CN106566794B - 产2-苯乙醇的基因工程菌及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产2‑苯乙醇的基因工程菌及其应用方法。该重组菌按照如下方法构建得到：在大肠杆菌中共表达芳香族氨基酸氨基转移酶以及外源的苯丙酮酸脱羧酶(Aro10)(或吲哚‑3‑丙酮酸脱羧酶)、苯乙醇脱氢酶或苯乙醛还原酶，获得产2‑苯乙醇的重组菌。本发明在此基础上共表达谷氨酸脱氢酶，实现了“自平衡”的辅因子循环，提高2‑苯乙醇产率。用本发明重组菌制备2‑苯乙醇的转化率高，在今后的2‑苯乙醇的生产中具有重要应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物基因工程领域，具体涉及一种产2-苯乙醇的基因工程菌及其应用方法。
背景技术
2-苯乙醇是一种简单的芳香族伯醇，常温下为无色液体，具有淡雅、细腻而持久的玫瑰花香气，如在玫瑰花中具有产生令人愉悦的特有的花香。在大马士革玫瑰的香精油中，2-苯乙醇占到其总挥发物质含量的60％以上。因此，2-苯乙醇可以作为香料物质被广泛的应用于香水、化妆品以及食品工业。
2010年，世界苯乙醇的需求量为10,000吨。目前，2-苯乙醇的主要是通过化学方法合成的，但是化学方法合成的2-苯乙醇产品纯度较低，纯化难度较大，产物中往往混合一些难以去除的副产物和有毒有害的重金属催化剂等杂质，达不到食品级的要求。因此其在食品、化妆品等领域的应用受到了严格的限制，2008年1月份的化学合成的2-苯乙醇的国际市场价格为5.5美元，价格不到天然2-苯乙醇价格的百分之一。同时，由于2-苯乙醇在植物中的含量极低，因此通过植物提取获得的2-苯乙醇价格高达US$1000/kg，而且考虑到植物的获取受到天气情况、季节的影响，通过植物组织提取获得的2-苯乙醇显然不能够满足市场需求。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种产2-苯乙醇的生产菌株及其构建方法，以及利用该菌株生产2-苯乙醇的方法。
本发明所构建的重组菌，其构建方法为如下(1)或(2)：
(1)通过共表达如下四种酶：芳香族氨基酸氨基转移酶、苯丙酮酸脱羧酶或吲哚-3-丙酮酸脱羧酶、苯乙醇脱氢酶或苯乙醛还原酶、谷氨酸脱氢酶，得到重组菌；
(2)通过共表达如下三种酶：芳香族氨基酸氨基转移酶、苯丙酮酸脱羧酶或吲哚-3-丙酮酸脱羧酶、苯乙醇脱氢酶或苯乙醛还原酶，得到重组菌。
上述重组菌中，构建重组菌中使用的宿主菌为大肠杆菌；所述大肠杆菌为任何野生型大肠杆菌或任何突变型的大肠杆菌。
上述任一所述重组菌中，所述突变型的大肠杆菌为大肠杆菌的基因敲除突变体。所述大肠杆菌的基因敲除突变体具体为将大肠杆菌中谷氨酸脱氢酶编码基因(gdhA)、苯乙醛脱氢酶编码基因(feaB)、过氧化化物酶编码基因(katG)和分支酸变位酶编码基因(pheA)中的至少一个基因敲除后得到的。
所述宿主菌具体可为大肠杆菌BW25113或大肠杆菌BW25113ΔgdhA或大肠杆菌BW25113ΔfeaB或大肠杆菌BW25113ΔkatG或大肠杆菌BW25113ΔpheA。
上述任一所述重组菌中，所述苯乙醛还原酶来源包括但不限于玫瑰。
上述任一所述重组菌中，所述苯乙醇脱氢酶来源包括但不限于酿酒酵母菌或大肠杆菌。
上述任一所述重组菌中，所述谷氨酸脱氢酶为所述宿主菌自身携带的谷氨酸脱氢酶或者为将宿主菌自身的谷氨酸脱氢酶编码基因敲除再导入其它来源的谷氨酸脱氢酶的编码基因；
所述其它来源的谷氨酸脱氢酶来源包括但不限于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、不解糖嗜胨菌(Peptoniphilus asaccharolyticus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)或人。
上述任一所述重组菌中，所述苯丙酮酸脱羧酶来源包括但不限于酵母菌、运动单胞菌；所述吲哚-3-丙酮酸脱羧酶来源包括但不限于巴西固氮菌。
上述任一所述重组菌中，所述芳香族氨基酸氨基转移酶的编码基因为宿主大肠杆菌自身携带的或来源于不同于宿主大肠杆菌的其它大肠杆菌；
上述任一所述重组菌中，所述共表达的方法为：利用重组表达载体向所述宿主菌中导入所述酶的编码基因。
上述任一所述重组菌中，所述编码基因序列具体如下：
所述芳香族氨基酸氨基转移酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示或氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有芳香族氨基酸氨基转移酶活性的衍生的蛋白质；所述芳香族氨基酸氨基转移酶的编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.10所示或与SEQ ID No.10所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述芳香族氨基酸氨基转移酶的DNA分子；
所述苯丙酮酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2或氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有苯丙酮酸脱羧酶活性的衍生的蛋白质；所述苯丙酮酸脱羧酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.11或与SEQ ID No.11所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述苯丙酮酸脱羧酶的DNA分子；
所述苯丙酮酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQ ID No.22或氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有苯丙酮酸脱羧酶活性的衍生的蛋白质；所述苯丙酮酸脱羧酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.21或与SEQ ID No.21所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述苯丙酮酸脱羧酶的DNA分子；；
所述吲哚-3-丙酮酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQ ID No.24或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有吲哚-3-丙酮酸脱羧酶活性的衍生的蛋白质；所述吲哚-3-丙酮酸脱羧酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.23或与SEQ ID No.23所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述吲哚-3-丙酮酸脱羧酶的DNA分子；；
所述苯乙醇脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.3或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有苯乙醇脱氢酶活性的衍生的蛋白质；所述苯乙醇脱氢酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.12或与SEQ ID No.12所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述苯乙醇脱氢酶的DNA分子；
所述苯乙醇脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.5或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有苯乙醇脱氢酶活性的衍生的蛋白质；所述苯乙醇脱氢酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.14或与SEQ ID No.14所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述苯乙醇脱氢酶的DNA分子；
所述苯乙醛还原酶的氨基酸序列为SEQ ID No.4或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有苯乙醛还原酶活性的衍生的蛋白质；所述苯乙醛还原酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.13或与SEQ ID No.13所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述苯乙醛还原酶的DNA分子；
所述谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.6或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有谷氨酸脱氢酶活性的衍生的蛋白质；所述谷氨酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.15或与SEQ ID No.15所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述谷氨酸脱氢酶的DNA分子；
所述谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.7或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有谷氨酸脱氢酶活性的衍生的蛋白质；所述谷氨酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.16或与SEQ ID No.16所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述谷氨酸脱氢酶的DNA分子；
所述谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.8或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有谷氨酸脱氢酶活性的衍生的蛋白质；所述谷氨酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.17或与SEQ ID No.17所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述谷氨酸脱氢酶的DNA分子；
所述谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.9或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有谷氨酸脱氢酶活性的衍生的蛋白质；所述谷氨酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.18或与SEQ ID No.18所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述谷氨酸脱氢酶的DNA分子。
上述任一所述重组菌在制备2-苯乙醇中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种制备2-苯乙醇的方法。
本发明所提供的制备2-苯乙醇的方法，包括如下步骤：将上述任一所述重组菌进行培养，诱导蛋白表达，然后将表达后的重组菌重悬于含L-苯丙氨酸的转化液中，全细胞催化转化得到2-苯乙醇。
上述方法中，所述转化体系中还包括如下中的至少一种：α-酮戊二酸、L-谷氨酸和沸石。
上述方法中，所述转化体系的组成为如下任一：
(1)50mM MOPS缓冲液，10-100mM L-苯丙氨酸，pH＝6.0-7.5；具体为50mM MOPS缓冲液，50mM L-苯丙氨酸，pH＝6.5；
(2)50mM MOPS缓冲液，10-100mM L-苯丙氨酸，0-20mM的L-谷氨酸，pH＝6.0-7.5，L-谷氨酸含量不为0；具体为50mM MOPS缓冲液，50mM L-苯丙氨酸，10mM L-谷氨酸、1mM L-谷氨酸、2mM L-谷氨酸、5mM L-谷氨酸或20mM L-谷氨酸，pH＝6.5；
(3)50mM MOPS缓冲液，10-100mM L-苯丙氨酸，0-20mMα-酮戊二酸，pH＝6.0-7.5，α-酮戊二酸含量不为0；具体为50mM MOPS缓冲液，50mM L-苯丙氨酸，20mMα-酮戊二酸、1mMα-酮戊二酸、2mMα-酮戊二酸、5mMα-酮戊二酸或10mMα-酮戊二酸，pH＝6.5；
(4)50mM MOPS缓冲液，10-100mM L-苯丙氨酸，0-30g/L沸石，pH＝6.0-7.5，沸石含量不为0；具体为50mM MOPS缓冲液，50mM L-苯丙氨酸，10g/L沸石、1g/L沸石、5g/L沸石、20g/L沸石或30g/L沸石，pH＝6.5；
(5)50mM MOPS缓冲液，10-100mM L-苯丙氨酸，0-30g/L沸石，0-20mMα-酮戊二酸，pH＝6.0-7.5，具体为50mM MOPS缓冲液，50mM L-苯丙氨酸，10g/L沸石，5mMα-酮戊二酸，pH＝6.5；
(6)50mM MOPS缓冲液，10-100mM L-苯丙氨酸，0-30g/L沸石，0-20mM L-谷氨酸，pH＝6.0-7.5，具体为50mM MOPS缓冲液，50mM L-苯丙氨酸，10g/L沸石，5mM L-谷氨酸，pH＝6.5。
本发明在大肠杆菌中共表达芳香族氨基酸氨基转移酶以及外源的苯丙酮酸脱羧酶、苯乙醇脱氢酶，利用该菌株全细胞催化苯丙氨酸生成苯乙醇。本发明在此基础上共表达谷氨酸脱氢酶，实现了“自平衡”的辅因子循环，提高苯乙醛转化生产苯乙醇的效率。在全细胞转化中，本发明使用了沸石、谷氨酸等添加物提高了辅因子循环效率，进而进一步提高了2-苯乙醇的合成量。本发明的全细胞催化方法是一种高效的2-苯乙醇生产方法，解除了2-苯乙醇对于菌株生长的抑制，生产周期短，将在今后的2-苯乙醇的生产中具有重要应用价值。
附图说明
图1为2-苯乙醇代谢途径改造。
图2为转化物产物的HPLC分析。A.2-苯乙醇标准品的HPLC图谱。B.为转化物产物的HPLC图谱。
图3为PEA31B产物变化情况。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、重组菌的构建
一、构建重组质粒
(一)构建用于2-苯乙醇生产的重组质粒
1、构建重组质粒PEA31
以大肠杆菌Escherichia coli str.K-12基因组为模板，设计一对引物，扩增得到芳香族氨基酸氨基转移酶的编码基因(tyrB)，片段大小约1200bp，经测序分析，结果表明扩增所得基因tyrB的核苷酸序列如列表中的序列10所示，该核苷酸序列所编码的芳香族氨基酸氨基转移酶的氨基酸序列如序列表中序列1所示。
以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae基因组为模板，设计一对引物，扩增得到苯丙酮酸脱羧酶的编码基因(aro10)，片段大小约1900bp，经测序分析，结果表明扩增的得到基因aro10的核苷酸序序列如列表中的序列11所示，该核苷酸序列所编码的苯丙酮酸脱羧酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae基因组为模板，设计一对引物，扩增得到苯乙醇脱氢酶的编码基因(adh1)，片段大小约1100bp，经测序分析，结果表明扩增的得到基因adh1的基因序列如列表中的序列12所示，该核苷酸序列所编码的苯乙醇脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示。
pRB1s是由pBADhisB载体(购自invitrogen公司)改造而来，将其中的氨苄青霉素抗性基因(979-1839bp)换成链霉素抗性基因aadA(aadA序列如SEQ ID No.20所示)，复制起始位点(1984-2657bp)换成RSF复制起始位点片段(序列如SEQ ID No.19所示)。
将载体pRB1s使用NcoI和BglII双酶切，电泳回收3500bp片段。使用Gibson连接方法，将酶切回收后的pRB1s和上述3片段以一定比例加入Gibson反应体系中。50℃反应1小时。取5μL连接产物转化DH5α(购自Takara，产品目录号为D9057A)，使用链霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒，进行酶切验证，结果表明aro10基因、adh1基因和tyrB基因串联插入pRB1s的多克隆位点中，重组质粒构建正确，将该重组载体命名为PEA31，含该质粒的菌株诱导后能够表达出芳香族氨基酸氨基转移酶、苯丙酮酸脱羧酶和苯乙醇脱氢酶。
2、构建重组质粒PEA32和PEA33
根据玫瑰Rosa x damascena的苯乙醛还原酶(PAR)的氨基酸序列，依据大肠杆菌的密码子偏好性进行优化，全基因合成优化后的序列。设计引物，扩增得到苯乙醛还原酶的编码基因(par)，片段大小约1000bp，经测序分析，结果表明扩增的得到的基因par序列如列表中的序列13所示，该核苷酸序列所编码的苯乙醛还原酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示。
以大肠杆菌Escherichia coli str.K-12基因组为模板，设计一对引物，扩增得到苯乙醇脱氢酶的编码基因(yahK)，片段大小约1100bp，与目的片段相符，经测序分析，结果表明扩增的得到的yahK的基因序列如列表中的序列14所示，该核苷酸序列所编码的苯乙醇脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列5所示。
将质粒PEA31使用KpnI和XhoI双酶切，电泳回收6600kb片段。使用Gibson连接方法，将酶切回收后的PEA31和par以一定比例加入Gibson反应体系中。50℃反应1小时。取5μL连接产物转化DH5α(购自Takara，产品目录号为D9057A)，使用链霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒，进行酶切验证，结果表明par基因插入了质粒当中(par基因取代了PEA31中的adh1)，重组质粒构建正确，将该重组载体命名为PEA32，含该质粒的菌株诱导后能够表达出芳香族氨基酸氨基转移酶、苯丙酮酸脱羧酶和苯乙醛还原酶。
将质粒PEA31使用KpnI和XhoI双酶切，电泳回收6600kb片段。使用Gibson连接方法，将酶切回收后的PEA31和yahK以一定比例加入Gibson反应体系中。50℃反应1小时。取5μL连接产物转化DH5α(购自Takara，产品目录号为D9057A)，使用链霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒，进行酶切验证，结果表明yahK基因插入了质粒当中(yahK基因取代了PEA31中的adh1)，重组质粒构建正确，将该重组载体命名为PEA33，含该质粒的菌株诱导后能够表达出芳香族氨基酸氨基转移酶、苯丙酮酸脱羧酶和苯乙醇脱氢酶。
(二)根据图1所示代谢途径，构建用于产2-苯乙醇的重组质粒(含谷氨酸脱氢酶)
1、PEA41质粒的构建
以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis基因组为模板，设计一对引物，扩增得到谷氨酸脱氢酶的编码基因(rocG)，片段大小约1300bp，经测序分析，结果表明扩增的rocG的基因序列如列表中的序列15所示，该核苷酸序列所编码的谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列6所示。
将质粒PEA31使用AscI和BglII双酶切，电泳回收7600kb片段。使用Gibson连接方法，将酶切回收后的PEA31片段与rocG片段以一定比例加入Gibson反应体系中。50℃反应1小时。取5μL连接产物转化DH5α(购自Takara，产品目录号为D9057A)，使用链霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒，测序表明，获得正确连接的质粒，将该质粒命名为PEA41，含该质粒的菌株诱导后能够表达出芳香族氨基酸氨基转移酶、苯丙酮酸脱羧酶、苯乙醇脱氢酶和谷氨酸脱氢酶。
2、PEA42质粒的构建
根据不解糖嗜胨菌Peptoniphilus asaccharolyticus的谷氨酸脱氢酶(PaGDH)的氨基酸序列，依据大肠杆菌的密码子偏好性进行优化，全基因合成优化后的序列。设计引物，扩增得到谷氨酸脱氢酶的编码基因(paGDH)，片段大小约1300bp，经测序分析，结果表明扩增的得到的基因(paGDH)序列如列表中的序列16所示，该核苷酸序列所编码的谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列7所示。
将质粒PEA31使用AscI和BglII双酶切，电泳回收7600kb片段。使用Gibson连接方法，将酶切回收后的PEA31片段与paGDH片段以一定比例加入Gibson反应体系中。50℃反应1小时。取5μL连接产物转化DH5α(购自Takara，产品目录号为D9057A)，使用链霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒，经过测序表明获得正确连接的质粒，将该质粒命名为PEA42，含该质粒的菌株诱导后能够表达出芳香族氨基酸氨基转移酶、苯丙酮酸脱羧酶、苯乙醇脱氢酶和谷氨酸脱氢酶。
3、PEA43质粒的构建
以大肠杆菌Escherichia coli str.K-12基因组为模板，设计一对引物，扩增得到谷氨酸脱氢酶的编码基因(gdhA)，片段大小约1300bp，经测序分析，结果表明扩增的gdhA的基因序列如列表中的序列17所示，该核苷酸序列所编码的谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列8所示。
将质粒PEA31使用AscI和BglII双酶切，电泳回收7600kb片段。使用Gibson连接方法，将酶切回收后的PEA31片段与gdhA片段以一定比例加入Gibson反应体系中。50℃反应1小时。取5μL连接产物转化DH5α(购自Takara，产品目录号为D9057A)，使用链霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒，经过测序表明获得正确连接的质粒，将该质粒命名为PEA43，含该质粒的菌株能够表达出芳香族氨基酸氨基转移酶、苯丙酮酸脱羧酶、苯乙醇脱氢酶和谷氨酸脱氢酶。
4、PEA44质粒的构建
根据人homo sapiens的谷氨酸脱氢酶hGDH1的氨基酸序列，依据大肠杆菌的密码子偏好性进行优化，全基因合成优化后的序列。设计引物，扩增得到谷氨酸脱氢酶的编码基因(hGDH1)，片段大小约1500bp，经测序分析，结果表明扩增的基因序列如列表中的序列18所示，该核苷酸序列所编码的谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列9所示。
将质粒PEA31使用AscI和BglII双酶切，电泳回收7600kb片段。使用Gibson连接方法，将酶切回收后的PEA31片段与hGDH1片段以一定比例加入Gibson反应体系中。50℃反应1小时。取5μL连接产物转化DH5α(购自Takara，产品目录号为D9057A)，使用链霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒，经过测序表明获得正确连接的质粒，将该质粒命名为PEA44，含该质粒的菌株能够表达出芳香族氨基酸氨基转移酶、苯丙酮酸脱羧酶、苯乙醇脱氢酶和谷氨酸脱氢酶。
5、PEA45质粒的构建
将质粒PEA32使用AscI和BglII双酶切，电泳回收7600kb片段。使用Gibson连接方法，将酶切回收后的PEA32片段与上述获得的基因rocG以一定比例加入Gibson反应体系中。50℃反应1小时。取5μL连接产物转化DH5α(购自Takara，产品目录号为D9057A)，使用链霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒，经过测序表明获得正确连接的质粒，将该质粒命名为PEA45，含该质粒的菌株能够表达出芳香族氨基酸氨基转移酶、苯丙酮酸脱羧酶、苯乙醛还原酶和谷氨酸脱氢酶。
6、PEA46质粒的构建
将质粒PEA32使用AscI和BglII双酶切，电泳回收7600kb片段。使用Gibson连接方法，将酶切回收后的PEA32片段与上述获得的基因paGDH以一定比例加入Gibson反应体系中。50℃反应1小时。取5μL连接产物转化DH5α(购自Takara，产品目录号为D9057A)，使用链霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒，经过测序表明获得正确连接的质粒，将该质粒命名为PEA46，含该质粒的菌株能够表达出芳香族氨基酸氨基转移酶、苯丙酮酸脱羧酶、苯乙醛还原酶和谷氨酸脱氢酶。
7、PEA47质粒的构建
将质粒PEA32使用AscI和BglII双酶切，电泳回收7600kb片段。使用Gibson连接方法，将酶切回收后的PEA32片段与上述获得的基因gdhA片段以一定比例加入Gibson反应体系中。50℃反应1小时。取5μL连接产物转化DH5α(购自Takara，产品目录号为D9057A)，使用链霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒，经过测序表明获得正确连接的质粒，将该质粒命名为PEA47，含该质粒的菌株能够表达出芳香族氨基酸氨基转移酶、苯丙酮酸脱羧酶、苯乙醛还原酶和谷氨酸脱氢酶。
8、PEA48质粒的构建
将质粒PEA32使用AscI和BglII双酶切，电泳回收7600kb片段。使用Gibson连接方法，将酶切回收后的PEA32片段与上述获得的基因hGDH1以一定比例加入Gibson反应体系中。50℃反应1小时。取5μL连接产物转化DH5α(购自Takara，产品目录号为D9057A)，使用链霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒，经过测序表明获得正确连接的质粒，将该质粒命名为PEA48，含该质粒的菌株能够表达出芳香族氨基酸氨基转移酶、苯丙酮酸脱羧酶、苯乙醛还原酶和谷氨酸脱氢酶。
9、PEA49质粒的构建
以运动单胞菌Zymomonas mobilis subsp.mobilis ZM4基因组为模板，设计一对引物，扩增得到苯丙酮酸脱羧酶的编码基因(zmpdc)，片段大小约1600bp，经测序分析，结果表明扩增的zmpdc的基因序列如列表中的序列21所示，该核苷酸序列所编码的苯丙酮酸脱羧酶的氨基酸序列如序列表中序列22所示。
将质粒PEA48使用NcoI和KpnI双酶切，电泳回收7000kb片段。使用Gibson连接方法，将酶切回收后的PEA48片段与上述获得的基因zmpdc以一定比例加入Gibson反应体系中。50℃反应1小时。取5μL连接产物转化DH5α(购自Takara，产品目录号为D9057A)，使用链霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒，经过测序表明获得正确连接的质粒，将该质粒命名为PEA49，含该质粒的菌株能够表达出芳香族氨基酸氨基转移酶、苯丙酮酸脱羧酶、苯乙醛还原酶和谷氨酸脱氢酶。
10、PEA410质粒的构建
以巴西固氮菌Azospirillum brasilense基因组为模板，设计一对引物，扩增得到吲哚-3-丙酮酸脱羧酶编码基因(ipdc)，片段大小约1600bp，经测序分析，结果表明扩增的ipdc的基因序列如列表中的序列23所示，该核苷酸序列所编码的吲哚-3-丙酮酸脱羧酶的氨基酸序列如序列表中序列24所示。
将质粒PEA48使用NcoI和KpnI双酶切，电泳回收7000kb片段。使用Gibson连接方法，将酶切回收后的PEA48片段与上述获得的基因ipdc以一定比例加入Gibson反应体系中。50℃反应1小时。取5μL连接产物转化DH5α(购自Takara，产品目录号为D9057A)，使用链霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒，经过测序表明获得正确连接的质粒，将该质粒命名为PEA410，含该质粒的菌株能够表达出芳香族氨基酸氨基转移酶、吲哚-3-丙酮酸脱羧酶、苯乙醛还原酶和谷氨酸脱氢酶。
二、构建产2-苯乙醇的重组菌
大肠杆菌E.coli BW25113(公众可从中国科学院微生物研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Tomoya Baba,Takeshi Ara,Miki Hasegawa,Yuki Takai,YoshikoOkumura,Miki Baba,Kirill A Datsenko,Masaru Tomita,Barry L Wanner,and HirotadaMori1.Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockoutmutants:the Keio collection.Molecular Systems Biology(2006):1-11.)
ΔgdhA、ΔfeaB、ΔkatG、ΔpheA购自国立遗传学研究所(NIG，Japan)。
ΔgdhA：在E.coli BW25113的基础上缺失谷氨酸脱氢酶基因得到的菌株。
ΔfeaB：在E.coli BW25113的基础上缺失苯乙醛脱氢酶基因得到的菌株。
ΔkatG：在E.coli BW25113的基础上缺失过氧化物酶基因得到的菌株。
ΔpheA：在E.coli BW25113的基础上缺失预苯酸脱氢酶基因得到的菌株。
本实施例中使用的宿主菌如下表所示。
将步骤一中构建的质粒用氯化钙法转化不同的宿主大肠杆菌获得工程菌株。
将上述宿主菌BW25113、ΔgdhA、ΔfeaB、ΔkatG、ΔpheA制备为感受态细胞。
将质粒PEA31转化至BW25113菌株感受态中获得PEA31B。
将质粒PEA32转化至BW25113菌株感受态中获得PEA32B。
将质粒PEA33转化至BW25113菌株感受态中获得PEA33B。
将质粒PEA31转化至ΔgdhA菌株感受态中获得PEA31G。
将质粒PEA32转化至ΔgdhA菌株感受态中获得PEA32G。
将质粒PEA41转化至ΔgdhA菌株感受态中获得PEA41G。
将质粒PEA42转化至ΔgdhA菌株感受态中获得PEA42G。
将质粒PEA43转化至ΔgdhA菌株感受态中获得PEA43G。
将质粒PEA44转化至ΔgdhA菌株感受态中获得PEA44G。
将质粒PEA45转化至ΔgdhA菌株感受态中获得PEA45G。
将质粒PEA46转化至ΔgdhA菌株感受态中获得PEA46G。
将质粒PEA47转化至ΔgdhA菌株感受态中获得PEA47G。
将质粒PEA48转化至ΔgdhA菌株感受态中获得PEA48G。
将质粒PEA49转化至ΔgdhA菌株感受态中获得PEA49G。
将质粒PEA410转化至ΔgdhA菌株感受态中获得PEA410G。
将质粒PEA31转化至ΔfeaB菌株感受态中获得质粒PEA31F。
将质粒PEA31转化至ΔkatG菌株感受态中获得质粒PEA31K。
将质粒PEA31转化至ΔpheA菌株感受态中获得质粒PEA31P。
实施例2、重组菌全细胞催化制备2-苯乙醇
1、重组菌的诱导
自诱导培养：将重组菌划线到含有质量百分比浓度为1.5％的琼脂和含50μg/mL的链霉素LB平板上，37℃培养12h。挑取平板上所长的单克隆，接种到含有50μg/mL的链霉素的液体LB培养基中，37℃过夜震荡培养，转速为220rpm；将过夜培养的物以体积百分比为1％的接种量接种至自诱导培养基ZYM中，20℃震荡培养，转速220rpm，培养时间为24h。
自诱导培养基ZYM配方如下：100mL A+2mL B+2mL C+200μL D+100μL E。
以下均为质量百分比浓度：
A.ZY：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉；
B.50×M：1.25M Na2HPO4，1.25M KH2PO4，2.5M NH4Cl和0.25M Na2SO4；
C.50×5052：25％甘油，2.5％葡萄糖，10％L-阿拉伯糖；
D.500×MgSO4；1M MgSO4
E.1000×微量元素：50mMFeCl3，20mMCaCl2，10mMMnCl2，10mMZnSO4，CoCl2、NiCl2、Na2Mo4、Na2SeO3和H3BO3各2mM。
自诱导培养后的重组菌表达芳香族氨基酸氨基转移酶、苯丙酮酸脱羧酶、苯乙醛还原酶(或苯乙醇脱氢酶)，或者表达芳香族氨基酸氨基转移酶、苯丙酮酸脱羧酶(或吲哚-3-丙酮酸脱羧酶)、苯乙醛还原酶(或苯乙醇脱氢酶)和谷氨酸脱氢酶。
2、全细胞生物转化制备2-苯乙醇
将诱导后的重组菌，于4摄氏度4200rpm离心10min，使用200μL转化液洗涤一次，弃上清后，再次重悬于200μL转化液中，使其最终OD值为10-100，转化温度30度，时间6-12h，转速200rpm。
基础转化液：50mM MOPS缓冲液，50mM L-苯丙氨酸，pH＝6.5。
3、2-苯乙醇的检测方法
将转化后的体系，12000rpm离心10min，取上清，使用0.22μm滤膜过滤后，用HPLC检测2-苯乙醇产量。HPLC采用Agilent 1200高效液相色谱仪(配四元泵、DAD检测器和工作站)。色谱条件：Waters X-Bridge C-183.5μm 4.6*150mm Column；流动相：水/乙腈＝70/30，流速：0.5mL min-1，柱温25℃；进样量5μL，检测波长214nm。实验设置三次重复，结果取平均值。
苯丙酮酸(PP)、苯丙氨酸(phe)、苯乙醛(PAld)、苯乙醇(PEA)标准品(购自sigma公司)，保留时间分别为2.6min、3.0min、4.8min、8.4min。如图2A所示。
实施例3、不同工程菌株全细胞催化制备2-苯乙醇
本实施例中所述的2-苯乙醇的量mM，均是指转化体系中2-苯乙醇的浓度。
1、PEA31B全细胞转化产2-苯乙醇
使用菌株PEA31B按照实施案例2中方法进行蛋白诱导表达，使用基础转化液全细胞转化合成2-苯乙醇。产物2-苯乙醇(PEA)的合成量随时间延长逐渐升高，在6小时后，2-苯乙醇积累量基本保持不变(图3)。
2、PEA31B、PEA32B、PEA33B全细胞转化产2-苯乙醇
使用菌株PEA31B、PEA32B、PEA33B按照实施案例2中方法进行蛋白诱导表达，使用基础转化液进行全细胞催化转化实验。
PEA31B中乙醇脱氢酶来源于酿酒酵母的乙醇脱氢酶(adh1)，产量10.79mM；
PEA32B将PEA31B中乙醇脱氢酶替换为来源于玫瑰的par，产量29.87mM,是PEA31B的2.77倍；
PEA33B将PEA31B中乙醇脱氢酶替换为来源于大肠杆菌的yahK，产量29.07mM；是PEA31B的2.70倍。
3.不同敲除菌株的合成能力的比较：
使用菌株PEA31B、PEA31F、PEA31K、PEA31P按照实施案例2中方法进行蛋白诱导表达，使用基础转化液进行全细胞催化转化实验。转化6小时候转化液2-苯乙醇浓度如下表所示：
| 菌株 | 2-苯乙醇浓度(mM) |
| PEA31B | 10.79 |
| PEA31F | 10.38 |
| PEA31K | 22.90 |
| PEA31P | 7.53 |
其中，宿主菌中敲除katG菌株2-苯乙醇合成能力是对照BW25113的2.12倍。
4、PEA31B，PEA32B，PEA31G，PEA32G全细胞转化产2-苯乙醇
使用菌株PEA31B，PEA32B，PEA31G，PEA32G的2-苯乙醇按照实施案例2中方法进行蛋白诱导表达，使用基础转化液进行全细胞催化转化实验。转化6小时候转化液2-苯乙醇浓度如下表所示，结果表明，gdhA对2-苯乙醇具有重要作用，含有gdhA的菌株(PEA31B，PEA32B)产量比没有gdhA菌株PEA31G，PEA32G高。
5、谷氨酸脱氢酶与乙醇脱氢酶配对2-苯乙醇合成的影响
构建了带有不同来源谷氨酸脱氢酶编码基因的质粒PEA41-PEA48，转化gdhA缺失的菌株。比较其2-苯乙醇合成能力。
PEA41G、PEA42G、PEA43G、PEA44G、PEA45G、PEA46G、PEA47G、PEA48G全细胞转化6h后的2-苯乙醇浓度分别为：21.80mM、10.20mM、0mM、4.83mM、8.78mM、13.30mM、28.95mM、26.22mM。其中产量最高的是PEA41G、PEA47G、PEA48G。结果表明，使用NADH依赖型的ADH1时，枯草芽孢杆菌中的NADH依赖型的谷氨酸脱氢酶RocG与之匹配时产量最高。使用NADPH依赖型的PAR时，大肠杆菌中和人来源的NADPH依赖型的谷氨酸脱氢酶GdhA和hGDH与之匹配时产量高。其中，最高为使用大肠杆菌来源的GdhA与PAR匹配时，合成量最高，达到28.95mM。
6、对苯丙酮酸脱羧酶Aro10的替换结果
使用菌株PEA48G，PEA49G，PEA410G，按照实施案例2中所述方法进行蛋白诱导表达，蛋白诱导表达温度为30℃，使用基础转化液进行全细胞催化转化实验。转化6小时候，2-苯乙醇产量依次为13.35mM、0.26mM、5.44mM。结果表明PEA48G转化效果最高达到13.35mM。
实施例4、谷氨酸对全细胞转化产2-苯乙醇的作用
使用菌株PEA32B实施案例2中方法进行蛋白诱导表达，使用基础转化液中添加0-20mM的L-谷氨酸，转化体系pH＝6.5，全细胞催化6h合成2-苯乙醇浓度如下表所示。结果表明其中在体系中添加10mM L-谷氨酸所获得的2-苯乙醇浓度最高，达到44.49mM即5.48g/L。
实施例5、α-酮戊二酸对全细胞转化产2-苯乙醇的作用
使用菌株PEA32B实施案例2中方法进行蛋白诱导表达，使用基础转化液中添加0-20mM的α-酮戊二酸，转化体系pH＝6.5，全细胞催化6h合成2-苯乙醇浓度如下表所示。结果表明，在体系中添加20mMα-酮戊二酸所获得的2-苯乙醇浓度最高，达到48.90mM即5.97g/L。
实施例6、沸石对全细胞转化产2-苯乙醇的作用
使用菌株PEA32B实施案例2中方法进行蛋白诱导表达，使用基础转化液中添加0-30g/L的沸石，转化体系pH＝6.5，全细胞催化6h合成2-苯乙醇浓度如下表所示。结果表明，在体系中添加10g/L沸石所获得的2-苯乙醇浓度最高，达到43.65mM即5.36g/L。
实施例7、全细胞转化产2-苯乙醇
使用菌株PEA32B实施案例2中方法进行蛋白诱导表达，使用基础转化液,并向其中添加10g/L的沸石和终浓度为5mM的α-酮戊二酸，转化体系pH＝6.5。全细胞催化6h合成2-苯乙醇浓度为49mM，即5.98g/L，转化率98％，生产强度为0.99g/L/h。
使用菌株PEA32B实施案例2中方法进行蛋白诱导表达，使用基础转化液,并向其中添加10g/L的沸石和终浓度为5mM的L-谷氨酸，转化体系pH＝6.5。全细胞催化6h合成2-苯乙醇浓度为46.65mM，即5.69g/L，转化率93.3％，生产强度为0.94g/L/h。
Claims (8)
1.一种重组菌，其构建方法为通过共表达如下三种酶：芳香族氨基酸氨基转移酶、苯丙酮酸脱羧酶或吲哚-3-丙酮酸脱羧酶、苯乙醇脱氢酶或苯乙醛还原酶，得到重组菌；
构建重组菌中使用的宿主菌为大肠杆菌；所述大肠杆菌为野生型大肠杆菌或突变型的大肠杆菌；
所述突变型的大肠杆菌为大肠杆菌的基因敲除突变体，所述大肠杆菌的基因敲除突变体为将大肠杆菌中苯乙醛脱氢酶编码基因feaB、过氧化物酶编码基因katG和分支酸变位酶编码基因pheA中的至少一个基因敲除后得到的；
所述芳香族氨基酸氨基转移酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；
所述苯丙酮酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2或 SEQ ID No.22；
所述吲哚-3-丙酮酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQ ID No.24；
所述苯乙醇脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.3或SEQ ID No.5；
所述苯乙醛还原酶的氨基酸序列为SEQ ID No.4。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述共表达的方法为：利用重组表达载体向所述宿主菌中导入所述酶的编码基因；
所述芳香族氨基酸氨基转移酶的编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.10所示；
所述苯丙酮酸脱羧酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.11或SEQ ID No.21；
所述吲哚-3-丙酮酸脱羧酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.23；
所述苯乙醇脱氢酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.12或SEQ ID No.14；
所述苯乙醛还原酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.13。
3.一种重组菌，其构建方法为通过共表达如下四种酶：芳香族氨基酸氨基转移酶、苯丙酮酸脱羧酶或吲哚-3-丙酮酸脱羧酶、苯乙醇脱氢酶或苯乙醛还原酶、谷氨酸脱氢酶，得到重组菌；
其中，所述芳香族氨基酸氨基转移酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；
所述苯丙酮酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2或 SEQ ID No.22；
所述吲哚-3-丙酮酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQ ID No.24；
所述苯乙醇脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.3或SEQ ID No.5；
所述苯乙醛还原酶的氨基酸序列为SEQ ID No.4；
所述谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.6或SEQ ID No.7或SEQ ID No.8或SEQID No.9；
构建重组菌中使用的宿主菌为大肠杆菌；所述大肠杆菌为野生型大肠杆菌或突变型的大肠杆菌；
所述突变型的大肠杆菌为大肠杆菌的基因敲除突变体，所述大肠杆菌的基因敲除突变体为将大肠杆菌中谷氨酸脱氢酶编码基因gdhA、苯乙醛脱氢酶编码基因feaB、过氧化物酶编码基因katG和分支酸变位酶编码基因pheA中的至少一个基因敲除后得到的。
4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于：所述共表达的方法为：利用重组表达载体向所述宿主菌中导入所述酶的编码基因；
导入芳香族氨基酸氨基转移酶的编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.10所示；
导入苯丙酮酸脱羧酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.11或SEQ ID No.21；
导入吲哚-3-丙酮酸脱羧酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.23；
导入苯乙醇脱氢酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.12或SEQ ID No.14；
导入苯乙醛还原酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.13；
导入谷氨酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.15或SEQ ID No.16或SEQID No.17或SEQ ID No.18。
5.权利要求1-4任一所述的重组菌在制备2-苯乙醇中的应用。
6.一种制备2-苯乙醇的方法，包括如下步骤：将权利要求1-4中任一所述重组菌进行培养，诱导蛋白表达，然后将表达后的重组菌重悬于含L-苯丙氨酸的转化液中，全细胞催化转化得到2-苯乙醇。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述转化体系中还包括如下中的至少一种：α-酮戊二酸、L-谷氨酸和沸石。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述转化体系的组成为如下任一：
（1）50mM MOPS缓冲液，10-100mM L-苯丙氨酸，pH=6.0-7.5；具体为50mM MOPS缓冲液，50mM L-苯丙氨酸，pH=6.5；
（2）50mM MOPS缓冲液，10-100mM L-苯丙氨酸，0-20mM的L-谷氨酸，pH=6.0-7.5，L-谷氨酸含量不为0；具体为50mM MOPS缓冲液，50mM L-苯丙氨酸，10mM L-谷氨酸、1mM L-谷氨酸、2mM L-谷氨酸、5mM L-谷氨酸或20mM L-谷氨酸，pH=6.5；
（3）50mM MOPS缓冲液，10-100mM L-苯丙氨酸，0-20mMα-酮戊二酸，pH=6.0-7.5，α-酮戊二酸含量不为0；具体为50mM MOPS缓冲液，50mM L-苯丙氨酸，20mMα-酮戊二酸、1mMα-酮戊二酸、2mMα-酮戊二酸、5mMα-酮戊二酸或10mMα-酮戊二酸，pH=6.5；
（4）50mM MOPS缓冲液，10-100mM L-苯丙氨酸，0-30g/L 沸石，pH=6.0-7.5，沸石含量不为0；具体为50mM MOPS缓冲液，50mM L-苯丙氨酸，10g/L沸石、1g/L沸石、5g/L沸石、20g/L沸石或30g/L沸石，pH=6.5；
（5）50mM MOPS缓冲液，10-100mM L-苯丙氨酸，0-30g/L沸石，0-20 mMα-酮戊二酸，pH=6.0-7.5，具体为50mM MOPS缓冲液，50mM L-苯丙氨酸，10g/L沸石，5mMα-酮戊二酸， pH=6.5；
（6）50mM MOPS缓冲液，10-100mM L-苯丙氨酸，0-30g/L沸石， 0-20mM L-谷氨酸，pH=6.0-7.5，具体为50mM MOPS缓冲液，50mM L-苯丙氨酸，10g/L沸石，5mM L-谷氨酸，pH=6.5。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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