ES2693522T3 - Variante de ARN polimerasa de factor sigma 32 y método de producción de L-treonina utilizando un microorganismo que exprese la variante - Google Patents

Variante de ARN polimerasa de factor sigma 32 y método de producción de L-treonina utilizando un microorganismo que exprese la variante Download PDF

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Abstract

Una variante de ARN polimerasa de factor sigma 32 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 17.

Description

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DESCRIPCION
Variante de ARN polimerasa de factor sigma 32 y metodo de produccion de L-treonina utilizando un microorganismo que exprese la variante
Campo Tecnico
La presente solicitud se refiere a una variante de ARN polimerasa de factor sigma 32 y a un metodo de produccion de L-treonina utilizando la misma.
Tecnica anterior
El uso de la L-treonina, un tipo de aminoacido esencial, esta muy extendido como aditivo para piensos y alimentos, y tambien se utiliza de un modo eficaz en soluciones de rehidratacion y materiales sinteticos para uso medico y farmaceutico.
La L-treonina se produce principalmente por fermentacion utilizando Escherichia coli o Corynebacterium, desarrolladas por metodos de mutacion artificial o metodos de recombinacion genetica. Las cepas mutantes artificiales procedentes de cepas de tipo silvestre, incluyendo Escherichia coli, Serratia, Providencia o Corynebacterium, se utilizan en general para la produccion de L-treonina.
Con el desarrollo de la tecnologfa de la recombinacion genetica, para cepas que tienen productividad de L-treonina por mutacion al azar, se han descrito tecnologfas de manipulacion tales como el reemplazo genico espedfico de sitio, la amplificacion y delecion genica, etc. para mejorar la productividad de L-treonina. Se han desarrollado genes relacionados con la biosmtesis de la treonina y varios metodos para aumentar la expresion de estos genes, pero aun existe una demanda de un metodo que sea capaz de producir L-treonina con un rendimiento mas alto.
La maquinaria de transcripcion global funciona controlando los transcritos en todos los sistemas celulares (procariotas y eucariotas). La modificacion por ingeniena genetica de la maquinaria de transcripcion global proporciona celulas recombinantes que comprenden un regulador global que tiene caracteres mejorados mutando ya sea un acido nucleico que codifica el regulador global o un promotor que controla su expresion, y mediante este metodo pueden producirse celulas con fenotipos mejorados.
Un factor sigma es un tipo de regulador global que desempena un papel importante en la regulacion de la transcripcion global en funcion de la preferencia del promotor de la holoenzima ARN polimerasa. Un factor sigma es un factor de inicio de la transcripcion procariota, que permite la union espedfica de la ARN polimerasa con genes promotores. Cada factor sigma se activa en respuesta a diferentes condiciones ambientales, y cada molecula de ARN polimerasa contiene una subunidad de factor sigma. Se sabe que E. coli tiene al menos ocho factores sigma y que el numero de factores de sigma vana dependiendo de la especie bacteriana.
Los autores de la presente invencion han realizado estudios para modificar el gen rpoH que codifica el factor sigma- 32, que se sabe que controla la respuesta al choque termico con el fin de potenciar adicionalmente la resistencia al estres a alta temperatura de una cepa de E. coli que tiene productividad de L-treonina. Como resultado, los autores de la presente invencion han desarrollado una variante de ARN polimerasa de factor sigma 32 que regula el mecanismo transcripcional para que la productividad de la treonina no disminuya en gran medida incluso a altas temperaturas, y han introducido la variante de ARN polimerasa de factor sigma 32 en una cepa productora de treonina, completando asf la presente solicitud.
El documento US 5.200.341 desvela un gen rpoH que codifica una protema a32 en la que en el resto de aminoacido 268 en lugar de arginina hay cistema, que se aislo de un mutante de la cepa W3110 de Escherichia coli. El gen rpoH tiene timina en lugar de citosina en la posicion del nucleotido correspondiente a 802 en el gen rpoH de tipo silvestre.
El documento US 6.156.532 desvela un microorganismo utilizado para producir sustancias utiles, tales como aminoacidos, cultivando el microorganismo en un medio para permitir que se produzca un producto fermentativo y se acumule en el medio y recoger el producto fermentativo, en el que el microorganismo a utilizar se modifica introduciendo al menos uno de un gen que codifica una protema de choque termico y un gen que codifica un factor a que funciona espedficamente para que el gen de la protema de choque termico para potencie la cantidad de expresion de la protema de choque termico en las celulas, por lo que se permite que el microorganismo tenga resistencia anadida al estres que, de otro modo, restringina el crecimiento del microorganismo y/o la produccion del producto fermentativo.
Divulgacion
Problema tecnico
Es un objeto de la presente solicitud proporcionar una variante de ARN polimerasa de factor sigma 32.
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Otro objeto de la presente solicitud es proporcionar una secuencia de nucleotidos que codifique la variante de ARN polimerasa de factor sigma 32.
Incluso otro objeto de la presente solicitud, es proporcionar es un vector que comprenda la secuencia de nucleotidos.
Incluso otro objeto de la presente solicitud, es proporcionar un microorganismo recombinante del genero Escherichia que tenga productividad de L-treonina, que exprese la variante.
Incluso otro objeto de la presente solicitud, es proporcionar un metodo de produccion de L-treonina utilizando el microorganismo del genero Escherichia.
Solucion tecnica
Para lograr los objetos anteriores, la presente solicitud proporciona una variante de ARN polimerasa de factor sigma 32 que tiene una secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 17
La presente solicitud tambien proporciona una secuencia de nucleotidos que codifica la variante de ARN polimerasa de factor sigma 32.
La presente solicitud tambien proporciona un microorganismo recombinante del genero Escherichia que tiene productividad de L-treonina, que expresa la variante.
La presente solicitud tambien proporciona un metodo de produccion de L-treonina utilizando el microorganismo del genero Escherichia.
Efectos ventajosos
De acuerdo con la presente solicitud, una cepa transformada con un vector que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una variante de ARN polimerasa de factor sigma 32 tiene resistencia al estres a alta temperatura, tiene resistencia a la temperatura y tambien puede producir L-treonina con un rendimiento aumentado. Por tanto, puede producir treonina con una productividad significativamente alta en comparacion con las cepas convencionales, incluso cuando se cultiva a altas temperaturas. Por consiguiente, puede utilizarse de un modo eficaz para producir treonina en alto rendimiento.
Modo para llevar a cabo la invencion
En lo sucesivo, en el presente documento, la presente solicitud se describira con detalle.
La presente solicitud proporciona una variante de ARN polimerasa de factor sigma 32 que tiene una secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 17.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresion “factor sigma 32 (a32)” se refiere al factor sigma regulador global conocido como un factor sigma principal que controla la respuesta al choque termico en la fase logantmica y que esta codificado por el gen rpoH.
Ademas, fuera del alcance de las reivindicaciones, se desvelan variantes que tienen una homologfa de al menos 80 %, espedficamente de al menos 90 %, mas espedficamente de al menos 95 % y, en particular, espedficamente de al menos 99 %, con las secuencias de aminoacidos de la variante de la presente solicitud. La homologfa de la secuencia de aminoacidos puede determinarse utilizando, por ejemplo, el algoritmo de BLAST o de Karlin y Altschul (vease Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)) o FASTA (vease Methods Enzymol., 183, 63 (1990)). Los programas denominados BLASTN y BLASTX se han desarrollado basandose en este algoritmo de BLAST (consultese
www.ncbi.nlm.nih.gov). Fuera del alcance de las reivindicaciones, la variante de la presente solicitud incluye mutantes que tienen una sustitucion, delecion e insercion de aminoacidos y similar, en comparacion con la secuencia de aminoacidos de la variante, y tambien mutantes que tienen una sustitucion codonica.
En una realizacion de la presente solicitud, se selecciono una variante de un conjunto de ADN de ropH mutado obtenido introduciendo mutaciones al azar en la cepa W3110 de E. coli de tipo silvestre, y la variante seleccionada se denomino rpoH2'06 La secuencia de nucleotidos de la variante extrafda se analizo, y como resultado, pudo observarse que se produda una mutacion en la secuencia de aminoacidos de la variante en comparacion con la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 16) de una ARN polimerasa factor sigma 32 de tipo silvestre (Ejemplo 3).
La presente solicitud tambien proporciona una secuencia de nucleotidos que codifica la variante.
En una realizacion de la presente solicitud, la variante de ARN polimerasa de factor sigma 32 puede tener espedficamente una secuencia de nucleotidos representada por SEQ ID NO: 15.
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En una realizacion de la presente solicitud, el codigo genetico de la secuencia de nucleotidos que codifica la variante puede estar generado. En este caso, la degeneracion del codigo genetico es un fenomeno en el que la ultima letra del codigo genetico no tiene sentido. Si las dos primeras bases son iguales, codifican lo mismo, incluso cuando los codigos en las posiciones son diferentes.
Por consiguiente, la secuencia de nucleotidos de la variante desvelada puede tener una homologfa de al menos 80 %, espedficamente de al menos 90 %, mas espedficamente de al menos 95 %, lo mas espedficamente de 99 %, con una secuencia de nucleotidos representada por SEQ ID NO: 15.
La presente solicitud tambien proporciona un vector que comprende la secuencia de nucleotidos.
El vector utilizado en la presente solicitud no esta espedficamente limitado y puede ser cualquier vector conocido en la tecnica, siempre que pueda replicarse en un hospedador. Como ejemplos de vectores que se utilizan normalmente se incluyen plasmidos, cosmidos, virus y bacteriofagos, naturales o recombinantes. Por ejemplo, el vector de fago o vector de cosmido utilizado en la presente solicitud puede ser pWE15, M13, AMBL3, AMBL4, AIXII, AASHII, AAPII, At10, At11, Charon4A, Charon21A o similares, y el vector de plasmido utilizado en la presente solicitud puede ser el tipo pBR, tipo pUC, tipo pBluescriptll, tipo pGEM, tipo pTZ, tipo pCL, tipo pET o similares. Un vector que puede utilizarse en la presente solicitud no esta espedficamente limitado y puede ser cualquier vector de expresion conocido en la tecnica. Espedficamente, puede utilizarse un vector pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 o pCClBAC. Mas espedficamente, puede utilizarse un vector pACYC177, pCL o pCClBAC.
La presente solicitud proporciona un microorganismo recombinante del genero Escherichia que tiene productividad de L-treonina, que expresa la variante.
En la presente solicitud, la expresion de la variante puede realizarse bien por transformacion con un vector recombinante que comprende operativamente un gen que codifica la variante o por insercion de un polinucleotido que codifica la variante en el cromosoma del microorganismo, pero no esta espedficamente limitado a esto.
Como se usa en el presente documento, el termino “transformacion” significa introducir, en la celula hospedadora, un vector que comprenda un polinucleotido que codifique una protema diana, para permitir que exprese una protema codificada por el nucleotido. El polinucleotido introducido puede insertarse y localizarse en el cromosoma de la celula hospedadora o localizarse fuera del cromosoma, siempre que pueda expresarse en la celula hospedadora. Ademas, los polinucleotidos incluyen ADN y ARN, que codifican la protema diana. Siempre que el polinucleotido pueda introducirse en la celula hospedadora y expresarse en su interior, este puede introducirse en cualquier forma. Por ejemplo, el polinucleotido puede introducirse en la celula hospedadora en forma de un casete de expresion que es una construccion polinucleotidica que incluye todos los elementos necesarios para la autoexpresion. El casete de expresion incluye generalmente un promotor que esta unido operativamente a la fase de lectura abierta (en lo sucesivo abreviada como “ORF” de las siglas en ingles Open Reading Frame) del gen, una senal de terminacion de la transcripcion, un sitio de union al ribosoma, y una senal de terminacion de la traduccion. El casete de expresion puede estar en forma de un vector de expresion autorreplicable. Ademas, el polinucleotido puede introducirse en la celula hospedadora por sf mismo y unirse operativamente a la secuencia necesaria para la expresion en la celula hospedadora.
En la presente solicitud, la transformacion puede realizarse bien por transduccion de un vector que comprenda una secuencia de nucleotidos que codifique la variante de ARN polimerasa de factor sigma 32 o por insercion de la secuencia de nucleotidos en el cromosoma del microorganismo, pero no esta espedficamente limitado a esto.
El microorganismo de la presente solicitud incluye un microorganismo procariota, siempre y cuando pueda producir L-treonina. Por ejemplo, puede incluir un microorganismo perteneciente al genero Escherichia, al genero Erwinia, al genero Serratia, al genero Providencia, al genero Corynebacterium o al genero Brevibacterium. Espedficamente, el microorganismo utilizado en la presente solicitud es el genero Escherichia. Mas espedficamente, es la especie Escherichia coli.
En una realizacion de la presente solicitud, como cepa precursora, puede utilizarse una cepa productora de treonina. La cepa productora de treonina puede ser una cepa de E. coli que tenga un fenotipo auxotrofo para la metionina, resistencia a un analogo de treonina, resistencia a un analogo de lisina, resistencia a un analogo de isoleucina y resistencia a un analogo de metionina. Ademas, la cepa productora de treonina puede ser una cepa de E. coli recombinante obtenida manipulando el gen de la biosmtesis de treonina o similar. Por ejemplo, puede ser una cepa de E. coli recombinante que tenga introducida en su interior una copia de cada uno del gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc) y un operon que comprenda aspartoquinasa L-homoserina deshidrogenasa (thrA), homoserina quinasa (thrB) y treonina sintasa (thrC). Como alternativa, puede ser una cepa de E. coli recombinante obtenida inactivando tanto un gen de operon (tdcBc), que esta implicado en la degradacion de la L-treonina, como una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (pckA).
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Espedficamente, una cepa utilizada en la presente solicitud puede ser una cepa seleccionada del grupo que consiste en E. coli KCCM10541P (Patente Coreana N. ° 10-0576342), E. coli ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB (Patente Coreana N. ° 10-1145943) y E. coli KCCM11167P (Publicacion de Patente Coreana abierta a inspeccion publica N. ° 10-2012-0083795).
En una realizacion de la presente solicitud, el microorganismo transformado puede ser E. coli. FTR2700.
En una realizacion de la presente solicitud, el microorganismo de la presente solicitud puede ser una cepa de E. coli que tenga uno o mas fenotipos deseados para potenciar la productividad de LA L-treonina. Espedficamente, el uno o mas fenotipos deseados son fenotipos resistentes a temperatura.
La presente solicitud tambien proporciona un metodo de produccion de L-treonina utilizando la cepa transformada.
El metodo de cultivo en la presente solicitud puede realizarse en medios adecuados y en condiciones de cultivo adecuadas conocidos en la materia. Dependiendo del tipo de cepa que se seleccione, este metodo de cultivo puede modificarlo facilmente cualquier persona experta en la materia. Como ejemplos de metodos de cultivo se incluyen, pero sin limitacion, el cultivo discontinuo, el cultivo continuo y el cultivo semicontinuo.
El medio y las condiciones de cultivo que se utilizan en el cultivo del microorganismo de la presente solicitud, pueden ser cualquiera de los que se utilizan generalmente en el cultivo de microorganismos del genero Escherichia, pero estos deben satisfacer adecuadamente los requisitos del microorganismo de la presente solicitud.
En una realizacion espedfica, el microorganismo de la presente solicitud puede cultivarse en un medio convencional que contenga fuentes de carbono, fuentes de nitrogeno, aminoacidos, vitaminas y similares, que sean adecuados, en condiciones aerobias, ajustando al mismo tiempo la temperatura, el pH y parametros similares.
Las fuentes de carbono que pueden utilizarse en la presente solicitud incluyen hidratos de carbono tales como glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa, manitol, sorbitol; alcoholes, tal como, alcohol de azucar, glicerol, acido piruvico, acido lactico y acido dtrico; y aminoacidos, tales como, acido organico, acido glutamico, metionina y lisina. Ademas, pueden utilizarse fuentes de nutrientes organicos naturales, tales como, hidrolizados de almidon, melazas, melazas residuales, salvado de arroz, yuca, bagazo y licor de macerado de mafz. Espedficamente, pueden utilizarse hidratos de carbono tales como glucosa y melazas esteriles previamente tratadas (es decir, melazas convertidas en azucares reducidos). Ademas, pueden utilizarse, sin limitacion, cantidades adecuadas de otras fuentes de carbono. Las fuentes de nitrogeno que pueden utilizarse en la presente solicitud incluyen fuentes de nitrogeno inorganico tales como amoniaco, sulfato de amonio, cloruro de amonio, acetato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio; aminoacidos, tales como, acido glutamico, metionina y glutamina; y fuentes de nitrogeno organico tales como peptona, NZ-amina, extracto de carne, extracto de levadura, extracto de malta, licor de macerado de mafz, hidrolizado de casema, harina de pescado o su producto digerido, torta de soja desgrasada o su producto digerido, etc. Estas fuentes de nitrogeno pueden utilizarse solas o en combinacion. El medio puede contener, como fuentes de fosforo, fosfato de potasio monobasico, fosfato de potasio dibasico y sales correspondientes que contengan sodio. Los compuestos inorganicos que pueden utilizarse en la presente solicitud incluyen cloruro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de hierro, sulfato de magnesio, sulfato de hierro, sulfato de manganeso y carbonato de calcio. Ademas, el medio puede contener aminoacidos, vitaminas y precursores adecuados. Estas fuentes o precursores pueden anadirse al medio de manera discontinua o continua.
Durante el cultivo, para ajustar el pH del medio de cultivo, pueden anadirse al medio, de manera adecuada, compuestos tales como, hidroxido de amonio, hidroxido de potasio, amoniaco, acido fosforico y acido sulfurico. Ademas, durante el cultivo, puede utilizarse un agente antiespumante, tal como ester de poliglicol de acido graso, para suprimir la formacion de burbujas. Ademas, para mantener el medio de cultivo en un estado aerobio, puede inyectarse oxfgeno o un gas que contenga oxfgeno en el medio de cultivo. Ademas, para mantener el medio de cultivo en un estado anaerobio o no aerobio, no se inyecta gas o puede inyectarse nitrogeno, hidrogeno o dioxido de carbono en el medio de cultivo. El medio de cultivo puede mantenerse tfpicamente a una temperatura que vane de 27 °C a 37 °C, y espedficamente de 30 °C a 37 °C. El cultivo del microorganismo puede continuar hasta que se obtenga el nivel deseado de la sustancia util. Espedficamente, el periodo de cultivo puede ser de 10 a 100 horas.
El metodo de la presente solicitud puede comprender adicionalmente una etapa de purificacion o de recuperacion de la L-treonina producida en la etapa de cultivo. El metodo de purificacion o de recuperacion puede realizarse purificando o recuperando la L-treonina deseada del medio de cultivo utilizando un metodo adecuado dependiendo de un metodo utilizado para el cultivo del microorganismo en la presente solicitud, por ejemplo, un metodo discontinuo, continuo o semidiscontinuo.
En lo sucesivo, la presente solicitud se describira con mas detalle con referencia a los ejemplos. Sin embargo, debe entenderse, que estos ejemplos son solo para fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente solicitud.
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Ejemplos
Ejemplo 1: Construccion del vector recombinante pCC1BAc-rpoH
(1) Preparacion del fragmento genico rpoH
Para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 1,0 kb que comprenda el gen rpoH (secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 14 y secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 16), el ADN genomico (ADNg) de la cepa W3110 de E. coli de tipo silvestre, se aislo con un sistema Genomic-tip (Qiagen). Utilizando el ADNg como molde, se realizo una reaccion en cadena de polimerasa (en lo sucesivo abreviada como “PCR” por sus siglas del ingles polymerase chain reaction) utilizando un kit de PCR HL premix (BIONEER, en lo sucesivo el mismo).
La reaccion de la PCR para amplificar el gen rpoH se realizo utilizando los cebadores de las SEQ ID NO: 1 y 2 durante 27 ciclos, consistiendo cada uno de ellos en desnaturalizacion a 94 °C durante 30 s, hibridacion a 55 °C durante 30 s y elongacion a 72 °C durante 1 min.
El producto de la PCR se digirio con EcoRI, y el fragmento de ADN de 1,0 kb (en lo sucesivo denominado “fragmento rpoH") se sometio a electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % y despues se recogio por elucion.
(2) Construccion del vector recombinante pCC1BAC-rpoH
Cada uno de un vector listo para clonacion, copycontrol pCCIBAC EcoRI (EPICENTRE (USA)) y el rpoH obtenido en el Ejemplo 1-(1), se trataron con la enzima de restriccion EcoRI y se ligaron entre sf, construyendo de este modo un plasmido pCC1BAC-rpoH.
Ejemplo 2: Construccion de una biblioteca de variantes del vector recombinante pCC1BAC-rpoH
(1) Preparacion de variantes de rpoH por PCR propensa a error
Para obtener un conjunto de ADN que consistfa en fragmentos de variantes de rpoH que teman mutaciones al azar introducidas en su interior, se realizo PCR utilizando como molde el ADNg de la cepa W3110 (extrafdo en el Ejemplo 1-(1)), en las condiciones de reacciones de mutagenesis 4 mostradas en la Tabla III del manual de usuario de un kit de mutagenesis al azar por PCR diversificada (catalogo N. ° K1830-1; Clonetech). La PCR se realizo utilizando los cebadores de las SEQ ID NO: 1 y 2 durante 25 ciclos, consistiendo cada uno de ellos en una desnaturalizacion a 94 °C durante 30 s y elongacion a 68 °C durante 1 min.
El producto de la PCR se digirio con EcoRI, y el fragmento de ADN de 1,0 kb (en lo sucesivo denominado “fragmento rpoHm") se sometio a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8 % y despues se recogio por elucion.
(2) Construccion de una biblioteca de variantes del vector recombinante pCC1BAC-rpoH
Un vector listo para clonacion copycontrol pCCIBAC EcoRI se ligo con el fragmento rpoHm obtenido en el Ejemplo 2- (1), construyendo de este modo un vector pCC1BAC-rpoHm
El vector construido se transformo en E. coli Electrocompetente TransforMax EPI300 (EPICENTRE) y despues, en una placa con caldo LB (Luria Bertani) + cloranfenicol 15 pg/ml + X-Gal 40 pg/ml + IPTG 0,4 mM, se realizo la seleccion de las colonias. Se confirmo que no se detectaron colonias de color azul. Las colonias seleccionadas se recogieron y se sometieron a una preparacion de plasmidos construyendo asf una biblioteca de variantes de pCC1BAC-rpoH.
(3) Introduccion de variantes de pCC1BAC-rpoH en una cepa productora de treonina
Cada una de la biblioteca de variantes de pCC1BAC-rpoH, obtenida en el Ejemplo 1-(2) y pCC1BAC-rpoH obtenida en el Ejemplo 2-(2), se introdujo por transformacion en la cepa KCCM 10541 de E. coli productora de treonina preparada de una manera competente, y las cepas resultantes se denominaron “KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH" y “biblioteca de mutantes de KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH", respectivamente.
La cepa KCCM10541 de E. coli utilizada como cepa precursora en este Ejemplo, es una cepa que tiene productividad de L-treonina potenciada como resultado de la inactivacion del gen tyrR y del gen galR presentes en el cromosoma de la cepa precursora KCCM 10236 de Escherichia coli con caractensticas, entre las que se incluyen, un fenotipo auxotrofo de metionina, un fenotipo auxotrofo de isoleucina permeable, resistencia a un analogo de L- treonina (por ejemplo, acido a-amino-p-hidroxi valerico (AHV), resistencia a un analogo de L-lisina (por ejemplo, S- (2-aminoetil)-L-cistema (AEC)), resistencia a un analogo de isoleucina (por ejemplo, acido a-aminobutmco) y resistencia a un analogo de metionina (por ejemplo, etionina) (Patente Coreana registrada N.° 10-0576342).
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Ejemplo 3: Seleccion de una variante de ARN polimerasa de factor sigma 32 que tiene resistencia a la temperatura
En este Ejemplo, se realizo un experimento para seleccionar una variante de ARN polimerasa de factor sigma 32 que tiene resistencia a la temperatura.
Cada una de la biblioteca de mutantes de E. coli KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH y E. coli KCCM 10541/pCC1BAC- rpoH preparada en el Ejemplo 2-(3) se cultivo durante una noche en medio solido con LB en una incubadora a 37 °C y 33 °C. Un asa de siembra de platino de cada una de las cepas cultivadas, se inoculo en 25 ml del medio de titulacion mostrado a continuacion en la Tabla 1, y despues se cultivo durante 48 horas en una incubadora con agitacion a 37 °C, 33 °C y a 200 rpm .
Tabla 1
Composicion
Concentracion (por litro)
Glucosa
70 g
KH2PO4
2 g
(NH4)2SO4
27,5 g
MgSO4-7H2O
1 g
FeSO4-7H2O
5 mg
MnSO4 4H2O
5 mg
DL-metionina
0,15 g
Extracto de levadura
2 g
Carbonato de calcio
30 g
pH
6,8
Cada una de las colonias que tema la biblioteca de variantes de rpoH introducida en su interior, se cultivo a 37 °C, y las variantes que mostraban un aumento en la concentracion de treonina en comparacion con KCCM10541/pCC1BAC-rpoH, se seleccionaron y se cultivaron a 33 °C. De esta manera, se realizo la evaluacion de la biblioteca de mutantes de rpoH repitiendo el cultivo y el metodo de seleccion. A traves de este metodo, se selecciono un clon mejorado tanto en resistencia a la temperatura como en rendimiento. Se extrajo un vector del clon seleccionado y se denomino pCC1BAC-rpoH2-G6
Para detectar una mutacion en pCC1BAC-rpoH2-G6, pCC1BAC-rpoH2-G6 se amplifico por PCR utilizando los cebadores de pIB FP (SEQ ID NO: 3) y pIB RP (SEQ ID NO: 4) proporcionados como cebadores para la deteccion en el vector listo para clonacion copycontrol pCCIBAC EcoRI y el producto de la PCR se secuencio. Los resultados de la secuenciacion indicaron que rpoH2-G6 (SEQ ID NO: 15), y la variante de rpoH, teman una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 17.
Ejemplo 4: Comparacion de la Productividad de L-treonina de cepas recombinantes
El vector pCC1BAC-rpoH2-G6 obtenido del Ejemplo 3 se transformo en E. coli KCCM 10541 para de este modo preparar E. coli KCCM 10541/ pCC1BAC-rpoH2'G6.
Cada una de la cepa precursora de E. coli KCCM 10541, la cepa de E. coli KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH y la cepa de E. coli KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH2-G6, se cultivo en un matraz de Erlenmeyer utilizando el medio de titulacion de treonina mostrado en la Tabla 1 anterior, y se analizaron sus productividades de L-treonina. Los resultados de los analisis se muestran a continuacion en la Tabla 2.
Tabla 2
Cepa
L-treonina jgD_________
33 °C
37 °C
KCCM 10541 (cepa precursora)
30,6 25,0
KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH
30,5 26,1
KCCM 10541/ pCC1BAC-rpoH2'G6
31,1 31,8
Como se muestra en la Tabla 2 anterior, la cepa precursora de E. coli KCCM10541 y la cepa de control KCCM10541/pCC1BAC-rpoH produjeron 30,6 g/l y 30,5 g/l de L-treonina, respectivamente, cuando se cultivaron durante 48 horas, pero la cepa de E. coli KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH2-G6 produjo 31,1 g/l de L-treonina, y por tanto mostro un aumento en la productividad de L-treonina de aproximadamente 1 %P en comparacion con la cepa precursora.
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A 37 °C, la cepa precursora (KCCM 10541) y la cepa de control (KCCM10541/pCC1BAC-rpoH) mostraron una disminucion en la produccion, mientras que la cepa KCCM 10541/pCC1BAC-rpoH2-G6 mostro disminucion no dependiente de la temperatura en la concentracion de productividad de L-treonina y produjo 31,8 g/l de L-treonina, lo que sugiere que muestra un aumento en la productividad de treonina de aproximadamente 8 %P en comparacion con el grupo de control cuando se cultiva a altas temperaturas.
Ejemplo 5: Comparacion de Efectos de la variante rpoH seleccionada (rpoH2-G6) utilizando otras cepas productoras de treonina
(1) Analisis de los Efectos de la variante rpoH (rpoH2-G6) en la cepa ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB
Efectos del vector pCC1BAC-rpoH2-G6 confirmado en el Ejemplo 4, el vector se introdujo en la cepa productora de treonina ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB (Patente Coreana N.° 10-1145943) para construir de este modo ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB, pCC1BAC-rpoH2-G6 Despues se realizo la evaluacion del tftulo utilizando el medio de titulacion preparado como se muestra a continuacion en la Tabla 3. Los resultados de la evaluacion se muestran en la Tabla a continuacion.
La cepa precursora ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB utilizada en este Ejemplo es una cepa de E. coli que tiene productividad de L-treonina, obtenida transformando la cepa productora de treonina ABA5g (que es una cepa construida induciendo una mutacion con NTG (nitrosoguanidina) en la cepa precursora de E. coli W3110 y que tiene un fenotipo auxotrofo de metionina, un fenotipo auxotrofo de isoleucina permeable, resistencia al acido a-amino-p- hidroxi valerico, resistencia a S-(2-aminoetil)-L-cistema, y resistencia al acido 1-azetidin-2- carboxflico, con un vector que comprende un grupo genico pAcscBAR'-M y un grupo genico pC-PtrcscrAB.
Tabla 3
Composicion
Concentracion (por litro)
Sacarosa
70 g
KH2PO4
2 g
(NH4)2SO4
27,5 g
MgSO4-7H2O
1 g
FeSO4-7H2O
5 mg
MnSO4 4H2O
5 mg
DL-metionina
0,15 g
Extracto de levadura
2 g
Carbonato de calcio
30 g
pH
6,8
Tabla
Cepa
L-treonina (g/l)
33 °C
37 °C
ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB
22,8 19,0
ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB, pCC1BAC-rpoH2'G0
22,8 22,0
Como puede observarse en la Tabla 4 anterior, cuando el vector pCC1BAC-rpoH2-G6 se introdujo en cepas productoras de treonina distintas de la E. coli KCCM10541, la treonina producida a 33 °C se mantuvo a un nivel similar al mostrado en la Tabla 2 anterior, y la treonina producida a 37 °C se mantuvo a un nivel similar al de la treonina producida observada a 33 °C.
(2) Efectos del analisis de la variante rpoH (rpoH2-G6) en la cepa de E. coli KCCM11167P
El vector pCC1BAC-rpoH2-G6 se introdujo en otra cepa de E. coli KCCM11167P productora de treonina (Solicitud de Patente Coreana N. ° 2011-0005136 publicada como EP-A-2665809) para construir de este modo E. coli KCCM11167P/pCC1BAC-rpoH2-G6, y la productividad de treonina de la cepa construida se evaluo utilizando el medio de titulacion preparado como se muestra en la Tabla 1 anterior. Los resultados de la evaluacion se muestran a continuacion en la Tabla 5.
La cepa precursora de E. coli KCCM11167P utilizada en este Ejemplo es una cepa obtenida inactivando tdcB en una cepa KCCM10541 (Patente Coreana N. ° 10-0576342) y potenciando nadK en dos copias para potenciar la actividad nAd quinasa.
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Tabla 5
Cepa
L-treonina (g/l)
33 °C
37 °C
KCCM11167P
30,1 26,2
KCCM11167P/pCC1 BAC-rpoH2'G0
30,2 29,8
Como puede observarse en los resultados de evaluacion de titulacion indicados en la Tabla 5 anterior, cuando se introdujo pCC1 BAC-rpoH2-G6 en la cepa que tema productividad de treonina, el rendimiento de la treonina a 33 °C se mantuvo y el rendimiento de la treonina a 37 °C se mantuvo a un nivel similar al rendimiento de treonina a 33 °C, igual que cuando se introdujo pCC1BAC-rpoH2-G6 en la cepa diferente productora de treonina como se describe en el Ejemplo 5-(1).
Ejemplo 6: Insercion adicional de la variante rpoH seleccionada (rpoH2-G6) en cromosomas
(1) Preparacion del fragmento del casete de integracion rpoH2-G6
Para insertar adicionalmente en un cromosoma, la variante rpoH2-G6 seleccionada en el Ejemplo 3, se construyo un casete de integracion lineal. El casete de integracion lineal se construyo de la siguiente manera.
Se realizo PCR utilizando como molde el ADNg de E. coli W3110 y los cebadores de las SEQ ID NO: 5 y 6. La PCR se realizo durante 27 ciclos, consistiendo cada uno de ellos en desnaturalizacion a 94 °C durante 30 s, hibridacion a 55 °C durante 30 s y elongacion a 72 °C durante 30 s. El fragmento de ADN resultante se denomino “region 1 homologa”.
Utilizando como molde pMloxCmt y los cebadores de las SEQ ID NO: 7 y 8, se realizo una PCR para amplificar un casete loxP mutante-Cmr-loxP durante 27 ciclos, consistiendo cada uno de ellos en desnaturalizacion a 94 °C durante 30 s, hibridacion a 55 °C durante 30 s y elongacion a 72 °C durante 1 min. En este caso, pMloxCmt utilizado molde, es un vector construido por un experto en la materia basandose en un informe de un metodo mejorado de delecion genica que utiliza loxP mutante, denominado lox71 y lox66 de Suzuki et al. (Suzuki N. et al., Appl. Environ. Microbiol. 71: 8472, 2005).
La region 1 homologa obtenida y el fragmento del casete loxP mutante-Cmr-loxP se sometieron a PCR de extension solapada utilizando los cebadores de las SEQ ID NO: 5 y 8, obteniendo de este modo “region 1 homologa-loxP mutante-Cmr-loxP”. En este caso, la PCR se realizo sin cebadores durante 5 ciclos, consistiendo cada uno de ellos en desnaturalizacion a 94 °C durante 30 s, hibridacion a 55 °C durante 30 s y elongacion a 72 °C durante 90 s, y despues se realizo en presencia de cebadores durante 23 ciclos.
Utilizando como molde pCC1BAC-rpoH2-G6 y los cebadores de las SEQ ID NO: 9 y 10, se realizo PCR durante 27 ciclos, consistiendo cada uno de ellos en desnaturalizacion a 94 °C durante 30 s, hibridacion a 55 °C durante 30 s y elongacion a 72 °C durante 1 min.
Utilizando como molde el ADNg de E. coli W3110 y los cebadores de las SEQ ID NO: 11 y 12, se realizo PCR durante 27 ciclos, consistiendo cada uno de ellos en desnaturalizacion a 94 °C durante 30 s, hibridacion a 55 °C durante 30 s y elongacion a 72 °C durante 30 s. El fragmento de ADN resultante se denomino “region 2 homologa”.
La variante rpoH2-G6 y la region 2 homologa se sometieron a PCR de extension solapada utilizando los cebadores de las SEQ ID NO: 9 y 12, obteniendo de este modo “rpoH2'G6 . region 2 homologa”. En este caso, la PCR se realizo sin cebadores durante 5 ciclos, consistiendo cada uno de ellos en desnaturalizacion a 94 °C durante 30 s, hibridacion a 55 °C durante 30 s y elongacion a 72 °C durante 90 s y despues se realizo en presencia de cebadores durante 23 ciclos.
Utilizando la “region 1 homologa- loxP mutante -Cmr-loxP” obtenida, la “rpoH2-G6 - region 2 homologa” como molde y los cebadores de las SEQ ID NO: 5 y 12, se realizo PCR de extension solapada, construyendo de este modo un casete de integracion rpoH2-G6. En este caso, la PCR se realizo sin cebadores durante 5 ciclos, consistiendo cada uno de ellos en desnaturalizacion a 94 °C durante 30 s, hibridacion a 55 °C durante 30 s y elongacion a 72 °C durante 3 min y despues se realizo en presencia de cebadores durante 23 ciclos. Como resultado, se construyo un casete de integracion rpoH2-G6 representado por SEQ ID NO: 13.
(2) Insercion adicional de la variante rpoH2-G6 en cromosomas de la cepa recombinante
Para insertar la variante rpoH ' seleccionada en un cromosoma, el casete de integracion rpoH ' construido en el Ejemplo 6-(1) se purifico y la variante rpoH2-G6 se inserto adicionalmente en una region cromosomica despues de la rpoH ya existente de E. coli KCCM10541 de la misma manera que un metodo conocido de inactivacion de una sola etapa (Warner et al., PNAS, 6; 97(12): 6640, 2000). A continuacion, se elimino el gen marcador de resistencia a antibioticos, construyendo de este modo una cepa que tema la variante rpoH2-G6 adicionalmente insertada en su
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interior, y la construccion se secuencio para garantizar que no se introdujera un error de PCR. La cepa construida que tema rpoH2-G6 adicionalmente insertada en su interior se denomino “FTR2700” y la E. coli FTR2700 transformada se deposito en el Korean Culture Center of Microorganisms (en lo sucesivo como KCCM) el 5 de febrero de 2013 con el numero de registro KCCM11368P.
(3) Analisis de productividad de L-Treonina
El microorganismo recombinante construido en el Ejemplo 6-(2) se cultivo en un matraz de Erlenmeyer utilizando el medio de titulacion de treonina mostrado en la Tabla 1 anterior, y se analizo la productividad de L-treonina del microorganismo.
Un asa de siembra de platino de cada una de las cepas de E. coli KCCM 10541 y KCCM11368P, cultivadas durante una noche en medio solido con LB en una incubadora a 33 °C y 37 °C, se inoculo en 25 ml del medio de titulacion mostrado en la Tabla 1 anterior, y despues cada una de las cepas de E. coli se cultivo durante 48 horas en una incubadora con agitacion a 33 °C, 37 °C y a 200 rpm.
Como puede observarse a continuacion en la Tabla 6, cuando la cepa precursora KCCM105411 de E. coli se cultivo durante 48 horas, produjo 30,3 g/l de L-treonina y la cepa KCCM 11368P de E. coli construida en el Ejemplo 6-(2) de la presente solicitud produjo 30,0 g/l de L-treonina, y por tanto mostro una productividad de L-treonina similar a la de la cepa precursora. La cepa precursora (KCCM 10541) mostro disminucion en el rendimiento de L-treonina a 37 °C, mientras que la cepa KCCM 11368P no mostro disminucion dependiente de la temperatura en la concentracion de L- treonina y mostro un aumento en la concentracion de L-treonina.
Por tanto, puede observarse que, al igual que la cepa transformada con el vector, la cepa construida en el Ejemplo 6-(2), cuando se cultiva a 37 °C, muestra una productividad de treonina similar o superior a la obtenida cuando se cultiva a 33 °C.
Tabla 6
Cepa
L-treonina Jg/D__________
33 °C
37 °C
KCCM 10541 (cepa precursora)
30,3 26,0
KCCM 11368P
30,9 32,0
Numero de registro
Autoridad depositaria: Korean Culture Center of Microorganisms;
Numero de registro: KCCM11368P;
Fecha de deposito: 5 de febrero de 2013.
<110> CJ Cheiljedang Corporation
<120> Microorganismos para la produccion de L-treonina y proceso para la produccion de L-treonina utilizando los mismos
<130> PP14-0106
<160> 17
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1 <211> 35 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 1
cagtatccgg aattcgcttg cattgaactt gtgga 35
<210>2 <211> 35 <212>ADN
<213> Secuencia artificial
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<220>
<223> cebador <400>2
gtcataccgg aattccttaa tagcggaaat tacgc 35
<210> 3 <211> 35 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400>3
cagtatccgg aattcgcttg cattgaactt gtgga 35
<210> 4 <211> 35 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400>4
gtcataccgg aattccttaa tagcggaaat tacgc 35
<210> 5 <211> 27 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400>5
atctagaaag cgcagcgcaa actgttc 27
<210> 6 <211> 50 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador
<400>6
ttcgtataat gtatgctata cgaacggtaa ccccggactc tcatccaggg 50
<210>7 <211> 50 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400>7
gcagagaacc ctggatgaga gtccggggtt accgttcgta tagcatacat 50
<210>8 <211> 50
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50
55
60
<212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400>8
gtgattttat ccacaagttc aatgcaagcg gtacctaccg ttcgtataat 50
<210>9 <211> 50 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400>9
tagcatacat tatacgaacg gtaggtaccg cttgcattga acttgtggat 50
<210> 10 <211> 52 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 10
catccagggt tctctgctta atagcggaaa ttacgcttca atggcagcac gc 52
<210> 11 <211> 50 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 11
aaaaattgcg tgctgccatt gaagcgtaat ttccgctatt aagcagagaa 50
<210> 12 <211> 28 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 12
aaagctttgt ttcgggtcac aggcatcg 28
<210> 13 <211> 3136 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> casete de integracion rpoH2-G6

Claims (9)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. Una variante de ARN polimerasa de factor sigma 32 que tiene una secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 17.
  2. 2. Una secuencia de nucleotidos que codifica la variante de ARN polimerasa de factor sigma 32 de la reivindicacion 1.
  3. 3. La secuencia de nucleotidos de acuerdo con la reivindicacion 2, estando la secuencia de nucleotidos representada por SEQ ID NO: 15.
  4. 4. Un vector que comprende la secuencia de nucleotidos de la reivindicacion 2 o reivindicacion 3.
  5. 5. Un microorganismo recombinante del genero Escherichia que tiene productividad de L-treonina, que expresa la variante de la reivindicacion 1.
  6. 6. El microorganismo recombinante del genero Escherichia que tiene productividad de L-treonina de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que el microorganismo recombinante se transforma bien mediante un vector recombinante que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una variante de ARN polimerasa de factor sigma 32 que tiene una secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 17, o mediante insercion adicional en un cromosoma de la secuencia de nucleotidos.
  7. 7. El microorganismo recombinante del genero Escherichia que tiene productividad de L-treonina de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que la secuencia de nucleotidos se representa por SEQ ID NO: 15.
  8. 8. El microorganismo recombinante del genero Escherichia que tiene productividad de L-treonina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que el microorganismo del genero Escherichia es Escherichia coli.
  9. 9. Un metodo para la produccion de L-treonina, que comprende las etapas de:
    cultivar un microorganismo recombinante del genero Escherichia que tenga productividad de L-treonina de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8; y recuperar del cultivo la L-treonina.
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