tyrAfbr基因整合片段，所述基因整合片段由yeeP上游同源臂、Ptrc-yeeP-tyrAfbr目的基因和yeeP下游同源臂组成。
②以yeeP-pGRB-U和yeeP-pGRB-D为一组引物，通过PCR退火程序构建pGRB-yeeP使用的含靶序列的DNA片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pGRB-yeeP。
③将步骤①、②中得到的Ptrc-yeeP-tyrAfbr基因整合片段与pGRB-yeeP质粒电转进入LDp06菌株中，经过筛选获得阳性转化子，并命名为LDp07。
实施例9
本实施例旨在说明在ygaY假基因位点使用Ptrc启动子控制aroGfbr基因过表达的步骤。
具体步骤如下：
①以LDp07基因组为模板，分别以ygaY-U-S、ygaY-U-A、ygaY-D-S、ygaY-D-A与ygaY-aroGfbr-UP、ygaY-aroGfbr-DN为引物，通过HS酶PCR扩增获得到上游同源臂、下游同源臂、与目的基因片段，再以其为模板，通过HS酶重叠PCR获得Ptrc-ygaY-aroGfbr基因整合片段，所述基因整合片段由ygaY上游同源臂、Ptrc-ygaY-aroGfbr目的基因和ygaY下游同源臂组成。
②以ygaY-pGRB-U和ygaY-pGRB-D为一组引物，通过PCR退火程序构建pGRB-ygaY使用的含靶序列的DNA片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pGRB-ygaY。
③将步骤①、②中得到的Ptrc-ygaY-aroGfbr基因整合片段与pGRB-ygaY质粒电转进入LDp07菌株中，经过筛选获得阳性转化子，并命名为LDp08。
实施例10
本实施例旨在说明在yeeL假基因位点使用Ptrc启动子控制tyrB基因过表达的步骤。
具体步骤如下：
①以LDp08基因组为模板，分别以yeeL-U-S、yeeL-U-A、yeeL-D-S、yeeL-D-A与yeeL-tyrB-UP、yeeL-tyrB-DN为引物，通过HS酶PCR扩增获得到上游同源臂、下游同源臂、与目的基因片段，再以其为模板，通过HS酶重叠PCR获得Ptrc-yeeL-tyrB基因整合片段，所述基因整合片段由yeeL上游同源臂、Ptrc-yeeL-tyrB目的基因和yeeL下游同源臂组成。
②以yeeL-pGRB-U和yeeL-pGRB-D为一组引物，通过PCR退火程序构建pGRB-yeeL使用的含靶序列的DNA片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pGRB-yeeL。
③将步骤①、②中得到的Ptrc-yeeL-tyrB基因整合片段与pGRB-yeeL质粒电转进入LDp08菌株中，经过筛选获得阳性转化子，并命名为LDp09。
实施例10
本实施例旨在说明构建可以表达4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因hpaBC的PETL02质粒的步骤，构建目的菌株LDp10。
具体步骤如下：
①以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，以hpaBC-BH-UP和hpaBC-DOWN为引物，通过HS酶PCR扩增获得到目的基因片段。
②以PET28a(+)质粒基因组为模板，以Q-lac-S和Q-lac-A为引物，通过HS酶PCR扩增获得到DNA片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒PETL01。
③以BamHⅠ和HindⅢ为限制性酶切位点，酶切PETL01质粒，利用重组酶连接线性化载体与hpaBC目的基因片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒PETL02。
④将步骤③中得到的PETL02质粒电转进入LDp09菌株中，经过筛选获得阳性转化子，并命名为LDp10。
实施例11
以LDp10为生产菌株，本实施例旨在说明实施例10所述菌株LDp10在左旋多巴生产中的应用，具体培养方法如下：
(1)菌种活化：将菌株从甘油管接至斜面培养基活化培养12h后，接至茄形瓶培养基中继续活化扩大培养10h，培养温度为37℃；
(2)种子培养：将200mL无菌水于超净台火焰附近倒入上述茄形瓶中，使用接种环将菌落刮至无菌水中并打散制备菌悬液，在发酵罐火圈旁将菌悬液接种入发酵种子培养罐中，进行菌种扩大培养，其中，所用种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母3g/L，蛋白胨1g/L，(NH4)2SO4 1g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，柠檬酸1.5g/L，谷氨酸3g/L，蛋氨酸6g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MgSO4·7H2O10 mg/L；培养温度为37℃，通过自动流加25％氨水溶液维持培养pH在7.0±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为50％，当OD600nm为15时达到接种要求；
(3)发酵培养：接种量为20％，培养温度为37℃，所用发酵培养基：发酵培养基：酵母粉3.5g/L，蛋白胨1g/L，(NH4)2SO4 2g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，谷氨酸2g/L，蛋氨酸0.5g/L，柠檬酸3g/L，MnSO4·7H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O 30mg/L，通过自动流加25％氨水溶液维持培养pH在7.0±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为50％，通过流加80％葡萄糖溶液将罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5g/L，发酵周期≤36h，如图2所示，发酵36h时生产左旋多巴15g/L。
实施例12
本实施例旨在说明实施例11中发酵样品的HPLC检测方法与条件
发酵样品的处理：发酵液样品利用0.1mM的HCl稀释至待测范围(产物浓度：0.1-1g/L)后，13000r/min离心2min，用0.22μm水系滤膜过滤处除去大分子杂质。
检测仪器：LC-100液相色谱仪(UV100 Plus紫外检测器)；色谱柱：Agilent C18高效液相色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；
检测条件：流动相甲醇-磷酸盐，流速1mL/min，柱温30℃，上样量20μL，检测波长280nm，色谱分析报告如图3所示。
检测结果：标准品左旋多巴HPLC出峰时间：2.967min；
经比对同一浓度下发酵液样品与左旋多巴标品的紫外吸收峰，可计算出产物的纯度约为96.7％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，本发明菌株的构建步骤不分先后顺序，本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行的菌种改造等改进和润饰均视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种左旋多巴生产菌株的定向改造方法，其特征在于：利用代谢工程手段改造野生型大肠杆菌W3110，对csrA、tyrR、pykF、galP、glk、aroE、tyrAfbr、aroGfbr、tyrB基因的表达强度进行调整，在PETL01质粒的基础上构建可以表达4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因hpaBC的PETL02质粒，其中，在出发菌株E.coli W3110基因组上敲除csrA基因，使其不表达；继续敲除tyrR基因，使其不表达；继续敲除pykF基因，使其不表达；在基因组ycdN假基因位点使用BBa_J23101启动子控制galP基因过表达；在基因组mbhA假基因位点使用BBa_J23101启动子控制glk基因过表达；在基因组ycgh假基因位点使用Ptrc启动子控制aroE基因过表达；在基因组yeeP假基因位点使用Ptrc启动子控制tyrAfbr基因过表达；在基因组ygaY假基因位点使用Ptrc启动子控制aroGfbr基因过表达；在基因组yeeL假基因位点使用Ptrc启动子控制tyrB基因过表达；PETL01质粒导入hpaBC基因。
2.根据权利要求1所述的左旋多巴生产菌株的定向改造方法，所述出发菌株为大肠杆菌E.coli W3110，保藏号ATCC 273250；Ptrc启动子具有序列表SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；BBa_J23101启动子具有序列表SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；csrA基因具有序列表SEQID NO.3所示核苷酸序列；tyrR基因具有序列表SEQ ID NO.4所示核苷酸序列；pykF基因具有序列表SEQ ID NO.5所示核苷酸序列；galP基因具有序列表SEQ ID NO.6所示核苷酸序列；glk基因具有序列表SEQ ID NO.7所示核苷酸序列；aroE基因具有序列表SEQ ID NO.8所示核苷酸序列；tyrAfbr基因具有序列表SEQ ID NO.9所示核苷酸序列；aroGfbr基因具有序列表SEQ ID NO.10所示核苷酸序列；tyrB基因具有序列表SEQ ID NO.11所示核苷酸序列；hpaBC基因具有序列表SEQ ID NO.12所示核苷酸序列；PETL01质粒具有序列表SEQ IDNO.13所示核苷酸序列。
3.一种左旋多巴生产菌株，其特征在于：是由权利要求1或2所述方法获得的，其中：
菌株LDp01，是在出发菌株E.coli W3110基因组上敲除csrA基因得到的；
菌株LDp02，是以菌株LDp01为出发菌株，在其基因组上敲除tyrR基因得到的；
菌株LDp03，是以菌株LDp02为出发菌株，在其基因组上敲除pykF基因得到的；
菌株LDp04，是以菌株LDp03为出发菌株，在ycdn假基因位点使用BBa_J23101启动子控制galP基因过表达得到的；
菌株LDp05，是以菌株LDp04为出发菌株，在mbhA假基因位点使用BBa_J23101启动子控制glk基因过表达得到的；
菌株LDp06，是以菌株LDp05为出发菌株，在ycgh假基因位点使用Ptrc启动子控制aroE基因过表达得到的；
菌株LDp07，是以菌株LDp06为出发菌株，在yeeP假基因位点使用Ptrc启动子控制tyrAfbr基因过表达得到的；
菌株LDp08，是以菌株LDp07为出发菌株，在ygaY假基因位点使用Ptrc启动子控制aroGfbr基因过表达得到的；
菌株LDp09，是以菌株LDp08为出发菌株，在yeeL假基因位点使用Ptrc启动子控制tyrB基因过表达得到的；
菌株LDp10，是将PETL02质粒转入菌株LDp09中得到的改造成功后的目的菌，所述PETL02质粒是利用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切PETL01质粒，将线性载体与hpaBC基因连接得到的。
4.权利要求3所述左旋多巴生产菌株在生产左旋多巴方面的应用。
5.根据权利要求4所述的左旋多巴生产菌株的应用，其特征在于：是利用发酵方法生产左旋多巴。
6.根据权利要求5所述的左旋多巴生产菌株的应用，其特征在于：发酵罐发酵培养的具体步骤如下：
(1)菌种活化：将菌株从甘油管接至斜面培养基活化培养12h后，接至茄形瓶培养基中继续活化扩大培养10h，培养温度为37℃；
(2)种子培养：将无菌水于超净台火焰附近倒入上述茄形瓶中，使用接种环将菌落刮至无菌水中并打散制备菌悬液，在发酵罐火圈旁将菌悬液接种入发酵种子培养罐中，进行菌种扩大培养；培养温度为37℃，通过自动流加25％氨水溶液维持培养pH在7.0±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为50％，当OD600nm为15时达到接种要求；
(3)发酵培养：接种量为20％，培养温度为37℃，通过自动流加25％氨水溶液维持培养pH在7.0±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为50％，通过流加80％葡萄糖溶液将罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5g/L。
7.根据权利要求6所述的左旋多巴生产菌株的应用，其特征在于：所述种子培养中采用的种子培养基为：葡萄糖20g/L，酵母3g/L，蛋白胨1g/L，(NH4)2SO41g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，柠檬酸1.5g/L，谷氨酸3g/L，蛋氨酸6g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MgSO4·7H2O 10mg/L，其余为水。
8.根据权利要求6所述的左旋多巴生产菌株的应用，其特征在于：所述发酵培养中采用的发酵培养基为：酵母粉3.5g/L，蛋白胨1g/L，(NH4)2SO4 2g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，谷氨酸2g/L，蛋氨酸0.5g/L，柠檬酸3g/L，MnSO4·7H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O30mg/L，其余为水。
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