CN105431531B - 产l-苏氨酸微生物和使用该微生物生产l-苏氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及产L‑苏氨酸微生物和使用该微生物生产L‑苏氨酸的方法，特别是，涉及L‑苏氨酸生产力增强的微生物和使用该微生物以高产量生产L‑苏氨酸的方法。

Description

产L-苏氨酸微生物和使用该微生物生产L-苏氨酸的方法
技术领域
本发明涉及RNA聚合酶σ32因子变体，并且涉及使用该微生物生产L-苏氨酸的方法。
背景技术
L-苏氨酸，是一种必需氨基酸，被广泛用作动物饲料和食品的添加剂，并且被有效用作医药和制药用再水化溶液和合成材料。
L-苏氨酸主要通过使用人工突变方法或基因重组方法开发的大肠杆菌(Escherichia coli)或棒状杆菌(Corynebacterium)发酵生产。源自野生型菌株(包括大肠杆菌(Escherichia coil)、沙雷菌(Serratia)、普罗威登斯菌(Providencia)或棒状杆菌)的人工突变菌株被广泛用于生产L-苏氨酸。
随着基因重组技术的发展，通过随机突变操纵具有L-苏氨酸生产力的菌株的技术已经被报道为用于提高L-苏氨酸生产力的位点特异性基因置换、基因扩增与缺失等。已开发了与苏氨酸的生物合成有关的基因和用于增加这些基因表达的各种方法。但是仍然需要能够以高产量生产L-苏氨酸的方法。
全局转录机器的功能是控制所有细胞系统(原核的和真核的)的转录。全局转录机器工程通过突变编码全局性调控因子的核酸或控制其表达的启动子而提供包含特性改进的全局性调控因子的重组细胞，并且可通过该方法生产表型改进的细胞。
σ因子为一类基于RNA聚合酶全酶的启动子偏好在调控全局转录中发挥重要作用的全局性调控因子。σ因子是能使RNA聚合酶特异性结合到基因启动子的原核生物的转录起始因子。每个σ因子响应不同的环境条件而激活，并且每个RNA聚合酶分子都包含一个σ因子亚基。众所周知，大肠杆菌(E.coli)具有至少8个σ因子，并且σ因子的数量变化取决于细菌种类。
为了进一步增强具有L-苏氨酸生产力的大肠杆菌菌株的耐高温压力，本发明人已经进行了研究以修饰编码已知控制热激应答的σ32的rpoH基因。因此，本发明人已经研发了调控转录机制的RNA聚合酶σ32因子变体，使得苏氨酸生产力即使在高温下也没有极大降低，并且已经将RNA聚合酶σ32因子变体引入到产苏氨酸菌株中，从而完成本申请。
发明内容
技术问题
本申请的目的是提供RNA聚合酶σ32因子变体。
本申请的另一个目的是提供编码RNA聚合酶σ32因子变体的核苷酸序列。
本申请的又另一个目的是提供包含所述核苷酸序列的载体。
本申请的又另一个目的是提供具有L-苏氨酸生产力的埃希氏杆菌属(Escherichia)的重组微生物，其表达所述变体。
本申请的又另一个目的是提供使用所述埃希氏杆菌属的微生物生产L-苏氨酸的方法。
技术方案
为了完成上述目的，本申请提供了具有SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的RNA聚合酶σ32因子变体。
本申请也提供了编码RNA聚合酶σ32因子变体的核苷酸序列。
本申请也提供了具有L-苏氨酸生产力的埃希氏杆菌属的重组微生物，其表达所述变体。
本申请也提供了使用所述埃希氏杆菌属的微生物生产L-苏氨酸的方法。
有益效果
根据本申请，用包含编码耐高温应激的RNA聚合酶σ32因子变体的核苷酸序列的载体转化的菌株具有耐温性并且也可以增加的产量生产L-苏氨酸。因此，与常规菌株相比，即使当在高温下培养时，它可以显著高的生产力生产苏氨酸。因此，它能被有效用于以高产量生产苏氨酸。
发明详述
下文将详细描述本申请。
本申请提供了具有SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的RNA聚合酶σ32因子变体。
本文所用的术语“σ32(σ32)因子”指的是称为主要σ因子的全局性调控σ因子，其在对数期控制热激应答并且由rpoH基因编码。
此外，与本申请变体的氨基酸序列具有至少80％，特别是至少90％，更特别是至少95％，并且尤其特别是至少99％同源性的变体也包括在本申请的范围内。通过利用，例如Karlin和Altschul的BLAST算法(参见Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))或FASTA(参见Methods Enzymol.,183,63(1990))可以测定氨基酸序列的同源性。已经在该BLAST算法(参见www.ncbi.nlm.nih.gov)的基础上开发了称为BLASTN和BLASTX的程序。本申请的变体的范围包括与所述变体的氨基酸序列相比具有缺失、插入和氨基酸取代等的突变体，并且也包括具有密码子取代的突变体。
在本申请的实施方案中，变体选自通过将随机突变引入野生型大肠杆菌菌株W3110中而获得的突变rpoH DNA库，并且选择的变体命名为rpoH2-G6。分析提取的变体的核苷酸序列，并且结果是，可以看出与野生型RNA聚合酶σ32因子的氨基酸序列(SEQ ID NO:16)相比，在变体的氨基酸序列中发生了突变(实施例3)。
本申请还提供了编码所述变体的核苷酸序列。
在本申请的实施方案中，RNA聚合酶σ32因子变体可特别具有SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
在本申请的实施方案中，编码所述变体的核苷酸序列的遗传密码可以是简并的。在本文中，遗传密码简并性是在遗传密码中最后一个碱基是无意义的现象。如果开始两个碱基是相同的，即使当在该位置的密码子是不同的，它们编码相同。
因此，本申请的变体的核苷酸序列可与SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列具有至少80％，特别是至少90％，更特别是至少95％，最特别是99％的同源性。
本申请也提供了包含所述核苷酸序列的载体。
本申请所用的载体并无特别限制，并且可以是本领域已知的任何载体，只要它可以在宿主中复制即可。通常使用的载体的实例包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，本申请所用的噬菌体载体或粘粒载体可以是pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A、Charon21A等，并且本申请所用的质粒载体可以是pBR类型、pUC类型、pBluescriptII类型、pGEM类型、pTZ类型、pCL类型、pET类型等。本申请所用的载体并无特别限制，并且可以是本领域已知的任何表达载体。具体而言，可以使用pACYC177载体、pACYC184载体、pCL载体、pECCG117载体、pUC19载体、pBR322载体、pMW118载体或pCC1BAC载体。最特别是，可以使用pACYC177载体、pCL载体或pCC1BAC载体。
本申请提供了具有L-苏氨酸生产力的埃希氏杆菌属的重组微生物，其表达所述变体。
在本申请中，所述变体的表达可通过用可操作地包含编码所述变体的基因的重组载体转化或通过将编码所述变体的多核苷酸插入到微生物的染色体中而获得，但是不特别限于此。
本文所用的术语“转化”意思是将包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入到宿主细胞，从而能够在宿主细胞中表达所述多核苷酸编码的蛋白。可以使引入的多核苷酸插入或位于宿主细胞的染色体中或染色体外，只要它能在宿主细胞中表达即可。此外，多核苷酸包括编码靶蛋白的DAN和RNA。只要多核苷酸可以被引入宿主细胞并且可以在其中表达，它就可以以任何形式被引入。例如，可以以包括自我表达所需的所有元素的多核苷酸构建体的表达盒的形式将多核苷酸引入到宿主细胞。表达盒一般包括可操作地连接到基因的可读框(在下文中缩写为“ORF”)的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可以是自我复制表达载体的形式。此外，多核苷酸可以通过自身引入到宿主细胞，并且可操作地连接到在宿主细胞中表达所必需的序列。
在本申请，转化可以通过转导包含编码RNA聚合酶σ32因子变体的核苷酸序列的载体或通过将核苷酸序列插入到微生物的染色体而获得，但是并不特别限于此。
本申请的微生物包括任何原核微生物，只要它能生产L-苏氨酸即可。例如，它可以包括属于埃希氏杆菌属、欧文菌属(Erwinia)、沙雷菌属(Serratia)、普罗威登斯菌属、棒状杆菌属或短杆菌属(Brevibacterium)的微生物。特别是，本申请所用的微生物属于埃希氏杆菌属。特别是，它是大肠杆菌。
在本申请的实施方案中，产苏氨酸菌株可以用作亲本菌株。产苏氨酸菌株可以是具有甲硫氨酸营养缺陷型表型、耐苏氨酸类似物、耐赖氨酸类似物、耐异亮氨酸类似物以及耐甲硫氨酸类似物的大肠杆菌菌株。此外，产苏氨酸菌株可以是通过操纵苏氨酸生物合成基因等而获得的重组大肠杆菌菌株。例如，它可以是引入了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因和包含天冬氨酸激酶L-高丝氨酸脱氢酶(thrA)、高丝氨酸激酶(thrB)和苏氨酸合酶(thrC)的操纵子中各自一个拷贝的重组大肠杆菌菌株。另外，它可以是通过灭活涉及L-苏氨酸降解的操纵子基因(tdcBC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pckA)两者而获得的重组大肠杆菌菌株。
特别是，本申请所用的菌株可以选自大肠杆菌KCCM10541P(韩国专利号10-0576342)，大肠杆菌ABA5G/pAcscBAR'-M,pC-Ptrc-scrAB(韩国专利号10-1145943)和大肠杆菌KCCM11167P(韩国专利特开公开号10-2012-0083795)的菌株。
在本申请的实施方案中，转化的微生物可以是大肠杆菌FTR2700。
在本申请的实施方案中，本申请的微生物可以是具有一种或多种用于增强L-苏氨酸生产力的期望的表型的大肠杆菌菌株。特别是，一种或多种期望的表型是耐温表型。
本申请也提供了使用所述转化的菌株生产L-苏氨酸的方法。
本申请中的培养方法可以在合适的培养基和本领域已知的培养条件下进行。本领域的任何技术人员可以容易地根据所选菌株的类型改良该培养方法。培养方法的实例包括，但不限于分批培养、连续培养和补料分批培养。
用于培养本申请的微生物的培养基和培养条件可以是通常用于培养埃希氏杆菌属微生物的任何一种培养基和培养条件，但是这些培养基和培养条件应当适当满足本申请的微生物的需要。
在具体实施方案中，本申请的微生物可以在有氧条件下在包含合适的碳源、氮源、氨基酸、维生素等的常规培养基中培养，同时调节温度、pH等。
可以用于本申请的碳源包括碳水化合物，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、山梨糖醇；醇，例如糖醇、丙三醇、丙酮酸、乳酸和柠檬酸；和氨基酸，例如有机酸、谷氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸。此外，可以使用天然有机营养源，例如淀粉水解物、糖蜜、赤糖糊、米糠、木薯、甘蔗渣和玉米浆。特别是，可以使用碳水化合物，例如葡萄糖和无菌预处理的糖蜜(即糖蜜转化为还原糖)。此外，在无限制的情况下，可以使用适量的其它碳源。可以用于本申请的氮源包括无机氮源，例如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、碳酸铵和硝酸铵；氨基酸，例如谷氨酸、甲硫氨酸和谷氨酰胺；和有机氮源，例如蛋白胨、NZ-胺、肉提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼粉或其消化产物、脱脂大豆饼或其消化产物等。这些氮源可以单独或组合使用。培养基可以包含作为磷源的磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和相应的含钠盐。可以用于本申请的无机化合物包括氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰和碳酸钙。此外，培养基可以包含氨基酸、维生素和合适的前体。这些来源或前体可以以分批或连续的方式添加到培养基。
可以将化合物，例如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸，在培养期间以合适的方式添加到培养基来调节培养基的pH。此外，在培养期间，可以用消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯抑制泡沫的形成。进一步，为了保持培养基在有氧状态下，可以将氧气或含氧气体注入培养基中。此外，为了保持培养基在厌氧或非有氧状态下，不注入气体，或可以将氮气、氢气或二氧化碳气体注入培养基。培养基可以通常保持在范围为27℃-37℃，并且特别是30℃-37℃的温度。微生物的培养可以持续直到获得期望水平的有用物质。特别是，培养周期可以为10-100h。
本申请的方法可以进一步包含纯化或回收在培养步骤中生产的L-苏氨酸的步骤。纯化或回收方法可以利用合适方法通过从培养基中纯化或回收期望的L-苏氨酸而进行，所述合适的方法取决于培养本申请微生物所用的方法，例如，分批培养方法、连续培养方法和补料分批培养方法。
具体实施方式
在下文中，参照实施例将进一步详细描述本申请。但应当理解的是，这些实施例仅用于说明目的并且并非意欲限制本申请的范围。
实施例
实施例1：重组载体pCC1BAC-rpoH的构建
(1)rpoH基因片段的制备
为了获得包含rpoH基因(SEQ ID NO:14的核苷酸序列和SEQ ID NO:16的氨基酸序列)的约1.0kb的DNA片段，使用基因组尖端系统(Genomic-tip system(Qiagen))分离野生型大肠杆菌菌株W3110的基因组DNA(gDNA)。使用gDNA作为模板，使用PCR HL预混合试剂盒(BIONEER，下同)进行聚合酶链式反应(在下文中缩写为“PCR”)。
使用SEQ ID NOS:1和SEQ ID NOS:2的引物进行扩增rpoH基因的PCR反应，持续27个循环，每个循环由在94℃变性30s(秒)，在55℃退火30s和在72℃延伸1min(分钟)组成。
PCR产物用EcoRI消化，并且1.0kb DNA片段(在下文中被称为“rpoH片段”)在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳，然后通过洗脱收集。
(2)重组载体pCC1BAC-rpoH的构建
拷贝控制pCC1BAC EcoRI即可克隆(cloning-ready)载体(EPICENTRE(USA))和在实施例1-(1)中获得的rpoH的每个用限制性内切酶处理并且彼此连接，从而构建pCC1BAC-rpoH质粒。
实施例2：重组载体pCC1BAC-rpoH变体的文库构建
(1)通过易错PCR制备rpoH变体
为了获得由具有引入的随机突变的rpoH变体片段组成的DNA库，使用W3110gDNA(在实施例1-(1)中提取)作为模板在多样化PCR随机诱变试剂盒(diversify PCR randommutagenesis kit,目录编号K1830-1；Clonetech)的使用手册的表Ⅲ所示的诱变反应4的条件下进行PCR。使用SEQ ID NOS:1和SEQ ID NOS:2的引物进行PCR，持续25个循环，每个循环由在94℃变性30s、在68℃延伸1min组成。
PCR产物用EcoRI消化，并且1.0kb DNA片段(在下文中被称为“rpoH片段”)在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳，然后通过洗脱收集。
(2)重组载体pCC1BAC-rpoH变体的文库构建
拷贝控制pCC1BAC EcoRI即可克隆载体与在实施例2-(1)中获得的rpoHm片段连接，从而构建pCC1BAC-rpoHm载体。
将构建的载体转化到TransforMax EPI300电感受态大肠杆菌(EPICENTRE)中，然后在加入15μg/ml氯霉素、40μg/ml X-Gal和0.4mM IPTG的LB平板上进行菌落选择。确认没有检测到蓝色菌落。收集所选菌落并且经受质粒准备，从而构建pCC1BAC-rpoH变体的文库。
(3)将pCC1BAC-rpoH变体引入到产苏氨酸菌株
将在实施例1-(2)中获得的pCC1BAC-rpoH和在实施例2-(2)中获得的pCC1BAC-rpoH获得的变体文库各自通过转化引入到以感受态方式制备的产苏氨酸大肠杆菌菌株KCCM 10541，并且得到的菌株分别命名为“KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH”和“KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH突变体文库”。
在本实施例中用作亲本菌株的大肠杆菌菌株KCCM10541，是由于灭活存在于亲本菌株大肠杆菌KCCM10236的染色体中的tyrR基因和galR基因而具有增强的L-苏氨酸生产力的菌株，所述亲本菌株大肠杆菌KCCM10236具有的特性包括甲硫氨酸营养缺陷型表型、渗漏异亮氨酸营养缺陷型表型、耐L-苏氨酸类似物(例如，α-氨基-β-羟基戊酸(AHV))、耐L-赖氨酸类似物(例如S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC))、耐异亮氨酸类似物(例如α-氨基丁酸)，并且耐甲硫氨酸类似物(例如乙硫氨酸)(韩国登记专利号10-0576342)。
实施例3：具有耐温性的RNA聚合酶σ32因子变体的筛选
在本实施例中，进行实验来筛选具有耐温性的RNA聚合酶σ32因子变体。
每个大肠杆菌KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH和每个在实施例2-(3)中制备的大肠杆菌KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH突变体文库在37℃和33℃下在培养箱中在LB固体培养基上培养过夜。将一铂环每个培养的菌株接种到25mL下表1所示的滴定培养基中，然后在37℃、33℃下和在200rpm下在震荡培养箱中培养48h(小时)。
表1
组成 浓度(/L)
葡萄糖 70g
KH2PO4 2g
(NH4)2SO4 27.5g
MgSO4·7H2O 1g
FeSO4·7H2O 5mg
MnSO4·4H2O 5mg
DL-甲硫氨酸 0.15g
酵母提取物 2g
碳酸钙 30g
pH 6.8
将每个具有引入的rpoH的变体文库的菌落在37℃下培养，并且选择与KCCM10541/pCC1BAC-rpoH相比，表现出苏氨酸浓度增加的变体，并且在33℃下培养。以这种方式，通过重复培养和选择方法进行rpoH突变体文库的评价。通过这种方法，选择在耐温性和产量两者方面均提高的克隆。从所选的克隆中提取载体并命名为pCC1BAC-rpoH2-G6。
为了检测在pCC1BAC-rpoH2-G6中的突变，使用pIB FP(SEQ ID NO:3)和pIB RP(SEQID NO:4)的引物通过PCR扩增pCC1BAC-rpoH2-G6，其中，pIB FP(SEQ ID NO:3)和pIB RP(SEQID NO:4)作为用于检测拷贝控制pCC1BAC EcoRI即可克隆载体的引物而提供，并且对PCR产物测序。测序结果表明：rpoH2-G6(SEQ ID NO:15)即rpoH变体具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
实施例4：重组菌株的L-苏氨酸生产力比较
将在实施例3中获得的载体pCC1BAC-rpoH2-G6转化到大肠杆菌KCCM 10541从而制备大肠杆菌KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH2-G6。
将亲本菌株大肠杆菌KCCM 10541、大肠杆菌KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH菌株和大肠杆菌KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH2-G6菌株中的每一种使用上表1所示的苏氨酸滴定培养基在锥形瓶中培养，并且分析其L-苏氨酸生产力。分析结果如下表2所示。
表2
如上表2所示，当将亲本菌株大肠杆菌KCCM10541和对照菌株KCCM10541/pCC1BAC-rpoH培养48h时，它们分别生产30.6g/L和30.5g/L的L-苏氨酸，但是大肠杆菌KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH2-G6菌株产生31.1g/L的L-苏氨酸，因此与亲本菌株相比，表现出了约1％P的L-苏氨酸生产力的增加。
在37℃下，亲本菌株(KCCM 10541)和对照菌株(KCCM10541/pCC1BAC-rpoH)都表现出了产量减少，然而，KCCM10541/pCC1BAC-rpoH2-G6菌株没有表现出L-苏氨酸生产力浓度的温度依赖性减少，并且产生31.8g/L的L-苏氨酸，表明，当它在高温下培养时，与对照组相比，它表现出了约8％P的苏氨酸生产力的增加。
实施例5：使用其它产苏氨酸菌株所选rpoH变体(rpoH2-G6)的效果比较
(1)rpoH变体(rpoH2-G6)在ABA5G/pAcscBAR'-M、pC-Ptrc-scrAB菌株中的效果分析
在实施例4中确认了载体pCC1BAC-rpoH2-G6的效果，将所述载体引入到产苏氨酸菌株ABA5G/pAcscBAR'-M,pC-Ptrc-scrAB(韩国专利号10-1145943)，从而构建ABA5G/pAcscBAR'-M,pC-Ptrc-scrAB,pCC1BAC-rpoH2-G6。然后使用制备的如下表3所示的滴定培养基进行效价评价。评价结果如下表所示。
用于本实施例的亲本菌株ABA5G/pAcscBAR'-M,pC-Ptrc-scrAB是通过用包含pAcscBAR'-M基因组和pC-Ptrc-scrAB基因组的载体转化产苏氨酸菌株ABA5G(其是通过在亲本菌株大肠杆菌W3110中诱导NTG突变而构建的菌株，并且具有甲硫氨酸营养缺陷型表型、渗漏异亮氨酸营养缺陷型表型、耐α-氨基-β-羟基戊酸、耐(2-氨乙基)-L-半胱氨酸、耐1-氮杂环丁烷-2-羧酸)而获得的具有L-苏氨酸生产力的大肠杆菌菌株。
表3
表4
从上表4可以看出，当将载体pCC1BAC-rpoH2-G6引入到除大肠杆菌KCCM10541以外的产苏氨酸菌株中时，在33℃下的苏氨酸产量保持在类似于上表2所示的水平，并且在37℃下的苏氨酸产量保持在类似于在33℃下观察到的苏氨酸产量的水平。
(2)rpoH变体(rpoH2-G6)在大肠杆菌KCCM11167P菌株中的效果分析
将载体pCC1BAC-rpoH2-G6引入到另一个产苏氨酸菌株大肠杆菌KCCM11167P(韩国专利申请号2011-0005136)从而构建大肠杆菌KCCM11167P/pCC1BAC-rpoH2-G6,然后使用制备的如上表1所示的滴定培养基来评价构建的菌株的苏氨酸生产力。评价结果如下表5所示。
用于本实施例的亲本菌株大肠杆菌KCCM11167P是通过灭活在KCCM10541菌株(韩国专利号10-0576342)中的tdcB并且将nadK增强到两个拷贝以增强NAD激酶活性而获得的菌株。
表5
从在上表5中的效价评价结果可以看出，当将pCC1BAC-rpoH2-G6引入到具有苏氨酸生产力的菌株中时，在33℃下的苏氨酸产量得以保持，并且在37℃下的苏氨酸产量保持在类似于在33℃下的苏氨酸产量的水平，如同当将pCC1BAC-rpoH2-G6引入到如实施例5-(1)所描述的不同产苏氨酸菌株时一样。
实施例6：将所选rpoH变体(rpoH2-G6)另外插入到染色体中
(1)rpoH2-G6整合盒片段的制备
为了将在实施例3中所选的变体rpoH2-G6另外插入(additionally insert)到染色体中，构建线性整合盒。线性整合盒用下面的方式构建。
使用大肠杆菌W3110gDNA作为模板和使用SEQ ID NOS:5和SEQ ID NOS:6的引物进行PCR。PCR进行27个循环，每个循环由在94℃变性30s、在55℃退火30s和在72℃延伸30s组成。得到的DNA片段命名为“同源区1”。
使用pMloxCmt作为模板和使用SEQ ID NOS:7和SEQ ID NOS:8的引物，进行用于扩增突变体loxP-Cmr-loxP盒的PCR持续27个循环，每个循环由在94℃变性30s、在55℃退火30s和在72℃延伸1min组成。于此，用作模板的pMloxCmt是本领域技术人员根据使用突变体loxP的改进的基因缺失方法的报道而构建的载体，突变体loxP由Suzuki等命名为lox71和lox66(Suzuki N.et al.,Appl.Environ.Microbiol.71:8472,2005)。
使获得的同源区1和突变体loxP-Cmr-loxP盒片段经历使用SEQ ID NOS:5和SEQID NOS:8的引物的重叠延伸PCR，从而获得“同源区1-突变体loxP-Cmr-loxP”。于此，在缺乏引物的情况下进行PCR，持续5个循环，每个循环由在94℃变性30s、在55℃退火30s和在72℃延伸90s组成，然后在引物存在的情况下进行PCR，持续23个循环。
使用pCC1BAC-rpoH2-G6作为模板和使用SEQ ID NOS:9和SEQ ID NOS:10的引物进行PCR，持续27个循环，每个循环由在94℃变性30s、在55℃退火30s和在72℃延伸1min组成。
使用大肠杆菌W3110gDNA作为模板和使用SEQ ID NOS:11和SEQ ID NOS:12的引物进行PCR，持续27个循环，每个循环由在94℃变性30s、在55℃退火30s和在72℃延伸30s组成。得到的DNA片段命名为“同源区2”。
使rpoH2-G6和同源区2经历使用SEQ ID NOS:9和SEQ ID NOS:12的引物的重叠延伸PCR，从而获得“rpoH2-G6-同源区2”。于此，在缺乏引物的情况下进行PCR，持续5个循环，每个循环由在94℃变性30s、在55℃退火30s和在72℃延伸90s组成，并且然后在引物存在的情况下进行PCR，持续23个循环。
使用获得的“同源区1-突变体loxP-Cmr-loxP”和“rpoH2-G6-同源区2”作为模板和使用SEQ ID NOS:5和SEQ ID NOS:12的引物进行重叠延伸PCR，从而构建rpoH2-G6整合盒。于此，在缺乏引物的情况下进行PCR，持续5个循环，每个循环由在94℃变性30s、在55℃退火30s和在72℃延伸3min组成，然后在引物存在的情况下进行PCR，持续23个循环。因此，构建SEQ ID NO:13所示的rpoH2-G6整合盒。
(2)将rpoH2-G6变体另外插入到重组菌株的染色体中
为了将所选的rpoH2-G6变体插入到染色体中，纯化在实施例6-(1)中构建的rpoH2-G6整合盒，并且将rpoH2-G6变体以与已知的一步灭活法(Warner et al.,PNAS,6；97(12):6640,2000)相同的方式另外插入到已经存在的大肠杆菌KCCM10541的rpoH之后的染色体区域。接着，去除抗生素抗性标记基因，从而构建具有另外插入的rpoH2-G6变体的菌株，并且对构建体测序，以确保没有引入PCR错误。将构建的具有另外插入的rpoH2-G6的菌株命名为“FTR2700”，并且将转化的大肠杆菌FTR2700于2013年2月5日保藏在韩国微生物保藏中心(在下文中缩写为KCCM)，保藏登记号为KCCM11368P。
(3)L-苏氨酸生产力分析
将在实施例6-(2)中构建的重组微生物使用上表1所示的苏氨酸滴定培养基在锥形瓶中培养，并且分析微生物的L-苏氨酸生产力。
将一铂环的在37℃和33℃下在培养箱中在LB固体培养基上过夜培养的每种大肠杆菌KCCM 10541和大肠杆菌KCCM11368P接种到25mL上表1所示的滴定培养基，然后将每种大肠杆菌菌株在33℃、37℃下和在200rpm下在震荡培养箱中培养48h。
从下表6中可以看出，当亲本菌株大肠杆菌KCCM10541培养48h时，它产生了30.3g/L的L-苏氨酸，并且在本申请的实施例6-(2)中构建的大肠杆菌KCCM 11368P产生了30.0g/L的L-苏氨酸，因此表现出的L-苏氨酸生产力类似于亲本菌株的L-苏氨酸生产力。亲本菌株(KCCM 10541)表现出在37℃下L-苏氨酸产量的减少，然而KCCM11368P菌株没有表现出L-苏氨酸浓度的温度依赖性减少，并且表现出L-苏氨酸浓度增加。
因此，可以看出，如同用载体转化的菌株，当在37℃下培养时，在实施例6-(2)中构建的菌株表现出的苏氨酸生产力类似于或高于当它在33℃下培养时获得的苏氨酸生产力。
表6
虽然已经参照具体的说明性实施方案对本申请进行了描述，但是本领域技术人员将理解，本申请可以不背离本申请的技术精神或本质特征的其它特定形式体现。因此，本文的实施方案和实验实施例在各方面都被视为说明性的并且不是限制性的。而且，本申请的范围由所附权利要求书而不是详细描述所限定，并且应当理解由本申请的意义和范围衍生的所有的改变或变化以及其等价体都包含在所附权利要求书的范围内。
登记号
保藏机构：韩国微生物保藏中心；
保藏登记号：KCCM11368P；
保藏日期：2013年2月5日。
保藏的微生物或其它生物学物质的表示事项
(专利合作条约规则第13条第2款)

Claims (9)

1.RNA聚合酶σ32因子变体，所述RNA聚合酶σ32因子变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:17。
2.编码权利要求1所述的RNA聚合酶σ32因子变体的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。
4.包含权利要求2所述的核苷酸序列的载体。
5.具有L-苏氨酸生产力的埃希氏杆菌属(Escherichia)的重组微生物，所述重组微生物表达权利要求1所述的变体。
6.根据权利要求5所述的具有L-苏氨酸生产力的埃希氏杆菌属的重组微生物，其中，所述重组微生物通过包含编码氨基酸序列为SEQ ID NO:17的RNA聚合酶σ32因子变体的核苷酸序列的重组载体或通过将所述核苷酸序列另外插入到染色体中而被转化。
7.根据权利要求6所述的具有L-苏氨酸生产力的埃希氏杆菌属的重组微生物，其中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。
8.根据权利要求6所述的具有L-苏氨酸生产力的埃希氏杆菌属的重组微生物，其中，所述埃希氏杆菌属的微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)。
9.生产L-苏氨酸的方法，包含以下步骤：
培养权利要求5-8中任一项所述的具有L-苏氨酸生产力的埃希氏杆菌属的重组微生物；和
从所述微生物或培养物中回收L-苏氨酸。
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