BRPI0709628A2 - processo para produção de cadaverina, e de uma poliamida, e, microrganismo recombinante - Google Patents
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Abstract
PROCESSOS PARA A PRODUçãO DE CADAVERINA, E DE UMA POLIAMIDA, E, MICROORGANISMO RECOMBINANTE. Processo para a produção de cadaverina pela construção de um microorganismo recombinante que possui para a produção de cadaverina pela construção de um microorganismo recombinante que possui um gene de lisina-descarboxilase desregulado e pelo menos um gene desregulado selecionado do grupo (i) que consiste de aspartocinase, aspartato-semialdeido-desidrogenase, diidro-dipicolinato-sintase, diidro-dipicolinato-redutase, tetraidrodipicolinato-succinilase, succinil-amino-ceto-pimelato-transaminase, succinil-amino-pimelato-dessuccinilase, diamino-pimelato-epimerase, diamino-pimelato-desidrogenase, arginil-tRNA-sintetase, diamino-pimelato- descarboxilase, piruvato-carboxilase, fosfo-enol-piruvato-carboxilase, glicose-6-fosfato-desidrogenase, transcetolase, transaldolase, 6-fosfo-glicono- lactonase, frutose- 1,6-bifosfatase, homo-serina-desidrogenase, fosfo-enol- piruvato-carboxilase, succinil-CoA sintetase, metil-malonil-CoA-mutase, desde que se aspartocinase estiver desregulada como gene (i) pelo menos um segundo gene (i) diferente de aspartocinase tem que estar desregulado, e cultivo de citado microorganismo.
Description
"PROCESSOS PARA A PRODUÇÃO DE CADAVERINA, E DE UMAPOLIAMIDA, E, MICROORGANISMO RECOMBINANTE"Campo da invenção
A presente invenção refere-se a um processo para a produçãode cadaverina. Mais particularmente, esta invenção refere-se ao uso demicroorganismo recombinante compreendendo moléculas de DNA em umaforma desregulada que são essenciais para produzir cadaverina.Arte anterior
JP 2002223770 descreve um método para produzir cadaverinapela introdução de um gene de lisina-descarboxilase e/ou gene antiportador delisina-cadaverina em um microorganismo produtor de lisina.
JP 2004222569 descreve um método para produzir a métodopara produzir cadaverina pelo cultivo de bactérias corineformesrecombinantes possuindo atividade de L-lisina-descarboxilase e auxotrofiapara homo-serina.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Em um aspecto, a presente invenção proporciona um processopara a produção de cadaverina pela construção de um microorganismorecombinante que possui uma lisina-descarboxilase desregulada e pelo menosum gene desregulado selecionado de genes que são essenciais na rota debiossíntese de lisina, e cultivo de citado microorganismo.
Em outro aspecto, a presente invenção proporciona umprocesso para a produção de poliamidas compreendendo uma etapa comomencionada acima para a produção de cadaverina e reação daquela cadaverinacom um ácido dicarboxílico.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Na descrição que segue, numerosos termos são utilizadosextensivamente. Definições são aqui proporcionadas para facilitar oentendimento da invenção.O termo cadaverina significa 1,5-diamino-pentano.
Promotor. Uma seqüência de DNA que dirige a transcrição deum gene estrutural para produzir mRNA. Tipicamente, um promotor estálocalizado na região 5' de um gene, próximo do códon de iniciação de umgene estrutural. Se um promotor é um promotor indutível, então a velocidadede transcrição aumenta em resposta a um agente indutor. Em contraste, avelocidade de transcrição não é regulada por um agente indutor, se opromotor é um promotor constitutivo.
Intensificador. Um elemento de promotor. Um intensificadorpode aumentar a eficiência com a qual um gene particular é transcrito emmRNA independente da distância ou da orientação do intensificador emrelação ao sítio de iniciação de transcrição.
Expressão. Expressão é o processo pelo qual um polipeptídeoé produzido de um gene estrutural. O processo envolve transcrição do geneem mRNA e a tradução de tal mRNA em polipeptídeo(s).
Vetor de clonagem. Uma molécula de DNA, tal como umplasmídeo, cosmídeo, fagomídeo, ou bacteriófago, que possui a capacidade dese replicar autonomamente em uma célula hospedeira e que é usada paratransformar células para manipulação de gene. Vetores de clonagemtipicamente contêm um ou um número pequeno de sítios de reconhecimentode endonuclease de restrição no(s) qual(ais) seqüências de DNA estranhaspodem ser inseridas em um modo determinável sem perda de uma funçãobiológica essencial do vetor, bem como um gene marcador que é adequadopara uso na identificação e na seleção de células transformadas com o vetorde clonagem. Genes marcadores tipicamente incluem genes queproporcionam resistência à tetraciclina e resistência à ampicilina.
Vetor de expressão. Uma molécula de DNA compreendendoum gene estrutural clonado codificador de uma proteína estranha queproporciona a expressão da proteína estranha em um hospedeirorecombinante. Tipicamente, a expressão do gene clonado é posta sob ocontrole (i.e., operacionalmente ligada) de certas seqüências regulatórias taiscomo seqüências de promotor e de intensificador. Seqüências de promotorpodem ser constitutivas ou indutíveis.
Hospedeiro recombinante. Um hospedeiro recombinante podeser qualquer célula procariótica ou eucariótica que contém um vetor declonagem ou um vetor de expressão. Este termo também significa a inclusãodaquelas células procarióticas ou eucarióticas que têm sido geneticamenteengenhadas para conterem gene(s) clonado(s) no cromossomo ou genoma dacélula hospedeira. Para exemplos de hospedeiros adequados, veja Sambrooket al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, segundaedição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)["Sambrook"].
Como aqui usado, uma proteína substancialmente purasignifica que a proteína purificada desejada está essencialmente livre decomponentes celulares contaminantes, como evidenciado por uma bandaúnica após eletroforese em gel de dodecil-sulfato de sódio-poliacrilamida(SDS-PAGE). O termo "substancialmente pura" significa adicionalmente adescrição de uma molécula que é homogênea por uma ou mais característicasde pureza ou de homogeneidade usadas por aquelas pessoas experientes natécnica. Por exemplo, uma lisina-descarboxilase substancialmente puramostrará características constantes e reproduzíveis dentro de desvios padrãoexperimentais para parâmetros tais como os seguintes: peso molecular,migração cromatográfica, composição de aminoácido, seqüência deaminoácidos, terminação-N bloqueada ou não-bloqueada, perfil de eluição emHPLC, atividade biológica, e outros tais parâmetros. O termo, contudo, nãosignifica a exclusão de misturas artificiais ou sintéticas de lisina-descarboxilase com outros compostos. Em adição, o termo não significa aexclusão de proteínas de fusão de lisina-descarboxilase isoladas de umhospedeiro recombinante.
Em um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona umprocesso para a produção de cadaverina pela construção de ummicroorganismo recombinante que possui um gene de lisina-descarboxilasedesregulado e pelo menos um gene desregulado selecionado do grupo (i) queconsiste de aspartocinase, aspartato-semialdeído-desidrogenase, diidro-dipicolinato-sintase, diidro-dipicolinato-redutase, tetraidrodipicolinato-succinilase, succinil-amino-ceto-pimelato-transaminase, succinil-amino-pimelato-dessuccinilase, diamino-pimelato-epimerase, diamino-pimelato- desidrogenase, arginil-tRNA-sintetase, diamino-pimelato-descarboxilase,piruvato-carboxilase, fosfo-enol-piruvato-carboxilase, glicose-6-fosfato-desidrogenase, transcetolase, transaldolase, 6-fosfo-glicono-lactonase,frutose-1,6-bifosfatase, homo-serina-desidrogenase, fosfo-enol-piruvato-carboxilase, succinil-CoA sintetase, metil-malonil-CoA-mutase, desde que se aspartocinase estiver desregulada como gene (i) pelo menos um segundo gene(i) diferente de aspartocinase tem que estar desregulado, e cultivo de citadomicroorganismo.
As metodologias da presente invenção retratammicroorganismos recombinantes, preferivelmente incluindo vetores ou genes(e.g., genes de tipo selvagem e/ou mutados) como aqui descritos e/oucultivados em uma maneira que resulta na produção de cadaverina.
O termo microorganismo "recombinante" inclui ummicroorganismo (e.g., bactérias, célula de levedura, célula fungica, etc.) quetem sido geneticamente alterado, modificado ou engenhado (e.g.,geneticamente engenhado) de tal modo que exibe um fenótipo e/ou genótipoalterado, modificado e/ou diferente (e.g., quando a modificação genética afetaas seqüências de ácido nucleico codificadoras do microorganismo) emcomparação com o microorganismo naturalmente ocorrente do qual foiderivado.O termo "desregulado" inclui expressão de um produto degene (e.g., lisina-descarboxilase) em um nível menor ou maior do que aqueleexpressado antes da manipulação do microorganismo ou em ummicroorganismo comparável que não tem sido manipulado. Em umamodalidade, o microorganismo pode ser geneticamente manipulado (e.g.,geneticamente engenhado) para expressar um nível de produto de gene em umnível menor ou maior do que aquele expressado antes da manipulação domicroorganismo ou em um microorganismo comparável que não tem sidomanipulado. Manipulação genética pode incluir, mas não é limitada à,alteração ou modificação de seqüências regulatórias ou sítios associados coma expressão de um gene particular (e.g., pela remoção de promotores fortes,promotores indutíveis ou promotores múltiplos), modificação da localizaçãocromossômica de um gene particular, alteração das seqüências de ácidonucleico adjacentes a um gene particular tal como um sítio de ligação deribossomo ou terminador de transcrição, decréscimo do número de cópias deum gene particular, modificação de proteínas (e.g., proteínas regulatórias,supressores, intensificadores, ativadores de transcrição e semelhantes)envolvidos em transcrição de um gene particular e/ou tradução de um produtode gene particular, ou quaisquer outros meios convencionais de desregulaçãode expressão de uma rotina de gene particular na técnica (incluindo mas nãolimitado ao uso de moléculas de ácido nucleico de anti-senso, ou outrosmétodos para knock-out ou bloqueio da expressão da proteína alvo).
O termo "atividade de gene desregulada", e.g. lisina-descarboxilase desregulada, também significa que uma atividade de gene, e.g.uma atividade de lisina-descarboxilase, é introduzida em um microorganismoonde a atividade de gene respectivo, e.g. a atividade de lisina-descarboxilase,não tem sito antes observada, e.g. pela introdução de um gene heterólogo, e.g.um gene de lisina-descarboxilase em uma ou mais cópias no microorganismopreferivelmente por meio de engenharia genética.Lisina-descarboxilase catalisa a descarboxilação de L-Iisinaem cadaverina. A enzima tem sido classificada como E.C. 4.1.1.18. Asenzimas isoladas de Escherichia coli possuindo atividade de lisina-descarboxilase são o produto de gene cadA (Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes, Entry b4131) e o produto de gen IdcC (Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes, Entry JWOl81).
As seqüências de aminoácidos de E. coli cadA é descrita emSEQ ID NO: 1 e de E. coli IdcC é descrita em SEQ ID NO:2.
Moléculas de DNA codificadoras do gene de lisina-descarboxilase de E. coli podem ser obtidas por triagem de bibliotecasgenômicas ou de cDNA com sondas de polinucleotídeo possuindo seqüênciasde nucleotídeos reversamente traduzidas da seqüência de aminoácidos deSEQ ID NO: 1 ou 2.
Alternativamente, os genes de lisina-descarboxilase de E. colipodem ser obtidos por síntese de moléculas de DNA usandooligonucleotídeos longos mutuamente iniciadores. Veja, por exemplo,Ausubel et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY, páginas 8.2.8 a 8.2.13 (1990) ["Ausubel"]. Também, vejaWosnick et al., Gene 60:115 (1987); e Ausubel et al. (eds.), SHORTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3a edição, páginas 8-8 a 8-9(John Wiley & Sons, Inc. 1995). Técnicas estabelecidas usando a reação emcadeia de polimerase proporcionam a capacidade para sintetizar moléculas deDNA de comprimento de pelo menos 2 quilobases. Adang et al., Plant Molec.Biol. 21:1131 (1993); Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266(1993); Dillon et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the RapidConstruction of Synthetic Genes," em METHODS IN MOLECULARBIOLOGY, Vol. 15: PCR PROTOCOLS: CURRENT METHODS ANDAPPLICATIONS, White (ed.), páginas 263-268, (Humana Press, Inc. 1993);Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299 (1995).Podem ser produzidas variantes de lisina-descarboxilase deE.coli que contêm mudanças de aminoácidos conservativas, comparadas coma enzima parental. Isto é, podem ser obtidas variantes que contêm uma oumais substituições de aminoácido de SEQ ID NO:l ou 2, na qual um alquil-aminoácido substitui um alquil-aminoácido na seqüência de aminoácidos delisina-descarboxilase, um aminoácido aromático substitui um aminoácidoaromático na seqüência de aminoácidos de lisina-descarboxilase de E.coli, umaminoácido contendo enxofre substitui um aminoácido contendo enxofre naseqüência de aminoácidos de lisina-descarboxilase de E. coli, um aminoácidocontendo hidroxila substitui um aminoácido contendo hidroxila na seqüênciade aminoácidos de lisina-descarboxilase de E.coli, um aminoácido ácidosubstitui um aminoácido ácido na seqüência de aminoácidos de lisina-descarboxilase de E.coli, um aminoácido básico substitui um aminoácidobásico na seqüência de aminoácidos de lisina-descarboxilase de E.coli.
Dentre os aminoácidos comuns, por exemplo, uma"substituição de aminoácido conservativo" é ilustrada por uma substituiçãodentre os aminoácidos dentro de cada um dos seguintes grupos: (1) glicina,alanina, valina, leucina, e isoleucina, (2) fenil-alanina, tirosina, e triptofano,(3) cisteína e metionina, (4) serina e treonina, (5) aspartato e glutamato, (6)glutamina e asparagina, e (7) lisina, arginina e histidina.
Mudanças de aminoácido conservativo na lisina-descarboxilase de E. coli podem ser introduzidas pela substituição denucleotídeos citados em SEQ ID NO:l ou NO: 2. Tais variantes de"aminoácido conservativo" podem ser obtidas, por exemplo, por mutagênesedirecionada por oligonucleotídeo, mutagênese de varredura de linker,mutagênese usando a reação em cadeia de polimerase, e semelhante. Ausubelet ai., supra, em páginas 8.0.3-8.5.9; Ausubel et al. (eds.), SHORTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3a edição, páginas 8-10 a 8-22(John Wiley & Sons, Inc. 1995). Veja também em geral, McPherson (ed.),DIRECTED MUTAGENESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press(1991). A capacidade de tais variantes de converterem L-Iisina em cadaverinapode ser determinada usando um ensaio de atividade enzimática padrão, talcomo o ensaio aqui descrito.
Lisina-descarboxilases preferidas de acordo com a invençãosão a lisina-descarboxilase de E. coli, e seus genes equivalentes, que possuematé 80%, preferivelmente 90%, mais preferivelmente 95% e 98% deidentidade de seqüência (baseada na seqüência de aminoácidos) com ocorrespondente produto de gene "original" e que possuem ainda a atividadebiológica de lisina-descarboxilase. Estes genes equivalentes podem serfacilmente construídos pela introdução de substituições, deleções ou inserçõesde nucleotídeo por métodos conhecidos na técnica.
Outra modalidade preferida da invenção é a de lisinas-descarboxilases de E. coli (SEQ ID NO:l e No:2) que são retraduzidas emDNA pela aplicação do uso de códon de Corynebacterium glutamicum. Estaseqüência de polinucleotídeo de lisina-descarboxilase é útil para a expressãode lisina-descarboxilase em microorganismo do gênero Corynebacterium,especialmente C. glutamicum.
Além do gene desregulado de lisina-descarboxilase omicroorganismo de acordo com a invenção tem que possuir pelo menos umgene desregulado selecionado do grupo (i). O grupo (i) é um grupo de genesque desempenham um papel chave na biossíntese de lisina e consiste dosgenes de aspartocinase, aspartato-semialdeído-desidrogenase, diidro-dipicolinato-sintase, diidro-dipicolinato-redutase, tetraidrodipicolinato-succinilase, succinil-amino-ceto-pimelato-transaminase, succinil-amino-pimelato-dessuccinilase, diamino-pimelato-epimerase, diamino-pimelato-desidrogenase, arginil-tRNA-sintetase, diamino-pimelato-descarboxilase,piruvato-carboxilase, fosfo-enol-piruvato-carboxilase, glicose-6-fosfato-desidrogenase, transcetolase, transaldolase, 6-fosfo-glicono-lactonase,frutose-1,6-bifosfatase, homo-serina-desidrogenase, fosfo-enol-piruvato-carboxilase, succinil-CoA sintetase, metil-malonil-CoA-mutase.
Pelo menos um gene do grupo (i) tem que ser desregulado deacordo com o processo da invenção. Preferivelmente mais do que um gene dogrupo (i), e.g. dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez genes sãodesregulados no microorganismo de acordo com a invenção.
Os genes e produtos de gene de grupo (i) são conhecidos natécnica. EP 1108790 descreve mutações nos genes de homo-serina-desidrogenase e piruvato-carboxilase que possuem um efeito benéfico sobre aprodutividade de corinebactérias recombinantes na produção de lisina. WO00/63388 descreve mutações no gene de aspartocinase que possuem um efeitobenéfico sobre a produtividade de corinebactérias recombinantes na produçãode lisina. EP 1108790 e WO 00/63388 são aqui incorporadas comoreferências com respeito às mutações nestes genes descritas acima.
Na tabela abaixo para cada gene/produto de gene sãomencionadas maneiras possíveis de desregulação do respectivo gene. Aliteratura e os documentos citados na coluna "Desregulação" da tabela sãoaqui incorporados como referências com respeito à desregulação de gene. Asmaneiras mencionadas na tabela são modalidades preferidas de umadesregulação do gene respectivo.
Tabela. 1
<table>table see original document page 10</column></row><table><table>table see original document page 11</column></row><table>
Uma maneira preferida de desregulação dos gene deaspartocinase, aspartato-semialdeído-desidrogenase, diidro-dipicolinato-sintase, diidro-dipicolinato-redutase, tetraidrodipicolinato-succinilase,succinil-amino-ceto-pimelato-transaminase,succinil-amino-pimelato-dessuccinilase, diamino-pimelato-epimerase,diamino-pimelato-desidrogenase, arginil-tRNA-sintetase, diamino-pimelato-descarboxilase,piruvato-carboxilase, fosfo-enol-piruvato-carboxilase, glicose-6-fosfato-desidrogenase, transcetolase, transaldolase, 6-fosfo-glicono-lactonase,frutose-l,6-bifosfatase é uma "supra"- mutação que aumenta a atividade degene e.g. por amplificação de gene e/ou usando sinais de expressão fortes e/oumutações pontuais que intensificam a atividade enzimática.Uma maneira preferida de desregulação dos genes de homo-serina-desidrogenase, fosfo-enol-piruvato-carboxilase, succinil-CoA sintetase,metil-malonil-CoA-mutase é uma "infra"-mutação que diminui a atividade degene e.g. por deleção ou rompimento de gene, e/ou usando sinais deexpressão fracos e/ou mutações pontuais que destroem ou diminuem aatividade enzimática.
Se aspartocinase é desregulada como um membro de grupo degene (i) pelo menos um segundo membro de gene (i)-diferente deaspartocinase-também tem que ser desregulado.
Tem sido observado que uma porção significativa dacadaverina produzida no microorganismo de acordo com o processo dainvenção é acetilada. Com o objetivo de bloquear esta reação de acetilaçãoque é atribuída a uma diamina-acetil-transferase dependente de acetil-CoA ecom o propósito de aumentar o rendimento de cadaverina é uma modalidadepreferida da invenção a desregulação da diamina-acetil-transferase domicroorganismo produtor, especialmente a diminuição de sua atividade, e.g.por deleção ou rompimento do gene.
Para expressar os genes desregulados de acordo com ainvenção, a seqüência de DNA codificadora da enzima tem que estaroperacionalmente ligada em seqüências regulatórias que controlam aexpressão de transcrição em um vetor de expressão e então, ser introduzidaem uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica. Em adição àsseqüências regulatórias de transcrição, tais promotores e intensificadores,vetores de expressão podem incluir seqüências regulatórias de transcrição eum gene marcador que é adequado para seleção de células que trazem o vetorde expressão.
Promotores adequados para expressão em um hospedeiroprocariótico podem ser reprimíveis, constitutivos, ou indutíveis. Promotoresadequados são bem conhecidos por aquelas pessoas experientes na técnica eincluem promotores capazes de reconhecer as T4, T3, Sp6 e T7 polimerases,os promotores P.sub.R e P.surb.L de bacteriófago lambda, os promotores trp,recA, promotor de choque térmico, lacUV5, tac, lpp-la^.lambda.pr, phoA,gal, trc e IacZ de E. coli, os promotores de alfa.a-amilase e os promotoressigma.a.sup.28 -específicos de B. subtilis, os promotores dos bacteriófagos deBacillus, promotores de Streptomyces, o promotor int de bacteriófago lambda,o promotor bla do gene de beta.p-lactamase de pBR322, e o promotor CATdo gene de cloranfenicil-acetil-transferase. Promotores procarióticos sãorevistos por Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987); Watson et al.,MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, 4a Ed., Benjamin Cummins(1987); Ausubel et al., supra, e Sambrook et al., supra.
Um promotor preferido para a expressão da lisina-descarboxilase de E.coli é o promotor sodA de C. glutamicum.
Métodos para a expressão de proteínas em hospedeirosprocarióticos são bem conhecidos por aquelas pessoas experientes na técnica.Veja, por exemplo, Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coliusing plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies," emDNA CLONING 2: EXPRESSION SYSTEMS, 2a edição, Glover et al. (eds.),páginas 15-58 (Oxford University Press 1995). Veja também, Ward et al.,"Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," em MONOCLONALANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, páginas 137-185(Wiley-Liss, Inc. 1995); e Georgiou, "Expression of Proteins in Bactéria," emPROTEIN ENGINEERING: PRINCIPLES AND PRACTICE, Cleland et al.(eds.), páginas 101-127 (John Wiley & Sons, Inc. 1996).
Um vetor de expressão pode ser introduzido em célulashospedeiras bacterianas usando uma variedade de técnicas incluindotransformação em cloreto de cálcio, eletroporação, e semelhantes. Veja, porexemplo, Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY, 3a edição, páginas 1-1 a 1-24 (John Wiley & Sons, Inc. 1995).Um aspecto importante da presente invenção envolve o cultivoou a cultura de microorganismos recombinantes aqui descritos, de tal modoque um composto desejado de cadaverina seja produzido. O termo "cultivo"inclui manutenção e/ou crescimento de um microorganismo vivo da presenteinvenção (e.g., manutenção e/ou crescimento de uma cultura ou cepa). Emuma modalidade, um microorganismo da invenção é cultivado em meiolíquido. Em outra modalidade, um microorganismo da invenção é cultivadoem meio sólido ou em meio semi-sólido. Em uma modalidade preferida, ummicroorganismo da invenção é cultivado em meio (e.g., um meio líquido,estéril) compreendendo nutrientes essenciais ou benéficos para a manutençãoe/ou o crescimento do microorganismo.
Fontes de carbono que podem ser usadas incluem açúcares ecarboidratos, tais como por exemplo glicose, sacarose, lactose, frutose,maltose, melaço, amido e celulose, óleos e gorduras, tais como por exemploóleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco, ácidosgraxos, tais como por exemplo ácido palmítico, ácido esteárico e ácidolinoleico, álcoois, tais como por exemplo glicerol e etanol, e ácidos orgânicos,tal como por exemplo ácido acético. Em uma modalidade preferida, glicose,frutose ou sacarose são usadas como fontes de carbono. Estas substânciaspodem ser utilizadas individualmente ou como uma mistura.
Fontes de nitrogênio que podem ser usadas compreendemcompostos contendo nitrogênio, tais como peptonas, extrato de levedo, extratode carne, extrato de malte, licor de macerado de milho, farinha de soja e uréiaou compostos inorgânicos, tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio,carbonato de amônio e nitrato de amônio. As fontes de nitrogênio podem serusadas individualmente ou como uma mistura. Fontes de fósforo que podemser usadas são ácido fosfórico, di-hidrogeno-fosfato de potássio ou hidrogeno-fosfato de dipotássio ou os sais correspondentes contendo sódio. O meio decultura tem que conter adicionalmente sais de metal, tais como por exemplosulfato de magnésio ou sulfato de ferro, que são necessários para crescimento.Finalmente, substâncias promotoras de crescimento essenciais tais comoaminoácidos e vitaminas também podem ser usadas em adição às substânciascitadas acima. Precursores adequados podem ser adicionalmente adicionadosno meio de cultura.As substâncias alimentícias mencionadas acima podem seradicionadas na cultura como uma batelada única ou podem ser alimentadasapropriadamente durante a cultura.
Preferivelmente, os microorganismos da presente invenção sãocultivados sob pH controlado. O termo "pH controlado" inclui qualquer pHque resulta em produção do produto de química fina desejado, e.g.,cadaverina. Em uma modalidade, microorganismos são cultivados em um pHde cerca de 7. Em outra modalidade, os microorganismos são cultivados emum pH de entre 6,0 e 8,5. O pH desejado pode ser mantido por qualquer umde numerosos métodos conhecidos por aquelas pessoas experientes na técnica.Por exemplo, compostos básicos tais como hidróxido de sódio, hidróxido depotássio, amônia, ou água amoniacal, ou compostos ácidos, tais como ácidofosfórico ou ácido sulfurico, são usados para apropriadamente controlar o pHda cultura.
Também preferivelmente, microorganismos da presenteinvenção são cultivados sob aeração controlada. O termo "aeraçãocontrolada" inclui aeração suficiente (e.g., oxigênio) para resultar emprodução do composto de química fina desejado, e.g., cadaverina-lisina. Emuma modalidade, aeração é controlada por regulação dos níveis de oxigêniona cultura, por exemplo, por regulação da quantidade de oxigênio dissolvidono meio de cultura. Preferivelmente, aeração da cultura é controlada poragitação da cultura. Agitação pode ser proporcionada por uma hélice ouequipamento de agitação mecânica similar, pelo revolvimento ou pelovascolejamento do vaso de crescimento (e.g., fermentador) ou por váriosequipamentos de bombeamento. Aeração pode ser adicionalmente controladapela passagem de oxigênio ou ar estéril através do meio (e.g., através damistura de fermentação). Também, preferivelmente, microorganismos dapresente invenção são cultivados sem espumação em excesso (e.g., via adiçãode agentes antiespumantes tais como poliglicol-ésteres de ácido graxo).
Além disso, microorganismos da presente invenção podem sercultivados sob temperaturas controladas. O termo "temperatura controlada"inclui qualquer temperatura que resulta em produção do composto de químicafina desejado, e.g., cadaverina-lisina. Em uma modalidade, a temperaturacontrolada inclui temperaturas entre 15°C e 95°C. Em outra modalidade,temperaturas controladas incluem temperaturas entre 15°C e 70°C.Temperaturas preferidas estão entre 20°C e 55°C, mais preferivelmente entre30°C e 45°C ou entre 30°C e 50°C.
Microorganismos podem ser cultivados (e.g., mantidos e/oucrescidos) em meios líquidos e preferivelmente são cultivados, contínua ouintermitentemente, por métodos de cultura convencionais tais como culturaem repouso, cultura em tubo de ensaio, cultura com vascolejamento (e.g.,cultura com vascolejamento rotativo, cultura em frasco de vascolejamento,etc.), cultura rotativa com aeração, ou fermentação. Em uma modalidadepreferida, os microorganismos são cultivados em frascos de vascolejamento.
Em uma modalidade mais preferida, os microorganismos são cultivados emum fermentador (e.g., um processo de fermentação). Processos defermentação da presente invenção incluem, mas não são limitados a, métodosde fermentação contínuos ou em batelada alimentada. A frase "processo embatelada" ou "fermentação em batelada" refere-se a um sistema fechado noqual a composição de meio, nutrientes, aditivos suplementares e semelhantesão ajustados no início da fermentação e não são submetidos à alteraçãodurante a fermentação, contudo, podem ser feitas tentativas para controlarfatores tais como pH e concentração de oxigênio para prevenir acidulaçãoexcessiva do meio e/ou morte de microorganismo. A frase "processo embatelada alimentada" ou fermentação em "batelada alimentada" refere-se auma fermentação em batelada exceto que um ou mais substratos ousuplementos são adicionados (e.g., adicionados em incrementos oucontinuamente) à medida que a fermentação progride. A frase "processocontínuo" ou "fermentação contínua" refere-se a um sistema no qual um meiode fermentação definido é adicionado em um fermentador e uma quantidadeigual de meio usado ou "condicionado" é simultaneamente removida,preferivelmente para recuperar a cadaverina-beta-lisina técnica.
A metodologia da presente invenção pode adicionalmenteincluir uma etapa de recuperação de cadaverina. O termo "recuperação de"cadaverina inclui extração, colheita, isolamento ou purificação do compostodo meio de cultura. Recuperação do composto pode ser realizada de acordocom qualquer metodologia de isolamento ou purificação convencionalconhecida na técnica incluindo, mas não limitada a, tratamento com umaresina convencional (e.g., resina de troca aniônica ou catiônica, resina deadsorção não-iônica, etc.), tratamento com um adsorvente convencional (e.g.,carvão ativado, ácido silícico, gel de sílica, celulose, alumina, etc.), alteraçãode pH, extração em solvente (e.g., com um solvente convencional tal comoum álcool, acetato de etila, hexano e semelhante), destilação, diálise, filtração,concentração, cristalização, recristalização, ajuste de pH, liofilização esemelhante. Por exemplo cadaverina pode ser recuperada do meio de culturaprimeiro por remoção dos microorganismos da cultura. A biomassa removidado caldo é então passada através ou sobre uma resina de troca catiônica pararemover cátions indesejados e então através ou sobre uma resina de trocaaniônica para remover ânions inorgânicos e ácidos orgânicos indesejadospossuindo acidezes mais fortes do que a cadaverina.
Em outro aspecto, a presente invenção proporciona umprocesso para a produção de poliamidas (e.g. nylon ®) compreendendo umaetapa como mencionada acima para a produção de cadaverina. A cadaverina éreagida em uma maneira conhecida com ácidos di-, tri- ou policarboxílicospara dar poliamidas. Preferivelmente a cadaverina é reagida com ácidosdicarboxílicos contendo 4 a 10 carbonos tais como ácido succínico, ácidoglutárico, ácido adípico, ácido pimélico, ácido subérico, ácido azeláico, ácidosebácico etc. O ácido dicarboxílico é preferivelmente um ácido livre.
Exemplos
1. Clonagem do gene de lisina-descarboxilase
Iniciadores de PCR, WKJ12/WKJ13 e WKJ35/WKJ34, foramusados com DNA cromossômico de E. eoli como um modelo para amplificaros fragmentos de DNA contendo os genes cadA e IdcC, respectivamente. Osfragmentos de DNA amplificados foram purificados, digeridos com enzimasde restrição, Asp718/Ndel para cadA e Xhol/Spel para IdcC, e ligados novetor pClik5aMCS digerido com as mesmas enzimas de restrição resultandoem pClik5aMCS cadA e pClik5aMCS IdcC, respectivamente.
Para aumentar a expressão do gene IdcC, promotor sodA de C.glutamicum (Psod) foi substituído em frente de códon de iniciação do gene.Os fragmentos de DNA contendo o promotor sodA e a região codificadora dogene IdcC foram amplificados de cada DNA cromossômico usandoiniciadores PCR, WKJ31/OLD47 para Psod e WKJ33/WKJ34 para IdcC, eusados como um modelo para PCR de fusão com iniciadores WKJ31/WKJ34.O fragmento de PCR fusionado foi purificado, digerido com XhoI e SpeI, einserido entre sítios de clivagem XhoI e SpeI do vetor pClik5aMCS paraconstruir pClik5aMCS Psod-ldcC.
Iniciadores oligonucleotídeo usados:
WKJ12 caagctccttcgagctggca
WKJ13 gggtaacgtaaaccagagaa
WKJ31 gagagagactcgagtagctgccaattattccggg
WKJ33 acgaaaggattttttacccatgaacatcattgccattatg
WKJ34 ctctctctcactagtgctcaatcacatattgcccaWKJ3 5 gagagagactcgagccggaagcgatggcggcatcOLD47 gggtaaaaaatcctttcgtag
2. Construção de cepa produtora de cadaverina
Para construir uma cepa produtora de cadaverina, um produtorde lisina LUl 1271, que foi derivado de cepa de tipo selvagem de C.glutamicum ATCC13032 pela incorporação de uma mutação pontual T311Ino gene de aspartocinase, duplicação do gene de diamino-pimelato-desidrogenase e rompimento do gene de fosfo-enol-piruvato-carbóxi-cinase,foi transformada com os plasmídeos recombinantes possuindo os genes delisina-descarboxilase.
3. Produção de cadaverina em cultura de frasco com vascolejamentoExperimentos em frasco de vascolejamento foram realizadoscom cepas recombinantes para testar a produção de cadaverina. O mesmomeio de cultura e as mesmas condições que da produção de lisina foramempregados como descrito em W02005059139. A cepa hospedeira decontrole e a cepa recombinante possuindo pClik5aMCS foram testadas emparalelo. As cepas foram pré-cultivadas sobre ágar CM durante a noite a30°C. Células cultivadas foram colhidas em um microtubo contendo 1,5 ml deNaCl 0,9 % e a densidade de células foi determinada por absorbância a 610nm após agitação. Para a cultura principal as células suspensas foraminoculadas para alcançar 1,5 de OD inicial em 10 ml do meio de produçãocontido em um frasco Erlenmeyer autoclavado de 100 mL possuindo 0,5 g deCaC03. Cultura principal foi realizada em um vascolejador rotativo (InforsAJl 18, Bottmingen, Suíça) com 200 rpm por 48-78 horas a 30°C. Asconcentrações de cadaverina e lisina foram determinadas usando HPLC(Agilent 1100 Series LC system).
No caldo cultivado com todas as cepas recombinantescontendo os genes de lisina-descarboxilase uma quantidade significativa decadaverina foi acumulada. Ao contrário, decréscimo marcante naprodutividade de lisina foi observado. Considerando a conversão completa delisina em cadaverina o mesmo número de moléculas de cadaverina que o delisina tem que ser produzido. Contudo, a quantidade de cadaverina acumuladafoi menor do que aquela de lisina produzida pela cepa hospedeira, por outrolado, uma quantidade considerável de subproduto, acetil-cadaverina, foicontinuamente acumulada resultando em decréscimo de rendimento deaçúcar.
Em adição à análise por HPLC, cadaverina e acetil-cadaverinaforam identificadas pelo método espectrométrico de massa.4. Identificação de enzima formadora de acetil-cadaverina
Para identificar a enzima formadora de acetil-cadaverinapurificação de proteína foi realizada. A cepa ATCC13032 de C. glutamicumou de alguns derivados cultivados em líquido CM foi colhida, lavada esuspensa em 0,5 volume de tampão padrão consistindo de Tris-HCl 50 mM(pH 7,8), Brij 35 0,02 %, mistura inibidora de proteína (Complete, Roche) eglicerol 20 %. Suspensão de células foi rompida usando Microfluidizer (M-110EH, Microfluidics Co.) seguida por filtração utilizando Microfiltrater(MF42, Satorius).
A enzima no filtrado foi purificada por aplicação em uma sériede colunas de Q Sepharose (Amersham Bioscience, 50 mm χ 300 mm,gradiente linear de -NaCl 0,0-0,5 M em tampão Tris 10 mM (pH 7,5), 10ml/min de vazão de fluxo), Phenyl Sepharose (Amersham Bioscience, 50 mmχ 300 mm, gradiente linear de acetato de amônio 1,5-0,0 M em tampão Tris10 mM (pH 7,5) =,10 ml/min de vazão de fluxo), Superdex (AmershamBioscience, 26 mm χ 600 mm, tampão Tris 10 mM (pH 7,5), 4 ml/min devazão de fluxo), Mono-Q (Amersham Bioscience, 5 mm χ 50 mm, gradientelinear de M-NaCl 0,0-0,5 em tampão Tris 10 mM (pH 7,5), 1 ml/min de vazãode fluxo) e Superose (Amersham Bioscience, 15 mn χ 300 mm, tampão Tris10 mM (pH 7,5), 0,3 ml/min de vazão de fluxo). Através de todas as etapas depurificação a atividade de enzima de acetil-transferase nas frações e apresença de acetil-cadaverina na mistura de reações de enzima forammonitoradas. Atividade de enzima foi determinada por monitoração doaumento de absorção a 412 nm devido à geração de TNB (ácido tio-nitro-benzóico) em um volume total de 1 ml sob as seguintes condições:
Tris-HCl 10 mM (pH 7,8), (5,5'-ditio-bis-(ácido 2-nitro-benzóico) DTNB 0,1 mM), acetil-CoA 0,25 mM, cadaverina 5 mM, soluçãode enzima.
Atividades específicas foram calculadas usando o coeficientede extinção molar de 13,6 mM"1 χ cm"1 para TNB.
As frações contendo a atividade de enzima da coluna Superoseforam carregadas em gel de SDS-PAGE. As manchas de proteína foramdigeridas com tripsina modificada (Roche, Mannheim) como descrito porHermann et al. (Electrophoresis (2001), 22, 1712-1723) após excisão de gelcolorido com Coomassie. Identificações espectrométricas de massa foramrealizadas em um LCQ advantage (Thermo Electron) após separação dospeptídeos por nano-HPLC (LC Packings, coluna RPl8, comprimento de 15cm, i.d. 75 μηι), usando o programa de computador MASCOT (David et al.(1999) Electrophoresis, 20, 3551-3567). Conseqüentemente, uma acetil-transferase (número de acesso no GeneBank: NP_600742) foi identificadacomo uma enzima formadora de acetil-cadaverina potencial.
5. Construção de plasmídeo e rompimento do gene de acetil-transferase
Para rompimento cromossômico do gene codificador de acetil-transferase identificado foi construído um plasmídeo recombinante quepermite a manipulação livre de marcador por dois eventos de recombinaçãohomóloga consecutivos. Os fragmentos de DNA contendo as regiões amontante e a jusante do gene foram amplificados de DNA cromossômico deC. glutamicum usando os conjuntos de iniciadores de PCR, WKJ203/WKJ205para a região a montante, e WKJ206/WKJ204 para a região a jusante, eusados como um modelo para PCR de fusão com iniciadores de PCRWKJ203/WKJ204 para preparar fragmento fusionado cuja região do meio dogene está removida. O produto da PCR de fusão foi purificado, digerido comXhoI e SpeI, e inserido no vetor pClikintsacB, que realiza a integração deseqüências no locus genômico de C. glutamicum (Becker et al (2005),Applied and Environmental Microbiology, 71 (12), p.8587-8596), digeridocom as mesmas enzimas de restrição.
O plasmídeo foi então usado para interromper a regiãocodificadora nativa do gene de acetil-transferase. A cepa usada foi LUl 1271LdcC na qual o gene IdcC estava integrado no locus bioD do cromossomo eque produz tanto cadaverina quanto acetil-cadaverina. Dois eventos derecombinação consecutivos, um em cada uma das regiões a montante e ajusante, respectivamente, são necessários para interromper a seqüência domeio do gene. Os mutantes interrompidos foram confirmados por PCR cominiciadores WKJ203/WKJ204 e análise de hibridização de Southern.Iniciadores oligonucleotídeo usados:
WKJ203 gctcctcgaggcattgtatactgcgaccactWKJ204 cggtactagtgtagtgagccaagacatggWKJ205 cgattccgtgattaagaagcgcttcaaccagaacatcgacWKJ206 gtcgatgttctggttgaagcgcttcttaatcacggaatcg
6. Efeito sobre a formação de acetil-cadaverina e a produtividade decadaverina
Para analisar o efeito do rompimento do gene acetil-transferasesobre a formação de acetil-cadaverina e a produtividade de cadaverina,experimentos em frasco de vascolejamento foram realizados em mutantesinterrompidos. O mesmo meio de cultura e as mesmas condições que daprodução de cadaverina foram usados (vide supra). Os mutantesinterrompidos não mostraram acúmulo de acetil-cadaverina. Isto indica queapenas a acetil-transferase identificada é responsável pela formação de acetil-cadaverina. Conseqüentemente, a produtividade de cadaverina foi melhoradapelo rompimento do gene resultante da eliminação de formação de acetil-cadaverina.
A seqüência de gene e a seqüência de polipeptídeo de acetil-transferase é descrita abaixo:
Seqüência de gene de acetil-transferaseATGAGTCCCACCGTTTTGCCTGCTACACAAGCTGACTTCCCTAAGATCGTCGATGTTCTGGTTGAAGCATTCGCCAACGATCCAGCATTTTTACGATGGATCCCGCAGCCGGACCCCGGTTCAGCAAAGCTTCGAGCACTTTTCGAACTGC AGATTGAGAAGCAGTATGC AGTGGCGGGAAATATTGATGTCGCGCGTGATTCTGAGGGAGAAATCGTCGGCGTCGCGTTATGGGATCGGCCAGATGGTAATCACAGTGCCAAAGATCAAGCAGCGATGCTCCCCCGGCTCGTCTCCATTTTCGGGATCAAGGCTGCGCAGGTGGCGTGGACGGATTTGAGTTCGGCTCGTTTCCACCCCAAATTCCCCC ATTGGTACCTCTACACCGTGGC AAC ATCTAGTTCTGCCCGTGGAACGGGTGTTGGCAGTGCGCTTCTTAATCACGGAATCGCTCGCGCGGGTGATGAAGCTATCTATTTGGAGGCGACGTCGACTCGTGCGGCTCAACTATATAACCGTCTGGGATTTGTGCCCTTGGGTTATATCCCCTCAGATGATGATGGCACTCCTGAACTGGCGATGTGGAAACCGCCAGCGATGCCAACTGTTTAA
Seqüência de proteínaMSPTVLP ATQADFPKJVD VL VE AF ANDP AFLR WIPQPDPGSAKLRALFELQIEKQ YA VAGNID V AiUDSEGEIVGV AL WDRPDGNHS AKDQ AAMLPRLVSIFGIKAAQVAWTDLSSARFHPKFPHWYLYTVATSSSARGTGVGSALLNHGIARAGDEAIYLEATSTRAAQLYNRLGFVPLGYIPSDDDGTPELA M WKPP AMPT VLISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> BASF Aktiengesellschaft<120> Processo para a produção de cadaverina<130> PF57813<160> 2
<170> PatentIn versão 3.1<210> 1<211> 715<212> PRT
<213> Escherichia coli<400> 1
Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu1 5 10 15
Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln
20 25 30
Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn
35 40 45
Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu
50 55 60
Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr65 70 75 80
Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp
100 105 110
Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile
115 120 125
Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys130 135 140Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys145 150 155 160
Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met
165 170 175
Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp
180 185 190
His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe
195 200 205
Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn
210 215 220
Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile225 230 235 240
Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp
245 250 255
Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu
260 265 270
Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg
275 280 285
Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys305 310 315 320
Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr
325 330 335
Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly
340 345 350
Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu
355 360 365
Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val370 375 380
Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser385 390 395 400
Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met
405 410 415
Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala
420 425 430
Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly
435 440 445
Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys
450 455 460
Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp465 470 475 480
Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro
485 490 495
Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser
500 505 510
Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr
515 520 525
Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr
530 535 540
Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe545 550 555 560
Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu
565 570 575
Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn
580 585 590
Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg595 600 605Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe
610 615 620
Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met
625 630 635 640
Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val
645 650 655
Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val
660 665 670
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675 680 685
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Ser Pro Val Gly Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu
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610 615 620
Gln Arg Gln Ile Lys Gly Glu Val Glu Thr Ile Ala Leu Glu Gln Leu625 630 635 640
Val Gly Arg Val Ser Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val
645 650 655
Pro Leu Leu Met Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys Glu Ser Arg Thr Val
660 665 670
Leu Asp Phe Leu Leu Met Leu Cys Ser Val Gly Gln His Tyr Pro Gly
675 680 685
Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Lys Gln Asp Glu Asp Gly Val Tyr
690 695 700
Arg Val Arg Val Leu Lys Met Ala Gly705 710
Claims (8)
1. Processo para a produção de cadaverina, caracterizado pelofato de ser pela construção de um microorganismo recombinante que possuium gene de lisina-descarboxilase desregulado e pelo menos um genedesregulado selecionado do grupo (i) que consiste de aspartocinase, aspartato-semialdeído-desidrogenase, diidro-dipicolinato-sintase, diidro-dipicolinato-redutase, tetraidrodipicolinato-succinilase, succinil-amino-ceto-pimelato-transaminase, succinil-amino-pimelato-dessuccinilase, diamino-pimelato-epimerase, diamino-pimelato-desidrogenase, arginil-tRNA-sintetase, diamino-pimelato-descarboxilase, piruvato-carboxilase, fosfo-enol-piruvato-carboxilase, glicose-6-fosfato-desidrogenase, transcetolase, transaldolase, 6-fosfo-glicono-lactonase, frutose-1,6-bifosfatase, homo-serina-desidrogenase,fosfo-enol-piruvato-carboxilase, succinil-CoA sintetase, metil-malonil-CoA-mutase, desde que se aspartocinase estiver desregulada como gene (i) pelomenos um segundo gene (i) diferente de aspartocinase tem que estardesregulado, e cultivo de citado microorganismo.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o microorganismo pertence ao gênero Corynebacterium.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o microorganismo é Corynebacterium glutamicum.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a lisina-descarboxilase desregulada é heteróloga àquelemicroorganismo.
5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o microorganismo recombinante possui uma lisina-descarboxilase de Escherichia.
6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a lisina-descarboxilase possui a seqüência de polipeptídeo deSEQ ID NO: 1 ou 2 ou uma seqüência de polipeptídeo com uma atividade delisina-descarboxilase que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou 2.
7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a atividade de diamina-acetil-transferase do MO estádesregulada.
8. Processo para a produção de uma poliamida, caracterizadopelo fato de compreender a produção de cadaverina como definida nareivindicação Iea reação daquela cadaverina com um ácido dicarboxílico.
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