JP2009509533A - 包括的な転写機構エンジニアリング - Google Patents
包括的な転写機構エンジニアリング Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009509533A JP2009509533A JP2008533553A JP2008533553A JP2009509533A JP 2009509533 A JP2009509533 A JP 2009509533A JP 2008533553 A JP2008533553 A JP 2008533553A JP 2008533553 A JP2008533553 A JP 2008533553A JP 2009509533 A JP2009509533 A JP 2009509533A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell
- nucleic acid
- gene
- cells
- transcription machinery
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1058—Directional evolution of libraries, e.g. evolution of libraries is achieved by mutagenesis and screening or selection of mixed population of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1079—Screening libraries by altering the phenotype or phenotypic trait of the host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
- C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Ecology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Processing Of Solid Wastes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、改良された表現型を有する、変化した細胞を産生する、包括的な転写機構エンジニアリングに関する。
多くの重要な細胞の表現型が、疾患状態から代謝産生物過剰産生までにわたり、多くの遺伝子により影響されることが、現在、一般的に受容されている。だが、ほとんどの細胞および代謝エンジニアリング手段は、ベクターコンストラクションにおける実験的制限および転換効率による、単一の遺伝子の欠失または過剰発現に、ほぼ独占的に依存する。これらの制限は、複数の遺伝子修飾の同時の探索(simultaneous exploration)を排除し、遺伝子修飾検索を単一の遺伝子が一時に修飾される制限された配列手段へと限定する。
本発明は包括的に転写機構エンジニアリングを利用し、改良された表現型を有する変化した細胞を産生する。特に、本発明はゲノム規模レベル上でのプロモーターに対する異なる選択を有する、変異した細菌シグマ因子の産生を介して実証される。変異したシグマ因子の導入から生じる細胞は、急速および際立った表現型における改善、例えば有害な培養条件の耐性または改良された代謝産生物の産生など、を有する。
ある態様において、かかる核酸は核酸の集団(例えば、ライブラリ)の一員である。そのため、本発明の方法は、いくつかの態様において、かかる集団をかかる細胞へと導入することを含む。
かかる核酸の変異は、ある態様において、かかる核酸の指向進化、例えばエラープローンPCRによる変異、または遺伝子シャッフリングによる変異を含む。他の態様において、かかる核酸の変異はかかる核酸を1つまたは2つ以上の変異とともに合成することを含む。
本発明のいくつかの態様において、包括的な転写機構のプロモーター結合領域は1つまたは2つ以上の切断または欠失により中断または除去されない。他の態様において、かかる変異した包括的な転写機構は、非変異の包括的な転写機構に対して増加した遺伝子の転写、非変異の包括的な転写機構に対して減少した遺伝子の転写、非変異の包括的な転写機構に対して増加した遺伝子の転写の抑制、および/または非変異の包括的な転写機構に対して減少した遺伝子の転写の抑制を呈する。
さらに他の好ましい態様において、かかる表現型は毒性基質、代謝中間体または産生物に対して耐性である。毒性代謝産生物は、有機溶媒、酢酸塩、パラヒドロキシ安息香酸(pHBA)および過剰発現したタンパク質を含む。
いくつかの態様において、かかる細胞は多細胞生物に含有される。かかる態様において、好ましい表現型は、1つまたは2つ以上の成長特性、世代時間、1つまたは2つ以上の疫病または疾患に対する抵抗性、植物の果実またはその他の部分の産生、1つまたは2つ以上の発育変動、1つまたは2つ以上の寿命変化、機能の獲得または損失、および/または増加したロバスト性を含む。
本発明の方法は、ある態様において、また、かかる変化した細胞における遺伝子発現の変化を同定することを含む。遺伝子発現におけるかかる変化は、好ましくは、核酸マイクロアレイを用いて決定される。
他の態様において、かかる第2の細胞における遺伝子発現の変化は、遺伝子のモデルまたはタンパク質ネットワークを構築するために用いられ、かかるモデルはネットワークにおける1つまたは2つ以上の遺伝子産生物のうちどれが変化するかを決定するために用いられる。
かかる包括的な転写機構は、いくつかの態様において、1つより多い核酸および/またはポリペプチドの配列を含む、あるいは1つより多い核酸によりコードされる。
また、本発明に従い、前述の方法により産生される細胞が提供される。
本発明のもう1つの側面において、(カルボキシ末端)領域4を含む、切断されたシグマ因子タンパク質が提供される。
本発明のこれらのおよび他の側面、ならびにそのさまざまな態様は、本発明の図面および詳細な説明を参照することにより、より明らかとなるであろう。
図1は、包括的な転写機構エンジニアリングの基本的な手順を描く。変化した包括的な転写機構を細胞中へ導入することにより、かかる転写は変化し、遺伝子の発現レベルは包括的な様式で変わる。この研究において細菌性シグマ因子70(rpoDによりコードされる)はエラープローンPCRを受け、さまざまな変異体を産生した。かかる変異体は次いで低コピー発現ベクターへとクローン化されるが、その間、ほぼ完全な内部制限酵素部位の存在のために、シグマ因子の切断された形態となる可能性が生じた。かかるベクターを付いてE. Coli中へと導入し、所望の発現型に基づいてスクリーニングした。単離された変異体はそれから引き続く突然変異生成のラウンドおよび表現型をさらに改善する選別を受けることができる。
図5は、単離された株の、シクロヘキサン耐容性シグマ因子変異体との培養物の細胞密度を示す。
図6は、増加濃度のナリジクス酸における、抗生物質抵抗性シグマ因子変異体の単離された株の培養物の細胞密度を描く。
図8は、コントロールに対し発酵の間に達成されるリコピン生産における最大の倍増を描くドットプロットである。円のサイズは、倍加に比例する。
包括的な転写機構は、全ての細胞系(原核および真核)におけるトランスクリプトームの制御に関与する。細胞系において、かかるシグマ因子は、RNAポリメラーゼホロ酵素のプロモーター優先傾向に注目することにより、包括的な転写の組織化に決定的な役割を果たす(R. R. Burgess, L. Anthony, Curr. Opin. Microbiol 4, 126-131 (2001))。Escherichia coliは、6つの代替のシグマ因子、およびrpoD遺伝子によりコードされる1つの主要な因子、σ70を含有する。かかるタンパク質レベルにおいて、残基の領域はプロモーターサイトおよびかかるホロ酵素との接触に対して解析されてきた(J. T. Owens et al., PNAS 95, 6021-6026 (1998))。E. Coli.および他の細菌におけるσ70の結晶構造解析および部位特異性突然変異生成が、レポーター遺伝子の増加したまたは減少した転写により証拠付けられる、RNAポリメラーゼホロ酵素のin vitroプロモーター優先傾向を変化させる能力を実証してきた(A. Malhotra, E. Severinova, S. A. Darst, Cell 87, 127-36 (1996))。本発明は、ゲノム規模レベルでのプロモーターに対し変動する優先傾向を有する変異体シグマ因子を産生する能力を利用する。
多くの例において、包括的な転写機構を変異させるプロセスは包括的な転写機構の複数の変異を反復して作ることを含むであろうが、その必要はない、なぜなら、かかる包括的な転写機構の単一の変異でさえ、明細書中で実証されるような表現型の劇的な変更を結果的に引き起こすことができるからである。
かかる変異した包括的な転写機構は、非変異の包括的な転写機構に対して、増加したまたは減少した遺伝子の転写を呈することができる。さらに、かかる変異した包括的な転写機構は、非変異の包括的な転写機構に対して増加したまたは減少した遺伝子の転写の抑制を呈することができる。
原料および方法
株および培地
E. Coli DH5 α(Invitrogen, Carlsbad, CA)を、プロトコールに記載される定常の導入、ならびにこの実験における全ての表現型解析に用いた。株を5g/LのD−ブドウ糖を含有し、1mMのチアミンを添加したLB-Miller培地またはM9最少培地のいずれかにおいて、225RPMの回転攪拌で、37℃にて生育させた。低コピープラスミドの繁殖に対しては34μg/mlのクロラムフェニコールを、高コピープラスミドの維持に対しては、必要に応じ、68μg/mlのクロラムフェニコール、20μg/mlのカナマイシン、および100μg/mlのアンピシリンを、必要に応じて培地に添加した。細胞密度は、600nmにおける分光光度法でモニターした。M9最少塩はUS Biological (Swampscott, MA)より購入し、X-galはAmerican Bioanalytical (Natick, MA)より購入し、残りの全ての化学物質はSigma-Aldrich (St. Louis, MO)より購入した。プライマーは、Invitrogenより購入した。
低コピーの宿主プラスミド(pHACM)を、宿主バックグラウンド株としてpUC19(Yanisch-Perron, et al., Gene 33: 103-119, 1985)を用いて、ならびに、pACYC184中のCAT遺伝子(Chang, et al., J Bacteriol 134: 1141-1156, 1978)、およびpSC101からの複製の起源のpSC101(Bernardi, et al., Nucleuc Acuds Res 12: 9415-9426, 1984)を用いて、アンピシリン抵抗性をクロラムフェニコールと置換して、構築した。かかるpACYC184からのクロラムフェニコール遺伝子をAatIIとともに増幅し、AhdI制限部位をCMセンスAhdI:GTTGCCTGACTCCCCGTCGCCAGGCGTTTAAGGGCACCAATAAC(配列番号1)およびCMアンチAatII:CAGAAGCCACTGGAGCACCTCAAAACTGCAGT(配列番号2)プライマーを用いてオーバーハングした。かかる配列をpUC19骨格とともに分解し、ともにライゲーションし、pUC19-Cmを形成した。pSC101からのかかるpSC101断片は、pSCセンスAflIII:CCCACATGTCCTAGACCTAGCTGCAGGTCGAGGA(配列番号3)およびpSCアンチNotI:AAGGAAAAAAGCGGCCGCACGGGTAAGCCTGTTGATGATACCGCTGCCTTACT(配列番号4)プライマーを用いて、AflIIIおよびNotI制限部位オーバーハングとともに増幅した。この断片をpUC19-Cm構築とともに分解し、ともにライゲーションし、pHACMを形成した。
液体ライブラリーからの試料を負荷環境へと配置し、生存変異体に対し選別した。エタノール耐性に関し、株は50g/Lのエタノールを含有する、ろ過したLB中に配置した。これらの培養は、30×115mmの閉塞蓋の遠心チューブ中で、37℃で振盪して実行した。株を20時間後にプレートし、個々のコロニー試験に関して選別した。酢酸塩耐性に対しては、M9最少培地において20g/Lで開始し、30g/Lへと増加させた、酢酸塩の増加濃度において、2度、順番に継代培養した。次いで、細胞をLBプレートへと撒き、いくつかのコロニーを単一コロニーアッセイのために選択した。パラヒドロキシ安息香酸(pHBA)耐性に対しては、株をM9最少培地中の20g/LのpHBA中で培養し、20時間後にプレートし、生存細胞を選択した。改良された表現型であると同定された全ての株からのプラスミドを回収し、コンピテント細胞の新鮮なバッチへと再導入した。いくつかのコロニーが、表現型を検証するための生物学的な複製を実行するそれぞれのプレートから選択された。
変異体シグマ因子の配列は、以下の一式のプライマーを用いて、配列決定された。
S1:CCATATGCGGTGTGAAATACCGC(配列番号7)、
S2:CACAGCTGAAACTTCTTGTCACCC(配列番号8)、
S3:TTGTTGACCCGAACGCAGAAGA(配列番号9)、
S4:AGAAACCGGCCTGACCATCG(配列番号10)、
A1:GCTTCGATCTGACGGATACGTTCG(配列番号11)、
A2:CAGGTTGCGTAGGTGGAGAACTTG(配列番号12)、
A3:GTGACTGCGACCTTTCGCTTTG(配列番号13)、
A4:CATCAGATCATCGGCATCCG(配列番号14)、
A5:GCTTCGGCAGCATCTTCGT(配列番号15)、および
A6: CGGAAGCGATCACCTATCTGC(配列番号16)。
配列を整列させ、Clustal W version 1.82を用いて比較した。
シグマ因子ライブラリーの変異体は、LB複合培地におけるエタノールの高濃度の存在下において、増殖する能力に基づき、まず、選択される(L. P. Yomano, S. W. York, L. O. Ingram, J Ind Microbiol Biotechnol 20、132-8 (Feb、1998))。この選別に対し、株は連続的に50g/Lのエタノールで2度、一晩継代培養し、次いでプレートし、耐久性変異体に対する選別をした。合計20のコロニーを選択し、異なるエタノール濃度における増殖に対してアッセイした。改良された株の単離および検証ののち、最良の変異体シグマ因子は連続的なラウンドの進化を受けた。引き続く反復のいずれにおいても、選別濃度は70および80g/Lエタノールへと増加させた。これらの濃縮実験において、用いられる強い選択圧力のために、細胞は培養の4〜8時間後にプレートした。それぞれのラウンドから単離された変異体は、さまざまなエタノール濃度において、改良された全般的な増殖を示した(図2A)。
第2の例として、オリジナルのシグマ因子変異体ライブラリーを、M9最少培地における酢酸塩20g/Lにおいて、続いて30g/Lで、2度連続して継代培養した。単一のコロニーをこの混合物から単離し、再導入して、任意の染色体に基づく増殖適合を排除し、異なる酢酸塩濃度において、増殖に対してアッセイした。単離された株は高レベルの酢酸塩の存在において、耐性における強烈な増加を示した。さらに、かかる成長速度は、再度、酢酸塩の非存在において実質的には影響されなかった(表2)。30g/Lの酢酸塩において、単離された株は10.5〜12.5時間の倍加時間を有し、いくつかの抑制された対照群の倍加時間(56時間の倍加時間)の約1/5であった。
有機溶媒耐性
包括的な転写機構エンジニアリングの適用は、付加的な耐性表現型を含んで拡張されてきた。有機溶媒に対する細菌株耐性は、いくつかの状況において有用である:(1)有害廃棄物のバイオレメディエーション、(2)細菌からの有機溶媒のバイオプロダクト、および(3)2相反応器を要するバイオプロセス適用(例えば、疎水性産生物操作を連続的に除去するための抽出性発酵、など)。E. Coliにおける溶媒耐性を増加させる潜在性を調査するために、原型のrpoD(σ70)変異体ライブラリーを培養し、指数増殖器に収穫し、LB培地およびヘキサン(10%v/v)を含有する2相系へと導入した。株を、ヘキサン存在下での18時間増殖後、単離した。
抗生物質抵抗性
包括的な転写機構エンジニアリングの適用を、抗生物質抵抗性を含んで拡大させた。微生物における抗生物質抵抗性は、感染と戦う代替法を求めるヘルスケアおよび製薬会社において、ストレスを置く重要な問題となりつつある。多くの抵抗性株が、抵抗性に対してコードする特異的な遺伝子を含有すると知られる。しかしながら、微生物がそのような遺伝子を進化させられるようになる前に、それらはまず、抗生物質の存在下で存続する試みにおいて、初期の抵抗性を獲得する。かかるゲノムにおいて起こるランダム変異は代替のものであるが、細胞はまた、これらの抗生物質に対する反応におけるそれらの遺伝子発現を変化することができる。包括的な転写機構エンジニアリングの使用は、抗生物質抵抗性株を作る可能性を同定するために試験した。この表現型は、トランスクリプトームの変更された発現により制御され、変異体転写機構を介して調節された。これらの株の遺伝子発現の解析により、かかる株の抵抗性を制御する新規の遺伝子標的および酵素の同定をできるようにし得る。
代謝産生物過剰産生表現型
包括的な転写機構エンジニアリングの基本的なテネットは、複数および同時の遺伝子発現修飾を作る能力である。以前、この方法は増加した耐性表現型を持つ変異体の同定に対して成功的に採用された。これらの引き続く例において、rpoDによりコードされる、かかる主要なシグマ因子の変異体ライブラリーは、単一の遺伝子修飾により達成されるレベルを超えて、代謝産生物過剰産生表現型を増強する能力に関して試験された。
以前、我々は、前もって設計された株のバックグウンドにおいてリコピン産生の増加を示す単一および複数遺伝子ノックアウト標的の多数を同定した(Alper et al., Nat Biotechnol 2005 and Alper et al., Metab Eng 2005)。この研究において、我々はリコピン産生を増加させる包括的な転写機構エンジニアリングの技術の利用を探索した。親株とともに以前設計されたいくつかの利用可能なバックグラウンドを利用し、それぞれのバックグラウンドにおいて独立して、変異体因子に対する探索が可能となり、その結果増加したリコピン産生となった。この研究に関し、親株Δhnrおよび2つの同定された包括的な最大株ΔgdhAΔaceEΔfdhFおよびΔgdhAΔaceEΔPyjiDを選択した。次いで、4つの試験した遺伝子バックグラウンドそれぞれからの最良の変異体を取りかえ、4株を4つの同定された変異体シグマ因子と混合することにより作られたランドスケープを調査した。
かかる変異体シグマ因子ライブラリーをかかる4つの株それぞれへと導入し、リコピン産生に基づいて、5g/Lのブドウ糖を添加した最少培地プレート上で選択した。それから、選択された株を培養し、リコピン産生に関し、15および24時間後に、M9培地を用いてアッセイした。図7A〜Dは、これらのサーチの結果を、最良の株からのシグマ因子変異体の配列とともに描く。制御プラスミドを持つまたは持たない株に関するリコピン産生を示す。いくつかのバックグラウンドに関し、この制御プラスミドの結果、このプラスミドが欠如する株に対し、リコピン産生における大きな減少が生じた。興味深いことに、これらの同定された因子の全ては切断された。さらに、hnrノックアウトバックグラウンドから同定された変異体は、単純に切断され、変異を含有しなかった。この切断に対する作用の推測されるモードを考えると、この変異体因子はrpoDの制御下で発現される全ての正常な遺伝子を必然的に抑制することが考えら得る。hnr変異体において、より高い安定レベルの静止期シグマ因子、σSは、転写の残りを引き継ぐために利用可能である。さらに、このバックグラウンドにおいて2番目に高い変異体は、いくつかの変異を含有する全長シグマ因子という結果となった。
次いで、異なる遺伝のバックグランドを持つ4つの株を、4つの独立して同定された変異体シグマ因子と組み合わせ、生じた16株のランドスケープを分析した。まず、興味深いことに、所定の遺伝背景に対して配列化した、図7A〜7Dで同定した変異体のいずれも、もう1つの遺伝背景において同定されたものと重複しなかった。結果として、まず、かかるランドスケープが対角優位(diagonally-dominant)であることが推測され、かかる変異体因子により引き出される効果が遺伝背景特異性であることを示した。これらの16株を対照群とともに、段階的なブドウ糖供給で、2×M9培地中で培養した。かかるリコピンレベルを15、24、39、および48時間時点で分析した。図4は、発酵の間の対照群に対して達成されたリコピン産生における最大倍増を描くドットプロットを提示する。円のサイズは、倍増に比例する。推測されるように、かかるランドスケープは、同定された株のバックグラウンドにおいて圧倒的に機能する変異体因子に関し、明白に対角優位であった。
包括的な転写機構エンジニアリングの適用は、代謝産生物過剰生産のさらなる例を含むよう拡張されてきた。(リコピン産生に加えて)追加の代謝の表現型である、ポリヒドロキシブチレート(PHB)のバイオプロダクトを、転写機構エンジニアリングを用いて調査した。PHBがアセチル−coAの前駆体分子から産生された。
修正pJOE7(Lawrence, A. G., J. Choi, C. Rha, J. Stubbe, and A. J. Sinskey. 2005. Biomacromolecules 6:2113-2119)プラスミドで転換したEscherichia coli (XL-1 Blue, Stratagene, La Jolla, Calif.)を、20g/Lブドウ糖および25μg/mLカナマイシン含有Luria-Bertani(LB)培地中、37℃で培養した。修正pJOE7は、Dr. Anthony Sinskey (MIT, Cambridge, MA)より寛大に譲受され、C. necatorからのphaABおよびAllochromatium vinosumからのphECを含有し、カナマイシン抵抗性をコードする。PHBでない対照として、pha遺伝子がない同様なプラスミドも、また、培養した。最適密度を用い、Ultraspec 2100 pro (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)を用いた細胞増殖を追跡した。
他に記載のない限りは、ナイルレッド(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)原液を溶解させて、ジメチルスルホキシド中で1mg/mlとした。染色の最適化において示されるように、3μLの原液を1mlの染色バッファーへ添加した。フローサイトメトリーを、FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA)上で、以下の設定を用いて実行した;Synechocystis FSC=E00, SSC=411, FL-1=582, FL-2=551およびE. coli FSC=E00, SSC=411, FL-1=582, FL-2=535。細胞を空冷アルゴンイオンレーザー(488nm)で励起させ、FL2(585nm)を用いてナイルレッド染色を検出した。フローサイトメトリー解析をWinMDI 2.8を用いて50,000細胞において実施した。
PHBを従来より示されるように解析した(Taroncher-Oldenburg, G., and G. Stephanopoulos. 2000. Applied Microbiology and Biotechnology 54:677-680)。>10mgの細胞を培養物より遠心分離(10分、3,200g)で収集した。得られたペレットを冷脱イオンH2Oで一度洗浄し、80℃で一晩乾燥させた。乾燥したペレットを1mlの濃縮H2SO4中で60分間沸騰させ、4mlの0.014MのH2SO4で希釈した。サンプルを遠心分離し(15分、18,000g)、細胞残屑を除去し、Aminex HPX-87Hイオン排除カラム(300 x 7.8 mm; Bio-Rad, Hercules, Calif.)を用いてHPLCにより解析した(Karr, D. B., J. K. Waters, and D. W. Emerich. 1983. Applied and Environmental Microbiology 46:1339-1344)。市販のPHB(Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.)を試料と平行して加工し、基準として用いた。
修飾pJOEを持つE. coli XL1-blueおよび非PHB対照を、記載通りに培養した。
スクロース濃度最適化:異なるスクロース濃度(0、5、10、15、20%)のTSEバッファーを用いて、スクロースショックにより細胞を作製した。
ライブラリー多様性および構築
シグマ因子ライブラリーのサイズおよび幅は、以下の方法の1つまたは2つ以上のように増加した。
表現型をさらに改善し、転写機構ユニットの複数の変異体の形式を同時に導入することにより、最適化した株を探索することも可能であり得る。かかる突然変異したシグマ因子遺伝子(または他の包括的な転写機構)を、例えば、2つまたは3つ以上のこれらの遺伝子を共発現する発現カセットを用いて、発現させる。かかる2つまたは3つ以上の遺伝子は、2つまたは3つ以上の同じ型の転写機構(例えば、2つの形式のrpoD)または2つまたは3つ以上の異なる転写機構(例えば、rpoDおよびrpoS)であってもよい。
真核細胞における包括的な転写機構エンジニアリング
包括的な転写機構の指向進化を、強化された組み換えタンパク質産生および誘発条件におけるアポトーシスの抵抗性に対して、酵母および哺乳類系(例えば、CHO、HeLa、Hek 細胞系)に適用する。
SDS耐性
包括的な転写機構の指向進化を、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)に対する細胞耐性の問題に適用した。
複数の表現型のエンジニアリング
包括的な転写機構エンジニアリングを、E. coliにおける複数の耐性表現型を付与する問題へと適用した。エタノールおよびSDS両方への耐性を獲得するために、第1のセットの実験において、株を3つの代替の方策に従って単離した;(i)変異体をエタノールおよびSDSの両方における処置/選別後に単離した、(ii)まずエタノールに対して耐性である変異体を単離し、次いで突然変異生成の追加のラウンドを施し、エタノール/SDS混合物を用いて選別した、そして(iii)まずSDSに対して耐性である変異体を単離し、次いで、追加のラウンドの突然変異生成を施し、エタノール/SDS混合物を用いて選別した。これらの株をさまざまな濃度のエタノールおよびSDSの存在下で生育に関して試験し、成長曲線を得、これらの方策の効率を評価した。かかる実験は、上記の他の例のプロトコールを用いて、実施した。
包括的な転写機構エンジニアリング(gTME)の酵母系への拡張
任意の型の細胞系において、タンパク質のサブセットは包括的な遺伝子発現の調製に関与する。そのように、これらのタンパク質は、より高次な生命体の表現型に広く影響を及ぼす多様なトランスクリプトーム修飾にアクセスポイントを提供する。この例により、gTMEの酵母(Saccharomyces cerevisiae)の真核のモデル系への適用が実証される。原核系の転写機構と全く対照的に、真核性の転写機構は、プロモーター特異性を調節することに関連するコンポーネントおよび因子の数に関し、より複雑である。まず、真核系においては、別の機能を有する3つのRNAポリメラーゼ酵素がある一方、原核生物においてはただ1つのみ存在する。
本研究で用いたS. cerevisiae 株 BY4741 (MATa;his3D1;leu2D0;met15D0;ura3D0)は、EUROSCARF, Frankfurt, Germanyより得た。それを、YPD培地(10gの酵母エキス/リットル、20gのBacto Peptone/リットルおよび20gのブドウ糖/リットル)で培養した。酵母の形質転換に関し、Frozen-EZ Yeast Transformation II(ZYMO RESEARCH)を用いた。選択マーカーとしてURA3を持つプラスミドを生じる酵母形質転換細胞を選別し生育させるために、6.7gのYeast Nitrogen Base(Difco)/リットル、20gのブドウ糖/リットルおよび適合したヌクレオチドの混合物を含有する、酵母完全合成(yeast synthetic complete (YSC))培地を用い、明細書中でYSC Ura-培地と言及されるアミノ酸(CSM-URA、Qbio遺伝子)を、固体培地に対し、1.5%の寒天とともに添加した。
浸透圧ストレス反応および耐性は、細胞における、複雑で、多面的な反応である。酵母に関し、およそ100mMの上昇したLiCl濃度により浸透圧ストレスを誘発することが示されてきた(Haro, Garciadeblas, & Rodriguez-Navarro, FEBS Lett, 291(2), 189-191, 1991;Lee, Van Montagu, & Verbruggen, Proc Natl Acad Sci U S A, 96(10), 5873-5877, 1999;Park et al., Nat Biotechnol, 21(10), 1208-1214, 2003)。TBPまたはTAF25のいずれかの変異体形式を保因する酵母細胞ライブラリーを、200〜400mMのLiClの存在下で連続継代培養した。株を単離および再転換し、かかる表現型は変異体因子の成果であることを再実証した。興味深いことに、それぞれのライブラリーからの最良の株は、LiClに対して変動する改善を示した。かかるTAF25は、低LiCl濃度において、それぞれのTAF非変異対照群より優れていたが、約200mMの濃度においては有効ではなかった。逆に、SPT15変異体は、150〜400mMの上昇レベルにおいて対照群よりも優れるものとできた。それぞれの場合において、LiCl欠如における増殖表現型は、かかる変異体因子の存在により影響を及ぼされなかった。増殖収率における改善の概要を図12において提示する。配列解析(図13)により、LiCl耐性における改善はそれぞれのタンパク質における単一の変異により制御され、SPT変異は非保存領域で生じた。
高ブドウ糖発酵が、酵母のバッチ培養から産生された、増加されたエタノールに関して探究されてきた。しかしながら、これらの「非常に高い重大な(gravity)発酵」は、しばしば、細胞増殖に対し極めて阻害性であり、典型的には細胞を変更することよりむしろ、培地組成物を変更することにより処置される(Bafrncova et al., Biotechnology Letters, 21(4), 337 - 341, 1999;Bai et al., J Biotechnol, 110(3), 287-293, 2004;Thatipamala, Rohani, & Hill, Biotechnology and Bioengineering, 40(2), 289-297, 1992)。gTMEを用いてこの問題を探求するために、TBPまたはTAF25のいずれかの変異体形式を保因する酵母細胞ライブラリーを、200〜400g/Lのブドウ糖の存在下で連続継代培養した。株を単離し、再導入して、かかる表現型がかかる変異体因子の成果であることを再実証した。
酵母に関するバイオエタノールの成功的な発酵は、高ブドウ糖およびエタノール濃度の両方に対する耐性を必要とする。この目的を達成するために、複合耐性表現型を、エタノールおよびブドウ糖の上昇レベル(5%および100g/L)へと両方の変異体ライブラリーを同時に処置することを介して、試験した。単離された株を再導入し、5および6%エタノールの存在下のブドウ糖濃度の範囲下でアッセイした。興味深いことに、かかるSPT15変異体は試験をした全ての濃度において対照群より優れており、いくつかの濃度においては13倍もの改善であった。この改善は、6%エタノールの存在下で増殖できなかったTAF25変異体の全体の改善をはるかに超えていた。図16はこれらの最良の株の成長解析を表示し、配列は図17で提供される。かかる変異体転写機構の導入を介して達成される改善は、他の手段の改善された細胞表現型を介して得られた改善をはるかに凌いだ。さらに、これらの結果により、高い引力(gravity)の発酵を用いる高いエタノール産生の生育可能なソースとして酵母を使用する存在性を促進させる。
明細書中で開示される全ての引例は、その全体を引例として組み入れる。
Claims (140)
- 細胞の表現型を変化するための方法であって、
包括的な転写機構、および随意にそのプロモーターをコードする核酸を変異させること、
前記核酸を細胞に発現させ、変異した包括的な転写機構を含む、変化した細胞を提供すること、および、
前記変化した細胞を培養すること、
を含む、前記方法。 - 変化した細胞の表現型を決定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 核酸の変異を繰り返し、第n世代の変化した細胞を産生することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 第n世代の変化した細胞の表現型を決定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 包括的な転写機構の変異の繰り返しのステップが、変異した包括的な転写機構をコードする核酸、および随意にそのプロモーターを変化した細胞から単離すること、前記核酸を変異させること、ならびに前記変異した核酸を別の細胞へと導入することを含む、請求項3に記載の方法。
- 細胞が原核細胞である、請求項1に記載の方法。
- 原核細胞が細菌細胞または古細菌細胞である、請求項6に記載の方法。
- 包括的な転写機構がシグマ因子またはアンチシグマ因子である、請求項7に記載の方法。
- シグマ因子をコードする核酸がrpoD(σ70)遺伝子、rpoF(σ28)遺伝子、rpoS(σ38)遺伝子、rpoH(σ32)遺伝子、rpoN(σ54)遺伝子、rpoE(σ24)遺伝子またはfecI(σ19)遺伝子である、請求項8に記載の方法。
- シグマ因子またはアンチシグマ因子が発現ベクターから発現される、請求項8に記載の方法。
- 細胞が真核細胞である、請求項1に記載の方法。
- 真核細胞が酵母細胞である、請求項11に記載の方法。
- 真核細胞が哺乳類細胞である、請求項11に記載の方法。
- 真核細胞が植物細胞である、請求項11に記載の方法。
- 真核細胞が昆虫細胞である、請求項11に記載の方法。
- 真核細胞が幹細胞である、請求項11に記載の方法。
- 真核細胞が真菌細胞である、請求項11に記載の方法。
- 真核細胞が多細胞生物に含有される、請求項11〜17のいずれかに記載の方法。
- 核酸が、細胞において組織特異性プロモーター、細胞特異性プロモーター、または細胞小器官特異性プロモーターから発現される、請求項11に記載の方法。
- 包括的な転写機構が、RNAポリメラーゼI、RNAポリメラーゼII、またはRNAポリメラーゼIII、あるいはRNAポリメラーゼI、RNAポリメラーゼII、またはRNAポリメラーゼIIIのプロモーターに結合する、請求項11に記載の方法。
- 包括的な転写機構がTFIIDまたはそのサブユニットである、請求項20に記載の方法。
- サブユニットがTATA結合タンパク質(TBP)またはTBP関連因子(TAF)、例えばTAF25である、請求項21に記載の方法。
- 包括的な転写機構をコードする核酸が、GAL11遺伝子、SIN4遺伝子、RGR1遺伝子、HRS1遺伝子、PAF1遺伝子、MED2遺伝子、SNF6遺伝子、SNF2遺伝子またはSWI1遺伝子である、請求項20に記載の方法。
- 包括的な転写機構が、核酸メチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチラーゼまたはヒストンデアセチラーゼである、請求項20に記載の方法。
- 包括的な転写機構が発現ベクターから発現される、請求項20または請求項24に記載の方法。
- 核酸が真核細胞の細胞小器官の核酸である、請求項11に記載の方法。
- 細胞小器官がミトコンドリアまたは葉緑体である、請求項26に記載の方法。
- 核酸が発現ベクターの一部である、請求項1に記載の方法。
- 核酸が核酸の集団の一員である、請求項1に記載の方法。
- 細胞に集団を導入することをさらに含む、請求項29に記載の方法。
- 核酸を発現させるステップが、核酸をゲノム中へと融合させること、または内因性の包括的な転写機構をコードする核酸を置換することを含む、請求項1に記載の方法。
- 核酸の変異が核酸の指向進化を含む、請求項1に記載の方法。
- 指向進化がエラープローンPCRによる変異を含む、請求項32に記載の方法。
- 指向進化が遺伝子シャッフリングによる変異を含む、請求項32に記載の方法。
- 核酸の変異が、核酸を1つまたは2つ以上の変異とともに合成することを含む、請求項1に記載の方法。
- 核酸の変異が1つまたは2つ以上の点変異である、請求項1に記載の方法。
- 核酸の変異が1つまたは2つ以上の切断または欠失である、請求項1に記載の方法。
- 包括的な転写機構のプロモーター結合領域が、1つまたは2つ以上の切断または欠失によって中断または除去されない、請求項37に記載の方法。
- 変異した包括的な転写機構が、非変異の包括的な転写機構に相対した増加した遺伝子の転写を呈する、請求項1に記載の方法。
- 変異した包括的な転写機構が、非変異の包括的な転写機構に相対した低下した遺伝子の転写を呈する、請求項1に記載の方法。
- 変異した包括的な転写機構が、非変異の包括的な転写機構に相対した増加した遺伝子転写の抑制を呈する、請求項1に記載の方法。
- 変異した包括的な転写機構が、非変異の包括的な転写機構に相対した低下した遺伝子転写の抑制を呈する、請求項1に記載の方法。
- 既定の表現型へと変化した細胞を選択することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 選択のステップが、変化した細胞を選択条件下で培養することを含む、請求項43に記載の方法。
- 選択のステップが表現型に対する個々の細胞のハイスループットアッセイを含む、請求項43に記載の方法。
- 表現型が、有害な培養条件への増加した耐性である、請求項43に記載の方法。
- 表現型が溶媒耐性または有害廃棄物耐性である、請求項46に記載の方法。
- 溶媒がエタノール、ヘキサンまたはシクロヘキサンである、請求項47に記載の方法。
- 表現型が工業媒体への耐性である、請求項46に記載の方法。
- 表現型が高糖分濃度への耐性である、請求項46に記載の方法。
- 表現型が高塩分濃度または浸透圧ストレスへの耐性である、請求項46に記載の方法。
- 表現型が高温への耐性である、請求項46に記載の方法。
- 表現型が極度のpHへの耐性である、請求項46に記載の方法。
- 表現型が界面活性剤への耐性である、請求項46に記載の方法。
- 表現型が複数の有害な条件への耐性、例えば高糖分濃度および高エタノール濃度の耐性である、請求項46に記載の方法。
- 表現型が増加した代謝産生物産生である、請求項43に記載の方法。
- 代謝産生物がリコピンまたはエタノールである、請求項56に記載の方法。
- 代謝産生物がポリヒドロキシブチレート(PHB)である、請求項56に記載の方法。
- 代謝産生物が治療用タンパク質である、請求項56に記載の方法。
- 治療用タンパク質が抗体または抗体断片である、請求項59に記載の方法。
- 表現型が毒性基質、代謝中間体または産生物に対して耐性である、請求項43に記載の方法。
- 毒性代謝産生物が有機溶媒である、請求項61に記載の方法。
- 毒性代謝産生物が酢酸またはパラ−ヒドロキシ安息香酸(pHBA)である、請求項62に記載の方法。
- 毒性代謝産生物が過剰発現したタンパク質である、請求項62に記載の方法。
- 表現型が抗生物質抵抗性である、請求項43に記載の方法。
- 表現型がアポトーシスに対する増加した抵抗性である、請求項43に記載の方法。
- 細胞が多細胞物に含有される、請求項43〜45のいずれかに記載の方法。
- 表現型が、1つまたは2つ以上の成長特性、世代時間、1つまたは2つ以上の疫病または疾患に対する抵抗性、植物の果実またはその他の部分の産生、1つまたは2つ以上の発育変動、1つまたは2つ以上の寿命変化、機能の獲得または損失、および/または増加したロバスト性である、請求項67に記載の方法。
- 方法において使用される細胞が、包括的な転写機構の変異に先立ち、表現型に対して最適化される、請求項1に記載の方法。
- 変化した細胞における遺伝子発現の変化を同定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 遺伝子発現の変化を核酸マイクロアレイを用いて決定する、請求項70に記載の方法。
- 細胞の表現型を変化させるための方法であって、
第2の細胞における遺伝子発現の変化を検出するために同定される第1の細胞における1つまたは2つ以上の遺伝子産生物の発現を変化させ、そこにおいて前記第2の細胞における遺伝子発現の変化が前記第2の細胞の包括的な転写機構を変異させることにより産生されること、
を含む、前記方法。 - 第1の細胞における1つまたは2つ以上の遺伝子産生物の発現を変化させることが、第2の細胞において増加する1つまたは2つ以上の遺伝子産生物の発現を増加させることを含む、請求項72に記載の方法。
- 1つまたは2つ以上の遺伝子産生物の発現が、第1の細胞へ1つまたは2つ以上の遺伝子産生物を発現する1つまたは2つ以上の発現ベクターを導入することにより、増加される、請求項73に記載の方法。
- 1つまたは2つ以上の遺伝子産生物の発現が、1つまたは2つ以上の遺伝子産生物をコードする1つまたは2つ以上の内因性遺伝子の転写を増加させることにより、増加される、請求項73に記載の方法。
- 1つまたは2つ以上の内因性遺伝子の転写を増加させることが1つまたは2つ以上の遺伝子の転写制御配列を変異させることを含む、請求項75に記載の方法。
- 第1の細胞における1つまたは2つ以上の遺伝子産生物の発現を変化させることが、変化した細胞において低下した1つまたは2つ以上の遺伝子産生物の発現を減少させることを含む、請求項72に記載の方法。
- 1つまたは2つ以上の遺伝子産生物の発現が、第1の細胞へ1つまたは2つ以上の遺伝子産生物の発現を低下させる核酸分子を導入することにより低下させる、請求項77に記載の方法。
- 核酸分子がsiRNA分子であるか、またはsiRNA分子を発現する、請求項78に記載の方法。
- 1つまたは2つ以上の遺伝子産生物の発現が、1つまたは2つ以上の遺伝子産生物をコードする1つまたは2つ以上の遺伝子、あるいは前記1つまたは2つ以上の遺伝子の転写制御配列を変異させることにより低下される、請求項77に記載の方法。
- 第2の細胞における遺伝子発現の変化が、核酸マイクロアレイを用いて決定される、請求項72に記載の方法。
- 第2の細胞における遺伝子発現の変化が、遺伝子またはタンパク質ネットワークのモデルを構築するために用いられ、そこにおいて、前記モデルが1つまたは2つ以上の遺伝子産生物のいずれが変化するかを選択するために用いられる、請求項72に記載の方法。
- 包括的な転写機構が1つより多い核酸および/またはポリペプチドを含む、または1つより多い核酸によりコードされる、請求項1〜82のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜83のいずれかに記載の方法により産生される細胞。
- 代謝産生物の産生を変化させるための方法であって、
請求項1〜83のいずれかに記載の方法に従って、変化した細胞を産生する選択された代謝産生物を産生する細胞の包括的な転写機構を変異させること、および、
増加したまたは減少した量の前記選択された代謝産生物を産生する変化した細胞を単離すること、
を含む、前記方法。 - 請求項85に記載の方法であって、前記方法が、
単離された細胞を培養すること、および、
前記細胞または前記細胞培養物から代謝産生物を回収すること、
をさらに含む、前記方法。 - 代謝産生物がリコピンまたはエタノールである、請求項85に記載の方法。
- 代謝産生物がポリヒドロキシブチレート(PHB)である、請求項85に記載の方法。
- 代謝産生物が治療用タンパク質である、請求項85に記載の方法。
- 治療用タンパク質が組み換えタンパク質である、請求項89に記載の方法。
- 治療用タンパク質が抗体または抗体断片である、請求項89に記載の方法。
- 細胞が原核細胞である、請求項85に記載の方法。
- 原核細胞が細菌細胞または古細菌細胞である、請求項92に記載の方法。
- 細胞が真核細胞である、請求項85に記載の方法。
- 真核細胞が酵母細胞である、請求項94に記載の方法。
- 真核細胞が哺乳類細胞である、請求項94に記載の方法。
- 真核細胞が植物細胞である、請求項94に記載の方法。
- 真核細胞が昆虫細胞である、請求項94に記載の方法。
- 真核細胞が幹細胞である、請求項94に記載の方法。
- 真核細胞が真菌細胞である、請求項94に記載の方法。
- 包括的な転写機構が真核細胞の細胞小器官の核酸によりコードされる、請求項85に記載の方法。
- 細胞小器官がミトコンドリアまたは葉緑体である、請求項101に記載の方法。
- 複数の異なる核酸分子種を含む集団であって、個々の核酸分子種が異なる変異を含む包括的な転写機構をコードする、前記集団。
- 包括的な転写機構がシグマ因子またはアンチシグマ因子である、請求項103に記載の集団。
- シグマ因子をコードする核酸が、rpoD(σ70)遺伝子、rpoF(σ28)遺伝子、rpoS(σ38)遺伝子、rpoH(σ32)遺伝子、rpoN(σ54)遺伝子、rpoE(σ24)遺伝子またはfecI(σ19)遺伝子である、請求項104に記載の集団。
- 包括的な転写機構が、RNAポリメラーゼI、RNAポリメラーゼIIまたはRNAポリメラーゼIII、あるいはRNAポリメラーゼI、RNAポリメラーゼIIまたはRNAポリメラーゼIIIのプロモーターに結合する、請求項C1に記載の集団。
- 包括的な転写機構がTFIIDまたはそのサブユニットである、請求項106に記載の集団。
- サブユニットがTATA結合タンパク質(TBP)またはTBP関連因子(TAF)、例えばTAF25である、請求項107に記載の集団。
- 包括的な転写機構が、核酸メチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチラーゼまたはヒストンデアセチラーゼである、請求項103に記載の集団。
- 核酸分子種が発現ベクターに含有される、請求項103に記載の集団。
- 核酸が組織特異性プロモーター、細胞特異性プロモーター、または細胞小器官特異性プロモーターから発現される、請求項110に記載の集団。
- 発現ベクターが複数の異なる核酸分子種を含有し、それぞれの核酸分子種が異なる包括的な転写機構をコードする、請求項110に記載の集団。
- 包括的な転写機構が指向進化により変異される、請求項103に記載の集団。
- 指向進化がエラープローンPCRを用いて実行される、請求項113に記載の集団。
- 指向進化が遺伝子シャッフリングを用いて実行される、請求項113に記載の集団。
- 包括的な転写機構における変異が1つまたは2つ以上の点変異である、請求項103に記載の集団。
- 包括的な転写機構における変異が1つまたは2つ以上の切断または欠失である、請求項103に記載の集団。
- 切断が包括的な転写機構のプロモーター結合領域を含まない、請求項117に記載の集団。
- 細胞の包括的な転写機構が請求項1〜83のいずれかに記載の方法に従って変異される、請求項103に記載の集団。
- 請求項103〜119のいずれかに記載の核酸分子の集団を含む細胞の集団。
- 複数の細胞を含み、前記複数の細胞のそれぞれが1つまたは2つ以上の核酸分子を含む、請求項120に記載の集団。
- 細胞が原核細胞である、請求項120に記載の集団。
- 原核細胞が細菌細胞または古細菌細胞である、請求項122に記載の集団。
- 細胞が真核細胞である、請求項120に記載の集団。
- 真核細胞が酵母細胞である、請求項124に記載の集団。
- 真核細胞が哺乳類細胞である、請求項124に記載の集団。
- 真核細胞が植物細胞である、請求項124に記載の集団。
- 真核細胞が昆虫細胞である、請求項124に記載の集団。
- 真核細胞が幹細胞である、請求項124に記載の集団。
- 真核細胞が真菌細胞である、請求項124に記載の集団。
- 核酸分子が細胞のゲノムへと融合する、または内因性の包括的な転写機構をコードする核酸を置換する、請求項120に記載の集団。
- 複数のラウンドの変異により産生される包括的な転写機構をコードする、核酸。
- 複数のラウンドの変異が指向進化を含む、請求項132に記載の核酸。
- 指向進化がエラープローンPCRによる変異を含む、請求項133に記載の核酸。
- 指向進化が遺伝子シャッフリングによる変異を含む、請求項133に記載の核酸。
- 核酸が複数の異なる包括的な転写機構種をコードする、請求項132に記載の核酸。
- 核酸が複数の異なるバージョンの同じ型の包括的な転写機構種をコードする、請求項132に記載の核酸。
- 請求項132〜136に記載の核酸によりコードされる包括的な転写機構。
- (カルボキシ末端)領域4を含む、切断されたシグマ因子タンパク質。
- 選択された廃棄物のバイオレメディエーションのための方法であって、
請求項1〜83のいずれかに記載の方法に従って、変化した細胞を産生する細胞の包括的な転写機構を変異させること、
変化しない細胞に相対して増加した量の選択された廃棄物を代謝する変化した細胞を単離すること、
前記単離された細胞を培養すること、および、
前記変化した細胞を前記選択された廃棄物へと暴露し、それにより前記選択された廃棄物のバイオレメディエーションを提供すること、
を含む、前記方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US11/238,096 US20070072194A1 (en) | 2005-09-28 | 2005-09-28 | Global transcription machinery engineering |
US74831505P | 2005-12-07 | 2005-12-07 | |
PCT/US2006/037597 WO2007038564A2 (en) | 2005-09-28 | 2006-09-28 | Global transcription machinery engineering |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009509533A true JP2009509533A (ja) | 2009-03-12 |
JP2009509533A5 JP2009509533A5 (ja) | 2009-11-12 |
Family
ID=37891512
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008533553A Pending JP2009509533A (ja) | 2005-09-28 | 2006-09-28 | 包括的な転写機構エンジニアリング |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1943343A2 (ja) |
JP (1) | JP2009509533A (ja) |
WO (1) | WO2007038564A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016521763A (ja) * | 2013-06-24 | 2016-07-25 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーションCj Cheiljedang Corporation | L−スレオニン産生微生物およびこれを用いたl−スレオニンの産生方法 |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20090127868A (ko) * | 2006-12-07 | 2009-12-14 | 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 | 광역 전사 기구 조작 |
US8193314B2 (en) | 2007-07-12 | 2012-06-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Transcriptional engineering of Lactobacillus |
WO2009025761A2 (en) | 2007-08-17 | 2009-02-26 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for identifying bacterial strains that produce l-tyrosine |
US20100330614A1 (en) * | 2007-11-06 | 2010-12-30 | Massachusetts Institute Of Technology | Global transcription machinery engineering targeting the rnap alpha subunit (rpoa) |
WO2011159629A2 (en) * | 2010-06-14 | 2011-12-22 | Cobalt Technologies, Inc. | Salt selection of microbial mutants to increase bioproduct tolerance, titer, or osmotic shock tolerance |
CN104630149B (zh) * | 2013-11-08 | 2018-08-21 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 外源线粒体导入到哺乳动物细胞中的方法 |
CN104845924B (zh) * | 2015-04-01 | 2018-03-16 | 农业部沼气科学研究所 | 一株耐呋喃甲醛的运动发酵单胞菌及其制备方法和应用 |
-
2006
- 2006-09-28 WO PCT/US2006/037597 patent/WO2007038564A2/en active Application Filing
- 2006-09-28 JP JP2008533553A patent/JP2009509533A/ja active Pending
- 2006-09-28 EP EP06825155A patent/EP1943343A2/en not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (11)
Title |
---|
JPN6012011297; J. Bacteriol. Vol. 186, No. 12, 2004, p. 4034-4037 * |
JPN6012011300; J. Mol. Biol. Vol. 203, 1988, p. 29-37 * |
JPN6012011303; Mol. Gen. Genet. Vol. 184, 1981, p. 166-173 * |
JPN6012011304; Genetics Vol. 153, 1999, p. 643-652 * |
JPN6012011305; J. Mol. Biol. Vol. 254, 1995, p. 815-837 * |
JPN6012011307; J. Bacteriol. Vol. 183, No. 21, 2001, p. 6413-6421 * |
JPN6013027445; J. Bacteriol. Vol. 187, No. 3, 2005, p. 1022-1035 * |
JPN6013027447; Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 288, 2001, p. 385-389 * |
JPN6013027449; FEMS Microbiol. Lett. Vol. 242, 2005, p. 161-167 * |
JPN6013027451; J. Biol. Chem. Vol. 279, 2004, p. 54369-54379 * |
JPN6013027452; J. Bacteriol. Vol. 181, No. 18, 1999, p. 5855-5859 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016521763A (ja) * | 2013-06-24 | 2016-07-25 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーションCj Cheiljedang Corporation | L−スレオニン産生微生物およびこれを用いたl−スレオニンの産生方法 |
US9758772B2 (en) | 2013-06-24 | 2017-09-12 | Cj Cheiljedang Corporation | L-threonine-producing microorganism and production method for L-threonine using the same |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2007038564A2 (en) | 2007-04-05 |
WO2007038564A3 (en) | 2007-06-28 |
EP1943343A2 (en) | 2008-07-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9273307B2 (en) | Global transcription machinery engineering | |
EP2407541A1 (en) | Global transcription machinery engineering | |
EP3555278B1 (en) | Thermostable cas9 nucleases | |
JP2009509533A (ja) | 包括的な転写機構エンジニアリング | |
Jin et al. | Improvement of xylose uptake and ethanol production in recombinant Saccharomyces cerevisiae through an inverse metabolic engineering approach | |
Woodruff et al. | Engineering improved ethanol production in Escherichia coli with a genome-wide approach | |
Otoupal et al. | Multiplexed CRISPR-Cas9-based genome editing of Rhodosporidium toruloides | |
Klein-Marcuschamer et al. | Mutagenesis of the bacterial RNA polymerase alpha subunit for improvement of complex phenotypes | |
Luan et al. | Genome replication engineering assisted continuous evolution (GREACE) to improve microbial tolerance for biofuels production | |
US10711267B2 (en) | Recombinant type I CRISPR-Cas system | |
Maeda et al. | Protein engineering of hydrogenase 3 to enhance hydrogen production | |
García-Hidalgo et al. | Vanillin production in Pseudomonas: whole-genome sequencing of Pseudomonas sp. strain 9.1 and reannotation of Pseudomonas putida CalA as a vanillin reductase | |
JP6746570B2 (ja) | Gal2輸送体のバリアントおよびその使用 | |
Forsberg et al. | Identification of genes conferring tolerance to lignocellulose-derived inhibitors by functional selections in soil metagenomes | |
WO2019072596A1 (en) | THERMOSTABLE CAS9 NUCLEASES WITH OFF-TARGET ACTIVITY | |
US20100330614A1 (en) | Global transcription machinery engineering targeting the rnap alpha subunit (rpoa) | |
US8193314B2 (en) | Transcriptional engineering of Lactobacillus | |
BRPI0615980A2 (pt) | método de identificação de genes que aumentam a toleráncia ao stress na levedura para melhorar a eficiência da levedura | |
CN113677795B (zh) | 新型dahp合成酶 | |
US20230119263A1 (en) | Pseudomonas mutant strains with enhanced xylose and galactose utilization | |
Nyerges et al. | Swapped genetic code blocks viral infections and gene transfer | |
Vincent et al. | Building a new bacterial orthogonal translation initiation system | |
Orr et al. | Emulsion-based evolution of Escherichia coli for higher growth yield on D-xylose identifies central role of cyclic AMP |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090928 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090928 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120306 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20120604 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20120611 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120906 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20130611 |