KR20170047725A - L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용하여 l-이소루신을 생산하는 방법 - Google Patents

L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용하여 l-이소루신을 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시트라말레이트 신타아제(citramalate synthase) 활성을 가지는 단백질을 포함하는 L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물, 및 이를 이용하여 L-이소루신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용하여 L-이소루신을 생산하는 방법{MICROORGANISMS HAVING L-ISOLEUCINE PRODUCTIVITY AND PROCESS FOR PRODUCING L-ISOLEUCINE USING THE SAME}
본 발명은 L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물 및 이를 이용하여 L-이소루신을 생산하는 방법에 관한 것이다.
분지쇄 아미노산(branched-chain amino acid)은 L-발린, L-루신 및 L-이소루신 3종을 지칭하는 것으로, 식품 첨가제, 약학제 등의 용도로 산업적으로 이용된다. 특히, L-이소루신은 근육에서 대사되어 에너지를 생성하며, 헤모글로빈의 생성에 관여하여 피로 경감과 성장 촉진 기능을 한다. 이에 따라, 수액제제 및 영양제 등 다양하게 이용되고 있으며 스포츠 영양식품에도 사용이 증가되고 있다.
미생물을 이용한 L-이소루신의 생합성은 피루브산(pyruvate)과 2-케토부티르산(2-ketobutyrate)을 전구체로 사용하여 3개의 중간대사 물질을 거쳐 합성된다(Jinhwan Park et al., Appl. Microbial. Biotechnol. 85: 491-506, 2010).
그러나, L-이소루신 생합성 단계 중 L-쓰레오닌으로부터 2-케토부티르산을 생성하는 쓰레오닌 디하이드라타아제(threonine dehydratase, 유전자 ilvA)와 다음 단계의 아세토하이드록시산 신타아제(acetohydroxy acid synthase, 유전자 ilvBN)는 모두 L-이소루신에 의해 피드백 저해를 받는다.
따라서, L-이소루신에 의한 피드백 해제를 통해 생합성에 관련된 효소들을 조절하는 것이 고수율의 L-이소루신 생산 균주를 만드는 데에 중요한 요소임을 알 수 있다(Jinhwan Park et al., Biotechnology Journal, 560-577, 2010). 이와 더불어 분지쇄 아미노산은 피루브산(pyruvate)까지 동일한 생합성 경로를 통해 생성되기 때문에, 고수율의 L-이소루신을 대량 생산하기 위해서는 2-케토부티르산 전단계인 L-쓰레오닌의 원활한 공급이 이루어져야 한다(대한민국 등록특허 제10-0823044호).
이러한 배경하에, 본 발명자들은 L-쓰레오닌을 전구체로 이용하지 않는 신규 생합성 경로를 검토하던 중, 시트라말레이트 신타아제(citramalate synthase) 활성을 가지는 유전자를 L-이소루신 생합성 경로에 도입한 결과 L-이소루신 생산이 향상된 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신규 생합성 경로가 도입된 L-이소루신 생산능을 가지는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 생합성 경로가 도입된 재조합 미생물을 배지에서 배양하는 단계, 및 상기 미생물 또는 배지로부터 L-이소루신을 회수하는 단계를 포함하는, L-이소루신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양태는 시트라말레이트 신타아제 활성을 가지는 단백질을 포함하는 L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "L-이소루신"은 필수 아미노산의 하나로 구조적으로 L-발린, L-루신과 함께 분지쇄 아미노산에 해당하는 화학식 HO2CCH(NH2)CH(CH3)CH2CH3인 L-아미노산을 의미한다.
본 발명에서 용어 "L-이소루신 생산능을 가지는"은 해당 미생물이 배지에서 배양될 때 배지 또는 미생물 내에 L-이소루신을 축적할 수 있는 능력을 나타냄을 의미한다. 이러한 L-이소루신 생성능은 야생형 균주에 의해 보유된 특성이거나 균주 개량에 의해 부여된 또는 증강된 특성일 수 있다.
예를 들어, L-이소루신 생산능을 갖기 위해서 해당 미생물은 영양 요구성 변이주, 아날로그 내성 변이주, 또는 대사 제어 변이주의 취득, 또는 L-이소루신 생합성 관련 효소의 활성을 강화시키는 등의 재조합 변이주의 제작 등 미생물의 변형에 이용된 방법을 단독 또는 조합으로 적용할 수 있다.
또한, L-이소루신 생합성 관련 효소 활성을 강화하는 경우, 강화되는 L-이소루신 생합성에 관여하는 유전자, 구체적으로 ilvG, ilvM, ilvE, ilvD 및 ilvA 유전자는 단독 또는 2종 이상으로 조합하여 강화될 수 있다. 상기 ilvG, ilvM, ilvE, ilvD 및 ilvA 유전자는 각각 아세토하이드록시산 신타제의 이소자임 II의 대형 서브유니트, 소형 서브유니트, 트랜스아미나제, 디하이드록시산 데하이드라타제 및 쓰레오닌 데아미나제를 암호화한다.
본 발명에서 용어 "시트라말레이트 신타아제(EC2.3.1.182)"는 아세틸-CoA와 파이루베이트를 시트라말레이트 및 코엔자임 A(coenzyme A)로 변환하는 과정을 촉매하는 효소이다. 이 효소는 메타노칼도코커스 야나시(Methanocaldococcus jannaschii)(Howell et al., J Bacteriol. 181: 331-333, 1999), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interogans)(Xu et al., J Bacteriol. 186: 5400-5409, 2004), 지오박터 설푸레두센스(Geobacter sulfurreducens) 등의 고세균류에서 발견되며 이소루신 생합성의 쓰레오닌-비의존형 경로에 참여한다(Risso et al., J Bacteriol. 190: 2266-2274, 2008). 상기 효소는 기질로서 파이루베이트에 대한 특이성이 높고, 전형적으로 이소루신에 의해 저해되는 것으로 공지되어 있다.
본 발명에서 용어 "시트라말레이트 신타아제 활성을 가지는 단백질" 및 "이를 코딩하는 유전자"에는 상기와 같은 시트라말레이트 신타아제 활성을 가지는 임의의 단백질 및 이를 코딩하는 임의의 유전자가 제한 없이 포함될 수 있다.
구체적으로는, 시트라말레이트 신타아제 활성을 가지는 단백질은 메타노칼도코커스 유래일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 메타노칼도코커스 야나시 유래일 수 있다. 상기 시트라말레이트 신타아제는 서열번호: 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이를 코딩하는 cimA 유전자는 서열번호: 2로 기재되는 염기 서열을 갖는다. 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하거나, 또는 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해 기능상 동일한 다수의 핵산이 임의의 소정의 단백질을 코딩할 수 있기 때문에, 상기 개시된 서열번호에 한정되지 않는다.
또한, 실질적으로 서열번호: 1의 아미노산 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱더 구체적으로는 98% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 시트라말레이트 신타아제 활성을 가지는 단백질이라면 제한 없이 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.
나아가, 상기 서열과 상동성을 가지는 서열로서 실질적으로 서열번호: 1의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 경우도 역시 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.
또한, 상기 시트라말레이트 신타아제를 코딩하는 유전자는 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들면 서열번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으며, 이와 상동성이 80%, 구체적으로는 90% 이상, 더욱 구체적으로는 99% 이상인 염기서열을 가질 수 있다. 그러나 이에 한정되지는 않는다.
또한, 상기 시트라말레이트 신타아제 활성이 향상된 변이형을 수득하기 위하여, 서열번호: 1의 단백질의 변이형으로서 본 발명은 error-prone PCR을 이용하여 수득된 CimA(M) 돌연변이 라이브러리를 제공한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 CimA(M) 돌연변이 라이브러리는
서열번호: 3의 아미노산 서열을 가지는 CimA(M)m1(구체적으로 서열번호: 4의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있음);
서열번호: 5의 아미노산 서열을 가지는 CimA(M)m2(구체적으로 서열번호: 6의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있음);
서열번호: 7의 아미노산 서열을 가지는 CimA(M)m3(구체적으로 서열번호: 8의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있음);
서열번호: 9의 아미노산 서열을 가지는 CimA(M)m4(구체적으로 서열번호: 10의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있음);
서열번호: 11의 아미노산 서열을 가지는 CimA(M)m5(구체적으로 서열번호: 12의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있음);
서열번호: 13의 아미노산 서열을 가지는 CimA(M)m6(구체적으로 서열번호: 14의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있음); 및
서열번호: 15의 아미노산 서열을 가지는 CimA(M)m7(구체적으로 서열번호: 16의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있음)을 포함할 수 있다.
또한, 실질적으로 상기 서열번호의 아미노산 서열과 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱더 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 상기 시트라말레이트 신타아제 변이체의 활성을 가지는 단백질이라면 제한 없이 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고(예, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 1989 참고), 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.
구체적인 일 실시양태에서, 본 발명의 미생물은 메타노칼도코커스 야나시 유래 서열번호: 1의 시트라말레이트 신타아제 및 이의 변이체로서 서열번호: 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로는 상기 유전자를 각각 포함하는 재조합 벡터를 미생물 내로 형질전환시켜 목적 유전자를 발현시킬 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "재조합 벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 재조합 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 재조합 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용하여 제작될 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 구체적으로는 pECCG117, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 숙주세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 도입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
한편, 본 발명의 구체적 실시양태에서 코리네박테리움 속 미생물은 추가적으로 활성이 강화된 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제(3-isopropylmalate dehydrogenase) 및 이소프로필말레이트 디하이드라타아제(3-isopropylmalate dehydratase)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "단백질의 활성의 강화"란, 당해 단백질의 활성이 야생형 또는 변이 전 상태에 비하여 활성이 증가되는 것을 의미한다. 구체적으로, 당해 단백질을 코딩하는 내재적 유전자 활성의 증가, 내부 또는 외부 요인으로부터 내재적 유전자의 증폭, 상기 유전자 발현의 억제 조절 인자의 결실, 유전자 카피수 증가, 외부로부터의 유전자 도입, 발현 조절서열의 변형, 특히 프로모터 교체 또는 변형 및 유전자 내 돌연변이에 의한 단백질 활성의 증가 등에 의해 그 활성이 증가되는 것을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제 또는 이소프로필말레이트 디하이드라타아제 단백질의 활성을 강화시키는 것은
1) 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가,
2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절서열의 변형,
3) 상기 효소의 활성이 강화되도록 염색체상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형, 상기 유전자 발현의 억제 조절 인자의 결실, 또는
4) 이들의 조합으로부터 선택된 방법에 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기에서 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있거나, 상기 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 상기 숙주세포의 염색체 내 상기 폴리뉴클레오티드의 카피수를 증가하는 방법으로 수행될 수 있다.
다음으로, 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절서열을 변형하는 것은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 cj7 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0620092호 및 WO 2006/065095), EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 혹은 aceB 프로모터 등이 있으며, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 유래 프로모터인 cj7 프로모터와 작동가능하게 연결되어 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현율을 향상시킬 수 있다.
아울러, 염색체상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 용어 "이소프로필말레이트 디하이드로게나아제" 및 "이소프로필말레이트 디하이드라타아제"는 L-루신, L-이소루신 및 L-발린 생합성 경로에 관여하는 효소로서, 이들 활성을 가지는 단백질 및 이를 코딩하는 유전자에는 상기와 같은 효소 활성을 가지는 임의의 단백질 및 이를 코딩하는 임의의 유전자가 제한 없이 포함될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제(EC1.1.1.85)는 코리네박테리움 속 미생물 유래일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래일 수 있다. 한편, 본 발명의 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제는 서열번호: 17로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다. 또한, 실질적으로 서열번호: 17의 아미노산 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱더 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제 활성을 가지는 단백질이라면 제한 없이 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.
또한, 상기 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 서열번호: 17로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 가질 수 있다. 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하거나, 또는 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해 기능상 동일한 다수의 핵산이 임의의 소정의 단백질을 코딩할 수 있기 때문에, 상기 유전자는 개시된 서열번호에 한정되지 않으나, 예를 들면 서열번호: 18의 염기 서열을 가질 수 있으며, 이와 상동성이 80%, 구체적으로는 90% 이상, 더욱 구체적으로는 99% 이상인 염기서열을 가질 수 있다.
또한, 본 발명에서 이소프로필말레이트 디하이드라타아제(EC4.2.1.33)는 코리네박테리움 속 미생물 유래일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래일 수 있다. 한편, 본 발명의 이소프로필말레이트 디하이드라타아제는 2개의 소단위(small/large subunits)로 구성되는데, 이들 각각은 서열번호: 19 및 서열번호: 21로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다. 또한, 실질적으로 서열번호: 19 및 21의 아미노산 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱더 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 이소프로필말레이트 디하이드라타아제 활성을 가지는 단백질이라면 제한 없이 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.
또한, 상기 이소프로필말레이트 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자는 서열번호: 19 및 서열번호: 21로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 가질 수 있다. 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하거나, 또는 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해 기능상 동일한 다수의 핵산이 임의의 소정의 단백질을 코딩할 수 있기 때문에, 상기 유전자는 개시된 서열번호에 한정되지 않는다. 예를 들면 서열번호: 20 및 서열번호: 22의 염기 서열을 가질 수 있으며, 이와 상동성이 80%, 구체적으로는 90% 이상, 더욱 구체적으로는 99% 이상인 염기서열을 가질 수 있다.
한편, 본 발명의 구체적 실시양태에서 코리네박테리움 속 미생물은 추가적으로 활성이 강화된 L-이소루신 생합성 경로에 관여하는 효소를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "L-이소루신 생합성 경로에 관여하는 효소"에는 아스파르테이트 키나아제(aspartate kinase, lysC 유전자), 아스파르테이트-β-세미알데히드 디하이드로게나아제(aspartate-β-semialdehyde dehydrogenase, asd 유전자), 호모세린 디하이드로게나아제(homoserine dehydrogenase, hom 유전자), 호모세린 키나아제(homoserine kinase, thrB 유전자), 쓰레오닌 신타아제(threonine synthase, thrC 유전자), 쓰레오닌 디하이드라타아제(threonine dehydratase, ilvA 유전자), 아미노트랜스퍼라제(aminotransferase, ilvE 유전자) 등이 포함될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 구체적 실시양태에서 코리네박테리움 속 미생물은 추가적으로 불활성화된 파이루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "파이루베이트 디하이드로게나아제(EC1.2.4.1)"는 파이루베이트를 아세틸-CoA 및 CO2로 전환시키는 효소이다. 본 발명에서는 cimA 유전자의 전구체로 사용되는 아세틸-CoA의 공급을 증가시키기 위해 상기 효소를 코딩하는 aceE 유전자가 결손된 균주를 제조할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 파이루베이트 디하이드로게나아제(EC1.2.4.1)는 코리네박테리움 속 미생물 유래일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래일 수 있다. 한편, 본 발명의 파이루베이트 디하이드로게나아제는 서열번호: 25로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다. 또한, 실질적으로 서열번호: 25의 아미노산 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱더 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 파이루베이트 디하이드로게나아제 활성을 가지는 단백질이라면 제한 없이 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.
또한, 상기 파이루베이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 서열번호: 25로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 가질 수 있다. 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하거나, 또는 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해 기능상 동일한 다수의 핵산이 임의의 소정의 단백질을 코딩할 수 있기 때문에, 상기 유전자는 개시된 서열번호에 한정되지 않는다. 예를 들면, 서열번호: 26의 염기 서열을 가질 수 있으며, 이와 상동성이 80%, 구체적으로는 90% 이상, 더욱 구체적으로는 99% 이상인 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명에서 용어 "불활성화"란, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나, 유전자 발현에 있어 불완전한 발현으로 인한 활성의 감소를 나타내거나, 발현되더라도 기능성이 있는 해당 폴리펩티드를 생산하지 않는 것을 의미한다.
또한, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 완전하게 불활성화되어 있는 것뿐만 아니라 그 발현 수준이 현저하게 낮아 실질적으로 발현되지 않는 것도 포함되는 의미이다. 따라서, 유전자 불활성화는 완전(녹-아웃)하거나 부분적(예를 들면, 유전자가 정상의 발현 수준 미만을 나타내는 저차형 유전자(hypomorph)이거나 이것이 영향을 미치는 활성에 있어서 부분적인 감소를 나타내는 돌연변이체 유전자의 생성물)일 수 있다.
나아가, 본 발명에서 해당 폴리펩티드의 "불활성화"에는 변형되지 않은 균주에 비해 해당 폴리펩티드의 활성이 감소된 것뿐만 아니라 이의 활성이 제거된 경우도 포함한다. 구체적으로, 본 발명에서 쓰레오닌 디하이드라타아제의 불활성화는,
1) 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 결실,
2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소하도록 발현 조절 서열의 변형,
3) 상기 단백질의 활성이 약화되도록 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형, 또는
4) 이들의 조합으로부터 선택된 방법에 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기에서 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은 세균 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 상기 "일부"란 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 더욱 구체적으로는 1 내지 100개, 보다 더욱 구체적으로는 1 내지 50개일 수 있다.
다음으로, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소하도록 발현 조절서열을 변형하는 방법은, 특별히 이에 한정되지 않으나, 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열 상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법은 상기 단백질의 활성을 더욱 약화하도록 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함으로써 수행할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또다른 구체적 실시양태에서 이소류신 생산능을 가지는 미생물은 상기 시트라말레이트 신타아제 활성을 가지는 단백질이 도입되어 발현될 수 있는 미생물이면 제한 없이 본 발명의 범주에 포함될 수 있다. 예로는 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 시겔라 속(Shigella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 살모넬라 속(Salmonella sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) 여시니아 속(Yersinia sp.), 크렙시엘라 속(Klebsiella sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 브레비박테리움 속(Brevibacterium sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 셀레노모나스 속(Selenomanas sp.), 비브리오 속(Vibrio sp.), 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.), 스트렙토마이시스 속 (Streptomyces sp.), 아카노박테리아 속 (Arcanobacterium sp.), 알칼리제네스 속(Alcaligenes sp) 등에 속하는 미생물일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 미생물은 코리네박테리움 속에 속하는 미생물이며, 보다 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 양태는
시트라말레이트 신타아제(citramalate synthase) 활성을 가지는 단백질을 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계, 및
상기 미생물 또는 배지로부터 L-이소루신을 회수하는 단계를 포함하는, L-이소루신 생산 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 시트라말레이트 신타아제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 코리네박테리움 속 미생물은 앞서 설명한 바와 같다.
간략히 설명하면, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 메타노칼도코커스(Methanocaldococcus) 유래의 시트라말레이트 신타아제를 코딩하는 유전자가 도입된 것일 수 있고, 구체적으로는 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 시트라말레이트 신타아제를 코딩하는 유전자가 도입된 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 코리네박테리움 속 미생물은 추가적으로 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제(3-isopropylmalate dehydrogenase) 및 이소프로필말레이트 디하이드라타아제(3-isopropylmalate dehydratase)의 활성이 강화된 것일 수 있다. 나아가, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 추가적으로 파이루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase)의 활성이 불활성화된 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일예에 따른 코리네박테리움 속 미생물은 시트라말레이트 신타아제를 코딩하는 유전자가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 본 발명에 따른 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다.
이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8)를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.
산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있으며, 배양온도는 20 내지 45℃, 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있다. 배양은 원하는 L-이소루신의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속되며, 이러한 목적을 달성하기 위해 보통 10 내지 160시간 동안 배양할 수 있다. 상기 배양에 의하여 생산된 L-이소루신은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있다, 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적 실시양태에서 이소류신을 생산하는 방법은 상기 코리네박테리움 속 미생물의 배양 단계에서 아세테이트가 추가로 공급될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 배양 단계에서 생산된 L-이소루신을 회수하는 방법은 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 수집할 수 있다. 예컨대, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 시트라말레이트 신타아제 활성이 도입되어 L-쓰레오닌을 전구체로 이용하지 않는 새로운 생합성 경로를 통해 L-이소루신을 고수율로 생산할 수 있다.
실시예 1: 메타노칼도코커스 유래의 cimA 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작
<1-1> 메타노칼도코커스 유래의 cimA 유전자 단편의 준비
시트라말레이트 신타아제를 코딩하는 cimA 유전자(NC_000909.1)의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 1476 bp 단편을 얻기 위해, 제노믹-팁 시스템(Genomic-tip system, Qiagen)을 이용하여 메타노칼도코커스 야나시(Methanocaldococcus jannaschii) DSM 2661로부터 게놈 DNA를 추출하였다.
메타노칼도코커스 야나시 DSM 2661 유래 시트라말레이트 신타아제는 서열번호: 1로 기재되는 491개의 아미노산 서열을 가지며, 이를 코딩하는 cimA 유전자는 서열번호: 2로 기재되는 염기 서열을 갖는다.
상기에서 추출된 gDNA를 주형으로 하고 하기 서열번호: 35 및 36의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 60초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "cimA(M) 단편"이라 명명하였다.
프라이머 cimA-5-NdeI (서열번호: 35):
5'-GCATCATATGATGGTAAGGATATTC-3'
프라이머 cimA-3-XbaI (서열번호: 36):
5'-CGATCTAGATTAATTCAACAACATGTT-3'
<1-2> 재조합 벡터 p117- cj7 - cimA(M)의 제작
공지된 코리네박테리움 속 미생물 유래의 프로모터 cj7을 포함하는 p117-cj7-gfp를 주형으로 하여 PCR을 실시하였다(대한민국 등록특허 제10-0620092호). 여기서 'p117'은 대장균-코리네박테리움 셔틀 벡터(E. coli-Corynebacterium shuttle vector)인 pECCG117(Biotechnology Letters 13(10): 721-726, 1991)을 나타내는 것이다. 상기 PCR 반응은 하기 서열번호: 27 및 28의 프라이머 쌍을 사용하여 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 20초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 323 bp 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "cj7 단편"이라 명명하였다.
프라이머 Pcj7-5-KpnI(서열번호: 27):
5'-GATGGTACCACCCCAGAAACATCCCAGC-3'
프라이머 Pcj7-3 NdeI(서열번호: 28):
5'-CGATCATATGGAGTGTTTCCTTTCGTTGGG-3'
상기에서 준비한 cj7 단편과 상기 실시예 <1-1>에서 제작한 cimA(M) 단편을 주형으로 하고, 서열번호: 27 및 36의 프라이머 쌍을 사용하여 융합(sewing) PCR을 실시하였다. PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 60초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 1799 bp 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "cj7-cimA(M) 단편"이라 명명하였다.
상기에서 수득한 cj7-cimA(M) 단편을 제한효소 KpnI 및 XbaI으로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 선형 p117 단편과 라이게이션(ligation)하였다.
이로부터 제작된 재조합 벡터를 대장균 DH5α 세포에 열 충격으로 형질전환(heat shock transformation, 이하 동일함)시켰고, 이를 카나마이신 25 μg/ml 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양한 콜로니 한 백금이를 카나마이신 25 μg/ml 함유 LB 액체 배지 3 ml에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩 키트(Qiagen, 카달로그# 27104, 이하 동일함)를 사용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다.
재조합 벡터의 제작 여부는 제한효소 KpnI 및 XbaI으로 처리하여 확인하였으며, 하기 서열번호: 29 및 30의 프라이머 쌍으로 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 90초의 신장 과정을 30회 반복하는 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 이로부터 수득된 재조합 벡터를 "p117-cj7-cimA(M)"이라 명명하였다.
프라이머 117-F(서열번호: 29):
5'-CCACAGCCGACAGGATGGTGA-3'
프라이머 117-R(서열번호: 30):
5'-CTCAGGGTGTAGCGGTTCGGT-3'
<1-3> 2- 케토부티르산 생합성 경로에 관여하는 leuBCD 유전자 단편의 준비
2-케토부티르산 생합성 경로 유전자 강화 재조합 벡터를 제조하기 위하여, 코리네박테리움 속 미생물 유래의 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제(3-isopropylmalate dehydrogenase) 및 이소프로필말레이트 디하이드라타아제(3-isopropylmalate dehydratase)를 코딩하는 leuBCD 유전자 단편을 하기와 같이 준비하였다.
먼저, 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제(EC1.1.1.85)을 코딩하는 leuB 유전자의 ORF를 포함하는 1359 bp 단편을 얻기 위해, 제노믹-팁 시스템(Qiagen)을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032로부터 게놈 DNA를 추출하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제는 서열번호: 17로 기재되는 340개의 아미노산 서열을 가지며, 이를 코딩하는 leuB 유전자는 서열번호: 18로 기재되는 염기 서열을 가진다.
상기에서 추출된 gDNA를 주형으로 하고 하기 서열번호: 31 및 32의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 60초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "leuB 단편"이라 명명하였다.
프라이머 leuB-5-cimA(서열번호: 31):
5'-TTGTTGAATTAATCTAGAGGTGACACCCCAGTGG-3'
프라이머 leuB-3-leuC(서열번호: 32):
5'-TCGCAGCTGCCACCGATATTTAGCTTTGCAGCGC-3'
이소프로필말레이트 디하이드라타아제(EC4.2.1.33)를 코딩하는 leuCD 유전자의 ORF를 포함하는 2078 bp 단편을 얻기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 gDNA를 주형으로 하여 PCR을 실시하였다.
leuC 유전자는 이소프로필말레이트 디하이드라타아제의 큰 소단위(large subunit)을 코딩하는데, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 leuC 유전자는 서열번호: 20으로 기재되는 염기 서열을 가지며 이로부터 서열번호: 19로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩한다. 또한, leuD 유전자는 이소프로필말레이트 디하이드라타아제의 작은 소단위(small subunit)를 코딩하는데, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 leuD 유전자는 서열번호: 22로 기재되는 염기 서열을 가지며 이로부터 서열번호: 21로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩한다.
상기 PCR 반응은 하기 서열번호: 33 및 34의 프라이머 쌍을 사용하여 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 80초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "leuCD 단편"이라 명명하였다.
프라이머 leuC-5-leuB(서열번호: 33):
5'-GCGCTGCAAAGCTAAATATCGGTGGCAGCTGCGA-3'
프라이머 leuD-3-XbaI(서열번호: 34):
5'-TGGCGGCCGCTCTAGAGCTTTCGCTATCAGACTG-3'
상기에서 수득한 leuB 단편과 leuCD 단편을 주형으로 하고 서열번호: 31 및 34의 프라이머 쌍을 사용하는 융합 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 120초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 3437 bp 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "leuBCD 단편"이라 명명하였다.
<1-4> 재조합 벡터 p117- cj7 - cimA (M)- leuBCD의 제작
2-케토부티르산 생합성 경로 유전자 강화 재조합 벡터를 제조하기 위하여, 상기 실시예 <1-2>에서 제작한 재조합 벡터 p117-cj7-cimA(M)를 XbaI으로 처리하고, 상기 실시예 <1-3>에서 수득한 leuBCD 단편을 제한효소 XbaI으로 처리한 후, 이들 두 단편을 라이게이션하였다.
이로부터 제작된 재조합 벡터를 대장균 DH5α 세포에 열 충격으로 형질전환시켰고, 이를 카나마이신 25 μg/ml 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양한 콜로니 한 백금이를 카나마이신 25 μg/ml 함유 LB 액체 배지 3 ml에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다.
재조합 벡터의 제작 여부는 제한효소 XbaI으로 처리하여 확인하였으며, 상기 서열번호: 29 및 30의 프라이머 쌍으로 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 180초의 신장 과정을 30회 반복하는 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 이로부터 수득된 재조합 벡터를 "p117-cj7-cimA(M)-leuBCD"라 명명하였다.
<1-5> Eerror -prone PCR을 이용한 cimA (M) 변이체 단편의 준비
cimA 유전자에 무작위 변이가 도입된 DNA 풀(pool)을 확보하기 위하여, 상기 실시예 <1-1>에서 수득한 cimA(M) 단편을 주형으로 하고 다양화 PCR 랜덤 돌연변이화 키트(diversify PCR random mutagenesis kit, Clonetech, 카달로그# 630703)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때 PCR 반응은 제품 사용자 매뉴얼의 표 Ⅲ 내 돌연변이화 반응 4를 조건으로 하여 진행되었다. 이를 위해 하기 서열번호: 35 및 36의 프라이머 쌍을 사용하였으며, 95℃에서 30초의 변성 및 68℃에서 30초의 신장 과정을 25회 반복 수행하였다.
이로부터 염기 치환변이가 무작위적으로 도입된 cimA(M) 유전자 변이체 풀(mutated art cimA DNA pool)을 PCR 결과물로 수득하였다. 상기 PCR 결과물(이하, "cimA(M)m 단편"이라 명명함)을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 용리하여 수득하였다.
프라이머 cimA-5-NdeI(서열번호: 35):
5'-GCATCATATGATGGTAAGGATATTC-3'
프라이머 cimA-3-XbaI(서열번호: 36):
5'-CGATCTAGATTAATTCAACAACATGTT-3'
<1-6> p117- cj7 - cimA(M)m 돌연변이 라이브러리의 제작
상기 실시예 <1-2>에서 제작한 재조합 벡터 p117-cj7-cimA(M)를 제한효소 NdeI 및 XbaI으로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 상기 실시예 <1-5>에서 수득된 cimA(M)m 단편과 라이게이션하였다.
이로부터 제작된 재조합 벡터를 대장균 DH5α 세포에 열 충격으로 형질전환시켰고, 이를 카나마이신 25 μg/ml 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양한 콜로니들을 모아 플라스미드 미니프랩 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 회수하여 "p117-cj7-cimA(M)m 돌연변이 라이브러리"를 제작하였다.
실시예 2: cimA 유전자 도입을 통한 L- 이소루신 생산능 부여 확인
메타노칼도코커스 유래의 cimA 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰에 도입한 경우 L-이소루신 생산능이 부여되는지 여부를 확인하기 위하여, 먼저 쓰레오닌 디하이드라타아제(threonine dehydratase)를 코딩하는 ilvA 유전자가 제거된 균주를 제작하고, 이 균주에 cimA 유전자를 도입하여 L-이소루신 생산능이 회복되는지 여부를 확인하였다.
쓰레오닌 디하이드라타아제는 L-이소루신 생합성의 전구체인 L-쓰레오닌을 2-케토부티르산으로 전환시키는 효소이다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 쓰레오닌 디하이드라타아제는 서열번호: 23으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이를 코딩하는 ilvA 유전자는 서열번호: 24로 기재되는 염기 서열을 갖는다. 또한, 실질적으로 쓰레오닌 디하이드라타아제 활성을 가지는 단백질이라면 제한 없이 본 발명의 범주에 포함된다.
<2-1> ilvA 유전자 결손 벡터의 제작
ilvA 유전자의 단편을 얻기 위해, 제노믹-팁 시스템(Qiagen)을 사용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고 하기 서열번호: 37 및 38의 프라이머 쌍과, 서열번호: 39 및 40의 프라이머 쌍을 사용하여 각각 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 45초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 각각 547 bp 및 467 bp 크기의 밴드를 용리하여 수득하였다.
상기에서 수득한 ilvA 유전자의 두 단편을 주형으로 하고 하기 서열번호: 37 및 40의 프라이머 쌍을 사용하는 융합 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 60초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 1014 bp 크기의 밴드를 용리하여 수득하였다. 이렇게 수득된 ilvA 유전자가 결손된 단편을 "DilvA"라고 명명하였다.
상기에서 수득한 DilvA 단편을 제한효소 XbaI으로 처리한 후, 동일한 제한효소로 pDZ 벡터(대한민국 등록특허 제10-0924065호)를 처리하여 수득한 선형 pDZ 단편과 라이게이션하여 ilvA 유전자 결손 재조합 벡터를 제작하였다.
이렇게 제작된 재조합 벡터를 대장균 DH5α 세포에 열 충격으로 형질전환시켰고, 이를 카나마이신 25 μg/ml 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양한 콜로니 한 백금이를 카나마이신 25 μg/ml 함유 LB 액체 배지 3 ml에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다.
재조합 벡터의 제작 여부는 제한효소 XbaI으로 처리하여 확인하였으며, 하기 서열번호: 41 및 42의 프라이머 쌍을 사용하고 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 90초의 신장 과정을 30회 반복하는 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 이로부터 수득된 재조합 벡터를 "pDZ-ilvA(Del)"라 명명하였다.
프라이머 ilvA-5-XbaI(서열번호: 37):
5'-GCATCTAGAGAACACGGACAATGCCAC-3'
프라이머 ilvA-Del-R(서열번호: 38):
5'-CAAACAGCGTGATGTCCTGAGTGAGCTGCGCT-3'
프라이머 ilvA-Del-F(서열번호: 39):
5'-AGCGCAGCTCACTCAGGACATCACGCTGTTTG-3'
프라이머 ilvA-3-XbaI(서열번호: 40):
5'-GCATCTAGAACCTGCGGCACACCTTGGGC-3'
프라이머 Topo-F(서열번호: 41):
5'-GCAGTGAGCGCAACGCAAT-3'
프라이머 Topo-R(서열번호: 42):
5'-CGTTGTAAAACGACGGCCA-3'
<2-2> ilvA 유전자 결손 균주의 제작
모균주로서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 상기 실시예 <2-1>에서 제작된 재조합 벡터 pDZ-ilvA(Del)를 전기천공법으로 도입한 후 카나마이신 25 μg/ml이 포함된 고체 배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별하였다.
이로부터 2차 계대(passage)에 의해 pDZ-ilvA(Del) 벡터가 염색체 내로 도입된 균주를 각각 선발하였다. 상기 선발된 각 균주로부터 수득한 gDNA를 주형으로 하고, 하기 서열번호: 43 및 44의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때 PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 90초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 ilvA 유전자가 결손된 균주를 획득하였고, 이를 "ATCC13032△ilvA" 균주라 명명하였다.
프라이머 CFilvA(서열번호: 43):
5'-GATCTGTGATGAGGTGATG-3'
프라이머 CRilvA(서열번호: 44):
5'-CGTCCTTCCATGACTCTCA-3'
<2-3> L- 이소루신 생합성 경로에 관여하는 유전자 단편의 준비
L-이소루신 생합성 경로 유전자 강화 재조합 벡터를 제조하기 위하여, 코리네박테리움 속 미생물 유래의 lysC, asd, hom, thrB, thrC 및 ilvA 유전자 단편을 하기와 같이 준비하였다.
먼저, 아스파르테이트 키나아제(aspartate kinase) 및 아스파르테이트-β-세미알데히드 디하이드로게나아제(aspartate-β-semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 lysC-asd 유전자의 ORF를 포함하는 DNA 단편을 얻기 위해, 상기 실시예 <2-1>에 기재한 바와 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고 하기 서열번호: 45 및 46의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 90초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 2666 bp 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "lysC-asd 단편"이라 명명하였다.
프라이머 lysC-5-KpnI(서열번호: 45):
5'-TGAGGTACCCATGCGATTGTTAATGC-3'
프라이머 asd-3-SfoI(서열번호: 46):
5'-CTAGGCGCCAGTGTAGCACTCAAGCGGA-3'
호모세린 디하이드로게나아제(homoserine dehydrogenase) 및 호모세린 키나아제(homoserine kinase)를 코딩하는 hom-thrB 유전자의 ORF를 포함하는 DNA 단편을 얻기 위해, 상기 실시예 <2-1>에 기재한 바와 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고 하기 서열번호: 47 및 48의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 90초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 2633 bp 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "hom-thrB 단편"이라 명명하였다.
프라이머 hom-5-BamHI(서열번호: 47):
5'-CTAGGATCCCTCACCATTCTCAATGGT-3'
프라이머 thrB-3-BamHI(서열번호: 48):
5'-CTAGGATCCGCCTTCCTTGTTGGGC-3'
쓰레오닌 신타아제(threonine synthase)를 코딩하는 thrC 유전자의 ORF를 포함하는 DNA 단편을 얻기 위해, 상기 실시예 <2-1>에 기재한 바와 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고 하기 서열번호: 49 및 50의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 60초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 1703 bp 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "thrC 단편"이라 명명하였다.
프라이머 thrC-5-SpeI(서열번호: 49):
5'-TGCACTAGTGAGAACATACAGGTTCCA-3'
프라이머 thrC-3-ilvA(서열번호: 50):
5'-GGCATTGTCCGTGTTCTTACTTCACGGAAGTG-3'
쓰레오닌 디하이드라타아제(threonine dehydratase)를 코딩하는 ilvA 유전자의 ORF를 포함하는 DNA 단편을 얻기 위해, 상기 실시예 <2-1>에 기재한 바와 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고 하기 서열번호: 51 및 52의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 60초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 1862 bp 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "ilvA 단편"이라 명명하였다.
프라이머 ilvA-5-thrC(서열번호: 51):
5'-CACTTCCGTGAAGTAAGAACACGGACAATGCC-3'
프라이머 ilvA-3-SpeI(서열번호: 52):
5'-TGCACTAGTACCTGCGGCACACCTTGGGC-3'
상기에서 획득한 thrC 단편과 ilvA 단편을 주형으로 하고 서열번호: 49 및 52의 프라이머 쌍을 사용하여 융합 PCR을 수행하였다. 이때 PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 120초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 3565 bp 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "thrC-ilvA 단편"이라 명명하였다.
<2-4> L- 이소루신 생합성 경로 유전자 강화 벡터의 제작
L-이소루신 생합성 경로 유전자 강화 재조합 벡터를 제조하기 위하여, 상기 실시예 <2-3>에서 획득한 lysC-asd 단편을 제한효소 KpnI과 SfoI으로 처리한 후, KpnI과 EcoRV로 처리된 선형 p117 단편과 라이게이션하였다.
상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 플라스미드 DNA를 회수하였다. 재조합 벡터의 제작 여부는 서열번호: 29 및 30의 프라이머 쌍으로 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 100초 신장 과정을 30회 반복하는 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 이로부터 수득된 재조합 벡터를 "p117-lysC-asd"라 명명하였다.
상기 실시예 <2-3>에서 수득한 hom-thrB 단편을 제한효소 BamHI으로 처리한 후, BamHI으로 처리된 선형 p117-lysC-asd 단편과 라이게이션하였다.
상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 플라스미드 DNA를 회수하였다. 재조합 벡터의 제작 여부는 서열번호: 29 및 30의 프라이머 쌍으로 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 180초의 신장 과정을 30회 반복하는 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 이로부터 수득된 재조합 벡터를 "p117-lysC-asd-hom-thrB"라 명명하였다.
상기 실시예 <2-3>에서 수득한 thrC-ilvA 단편을 제한효소 SpeI으로 처리한 후, SpeI으로 처리된 선형 p117-lysC-asd-hom-thrB 단편과 라이게이션하였다.
상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 플라스미드 DNA를 회수하였다. 재조합 벡터의 제작 여부는 서열번호: 29 및 30의 프라이머 쌍으로 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 300초의 과정을 30회 반복하는 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다.
이로부터 수득된 재조합 벡터를 "p117-IBGC (Isoleucine Biosynthesis Genes Cluster)"라 명명하였고, 이는 L-이소루신 생합성에 관연하는 6종의 lysC, asd, hom, thrB, thrC 및 ilvA 유전자 단편을 포함하는 L-이소루신 생합성 경로 유전자 강화 재조합 벡터이다.
<2-5> L- 이소루신 생산능 비교
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주에 실시예 <1-2>, <1-4> 및 <2-4>에서 제조한 재조합 벡터 p117-cj7-cimA(M), p117-cj7-cimA(M)-leuBCD 및 p117-IBGC를 각각 전기천공법으로 도입한 후 카나마이신 25 μg/ml이 포함된 고체 배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별하였다. 이로부터 선별된 균주들을 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 "ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)", "ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD" 및 "ATCC13032/p117-IBGC"로 명명하였다.
또한, 상기 실시예 <2-2>에서 제조한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032△ilvA 균주에도 상기와 같이 p117-cj7-cimA(M) 및 p117-cj7-cimA(M)-leuBCD를 각각 전기천공법으로 도입한 후 카나마이신 25 μg/ml이 포함된 고체 배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별하였다. 이로부터 선별된 균주들을 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 "ATCC13032△ilvA/p117-cj7-cimA(M)" 및 "ATCC13032△ilvA/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD"로 명명하였다.
이렇게 준비된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, ATCC13032/p117-IBGC, ATCC13032/p117-cj7-cimA(M), ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD, ATCC13032△ilvA, ATCC13032△ilvA/p117-cj7-cimA(M) 및 ATCC13032△ilvA/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD를 대상으로 L-이소루신 생산성에 대한 역가 평가를 진행하였다.
구체적으로, 하기 표 1의 조성과 같이 포도당이 함유된 25 ml의 역가 배지를 함유한 250 ml 삼각 플라스크에 상기 균주들을 각각 접종한 다음, 이를 32℃, 200 rpm의 배양기에서 30시간 동안 배양하였다. 이로부터 생산된 L-이소루신 농도는 하기 표 2에 나타내었다.
조성물 농도(리터당)
포도당 60 g
KH2PO4 1.1 g
(NH4)2SO4 20 g
MgSO4·7H2O 1.2 g
FeSO4·7H2O 90 mg
MnSO4·4H2O 90 mg
Thiamine-HCl 4.5 mg
d-Biotin 0.9 mg
HSM 20 g
탄산칼슘 30 g
pH 7.0
균주 L-이소루신(g/L)
ATCC13032 0.02
ATCC13032/p117-IBGC 0.70
ATCC13032/p117-cj7-cimA(M) 0.83
ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD 1.25
ATCC13032△ilvA 0.00
ATCC13032△ilvA/p117-cj7-cimA(M) 0.08
ATCC13032△ilvA/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD 0.15
상기 표 2에 기재된 바와 같이, ilvA 유전자가 결손되지 않은 야생형 균주 ATCC13032는 0.02 g/L의 L-이소루신을 생산하였고, L-이소루신 생합성 경로 유전자 6종을 동시에 도입한 형질전환 균주 ATCC13032/p117-IBGC는 0.70 g/L의 L-이소루신을 생산하여 야생형 대비 3400% 향상된 L-이소루신 생산능을 보였다.
또한 형질전환 균주 ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)과 ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD는 각각 0.83 g/L와 1.25 g/L의 L-이소루신을 생산하였고, 이는 L-이소루신 생산능이 야생형 대비 각각 4050% 및 6150% 향상된 것이다.
이로부터 L-이소루신 생합성 경로 자체를 강화한 형질전환 균주 ATCC13032/p117-IBGC보다 기존의 L-이소루신 생합성 경로에 cimA 유전자를 추가 도입한 형질전환균주 ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)의 L-이소루신 생산능이 더 우수함을 확인하였다. 또한, leuBCD 유전자를 추가로 강화한 형질전환 균주 ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD의 L-이소루신 생산능은 보다 더 우수할 수 있음을 확인하였다.
한편, ilvA 유전자를 결손한 ATCC13032△ilvA 균주는 L-이소루신의 생산능을 상실하였으나, 여기에 cimA 유전자가 도입된 ATCC13032△ilvA/p117-cj7-cimA(M) 균주는 0.08 g/L, cimA 유전자가 도입되고 leuBCD 유전자를 강화한 ATCC13032△ilvA/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD 균주는 0.15 g/L의 L-이소루신을 생산하였다.
상기 결과는 L-쓰레오닌을 전구체로 사용하는 기존의 L-이소루신 생합성 경로가 아닌 cimA 유전자 도입을 통한 신규 생합성 경로를 이용하여 L-이소루신 생산이 가능함을 보여주는 것이다.
실시예 3: 형질전환된 재조합 균주의 제조 및 L- 이소루신 생산성 비교
<3-1> 야생형 코리네박테리움 속 미생물을 이용한 재조합 균주의 제조
cimA 유전자의 전구체로 사용되는 아세틸-CoA(acetyl-CoA)의 공급을 위해 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 파이루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase)를 코딩하는 aceE 유전자가 결손된 아세테이트(acetate) 요구성 균주를 제조하고, 이 균주를 "ATCC13032△aceE"라 명명하였다(Schreiner et al., J Bacteriol. 187: 6005-18, 2005).
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 파이루베이트 디하이드로게나아제는 서열번호: 25로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이를 코딩하는 aceE 유전자는 서열번호: 26으로 기재되는 염기 서열을 갖는다.
상기 실시예 1에서 제조한 재조합 벡터 p117-cj7-cimA(M)과 p117-cj7-cimA(M)m 돌연변이 라이브러리를 상기에서 제조한 ATCC13032△aceE 균주에 전기천공법으로 도입하였다. 이렇게 제작된 균주를 각각 "ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)" 및 "ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m 돌연변이 라이브러리"로 명명하였다.
상기 균주 ATCC13032△aceE, ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M) 및 ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m 돌연변이 라이브러리를 카나마이신 25 μg/ml이 포함된 고체 배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별한 후 선별된 균주들을 대상으로 L-이소루신 생산성에 대한 역가 평가를 진행하였다.
구체적으로, 역가 평가는 하기 표 3의 조성과 같이 암모늄아세테이트(Ammonium acetate) 형태로 아세테이트를 함유한 역가 배지를 이용하여 수행되었다. 25 ml의 역가 배지를 함유한 250 ml 삼각 플라스크에 상기 균주들을 접종한 다음, 이를 32℃, 200 rpm의 배양기에서 30시간 동안 배양하였다. 이로부터 L-이소루신 농도가 증가한 콜로니 7종을 선별하였고, 이의 목록과 생산된 L-이소루신 농도를 하기 표 4에 나타내었다.
조성물 농도(리터당)
포도당 60 g
C2H7NO2 5 g
KH2PO4 1.1 g
(NH4)2SO4 20 g
MgSO4·7H2O 1.2 g
FeSO4·7H2O 90 mg
MnSO4·4H2O 90 mg
Thiamine-HCl 4.5 mg
d-Biotin 0.9 mg
HSM 20 g
탄산칼슘 30 g
pH 7.0
균주 L-이소루신(g/L)
ATCC13032△aceE 0.05
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M) 0.84
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m1 1.02
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m2 1.35
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m3 2.23
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m4 1.24
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m5 0.96
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m6 1.73
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m7 0.97
그 결과, 상기 표 4에 기재된 바와 같이, 모균주인 ATCC13032△aceE 균주는 0.05 g/L의 L-이소루신을 생산하였으나, 형질전환 균주들은 0.84 ~ 2.23 g/L의 L-이소루신을 생산하여 모균주에 비해 향상된 L-이소루신 생산능을 나타내었고, 이는 모균주 대비 L-이소루신 생산능이 약 1580% 내지 4360% 향상된 것이다. 이들 중에서 특히 형질전환 균주 ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m3이 모균주인 ATCC13032△aceE 대비 가장 높은 L-이소루신 생산능을 보였다.
표 4와 같이 L-이소루신 생산능 증가를 보여 선별된 변이형 cimA(M) 유전자의 변이 위치와 각 변이의 치환된 아미노산을 확인하기 위하여 시퀀싱(sequencing)을 진행하였다.
그 결과, CimA(M)m 돌연변이 라이브러리로서,
CimA(M)m1은 서열번호: 3의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 4의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있고;
CimA(M)m2는 서열번호: 5의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 6의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있고;
CimA(M)m3은 서열번호: 7의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 8의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있고;
CimA(M)m4는 서열번호: 9의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 10의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있고;
CimA(M)m5는 서열번호: 11의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 12의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있고;
CimA(M)m6은 서열번호: 13의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 14의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있고;
CimA(M)m7은 서열번호: 15의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 16의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있다.
<3-2> 선별된 p117- cimA(M)m 돌연변이 라이브러리 중 가장 활성이 높은 p117-cj7-cimA(M)m3을 이용한 재조합 균주의 제조
상기 실시예 <3-1>에서 가장 높은 L-이소루신 생산능을 나타내는 것으로 선별된 p117-cj7-cimA(M)m3 벡터를 XbaI으로 처리한 후, 실시예 <1-3>에서 수득한 leuBCD 단편을 제한효소 XbaI으로 처리하여 획득한 DNA 단편과 라이게이션하였다.
이로부터 제작된 재조합 벡터로 대장균 DH5α 세포를 열 충격에 의해 형질전환시켰고, 이를 카나마이신 25 μg/ml 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양한 콜로니 한 백금이를 카나마이신 25 μg/ml 함유 LB 액체 배지 3 ml에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩 키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다.
재조합 벡터의 제작 여부는 제한효소 XbaI으로 처리하여 확인하였으며, 서열번호: 29 및 30의 프라이머 쌍으로 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 180초의 신장 과정을 30회 반복하는 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 상기 재조합 벡터를 "p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD"라 명명하였다.
상기 실시예 <1-2>의 p117-cj7-cimA(M), 실시예 <1-4>의 p117-cj7-cimA(M)-leuBCD, 실시예 <3-1>의 p117-cj7-cimA(M)m3 및 실시예 <3-2>의 p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD를 실시예 <3-1>에서 사용된 ATCC13032△aceE 균주에 각각 전기천공법으로 도입한 후 카나마이신 25 μg/ml이 포함된 고체 배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별하였다.
선별된 균주들을 상기 표 3의 조성에 따라 포도당이 함유된 25 ml의 역가 배지를 함유한 250 ml 삼각 플라스크에 접종한 다음, 이를 32℃, 200 rpm의 배양기에서 30시간 배양하여 L-이소루신 생산성을 확인하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
균주 L-이소루신(g/L)
ATCC13032△aceE 0.04
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M) 0.98
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD 2.09
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m3 2.22
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD 3.76
상기 표 5에 기재된 바와 같이, 모균주 ATCC13032△aceE는 0.04 g/L의 L-이소루신을 생산하였으나, 형질전환 균주 ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)는 0.98 g/L, ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD는 2.09 g/L로 모균주보다 각각 0.94 g/L 및 2.05 g/L 상승한 L-이소루신 생산량을 보였다.
또한 실시예 <3-1>에서 수득한 cimA(M)m3 변이형 유전자를 포함하는 형질전환 균주 ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m3과 ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD는 각각 2.22 g/L와 3.76 g/L의 L-이소루신 생산량을 보였다. 이는 모균주 대비 각각 5450%와 9300% 증가한 것으로서 CimA(M)m3 변이형이 그 야생형보다 L-이소루신 생산능 증가에 효과적임을 보여주는 결과이다.
상기 실시예를 통하여 획득한 형질전환 균주 중에서 ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m3을 "코리네박테리움 글루타미쿰 CA10-1002"로 명명하고 부다페스트 조약 하에 2015년 2월 27일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM11672P를 부여 받았다.
<3-3> L- 이소루신 생산 균주 KCCM11248P를 이용한 재조합 균주의 제조
상기 실시예 <3-1> 및 <3-2>에서 사용된 재조합 벡터 p117-cj7-cimA(M), p117-cj7-cimA(M)-leuBCD, p117-cj7-cimA(M)m3 및 p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD를 각각 L-이소루신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11248P(대한민국 등록특허 제10-1335789호)에 전기천공법으로 도입하고, 카나마이신 25 μg/ml이 포함된 고체 배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별하였다.
선별된 균주를 각각 KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M), KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD, KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3 및 KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD로 명명하였다.
이들 균주를 하기 표 6의 조성으로 만들어진 이소루신 역가 배지를 이용하여 삼각 플라스크에서 아래 기술한 방법과 같이 배양하여 L-이소루신 생산성을 확인하였다.
조성물 농도(리터당)
포도당 45 g
BM 10 g
KH2PO4 1.1 g
(NH4)2SO4 12.5 g
MgSO4·7H2O 1.2 g
FeSO4·7H2O 180 mg
MnSO4·4H2O 180 mg
ZnSO4·5H2O 0.9 mg
CuSO4·5H2O 0.9 mg
Thiamine-HCl 9 mg
d-Biotin 1.8 mg
Ca-Pantothenate 9 mg
NCA 60 mg
HSM 20 g
탄산칼슘 30 g
pH 7.0
구체적으로, 모균주 KCCM11248P와, 형질전환 균주 KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M), KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD, KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3 및 KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD를 표 6의 조성과 같이 포도당이 포함된 25 ml의 역가 배지를 함유한 250 ml 삼각 플라스크에 접종한 다음, 이를 32℃, 200 rpm의 배양기에서 60시간 배양하였다. 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
균주 L-이소루신(g/L)
KCCM11248P 3.33
KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M) 4.04
KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD 4.82
KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3 4.71
KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD 11.21
상기 표 7에 기재된 바와 같이, 모균주 KCCM11248P는 3.33 g/L의 L-이소루신을 생산하였으나, 형질전환 균주 KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)는 4.04 g/L, KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD는 4.82 g/L로 모균주보다 각각 0.71 g/L 및 1.49 g/L 증가한 L-이소루신 생산량을 보였다.
반면, 형질전환 균주 KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3과 KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD는 각각 4.71 g/L와 11.21 g/L의 L-이소루신 생산량을 보였고, 이는 모균주 대비 각각 41.4%와 236.6% 증가한 것이다.
이는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 사용한 실시예 <3-2>의 결과와 마찬가지로 CimA(M)m3 변이형이 그 야생형보다 L-이소루신 생산능 증가에 효과적임을 다시 한번 입증하는 결과이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 본 명세서에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11672P 20150227
<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> MICROORGANISMS HAVING L-ISOLEUCINE PRODUCTIVITY AND PROCESS FOR PRODUCING L-ISOLEUCINE USING THE SAME <130> KPA141305-KR <160> 52 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 491 <212> PRT <213> cimA from Methanocaldococcus jannaschii <400> 1 Met Met Val Arg Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Thr 1 5 10 15 Pro Gly Val Ser Leu Thr Pro Asn Asp Lys Leu Glu Ile Ala Lys Lys 20 25 30 Leu Asp Glu Leu Gly Val Asp Val Ile Glu Ala Gly Ser Ala Ile Thr 35 40 45 Ser Lys Gly Glu Arg Glu Gly Ile Lys Leu Ile Thr Lys Glu Gly Leu 50 55 60 Asn Ala Glu Ile Cys Ser Phe Val Arg Ala Leu Pro Val Asp Ile Asp 65 70 75 80 Ala Ala Leu Glu Cys Asp Val Asp Ser Val His Leu Val Val Pro Thr 85 90 95 Ser Pro Ile His Met Lys Tyr Lys Leu Arg Lys Thr Glu Asp Glu Val 100 105 110 Leu Glu Thr Ala Leu Lys Ala Val Glu Tyr Ala Lys Glu His Gly Leu 115 120 125 Ile Val Glu Leu Ser Ala Glu Asp Ala Thr Arg Ser Asp Val Asn Phe 130 135 140 Leu Ile Lys Leu Phe Asn Glu Gly Glu Lys Val Gly Ala Asp Arg Val 145 150 155 160 Cys Val Cys Asp Thr Val Gly Val Leu Thr Pro Gln Lys Ser Gln Glu 165 170 175 Leu Phe Lys Lys Ile Thr Glu Asn Val Asn Leu Pro Val Ser Val His 180 185 190 Cys His Asn Asp Phe Gly Met Ala Thr Ala Asn Thr Cys Ser Ala Val 195 200 205 Leu Gly Gly Ala Val Gln Cys His Val Thr Val Asn Gly Ile Gly Glu 210 215 220 Arg Ala Gly Asn Ala Ser Leu Glu Glu Val Val Ala Ala Leu Lys Ile 225 230 235 240 Leu Tyr Gly Tyr Asp Thr Lys Ile Lys Met Glu Lys Leu Tyr Glu Val 245 250 255 Ser Arg Ile Val Ser Arg Leu Met Lys Leu Pro Val Pro Pro Asn Lys 260 265 270 Ala Ile Val Gly Asp Asn Ala Phe Ala His Glu Ala Gly Ile His Val 275 280 285 Asp Gly Leu Ile Lys Asn Thr Glu Thr Tyr Glu Pro Ile Lys Pro Glu 290 295 300 Met Val Gly Asn Arg Arg Arg Ile Ile Leu Gly Lys His Ser Gly Arg 305 310 315 320 Lys Ala Leu Lys Tyr Lys Leu Asp Leu Met Gly Ile Asn Val Ser Asp 325 330 335 Glu Gln Leu Asn Lys Ile Tyr Glu Arg Val Lys Glu Phe Gly Asp Leu 340 345 350 Gly Lys Tyr Ile Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ala Ile Val Arg Glu Val 355 360 365 Thr Gly Lys Leu Val Glu Glu Lys Ile Lys Leu Asp Glu Leu Thr Val 370 375 380 Val Ser Gly Asn Lys Ile Thr Pro Ile Ala Ser Val Lys Leu His Tyr 385 390 395 400 Lys Gly Glu Asp Ile Thr Leu Ile Glu Thr Ala Tyr Gly Val Gly Pro 405 410 415 Val Asp Ala Ala Ile Asn Ala Val Arg Lys Ala Ile Ser Gly Val Ala 420 425 430 Asp Ile Lys Leu Val Glu Tyr Arg Val Glu Ala Ile Gly Gly Gly Thr 435 440 445 Asp Ala Leu Ile Glu Val Val Val Lys Leu Arg Lys Gly Thr Glu Ile 450 455 460 Val Glu Val Arg Lys Ser Asp Ala Asp Ile Ile Arg Ala Ser Val Asp 465 470 475 480 Ala Val Met Glu Gly Ile Asn Met Leu Leu Asn 485 490 <210> 2 <211> 1476 <212> DNA <213> cimA from Methanocaldococcus jannaschii <400> 2 atgatggtaa ggatatttga tacaacactt agagatggag agcaaacacc aggagtttct 60 ttaacaccaa atgataagtt agagatagca aaaaaattgg atgagcttgg agttgatgtt 120 atagaggcag gttcagctat aacttcaaaa ggagagagag aaggaataaa attaataaca 180 aaagaaggtt taaatgcaga aatctgctca tttgttagag ctttacctgt agatattgat 240 gctgccttag aatgtgatgt agatagtgtc catttagtag tgccaacatc tccaatacac 300 atgaaatata agcttagaaa aacagaagat gaggttttag agacagcttt aaaggctgta 360 gagtatgcta aagaacatgg attgattgtt gagttatctg cagaggatgc aacaagaagt 420 gatgtaaatt tcttaataaa actatttaat gaaggggaaa aggttggagc agacagagtt 480 tgtgtttgtg acacagtagg agttttaact ccacaaaaga gtcaggaatt atttaaaaaa 540 ataactgaaa atgttaattt accggtctca gttcattgcc acaacgactt tggaatggct 600 actgctaata cttgctcagc agttttaggt ggagctgttc agtgccacgt aacagttaat 660 ggtattggag agagagcagg aaatgcctca ttggaagagg ttgttgctgc tttaaaaata 720 ctctatggct atgatactaa gataaagatg gaaaagttat atgaggtttc aagaattgtc 780 tcaagattga tgaaacttcc tgttccacca aataaagcaa ttgttgggga caatgcattt 840 gctcatgaag caggaataca tgttgatgga ttaataaaaa atactgaaac ctatgagcca 900 ataaaaccag aaatggttgg gaatagaaga agaattattt tgggtaagca ttctggtaga 960 aaagctttaa aatacaaact tgatttgatg ggcataaacg ttagtgatga gcaattaaat 1020 aaaatatatg aaagagttaa agaatttggg gatttgggta aatacatttc agacgctgat 1080 ttgttggcta tagttagaga agttactgga aaattggtag aagagaaaat caaattagat 1140 gaattaactg ttgtatctgg aaataaaata acaccaattg catctgttaa actccattat 1200 aaaggagaag atataacttt aatagaaact gcttatggtg ttggaccggt agatgcagca 1260 ataaatgctg tgagaaaggc aataagtgga gttgcagata ttaagttggt agagtataga 1320 gttgaagcaa ttggtggagg aactgatgcg ttaatagagg ttgttgttaa attaagaaaa 1380 ggaactgaaa ttgttgaagt tagaaaatca gacgctgata taataagggc ttctgtagat 1440 gctgtaatgg aaggaatcaa tatgttattg aattaa 1476 <210> 3 <211> 491 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CimA(M)m1 <400> 3 Met Met Val Arg Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Thr 1 5 10 15 Pro Gly Val Ser Leu Thr Pro Asn Asp Lys Leu Glu Ile Ala Lys Lys 20 25 30 Leu Asp Glu Leu Gly Val Asp Val Ile Glu Ala Gly Ser Ala Val Thr 35 40 45 Ser Lys Gly Glu Arg Glu Gly Ile Lys Leu Ile Thr Lys Glu Gly Leu 50 55 60 Asn Ala Glu Ile Cys Ser Phe Val Arg Ala Leu Pro Val Asp Ile Asp 65 70 75 80 Ala Ala Leu Glu Cys Asp Val Asp Ser Val His Leu Val Val Pro Thr 85 90 95 Ser Pro Ile His Met Lys Tyr Lys Leu 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Claims (12)

  1. 하기 단계를 포함하는 L-이소루신을 생산하는 방법:
    시트라말레이트 신타아제(citramalate synthase) 활성을 가지는 단백질을 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계, 및
    상기 미생물 또는 배지로부터 L-이소루신을 회수하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시트라말레이트 신타아제가 메타노칼도코커스 속(genus Methanocaldococcus) 미생물 유래인, L-이소루신을 생산하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 시트라말레이트 신타아제가 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는, L-이소루신을 생산하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물이 추가적으로 활성이 강화된 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제(3-isopropylmalate dehydrogenase) 및 이소프로필말레이트 디하이드라타아제(3-isopropylmalate dehydratase)를 포함하는, L-이소루신을 생산하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물이 추가적으로 불활성화된 파이루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase)를 포함하는, L-이소루신을 생산하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물의 배양 단계에서 아세테이트가 추가적으로 공급되는, L-이소루신을 생산하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, L-이소루신을 생산하는 방법.
  8. 시트라말레이트 신타아제 활성을 가지는 단백질을 포함하는, L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 시트라말레이트 신타아제가 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는, L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 미생물이 추가적으로 활성이 강화된 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제 및 이소프로필말레이트 디하이드라타아제 단백질을 포함하는, L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 미생물이 추가적으로 불활성화된 파이루베이트 디하이드로게나아제를 포함하는, L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물.
  12. 제8항에 있어서, 상기 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰인, L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물.
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