KR20020092912A - 판토-화합물의 생산을 위한 방법 및 미생물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 판토테네이트 생합성 경로 및(또는) 이소루이신-발린 생합성 경로 및(또는) 조효소 A 생합성 경로가 조작된 미생물을 이용하여 판토-화합물 (예를 들어, 판토테네이트)을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 케토판토에이트 리덕타제 과다발현 미생물 및 아스파테이트-α-데카르복실라제 과다발현 미생물을 이용하는 특징이 있는 방법이 제공된다. 본 명세서에는 전구체에 독립적인 방식으로 고수율로 판토-화합물을 생산하는 방법이 설명되어 있다. 상기 방법을 수행하는데 유용한 재조합 미생물, 벡터, 단리된 핵산 분자, 유전자 및 유전자 산물도 제공된다. 또한, 본 발명은 기존에 미확인된 미생물 판토테네이트 키나아제 유전자인 coaX, 및 변형된 판토테네이트 키나아제 활성을 지닌 미생물을 이용하여 판토-화합물을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명은 재조합 미생물, 벡터, 단리된 coaX 핵산 분자 및 정제된 CoaX 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 재조합 미생물 및(또는) 본 발명의 정제된 CoaX 단백질을 이용하여 판토테네이트 키나아제 조절 물질을 찾아내는 방법에 관한 것이다.

Description

판토-화합물의 생산을 위한 방법 및 미생물 {Methods and Microorganisms for Production of Panto-Compounds}
판토텐산 또는 비타민 B5라고도 알려진 판토테네이트는 비타민의 B 복합체의 구성원이며, 가축 및 인간을 비롯한 포유류에 필요한 영양소이다 (예를 들어, 수용성 비타민 공급물 또는 식품 첨가제로서의 식품 공급원으로부터). 세포에서 판토테네이트는 주로 조효소 A (CoA) 및 아실 캐리어 단백질 (ACP)의 생합성에 이용된다. 이들 조효소는 이들 분자의 4'-포스포판테테인 부분의 술프히드릴기와 함께 티오에스테르를 형성하는 아실 잔기의 대사에 작용한다. 이들 조효소는 세포내 물질대사에서 100가지가 넘는 상이한 중간 반응에 관여하는, 모든 세포에 필수적인 물질이다.
판토테네이트 (특히, 생물활성의 D 이성질체)를 합성하는 통상적인 수단은, 과도한 기질 비용으로 인해 제한을 받고 라세미 중간체의 광학 분할을 필요로 하는 과정 (예를 들어, DL-판토락톤을 분할하여 D-판토락톤을 얻어 β-알라닌과 화학 축합시킴)인 벌크 화합물의 화학적 합성을 통한 것이다. 따라서, 본 연구자들은 최근에 판토테네이트 생합성 과정에 유용한 효소를 생산하는 박테리아 또는 미생물 시스템 (박테리아는 그 자체로 판토테네이트를 합성할 수 있기 때문에)을 연구하였다. 특히, 생물전환 과정이 판토텐산의 D 이성질체 생산에 우호적인 수단으로서평가되었는데, 예를 들면 DL-판토텐산 에스테르를 D-판토텐산으로 선택적으로 가수분해하는 미생물을 이용하는 것, L-판토락톤을 선택적으로 분해하여 D-판토락톤만을 생성하는 미생물을 이용하는 것, 및 DL-판토락톤을 D-판토산으로 선택적으로 가수분해하는 미생물을 이용하는 것이 있다.
그러나, 개선된 판토테네이트 생산 과정, 특히 기질의 양을 줄이고(거나) 비용이 저렴한 기질을 필요로 하는 과정에 대한 상당한 요구가 여전히 존재한다. 이를 위해, 최근에 D-판토테네이트 생산을 개선시키는 수단으로서 직접적인 미생물 합성 방법이 조사되었다. 미생물에서 판토테네이트 생합성은 다단계 경로로서, 판토에이트 (α-케토이소발레레이트로부터 유래) 및 β-알라닌을 축합시켜 D-판토테네이트를 형성한다. 이소루이신-발린 (ilv) 경로의 생합성 효소인 아세토히드록시산 신테타제 (ilvBN 또는 alsS 유전자의 산물), 아세토히드록시산 이소메로리덕타제 (ilvC 유전자의 산물) 및 디히드록시산 데히드라타제 (ilvD 유전자의 산물)는 피루베이트를 α-케토이소발레레이트로 전환시키는 과정을 촉매한다. 또한, 이 반응은 판토테네이트 (pan) 경로의 생합성 효소인 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제 (panB 유전자의 산물), 케토판토에이트 리덕타제 (panE 유전자의 산물), 아스파테이트-α-데카르복실라제 (panD 유전자의 산물) 및 판토테네이트 신테타제 (panC 유전자의 산물)에 의해 촉매된다.
살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 및 에셰리키아 콜라이 (Escherichia coli)에서 판토텐산의 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자들이 최근 확인 및 특성화되었다 (Frodyma and Downs (1998)J. Biol. Chem.273:5572-5576 and Jackowski (1996) pp. 687-694,InNeidhardtet al(ed.)Escherichia coliandSalmonella: Cellular and Molecular Biology, 2nded.Am. Soc. Microbiol.Wash, D.C). 이. 콜라이에서 예를 들면, 판토텐산의 생합성은 4가지 주요 단계로 이루어진다. 제1 단계는 panB 유전자 산물인 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제에 의해 촉매되며, L-발린 중간체인 α-케토이소발레레이트를 이용하여 케토판토에이트를 생성한 후, panE 유전자 산물인 케토판토에이트 리덕타제에 의해 판토에이트로 환원되는 것이다. panD 유전자 산물인 아스파테이트-α-데카르복실라제는 아스파테이트로부터 β-알라닌을 생성한다. panC 유전자 산물인 판토테네이트 신테타제는 그 후에 β-알라닌을 판토에이트와 연결하여 D-판토테네이트를 생성한다.
더쉬 (Dusch) 등은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) panD 유전자의 확인에 대해 설명하였고, 이. 콜라이에서 씨. 글루타미쿰 (C. glutamicum) panD 유전자를 발현시켜 판토테네이트 140 ng/mg(건량)/시간의 비생산성으로 판토테네이트를 생산하는 균주를 얻을 수 있다고 보고하였다 (Duschet al.(1999)Appl. Environ. Microbiol.65:1530-1539).
삼 (Sahm) 및 에겔링 (Eggeling)은 panBC 유전자를 과다발현하는, 유전자 조작된 씨. 글루타미쿰 균주에 대해 설명하였다 (Sahm and Eggeling (1999)Appl. Environ. Microbiol.65:1973-1979). 조작된 균주가 판토테네이트를 생산하기는 하지만, 판토텐산 생산을 검출할 수 있도록 하기 위해 숙주 생물체에서 α-케토이소발레레이트를 담당하는 유전자를 과다발현시킬 필요가 있었다. 더욱이, β-알라닌의 첨가 없이는 제작된 균주에 판토테네이트가 거의 축적되지 않았다.
이와 유사하게, 살리실산나트륨에 내성이 있는 이. 콜라이 돌연변이 균주를 이용하여 β-알라닌의 존재하에 배양시 D-판토텐산을 생산하는 D-판토텐산의 생산 방법이 설명되었다 (미국 특허 제5,518,906호). 살리실산뿐 아니라, α-케토이소발레르산 및(또는) α-케토부티르산 및(또는) α-아미노부티르산 및(또는) β-히드록시아스파트산 및(또는) O-메틸-트레오닌에 내성이 있는 이. 콜라이 균주의 생성은 추가로 판토텐산의 생산량을 증가시켰다. 더욱이, panB, panC 및 panD 유전자가 포함된 플라스미드 DNA를 살리실산 내성 돌연변이 균주에 형질전환시키면 판토테네이트 생산량이 증가했지만, 해당 실시예에서 최대 20 g/L의 β-알라닌을 공급해야 했다. panB-panC-panD 유전자는 이. 콜라이 염색체에서 클러스터링되어 있었다.
마지막으로, 살리실산-내성, α-케토이소발레레이트-내성, α-케토부티레이트-내성, β-히드록시아스파테이트-내성, O-메틸트레오닌-내성 이. 콜라이 균주를 판토테네이트 생합성 유전자를 함유하는 DNA 단편 및(또는) 분지형 아미노산 생합성 유전자를 함유하는 DNA 단편으로 형질전환시켜 β-알라닌의 존재하에 배양하였다 (미국 특허 제5,932,457호).
판토에이트와 β-알라닌의 축합으로부터 박테리아에서 판토테네이트가 생산되며, 여기에는 판토테네이트 생합성 효소인 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제 (panB 유전자의 산물), 케토판토에이트 리덕타제 (panE 유전자의 산물), 아스파테이트-α-데카르복실라제 (panD 유전자의 산물) 및 판토테네이트 신테타제 (panC 유전자의 산물)이 관여한다. 비록 판토테네이트는 비타민으로서 생물학적 활성을 갖지만, 이는 모든 세포에서 추가의 물질대사를 통해 조효소 A (CoA)로 변환되어 트리카르복실산 (TCA) 회로, 지방산 대사 및 다수의 다른 중간 물질대사 반응에서 아실기 케리어로서 관여한다. 판토테네이트의 조효소 A (CoA)로의 전환에서 최초 (및 가능한 속도 조절) 단계는 판토테네이트 키나아제에 의한 판토테네이트의 인산화 단계이다. 판토테네이트 키나아제 활성은, 허용 온도에서는 CoA를 합성하지만 비-허용 온도에서는 판토테네이트를 분비하는 온도-감수성 돌연변이에 대한 스크리닝에 의해 살모넬라 티피무리움에서 처음으로 확인되었다. 돌연변이는 살모넬라의 염색체에 매핑되었고, 유전자 좌위는 coaA라 명명되었다. 이 유전자는 판토테네이트로부터의 조효소 A 생합성에서 제1 단계를 촉매하는 효소를 코딩한다 (Dunn and Snell (1979)J. Bacteriol.140:805-808). 이. 콜라이 온도 감수성 돌연변이체도 단리 및 특성화되었다 (Vallari and Rock (1987)J. Bacteriol.169:5795-5800). 이들 돌연변이체 (coaA15(Ts)라 명명)는 판토테네이트를 CoA로 전환시키는 능력이 결여되어 있었으며, 추가로 온도에 반응하여 증식하는 표현형을 나타냈는데, 이는 판토테네이트 키나아제 활성이 증식에 필수적임을 시사한다. 더욱이, CoA가 야생형 효소에 비해 돌연변이체에서 동일한 정도로 판토테네이트 키나아제 활성을 억제하는 것은 주목할만 하다.
피드백 내성 이. 콜라이 돌연변이체 (coaA16(fr)이라 명명)도 단리되었으며, 이는 CoA에 의한 피드백 억제에 저항하는 판토테네이트 키나아제 활성을 지니고 있었다 (Vallari and Jackowski (1988)J. Bacteriol.170:3961-3966). 복귀 (reversion)을 담당하는 돌연변이는 놀랍게도 형질도입에 의해 유전자적으로 coaA 유전자와 연관되어 있지 않았다. 여기에 기재된 부가의 데이타는 세포의 총 CoA 함량이 판토테네이트 키나아제 단계에서의 생합성 조절 및 가능하게는 CoA의 4'-포스포판테테인으로의 분해 둘 다에 의해 제어된다는 견해를 지지한다.
야생형 이. 콜라이 coaA 유전자는 이. 콜라이 온도-감수성 돌연변이체를 기능적으로 보완하여 클로닝하였다. 야생형 유전자의 서열을 결정하였다 (Song and Jackowski (1992)J. Bacteriol.174:6411-6417 and Flammet al.(1988)Gene(Amst.) 74:555-558). 다수 카피의 coaA 유전자를 함유하는 균주는 판토테네이트 키나아제의 활성이 76배 더 높았지만, coA의 정상 상태 (steady state) 양은 단지 2.7배만이 증가하였다 (Song and Jackowski, 상기 문헌). 추가로, 원핵생물의 효소 (이. 콜라이 및 다양한 다른 미생물에서 coaA에 의해 코딩됨)는 CoA에 의해, 상기 효소를 억제하는 아세틸-CoA에 비해 약 5배 더 강력하게 생체내 및 시험관내에서 피드백 억제된다 (Song and Jackowski, 상기 문헌, Vallariet al., 상기 문헌). 더욱이, 이. 콜라이에서 panB 유전자의 생산은 CoA에 의해 억제된다고 보고되었다 (Powers and Snell (1976)J. Biol. Chem.251:3786-3793). 또한, 이들 데이타는 판토테네이트 키나아제 활성의 피드백 억제가 세포내 CoA 농도를 조절하는 중요한 인자라는 견해를 지지한다.
표준 연구 및 정렬 도구를 이용하여, coaA 상동체가 헤모필루스 인플루엔자 (Hemophilus influenzae), 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacteriumtuberculosis), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae), 스트렙토코커스 파이로게네스 (Streptococcus pyogenes) 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)에서 확인되었다. 반대로, 상당히 유사한 단백질이 사카로마이세스 세레비지아 (Saccharomyces cerevisiae)를 비롯한 진핵 세포 및 포유류 발현 서열 태그 (EST) 데이타베이스에서 확인되었다. 유전자 선별 전략을 이용하여, 판토테네이트 키나아제 활성 물질을 코딩하는 cDNA를 최근에 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans)로부터 확인하였다 (Calderet al. (1999)J. Biol. Chem.274:2014-2020). 진핵 세포의 판토테네이트 키나아제 유전자 (panK)는 독특한 1차 구조를 가지고 있으며, 원핵 세포의 대응 유전자와 확인히 구분되는 독특한 조절 특성을 지니고 있다. 포유류 판토테네이트 키나아제 유전자 (mpanK1α)도 단리되었는데, 이는 에이. 니둘란스 (A. nidulans)의 PanK 단백질에 상동성이 있는 단백질, 및 에스. 세레비지아 (S. cerevisiae)의 게놈에서 확인된 진뱅크 (상표명, GenBank) 허가번호 927798의 예상 유전자 산물을 코딩한다 (Rocket al. (2000)J. Biol. Chem.275:1377-1383).
<발명의 개요>
본 발명은 부분적으로는, 바실러스 서브틸리스에서 판토테네이트 생합성 경로의 유전자를 코딩하는 중요한 효소의 발견을 토대로 완성된 것이다. 특히, 본 발명자들은 비. 서브틸리스 (B. subtilis)의 panE 유전자를 찾아냈다. 비. 서브틸리스에서 panE 유전자의 과다발현 또는 탈조절 (deregulation)은 panE 유전자의 산물인 케토판토에이트 리덕타제의 생산량을 증가시키고, 또한 판토테네이트의 생산량을 증가시킨다. 이와 유사하게, 이 유전자에서의 돌연변이는 비. 서브틸리스에서의 판토테네이트 생산을 90％가 넘게 감소시킨다. 또한, 본 발명자들은 과다발현 또는 탈조절의 결과 판토테네이트 생산을 증가시키는 비. 서브틸리스의 예상 panBCD 오페론을 확인하였다. 본 발명자들은 또한 비. 서브틸리스에서 panD 유전자의 과다발현 또는 탈조절 (panD 유전자 산물인 아스파테이트-α-데카르복실라제의 생산을 증가시킴)이, 특히 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 경로의 중요한 효소를 코딩하는 유전자의 탈조절과 병행하는 경우에 판토테네이트의 생산을 증가시킴을 입증하였다.
따라서, 본 발명은 판토테네이트뿐 아니라, 본원에서 "판토-화합물 (panto-compound)"이라 부르는 판토테네이트 생합성 경로의 다른 화합물 (예를 들어, 케토판토에이트, 판토에이트 및 β-알라닌)을, 판토테네이트 생합성 경로 및(또는) 이소루이신-발린 생합성 경로가 조작되어 판토테네이트 또는 다른 목적 판토-화합물이 생산되는 미생물을 이용하여 생산하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 panE 유전자의 산물인 케토판토에이트 리덕타제를 과다발현하는 미생물 (또한, 본원에서 케토판토에이트 리덕타제-과다발현 미생물 또는 "KPAR-O" 미생물로 언급)을, 판토-화합물 (예를 들어, 판토테네이트 또는 판토에이트)이 생산되는 조건하에서 배양하는 것을 포함하는 판토-화합물 (예를 들어, 판토테네이트 또는 판토에이트)의 생산 방법에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 판토테네이트 생합성 효소 (예를 들어, panB, panC 또는 panD 유전자의 산물들 중 하나 이상)를 과다발현하는 미생물을, 바람직하게는 KPAR-O 미생물을 판토-화합물 (예를 들어, 판토테네이트 또는 판토에이트)이 생산되는 조건하에서 배양하는 것을 포함하는 판토-화합물 (예를 들어, 판토테네이트 또는 판토에이트)의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 전구체 공급 (예를 들어, β-알라닌 또는 아스파테이트 및(또는) α-케토이소발레레이트 또는 발린)의 필요성에 독립적인 판토-화합물의 생산 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 판토테네이트가 생산되는 조건하에서 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 경로를 갖는 아스파테이트-α-데카르복실라제-과다발현 (AαD-O) 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 전구체 공급에 독립적인 방식으로 판토테네이트를 생산하는 방법에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 판토테네이트가 생산되는 조건하에서 탈조절된 판토테네이트 (pan) 경로 및 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 경로를 갖는 AαD-O 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 전구체 공급에 독립적인 방식으로 판토테네이트를 생산하는 방법에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 판토테네이트가 생산되는 조건하에서 AαD-O 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 아스파테이트 또는 β-알라닌 공급에 독립적인 방식으로 판토테네이트를 생산하는 방법에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 판토테네이트가 생산되는 조건하에서 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 경로를 갖는 AαD-O 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 발린 또는 α-케토이소발레레이트 공급에 독립적인 방식으로 판토테네이트를 생산하는 방법에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 판토테네이트가 상당히 높은 수율 (예를 들어, 10 g/L, 20 g/L, 30 g/L 또는 40 g/L가 넘는 양)로 생산되는 조건하에서 조작된 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 고수율로 판토테네이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명의 방법은 아세토히드록시산 신테타제 또는 아세토히드록시산 이소메로리덕타제를 과다발현하는 미생물 (예를 들어, ilvBNC 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물), 디히드록시산 데히드라타제를 과다발현하는 미생물 (예를 들어, ilvD 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물), 아스파테이트-α-데카르복실라제를 과다발현하는 미생물 (예를 들어, panD 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물), 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 경로를 갖는 미생물 및 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로를 갖는 미생물 (예를 들어, 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제, 케토판토에이트 리덕타제, 판토테네이트 신테타제 및 아스파테이트-α-데카르복실라제 중 어느 것을 과다발현하는 미생물; 예, panBCD 핵산 서열을 포함하는 벡터 또는 panE1 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물)에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 재조합 미생물은 그람 양성균 (예를 들어, 바실러스속, 코라네박테리움속, 락토바실러스속, 락토코커스속 또는 스트렙토마이세스속에 속하는 미생물들)이다. 다른 실시양태에서, 재조합 미생물은 그람 음성균이다. 특히 바람직한 것으로는 바실러스 재조합 미생물 (예를 들어, 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 서브틸리스, 바실러스 푸밀루스 (Bacillus pumilus), 바실러스 할로두란스 (Bacillus halodurans) 등)이 있다. 바실러스의 판토테네이트 및(또는) 이소루이신-발린 생합성 효소 (예를 들어, 비. 서브틸리스 판토테네이트 및(또는) 이소루이신-발린 생합성 효소)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터들도 설명되어 있다.
또한, 본 발명은 β-알라닌이 생산되는 조건하에서 아스파테이트-α-데카르복실라제-과다발현 (AαD-O) 미생물을 배양하는 것을 포함하는 β-알라닌의 생산 방법, 및 β-알라닌이 생산되는 조건하에서 아스파테이트를 포함하는 조성물을 단리된 바실러스 아스파테이트-α-데카르복실라제 효소와 접촉시키는 것을 포함하는 β-알라닌의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 생산 방법은 판토-화합물 (예를 들어, 판토테네이트 또는 판토에이트)을 회수하는 단계를 더 포함한다.
또한, 본 발명은 재조합 미생물, 예를 들어, AαD-O 미생물, 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 경로를 갖는 미생물, 1종 이상의 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제 (panB 유전자의 산물), 판토테네이트 신테타제 (panC 유전자의 산물), 아스파테이트-α-데카르복실라제 (panD 유전자의 산물) 및 케토판토에이트 리덕타제 (panE1 유전자의 산물) 중 하나 이상을 과다발현하는 미생물, 및 탈조절된 panBCD 오페론을 갖는 미생물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 panB, panC, panD, panE, ilvB, ilvN, alsS, ilvC 및(또는) ilvD 핵산 분자, 및 그러한 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 그러한 핵산 분자에 의해 코딩되는 유전자 산물에 관한 것이다.
본 발명의 방법은, 예를 들어 적어도 하나의 판토테네이트 생합성 효소를 과다발현하는 것 이외에, 제2 판토테네이트 생합성 효소를 결실시키거나 돌연변이화시키는 것을 더 포함하는데, 여기서 상기 제2 판토테네이트 생합성 효소는 판토테네이트 생합성 경로에서 목적 산물의 하류에 작용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, panE 유전자 산물을 과다발현하는 것 이외에, panC를 돌연변이화시키면 판토에이트의 생산이 추가로 증진 또는 증가한다. 따라서 한 실시양태에서, 본 발명은 panE 유전자 산물을 과다발현하며 panC 유전자가 결실된 미생물을 배양하는 것을 포함하는 판토에이트의 생산 방법에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 panE 유전자 산물 및(또는) panB 유전자 산물을 과다발현하며 panC 유전자가 결실된 미생물을 배양하는 것을 포함하는 판토에이트의 생산 방법에 관한 것이다. 다른 예시적 실시양태로는, panB 유전자 산물을 과다발현하며 panE 유전자가 결실된 미생물의 배양을 포함하는 케토판토에이트의 생산 방법, 및 panD 유전자 산물을 과다발현하며 panC 유전자가 결실된 미생물의 배양을 포함하는 β-알라닌의 생산 방법이 포함된다. 또한, 1종 이상의 판토테네이트 생합성 효소가 결실된 미생물에서 1종 이상의 발린 생합성 효소를 과다발현하는 것을 포함하는 판토-화합물의 생산 방법도 포함된다.
또한, 본 발명은 부분적으로는 기존에 미확인된 미생물의 판토테네이트 키나아제 유전자인 coaX의 확인 및 특성화를 토대로 완성된 것이다. coaX는 바실러스 서브틸리스에서 처음으로 확인된 것으로, ftsH 유전자를 포함하는 염색체 DNA 일부, 및 yacB, yacC, yacD, cysK 및 pabB 유전자 전부의 오픈 리딩 프레임에 상응한다. 본 발명은 yacB 오픈 리딩 프레임이 신규 판토테네이트 키나아제 활성을 코딩함을 입증하였는데, 상기 유전자는 기존에 알려진 판토테네이트 키나아제 유전자중 어느 것에도 상동성이 없다. 이 유전자는 판토테네이트에서 CoaA로의 경로에서 제1 단계를 촉매하기 때문에 coaX라 재명명하였다.
따라서, 본 발명은 판토테네이트를 생산하는 신규 및 개선된 방법에 관한 것이며, 또한 변형된 판토테네이트 키나아제 활성을 지닌 미생물을 이용하는 판토테네이트 생합성 경로의 다른 중요한 화합물 (예를 들어, 판토-화합물)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 coaX 유전자를 함유하거나, 또는 판토테네이트 키나아제 활성이 감소된 돌연변이체 coaX 유전자를 함유하는 재조합 미생물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로를 추가로 갖는 그러한 재조합 미생물에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 경로를 추가로 갖는 그러한 재조합 미생물에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 미생물은 바실러스속 (예를 들어, 비. 서브틸리스)에 속한다.
또한, 본 발명은 coaA 유전자를 함유하거나, 또는 판토테네이트 키나아제 활성이 감소된 coaX 유전자나 그의 돌연변이체를 임의로 포함할 수 있는 돌연변이체 coaA 유전자를 함유하는 재조합 미생물 (예를 들어, 바실러스속에 속하는 미생물; 예, 비. 서브틸리스)에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 추가로 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로를 갖거나 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 경로를 갖는 그러한 재조합 미생물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 단리된 coaX 또는 coaA 유전자뿐 아니라 돌연변이체 coaX 및(또는) coaA 유전자를 함유하는 벡터에 관한 것이다. 단리된 CoaX 단백질 및 돌연변이체 CoaX 단백질 이외에, 단리된 coaX 유전자 또는 돌연변이체 coaX 유전자를 함유하는 단리된 핵산 분자도 본 발명의 특징이다.
상기 기재된 핵산, 벡터 및 재조합 미생물은 본 발명의 방법에 특히 유용하다. 특히, 본 발명은 판토-화합물의 생산이 증진되는 조건하에서 돌연변이체 coaX 유전자를 갖는 재조합 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 판토-화합물의 생산 (예를 들어, 케토판토에이트, 판토에이트 및(또는) 판토테네이트 생산)을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 재조합 미생물은 돌연변이체 coaA 유전자를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 재조합 미생물은 돌연변이체 avtA 및(또는) 돌연변이체 ilv 유전자 및(또는) 돌연변이체 ansB 유전자 및(또는) 돌연변이체 alsD 유전자를 추가로 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 미생물 및 정제된 CoaX 단백질을 이용하여 판토테네이트 조절 물질을 찾아내는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구의 범위에서 명백해질 것이다.
도 1은 판토테네이트 생합성 경로의 개략도이다.
도 2는 균주 PA221에서 통합된 형태와 동등한, 상류에 연결된 P26panBCD 카세트를 함유하는 플라스미드 pAN240의 개략도이다.
도 3A는 P26및 RBS1에서 발현된 panBCD 오페론을 함유하는 플라스미드pAN004의 개략도이다.
도 3B는 P26및 RBS2에서 발현된 panBCD 오페론을 함유하는 플라스미드 pAN006의 개략도이다.
도 4는 통합 및 증폭 가능한 P26-RBS2-panE1 발현 카세트를 함유하는 플라스미드 pAN236의 개략도이다.
도 5는 플라스미드 pAN423 작제물의 개략도이다.
도 6은 플라스미드 pAN426 및 pAN427 작제물의 개략도이다.
도 7은 플라스미드 pAN428 및 pAN429 작제물의 개략도이다.
도 8은 플라스미드 pAN431 작제물의 개략도이다.
도 9는 플라스미드 pAN441 작제물의 개략도이다.
도 10은 플라스미드 pAN440 작제물의 개략도이다.
도 11은 단일 카피의 P26-panE1 카세트가 이중 교차에 의해 panE1 좌위에 통합되도록 디자인된 플라스미드 pAN251의 개략도이다.
도 12는 단일 카피의 P26-ilvBNC 카세트가 amyE 좌위에 통합되도록 디자인된 플라스미드 pAN267의 개략도이다.
도 13은 낮은 카피수 벡터 중의 바실러스 서브틸리스 ilvD 클론인 플라스미드 pAN257의 개략도이다.
도 14는 단일 카피의 P26-ilvD 카세트가 ilvD 좌위에 통합되도록 디자인된 플라스미드 pAN263의 개략도이다.
도 15는 바실러스 서브틸리스의 ilvD 유전자가 cat 유전자로 손상되도록 디자인된 플라스미드 pAN261의 개략도이다.
도 16은 이. 콜라이에서의 조효소 A 생합성 경로를 나타내는 개략도이다.
도 17은 비. 서브틸리스 coaA 유전자의 대부분이 결실되고 클로람페니콜 내성 유전자로 치환되도록 디자인된 플라스미드 pAN296의 개략도이다.
도 18은 coaA 유전자 영역에서 바실러스 서브틸리스 게놈의 구조를 나타내는 개략도이다. 눈금은 염기쌍을 나타내고, 중요한 오픈 리딩 프레임은 화살표로 표시하였다.
도 19는 bpr 좌위에 통합된 후에 바실러스 서브틸리스의 coaA를 발현하는 플라스미드 pAN281의 개략도이다.
도 20A 및 20B는 6가지 공지의 또는 예상된 미생물 coaA 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열들의 다중 서열 정렬 (MSA)을 도시한 것이다. 서열 4 내지 6 및 1 내지 3은 각각 미코박테레움 레프라 (Mycobacterium leprae)(스위스프롯 (상표명) 허가번호 Q9X795), 미코박테리움 투베르쿨로시스 (스위스프롯 (상표명) 허가번호 O53440), 스트렙토마이세스 코엘리칼라 (Streptomyces coelicolor)(스위스프롯 (상표명) 허가번호 O86799), 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae)(스위스프롯 (상표명) 허가번호 P44793), 에셰리키아 콜라이 (스위스프롯 (상표명) 허가번호 P15044) 및 바실러스 서브틸리스 (스위스프롯 (상표명) 허가번호 P54556)의 아미노산 서열들에 상응한다. 정렬은 인스티튜트 포 케미컬 리서치 (Institutefor Chemical Research, Kyoto University)의 GenomeNet CLUSTALW 서버에서 ClustalW MSA 소프트웨어를 이용하여 생성하였다. 하기 파라미터를 사용하였다: Pairwise Alignment, K-tuple (word) size = 1, Window size = 5, Gap Penalty = 3, Number of Top Diagonals = 5, Scoring Method = Percent; Multiple Alignment, Gap Open Penalty = 10, Gap Extension Penalty = 0.0, Weight Transition = No, Hydrophilic residues = Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg 및 Lys, Hydrophobic Gaps = Yes; 및 Scoring Matrix = BLOSUM.
도 21은 coaX (yacB) 유전자 영역에서 바실러스 서브틸리스 게놈의 구조를 나타내는 개략도이다. 눈금은 염기쌍을 나타내고, 중요한 오픈 리딩 프레임은 화살표로 표시하였으며, 특정한 제한효소 단편을 두꺼운 막대로 표시하였다.
도 22는 비. 서브틸리스 yacB (본원에서 coaX로 재명명함) 클론의 2가지 독립적인 PCR-유래의 클론인 pAN341과 pAN342의 구조를 나타내는 개략도이다.
도 23A 내지 23D는 14가지 공지의 또는 예상된 미생물 coaX 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열들의 다중 서열 정렬 (MSA)을 도시한 것이다. 서열 9, 74, 7-8, 75, 11, 10 및 12-18은 각각 바실러스 서브틸리스 (스위스프롯 (상표명) 허가번호 P37564), 클로스트리듐 아세토불리티쿰 (Clostridium acetobulyticum)(WIT (상표명) 허가번호 RCA03301, Argonne National Laboratories), 스트렙토마아세스 코엘리칼라 (PIR (상표명) 허가번호 T36391), 미코박테리움 투베르쿨로시스 (스위스프롯 (상표명) 허가번호 O06282), 로도박터 캅슐라투스 (Rhodobacter capsulatus)(WIT (상표명) 허가번호 RRC02473), 데술포비브리오 불가리스(Desulfovibrio vulgaris)(DBJ (상표명) 허가번호 BAA21476.1), 데이노코커스 라디오두란스 (Deinococcus radiodurans)(스위스프롯 (상표명) 허가번호 Q9RX54), 써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima)(진뱅크 (상표명) 허가번호 AAD35964.1), 트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum)(스위스프롯 (상표명) 허가번호 O83446), 보렐리아 불그도르페리 (Borrelia burgdorferi)(스위스프롯 (상표명) 허가번호O51477), 아퀴펙스 아에올리쿠스 (Aquifex aeolicus)(스위스프롯 (상표명) 허가번호 O67753), 시네코시스티스 종 (Synechocystis sp.)(스위스프롯 (상표명) 허가번호 P74045), 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori)(스위스프롯 (상표명) 허가번호 O25533) 및 보르데텔라 페르투시스 (Bordetella pertussis)(스위스프롯 (상표명) 허가번호 Q45338)의 아미노산 서열들에 상응한다. 정렬은 인스티튜트 포 케미컬 리서치의 GenomeNet CLUSTALW 서버에서 ClustalW MSA 소프트웨어를 이용하여 생성하였다. 하기 파라미터를 사용하였다: Pairwise Alignment, K-tuple (word) size = 1, Window size = 5, Gap Penalty = 3, Number of Top Diagonals = 5, Scoring Method = Percent; Multiple Alignment, Gap Open Penalty = 10, Gap Extension Penalty = 0.0, Weight Transition = No, Hydrophilic residues = Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg 및 Lys, Hydrophobic Gaps = Yes; 및 Scoring Matrix = BLOSUM.
도 24는 바실러스 서브틸리스, 에셰리키아 콜라이, 헤모필루스 인플루엔자, 미코박테리움 레프라, 미토박테리움 투베르쿨로시스 및 스트렙토마이세스 코엘리칼라로부터의 coaA 유전자 산물의 단백질 서열 일부에 대한 다중 서열 정렬을 도시한다. 이. 콜라이 coaA15(Ts) 및 비. 서브틸리스 coaA282A에서 돌연변이화된 잔기들을 각각 정렬된 부분의 위와 아래에 표시하였다. 이 부분들은 각각 서열 3의 168-187, 서열 2의 167-186, 서열 1이 165-184, 서열 4의 169-188, 서열 5의 169-188 및 서열 6의 179-198에 상응한다.
도 25는 천연 좌위에서 돌연변이화된 비. 서브틸리스 coaA를 통합시키기 위한 플라스미드 pAN294의 개략도이다.
도 26은 비. 서브틸리스의 염색체 좌위로부터 coaX를 결실시키고, 이를 카나마이신 내성 유전자로 대체하도록 디자인된 플라스미드 pAN336의 구조를 나타내는 개략도이다.
본 발명은 판토테네이트를 생산하는 신규 및 개선된 방법에 관한 것이며, 또한 판토테네이트 생합성 경로가 판토테네이트 또는 다른 판토-화합물을 생산하도록 조작된 미생물을 이용하는 판토테네이트 생합성 경로의 다른 중요한 화합물 (이하, "판토-화합물"이라 언급하며, 예를 들면 판토테네이트, 케토판토에이트, 판토에니트 및 β-알라닌이 있음)에 관한 것이다.
본 발명의 상기 신규 및 개선된 방법은, 판토테네이트 또는 다른 목적 판토-화합물이 생산 (예를 들어, 증가된 수준으로 생산)되도록 조작된 판토테네이트 생합성 경로의 효소 1종 이상을 갖는 미생물에서 판토-화합물 (예를 들어, 판토테네이트)을 생산하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 판토테네이트 또는 다른 목적 판토-화합물이 생산되도록 조작된 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제, 케토판토에이트 리덕타제, 판토테네이트 신테타제 또는 아스파테이트-α-데카르복실라제 중 하나 이상을 갖는 미생물에서 판토-화합물 (예를 들어, 판토테네이트)을 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 방법은 판토테네이트 또는 다른 목적 판토-화합물이 생산되도록 조작된 본원 기재의 발린-이소루이신 생합성 효소 1종 이상을 갖는 미생물에서 판토-화합물 (예를 들어, 판토테네이트)을 생산하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 판토테네이트 또는 다른 목적 판토-화합물이 생산되도록 조작된 아세토히드록시산 신테타제, 아세토히드록시산 이소메로리덕타제 또는 디히드록시산 데히드라타제 중 하나 이상을 갖는 미생물에서 판토-화합물 (예를 들어, 판토테네이트)을 생산하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 판토-화합물이 생산되는 조건하에서 케토판토에이트 리덕타제-과다발현 (KPAR-O) 미생물을 배양하는 것을 포함하는 판토-화합물의 생산 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 판토테네이트가 생산되는 조건하에서 아스파테이트-α-데카르복실라제-과다발현 (AαD-O) 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 전구체 공급에 독립적인 방식으로 판토-화합물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 β-알라닌에 독립적으로 고수율로 판토테네이트를 생산하는 방법, 및 β-알라닌을 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 판토테네이트 키나아제 돌연변이체를 배양하는 것을 포함하는 판토-화합물을 증진된 양으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 판토테네이트를 생산하는 신규 및 개선된 방법에 관한 것이며, 또한 변형된 판토테네이트 키나아제 활성을 지닌 미생물, 예를 들어 coaX 유전자를 포함하는 미생물이나 판토테네이트 키나아제 활성이 감소된 돌연변이체 coaX 유전자를 포함하는 미생물을 이용하는, 판토테네이트 생합성 경로의 중요한 화합물 (예를 들어, 판토-화합물)에 관한 것이다.
본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위해서는 본원에서 특정 용어를 먼저 정의해야 한다.
"판토테네이트 생합성 경로"라는 용어는 판토테네이트 생합성 효소 (예를 들어, 생합성 효소-코딩 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드), 화합물 (예를 들어, 전구체, 기질, 중간체 또는 생성물) 및 보조인자 등을 포함하는, 판토테네이트의 형성 또는 합성에 이용되는 생합성 경로를 포함한다. "판토테네이트 생합성 경로"라는 용어는 미생물에서 (예를 들어, 생체내에서) 판토테네이트를 합성하는 생합성 경로뿐 아니라, 시험관내에서 판토테네이트를 합성하는 생합성 경로도 포함한다. 도 1은 판토테네이트 생합성 경로의 개략도를 포함한다. 판토테네이트 생합성 효소는 두꺼운 글씨로 표시되어 있고, 상응하는 유전자는 이탤릭체로 표시되어 있다.
"판토테네이트 생합성 효소"라는 용어는 판토테네이트 생합성 경로의 화합물 (예를 들어, 중간체 또는 생성물)의 형성에 이용되는 모든 효소를 포함한다. 도 1에 따라, α-케토이소발레레이트 (α-KIV)로부터 판토에이트의 합성은 중간체인 케토판토에이트를 통해 진행된다. 케토판토에이트의 형성은 판토테네이트 생합성 효소인 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제 (panB 유전자의 산물)에 의해 촉매된다. 판토에이트의 형성은 판토테네이트 생합성 효소인 케토판토에이트 리덕타제 (panE 유전자의 산물)에 의해 촉매된다. 아스파테이트로부터 β-알라닌의 합성은 판토테네이트 생합성 효소인 아스파테이트-α-데카르복실라제 (panD 유전자의산물)에 의해 촉매된다. 판토에이트 및 β-알라닌으로부터 판토테네이트의 형성 (예를 들어, 축합)은 판토테네이트 생합성 효소인 판토테네이트 신테타제 (panC 유전자의 산물)에 의해 촉매된다.
"이소루이신-발린 생합성 경로"라는 용어는 이소루이신-발린 생합성 효소 (예를 들어, 생합성 효소-코딩 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드), 화합물 (예를 들어, 전구체, 기질, 중간체 또는 생성물) 및 보조인자 등을 포함하는, 피루베이트를 발린 또는 이소루이신으로 전환하여 이들 생성물을 형성하거나 합성하는 데 이용되는 생합성 경로를 포함한다. "이소루이신-발린 생합성 경로"라는 용어는 미생물에서 (예를 들어, 생체내에서) 발린 또는 이소루이신을 합성하는 생합성 경로뿐 아니라, 시험관내에서 발린 또는 이소루이신을 합성하는 생합성 경로도 포함한다. 도 1은 이소루이신-발린 생합성 경로의 개략도를 포함한다. 이소루이신-발린 생합성 효소는 두꺼운 이탤릭체로 표시되어 있고, 상응하는 유전자는 이탤릭체로 표시되어 있다.
"이소루이신-발린 생합성 효소"라는 용어는 이소루이신-발린 생합성 경로의 화합물 (예를 들어, 중간체 또는 생성물)의 형성에 이용되는 모든 효소를 포함한다. 도 1에 따라, 피루베이트로부터 발린의 합성은 중간체인 아세토락테이트, α,β-디히드록시이소발레레이트 (α,β-DHIV) 및 α-케토이소발레레이트 (α-KIV)를 통해 진행된다. 피루베이트로부터 아세토락테이트의 형성은 이소루이신-발린 생합성 효소인 아세토히드록시산 신테타제 (ilvBN 유전자의 산물, 또는 alsS 유전자의 산물)에 의해 촉매된다. 아세토락테이트로부터 α,β-DHIV의 형성은 이소루이신-발린 생합성 효소인 아세토히드록시산이소메로 리덕타제 (ilvC 유전자의 산물)에 의해 촉매된다. α,β-DHIV로부터 α-KIV의 합성은 이소루이신-발린 생합성 효소인 디히드록시산 데히드라타제 (ilvD 유전자의 산물)에 의해 촉매된다. 더욱이, 발린 및 이소루이신은 분지쇄 아미노산 트랜스아미나제에 의해 상호전환될 수 있다.
본원에 사용되는 케토판토에이트, 판토에이트, β-알라닌 및 판토테네이트는 "판토-화합물"이다. "판토-화합물"이란 용어는 특정 판토테네이트 생합성 효소의 하류에 있는 판토테네이트 생합성 경로에서의 화합물 (예를 들어, 기질, 중간체 및 생성물)을 포함한다. 한 예로써, 판토-화합물은 판토테네이트 생합성 효소인 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제 (panB 유전자의 산물)의 하류에 있는 것이며, 여기에는 케토판토에이트, 판토에이트 및(또는) 판토테네이트가 포함될 수 있다. 다른 예로써, 판토-화합물은 판토테네이트 생합성 효소인 케토판토에이트 리덕타제 (panE 유전자의 산물)의 하류에 있는 것이며, 여기에는 판토에이트 및(또는) 판토테네이트가 포함될 수 있다. 또다른 예로써, 판토-화합물은 판토테네이트 생합성 효소인 판토테네이트 신테타제 (panC 유전자의 산물)의 하류에 있는 것이며, 여기에는 판토테네이트가 포함될 수 있다. 또다른 예로써, 판토-화합물은 판토테네이트 생합성 효소인 아스파테이트-α-데카르복실라제 (panD 유전자의 산물)의 하류에 있는 것이며, 여기에는 β-알라닌 및(또는) 판토테네이트가 포함될 수 있다.
바람직한 판토-화합물로는 판토테네이트 및 판토에이트가 포함된다. "판토테네이트"라는 용어는 "판토텐산"이라고도 불리는 판토테네이트의 유리산 형태를 포함하며, "판토테네이트 염"이라고도 불리는 그의 임의의 염 (예를 들어, 판토테네이트 또는 판토텐산의 산성 수소를 칼슘, 나트륨, 칼륨 또는 암모늄과 같은 양이온으로 대체함으로써 유도됨)도 포함한다. "판토-화합물"이란 용어는 판토테네이트의 알콜 유도체들도 포함한다. 바람직한 판토테네이트 염으로는 칼슘 판토테네이트 또는 나트륨 판토테네이트가 있다. 바람직한 알콜 유도체로는 판토텐올이 있다. 본 발명의 판토테네이트 염 및(또는) 알콜은 본원에 기재된 유리산으로부터 통상적인 방법을 통해 제조할 수 있다. 다른 실시양태에서, 칼슘 판토테네이트는 본 발명의 미생물에 의해 직접 합성될 수 있다. 본 발명의 판토테네이트 염은 통상적인 방법에 의해 유사하게 판토테네이트 또는 판토텐산의 유리산 형태로 전환될 수 있다.
"판토에이트"라는 용어는 "판토산"이라고도 불리는 판토에이트의 유리산 형태를 포함하며, "판토에이트 염"이라고도 불리는 그의 임의의 염 (예를 들어, 판토에이트 또는 판토산의 산성 수소를 칼슘, 나트륨, 칼륨 또는 암모늄과 같은 양이온으로 대체함으로써 유도됨)도 포함한다. 바람직한 판토에이트 염으로는 칼슘 판토에이트 또는 나트륨 판토에이트가 있다. 본 발명의 판토에이트 염에는 본원에 기재된 유리산으로부터 통상적인 방법을 통해 제조된 염들이 포함된다. 본 발명의 판토에이트 염은 통상적인 방법에 의해 유사하게 판토에이트 또는 판토산의 유리산 형태로 전환될 수 있다. 더욱이, 판토에이트 또는 판토산의 유리산 형태는 통상적인 방법에 의해 판토락톤으로 전환될 수 있다.
"CoA 생합성 경로"라는 용어는 CoA 생합성 효소 (예를 들어, 생합성 효소-코딩 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드), 화합물 (예를 들어, 전구체, 기질, 중간체 또는 생성물) 및 보조인자 등을 포함하는, 판토테네이트로부터 CoA의 형성 또는 합성에 이용되는 생합성 경로를 포함한다. 이. 콜라이에서의 CoA 생합성 경로에 대한 개략도가 도 16에 도시되어 있다 (또한, 이 경로는 다른 미생물에 의해 이용될 수 있는 것으로 가정할 수 있다). "CoA 생합성 경로"라는 용어는 미생물에서 (예를 들어, 생체내에서) CoA를 합성하는 생합성 경로뿐 아니라, 시험관내에서 CoA를 합성하는 생합성 경로도 포함한다. "조효소 A 또는 CoA 생합성 효소"라는 용어는 CoA 생합성 경로의 화합물 (예를 들어, 중간체 또는 생성물)의 형성에 이용되는 모든 효소를 포함하는 것으로, 예를 들면 판토테네이트를 인산화시켜 4'-포스포판토테네이트를 형성하는 단계를 촉매하는 coaA, panK 또는 coaX 유전자의 산물, 또는 4'-포스포판토테네이트를 데포스포조효소 A로 전환시키는 단계를 촉매하는 coaD 유전자의 산물이 있다.
I. 재조합 미생물 및 판토-화합물이 생산되도록 미생물을 배양하는 방법
본 발명의 방법은 미생물, 예를 들어 재조합 미생물, 바람직하게는 본원에 기재된 벡터 또는 유전자 (예를 들어, 야생형 및(또는) 돌연변이 유전자)를 포함하고(하거나) 목적 화합물 (예를 들어, 판토-화합물 또는 판토-화합물들)의 생산을 초래하는 방식으로 배양된 재조합 미생물에 특징이 있다. "재조합" 미생물이란 용어는 유전자적으로 변화, 변형 또는 조작되어 (예를 들어, 유전공학적으로 조작되어) 이것이 유래한 자연발생의 미생물에 비해 변화된, 변형된 또는 상이한 유전자형 및(또는) 표현형 (예를 들어, 유전자의 변형이 미생물의 코딩 핵산 서열에 영향을 미치는 경우)을 나타내는 미생물 (예를 들어, 박테리아, 사카로마이세스 세레비지아 (Saccharomyces cerevisiae) 세포, 진균류 세포 등)을 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 "재조합" 미생물은 유전자 조작되어 본원에 기재된 1종 이상의 박테리아 유전자 또는 유전자 산물 (예를 들어, 판토테네이트 또는 이소루이신-발린 생합성 효소를 코딩하는 유전자), 바람직하게는 본원에 기재된 재조합 벡터를 포함하는 생합성 효소-코딩 유전자 및(또는) 재조합 벡터로부터 발현된 생합성 효소을 과다발현하는 것이다. 당업자는 유전자 산물을 발현 또는 과다발현하는 미생물이 유전자 산물을 코딩하는 핵산 서열들 및(또는) 유전자들의 발현 또는 과다발현의 결과로 유전자 산물이 생산 또는 과다생산됨을 이해할 것이다.
"조작된 미생물"이란 용어는 1종 이상의 판토테네이트 생합성 경로의 효소 및(또는) 1종 이상의 이소루이신-발린 생합성 경로의 효소가 변형됨으로써 판토테네이트 또는 다른 목적 판토-화합물이 생산되도록 조작된 (예를 들어, 유전공학적으로 조작된) 미생물을 포함한다. 그러한 미생물의 변형 또는 조작은, 생합성 경로의 탈조절 및(또는) 1종 이상의 생합성 효소의 과다발현을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 수행할 수 있다. "조작된" 효소 (예를 들어, "조작된" 생합성 효소)는, 그 효소의 발현 또는 생산이 변하거나 변형됨으로써, 예를 들어 상응하는 야생형 또는 자연발생의 효소에 비해 이전 또는 이후의 전구체, 기질 또는 효소 산물 중 하나 이상이 변화되거나 변형된 것이 포함된다.
"과다발현된" 또는 "과다발현"이란 용어는 유전자 산물 (예를 들어, 판토테네이트 생합성 효소 또는 이소루이신-발린 생합성 효소)이 미생물의 조작 전에 발현된 양에 비해, 또는 조작되는 않은 동등한 미생물에서 발현되는 양에 비해 더 많이 발현되는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 미생물은 유전자적으로 조작되어 (예를 들어, 유전공학적으로 조작되어) 미생물의 조작 전에 발현된 양에 비해, 또는 조작되는 않은 동등한 미생물에서 발현되는 양에 비해 더 많은 양의 유전자 산물을 과다발현할 수 있다. 유전자 조작에는 특정 유전자의 발현과 관련된 조절 서열 또는 부위를 변화 또는 변형시키는 것 (예를 들어, 강력한 프로모터, 유도가능 프로모터 또는 다중 프로모터의 첨가, 또는 발현이 구성적으로 이루어지도록 하는 조절 서열의 제거), 특정 유전자의 염색체 위치를 변형시키는 것, 리보솜 결합 부위 또는 전사 터미네이터와 같이 특정 유전자에 인접한 핵산 서열을 변화시키는 것, 특정 유전자의 카피수를 증가시키는 것, 특정 유전자의 전사 및(또는) 특정 유전자 산물의 번역에 관여하는 단백질 (예를 들어, 조절 단백질, 서프레서, 인핸서, 전사 활성화 인자 등)을 변형시키는 것, 또는 특정 유전자의 발현을 탈조절하는 당업계에 흔한 통상적인 임의의 수단 (예를 들어, 레프레서 단백질의 발현을 차단하기 위해 안티센스 핵산 분자를 이용하는 것이 포함되나, 이제 제한되지는 않음)이 포함된다.
다른 실시양태에서, 미생물은 물리적으로 또는 환경적으로 조작되어 미생물의 조작 전에 발현된 양에 비해, 또는 조작되는 않은 동등한 미생물에서 발현되는 양에 비해 더 많은 양의 유전자 산물을 과다발현할 수 있다. 예를 들어, 미생물을특정 유전자의 전사 및(또는) 특정 유전자 산물의 번역을 증가시키는 것으로 알려진 또는 예상되는 시약으로 처리하거나 상기 시약의 존재하에 배양하여 전사 및(또는) 번역을 증진 또는 증가시킬 수 있다. 별법으로, 미생물을 특정 유전자의 전사 및(또는) 특정 유전자 산물의 번역을 증가시키도록 선택된 온도에서 배양하여 전사 및(또는) 번역을 증진 또는 증가시킬 수 있다.
"탈조절된" 또는 "탈조절"이란 용어는 미생물에서 생합성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 1종 이상의 유전자를 변화 또는 변형시킴으로써, 미생물에서의 생합성량 또는 활성이 변화 또는 변형되도록 하는 것을 포함한다. 바람직하게는 생합성 경로의 효소를 코딩하는 1종 이상의 유전자가 변화 또는 변형되어 유전자 산물이 증진 또는 증가된다. 또한, "탈조절된 경로"라는 어구는 생합성 경로에서 효소를 코딩하는 1종 이상의 유전자가 변화 또는 변형되어 생합성 효소 1종 이상의 양 또는 활성이 변화 또는 변형된 것을 포함한다. 미생물에서 경로를 "탈조절"시키는 능력 (예를 들어, 주어진 생합성 경로에서 하나 이상의 유전자를 동시에 탈조절시킴)은, 하나 이상의 효소 (예를 들어, 2 또는 3개의 생합성 효소)가 "오페론"이라 불리는 유전자 물질의 연속된 조각 위에서 서로 인접하게 나타나는 유전자에 의해 코딩되는 미생물의 특정 현상으로부터 발생한다.
"오페론"이란 용어는 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상의 구조 유전자 (예를 들어, 생합성 효소와 같은 효소를 코딩하는 유전자)와 관련된 프로모터 및, 가능하게는 조절 성분을 함유하는 유전자 발현의 조화로운 단위를 포함한다. 구조 유전자의 발현은 조화롭게 조절, 예를 들어 조절 단백질이 조절 성분에 결합하거나전사의 종결을 방지함으로써 조절될 수 있다. 구조 유전자는 전사되어 모든 구조적 단백질들을 코딩하는 단일 mRNA가 만들어질 수 있다. 오페론에 포함된 유전자들의 조화로운 조절로 인하여, 단일 프로모터 및(또는) 조절 성분의 변화 또는 변형은 오페론에 의해 코딩되는 각 유전자 산물의 변화 또는 변형을 초래할 수 있다. 조절 성분의 변화 또는 변형은 내생성 프로모터 및(또는) 조절 성분(들)의 제거, 강력한 프로모터, 유도가능 프로모터 또는 다중 프로모터의 첨가 또는 유전자 산물의 발현이 변형되도록 조절 서열의 제거, 오페론의 염색체 위치 변형, 리보솜 결합 부위와 같이 오페론에 인접하거나 오페론 내에 있는 핵산 서열들의 변화, 오페론의 카피수 증가, 오페론의 전사 및(또는) 오페론 유전자 산물의 번역에 관여하는 단백질들 (예를 들어, 조절 단백질, 서프레서, 인핸서 및 전사 활성화 인자 등)의 변형, 또는 당업계에 흔한 유전자 발현의 탈조절을 위한 임의의 다른 통상적인 수단 (예를 들어, 레프레서 단백질의 발현 차단을 위한 안티센스 핵산 분자의 사용을 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 탈조절은 피드백 내성을 나타내거나 또는 더 높거나 더 낮은 특정 활성을 갖는 효소등을 수득하기 위해 유전자 1종 이상의 코딩 영역을 변화시키는 것을 포함한다.
특히 바람직한 본 발명의 "재조합" 미생물은 유전자 조작되어 박테리아-유래 유전자 또는 유전자 산물을 과다발현하는 것이다. "박테리아-유래" 또는 예를 들어 박테리아 "유래의"란 용어는 박테리아에서 자연적으로 발견되는 유전자 또는 박테리아의 유전자에 의해 코딩 (예를 들어, panB, panE, panC, panD, ilvB, ilvN, alsS, ilvC 또는 ilvD에 의해 코딩)되는 유전자 산물 (예를 들어, 케토판토에이트히드록시메틸트랜스퍼라제, 케토판토에이트 리덕타제, 판토테네이트 신테타제, 아스파테이트-α-데카르복실레이트 아세토히드록시산 신테타제, 아세토히드록시산 이소메로리덕타제 또는 디히드록시산 데히드라타제)을 포함한다.
본 발명의 방법은 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제, 케토판토에이트 리덕타제, 판토테네이트 신테타제 또는 아스파테이트-α-데카르복실라제 중 하나 이상을 과다발현하는 재조합 미생물에 특징이 있다. 특히 바람직한 본 발명의 재조합 미생물은 유전공학적으로 조작되어 바실러스 (예를 들어, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 바실러스 할로두란스, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 푸밀루스 등) 생합성 효소를 과다발현한다 [예를 들어, 비. 서브틸리스 케토판토에이트 리덕타제 (panE 유전자의 산물)(예를 들어, 서열 30의 아미노산 서열을 갖거나 서열 29의 핵산 서열에 의해 코딩되는 케토판토에이트 리덕타제), 비. 서브틸리스 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제 (panB 유전자의 산물)(예를 들어, 서열 24의 아미노산 서열을 갖거나 서열 23의 핵산 서열에 의해 코딩되는 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제), 비. 서브틸리스 판토테네이트 신테타제 (panC 유전자의 산물)(예를 들어, 서열 26의 아미노산 서열을 갖거나 서열 25의 핵산 서열에 의해 코딩되는 판토테네이트 신테타제), 및(또는) 비. 서브틸리스 아스파테이트-α-데카르복실라제 (panD 유전자의 산물)(예를 들어, 서열 28의 아미노산 서열을 갖거나 서열 27의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아스파테이트-α-데카르복실라제) 중 하나 이상을 과다발현하도록 유전공학적으로 조작됨].
예시적 실시양태에서, 본 발명은 panE 핵산 서열 (예를 들어, 서열 29에 기재된 panE 핵산 서열)을 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물 (예를 들어, KPAR-O 미생물)에 특징이 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 panB 핵산 서열 (예를 들어, 서열 23에 기재된 panB 핵산 서열)을 포함하는 벡터, panC 핵산 서열 (예를 들어, 서열 25에 기재된 panC 핵산 서열)을 포함하는 벡터 또는 panD 핵산 서열 (예를 들어, 서열 27에 기재된 panD 핵산 서열)을 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물 (예를 들어, KPAR-O 미생물)에 특징이 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 탈조절된 panBCD 오페론 (예를 들어, 서열 59)을 갖는 미생물에 특징이 있다.
다른 바람직한 본 발명의 "재조합" 미생물은 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 경로를 갖는다. "탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 경로를 갖는 미생물"이란 어구는 이소루이신-발린 (ilv) 경로의 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자가 변화 또는 변형되거나, 또는 이소루이신-발린 (ilv) 경로의 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 오페론이 변화 또는 변형된 미생물을 포함한다. 바람직한 "탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 경로를 갖는 미생물"은 유전공학적으로 조작되어 바실러스 (예를 들어, 비. 서브틸리스) ilv 생합성 효소를 과다발현 [예를 들어, 아세토히드록시산 신테타제 (ilvBN 유전자의 산물 또는 alsS 유전자의 산물)(예를 들어, 서열 32 및 서열 34의 아미노산 서열의 서브유닛을 갖거나, 또는 서열 31 및 서열 33의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 58의 뉴클레오티드 1-2246에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩되는 아세토히드록시산 신테타제, 또는 서열 86의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩되는 아세토히드록시산 신테타제), 아세토히드록시산 이소메로리덕타제 (ilvC 유전자의 산물)(예를들어, 서열 36의 아미노산 서열을 갖거나 서열 35의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩되는 아세토히드록시산 이소메로리덕타제), 디히드록시산 데히드라타제 (ilvD 유전자의 산물)(예를 들어, 서열 38의 아미노산 서열을 갖거나 서열 37의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩되는 디히드록시산 데히드라타제) 중 하나 이상을 과다발현하도록 조작됨]하고(하거나) ilvBNC 핵산 서열 (서열 58, 뉴클레오티드 1-1725, 1722-2246 및 2263-3291의 코딩 영역) 및(또는) ilvD 핵산 서열 (서열 37)을 포함하는 벡터로 형질전환되어 있다.
다른 바람직한 실시양태에서, 재조합 미생물은 돌연변이체 CoaA 및(또는) CoaX 생합성 효소가 발현되어 1종 이상의 판토테네이트 생합성 효소 및(또는) 1종 이상의 이소루이신-발린 생합성 효소가 과다발현되거나 탈조절되도록 디자인 또는 조작된다.
다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 미생물은 박테리아 유래의 유전자 또는 생합성 효소 (예를 들어, CoA 생합성 효소, 판토테네이트 생합성 효소 또는 이소루이신-발린 생합성 효소)를 과다발현하거나, 또는 이것이 돌연변이화 된다. "박테리아-유래" 또는 예를 들어 박테리아 "유래의"란 용어는 박테리아 유전자에 의해 코딩 (예를 들어, panB, panE, panC, panD, ilvBN (또는 alsS), ilvC 또는 ilvD에 의해 코딩되거나, 또는 coaA 또는 coaX에 의해 코딩)되는 유전자 산물 (예를 들어, 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제, 케토판토에이트 리덕타제, 판토테네이트 신테타제, 아스파테이트-α-데카르복실레이트 아세토히드록시산 신테타제, 아세토히드록시산 이소메로리덕타제, 디히드록시산 데히드라타제 또는 판토테네이트 키나아제)을 포함한다.
또다른 바람직한 본 발명의 재조합 미생물은 돌연변이체 미생물이다. 본원에 사용되는 "돌연변이체 미생물"이란 용어는 유전공학적으로 조작되어 미생물에 의해 정상적으로 또는 자연적으로 발현되는 유전자 또는 단백질의 돌연변이 형태를 발현하는 재조합 미생물을 포함한다. 바람직하게, 돌연변이체 미생물은 돌연변이 유전자 또는 단백질을 발현하여, 이 미생물이 변화되거나 변형되거나 또는 상이한 표현형 (예를 들어, 돌연변이 판토테네이트 키나아제와 같은 돌연변이 CoaA 생합성 효소를 발현하도록 조작됨)을 나타낸다. 한 실시양태에서, 돌연변이체 미생물은 본원에 정의된 돌연변이체 coaX 유전자를 포함하도록 디자인 또는 조작된다. 다른 실시양태에서, 재조합 미생물은 본원에 정의된 돌연변이체 coaA 유전자를 포함하도록 디자인 또는 조작된다. 다른 실시양태에서, 돌연변이체 미생물은 coaX 유전자가 결실 (즉, coaX 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 생산되지 않음)되도록 디자인 또는 조작된다. 다른 실시양태에서, 돌연변이체 미생물은 coaA 유전자가 결실 (즉, coaA 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 생산되지 않음)되도록 디자인 또는 조작된다. 바람직하게는, 돌연변이체 미생물이 돌연변이체 coaX 유전자 또는 돌연변이체 coaA 유전자를 갖거나, 또는 coaX 유전자 및(또는) coaA 유전자가 결실되도록 조작하여, 돌연변이체 미생물이 "감소된 판토테네이트 키나아제 활성"을 코딩하도록 한다. 전체 미생물의 견지에서, "감소된 판토테네이트 키나아제 활성"은 CoA 생합성 경로의 중간체 또는 생성물의 감소에 대해 측정 또는 분석함으로써, 예를 들어 미생물 (미생물로부터 단리 또는 유래한 용균액) 또는 미생물이 배양된 배지(예를 들어, 도 16 참조)에서 4'-포스포판토테네이트, 4'-포스포판토테닐시스테인, 4'-포스포판테테인, 데포스포조효소 A, 조효소 A, 아포-아실 캐리어 단백질 (apo-ACP) 또는 홀로-아실 캐리어 단백질 (ACP)에 대해 측정 또는 분석함으로써 결정할 수 있다. 별법으로, "감소된 판토테네이트 키나아제 활성"은 미생물의 증식 감소에 대해 측정 또는 분석함으로써 결정할 수 있다. 별법으로, "감소된 판토테네이트 키나아제 활성"은, 제1 단계가 판토테네이트 키나아제에 의해 촉매되는 CoA 생합성 경로의 상류에 판토-화합물이 있기 때문에 미생물 또는 주변 배지에서 판토-화합물 (예를 들어, 판토테네이트)의 증가에 대해 측정 또는 분석함으로써 결정할 수 있다. 또한, 본 발명은 재조합 미생물이 감소된 판토테네이트 키나아제 활성 (예를 들어, 돌연변이체 coaA 및(또는) 돌연변이체 coaX 유전자를 발현) 이외에 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로 및(또는) 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 경로를 갖는다는 특징이 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 미생물은 그람 양성 생물체 (예를 들어, 미생물을 둘러싸는 그람-양성 벽의 존재로 인해 크리스탈 바이올렛과 같은 염기성 염료를 보유하는 미생물)이다. 바람직한 실시양태에서, 재조합 미생물은 바실러스, 코리네박테리움, 락토바실러스, 락토코커스 및 스트렙토마이세스로 이루어진 군으로부터 선택되는 속에 속하는 미생물이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 재조합 미생물은 바실러스속의 미생물이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 재조합 미생물은 바실러스 서브틸리스, 바실러스 렌티모르부스 (Bacillus lentimorbus), 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus), 바실러스 피르무스 (Bacillus firmus), 바실러스판토텐티쿠스 (Bacillus pantothenticus), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans), 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 푸밀루스, 바실러스 투링기엔시스 (Bacillus thuringiensis), 및 다른 그룹 1의 바실러스 종, 예를 들어 16S rRNA의 유형에 의해 특성화되는 것들 (문헌 [Priest (1993) inBacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteriaeds. Sonensheinet al., ASM, Washington, D.C., p. 6] 참조)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 재조합 미생물은 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 바실러스 할로두란스, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 푸밀루스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 재조합 미생물은 그람 음성 (염기성 염료를 배제함) 생물체이다. 바람직한 실시양태에서, 재조합 미생물은 살모넬라 (Salmonella), 에셰리키아 (Escherichia), 클레브시엘라 (Klebsiella), 세라티아 (Serratia) 및 프로테우스 (Proteus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속에 속하는 미생물이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 재조합 미생물은 에셰리키아속의 미생물이다. 훨씬 더 바람직한 실시양태에서, 재조합 미생물은 이. 콜라이이다. 또다른 실시양태에서, 재조합 미생물은 사카로마이세스 (예를 들어, 에스. 세레비지아 (S. cerevisiae))이다.
본 발명의 중요한 측면은 본원에 기재된 재조합 미생물을 목적 화합물 (예를 들어, 목적 판토-화합물)이 생산되도록 배양하는 것을 포함한다. "배양하는"이란용어는 살아있는 본 발명의 미생물을 유지 및(또는) 증식 (예를 들어, 배양액 또는 균주를 유지 및(또는) 증식)시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 미생물은 액체 배지에서 배양된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 미생물은 고체 배지 또는 반고체 배지에서 배양된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 미생물은 미생물의 유지 및(또는) 배양에 필수적이거나 유익한 양분 (예를 들어, 콩과 같은 복합 탄수화물, 곡물, 전분, 당, 당 알콜, 탄수화물, 오일, 지방, 지방산, 유기산 및 알콜과 같은 탄소원 또는 탄소 기질; 예를 들어, 낟알, 열매 및 괴경으로부터 유래한 식물성 단백질, 펩톤, 펩티드 및 아미노산, 고기, 우유 및 동물 부산물 (예를 들어, 펩톤, 고기 추출물 및 카제인 가수분해물) 등의 동물 공급원으로부터 유래한 단백질, 펩티드 및 아미노산과 같은 질소원; 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄 및 인산암모늄과 같은 무기 질소원; 인산, 및 그의 나트륨염 및 칼륨염과 같은 인 공급원; 마그네슘, 철, 망간, 칼슘, 구리, 아연, 붕소, 몰리브덴 및(또는) 코발트염과 같은 미량원소; 및 아미노산, 비타민 및 성장 촉진제 등과 같은 성장 인자)을 포함하는 배지 (예를 들어, 멸균된 액체 배지)에서 배양된다.
바람직하게는, 본 발명의 미생물은 제어된 pH하에서 배양된다. "제어된 pH"라는 용어는 목적 화합물 (예를 들어, 판토-화합물)의 생산을 초래하는 임의의 pH를 포함한다. 한 실시양태에서, 미생물은 약 7의 pH에서 배양된다. 다른 실시양태에서, 미생물은 6.0 내지 8.5 사이의 pH에서 배양된다. 원하는 pH는 당업계에 공지된 다수의 방법에 의해 유지될 수 있다.
또한 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 제어된 통기하에서 배양된다. "제어된 통기"란 용어는 목적 화합물 (예를 들어, 판토-화합물)의 생산을 초래할 수 있도록 공기 (예를 들어, 산소) 공급이 충분한 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 통기는 배양액 중의 산소량에 의해, 예를 들어 배양 배지에 용해된 산소의 양을 조절함으로써 제어한다. 바람직하게는, 배양액의 통기는 배양액의 교반에 의해 제어한다. 교반은 프로펠러 또는 유사한 기계적 교반 장치에 의해, 증식 용기 (예를 들어, 발효기)의 회전 또는 진탕에 의해, 또는 다양한 펌핑 장치에 의해 제공할 수 있다. 통기는 멸균된 공기 또는 산소를 배지를 통해 (예를 들어, 발효 혼합물을 통해) 통과시킴으로써 추가로 제어할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 과도한 거품생성이 없이 (예를 들어, 소포제의 첨가를 통해) 배양된다.
더욱이, 본 발명의 미생물은 제어된 온도하에서 배양할 수 있다. "제어된 온도"라는 용어는 목적 화합물 (예를 들어, 판토-화합물)의 생산을 초래하는 임의의 온도를 포함한다. 한 실시양태에서, 제어된 온도에는 15℃ 내지 95℃ 사이의 온도가 포함된다. 다른 실시양태에서, 제어된 온도에는 15℃ 내지 70℃ 사이의 온도가 포함된다. 바람직한 온도는 20℃ 내지 55℃이며, 보다 바람직하게는 30℃ 내지 45℃ 사이 또는 30℃ 내지 50℃ 사이이다.
미생물은 액체 배지에서 배양 (예를 들어, 유지 및(또는) 증식)될 수 있으며, 바람직하게는 정치 배양, 시험관 배양, 진탕 배양 (예를 들어, 회전 진탕 배양, 진탕 플라스크 배양 등), 통기 스피너 배양 또는 발효와 같은 통상적인 배양 방법에 의해 연속적으로 또는 단속적으로 배양된다. 바람직한 실시양태에서, 미생물은 진탕 플라스크에서 배양된다. 보다 바람직한 실시양태에서, 미생물은 발효기(예를 들어, 발효 공정)에서 배양된다. 본 발명의 발효 공정에는 회분식, 공급-회분식 및 연속식 발효 방법이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. "회분 공정" 또는 "회분 발효"라는 어구는 배지, 영양물질, 보충 첨가물 등이 발효의 시작 시점에서 설정되어 발효 중간에 변하지 않는 폐쇄 시스템을 의미하지만, 과도한 배지의 산화 및(또는) 미생물의 사멸 방지를 목적으로 pH 및 산소 농도와 같은 인자들을 제어하기 위한 시도가 수행될 수 있다. "공급-회분 공정" 또는 "공급-회분" 발효라는 용어는 발효가 진행됨에 따라 1종 이상의 기질 또는 보충물을 첨가 (예를 들어, 증량하여 또는 연속적으로 첨가)하는 것을 제외하고는 회분 발효와 동일한 것을 의미한다. "연속 공정" 또는 "연속 발효"라는 용어는 정해진 발효 배지를 연속적으로 발효기에 가하고, 동등한 양의 사용된 또는 "조건화된" 배지를, 바람직하게는 목적 화합물 (예를 들어, 판토-화합물)의 회수를 위해 동시에 분리해 내는 시스템을 의미한다. 위와 같은 다양한 공정들이 개발되어 당업계에 알려져 있다.
"목적 화합물 (예를 들어, 판토테네이트와 같은 판토-화합물)이 생산되는 조건하에서 배양하는"이란 어구는 목적 화합물을 생산하기에, 또는 원하는 수율의 특정 화합물을 얻기에 적당하거나 충분한 조건 (예를 들어, 온도, 압력, pH, 배양 시간 등)하에서 미생물을 유지 및(또는) 증식시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 배양은 원하는 양의 판토-화합물 (예를 들어, 판토테네이트, 판토에이트 또는 β-알라닌)을 생산하기에 충분한 시간동안 계속된다. 바람직하게는, 배양은 판토-화합물의 최대 생산량에 거의 도달하기에 충분한 시간동안 계속된다. 한 실시양태에서, 배양은 약 12 내지 24시간동안 계속된다. 다른 실시양태에서, 배양은 약 24내지 36시간동안, 36 내지 48시간동안, 48 내지 72시간동안, 72 내지 96시간동안, 96 내지 120시간동안, 120 내지 144시간동안, 또는 144시간이 넘게 계속된다. 다른 실시양태에서, 배양은 판토-화합물의 생산 수율이, 예를 들어 세포가 약 15 내지 20 g/ℓ 이상의 판토-화합물을 생산하기에, 약 20 내지 25 g/ℓ 이상의 판토-화합물을 생산하기에, 약 25 내지 30 g/ℓ 이상의 판토-화합물을 생산하기에, 약 30 내지 35 g/ℓ 이상의 판토-화합물을 생산하기에, 약 35 내지 40 g/ℓ 이상의 판토-화합물을 생산하기에 (예를 들어, 37 g/ℓ 이상의 판토-화합물), 또는 약 40 내지 50 g/ℓ 이상의 판토-화합물을 생산하기에 충분한 시간동안 계속된다. 또다른 실시양태에서, 미생물은 바람직한 판토-화합물의 수율, 예를 들어 상기 언급한 범위 내의 수율이 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 72시간 또는 약 96시간에 생산되도록 하는 조건하에서 배양된다.
또한, 본 발명의 방법은 목적 화합물 (예를 들어, 판토-화합물)을 회수하는 단계를 포함한다. 목적 화합물 (예를 들어, 판토-화합물)을 "회수하는"이란 용어는 배양 배지로부터 화합물을 추출, 수획, 단리 또는 정제하는 것을 포함한다. 화합물을 회수하는 것은 통상적인 수지 (예를 들어, 음이온 또는 양이온 교환 수지, 비이온성 흡착 수지 등)로의 처리, 통상적인 흡착제 (예를 들어, 활성화된 차콜, 규산, 실리카겔, 셀룰로스, 알루미나 등), pH의 변화, 용매 추출 (예를 들어, 알콜, 에틸 아세테이트 및 헥산 등과 같은 통상적인 용매), 투석, 여과, 농축, 결정화, 재결정화, pH 조정 및 동결건조 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 당업계에 공지된 통상적인 단리 또는 정제 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들어, 화합물 (예를 들어, 판토-화합물)은 우선 배지로부터 미생물을 제거함으로써 회수될 수 있다. 이어서, 배지를 양이온 교환 수지를 통해 또는 그 위로 통과시켜 원치않는 양이온을 제거한 후, 음이온 교환 수지를 통해 또는 그 위로 통과시켜 원치않는 무기 음이이온과 목적 판토-화합물 (예를 들어, 판토테네이트)보다 산도가 높은 유기산을 제거한다. 그 결과 생성된 판토-화합물 (예를 들어, 판토테네이트)는 이후에 본원에 기재된 바와 같이 판토테네이트염 (예를 들어, 칼슘 판토테네이트)으로 전환될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 화합물은 "추출", "단리" 또는 "정제"하여 결과의 조제에 다른 성분 (예를 들어, 배지 성분 및(또는) 발효 부산물)이 거의 없게 만든다. "다른 성분이 거의 없는"이란 용어는 화합물이 자신이 생산된 배양액의 배지 성분 또는 발효 부산물로부터 분리 (예를 들어, 정제 또는 부분적 정제)된 목적 화합물의 조제를 포함한다. 한 실시양태에서, 조제는 약 80％ (건량 기준)가 넘는 목적 화합물 (예를 들어, 배지 성분 또는 발효 부산물이 약 20％ 미만), 보다 바람직하게는 90％가 넘는 목적 화합물 (예를 들어, 배지 성분 또는 발효 부산물이 약 10％ 미만), 보다 더 바람직하게는 95％가 넘는 목적 화합물 (예를 들어, 배지 성분 또는 발효 부산물이 약 5％ 미만), 및 가장 바람직하게는 98 내지 99％가 넘는 목적 화합물 (예를 들어, 배지 성분 또는 발효 부산물이 약 1 내지 2％ 미만)을 갖는다. 목적 화합물이 염 (예를 들어, 판토테네이트염 또는 판토에이트염)으로 유도체화된 판토-화합물인 경우, 이 판토-화합물은 또한 바람직하게는 염의 형성과 관련된 화학적 오염물이 없다 (예를 들어, 거의 없다). 목적 화합물이 알콜로 유도체화된 판토-화합물인 경우, 이 판토-화합물은 또한 바람직하게는 알콜의 형성과 관련된 화학적 오염물이 없다 (예를 들어, 거의 없다).
다른 실시양태에서, 목적 판토-화합물은, 예를 들어 미생물이 생물학적으로 무해 (예를 들어, 안전)할 경우에 미생물로부터 정제되지 않는다. 예를 들어, 전체 배양액 (또는 배양 상층액)은 생성물 (예를 들어, 조 생성물)의 공급원으로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 배양액 (또는 배양 상층액)은 변형시키지 않고 사용한다. 다른 실시양태에서, 배양액 (또는 배양 상층액)은 농축시킨다. 또다른 실시양태에서, 배양액 (또는 배양 상층액)은 건조 또는 동결건조시킨다.
II. 케토판토에이트 리덕타제-과다발현 미생물에 특징이 있는 판토-화합물의 생산 방법
본 발명의 한 측면은 케토판토에이트 리덕타제-과다발현 (KPAR-O) 미생물을 판토-화합물이 생산되는 조건하에서 배양하는 것을 포함하는 판토-화합물의 생산 방법에 특징이 있다. "케토판토에이트 리덕타제-과다발현 (KPAR-O) 미생물"이란 용어는 케토판토에이트 리덕타제가 과다발현 (예를 들어, 서열 30의 아미노산 서열을 갖는 비. 서브틸리스 케토판토에이트 리덕타제 단백질)되고(되거나) panE1 핵산 서열 (예를 들어, 서열 29에 기재된 비. 서브틸리스 panE1 핵산 서열)을 포함하는 벡터로 형질전환되도록 조작된 미생물을 포함한다. 한 실시양태에서, 판토-화합물은 판토테네이트이다. 다른 실시양태에서, 판토-화합물은 판토에이트이다. 다른 실시양태에서, 케토판토에이트 리덕타제는 박테리아 유래의 것이다. 다른 실시양태에서, 케토판토에이트 리덕타제는 바실러스 (예를 들어, 바실러스 서브틸리스)로부터 유래한 것이다. 또다른 실시양태에서, KPAR-O 미생물은 그람 양성균이다. 또다른 실시양태에서, KPAR-O 미생물은 바실러스, 코리네박테리움, 락토바실러스, 락토코커스 및 스트렙토마이세스로 이루어진 군으로부터 선택되는 속에 속하는 미생물이다. 바람직한 실시양태에서, KPAR-O 미생물은 바실러스속의 미생물이다. 보다 바람직한 실시양태에서, KPAR-O 미생물은 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 바실러스 할로두란스, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 푸밀루스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시양태에서, KPAR-O 미생물은 바실러스 서브틸리스이다.
또다른 실시양태에서, KPAR-O 미생물은 케토판토에이트 리덕타제 이외에 1종 이상의 판토테네이트 생합성 효소를 추가로 과다발현한다. 예시적 실시양태에서, KPAR-O 미생물은 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제, 판토테네이트 신테타제 및 아스파테이트-α-데카르복실라제 중 하나 이상을 추가로 과다발현한다. 또한 본 발명의 방법은 KPAR-O 미생물을 배양하는 것을 포함하며, 판토-화합물을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 판토-화합물의 생산 방법에 관한 것이다.
III. 전구체 공급 요건에 독립적인 판토-화합물 생산 방법
생합성 효소 또는 조작된 생합성 효소들의 조합에 따라, 본 발명의 미생물에 1종 이상의 판토테네이트 생합성 전구체를 제공 (예를 들어, 공급)하여 판토테네이트 또는 다른 목적 판토-화합물이 생산되도록 하는 것이 바람직하거나 또는 필요할 수 있다. "판토테네이트 생합성 전구체" 또는 "전구체"라는 용어는 미생물의 배양 배지에 제공시 상기 배지와 접촉하거나 상기 배지에 포함되어 판토테네이트 생합성을 증진 또는 증가시키는 시약 또는 화합물을 포함한다. 한 실시양태에서, 판토테네이트 생합성 전구체 또는 전구체는 아스파테이트이다. 다른 실시양태에서, 판토테네이트 생합성 전구체 또는 전구체는 β-알라닌이다. 첨가되는 아스파테이트 또는 β-알라닌의 양은 바람직하게는, 배양 배지 중의 농도가 미생물의 생산성을 증진시키기에 충분한 농도 (예를 들어, β-알라닌, 케토판토에이트, 판토에이트 또는 판토테네이트와 같은 판토-화합물의 생산을 증진시키기에 충분한 농도)의 양이다. 본 발명의 판토테네이트 생합성 전구체는 농축된 용액 또는 현탁액 (예를 들어, 물 또는 완충액과 같은 적합한 용매 중)의 형태로, 또는 고체 형태(예를 들어, 분말의 형태)로 첨가될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 판토테네이트 생합성 전구체는 단일 분액으로서, 연속적으로 또는 단속적으로 주어진 시간에 걸쳐 첨가될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 판토테네이트 생합성 전구체는 발린 (예를 들어, 실시예 III 참조)이다. 또다른 실시양태에서, 판토테네이트 생합성 전구체는 α-케토이소발레레이트이다. 바람직하게는, 발린 또는 α-케토이소발레레이트는 목적 생성물 (예를 들어, 판토-화합물)이 생산되기에 충분한 농도로 배지 중에 첨가된다. 판토테네이트 생합성 전구체는 또한 본원에서 "보충 판토테네이트 생합성 기질"이라고도 부른다.
본 발명의 판토테네이트 생합성 방법에서 판토테네이트 생합성 전구체를 제공하는 것은, 예를 들어 이 방법이 고수율의 판토-화합물 생산을 위해 사용되는 경우에 높은 비용을 수반할 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 방법은 1종 이상의 생합성 효소 또는 생합성 효소들의 조합 (예를 들어, 1종 이상의 판토테네이트생합성 효소 및(또는) 발린-이소루이신 생합성 효소)을 갖는 미생물을, 판토테네이트 또는 다른 목적 판토-화합물이 전구체 공급에 독립적인 방식으로 생산되도록 조작하는 것에 특징이 있다. "전구체 공급에 독립적인"이란 어구는, 예를 들어 원하는 화합물 (예를 들어, 판토-화합물)의 생산 방법을 언급할 때, 원하는 화합물의 생산 방법 또는 방식이 원하는 화합물의 생산에 이용하는 미생물에 제공 (예를 들어, 공급)되는 전구체에 의존하지 않는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 특징인 미생물은 아스파테이트, β-알라닌, 발린 및(또는) α-KIV 등의 전구체 공급을 필요로하지 않는 방식으로 판토-화합물을 생산할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 방법은 1종 이상의 생합성 효소 또는 생합성 효소들의 조합이 조작되어 판토테네이트 또는 다른 목적 판토-화합물을 전구체 공급에 거의 독립적인 방식으로 생산하는 미생물에 특징이 있다. "전구체 공급에 거의 독립적인 방식"이란 어구는, 원하는 화합물의 생산을 위해 사용되는 미생물에 제공 (예를 들어, 공급)되는 전구체에 보다 낮은 정도로 의존하는 방식 또는 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명 방법의 특징인 미생물은 실질적으로 감소된 양의 아스파테이트, β-알라닌, 발린 및(또는) α-KIV 등의 전구체가 필요한 방식으로 판토-화합물을 생산하는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 대조군 미생물 (예를 들어, 원하는 화합물의 효율적인 생산을 위해 전구체 공급에 의존적인, 예를 들어 완전히 의존적인 미생물)이 필요로 하는 양의 5％ 내지 10％ 미만의 전구체 공급을 필요로 하는 방식의 판토-화합물 (예를 들어, 판토테네이트) 생산 방법에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 대조군 미생물이 필요로 하는양의 15 내지 20％ 미만의 전구체 공급을 필요로 하는 방식의 판토-화합물 생산 방법에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 대조군 미생물이 필요로 하는 양의 25 내지 30％, 35 내지 40％, 45 내지 50％ 또는 55 내지 60％ 미만의 전구체 공급을 필요로 하는 방식의 판토-화합물 생산 방법에 관한 것이다. 본원의 실시예 I 내지 III에 기재된 바와 같이, 본 발명 방법의 특징인 특정 미생물은, 예를 들어, 5 g/ℓ의 아스파테이트, β-알라닌, 발린 또는 α-KIV (예를 들어, 시험관 배양 또는 진탕 플라스크 배양시)를 필요로 한다. 따라서 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 0.25 g/ℓ, 0.5 g/ℓ, 0.75 g/ℓ, 1 g/ℓ, 1.25 g/ℓ, 1.5 g/ℓ, 1.75 g/ℓ, 2 g/ℓ, 2.25 g/ℓ, 2.5 g/ℓ, 2.75 g/ℓ 또는 3 g/ℓ 미만의 전구체 공급이 필요한 방법에 관한 것이다.
전구체 공급에 독립적인 방식 또는 전구체 공급에 거의 독립적인 방식으로 원하는 화합물 (예를 들어, 판토-화합물)을 생산하는 바람직한 방법은, 판토테네이트 생합성 효소 1종 이상 및(또는) 이소루이신-발린 생합성 효소 1종 이상의 발현이 변형되도록 조작 (예를 들어, 디자인 또는 설계, 예를 들어 유전공학적으로 조작)된 미생물을 배양하는 것을 포함한다. 예를 들어 한 실시양태에서, 미생물은 판토테네이트 생합성 효소 1종 이상 및(또는) 이소루이신-발린 생합성 효소 1종 이상이 탈조절되도록 조작 (예를 들어, 디자인 또는 설계)된다. 바람직한 실시양태에서, 미생물은 생합성 경로가 탈조절되도록, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 판토테네이트 생합성 경로 및(또는) 이소루이신-발린 생합성 경로가 탈조절되도록 조작 (예를 들어, 디자인 또는 설계)된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 미생물은판토테네이트 생합성 효소 1종 이상 및(또는) 이소루이신-발린 생합성 효소 1종 이상이 과다발현되도록 조작 (예를 들어, 디자인 또는 설계)된다.
전구체 공급에 독립적인 방식으로 또는 전구체 공급에 거의 독립적인 방식으로 원하는 화합물 (예를 들어, 판토-화합물)을 생산하는 바람직한 방법은 다음과 같다. 한 실시양태에서, 본 발명은 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 경로를 갖는 아스파테이트-α-데카르복실라제-과다발현 (AαD-O) 미생물을 판토테네이트가 생산되는 조건하에서 배양하는 것을 포함하는, 전구체 공급에 독립적인 방식으로 판토테네이트를 생산하는 방법에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 탈조절된 판토테네이트 (pan) 경로 및 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 경로를 갖는 아스파테이트-α-데카르복실라제-과다발현 (AαD-O) 미생물을 판토테네이트가 생산되는 조건하에서 배양하는 것을 포함하는, 전구체 공급에 독립적인 방식으로 판토테네이트를 생산하는 방법에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 아스파테이트-α-데카르복실라제-과다발현 (AαD-O) 미생물을 판토테네이트가 생산되는 조건하에서 배양하는 것을 포함하는, 아스파테이트 또는 β-알라닌 공급에 독립적인 방식으로 판토테네이트를 생산하는 방법에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 경로를 갖는 미생물을 판토테네이트가 생산되는 조건하에서 배양하는 것을 포함하는, 발린 또는 α-케토이소발레레이트 공급에 독립적인 방식으로 판토테네이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.
"아스파테이트-α-데카르복실라제-과다발현 (AαD-O) 미생물"이란 용어는 아스파테이트-α-데카르복실라제가 과다발현되도록 조작된 미생물을 포함한다. 바람직한 "아스파테이트-α-데카르복실라제-과다발현 (AαD-O) 미생물"은 비. 서브틸리스 panD 핵산 서열 (예를 들어, 서열 28의 아미노산 서열을 갖는 아스파테이트-α-데카르복실라제 단백질을 코딩하는 panD 핵산 서열, 예를 들어 서열 27에 기재된 panD 핵산 서열)을 포함하는 벡터로 형질전환되어 있다.
"탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 경로를 갖는 미생물"이란 어구는 이소루이신-발린 (ilv) 경로의 효소를 코딩하는 1종 이상의 유전자가 변화 또는 변형되거나, 또는 이소루이신-발린 (ilv) 경로의 효소를 코딩하는 1종 이상의 유전자가 포함된 오페론이 변화 또는 변형된 미생물을 포함한다. 바람직한 "탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 경로를 갖는 미생물"은 아세토히드록시산 신테타제 (예를 들어, 서열 32 및 서열 34의 아미노산 서열의 서브유닛을 갖는 아세토히드록시산 신테타제, 또는 서열 87의 아미노산 서열을 갖는 아세토히드록시산 신테타제), 아세토히드록시산 이소메로리덕타제 (서열 36의 아미노산 서열을 가짐), 또는 디히드록시산 데히드라타제 (서열 38의 아미노산 서열을 가짐)를 과다발현하고(하거나) ilvB, ilvN, ilvC, ilvBN, ilvBNC 또는 alsS 핵산 서열 (각각, 서열 31, 서열 33, 서열 35, 서열 35의 뉴클레오티드 1-2246, 뉴클레오티드1-1725, 1722-2246 및 2263-3291의 영역을 갖는 서열 58, 또는 서열 86) 및(또는) ilvD 핵산 서열 (서열 37)을 포함하는 벡터로 형질전환되어 있다.
IV. 고수율의 생산 방법
본 발명의 특히 바람직한 실시양태는 판토테네이트가 상당히 고수율로 생산되는 조건하에서 조작된 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 고수율로 판토테네이트를 생산하는 방법에 관한 것이다. "고수율로 생산하는 방법"이란 어구, 예를 들어 원하는 화합물을 고수율로 생산하는 방법 (예를 들어, 판토-화합물의 생산 방법)은 원하는 화합물이 증진된 양, 또는 필적하는 생산 방법의 양보다 많은 양으로 생산되게 하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 고수율의 생산 방법이 원하는 화합물을 상당히 고수율로 생산할 수 있게 해준다. "상당히 고수율"이란 어구는 생산량 또는 수율이 충분히 증진되거나 필적하는 생산 방법의 양보다 충분히 많은 양으로 생산되는 것, 예를 들어 원하는 화합물의 상업적 생산 (예를 들어, 상업적으로 실행할 수 있는 비용으로 제품 생산)에 충분한 양으로 증진된 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 판토테네이트가 2 g/ℓ 초과의 양으로 생산되는 조건하에서 조작된 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 판토테네이트를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 판토테네이트가 10 g/ℓ 초과의 양으로 생산되는 조건하에서 조작된 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 판토테네이트를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 판토테네이트가 20 g/ℓ 초과의 양으로 생산되는 조건하에서 조작된 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 판토테네이트를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 판토테네이트가 30 g/ℓ 초과의 양으로 생산되는 조건하에서 조작된 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 판토테네이트를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 판토테네이트가 40 g/ℓ 초과의 양으로 생산되는 조건하에서 조작된 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 판토테네이트를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상업적으로 바람직한 기간 내에 충분히 상승된 양의 화합물이 생산되는 조건하에서 조작된 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 원하는 화합물을 고수율로 생산 (예를 들어, 판토-화합물의 생산 방법)하는 방법에 관한 것이다. 한 예시적 실시양태에서, 판토테네이트가 36시간에 15 내지 20 g/ℓ를 초과하는 양으로 생산되는 조건하에서 조작된 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 판토테네이트를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 판토테네이트가 48시간에 25 내지 30 g/ℓ를 초과하는 양으로 생산되는 조건하에서 조작된 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 판토테네이트를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 판토테네이트가 72시간에 35 내지 40 g/ℓ를 초과하는 양, 예를 들어 72시간에 37 g/ℓ의 양으로 생산되는 조건하에서 조작된 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 판토테네이트를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 판토테네이트가 60시간에 30 내지 40 g/ℓ를 초과하는 양, 예를 들어 60시간에 30, 35 또는 40 g/ℓ의 양으로 생산되는 조건하에서 조작된 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 판토테네이트를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다. 범위 내에 포함되고(되거나) 범위의 중간에 있는, 본원에 기재된 값 및 범위는 또한 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이다. 예를 들어, 60시간에 31, 32, 33, 34 ,35, 36, 37, 38 및 39 g/ℓ의 양으로 생산된 판토테네이트는 60시간에 30 내지 40 g/ℓ의 범위에 포함되는 것이다. 다른 예로써, 30 내지 35 g/ℓ 또는 35 내지 40 g/ℓ는 60시간에 30 내지 40 g/ℓ의 범위에 포함되는 것이다. 더욱이, 당업자는, 예를 들어 "60시간에 30 내지 40 g/ℓ"의 생산량을 얻기 위해 조작된 미생물을 배양하는 것이, 임의로 더 고수율로 판토테네이트를 생산하기 위해 부가의 기간 (예를 들어, 60시간이 넘는 시간)동안 미생물을 배양하는 것이 포함됨을 알 것이다.
V. 판토테네이트 키나아제 돌연변이체 미생물에 특징이 있는 판토-화합물 생산 방법
본 발명은 고수율로 판토테네이트 및 다른 판토-화하물을 생산하도록 조작된 미생물을 이용하여 판토테네이트를 생산하는 방법에 관한 것이다. 판토테네이트를 과다발현하는 세포들은, 판토테네이트의 세포내 양이 CoA에 의한 판토테네이트 키나아제의 피드백 억제를 극복할 수 있을만큼 증가하여 CoA과 과다생산되게 한다. 판토테네이트를 소비하는 것 이외에, CoA의 합성 증가는 PanB, PanD, PanE 또는 PanC 반응의 피드백 억제를 증가시킴으로써 야기될 수 있고, 이에 의해 판토테네이트 생산이 억제된다. 따라서, 판토테네이트 키나아제 활성의 감소는 CoA 양의 감소를 초래할 수 있고, 그 결과 PanB, PanD, PanE 또는 PanC의 활성과 판토테네이트 생산은 증가하게 된다.
따라서, 본 발명의 특정 방법은 부분적으로는 비. 서브틸리스 coaA 유전자의 확인 및 특성화, 및 이 유전자가 비. 서브틸리스 증식에 필수적이지도 않고 (즉, coaA 유전자를 비. 서브틸리스 염색체에서 제거해도 치사현상이 없음) 비. 서브틸리스에서의 판토테네이트 키나아제 활성에도 필수적이지 않다는 증명을 토대로 이루어진 것이다. 제2 판토테네이트 키나아제-코딩 유전자가 비. 서브틸리스에서 확인 및 특성화 되었고, 이를 "coaX"라 명명하였다. 이 유전자는 온도 감수성 판토테네이트 키나아제를 함유하는 이. 콜라이 돌연변이체를 보완해 주며, 이는 기존에 알려진 임의의 판토테네이트 키나아제 유전자와 상동성으로 연관되어 있지 않다.
한 측면에서, 본 발명의 방법은 coaX 유전자를 포함하는 재조합 미생물, 또는 판토테네이트 키나아제 활성이 감소된 돌연변이체 coaX 유전자를 포함하는 재조합 미생물에 특징이 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로를 추가로 갖는 상기 재조합 미생물에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 경로를 추가로 갖는 상기 재조합 미생물에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 이 미생물은 바실러스속 (예를 들어, 비. 서브틸리스)에 속한다.
또한, 본 발명의 방법은 coaA 유전자를 포함하는 재조합 미생물, 또는 돌연변이체 coaX 유전자 및 임의로 판토테네이트 키나아제 활성이 감소된 coaA 유전자 또는 그의 돌연변이체를 포함하는 재조합 미생물에 특징이 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로 또는 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 경로를 추가로 갖는 상기 재조합 미생물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단리된 coaX 또는 coaA 유전자 및 돌연변이체 coaX 및(또는) coaA 유전자를 포함하는 벡터에 특징이 있다. 단리된 coaX 유전자 또는 돌연변이체 coaX 유전자를 포함하는 단리된 핵산 분자는, 단리된 CoaX 단백질 및 돌연변이체 CoaX 단백질 이외의 본 발명의 특징이다.
상기 기재된 핵산 분자 (예를 들어, 유전자), 단백질, 벡터 및 재조합 미생물 (예를 들어, 돌연변이체 미생물)은 판토-화합물을 생산하는 방법 및(또는)판토-화합물 생산을 증진시키는 방법에 특히 적합하다. 한 실시양태에서, 본 발명은 판토테네이트 키나아제 돌연변이체 (예를 들어, 본원에 정의된 바와 같이 판토테네이트 키나아제가 돌연변이 등으로 잘못 발현되는 재조합 미생물)를 판토-화합물이 생산되는 조건하에서 배양하는 것을 포함하는 판토-화합물 (예를 들어, 판토테네이트)의 생산 방법에 특징이 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 판토테네이트 키나아제 돌연변이체 (예를 들어, 본원에 정의된 바와 같이 판토테네이트 키나아제가 돌연변이 등으로 잘못 발현되는 재조합 미생물)를 판토-화합물이 생산되는 조건하에서 배양하는 것을 포함하는 판토-화합물 (예를 들어, 판토테네이트) 생산의 증진 방법에 특징이 있다. 본원에 사용된 "증진"이란 용어 (예를 들어, "생산을 증진시키는"이란 어구에서)는 비-돌연변이체 미생물 (예를 들어, 정상적인 판토테네이트 키나아제 유전자(들)을 갖고(갖거나) 정상적인 판토테네이트 생산 속도 및(또는) 양을 갖는 미생물)에서의 생산량 또는 생산 속도에 비해 판토-화합물 (예를 들어, 판토테네이트)의 생산량 또는 생산 속도가 증가된 것을 의미한다.
바람직하게는, 본 발명의 판토테네이트 키나아제 돌연변이체에 특징이 있는 방법에 의해 생산된 판토-화합물의 양은 비-돌연변이체 (예를 들어, 돌연변이화되지 않은 판토테네이트 키나아제를 발현하는 재조합 미생물)에 의해 생산된 양에 비해 5％ 이상 증가한다. 보다 바람직하게는, 판토-화합물의 양이 비-돌연변이체에 특징이 있는 방법에 비해 10％ 증가한다. 훨씬 바람직하게는, 판토-화합물의 양이 비-돌연변이체에 특징이 있는 방법에 비해 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 증가하며, 2배, 5배, 10배, 50배, 100배 이상 증가한다.
VI. 판토-화합물의 생산을 증진시키는 부가의 돌연변이
본 발명의 방법은 또한, 판토테네이트 생합성 효소 및(또는) 루이신-발린 생합성 효소를 과다발현하거나 탈조절시키는 것 이외에, 또는 판토테네이트 키나아제 코딩 유전자를 돌연변이화시키는 것 이외에, 원치않거나 바람직하지 않은 생성물에 대해 중요한 판토테네이트 생합성 기질이나 전구체의 전환을 촉매하는 효소를 결실 또는 돌연변이화시키는 것도 포함할 수 있다. 예를 들어, ilvE 유전자 (문헌 [Kuramitsuet al.(1985)J. Biochem.97:993-999] 참조) 또는 그의 동족체 (서열 62 또는 서열 64)를 돌연변이화시킴으로써, 판토테네이트 키나아제 코딩 효소의 돌연변이화 이외에 α-케토이소발레레이트의 발린으로의 전환을 억제하여 판토-화합물의 생산이 더욱 증진 또는 증가될 것이라 예상된다. 별법으로, ansB 유전자 (문헌 [Sun and Seflow (1991)J. Bacteriol.173:3831-3845] 참조) 또는 그의 동족체 (서열 66)를 돌연변이화시킴으로써, 판토테네이트 키나아제 코딩 효소의 돌연변이화 이외에 아스파테이트의 분해를 억제하여 판토-화합물의 생산이 더욱 증진 또는 증가될 것이라 예상된다. 별법으로, alsD 유전자 (문헌 [Rennaet al.(1993)J. Bacteriol.175:3863-3875] 참조) 또는 그의 동족체 (서열 68)를 돌연변이화시킴으로써, 판토테네이트 키나아제 코딩 효소의 돌연변이화 이외에 아세토락테이트의 아세토인으로의 전환을 억제하여 판토-화합물의 생산이 더욱 증진 또는 증가될 것이라 예상된다. 별법으로, 알라닌-발린 트랜스아미나제를 코딩하는 avtA 유전자 또는 그의 동족체를 돌연변이화시킴으로써, 판토테네이트 키나아제 코딩 효소의 돌연변이화 이외에 α-케토이소발레레이트의 발린으로의 전환을 억제하여 판토-화합물의 생산이 더욱 증진 또는 증가될 것이라 예상된다. avtA 유전자를 돌연변이화시키는 것은, 예를 들어 서열 70 (예를 들어, 이. 콜라이 avtA 유전자)의 뉴클레오티드 서열을 갖는 avtA 유전자, 또는 그의 구조적 동족체 (예를 들어, 서열 71의 아미노산 서열과 30-40％, 40-50％, 50-60％, 60-70％, 70-80％, 80-90％, 90-95％ 또는 그 이상의 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 동족체) 또는 그의 기능적 동족체 (예를 들어, 알라닌-발린 트랜스아미나제 활성을 지닌, 구조적으로 관련이 없는 단백질을 코딩하는 유전자)를 돌연변이화시키는 것을 포함한다. 그러한 돌연변이는 실시예 (예를 들어, 실시예 XIII, XV, XVI 및 XVII)에 예시된 바와 같은 방법을 이용하여 성취할 수 있다.
따라서 한 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 판토테네이트 키나아제-코딩 유전자를 가지며, 또한 avtA, ilvE, ansB 및(또는) alsD 유전자, 또는 그의 동족체에 결실 또는 돌연변이가 있는 미생물을 배양하는 것을 포함하는 판토-화합물의 생산 방법에 특징이 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 판토테네이트 키나아제-코딩 유전자 및 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로 효소를 가지며, 또한 avtA, ilvE, ansB 및(또는) alsD 유전자, 또는 그의 동족체에 결실 또는 돌연변이가 있는 미생물을 배양하는 것을 포함하는 판토-화합물의 생산 방법에 특징이 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 판토테네이트 키나아제-코딩 유전자 및 탈조절된 이소루이신-발린 생합성 경로 효소를 가지며, 또한 avtA, ilvE, ansB 및(또는) alsD 유전자, 또는 그의 동족체에 결실 또는 돌연변이가 있는 미생물을 배양하는 것을 포함하는 판토-화합물의 생산 방법에 특징이 있다.
alsD 유전자를 돌연변이화시키는 것은, 예를 들어 α-KIV 생산에 이용되는 전구체 풀 (pool)에서 탄소 (예를 들어, 아세토락테이트)가 제외되는 것을 방지하기 위해 alsS 유전자의 과다발현 또는 탈조절과 함께 수행시 특히 유용하다. 따라서, 판토-화합물 생산을 위한 alsS 좌위의 기여를 최대화하기 위해서는 alsS 유전자를 과다발현시키는 것 이외에 alsD 유전자를 손상시키는 것이 바람직하다. alsD 유전자를 손상시키기 위해, als 오페론의 alsD 유전자에 인접하는 적당한 단편을 PCR로 증폭하여 클로닝함으로써, 손상체를 생성하기 위한 상동성을 제공한다. cat 유전자와 같은 약물 내성 유전자를 alsD 유전자 대신 인접 DNA 단편들 사이에 클로닝하고, 선형 DNA를 약물-내성에 대한 선별성이 있는 PA824와 같은 판토테네이트 생산 균주 내로 형질전환시킨다. alsS 유전자를 과다발현하기 위해, alsS 코딩 서열 (예를 들어, 발현을 위해 PCR에 의해 조작된 alsS 코딩 서열)을 발현 벡터 내로 클로닝한다. alsS를 발현하는 벡터 (또는 alsS + ilvC를 발현하는 벡터)를 판토-화합물 생산 균주 (예를 들어, 판토테네이트 생산 균주 PA824) 내에 도입한다.
본 발명의 방법은, 예를 들어 판토테네이트 생합성 효소 및(또는) 이소루이신-발린 생합성 효소를 과다발현하거나 탈조절하는 것 이외에, 또는 판토테네이트 키나아제 코딩 유전자를 돌연변이화시키는 것 이외에, 목적 판토-화합물을 원치않거나 바람직하지 않은 하류 생성물로 전환시키는 반응을 촉매하는 효소를 결실 또는 돌연변이화시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
VII. 단리된 핵산 분자 및 유전자
본 발명의 다른 측면은 바실러스 단백질 (예를 들어, 비. 서브틸리스 단백질), 예를 들어 바실러스 판토테네이트 생합성 효소 (예를 들어, 비. 서브틸리스 판토테네이트 생합성 효소) 또는 바실러스 발린-이소루이신 생합성 효소 (예를 들어, 비. 서브틸리스 발린-이소루이신 생합성 효소)를 코딩하는 단리된 핵산 분자에 특징이 있다. 또한, 본 발명은 단리된 coaX 및(또는) coaA 핵산 분자 (예를 들어, 단리된 coaX 및(또는) coaA 유전자) 및 그러한 coaX 및(또는) coaA 핵산 분자 또는 유전자를 포함하는 단리된 핵산 분자에 특징이 있다.
"핵산 분자"라는 용어에는 DNA 분자 (예를 들어, 선형, 환형, cDNA 또는 염색체 DNA) 및 RNA (예를 들어, tRNA, rRNA, mRNA), 및 뉴클레오티드 유사체를 이용하여 생성된 상기 DNA나 RNA의 유사체가 포함된다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중-가닥 DNA이다. "단리된" 핵산 분자라는 용어는 이 핵산이 유래한 생물체의 염색체 DNA에서 상기 핵산 분자에 자연적으로 인접하는 서열 (즉, 핵산 분자의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열)이 없는 핵산 분자를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 약 10 kb, 5 kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1 kb, 0.5 kb, 0.1 kb, 50 bp, 25 bp 또는 10 bp 미만의, 핵산이 유래한 생물체의 염색체 DNA에서 상기 핵산 분자에 자연적으로 인접하는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 더욱이, cDNA 분자와 같이 "단리된" 핵산 분자는 재조합 기술에 의해 생성시 다른 세포성 물질이 거의 없을 수 있으며, 화학적으로 합성시 화합물 전구체 또는 다른 화합물이 거의 없을 수 있다.
본원에 사용된 "유전자"라는 용어는 유전자간 (intergenic) DNA (즉, 생물체의 염색체 DNA에서 유전자에 자연적으로 인접하고(하거나) 유전자를 분리하는 개재DNA 또는 스페이서 DNA)에 의해 다른 유전자로부터 분리된 핵산 분자 (예를 들어, DNA 분자 또는 그의 단편), 예를 들어 생물체에서 단백질을 코딩하거나 RNA를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 유전자는 효소 또는 다른 단백질 분자 (예를 들어, 인접 오픈 리딩 프레임 (ORF)과 같은 코딩 서열을 포함할 수 있음)를 직접 합성하거나, 또는 생명체에서 그 자체로 기능을 나타낼 수 있다. 생명체의 유전자는 본원에 정의된 바와 같은 오페론에서 클러스터링 될 수 있으며, 여기서 상기 오페론은 유전자간 DNA에 의해 다른 유전자 및(또는) 오페론으로부터 분리되어 있다. 오페론에 함유된 개별 DNA는 상기 개별 DNA 사이에 유전자간 DNA가 없이 중첩될 수도 있다. 본원에 사용된 "단리된 유전자"에는 본질적으로는 유전자가 유래한 생물체의 염색체 DNA에서 상기 유전자에 자연적으로 인접하는 서열들이 없으며 (즉, 제2 또는 별도의 단백질 또는 RNA 분자를 코딩하는 인접 코딩 서열, 또는 인접 구조 서열 등이 없음), 임의로 프로모터 서열 및(또는) 터미네이터 서열과 같은 5' 및 3' 조절 서열을 포함할 수 있는 유전자가 포함된다. 한 실시양태에서, 단리된 유전자는 단백질에 대한 우선한 코딩 서열 (예를 들어, 바실러스 단백질을 코딩하는 서열)을 포함한다. 다른 실시양태에서, 단리된 유전자는 단백질 (예를 들어, 바실러스 단백질)에 대한 코딩 서열, 및 유전자가 유래한 생물체의 염색체 DNA로부터의 인접 5' 및(또는) 3' 조절 서열 (예를 들어, 인접한 5' 및(또는) 3' 바실러스 조절 서열)을 포함한다. 바람직하게는, 단리된 유전자는 약 10 kb, 5 kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1 kb, 0.5 kb, 0.1 kb, 50 bp, 25 bp 또는 10 bp 미만의, 유전자가 유래한 생물체의 염색체 DNA에서 상기 유전자에 자연적으로 인접하는 뉴클레오티드 서열을함유한다.
한 측면에서, 본 발명은 단리된 panB 핵산 서열 또는 유전자, 단리된 panC 핵산 서열 또는 유전자, 단리된 panD 핵산 서열 또는 유전자, 단리된 panE 핵산 서열 또는 유전자, 단리된 ilvB, ilvN, ilvBN 핵산 서열 또는 유전자, 단리된 alsS 핵산 서열 또는 유전자, 단리된 ilvC 핵산 서열 또는 유전자, 및(또는) 단리된 ilvD 핵산 서열 또는 유전자에 특징이 있다.
바람직한 실시양태에서, 핵산 또는 유전자는 바실러스로부터 유래한다 (예를 들어, 바실러스 유래의 것임). "바실러스로부터 유래한" 또는 "바실러스 유래의"라는 용어는 바실러스속의 미생물에서 자연적으로 발견되는 핵산 또는 유전자를 포함한다. 바람직하게는, 핵산 또는 유전자가 바실러스 서브틸리스, 바실러스 렌티모르부스, 바실러스 렌투스, 바실러스 피르무스, 바실러스 판토텐티쿠스 (Bacillus pantothenticus), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 바실러스 세레우스, 바실러스 서큘란스, 바실러스 코아굴란스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 푸밀루스, 바실러스 투링기엔시스, 및 다른 그룹 1의 바실러스 종, 예를 들어 16S rRNA의 유형에 의해 특성화되는 것들 (Priest의 상기 문헌)로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물에서 유래한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 핵산 또는 유전자는 바실러스 브레비스 (Bacillus brevis) 또는 바실러스 스테아로써모필루스 (Bacillus stearothermophilus)에서 유래한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자 및(또는) 유전자는 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 바실러스 할로두란스, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 푸밀루스로이루어진 군으로부터 선택되는 미생물에서 유래한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 핵산 또는 유전자는 바실러스 서브틸리스에서 유래한다 (즉, 바실러스 서브틸리스 유래의 것임). "바실러스 서브틸리스로부터 유래한" 또는 "바실러스 서브틸리스 유래의"라는 용어는 바실러스 서브틸리스에서 자연적으로 발견되는 핵산 또는 유전자를 포함한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 핵산 또는 유전자는 바실러스 유전자의 동족체 (예를 들어, 바실러스 pan 유전자 또는 바실러스 ilv 유전자와 같이, 바실러스와는 다른 종에서 유래하지만 본 발명의 바실러스 유전자와 상당한 상동성이 있음)이다.
박테리아 유래의 핵산 분자 또는 유전자 및(또는) 바실러스 유래의 핵산 분자 또는 유전자 (예를 들어, 비. 서브틸리스 유래의 핵산 분자 또는 유전자), 예를 들어 바실러스 또는 비. 서브틸리스의 coaX 유전자, coaA 유전자, pan 유전자 및(또는) ilv 유전자와 같이 본 발명의 발명자들에 의해 확인된 유전자들이 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 자연발생의 박테리아 및(또는) 바실러스 핵산 분자 또는 유전자 (예를 들어, 비. 서브틸리스 핵산 분자 또는 유전자)와는 상이한, 박테리아 유래의 핵산 분자 또는 유전자 및(또는) 바실러스 유래의 핵산 분자 또는 유전자 (예를 들어, 비. 서브틸리스 유래의 핵산 분자 또는 유전자)(예를 들어, 비. 서브틸리스 핵산 분자 또는 유전자), 예를 들어 치환, 삽입 또는 결실된 핵산을 갖지만 본 발명의 자연발생 유전자 산물과 실질적으로 유사한 단백질을 코딩하는 핵산 분자 또는 유전자가 본 발명의 범위에 포함된다. 한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 86, 서열 35또는 서열 37에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 1개 이상을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 88, 서열 35 또는 서열 37에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 2개, 3개 또는 4개 이상을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 단리된 핵산 분자는 서열 23, 서열 25 및 서열 27의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 단리된 핵산 분자가 미생물에서 발현시 서열 23, 서열 25 및 서열 27의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질이 각각 생산되도록 연결될 수 있다 (예를 들어, 서열 59). 다른 실시예에서, 본 발명의 바람직한 단리된 핵산 분자는 서열 31 및 서열 33의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 단리된 핵산 분자가 미생물에서 발현시 서열 31 및 서열 33의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질이 각각 생산되도록 연결될 수 있다 (예를 들어, 서열 58의 뉴클레오티드 1-2246). 다른 실시예에서, 본 발명의 바람직한 단리된 핵산 분자는 서열 86의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 본 발명의 바람직한 단리된 핵산 분자는 서열 31, 서열 33 및 서열 35의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 단리된 핵산 분자가 미생물에서 발현시 서열 31, 서열 33 및 서열 35의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질이 각각 생산되도록 연결될 수 있다 (예를 들어, 서열 59의 뉴클레오티드 1-2246).
다른 실시양태에서, 본 발명의 바람직한 단리된 핵산 분자는 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 88, 서열 35 또는 서열 37에 기재된 뉴클레오티드 서열과 약 60-65％ 이상, 바람직하게는 약 70-75％ 이상, 보다 바람직하게는 약 80-85％ 이상, 보다 더 바람직하게는 약 90-95％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 엄격한 조건하에서 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 88, 서열 35 또는 서열 37에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 혼성화된다. 그러한 엄격 조건은 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에서 찾아볼 수 있다. 엄격한 (예를 들어, 고도로 엄격한) 혼성화 조건의 예로는 6X 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC)에서 약 45℃로 혼성화시킨 후, 0.2X SSC, 0.1％ SDS에서 50 내지 65℃로 1회 이상 세척하는 것이 바람직하나, 이것으로 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 엄격한 조건하에서 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 88, 서열 35 또는 서열 37에 기재된 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 본 발명의 단리된 핵산 분자가 자연발생의 핵산 분자에 상응한다. 본원에 사용된 "자연발생의" 핵산 분자는 자연 상태에서 나타나는 핵산 서열을 갖는 RNA 또는 DNA 분자를 의미한다.
본 발명의 핵산 분자 (예를 들어, 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 88, 서열 35 또는 서열 37에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자)는 표준 분자생물학 기술 및 본원에 제공된 서열 정보를 이용하여 단리할 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 표준 혼성화 및 클로닝 기술 (문헌 [Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T.Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재된 바와 같이)을 이용하여 단리하거나, 또는 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 88, 서열 35 또는 서열 37의 뉴클레오티드 서열을 토대로 디자인된 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응에 의해 단리할 수 있다. 본 발명의 핵산은 cDNA, mRNA 또는, 별법으로 게놈 DNA를 주형으로 사용하고, 표준 PCR 증폭 기술에 따른 적당한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭할 수 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 33, 서열 31, 서열 33, 서열 88, 서열 35에 나타낸 뉴클레오티드 서열의 상보체이다.
부가의 panC 핵산 서열에는, 서열 25의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것, 서열 26에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 동족체를 코딩하는 것 (예를 들어, 서열 26에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 이상 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하며 상기 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 것), 엄격한 조건하에서 서열 25의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 혼성화되거나 서열 26의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 혼성화되는 것, 또는 본원에 기재된 panC 뉴클레오티드 서열에 대한 상보체가 포함된다.
부가의 panD 핵산 서열에는, 서열 27의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것, 서열 28에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 동족체를 코딩하는 것 (예를 들어, 서열 28에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 이상 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하며 상기 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 것), 엄격한 조건하에서 서열 27의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 혼성화되거나 서열 28의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 혼성화되는 것, 또는 본원에 기재된 panD 뉴클레오티드 서열에 대한 상보체가 포함된다.
부가의 panE 핵산 서열에는, 서열 29의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것, 서열 30에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 동족체를 코딩하는 것 (예를 들어, 서열 30에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 이상 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하며 상기 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 것), 엄격한 조건하에서 서열 29의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 혼성화되거나 서열 30의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 혼성화되는 것, 또는 본원에 기재된 panE 뉴클레오티드 서열에 대한 상보체가 포함된다.
부가의 ilvB 핵산 서열에는, 서열 31의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것, 서열 32에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 동족체를 코딩하는 것 (예를 들어, 서열 32에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 이상 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하며 상기 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 것), 엄격한 조건하에서 서열 31의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 혼성화되거나 서열 32의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 혼성화되는 것, 또는 본원에 기재된 ilvB 뉴클레오티드 서열에 대한 상보체가 포함된다.
부가의 ilvN 핵산 서열에는, 서열 33의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것, 서열 34에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 동족체를 코딩하는 것 (예를 들어, 서열 34에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 이상 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하며 상기 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 것), 엄격한 조건하에서 서열 33의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 혼성화되거나 서열 34의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 혼성화되는 것, 또는 본원에 기재된 ilvN 뉴클레오티드 서열에 대한 상보체가 포함된다.
부가의 ilvC 핵산 서열에는, 서열 35의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것, 서열 36에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 동족체를 코딩하는 것 (예를 들어, 서열 36에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 이상 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하며 상기 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 것), 엄격한 조건하에서 서열 35의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 혼성화되거나 서열 36의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 혼성화되는 것, 또는 본원에 기재된 ilvC 뉴클레오티드 서열에 대한 상보체가 포함된다.
부가의 ilvD 핵산 서열에는, 서열 37의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것, 서열 38에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 동족체를 코딩하는 것 (예를 들어, 서열 38에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 이상 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하며 상기 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 것), 엄격한 조건하에서 서열 37의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 혼성화되거나 서열 38의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 혼성화되는 것, 또는 본원에 기재된 ilvD 뉴클레오티드 서열에 대한 상보체가 포함된다.
부가의 alsS 핵산 서열에는, 서열 86의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것, 서열 87에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 동족체를 코딩하는 것 (예를 들어, 서열 87에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 이상 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하며 상기 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 것), 엄격한 조건하에서 서열 86의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 혼성화되거나 서열 87의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 혼성화되는 것, 또는 본원에 기재된 alsS 뉴클레오티드 서열에 대한 상보체가 포함된다.
다른 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 coaX 유전자, 또는 그의 부분 또는 단편이거나, 이를 포함하는 것이다. 한 실시양태에서, 단리된 coaX 핵산 분자 또는 유전자는 서열 19에 기재된 핵산 서열을 포함한다 (예를 들어, 비. 서브틸리스 coaX 뉴클레오티드 서열을 포함). 다른 실시양태에서, 단리된 coaX 핵산 분자 또는 유전자는 서열 9에 기재된 아미노산 서열을 코딩한다 (예를 들어, 비. 서브틸리스 CoaX 아미노산 서열을 코딩). 또다른 실시양태에서, 단리된 coaX 핵산 분자 또는 유전자는 서열 9의 아미노산 서열을 갖는 CoaX 단백질의 동족체를 코딩한다.본원에 사용되는 "동족체"란 용어는 본원에 기재된 야생형 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열과 약 30-35％, 바람직하게는 약 35-40％, 보다 바람직하게는 약 40-45％, 보다 더 바람직하게는 약 60％, 70％, 80％, 90％ 이상 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 가지며, 상기 야생형 단백질 또는 폴리펩티드와 실질적으로 동등한 기능적 또는 생물학적 활성을 지닌 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, CoaX 동족체는 서열 9에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 약 30-35％, 바람직하게는 약 35-40％, 보다 바람직하게는 약 40-45％, 보다 더 바람직하게는 약 60％, 70％, 80％, 90％ 이상 동일성을 공유하며, 서열 9에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동등한 기능적 또는 생물학적 활성 (즉, 기능적 균등물임)을 지니고 있다 (예를 들어, 실질적으로 동등한 판토테네이트 키나아제 활성을 지님). 바람직한 실시양태에서, 단리된 coaX 핵산 분자 또는 유전자는 서열 7, 서열 8, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 74 또는 서열 75 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 단리된 coaX 핵산 분자는 서열 19에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 혼성화되거나, 서열 7 내지 18, 74 또는 75 중 어느 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 혼성화된다. 그러한 혼성화 조건은 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelet al., eds., John Wiley & Sons, Inc. (1995), sections 2, 4 and 6]에서 찾아볼 수 있다. 부가의 엄격 조건은 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrooket al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), chapters 7, 9 and 11]에서 찾아볼 수 있다. 엄격한 혼성화 조건의 예로는 4X 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC)에서 약 65 내지 70℃로 혼성화 (또는 4X SSC + 50％ 포름아미드중에서 42 내지 50℃로 혼성화)시킨 후, 1X SSC에서 약 65 내지 70℃로 1회 이상 세척하는 것이 바람직하나, 이것으로 한정되지는 않는다. 고도로 엄격한 혼성화 조건의 예로는 1X SSC에서 약 65 내지 70℃로 혼성화 (또는 1X SSC + 50％ 포름아미드중에서 42 내지 50℃로 혼성화)시킨 후, 0.3X SSC에서 65 내지 70℃로 1회 이상 세척하는 것이 바람직하나, 이것으로 한정되지는 않는다. 감소된 엄격 혼성화 조건의 예로는 4X SSC에서 약 50 내지 65℃로 혼성화 (또는 6X SSC + 50％ 포름아미드중에서 40 내지 45℃로 혼성화)시킨 후, 2X SSC에서 50 내지 60℃로 1회 이상 세척하는 것이 바람직하나, 이것으로 한정되지는 않는다. 상기 인용된 값의 중간 범위, 예를 들어 '65 내지 70℃에서' 또는 '42 내지 50℃에서'도 또한 본 발명에 포함되는 것이다. SSPE (1X SSPE는 0.15 M NaCl, 10 mM NaH2PO4및 1.25 mM EDTA, pH 7.4임)를 SSC (1X SSC는 0.15 M NaCl 및 15 mM 시트르산나트륨임) 대신 혼성화 및 세척 완충액에 사용할 수 있으며; 세척은 각각의 혼성화가 완료된 후 15분동안 수행한다. 길이가 50 염기쌍 미만인 하이브리드를 위한 혼성화 온도는 하이브리드의 용융 온도 (Tm)보다 5 내지 10℃ 더 낮아야 하는데, 여기서 Tm은 하기 방정식에 따라 결정한다. 길이가 18 염기쌍 미만인 하이브리드의 경우, Tm(℃) = 2(A+T 염기의 수) + 4(G+C 염기의수)이다. 길이가 18 내지 49 염기쌍 사이인 하이브리드의 경우, Tm(℃) = 81.5 + 16.6(log10[Na+]) + 0.41(G+C의 ％) - (600/N) [여기서, N은 하이브리드 중 염기의 수이고, [Na+]는 혼성화 완충액 중 나트륨 이온의 농도 (1X SSC의 [Na+]=0.165 M)임]이다. 당업자는 막에 대한 핵산 분자의 비특이적 혼성화를 감소시키기 위해 혼성화 및(또는) 세척 완충액에, 블로킹 시약 (예를 들어, BSA 또는 연어나 청어의 정자 캐리어 DNA), 세제 (예를 들어, SDS), 킬레이트화제 (예를 들어, EDTA), 피콜 (Ficoll) 및 PVP 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 부가의 시약을 첨가할 수 있음을 알 것이다. 특히 나일론 막을 사용하는 경우, 엄격한 혼성화 조건의 예로는 0.25-0.5 M NaH2PO4, 7％ SDS에서 약 65℃로 혼성화시킨 후, 0.02 M NaH2PO4, 1％ SDS에서 65℃로 1회 이상 세척 (또는 별법으로 0.2X SSC, 1％ SDS에서)하는 것이 바람직하나, 이것으로 한정되지는 않는다 (문헌 [Church and Gilbert (1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:1991-1995] 참조). 다른 바람직한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 본원에 기재된 coaX 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 서열 19에 기재된 뉴클레오티드 서열의 완전한 상보 서열)을 포함한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 coaA 유전자, 예를 들어 바실러스 (예를 들어, 비. 서브틸리스) coaA 유전자, 또는 그의 부분 또는 단편이거나, 이를 포함하는 것이다. 단리된 coaA 핵산 분자 및(또는) 유전자의 예로는(1) 서열 20 내지 22 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 coaA 핵산 분자 또는 유전자, (2) 서열 3에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 coaA 핵산 분자 또는 유전자, (3) CoaA 동족체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 coaA 핵산 분자 또는 유전자 (예를 들어, 서열 3에 기재된 아미노산 서열과 약 30-35％, 바람직하게는 약 35-40％, 보다 바람직하게는 약 40-45％, 보다 더 바람직하게는 약 60％, 70％, 80％, 90％ 이상 동일한 아미노산 서열을 가지며, 실질적으로 동등한 효소 활성을 지닌 폴리펩티드), (4) 서열 1, 서열 2, 서열 4, 서열 5 또는 서열 6 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 coaA 핵산 분자 또는 유전자, (5) 엄격한 조건하에서 서열 20, 서열 21 또는 서열 22에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 혼성화되거나, 또는 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드들 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 혼성화되는 단리된 핵산 분자, 및 (6) 본원에 기재된 coaA 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자 (예를 들어, 서열 20, 서열 21 또는 서열 22에 기재된 뉴클레오티드 서열의 완전한 상보 서열)가 포함된다.
본 발명의 핵산 분자 (예를 들어, coaX 핵산 분자 또는 유전자, 또는 coaA 핵산 분자 또는 유전자)는 표준 분자생물학 기술 및 본원에 제공된 서열 정보를 이용하여 단리할 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 표준 혼성화 및 클로닝 기술 (문헌 [Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T.Molecular Cloning: ALaboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재된 바와 같이)을 이용하여 단리하거나, 또는 본원에 기재된 coaX 또는 coaA 뉴클레오티드 서열이나 그의 인접 서열을 토대로 디자인된 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응에 의해 단리할 수 있다. 본 발명의 핵산 (예를 들어, coaX 핵산 분자 또는 유전자, 또는 coaA 핵산 분자 또는 유전자)은 cDNA, mRNA 또는, 별법으로 게놈 DNA를 주형으로 사용하고, 표준 PCR 증폭 기술에 따른 적당한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태는 돌연변이체 coaX 및 coaA 핵산 분자 또는 유전자에 특징이 있다. 본원에 사용된 "돌연변이체 핵산 분자" 또는 "돌연변이체 유전자"라는 어구는, 상기 돌연변이체에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질이 야생형 핵산 분자 또는 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질과 다른 활성을 나타내도록 하나 이상의 변화 (예를 들어, 치환, 삽입, 결실)를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 또는 유전자를 포함한다. 바람직하게는, 돌연변이체 핵산 분자 또는 돌연변이체 유전자 (예를 들어, 돌연변이체 coaA 또는 coaX 유전자)는, 예를 들어 유사한 조건에서 분석 (예를 들어, 동일한 온도에서 배양된 미생물로 분석)하는 경우에 야생형 핵산 분자 또는 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질에 비해 감소된 활성 (예를 들어, 감소된 판토테네이트 키나아제 활성)을 지닌 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩한다. 또한, 돌연변이체 유전자는 폴리펩티드를 코딩하지 않을 수도, 또는 감소된 양으로 야생형 폴리펩티드를 생산할 수도있다.
본원에서 사용된 "감소된 활성" 또는 "감소된 효소 활성"은 야생형 핵산 분자 또는 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질의 활성보다 약 5％ 이상 낮은 것, 바람직하게는 야생형 핵산 분자 또는 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질의 활성보다 약 5 내지 10％, 보다 바람직하게는 약 10 내지 25％, 보다 더 바람직하게는 25 내지 50％, 50 내지 75％ 또는 75 내지 100％ 이상 낮은 것을 의미한다. 상기 언급한 값의 중간 범위, 예를 들어 75 내지 85％, 85 내지 90％, 90 내지 95％도 본 발명에 포함되는 것이다. 또한, 본원에서 사용된 "감소된 활성" 또는 "감소된 효소 활성"은 결실된 또는 "낙아웃된 (knocked out)" 활성(예를 들어, 야생형 핵산 분자 또는 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질의 활성보다 대략 100％ 낮은 활성)을 포함한다. 활성은 특정 목적 단백질의 활성 측정을 위해 허용할 수 있는 임의의 분석법에 따라 측정할 수 있다. 활성은 직접적으로, 예를 들어 세포로부터 단리 또는 정제된 단백질의 활성을 측정함으로써 측정 또는 분석할 수 있다. 별법으로, 활성은 세포 내에서 또는 세포외 배지 중에서 측정할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 coaA 유전자 또는 돌연변이체 coaX 유전자 (즉, 감소된 판토테네이트 키나아제 활성을 코딩하는 상기 돌연변이체)는 미생물에서, 예를 들어 온도-감수성 방식으로 판토테네이트 키나아제를 발현하는 돌연변이체 미생물에서 돌연변이화된 유전자를 발현함으로써, 돌연변이체 유전자가 판토테네이트 키나아제 활성에 대한 온도 감수성 (Ts) 돌연변이체를 보완할 수 있는지 여부를 분석할 수 있다. "감소된 판토테네이트 키나아제 활성"을 코딩하는coaX 돌연변이체 유전자 또는 coaA 돌연변이체 유전자는, 예를 들어 상응하는 야생형 coaX 유전자 또는 coaA 유전자에 비해 Ts 돌연변이체를 보완하는 효과가 더 낮은 것이다.
당업자는 핵산 또는 유전자 서열 중의 단일 치환 (예를 들어, 상응하는 아미노산 서열에서 한 아미노산의 변화를 코딩하는 염기 치환)이 상응하는 야생형 폴리펩티드 또는 단백질에 비해 코딩 폴리펩티드 또는 단백질의 활성에 극적인 영향을 미칠 수 있음을 알 것이다. 본원에 정의된 바와 같이, 돌연변이체 핵산 또는 돌연변이체 유전자 (예를 들어, 돌연변이체 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 것)는, 돌연변이체 핵산 또는 돌연변이체 유전자가 변화된 활성을 지닌 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하며, 야생형 유전자 또는 핵산을 발현하거나 상기 돌연변이체 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하는 상응하는 미생물에 비해 상기 돌연변이체 유전자 또는 핵산을 발현하거나 상기 돌연변이체 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하는 미생물에서 임의로 상이하거나 구별되는 표현형으로 관찰할 수 있다는 점에서, 상기 정의된 바와 같은 단백질 동족체를 코딩하는 핵산 또는 유전자와 쉽게 구별할 수 있다. 이와는 반대로, 단백질 동족체는 동일하거나 실질적으로 유사한 활성을 지니며, 야생형 유전자 또는 핵산을 발현하는 상응하는 미생물에 비해 미생물에서 생산시에 표현형으로는 임의로 구별할 수 없다. 따라서, 동족체와 돌연변이체를 구별하는 작용을 하는 것은 핵산 분자들, 유전자들, 단백질 또는 폴리펩티드들 사이의 서열 동일성 정도가 아니라, 오히려 코딩된 단백질 또는 폴리펩티드의 활성이 동족체와 돌연변이체를 구별하게 해준다. 즉, 동족체는 실질적으로 동등한 기능적 활성을 지니면서 서열 동일성 (예를 들어, 30 내지 50％)은 낮고, 돌연변이체는 상이하거나 변화된 기능적 활성을 지니면서도 99％와 같은 높은 서열 동일성을 갖는다. 동족체의 예는 도 20 (즉, CoaA 동족체) 및 도 23 (즉, CoaX 동족체)에 기재되어 있다. 돌연변이체의 예는 본원에서 실시예 XV 및 XVIII에 기재되어 있다.
VIII. 재조합 핵산 분자 및 벡터
또한, 본 발명은 본원에 기재된 핵산 분자 및(또는) 유전자, 바람직하게는 바실러스 유전자, 보다 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 유전자, 보다 더 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 판토테네이트 키나아제 유전자 (예를 들어, coaX 유전자 또는 coaA 유전자), 판토테네이트 생합성 유전자 (예를 들어, 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 panB 유전자, 케토판토에이트 리덕타제를 코딩하는 panE 유전자, 판토테네이트 신테타제를 코딩하는 panC 유전자 및(또는) 아스파테이트-α-데카르복실라제를 코딩하는 panD 유전자와 같은 케판토테네이트 생합성 유전자를 코딩하는 유전자) 및(또는) 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 유전자 (예를 들어, 아세토히드록시산 신테타제를 코딩하는 ilvBN 또는 alsS 유전자, 아세토히드록시산 이소메로리덕타제를 코딩하는 ilvC 유전자 및(또는) 디히드록시산 데히드라타제를 코딩하는 ilvD 유전자)를 포함하는 재조합 핵산 분자 (예를 들어, 재조합 DNA 분자)에 특징이 있다.
또한, 본 발명은 본원에 기재된 핵산 분자 (예를 들어, 단리된 또는 재조합 핵산 분자 및(또는) 유전자)를 포함하는 벡터 (예를 들어, 재조합 벡터)에 특징이 있다. 특히, 재조합 벡터는 본원에 기재된 박테리아 유전자 산물, 바람직하게는바실러스 유전자 산물, 보다 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 유전자 산물, 보다 더 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 판토테네이트 생합성 유전자 산물 (예를 들어, 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제, 케토판토에이트 리덕타제, 판토테네이트 신테타제 및(또는) 아스파테이트-α-데카르복실라제와 같은 판토테네이트 생합성 효소) 및(또는) 이소루이신-발린 생합성 유전자 산물 (예를 들어, 아세토히드록시산 신테타제, 아세토히드록시산 이소메로리덕타제 및(또는) 디히드록시산 데히드라타제)을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다는 특징이 있다.
"재조합 핵산 분자"라는 용어는 상기 재조합 핵산 분자가 유래한 (예를 들어, 뉴클레오티드 1개 이상의 부가, 결실 또는 치환에 의해) 고유의 또는 천연 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열과 달라지도록 변화, 변형 또는 조작된 핵산 분자 (예를 들어, DNA 분자)를 포함한다. 바람직하게는, 재조합 핵산 분자 (예를 들어, 재조합 DNA 분자)는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 단리된 핵산 분자 또는 유전자 (예를 들어, 단리된 coaX, coaA, pan 또는 ilv 유전자)를 포함한다.
"재조합 벡터"라는 용어는 상기 재조합 벡터가 유래한 고유의 또는 천연 핵산 분자에 포함된 핵산 서열에 비해 더 길거나, 더 짧거나 또는 상이한 핵산 서열을 함유하도록 변화, 변형 또는 조작된 벡터 (예를 들어, 플라스미드, 파지, 파스미드, 바이러스, 코스미드 또는 다른 정제된 핵산 벡터)를 포함한다. 바람직하게는, 재조합 벡터는 본원에 기재된 조절 서열, 예를 들어 프로모터 서열, 터미네이터 서열 및(또는) 인공 리보솜 결합 부위 (RBS)에 작동 가능하게 연결된, coaX, coaA, pan 또는 ilv 유전자 또는 coaX, coaA, pan 또는 ilv 유전자를 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함한다.
"조절 서열(들)에 작동 가능하게 연결된"이란 용어는 관심있는 핵산 분자 또는 유전자의 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현 (예를 들어, 증진, 증가, 구성적, 기본, 약화, 감소 또는 억제된 발현), 바람직하게는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 유전자 산물의 발현 (예를 들어, 재조합 핵산 분자가 본원에 정의된 재조합 벡터에 포함되어 미생물에 도입된 경우)을 허용하는 방식으로 조절 서열에 연결된 것을 의미한다.
"조절 서열"이란 용어는 다른 핵산 서열의 발현에 영향 (예를 들어, 변화 또는 조절)을 미치는 핵산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 조절 서열은 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터의 유사 또는 동일한 위치에, 및(또는) 자연 상태의 조절 서열과 목적 유전자에 대해 관찰되는 바와 같이 특정 목적 유전자에 적절한 방향으로, 예를 들어 자연 상태의 위치 및(또는) 방향으로 포함된다. 예를 들어, 목적 유전자는 천연 생물체에서 목적 유전자에 동반되거나 이에 인접한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터에 포함될 수 있다 (예를 들어, "천연" 프로모터와 같은 "천연" 조절 서열에 작동 가능하게 연결됨). 또는, 목적 유전자는 천연 생물체에서 다른 (예를 들어, 상이한) 유전자에 동반되거나 이에 인접한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터에 포함될 수 있다. 또는, 목적 유전자는 다른 생물체의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터에 포함될 수 있다. 예를 들어, 다른 미생물로부터의 조절 서열 (예를 들어, 다른 박테리아 조절 서열 및 박테리오파지 조절 서열 등)은 특정 목적 유전자에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
한 실시양태에서, 조절 서열은 비-천연 또는 비-자연발생 서열이다 (예를 들어, 화학적으로 합성된 서열을 비롯하여, 변화, 돌연변이화, 치환, 유도체화, 결실된 서열). 바람직한 조절 서열에는 프로모터, 인핸서, 종결 신호, 종결 방지 신호 (anti-termination signal) 및 다른 발현 조절 성분 (예를 들어, 레프레서 또는 인듀서가 결합하는 서열, 및(또는) 전사된 mRNA 등에서 전사 및(또는) 번역 조절 단백질에 대한 결합 부위)이 포함된다. 그러한 조절 서열은, 예를 들어 문헌 [Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T.Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재되어 있다. 조절 서열에는 미생물에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 유도하는 서열 (예를 들어, 구성적 프로모터 및 강력한 구성적 프로모터), 미생물에서 뉴클레오티드 서열의 유도가능 발현을 유도하는 서열 (예를 들어, 크실로스 유도가능 프로모터와 같은 유도가능 프로모터) 및 미생물에서 핵산 서열의 발현을 약화 또는 억제하는 서열 (예를 들어, 약화 신호 또는 레프레서 서열)이 포함된다. 또한, 조절 서열을 제거 또는 결실시킴으로써 목적 유전자의 발현을 조절하는 것도 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, 전사의 음성 조절에 관여하는 서열을 제거하여 목적 유전자의 발현을 증진시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터는 프로모터 또는 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된 1종 이상의 박테리아 유전자 산물 (예를 들어, 판토테네이트 생합성 효소, 이소루이신-발린 생합성 효소, 또는 CoaA 또는 CoaX와 같은 CoaA 생합성 효소)을 코딩하는 핵산 서열 또는 유전자를 포함한다. 바람직한 본 발명의 프로모터에는 바실러스 프로모터 및(또는) 박테리오파지 (예를 들어, 바실러스를 감염시키는 박테리오파지) 프로모터가 포함된다. 한 실시양태에서, 프로모터는 바실러스 프로모터, 바람직하게는 강력한 바실러스 프로모터 (예를 들어, 바실러스에서 생화학적 하우스키핑 유전자와 관련된 프로모터 또는 바실러스에서 해당 경로 (glycolytic pathway) 유전자와 관련된 프로모터)이다. 다른 실시양태에서, 프로모터는 박테리오파지 프로모터이다. 바람직한 실시양태에서, 프로모터는 박테리오파지 SP01로부터 유래한 것이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 프로모터는 서열 39, 서열 40 또는 서열 41에 기재된 프로모터인 P15, P26및 Pveg로 이루어진 군으로부터 선택된다. 부가의 바람직한 프로모터에는 바실러스 (예를 들어, 바실러스 서브틸리스)에서 높은 수준의 발현을 촉진하는 tef (번역 연장 인자 (TEF) 프로모터) 및 pyc (피루베이트 카르복실라제 (PYC) 프로모터)가 포함된다. 그람 양성 미생물에 사용하는 부가의 바람직한 프로모터에는 amyE 프로모터 또는 파지 SP02 프로모터가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 그람 음성 미생물에 사용하는 부가의 바람직한 프로모터에는 tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-PR또는 λ-PL이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터는 터미네이터 서열 또는 터미네이터 서열들 (예를 들어, 전사 터미네이터 서열들)을 포함한다. "터미네이터 서열"이란 용어는 유전자 전사의 종결에 작용하는 조절 서열을 포함한다. 터미네이터 서열 (또는 탠덤 전사 터미네이터)은 뉴클레아제와 같은 효소에 대항하여 mRNA를 안정화 (예를 들어, mRNA에 구조를 형성함으로써)시키는 데 추가로 작용할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터는 상기 서열을 함유하는 벡터를 검출할 수 있게 해주는 서열 (즉, 검출 가능하고(하거나) 선별 가능한 마커)을 포함하며, 그 예로는 영양요구성 돌연변이를 극복하는 ura3 또는 ilvE와 같은 서열, 형광 마커, 및(또는) 착색 마커 (예를 들어, lacZ/β-갈락토시다제), 및(또는) 항생제 내성 유전자 (예를 들어, amp 또는 tet)가 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터는 인공 리보솜 결합 부위 (RBS)를 포함한다. "인공 리보솜 결합 부위 (RBS)"는 리보솜이 결합 (예를 들어, 전사를 개시하기 위해)하는 mRNA 분자 (예를 들어, DNA 내에서 코딩됨) 내의 부위를 포함하는 것로서, 천연 RBS (예를 들어, 자연발생 유전자에서 발견되는 RBS)와는 1개 이상의 뉴클레오티드가 다르다. 바람직한 인공 RBS에는 천연 RBS (예를 들어, 목적 유전자의 천연 RBS)와 약 1-2, 3-4, 5-6, 7-8, 9-10, 11-12, 13-15 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 상이한, 약 5-6, 7-8, 9-10, 11-12, 13-14, 15-16, 17-18, 19-20, 21-22, 23-24, 25-26, 27-28, 29-30 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 포함된다. 바람직하게는, 상이한 뉴클레오티드가 치환되어, 비교를 위해 최적으로 정렬했을 때 이 뉴클레오티드가 이상적인 RBS (예를 들어, 서열 44,서열 45, 서열 46, 서열 47 또는 서열 48)의 뉴클레오티드 하나 이상과 동일하게 된다. 인공 RBS는 특정 유전자와 관련된 자연발생 또는 천연 RBS를 대신하여 사용할 수 있다. 인공 RBS는 바람직하게는 특정 유전자의 번역을 증가시킨다. 바람직한 인공 RBS (예를 들어, 비. 서브틸리스 panB와 같은 panB의 번역을 증가시키기 위한 RBS)는 표 1A에 기재되어 있다 (예를 들어, 서열 49 및 서열 50).
부가의 바람직한 인공 RBS (예를 들어, 비. 서브틸리스 panD와 같은 panD의 번역을 증가시키기 위한 RBS)는 표 1B에 기재되어 있다 (예를 들어, 서열 51, 서열 52, 서열 53 및 서열 54).
부가의 바람직한 인공 RBS (예를 들어, 비. 서브틸리스 panD와 같은 panD의 번역을 증가시키기 위한 RBS)는 표 1C에 기재되어 있다 (예를 들어, 서열 55, 서열56 및 서열 57). PanC 단백질의 C-말단에서 예상 아미노산 서열을 도시하였다. PanD 번역을 위한 시작 코돈에 밑줄을 그었다.
따라서 한 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 서열 49 또는 서열 50에 기재된 인공 RBS를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 서열 51, 서열 52, 서열 53 또는 서열 54에 기재된 인공 RBS를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 서열 55, 서열 56 또는 서열 57에 기재된 인공 RBS를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 벡터는 박테리아에서의 복제를 증진시키는 서열 (예를 들어, 복제-증진 서열)을 포함한다. 한 실시양태에서, 복제-증진 서열은 이. 콜라이로부터 유래한 것이다. 다른 실시양태에서, 복제-증진 서열은 pBR322 (예를 들어, 도면에 기재된 임의의 pAN 벡터 중에서 pBR322 유래의 부분 내에 포함된 서열, 즉 도 3A에 도시된 벡터에서 약 5.0 kB 내지 9.0 kB의 NotI-NotI 서열)로부터 유래한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 벡터는 항생제 내성 유전자를 포함한다. "항생제 내성 유전자"라는 용어는 숙주 생물체 (예를 들어, 바실러스)에 항생제에 대한 내성을 제공 또는 부여하는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항생제 내성 유전자는 cat (클로람페니콜 내성) 유전자, tet (테트라싸이클린 내성) 유전자, erm (에리쓰로마이신 내성) 유전자, neo (네오마이신 내성) 유전자 및 spec (스펙티노마이신 내성) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 재조합 벡터는 또한 상동성 재조합 서열 (예를 들어, 숙주 생물체의 염색체 내로 목적 유전자가 재조합되도록 디자인된 서열)을 포함할 수도 있다. 예를 들어, amyE 서열을 숙주 염색체 내로의 재조합에 대한 상동성 표적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 벡터에는 도 2-15, 17, 19, 22, 25 및 26에 도시된 벡터들이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 당업자는 벡터의 디자인이 유전공학적으로 조작될 미생물의 선택 및 원하는 유전자 산물의 발현과 같은 그러한 인자에 따라 맞춰질 수 있음을 알 것이다.
IX. 단리된 단백질
본 발명의 다른 측면은 단리된 단백질 (예를 들어, 단리된 판토테네이트 생합성 효소 및(또는) 발린-이소루이신 생합성 효소, 및(또는) 단리된 CoaA 또는 CoaX 와 같은 단리된 CoA 생합성 효소)에 특징이 있다. 한 실시양태에서, 단백질 (예를 들어, 단리된 판토테네이트 생합성 효소 및(또는) 발린-이소루이신 생합성 효소, 및(또는) 단리된 CoaA 또는 CoaX 와 같은 단리된 CoA 생합성 효소)은 재조합 DNA 기술에 의해 생산되며, 표준 단백질 정제 기술을 이용하는 적당한 정제 계획에의해 본 발명의 미생물로부터 단리될 수 있다. 다른 실시양태에서, 단백질은 표준 펩티드 합성 기술을 이용하여 화학적으로 합성된다.
"단리된" 또는 "정제된" 단백질 (예를 들어, 단리 또는 정제된 생합성 효소)는 단백질이 유래한 미생물로부터의 세포성 물질 또는 다른 오염 단백질이 거의 없거나, 또는 화학적으로 합성시 화합물 전구체 또는 다른 화합물이 거의 없는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 단리 또는 정제된 단백질에는 약 30％ (건량 기준) 미만의 오염 단백질 또는 화합물, 보다 바람직하게는 약 20％ 미만의 오염 단백질 또는 화합물, 보다 더 바람직하게는 약 10％ 미만의 오염 단백질 또는 화합물, 및 가장 바람직하게는 약 5％ 미만의 오염 단백질 또는 화합물이 있다.
바람직한 실시양태에서, 단백질 또는 유전자 산물은 바실러스로부터 유래한 것이다 (예를 들어, 바실러스 유래의 것임). "바실러스로부터 유래한" 또는 "바실러스 유래의"라는 용어는 바실러스 유전자에 의해 코딩되는 단백질 또는 유전자 산물을 포함한다. 바람직하게는, 유전자 산물이 바실러스 서브틸리스, 바실러스 렌티모르부스, 바실러스 렌투스, 바실러스 피르무스, 바실러스 판토텐티쿠스, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 바실러스 세레우스, 바실러스 서큘란스, 바실러스 코아굴란스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 푸밀루스, 바실러스 투링기엔시스, 및 다른 그룹 1의 바실러스 종, 예를 들어 16S rRNA의 유형에 의해 특성화되는 것들 (Priest의 상기 문헌)로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물에서 유래한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 단백질 또는 유전자 산물은 바실러스 브레비스 또는 바실러스 스테아로써모필루스에서 유래한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 단백질 또는 유전자 산물은 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 바실러스 할로두란스, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 푸밀루스로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물에서 유래한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 단백질 또는 유전자 산물은 바실러스 서브틸리스에서 유래한다 (예를 들어, 바실러스 서브틸리스 유래의 것임). "바실러스 서브틸리스로부터 유래한" 또는 "바실러스 서브틸리스 유래의"라는 용어는 바실러스 서브틸리스 유전자에 의해 코딩되는 단백질 또는 유전자 산물을 포함한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 단백질 또는 유전자 산물은 바실러스 유전자의 동족체 (예를 들어, 바실러스 pan 유전자 또는 바실러스 ilv 유전자와 같이, 바실러스와는 다른 종에서 유래하지만 본 발명의 바실러스 유전자와 상당한 상동성이 있음)에 의해 코딩된다.
예를 들어, 바실러스 또는 비. 서브틸리스의 coaX 유전자, coaA 유전자, pan 유전자 및(또는) ilv 유전자와 같이 본 발명의 발명자들에 의해 확인된 유전자와 같은 자연발생 박테리아 및(또는) 바실러스의 유전자 (예를 들어, 비. 서브틸리스 유전자)에 의해 코딩되는 박테리아 유래의 단백질 또는 유전자 산물 및(또는) 바실러스 유래의 단백질 또는 유전자 산물 (예를 들어, 비. 서브틸리스 유래의 유전자의 산물)이 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 예를 들어 돌연변이화, 삽입 또는 결실된 핵산을 갖지만 본 발명의 자연발생 유전자 산물과 실질적으로 유사한 단백질을 코딩하는 유전자와 같은 자연발생의 박테리아 및(또는) 바실러스의 유전자 (예를 들어, 비. 서브틸리스 유전자)와는 상이한, 박테리아 유래의 단백질 또는 유전자 산물 및(또는) 바실러스 유래의 단백질 또는 유전자 산물이 본 발명의 범위에포함된다. 예를 들어, 당업자는 유전자 코드의 축퇴 (degeneracy)로 인하여 자연발생 유전자에 의해 코딩되는 것과 동일한 아미노산을 코딩하는 핵산를 돌연변이화 (예를 들어, 치환)시킬 수 있음을 잘 이해할 것이다. 더욱이, 당업자는 보존적 아미노산 치환에 대해 코딩하는 핵산을 돌연변이화 (예를 들어, 치환)시킬 수 있음을 잘 이해할 것이다. 또한, 당업자는 자연발생 유전자 산물에 비해 유전자 산물의 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 특정 정도로 아미노산을 치환, 부가 또는 결실시킬 수 있음을 잘 이해할 것이며, 각각의 경우는 모두 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 단백질 (예를 들어, 단리된 판토테네이트 생합성 효소 및(또는) 단리된 이소루이신-발린 생합성 효소, 및(또는) 단리된 CoaA 또는 CoaX 와 같은 단리된 CoA 생합성 효소)은 서열 3, 서열 9, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 36, 서열 38 또는 서열 87에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 단리된 단백질은 서열 3, 서열 9, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 36, 서열 38 또는 서열 87에 기재된 단백질 중 하나 이상에 대한 동족체 (예를 들어, 서열 3, 서열 9, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 36, 서열 38 또는 서열 87의 아미노산 서열과 약 30-40％ 이상, 바람직하게는 약 40-50％ 이상, 보다 바람직하게는 약 50-60％ 이상, 보다 더 바람직하게는 약 60-70％, 70-80％, 80-90％, 90-95％ 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 각각 서열 3, 서열 9, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열34, 서열 36, 서열 38 또는 서열 87의 아미노산 서열에 의해 코딩되는 단백질의 활성과 실질적으로 유사한 활성을 지니는 것)이다.
두 아미노산 서열들 또는 두 핵산들의 상동성 퍼센트를 측정하기 위해, 서열들을 최적 비교 목적으로 정렬한다 (예를 들어, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 또는 핵산 서열에 갭을 도입할 수 있음). 제1 서열의 위치를 상응하는 제2 서열과 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 차지할 경우, 이들 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열들 사이의 동일성 퍼센트는 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수에 대한 함수 (즉, ％ 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 ×100)이며, 바람직하게는 최적 정렬을 위해 필요한 갭의 수와 상기 갭의 크기를 고려해야 한다.
서열의 비교 및 두 서열들 사이의 퍼센트 상동성 측정은 수학적 연산에 의해 성취할 수 있다. 서열의 비교를 위해 이용되는 수학적 연산의 예로는 Karlin 및 Altschul의 연산 (문헌 [Karlin and Altschul (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:2264-68] 참조) 및 변형된 Karlin 및 Altschul 연산(문헌 [Karlin and Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:5873-77] 참조)이 바람직하나 이것으로 한정되지는 않는다. 그러한 연산은 문헌 [Altschulet al.(1990)J. Mol. Biol.215:403-10]의 NBLSAT 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)에 혼입되어 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램에서 score = 100, wordlength = 12의 파라미터로 수행하여 본 발명의 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻는다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램에서 score = 50, wordlength = 3의 파라미터로 수행하여 본 발명의 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 얻는다. 비교를 목적으로 갭이 있는 정렬을 얻기 위해, 문헌 [Altschulet al.(1997)Nucleic Acids Research25(17):3389-3402]에 기재된 Gapped BLAST를 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램의 디폴트 파라미터 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)를 사용할 수 있다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조). 서열의 비교를 위해 이용되는 다른 수학적 연산의 예로는 Myers 및 Miller의 연산 (문헌 [Myers and Miller (1988)Comput Appl Biosci. 4:11-17] 참조)이 바람직하나 이것으로 한정되는 것은 아니다. 그러한 연산은 GENSTREAM 네트워크 서버 (IGH Montpellier, FRANCE; http://vega.igh.cnrs.fr) 또는 ISREC 서버 (http://www.ch.embnet.org) 등에서 입수할 수 있는 ALIGN 프로그램에 혼입되어 있다. 아미노산 서열들의 비교를 위해 ALIGN 프로그램을 이용하는 경우, weight residue table=PAM120, gap length penalty=12 및 gap penalty=4의 파라미터를 이용할 수 있다.
다른 바람직한 실시양태에서, 두 아미노산 서열들 사이의 퍼센트 상동성은 GCG 소프트웨퍼 패키지 중의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 입수가능)을 이용하여 측정할 수 있는데, 이 프로그램은 Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스를 이용하며, gap weight=12, 10, 8, 6 또는 4, 및 length weight=2, 3 또는 4의 파라미터를 이용한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 두 핵산 서열들 사이의 퍼센트 상동성은, gap weight=50 및 length weight=3의 파라미터를 이용하는, GCG 소프트웨퍼 패키지 중의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 입수가능)을 이용하여 얻을 수 있다.
X. 유전체학 및 생물전환
본 발명의 다른 측면은 본원에 기재된 재조합 미생물 (예를 들어, 돌연변이체 미생물) 및(또는) 단리된 CoA, 판토테네이트 또는 이소루이신-발린 생합성 효소에 특징이 있는 생물형질전환 과정을 포함한다. 본원에서 "생물전환 (bioconversion)"이라고도 부르는 "생물형질전환 과정 (biotransformation process)"이라는 용어는, CoA, 판토테네이트 또는 이소루이신-발린 생합성 효소의 하류에 있는 화합물 (예를 들어, 기질, 중간체 또는 생성물)에 대해 CoA, 판토테네이트 또는 이소루이신-발린 생합성 효소의 상류에 있는 임의의 화합물 (예를 들어, 중간체 또는 생성물)의 생산을 초래하는 생물학적 과정 (예를 들어, 형질전환 또는 전환)을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 판토-화합물이 생산되고 회수되는 조건하에서 1종 이상의 판토테네이트 생합성 효소를 과다발현하는 미생물을 1종 이상의 적당한 기질 또는 전구체와 접촉시키는 것을 포함하는 판토-화합물의 생산을 위한 생물형질전환 과정에 특징이 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 판토테네이트가 생산되고 회수되는 조건하에서 케토판토에이트 리덕타제 (panE 유전자의 산물)를 과다발현하는 미생물을 적당한 기질 (예를 들어, 케토판토에이트)과 접촉시키는 것을 포함하는 판토테네이트의 생산을 위한 생물형질전환 과정에 특징이 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 판토테네이트가 생산되고 회수되는 조건하에서 케토판토에이트 리덕타제 및 판토테네이트 신테타제를 과다발현하는 미생물을 적당한 기질(예를 들어, 케토판토에이트 및 β-알라닌)과 접촉시키는 것을 포함하는 판토테네이트의 생산을 위한 생물형질전환 과정에 특징이 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 판토테네이트가 생산되고 회수되는 조건하에서 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제, 케토판토에이트 리덕타제 및 판토테네이트 신테타제를 과다발현하는 미생물을 적당한 기질 (예를 들어, α-케토이소발레레이트 및 β-알라닌)과 접촉시키는 것을 포함하는 판토테네이트의 생산을 위한 생물형질전환 과정에 특징이 있다. 상기 기재된 생물형질전환을 수행하기에 바람직한 재조합 미생물로는 판토테네이트 키나아제 돌연변이체가 있다. 판토에이트 또는 판토테네이트가 생산되는 조건에는 각각 목적 판토에이트 또는 판토테네이트의 생산을 초래하는 임의의 조건이 포함될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 β-알라닌이 생산되는 조건하에서 아스파테이트-α-데카르복실라제를 과다발현하는 미생물을 배양하는 것을 포함하는 β-알라닌의 생산 방법을 포함한다. 바람직하게는, 아스파테이트-α-데카르복실라제-과다발현 미생물은, 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제, 케토판토에이트 리덕타제 및 판토테네이트 신테타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 판토테네이트 생합성 효소를 코딩하는 핵산 서열에 돌연변이를 가지고 있다.
또한, 본 발명은 β-알라닌이 생산되는 조건하에서 아스파테이트를 포함하는 조성물을 단리된 바실러스 아스파테이트-α-데카르복실라제 효소와 접촉시키는 것을 포함하는 β-알라닌의 생산 방법 (예를 들어, 시험관내 합성 방법)에 특징이 있다.
생물형질전환 반응에 사용되는 미생물(들) 및(또는) 효소들은 이들이 의도된 기능 (예를 들어, 목적 화합물의 생산)을 수행할 수 있게 해주는 형태로 존재한다. 미생물은 전세포일 수도, 또는 원하는 최종 결과를 얻는 데 필수적인 세포의 부분만일 수도 있다. 미생물은 현탁 (예를 들어, 완충 용액 또는 배지와 같은 적당한 용액 중에), 세정 (예를 들어, 미생물을 배양하지 않은 배지로 세정), 아세톤-건조, 고정 (예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 또는 k-카라게난 (carrageenan)으로, 또는 비드 및 매트릭스 등과 같은 합성 지지체 상에), 고착, 가교결합 또는 투과 (예를 들어, 기질, 중간체 또는 생성물과 같은 화합물이 보다 쉽게 막 또는 벽을 통과할 수 있도록 투과 막 및(또는) 벽을 가짐)될 수 있다.
정제 또는 비정제된 CoA 생합성 효소(들) (예를 들어, CoaA 및(또는) CoaX), 판토테네이트 생합성 효소(들) 및(또는) 발린-이소루이신 생합성 효소(들)도 생물형질전환 반응에 사용될 수 있다. 이 효소는 자신의 의도된 기능 (예를 들어, 원하는 화합물을 얻음)을 수행할 수 있게 해주는 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 이 효소는 유리된 형태 또는 고정된 형태일 수 있다. 정제 또는 비정제된 CoA 생합성 효소(들), 판토테네이트 생합성 효소(들) 및(또는) 발린-이소루이신 생합성 효소(들)은 1종 이상의 시험관내 반응에서 원하는 생성물이 생산되도록 적당한 기질(들)과 접촉할 수 있다.
적어도 상기 기재된 방법 (예를 들어, 본 발명의 생산 방법)에 관하여는, 본 발명의 한가지 이상의 측면이 하기의 특징을 갖는다: 방법이 코리네박테리움속의 미생물 및(또는) 에셰리키아속의 미생물을 사용하지 않는 실시양태; 방법이 에셰리키아 콜라이 및 코리네박테리움 글루타미쿰으로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물을 사용하지 않는 실시양태; 방법이 그람 음성 미생물을 사용하지 않는 실시양태; 사용된 미생물이 코리네박테리움속의 미생물 및(또는) 에셰리키아속의 미생물로부터 유래한 분자, 유전자 또는 단백질을 포함, 발현 또는 생산하지 않는 실시양태; 미생물이 에셰리키아 콜라이 및 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유래한 분자, 유전자 또는 단백질 (예를 들어, 생합성 효소)을 포함, 발현 또는 생산하지 않는 실시양태.
XI. 스크리닝 분석
CoA는 박테리아에서 필수적인 인자이기 때문에, CoA의 생합성에 관여하는 단백질 (예를 들어, 효소)은 신규 항생제를 연구하는 데 있어서 가치있는 수단을 제공한다. 특히, CoaX 단백질은 포유류의 판토테네이트 키나아제 효소와 1차 서열에서의 유사성이 전혀 없기 때문에, 살균성 화합물을 찾아내는 데 있어서 가치있는 표적이다. 따라서, 본 발명은 조절 물질, 즉 CoaX 에 결합하거나, 또는 CoaX 발현 또는 CoaX 활성에 자극 또는 억제 효과를 나타내는 후보 화합물, 시험 화합물 또는 시약 (예를 들어, 펩티드, 펩티드 유사체, 소분자 또는 다른 약물)을 찾아내기 위한 방법 (또한 본원에서 "스크리닝 분석"이라고도 언급)을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CoaX 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부에 결합할 수 있는 후보 또는 시험 화합물을 스크리닝하는 분석법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 CoaX 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부를 조절할 수 있는 후보 또는 시험 화합물을 스크리닝하는 분석법을 제공한다. 본 발명의 시험 화합물은 생물학적 라이브러리; 공간적으로 접근 가능한 평행 고상 또는 용액상 라이브러리; 탈회선 (deconvolution)이 필요한 합성 라이브러리 방법; '1-비드 1-화합물' 라이브러리 방법; 및 친화 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법을 포함하는, 당업계에 공지된 병용 라이브러리 방법 중 다수의 접근법을 이용하여 얻을 수 있다. 생물학적 라이브러리 접근법은 펩티드 라이브러리로 한정되는 반면, 다른 4가지 접근법은 펩티드, 비-펩티드 올리고머 및 화합물의 소분자 라이브러리에 적용할 수 있다 (문헌 [Lam, K.S. (1997)Anticancer Drug Des.12:145] 참조).
분자 라이브러리의 합성을 위한 방법의 예는 문헌 [DeWittet al.(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.90:6909; Erbet al.(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:11422; Zuckermannet al.(1994).J. Med. Chem.37:2678; Choet al.(1993)Science261:1303; Carrellet al.(1994)Angew. Chem. Int. Ed. Engl.33:2059; Carellet al.(1994)Angew. Chem. Int. Ed. Engl.33:2061; 및 Gallopet al.(1994)J. Med. Chem.37:1233]에서 찾아볼 수 있다. 화합물의 라이브러리는 용액 중에서 (예를 들어, 문헌 [Houghten (1992)Biotechniques13:412-421] 참조), 또는 비드에서 (문헌 [Lam (1991)Nature354:82-84] 참조), 칩에서 (Fodor (1993)Nature364:555-556), 박테리아에서 (문헌 [Ladner USP 5,223,409] 참조), 포자에서 (Ladner USP '409), 플라스미드에서 (문헌 [Cullet al.(1992)Proc Natl Acad Sci USA89:1865-1869] 참조) 또는 파지에서 (문헌 [Scott and Smith (1990)Science249:386-390; Devlin (1990)Science249:404-406; Cwirla et al.(1990)Proc. Natl. Acad. Sci.87:6378-6382; Felici (1991)J. Mol. Biol.222:301-310; Ladner, 상기 문헌] 참조) 나타날 수 있다.
한 실시양태에서, 분석법은 CoaX 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부를 발현하는 재조합 미생물을 시험 화합물과 접촉시킨 후, 시험 화합물의 CoaX 활성 조절능을 측정하는 미생물-기재의 분석법이다. 시험 화합물의 CoaX 활성 조절능은 모니터링, 예를 들어 세포내 포스포판토에이트 또는 CoA 농도 또는 분비된 판토테네이트 농도 (CoaX를 억제하는 화합물이 시험 미생물에서의 판토테네이트 축적을 초래하기 때문)를 모니터링함으로써 측정할 수 있다. CoaX 기질은 CoaX 활성 조절을, 표지된 기질의 중간체 또는 생성물로의 전환을 검출함으로써 측정할 수 있도록 방사성동위원소 또는 효소적 표지로 표지할 수 있다. 예를 들어, CoaX 기질은32P,14C 또는3H로, 직접 또는 간접적으로 표지할 수 있으며, 방사성동위원소는 방사선 방출의 직접 계수에 의해 또는 섬광 계수에 의해 검출할 수 있다. 별법으로, 화합물의 CoaX 활성 조절능은 리포터 유전자 (루시퍼라제와 같이 검출 가능한 마커를 코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 CoA-반응성 조절 성분을 포함)의 유도를 검출함으로써, 또는 CoA-조절 세포 반응을 검출함으로써 측정할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 스크리닝 분석법은 CoaX 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부를 시험관내에서 시험 화합물과 접촉시킨 후, 시험 화합물이 CoaX 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부에 결합하거나 그 활성을 조절하는 능력을 측정하는 무세포 분석법이다. 바람직한 실시양태에서, 분석법은CoaX 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부를 공지된 기질과 접촉시켜 분석 혼합물을 형성하고, 이 분석 혼합물을 시험 화합물과 접촉시킨 후, 시험 화합물이 기질 상에서 CoaX의 효소 활성을 조절하는 능력이 있는지 측정하는 것을 포함한다.
스크리닝 분석법은 미생물, 단백질 및(또는) 반응물을 함유하는 임의의 용기에서 수행할 수 있다. 그러한 용기의 예로는 마이크로타이터 플레이트, 시험관 및 미세-원심분리 튜브가 포함된다. 본 발명의 상기 분석법 중 하나 이상의 실시양태에서, CoaX 단백질 또는 CoaX 단백질을 발현하는 재조합 미생물을 고정시켜 생성물 및(또는) 기질의 분리를 촉진할 뿐 아니라 분석법의 자동화를 도모하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라제/CoaX 융합 단백질은 글루타티온 세파로스 비드 (Sigma, Chemical, St. Louis, MO) 또는 글루타티온 유도 마이크로타이터 플레이트에 흡착될 수 있다. 단백질을 매트릭스 상에 고정시키기 위한 다른 기술 (예를 들어, 바이오틴-접합 및 스트렙타비딘 고정 또는 항체 접합)도 본 발명의 스크리닝 분석법에 이용될 수 있다.
다른 실시양태에서, CoaX 발현의 조절 물질은, 세포를 후보 화합물과 접촉시키고 세포에서 coaX mRNA 또는 CoaX 폴리펩티드의 발현을 측정하는 방법으로 찾아낼 수 있다. 후보 화합물 존재하의 발현량을 후보 화합물 부재하의 (또는 적당한 완충액 대조군 또는 표준과 같은 적합한 대조군에 대한) 발현량과 비교한다. 그 후, 상기 비교를 토대로 후보 화합물이 coaX mRNA 또는 CoaX 폴리펩티드 발현의 조절 물질인지 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 스크리닝 분석법에 의해 확인된 신규 약제에 관한 것이다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같이 확인된 약제를 적당한 동물 모델에 이용하는 것도 본 발명의 범위에 포함되는 것이다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 확인된 CoaX 조절제 (예를 들어, 항균성 화합물)를 감염 동물 모델에 사용하여 그러한 약제로의 치료에 대한 효능, 독성 또는 부작용을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되는데, 이 실시예가 본 발명을 제한하기 위한 것으로 해석해서는 안된다. 본 출원을 통해 인용된 모든 참고문헌, 특허, 특허 출원 (1999년 9월 21일 출원된 미국 특허 출원 제09/400,494호 (계류중), 2000년 6월 7일 출원된 미국 특허 가출원 제60/210,072호, 2000년 7월 28일 출원된 미국 특허 가출원 제60/221,938, 및 2000년 8월 24일 출원되고 본 출원과 관련된 미국 특허 가출원 제60/227,860호 포함) 및 공개된 특허 출원은 이 거명을 통해 본 명세서에 참고문헌으로 포함되는 것이다.
일반 방법론:
균주.본 발명 바실러스 서브틸리스 균주는 보통 2가지 균주 중 하나에서 유래된 것이다. 첫번째 균주는 "168", "1A1" 또는 "RL-1"로 다양하게 불린다. 유전자형은trpC2이다. 이 균주는 야생형 "Marburg" 균주를 돌연변이 유발시켜 얻은 것으로 바실러스 서브틸리스에 대한 많은 분자 생물학적 연구의 토대가 된 것이다. 두번째 균주는 야생형 균주 W23으로부터 형질도입에 의해 Trp+로 만든 PY79 (168의 원영양성 유도체)이다.
배지.바실러스 서브틸리스의 표준 최소 배지는 1 x 스피지젠염 및 0.5% 글루코스로 이루어진다. 표준 고상 "강화 배지"는 트립톤 혈액 한천 배양액(디프코사 제품)이고, 표준 액상 "강화 배지"는 VY (송아지 육액 및 효모 추출물의 혼합물)이다. 액상 시험관 배지에서의 판토테네이트 생산 시험에서는 소위 "스페셜 VY" 또는 "SVY"라 불리는 VY의 강화형 배지를 사용한다. 회분 발효에는 SVYG 및 PFMG를 사용한다. 이 배지의 조성은 하기에 제공된다.
VY, 액상 강화 배지: 디프코 송아지 육액 25 g, 디프코 효모 추출물 5 g, 물 1 리터 (가압 멸균처리)
TBAB, 고상 강화 배지: 디프코 트립톤 혈액 한천 배양액 33 g, 물 1 리터 (가압 멸균처리).
MIN, 최소 배지: 10 x 스피지젠염 100 ml; 50% 글루코스 10 ml; 10% 아르기닌 HCl*10 ml; 0.8% 트립토판**10 ml; 물 / 총 1 리터. (*경우에 따라, 아르기닌은 생략하거나 최종 농도 0.04%의 글루탐산 나트륨으로 대체. 일반적으로 최소 배지에서 바실러스 서브틸리스는 아르기닌, 글루타민, 글루타메이트 또는 프롤린과 같은 특정 아미노산을 보조 질소원으로 첨가하면 더 빨리 증식한다). (**트립토판 영양요구성 균주의 경우는 대부분의 최소 배지에 트립토판을 통상 첨가함).
10 x 스피지젠염: K2HPO4ㆍ3H2O 174 g; (NH4)2SO420 g; KH2PO460 g; Na3시트레이트ㆍ2H2O 10 g; MgSO4ㆍ7H2O 2 g; 물 / 총 993 ml; 그 다음에 FeCl3용액 3.5 ml및 미량 원소 용액 3.5 ml를 첨가
FeCl3용액: FeCl3ㆍ6H2O 4 g; Na3시트레이트ㆍ2H2O 197 g; 물 / 총 1 리터 (필터 멸균처리).
미량 원소 용액: Na2MoO4ㆍ2H2O 0.15 g; H3BO32.5 g; CoCl2ㆍ6H2O 0.7 g; CuSO4ㆍ5H2O 0.25 g; MnCl2ㆍ4H2O 1.6 g; ZnSO4ㆍ7H2O 0.3 g; 물 / 총 1 리터 (필터 멸균처리).
SVY, 스페셜 VY, 시험관 배지에서의 판토테네이트 생산 시험을 위한 보충*강화 배지: 디프코 송아지 육액 25 g; 디프코 효모 추출물 5 g; 글루탐산 나트륨 5 g; 황산 암모늄 2.7 g; 물 740 ml (가압 멸균처리); 1 M 인산 칼륨 200 ml 첨가, pH 7.0; 50% 글루코스 60 ml. (*액상 SVY 시험관 배지에서의 판토테네이트 생산 시험에서는 필터 멸균처리한 원액으로부터 5 g/L 농도의 Na α-케토이소발레레이트 및(또는) β-알라닌을 첨가할 수 있다).
PFMG, 발효기에서 사용된 효모 추출물 배지: 앰브렉스 1003TM효모 추출물 20 g; 글루탐산 나트륨 5 g, 황산 암모늄 2g; 트립토판 5 g; KH2PO410 g; K2HPO4ㆍ3H2O 20 g; MgCl2ㆍ6H2O 1 g; CaCl2ㆍ2H2O 0.1 g; 시트르산 나트륨 1 g; FeSO4ㆍ7H2O 0.01 g; 미량 원소 용액 1 ml; 글루코스 20 g; 물 / 총 1 리터. 글루코스 또는 다른 당은 필요에 따라 공급함. 공급액에는 무기질, 특정 등급 또는 식품 등급의 영양소가 함유될 수 있다.
PF, 판토테네이트 영양요구성 시험을 위한 화학적 특정 판토테네이트 무함유 배지: 10 x 스피지젠염 100 ml; 1 x 디프코 판토테네이트 분석 배지 100 ml; 50% 글루코스 10 ml; 물 / 총 1 리터.
판토테네이트 영양요구성인 경우는, 일반적으로 강화 배지에는 바실러스 서브틸리스pan돌연변이체를 유지하는데 판토테네이트가 충분치 않기 때문에 1 mM Na 판토테네이트를 최소 배지 및 강화 배지 둘 다에 첨가한다. 5 mg/L 클로람페니콜, 100 mg/L 스펙티노마이신 HCl, 15 mg/L 테트라싸이클린 HCl, 또는 1 mg/L 에리쓰로마이신 및 25 mg/L 린코마이신을 이용하여 항생물질 내성 선별을 한다.
판토테네이트 분석: 생물학적 분석.표지 생물체인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 증식에 판토테네이트가 필요하며 낮은 농도(㎍/L)에도 반응한다. 따라서, 단계 희석액을 이용하여 넓은 농도 범위를 분석할 수 있다. 시판되는 배지 (예, 판토테네이트 분석 배지 (PAM), 디프코)을 사용할 수 있다. 그러나, 판토테네이트를 보충한 디프코 PAM은 프레쉬-믹스드 버전 판토테네이트 분석 배지 (FM-PAM, 디프코의 특정한 개별 성분들로 구성됨)을 이용하여 얻을 수 있는 것과 동일한 수준으로 증식시키지 못한다. 따라서 통상 FM-PAM이 시판 제품 대신에 사용된다.
바실러스 서브틸리스 배지 상청액의 분석 전에 바실러스 서브틸리스 세포를 제거 또는 사멸시켜야 한다. 바실러스 서브틸리스 배지 상청액은 상청액을 가압 멸균처리했을 때의 판토테네이트 역가가 필터 멸균처리했을 때의 역가와 대략 동일하다. 따라서, 통상의 절차에는 생물학적 분석 5 분 전의 시료 가압 멸균처리를 포함시킨다.
판토테네이트 분석: HPLC 분석.파장 197 nm 및 기준 450 nm의 검출기를 이용해 HPLC로 판토텐산 생산량을 측정하였다. 이 방법은 휴렛 팩커드의 수용성 비타민에 대한 권장 방법의 변형법이다. 배양액 시료를 같은 용적의 60% 아세토니트릴 (ACN)에 희석하고 원심분리하고 여과한다. 통상, 분석 전에 추가로 10배 희석을 하여 최종 20배 희석한다. 더 고농도의 생성물은 더 희석한다. 화합물을 C18 페노메넥스 5μ 아쿠아 250 x 4.6 mm 컬럼 상에서 50 mM 인산 나트륨 완충액 중의 5% 아세토니트릴 (ACN) (pH 2.5)를 이용해 분리한다. 5%에서 95%에 이르는 ACN 구배로 매번 시료 마다 컬럼을 세척한다. 판토테네이트 피크의 면적은 농도 5 내지 1000 mg/L에 비례한다. 다른 판토-화합물도 분리하고 이 방법으로 정량분석한다.
아미노산 분석: HPLC 분석.발효 전과정에 걸쳐 발효 배지 중에 존재하는 아미노산을 파장 338 nm 및 기준 390 nm의 검출기를 이용하여 HPLC에 의해 측정한다. 이 방법은 휴렛 팩커드의 아미노산 분석용 권장 방법의 변형법이다. 배양액 시료를 판토-화합물 분석에서와 동일하게 조제한다. 화합물을 C18 하이퍼실 5 μ ODS 200 x 2.1 mm 컬럼 상에서 분리한다. 용매 A는 20 mM 아세트산 나트륨 완충액 (pH 7.2)이다. 용매 B는 40% ACN 및 40% 메탄올을 함유한다. 용매 A 100%에서 용매 B 100%로의 구배를 통해 아미노산을 분리하고 매번 시료 마다 컬럼을 세척한다.
회분 발효.판토테네이트 생산 균주를 교반 탱크 발효기 (예, 작업 용량 10 리터의 CF3000 케맵 14 리터 반응기)에서 증식시킨다. 시판되는 소프트웨어 (예,B. Braun Biotech MFCS 소프트웨어)를 이용해 컴퓨터 제어 및 데이터 수집을 수행한다. 발효는 회분 공정이 가능하며, 글루코스를 제한한 유가 발효 공정이 바람직하다. 몇몇 배지 성분(예, SVYG 및 PMFG의 배지성분)을 발효기에 첨가하고 거기서 멸균시킨다. 배지의 일부는 따로 멸균처리하여 발효기에 무균 첨가한다. 이 방법은 당업자에게 널리 알려진 방법이다. 추가의 질소원을 따로 멸균처리하여 냉각후 탄소원에 첨가한다.
처음에 첨가된 배지 중의 당은 대략 6시간이 지나면 소비된다. 그 후에는 필요에 따라 무기물질과 특정 등급 또는 식품 등급의 영양소와 함께 글루코스 또는 다른 당을 첨가한다. 또는, 이전의 발효 과정에서 얻은 시료로부터의 일치되는 영양 요구 프로파일을 토대로 공급 계획을 짠다.
접종 후에 비교적 저속(예, 200 rpm)으로 교반한다. 용존 산소 (pO2)가 30%가 되면 컴퓨터 제어에 의해 용존 산소 농도가 25 내지 30% pO2를 유지하도록 교반 속도를 자동 조정한다.
<실시예 I: panBCD 유전자 산물을 과다발현하는 박테리아를 이용한 판토-화합물의 생산 증진>
이 실시예는 바실러스 서브틸리스panBCD오페론의 클로닝 및panBCD유전자 산물을 과다발현하는 미생물의 제조를 설명한다.
바실러스 서브틸리스panBCD오페론을 클로닝하기 위해 바실러스 서브틸리스 GP275 (168의 유도체) 게놈 DNA의 플라스미드 라이브러리를 이. 콜라이BM4062(birA ts )에 형질전환시키고, 42 ℃에서 온도 내성 클론을 선별하였다. 제한 지도를 게놈 서열과 비교하여 하나의 특정 클론이 바실러스 서브틸리스birA유전자 및 그에 인접한panBCD유전자를 함유하는 것으로 추정하였다. 이 플라스미드를 pAN201로 명명하였다.
panBCD오페론을 과다발현시켜 판토테네이트를 생산하기 위하여,panBCD오페론의 천연 프로모터를 바실러스 서브틸리스 박테리오파지 SP01 유래의 강한 구성적 프로모터 2가지 중 하나로 대체하였다. 이 두 프로모터는P 26 및P 15 이다. 또한, 두 개의 인공 리보솜 결합 부위 (RBS) 중 하나를 이용해 천연panBRBS를 대체했다. 이 두 개의 인공 RBS(서열 49 및 서열 50)은panBCD의 번역을 증진시킬 것으로 예측된 것으로 서열은 표 1A에 나타내었다. 이렇게 조작된panBCD발현 카셋트 3 개를 이. 콜라이에서 복제가능한 환상 플라스미드에 넣어 형성하였다. 이 플라스미드의 다른 특징에는 이. 콜라이 리보솜 RNA 전사 단위로부터의 강한 rho-의존성 전사 터미네이터(T1T2), pC194 유래의 그람-양성 클로람페니콜 내성 유전자 (cat) 및 이. 콜라이 레플리콘과 바실러스 서브틸리스 내로 도입하려는 목적 단편 간의 연결지점에 위치한 한쌍의NotI 제한 부위가 포함된다. pAN004, pAN005 및 pAN006의 세 플라스미드 시리즈를 구성하였다. pAN004는P 26 프로모터, RBS1 및 낮은 카피수 이. 콜라이 레플리콘을 함유한다. pAN005는P 15 프로모터와 낮은 카피수 레플리콘을 함유하는데, 이 프로모터는 우리 경험상P 26 , RBS1 및 낮은 카피수 레플리콘만큼 강력하지 못하다. pAN006은P 26 프로모터, RBS2 및 중간 카피수 레플리콘을 함유한다.
상기 언급된 3 개의 플라스미드에 함유된 3 개의panBCD발현 카셋트를 모두, 천연상태에서 천연panB유전자의 바로 상류에 존재하는 서열로 이루어진 DNA 단편에 라이게이션시키고 단일한 카피로 동종 재조합에 의해 바실러스 서브틸리스 균주 RL-1 및 PY79의panBCD좌위 내로 도입시켜 야생형 오페론을 대체하였다. 이 과정은 2 단계로 수행하였다. 먼저,panB코딩 영역의 약 2/3를 그람-양성 스펙티노마이신 내성 유전자 (spec)로 대체하는 결실-치환부위를panB에 도입하여 Spec-, 판토테네이트 영양요구주를 만들었다. pAN004, pAN005 및 pAN006의panBCD발현 카셋트를panB의 바로 상류에 위치하는 염색체 서열을 함유한 DNA 단편에 라이게이션한 후에 상기 중간 균주를 상기 카셋트로 형질전환시켰다. 얻어진 카셋트의 판토테네이트 원영양성 선별을 수행하였다. 생성된 균주를 PA221, PA222 및 PA223 (RL-1 유래의 균주) 및 PA235, PA232 및 PA233 (PY79 유래의 균주)로 각각 명명하였다. PA221 내에 도입된 균주 내의 연결된 상류 서열을 함유하는 플라스미드의 예는 pAN240이다 (도 2 참조). pAN240의 뉴클레오티드 서열은 서열 76에 나타내었다.
적당한 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄 반응을 통해 상기 조작된 균주의 정확한 염색체 구조를 확인하였다. 균주 PA221의 추출물을 SDS-PAGE로 조사한 결과 2종의 단백질이 과다발현되었음이 관찰되었다. 한 단백질은 겉보기 분자량이29,000 달톤이었고 다른 단백질은 39,000 달톤이었다. 29,000 달톤 밴드는 아마도 PanB (추정 분자량 29,761)일 것이다. 더 큰 단백질 밴드는 PanC (추정 분자량 31,960 달톤)일 것이다.
이들 균주의 시험관 배지 내에서의 판토테네이트 생산 능력은 다음과 같이 평가하였다. 각각의 균주를 SVY 배지(α-케토이소발레레이트 (α-KIV) 5 g/L 및 β-알라닌 5 g/L를, 이들 전구체가 제한되지 않도록 보충함)에서 증식시켰다. 배양 상청액을 가압 멸균처리하고 생물분석법을 이용해 분석하였다. 모균주인 RL-1 및 PY79에 비해 이 조작된 균주는 약 8배 내지 30배 더 많은 판토테네이트를 생산하였다(어떤 경우에는 1 g/L 판토테네이트에 달함).
5 g/ℓ의 α-KIV 및 5 g/ℓ의 β-알라닌을 함유하는 SVY 배지에서 액상 시험관 배양된 조작된 비. 서브틸리스 균주에 의한 판토테네이트 생산
실험 균주 프로모터 panB에서의 RBS [판토테네이트]㎎/ℓ
1 RL-1 천연 천연 30
PA221 P26 RBS1 990790
PA222 P15 RBS1 250250
PA223 P26 RBS2 790790
2 PY79 천연 천연 40
PA235 P26 RBS1 930860
PA221 P26 RBS1 11001030
P 26 프로모터는P 15 프로모터보다 약 3배 내지 4배가 효과적인 한편, RBS1 및RBS2는 대략 동등하다. pAN004, pAN005, pAN006과 같은 플라스미드는 또한 고리 형태로 캄벨형 (단일 교차) 도입에 의해 바실러스 서브틸리스 야생형panBCD좌위에 재조합하여 5 mg/L 클로람페니콜 내성 선별하는 것도 가능하다. 이러한 방식으로 얻어진 균주는 각각의 PA221, PA222 및 PA223 균주와 거의 동일량의 판토테네이트를 생산한다.P 26 프로모터, RBS1 및 낮은 카피수 이. 콜라이 레플리콘을 함유하는 pAN004는 도 3A에 도식적으로 나타내었다. 플라스미드 pAN004의 뉴클레오티드 서열은 서열 93에 나타내었다.P 26 프로모터, RBS2 및 중간 카피수 이. 콜라이 레플리콘을 함유하는 pAN006은 도 3B에 도식적으로 나타내었다. 플라스미드 pAN006의 뉴클레오티드 서열은 서열 94에 나타내었다.panBCD의 뉴클레오티드 서열은 서열 59에 나타내고, PanB, PanC 및 PanD의 추정 아미노산 서열은 각각 서열 24, 서열 26 및 서열 28에 나타내었다. 바실러스를 조작하는 방법은 예를 들어, 이 거명을 통해 그의 내용이 본 명세서에 포함되는 문헌[Harwood, C.R. and Cutting, S.M. (editors), Molecular Biological Methods for Bacillus (1990) John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, England]에 기재되어 있다.
<실시예 II: panE1 유전자 산물(케토판토에이트 리덕타제)를 과다발현하는 박테리아를 이용한 판토-화합물의 생산 증진>
이 실시예는 바실러스 서브틸리스panE1유전자의 클로닝 및panE1유전자 산물을 과다발현하는 미생물의 제조를 설명한다.
Pan-바실러스 서브틸리스 균주 (예, 판토텐산 합성과정이 차단된 바실러스서브틸리스 돌연변이체)를 미리 단리하였다. 이 중 하나는 케토판토에이트 리덕타제 활성이 손상된 것으로 보고되었다. 문헌[Baigoriet al. (1991)J. Bacteriol. 173:4240-4242]. 그러나, 이들 균주의 돌연변이는panE또는panBCD유전자를 함유하지 않는 바실러스 서브틸리스 유전자 지도의purE-tre인터발에 잘못 맵핑된 것이었다. 또한, 하기 나타낸 바와 같이,panE돌연변이체는ilvC유전자 산물이 이. 콜라이와 같은 다른 박테리아 균주에서처럼 바실러스 서브틸리스에서panE유전자 산물을 대체할 수 있기 때문에 Pan-표현형을 갖는 것이 아니다. 보다 최근에 에스. 티피무리움panE유전자의 위치가 밝혀졌고, 혐기성 퓨린 생합성의 필수 유전자인apbA의 대립 유전자라고 결정되었다. 문헌[Frodymaet al. (1998)J. Biol. Chem.273:5572-5576]. 이. 콜라이는 동일 지도 위치에서는 매우 높은 상동성의 유전자를 갖는다. 이. 콜라이 및 에스. 티피무리움에서의panE유전자는ilvC유전자 산물 (아세토히드록시산 이소메로리덕타제)도 또한 케토판토에이트 리덕타제 반응을 수행할 수 있다는 사실 때문에 확인하기가 복잡하다. 결과적으로panE및ilvC모두가 돌연변이되지 않는 한은 판토테네이트 영양요구주가 얻어지지 않는다.
바실러스 서브틸리스panE1유전자를 확인하기 위해, 이. 콜라이 또는 에스. 티피무리움 ApbA (PanE)의 단백질 서열을 이용해 바실러스 서브틸리스 게놈을 조사하여 2개의 오픈 리딩 프레임이 ApbA와 상동성임이 밝혀졌다, 즉ylbQ및ykpB. 이 유전자들은 판토테네이트 생합성에 기능을 하는 것으로 추정되므로panE1및panE2로 다시 명명하였다. 주형으로 RL-1 게놈 DNA를 이용해 제조한 PCR 산물로서panE1및panE2모두를 클로닝하였다. 이 두 유전자를 스펙티노마이신 내성 유전자(spec) 또는 클로람페니콜 내성 유전자(cat)를 이용해 손상시켰다. 손상된 유전자를 각각 이중 교차에 의해 PY79에 도입하여 PA240(△panEl::spec) 및 PA241(△panE2::cat)를 얻었다.△panEl::spec함유 PA240이 TBAB 상에서 1 mM 판토테네이트 보충물을 첨가하였을 때보다 판토테네이트를 첨가하지 않았을 때 더 천천히 성장하기 하였지만, 판토테네이트-무함유 (PF) 평판 상에서 시험하였을 때 이들 균주 중 어느 것도 판토테네이트 영양요구주가 아니었다. 비교한 결과△panB::spec균주는 TBAB 상에서 단일한 콜로니를 생성하지 않았는데, 이는 바실러스 서브틸리스가 판토테네이트에 대한 능동적 흡수 시스템을 갖고 있지 않기 때문인 듯하다.
바실러스 서브틸리스 유전자인ilvC가 이. 콜라이에서 입증된 바와 같이panE에 대한 작용을 할 수 있다는 가정이 수립되었다. 따라서panE1및panE2손상체를 CU550 균주 (trpC2 ilvC4 leuC124라고 알려짐)내에 도입하였다. 싱글panE1및 더블panE1,panE2손상체 둘 다 PF 배지 상에서 판토테네이트 영양요구주였다.
풍부 및 규정 배지에서 다양한 panE1 및 panE2의 표현형
균주 배지 증식*:-pan +pan
PY79 TBABPF +++++ +++++
PA240 TBAB specPF +++ +++++
PA241 TBAB camPF +++++ +++++
CU550 TBABPF +++++ +++++
PA256 TBAB specPF -- +++++
PA258 TBAB spec, camPF -- +++++
* 각각의 "+"는 37℃에서 하룻밤 후 1 mm 직경의 콜로니를 나타낸다.
즉,panE1및ilvC를 둘 다 돌연변이시키면 판토테네이트 영양요구주가 얻어지는 반면,panE1만을 돌연변이시키면 이. 콜라이와 에스. 티피무리움에 대해 보고된 바와 마찬가지로 영양요구주가 얻어지지 않는다.
다음, 판토테네이트 과생산 균주 (본 명세서에 기재된 PA235)에서의panE1및panE2녹아웃의 정량적 영향을 연구하였다.panE1및panE2손상체를 PA235에 각각 또는 함께 도입하여 PA245 (△panE1::spec), PA248 (△panE2::cat) 및 PA244 (△panE1::cat,△panE2::spec)를 생산하였다. 그 다음, 각각의 돌연변이가 판토테네이트 생산에 미치는 영향을 액상 시험관 배지로 시험하였다.
panE1 및 panE2 손상체를 함유하는 PA235 유도체에 의한 판토테네이트 생산
균주 [pan] ㎎/ℓ PA235의 ％
PA235 990 (100)
PA235 940 95
PA245 59 6
PA245 82 8
PA248 1060 106
PA248 1030 104
PA244 25 3
PA244 50 5
이리하여, 결실 분석 결과는 판토테네이트 생산량의 90% 이상이panE1유전자에 의한 것이며,panE2의 결실은 판토테네이트 생산에 큰 영향이 없음을 나타냈다. 따라서, 바실러스 서브틸리스에서 케토판토에이트 리덕타제 활성의 대부분 (반드시 전부는 아니지만)이panE1로 인한 것이라고 결론지어진다. 나머지 케토판토에이트 리덕타제 활성은ilvC에 의한 것이라고 생각된다.
panE1이 판토테네이트 생산에 중요한 유전자임이 확인되었으므로panE1발현의 증가가 PA221 또는 PA235와 같은 균주에서 판토테네이트 생산을 증대시킬 수 있는지를 시험하였다.bpr좌위 (비필수 프로테아제 유전자) 또는 클로닝된 삽입체의 좌위에 도입 및 증폭하도록 고안된 pOTP61 벡터 안의P 26 프로모터 및 RBS2 하류에panE1코딩 서열을 위치시켰다. 생성된 플라스미드 pAN236 (도 4)를 PA221 내로 형질전환시키고, 15 mg/L의 테트라싸이클린 내성 선별을 하였다. pAN236의 뉴클레오티드 서열은 서열 77로 나타내었다. PA236로 명명한 한 형질전환체를 다음의 연구를 위해 선택하였다.
PA236는 약 31,000 달톤(panE1단백질의 예상 분자량 33,290에 근접한 값)의 단백질을 과다발현하였다. 간략히, 전체 세포 추출물을 PY79, RL-1, PA221, PA221/pOTP61 및 PA236 (2개 샘플)로부터 조제하였다. 세포 추출물은 겔 전기영동을 통해 분리하고 겔을 쿠마시로 염색하여 단백질을 가시화했다.panE를 과다발현하도록 조작된 셀(PA236-1 및 PA236-2)에서는 분자량이 ~31,000 달톤 (분자량 마커와 비교한 결과)인 밴드가 나타났다. 또한 PA221 및 PA236은panB유전자 산물에 해당하는 ~29,000 달톤 밴드 및panC유전자 산물에 해당한다고 여겨지는 ~39,000 달톤의 밴드를 증가된 수준으로 발현시켰다. 또한 pAN006으로 형질전환된 이. 콜라이(도 3B)는panB및panC유전자 산물과 연관이 있는 밴드를 발현하였고, PAN236로 형질감염된 이. 콜라이는panE유전자 산물에 해당하는 ~31,000 달톤 밴드를 발현하였다.
그 다음, PA236을 빈 벡터 pOTO61을 함유하는 PA221과, β-알라닌 5 g/L 및 α-KIV 5 g/L를 보충한 액상 시험관 배지에서의 판토테네이트 생산능에 대해 비교하였다.
액상 시험관 배지에서의 조작된 균주에 의한 panE1 및 panE2 과다발현이 판토테네이트 생산에 미치는 영향
균주 추가의 플라스미드 과다발현된 유전자 [판토테네이트] ㎎/ℓ
PA221 pOTP61 없음 1,000940
PA236 pAN236 panE1 2,0302,050
A238 pAN238 panE2 530680
panE1의 과다발현은 모균주와 비교하였을 때 판토테네이트 생산량을 2배 증가 시킨 반면(예컨대, 2 g/L를 약간 넘는다),panE2의 과다발현은 모균주보다 판토테네이트 생산량이 약 35% 더 적은 균주를 제공하였다.panE1뉴클레오티드 서열및 추정 아미노산 서열은 서열 29 및 서열 30에 나타내었다.
<실시예 III: 발린 존재하에 panE1 또는 panBCD 를 과다발현하는 박테리아를 배양함으로써 판토-화합물의 생산량 증대>
panBCD오페론 및panE1를 과다발현하도록 조작된 균주에서 배지 보충성분 (예컨대, α-KIV의 대체 성분)으로서 기능하는 발린의 능력을 평가하였다. 발린은 아미노기전환에 의해 α-KIV과 밀접하게 관련이 있으며, α-KIV보다 저렴하고, 킬로그램 단위로 시판되고 있다. SVY 배지 중의 표준 액상 시험관 배지에서 α-KIV 를 발린으로 대체했다. 발린 농도는 5 내지 50 g/L이다. 5 g/L의 발린은 판토테네이트 생산의 촉진 면에서 α-KIV보다 약간 덜 효과적이지만, 10 또는 20 g/L 의 발린은 판토테네이트 생산 촉진이 5 g/L α-KIV 와 동등하거나 더 우수하다.
<실시예 IV-X 전구체-독립적 방식으로 판토테네이트를 생산할 수 있는 미생물의 제조>
(panBCD를 과다발현하도록 조작된) PA221 및 PA235, 및 (panBCD및panE1을 과다발현하도록 조작된) PA236은 최대 판토테네이트 생산을 달성하기 위해서는 α-케토이소발레레이트 (α-KIV) (또는 발린) 및 아스파테이트 (또는 β-알라닌)을 공급해야 한다. 이 두 전구체가 판토테네이트 합성의 제한 인자이기 때문이다. 따라서, 판토테네이트 생산에서 판토테네이트 생합성의 제한 전구체를 공급할 필요가 없도록 미생물을 고안해야 한다. 이러한 균주는 다양한 판토테네이트 생합성 경로의 중간물질 생산에도 유용하다.
<실시예 IV: 아스파테이트- (또는 β-알라닌)-독립적 방식으로 판토테네이트를 생산할 수 있는 미생물의 제조>
panD유전자를 바실러스 서브틸리스 발현 벡터 pOtP61에 클로닝시켜 pAN423을 구성하였다 (도 5). pAN423의 뉴클레오티드 서열은 서열 78에 나타내었다.panD를 함유하는NotI 제한 단편을 pAN423으로부터 단리하여 자체 라이게이션하고 이를 이용해 PA221을 형질전환시켰다. Tet15, Tet30및 Tet60내성이 있는 형질전환체를 단리하여 다음 분석을 위해 저장하였다.
6개의 pAN423 형질전환체와 2개의 대조군 형질전환체를 10 g/L 아스파테이트 함유 및 무함유의 5 g/L α-KIV를 함유하는 SVY에서 증식시킨 다음 판토테네이트 생산을 분석하였다 (표 6).
아스파테이트 첨가시 및 무첨가시 PanD 과다발현이 판토테네이트 생산에 미치는 영향
배지*(PA221 형질전환체) Asp(10 g/ℓ) TetR**(㎍/㎖) OD550 [pan](㎎/ℓ)
pOTP61-1 - 60 8.0 76
pOTP61-2 - 60 7.7 91
423#1-1 - 15 8.5 180
423#1-2 - 15 8.0 150
423#1-3 - 30 8.3 220
423#1-4 - 30 8.5 280
423#1-5 - 60 8.9 580
423#1-6 - 60 8.8 280
pOTP61-1 -- 60 7.5 380
pOTP61-2 - 60 6.9 560
423#1-1 - 15 8.5 1200
423#1-2 - 15 8.6 1000
423#1-3 - 30 8.8 1200
423#1-4 - 30 9.0 1200
423#1-5 - 60 9.0 1200
423#1-6 - 60 9.0 1200
* 시험관 배양물을 SVY + α-KIV (5 g/ℓ)(표시한 경우는 Asp (10 g/ℓ) 함유) 중에서 증식시킴
** TetR = 형질전환체의 대략적인 Tet-내성
pAN423 형질전환체는 판토테네이트를 대조군보다 적어도 2배 이상 생산하였다 (즉, 앞선 시험에서 β-알라닌을 배지에 첨가하여 얻은 정도의 또는 그에 근접한 수준). 이 데이터는 또한, 아스파테이트를 첨가하지 않아도 추가의panD유전자 발현 카셋트 카피를 함유하는 형질전환체는 대조군 형질전환체보다 많은 판토테네이트를 생산함을 보여 주고 있다. 한 형질전환체 423#1-5는 대조군보다 약 5배 많은 양의 판토테네이트를 생산하였다. 이 결과는 증가된 양의 PanD 단백질이 이용가능한 아스파테이트의 β-알라닌으로의 전환을 촉진하여,panD유전자 발현의 증가가 아스파테이트를 첨가한 경우 및 첨가하지 않은 경우 모두에서 판토테네이트 생산을 증진시킬 수 있음을 나타낸다.
형질전환체 423#1-5는 균주 PA401로 재명명하여 다음의 진탕 플라스크 발효에서 연구하였다. 진탕 플라스크 배지는 글루코스 함유 SVY가 아니라 말토스 함유 SVY를 사용했다. 진탕 플라스크 실험의 결과는 처음 24 시간 동안은 시험관 시험과 아주 일치했다. β-알라닌 무첨가 진탕 플라스크 시험에서는 PA401이 24 시간에 판토테네이트를 약 1.5 g/L를 생산하였다. β-알라닌을 배지에 첨가하여도 판토테네이트 역가가 더 개선되지 않았는데 (표 7), 이는 상기 균주와 배양 조건에서 β-알라닌이 판토테네이트 생산 제한 인자가 아님을 의미한다. 사실, β-알라닌이 공급되지 않는 경우에 PA401이 상당한 양의 β-알라닌을 배지에 분비하는 것을 관찰할 수 있다.
β-알라닌 함유 및 무함유 PA401 (panD) 균주가 담긴 플라스크 배양물을 진탕시킴
아미노산 (g/ℓ) 24 시간
초기β-ala첨가량 β-ala Val pH OD600 판토테네이트(g/ℓ)
0 0.7 1.5 7.5 13.7 1.5
5 g/ℓ 7.1 1.4 7.6 12.4 1.5
각 수치는 진탕 (200 rpm)하면서 37℃에서 인큐베이션한 배지 50 ㎖가 담긴 250 ㎖ 밀봉 플라스크 2개조의 평균값이다.
기본 배지: SVY (10 g/ℓ α-KIV, 30 g/ℓ 말토스 함유)
2％ 접종물: SVY (Tet15하에 24 시간 증식시킴)
<실시예 V: 아스파테이트 데카르복실라제의 합성을 더 증진하고 판토테네이트의 생산을 증진하기 위한 panD 유전자의 조작>
이 실시예는panD유전자내에 개선된 리보솜 결합 부위 (RBS)를 만들어panDmRNA의 번역을 증진시키는 것을 기재하고 있다.
합성 panD RBS의 제조에 의한 panD 유전자 mRNA의 번역 증진 방법
pAN423에서panD를 발현하는 데 사용되는 RBS (서열 88)은 합성 RBS이고 이를 이용하여 바실러스 서브틸리스의 다른 단백질을 성공적으로 높은 수준으로 생산할 수 있었다. 그러나, 이 서열은 "이상적인" 바실러스 서브틸리스 RBS (서열 45) (예, 바실러스 서브틸리스 리보솜 내의 16S RNA 서열과 상보적인 서열을 갖는 RBS)과 정렬 분석하였을 때 6개의 미스매치 부분을 가지고 있다. (예컨대, 표 1B 참조. 진한색이 미스매치 부분). 2개의 새로운 RBS를 이상적인 RBS를 보다 근접하게 모방하도록 고안하였다. 새로운 디자인 A (NDA) 및 새로운 디자인 B (NDB)(이하, RBS3 및 RBS4로 언급함)로 명명한 이 합성 RBS를 서열 51 및 52에 나타내고 표 1B의 이상적인 RBS와 정렬 분석하였다.
각각의 새로운 RBS의 상부 및 하부 가닥에 대응하는 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 어닐링한 다음 이를 이용하여 pAN420 내의 RBS를 대체함으로써 플라스미드 pAN426 및 pAN427을 제조하였다. 이 작제물은 도 6에 나타내었다. pAN426 및 pAN427 내의 NDA 및 NDB RBS의 존재는 DNA 서열 분석을 통해 확인하였다. 그 다음, pAN426 및 pAN427로부터의panD유전자를 도 7에 도시한 바실러스 서브틸리스 발현 벡터 pOTP61에 도입하여 pAN428 및 pAN429를 만들었다. pAN429의 뉴클레오티드 서열은 서열 79에 나타내었다.
NotI 제한 단편이 결핍된 이. 콜라이 벡터 서열을 pAN428 및 pAN429로부터 단리하여, 자체 라이게이션시키고, 이를 이용하여 PA221 균주에 Tet15내성 형질전환을 시켰다. Tet60내성인 4개의 단리물을 각각의 형질전환체로부터 골라 판토테네이트 및 β-알라닌 생산능을, 빈 벡터(pOTP61)로 형질전환된 PA221 및 pAN423 (균주 PA401)로 형질전환된 PA221과 함께 분석하였다. (참조 표 8).
5 g/l의 α-KIV (α-KIV5)를 보충한 배지에서 증식시켰을 때, pAN428-1 형질전환체 및 모든 4개의 pAN429 형질전환체가 PA401보다 많은 양의 판토테네이트를 생산하였고, 이는 이들 형질전환체가 더 높은 수준의 아스파테이트 데카르복실라제 활성을 가짐을 시시하는 것이다. α-KIV5및 Asp10을 보충한 배지에서 증식시켰을 때, pAN428 또는 pAN429 형질전환체 어느 것도 PA401보다 판토테네이트를 많이 생산하지 못했다. 그러나, pAN428-1 형질전환체 및 모든 4개의 pAN429 형질전환체는 PA401보다 상당히 많은 양의 β-알라닌을 생산하였다. 아스파테이트 첨가로 인해 생산된 과잉의 β-알라닌이 판토테네이트 생산의 억제를 야기할 가능성이 있다. 또는 판토에이트가 이들 균주의 제한 인자가 되어 β-알라닌이 축적될 수도 있다.
최대량의 β-알라닌을 생산한 균주인 pAN428-1 및 pAN429-4 형질전환체를 각각 PA402 및 PA403로 재명명하였다. 이 두 균주를 각종 중간체를 보충한 SVY 배지에서 증식시키고, 판토테네이트 및 β-알라닌 생산을 재분석하였다. PA221 및 PA401를 대조군으로 포함시켰다. 분석 결과는 표 9에 나타내었다.
α-KIV5또는 판토에이트5중 하나를 보충한 배지에서 증식시켰을 때, PA402 및 PA403는 PA401보다 상당히 많은 양의 판토테네이트를 생산하였다. 이전과 마찬가지로, α-KIV5및 Asp10를 보충한 배지에서 증식시켰을 때 PA402 및 PA403이 PA401보다 상당히 많은 양의 β-알라닌을 생산하였지만, 판토테네이트가 비례하여 증가하지는 않았다. 그러나, 판토에이트5와 Asp10를 보충한 배지에서 증식시켰을 때는, PA402 및 PA403 둘 다 PA401보다 상당히 많은 양의 판토테네이트를 약 30% 증가된 양을 생산하였다.
상기 실험을 통해, pAN428 및 pAN429내로 각각 도입된 개선된 NDA 및 NDBpanD리보솜 결합 부위가 아스파테이트 데카르복실라제 활성을 증가시킨다는 결론을 얻을 수 있다.
panBCD 오페론 내에 합성 panD RBS를 도입함으로써 panD 유전자 mRNA의 번역 증진
PA221 (및 본 명세서에 기재된 여타의 조작된 판토테네이트 생산 균주) 중에 존재하는P 26 panBCD오페론 카셋트에 있는 천연 바실러스 서브틸리스panD유전자 리보솜 결합 부위 (RBS) (서열 43)을 표 1C에 이상적인 리보솜 결합 부위 (서열 47)과 정렬 분석하여 나타내었다. 이 정렬 결과는 PanC의 코딩 서열 내에 위치하는 천연 바실러스 서브틸리스panD유전자 RBS와 이상적인 RBS 사이에 미스매치 부분이 있음을 보여준다. 3개의 새로운 RBS(P 26 panBCD오페론 카셋트 내의)를 만든결과,panD유전자 mRNA의 번역을 증진시키고 아스파테이트 데카르복실라제의 합성을 증가시켰다. 이 합성 RBS (명칭 NDI, NDII, 및 NDIII, 또한 본 명세서에서는 각각 RBS5, RBS6 및 RBS7로도 언급)는 각각 서열 55, 서열 56 및 서열 57에 나타내었고 표 1C에 포함되어 있다.panBCD오페론 내의panDRBS의 변화도 이 오페론에 의해 코딩되는 PanC 단백질의 C-말단 아미노산 서열을 변화시키지만, 공지의 추정 PanC 단백질 아미노산 서열들을 정렬 분석을 통해 보았을 때 임의 보존 아미노산 잔기에 영향을 주지 않고 바실러스 서브틸리스 PanC 단백질의 최종 9개 아미노산 서열이 변형될 수 있음(이는 이러한 변화가 판토테네이트 합성 활성 또는 발현을 저하시키지 않음을 의미)에 주의해야 한다. 이 새로운 RBS를 하기와 같이 합성하여P 26 panBCD오페론 발현 카셋트내로 도입시켰다.
먼저, 다음의 요소들을 함유하는 PCR 프라이머를 고안하였다: (1) PCR을 통해panD내에 미리 도입한 유일한BsiWI 제한 부위까지의 처음 5개의 PanD 아미노산을 코딩하는 핵산 서열; (2)panC의 종결 코돈 (3) 1개 이상의 합성 RBS; 및 (4)panDRBS 상류의panC와 100% 동일성을 보이는 30-39 bp의 핵산 서열. 이 프라이머는 TP102, TP103, 및 TP104로 명명하였고 NDI, NDII, 및 NDIII 리보솜 결합 부위를 각각 함유한다. 이 3개의 프라이머를panC의 개시 코돈 근처에 혼성화하는 5' 프라이머 TP101과 함께 이용하여 3번의 독립적인 PCR 반응을 통해 NDI, NDII, 및 NDIII PCR 산물을 제조하였다. 이 PCR 산물을 정제하고,XbaI로 절단한 다음, 플라스미드 벡터 pASK-1BA3 (XbaI 및SmaI로 미리 절단) 내로 클로닝하였다. 생성된플라스미드를 pAN431, pAN432, 및 pAN433으로 명명하였다. pAN431 구조는 도 8에 나타내었고 이는 3개의 플라스미드 구조 모두를 대표한다. 각각의 새 플라스미드에 목적하는 합성panD유전자 RBS가 존재하는 지는 DNA 서열분석을 통해 확인하엿다.
그 다음, 새로운panDRBS를 함유하는 변형된panC유전자를, 유일한BsiWI 제한 부위를 활용하는panD유전자와 합하였다. pAN431, pAN432 및 pAN433으로부터 적당한NsiI-BsiWI 제한 단편을 단리하고 이를BsiWI-변형panD유전자를 제공하는 pAN420로부터의 2395 bpNsiI-BsiWI 제한 단편과 라이게이션하여 수행하였다. 이 구성으로 플라스미드 pAN441, pAN442, 및 pAN443을 각각 얻었다. 대표적인 구조(pAN441)을 도 9에 나타내었다. pAN443의 뉴클레오티드 서열은 서열 80에 나타내었다.
이 새로운panD유전자 RBS로P 26 panBCD오페론 발현 카셋트를 하기와 같이 치환하였다. 먼저,panDRBS 함유panC영역을 제거하는 결실-삽입 돌연변이를 수행하였다.BspE1 및BglII의 혼합물로 pAN430을 절단하고panC의 3' 말단 및panD의 5' 말단이 결실된 4235 bp 단편을 회수하여 수행하였다. 이 단편을 플라스미드 pECC4로부터의AvaI-BamHI 제한 단편(클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (cat) 유전자 함유)과 라이게이션시켰다.AvaI 절단에 의해 생성된 5' 연장부는BspEI에 의해 생성된 연장부와 양립가능하며BglII 및BamHI 연장부들도 또한 양립가능하다. 생성된 플라스미드를 pAN440로 명명하였고 그의 구조는 도 10에 나타내었다.
동종 재조합을 통해, 선형화된 pAN440로 PA221를 형질전환시키고 1 mM 판토테네이트 함유 Cam5평판 상에서 클로람페니콜 내성 선별을 함으로써P 26 panBCD오페론 내로 결과의 결실-삽입 부위를 교차시켰다. 몇개의 형질전환체를 시험한 결과, 모두가 예상한 대로 증식에 1 mM 판토테네이트를 필요로 하였다. 이 형질전환체 중 2개를 PA408A 및 PA408B로 재명명하고 판토테네이트 생산능을 분석하였다. 어느 균주도, 심지어 판토에이트 및 β-알라닌 (5 g/L)를 함유한 배지에서 증식시켰을 때도 측정할 수 있는 양의 판토테네이트를 생산하지 못했다. 이는 이들 균주의 판토테네이트 합성능이 결손되었음을 의미한다. 그 다음, PA408을 선형화된 pAN441, pAN442, 및 pAN443 플라스미드 DNA로 형질전환시키고 판토테네이트 보충 없이 TBAB 평판 상에서 증식 선별함으로써 새로운panDRBS를P 26 panBCD오페론 내로 교차시켰다. 선형화된 pAN430 (천연 panD RBS 포함)로의 형질전환이 대조군으로 포함되며 이는 본 명세서에서 기재된 PA221와 동일한 형질전환체를 생성할 것으로 예상된다. 각각의 형질전환으로부터 4개의 단리물을 각종 중간체가 보충된 SVY 배지에서의 판토테네이트 및 β-알라닌 생산능을 분석하였다. (표 10 및 11).
PA221를 이용한 앞선 실험에서 예상되는 바와 같이, 천연panDRBS를 함유한 형질전환체 중 어느 것도 판토에이트를 보충한 배지에서 측정가능한 양의 판토테네이트를 생산하지 못했다. 그러나 변형된panDRBS를 함유하는 것으로 예상되는 12개의 형질전환체 중 9개가 이 조건하에서 상당한 양의 판토테네이트 (160-230 mg/l)를 생산하였다. 이는 상기 형질전환체의 아스파테이트 데카르복실라제 활성이 증대되었음을 의미한다. 판토에이트 및 아스파테이트 모두를 보충한 배지에서 증식시킬 때는 상기 9개의 형질전환체가 천연panDRBS 함유 형질전환체보다 약 4배 더 많은 양의 판토테네이트를 생산하였다. 또한, 이 9개의 형질전환체는 측정가능한 양의 β-알라닌 (230-410 mg/l)을 측정하였다. 모든 형질전환체는 판토에이트 및 β-알라닌 함유 배지에서 증식될 때 대략 동등한 양의 판토테네이트를 생산하였다. 즉, 각각이 기능적 판토테네이트 합성효소를 함유하고 있음이 입증된다.
이 데이터는 합성panDRBS가panD유전자 mRNA의 번역을 지시하는 데 천연panDRBS보다 약 4배 더 효과적임을 입증하며 이러한 합성 RBS가 판토테네이트 생산에 유용성이 있다는 증거가 된다. 판토테네이트 생산을 증가시키는 또다른 방법으로는 예를 들어,panD유전자 mRNA의 반감기 증가,panD전사 프로모터의 강도 증가 및(또는) PanD 단백질의 안정성 증가 등이 있다.
<실시예 VI: 항생물질 내성 유전자 무함유의 도입된 P 26 panE1 카셋트를 함유하는 균주의 구성>
실시예 II는 바실러스 서브틸리스에서 대부분의 케토판토에이트 리덕타제 활성을 담당하는 효소를 코딩하는 바실러스 서브틸리스panE1유전자의 확인에 관해 기재한다. PA236 (pAN236 플라스미드 함유)는 24시간 SVY 시험관 배양 시에 모균주인 PA221 (1 g/l)에 비해 약 2배 더 많은 판토테네이트(2 g/l)를 생산하였다. 테트라싸이클린 내성을 통해 선별한 PA236는 증폭된 (~3 카피) 도입된 pAN236 플라스미드를 함유하는 것으로 추정된다 (pAN236 플라스미드 상에서P 26 panE1카셋트 외에 tetR 유전자 산물도 코딩된다).panE1좌위에 단 하나의 도입된 증폭할 수없는P 26 panE1카피를 함유한 균주, 예를 들어 균주내에 항생물질 내성 유전자가 없는 균주도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 이러한 균주는 다음과 같이 제조하였다.
플라스미드 pAN251는 pAN236으로부터,P 26 panE1카셋트의 바로 상류 및 바로 하류에 추가의 염색체 서열을 삽입함으로써 만들었다.P 26 panE1카셋트의panE1위치에 이중 교차에 의한 도입이 가능한 정도의 상동성을 지닌 추가의 서열은 주형으로서의 염색체 DNA로부터 PCR하여 얻었다. pAN251은 도 11에 나타내었다. pAN251의 뉴클레오티드 서열은 서열 81에 나타내었다.
그 다음, 도입되는P 26 panE1카셋트를 선별할 수 있는 균주를 구성하였다. 이 균주에는 다음 3개의 요소를 포함시켰다: (1)P 26 panBCD; (2)△panE1; 및 (3)ilvC - (panE1및ilvC둘 다 Pan-표현형을 갖도록 반드시 돌연변이시켜야 하기 때문임). 출발 균주는 CU550 (trpC2, ilvC4, leuC124)이었다. PA221 염색체 DNA로부터의P 26 panBCD카셋트를 두 단계로 도입하여 균주 PA290를 만들었다. 이어서,△panE1::spec를 PA240 균주로부터의 염색체 DNA를 이용하여 PA290에 형질전환시켜 엄격한 판토테네이트 영양요구성인 균주 PA294 (trpC2, ilvC4, leuC124, P 26 panBCD, △panE1::spec)를 얻었다. 마지막으로 판토테네이트 원영양성 선별을 위해 PA294를 플라스미드 pAN251로 형질전환시켜 균주 PA303을 얻었다. 이 균주는유전자형trpC2, ilvC4, leuC124, P 26 panBCD, P 26 panE1를 갖는 것으로 예상된다. PA303이panE1좌위에 정확한 염색체 구조를 갖는지panE1의 바로 상류에 위치한P 26 삽입부 양끝의 프라이머를 이용한 PCR을 통해 조사했다. PA303으로부터의 PCR 산물은 예상대로의 크기를 가졌고, 동시에 야생형panE1유전자로부터 이 PCR 산물의 손실이 있었고 이는 목적하는 이중 교차가 일어났다는 것과 일치한다. 그러나, PA303는 테트라싸이클린 감수성이어서 또한, 플라스미드의 염색체내로의 캄벨형 단일 교차와는 반대로 목적하는 이중 교차가 일어났다는 것과 일치한다. 모균주로부터의trp,ilv, 및leu영양요구성이 모두 PA303에서 유지되었다.
24 시간 액상 SVY 시험관 배지에서, PA303은 표 12에 나타낸 바와 같이 양성 대조군 PA236와 거의 동일한 수준의 판토테네이트를 생산했고 조작된panE1를 함유하지 않는 PA221의 약 2배의 판토테네이트를 생산했다.
SVY + 5 g/ℓ α-KIV 및 5 g/ℓ β-알라닌 중에서 증식시킨 PA303 및 대조군의 24시간 시험관 배양에 의한 판토테네이트의 생산
균주 OD600 [pan] g/ℓ
PA221-1 10.9 0.85
PA221-2 10.5 0.85
PA236-1 9.5 1.74
PA236-2 9.3 1.70
PA303-1 10.8 1.66
PA303-2 10.7 1.61
실시예 VII: α-KIV (또는 발린)에 독립적인 방식으로 판토테네이트를 생산할 수 있는 미생물의 생성
판토테네이트 합성이 탈조절화된 특정 균주에 있어서 α-케토이소발레레이트 (α-KIV)는 판토테네이트의 생산 속도를 제한하는 중간 물질이다. α-KIV 또는 발린 5 g/ℓ를 PA221과 같은 균주가 있는 시험관 배지에 첨가함으로써, 판토테네이트 생산이 약 5배 정도 증가하였다. α-KIV 또는 발린 주입에 대한 필요성을 덜기 위해, α-KIV의 합성 능력을 증가시킨 균주를 유전공학적으로 제작하였다.
비. 서브틸리스에서 α-KIV는ilvB및ilvN,ilvC및ilvD의 4개의 유전자에 의해 코딩된 세 효소의 연속 작용을 통해 피루베이트로부터 합성된다. 야생형 비. 서브틸리스에서, 상기 유전자 중 셋 (ilvB, ilvN 및 ilvC)은 거대ilv-leu오페론의 첫 번째 세 유전자이다. α-KIV 합성에 필요한 제4의 유전자,ilvD는 염색체 상에서 다른 부분에 홀로 위치하고 있다. 비. 서브틸리스ilv-leu오페론은 오직 루이신의 양에 의해 조절되는 것으로 여겨진다. 외부에서 루이신을 주입하면ilv-leu오페론의 전사작용이 약 13배 정도 감소하며, 이는 아마도 전사감쇠 기전에 의한 것으로 보인다 (문헌 [Grandoniet al. (1992)J. Bacteriol. 174:3212-3219] 참조). 루이신에 의한leuA유전자 산물의 저해 작용은ilv-leu경로에서 알려진 유일한 피드백 조절이다.
α-KIV 합성을 탈조절화하는 제1 단계로서, 야생형 비. 서브틸리스ilv-leu오페론의ilvBNC영역 1 카피를 PCR에 의해 단리하고, pOLL8 벡터 (amyE좌위에서 이중 재조합에 의해 단일 P26발현 카세트를 삽입하도록 설계됨) 상의 P26프로모터및 RBS2 근처에 삽입하였다.amyE유전자는 비필수 α-아밀라제를 코딩하며, 발현 카세트를 도입하기에 유용한 좌위이다. 생성된 플라스미드인 pAN267은 도 12에 도시되어 있다. pAN267의 뉴클레오티드 서열은 서열 82에 기재되어 있다. pAN267은 하기 상세히 기술한 바와 같이 비. 서브틸리스 균주의amyE좌위에서의 이중 교차에 의해 안정한 형질전환체를 용이하게 얻도록 한다.
루이신 원영양주인 판토테네이트 과생산 균주의 제작
처음에,ilvC4및ΔpanE1을 포함하는 비. 서브틸리스 균주를 사용하여 항생제 내성 유전자를 이용하지 않고 염색체 내에 P26 panE1단일 카피를 도입하였다. P26 panE1카세트가 도입된 개체를 선별하기 위해서는 이중 돌연변이가 필요한데, 이는ΔpanE1돌연변이만으로는 판토테네이트 영양요구주가 생성되지 않기 때문이다.ilvC4를 포함하는, CU550으로 명명된 균주를 얻어, 이를 본 유형의 균주 제작을 위한 기재로 사용하였다. 그러나, CU550도 근접하게 연관된leuC124돌연변이를 포함하므로, 따라서 CU550으로부터 유래된 모든 균주는 루이신을 필요로 하였다.P 26 panBCD및P 26 panE1의 조합이 판토테네이트 생산에 바람직한 것으로 알려져 있어서, 다음 단계에서는 루이신 원영양주 내에서 두 카세트를 상기 조합으로 재조립하였다.
따라서, 두 카세트는 두개의 다른 균주 배경인 RL-1 및 PY79에서 조합되었다. 항생제 내성 유전자를 이용하지 않고 염색체P 26 panE1을 PY79 및 RL-1 균주 배경 내로 도입시키기 위해,ilvC4에 의존하지 않는 전략을 이용하였다. (상기 전략은ΔpanE1돌연변이가 판토테네이트 브래디트로프 (bradytroph)를 일으켜 TBAB (풍부) 플레이트 상에서 상대적으로 작은 콜로니로 나타난다는 관찰 결과를 이용한 것이다). 우선,ΔpanB::cat및ΔpanE::spec을 두 균주 배경으로 도입하였다. 그 후, 생성된 균주를 PA221 (P 26 panBCD) 및 PA303 (P 26 panE1)의 두 균주로부터의 DNA로 동시에 형질전환하고, TBAB 플레이트 상에서 Pan+에 대해 선별하였다. 콜로니는 선별 플레이트 상에서 두개의 구별된 크기로 자랐으며, 보다 큰 크기의 콜로니가 전체 콜로니의 약 2％를 구성하였다. 보다 큰 콜로니는P 26 panBCD및P 26 panE1을 모두 수용한 동시-형질전환체를 나타내는 것이고, 보다 작은 콜로니는P 26 panBCD만을 수용한 것으로 추정되었다. 이러한 예측에 부합하여, 보다 큰 콜로니는 Camr및 Specr둘 모두가 결실되었으나, 보다 작은 콜로니는 오직cat유전자만이 결실되고,spec유전자는 보유하였다. 또한, PA327로 명명된 PY79의 대표적인 유도체와 PA328로 명명된 RL-1의 대표적인 유도체 둘 모두 시험관 배양에서 판토테네이트를 상승된 수준으로 생산하였으며, 그 양은 1.6 내지 1.7 g/ℓ이었다 (표 13).
SVY와 α-KIV 5 g/ℓ 및 β-알라닌 중에서 증식시킨 24시간의 시험관 배양으로부터 PA327, PA328 및 대조군의 판토테네이트 생산
균주 균주 배경 P26 panE1의 카피수 [판토테네이트] g/ℓ
PA221-1 RL-1 0 0.92
PA221-2 RL-1 0 0.95
PA236-1 RL-1 증폭됨 (약 3) 1.60
PA236-2 RL-1 증폭됨 (약 3) 1.73
PA327-1 PY79 1 1.66
PA327-2 PY79 1 1.65
PA328-1 RL-1 1 1.61
PA328-2 RL-1 1 1.91
따라서, PA327 및 PA328은P 26 panBCD및P 26 panE1둘 모두를 함유하는 것으로 결론지었으며, 하기 기술한 바와 같이 추가의 작제물을 위해 사용하였다. PCR 분석으로 두 카세트의 존재를 확증하였다.
판토테네이트 과생산 균주의 두 세포주 내로 안정한 P26 ilvBNC 카세트 도입
P26 panBCD및P26 panE1를 함유하며 Leu+인 PY79 및 RL-1의 유도체, PA327 및 PA328을 제작하여, 다음 단계에서P26 ilvBNC의 안정한 카피를 도입하였다. 이는 PA327 및 PA328을 pAN267 플라스미드로 형질전환시키고, Specr에 대해 선별함으로써 수행하였다. PCR에 의한 스크리닝은 얻어진 형질전환체의 약 85％가 이중 교차에 의해amyE에 삽입된P 26 ilvBNC를 함유하고 있음을 나타내었다. PA340으로 명명된 PA327의 한 형질전환체 및 PA342로 명명된 P328의 한 혈질전환체를 추가 연구용으로 선택하였다.
β-알라닌 5 g/ℓ는 첨가하지만 α-KIV는 첨가하지 않은 SVY 배지 중의 시험관 배양에서, PA327 및 PA328의 양은 PA340 및 PA342 둘 모두의 생산량을 넘어서서, 예상했던 판토테네이트 생산의 증가를 일으켰으며, 그 양은 약 1.3 내지 2 g/ℓ이었다 (표 14).
β-알라닌 5 g/ℓ의 존재 및 α-KIV 5 g/ℓ의 존재 또는 부재 하의 SVY 중의 24시간 시험관 배양에서, 둘 다 P26 ilvBNC를 함유하는 PA340 및 PA342에 의한 판토테네이트 및 발린 생산
균주 균주 배경 OD600 [판토테네이트] g/ℓ [발린] g/ℓ
- α-KIV + α-KIV - α-KIV + α-KIV - α-KIV + α-KIV
PA340-1 PY79 11.8 7.1 2.02 2.10 0.38 0.90
PA340-2 PY79 10.3 7.5 1.97 2.03 0.40 0.91
PA342-1 RL-1 10.2 8.0 1.29 1.89 0.27 0.78
PA342-2 RL-1 9.6 9.2 1.34 2.04 0.21 0.79
또한, 두 신규 균주에서도 발린 분비가 약간 증가하여,ilvBNC유전자의 조절이 약화되었음을 나타내었다. 그러나, α-KIV 5 g/ℓ를 첨가하여 동일한 균주를 배양하는 경우, PA342로부터 추가의 판토테네이트 생산 증가가 일어나, α-KIV가 이 균주 배경에서 여전히 제한 인자임을 시사하였다. 진탕 플라스크 배양에서도 유사한 결과가 나타났으며, 단지 증식량이 높아지고 판토테네이트 농도가 더 높아졌을 뿐이다 (표 15).
β-알라닌 5 g/ℓ의 존재 및 α-KIV 5 g/ℓ의 존재 또는 부재 하의 SVY 중의 24시간 진탕 플라스크 배양에서, 둘 다 P26 ilvBNC를 함유하는 PA340 및 PA342에 의한 판토테네이트 및 발린 생산
균주 균주 배경 OD600 [판토테네이트] g/ℓ [발린] g/ℓ
- α-KIV + α-KIV - α-KIV + α-KIV - α-KIV + α-KIV
PA327 PY79 21 22 0.6 3.0 0.5 1.3
PA340-1 PY79 20 20 3.5 4.1 1.0 1.9
PA340-2 PY79 22 19 3.0 2.1 0.8 1.4
PA328 RL-1 20 16 1.4 2.7 0.6 1.3
PA342-1 RL-1 17 16 3.3 3.6 0.9 1.6
PA342-2 RL-1 18 18 3.1 4.2 0.8 1.4
실시예 VIII: panE1 및 ilvBNC 유전자 산물을 과생산하도록 유전자 조작된 균주 내에서 panD 카피수 증가는 판토테네이트 생산을 증가시킨다
β-알라닌이 조작된 비. 서브틸리스 균주의 배양액에 주입되는 경우의 실험에서는 β-알라닌이 판토테네이트 합성에서의 속도를 제한하는 중간 물질임을 일관되게 나타내었다.panD의 카피수 증가가 PA340 및 PA342의 판토테네이트 생산에 미치는 영향을 관찰하였다. PA340 및 PA342 균주를 PA401로부터 단리한 염색체 DNA로 형질전환하고 테트라싸이클린 15 ㎍/㎖가 함유된 플레이트 (Tet15플레이트) 상에서 선별하였다. 각 기원으로부터 유래된 형질전환체를 Tet60플레이트 상에 놓고 발현 카세트가 여러 카피로 함유되는 듯한 것들을 확인하였다. Tet60플레이트 상에서 증식한 각 형질 전환체로부터 형질전환체 12개를 단일 콜로니로 이 배지 상에 접종 획선을 긋고, 그 후 SVY 배지 시험관 배양에서 판토테네이트 생산에 대해 분석시험하였다. 각 군으로부터 한 형질전환체가 24시간 내에 판토테네이트 300 mg/ℓ초과량을 생산하는 것이 발견되었다. 이들 두 형질전환체를 저장하고, PA404(균주 배경은 PA340) 및 PA405 (균주 배경은 PA342)로 명명하였다. 두 균주 모두 스펙티노마이신에 내성이어서,P 26 ilvBNC발현 카세트가 여전히amyE부위에서 존재하고 있음을 나타내었다. 각 균주로부터 단리된 염색체 DNA의 PCR 분석 결과 탈조절된panE1유전자도 보유하고 있음을 확증하였다.
그 후, 말토스를 탄소원으로서 함유하며 다양한 중간체를 첨가한 SVY 배지에서 증식시킨 진탕 플라스크 배양물에서 PA404 및 PA405를 검증하였다. 상기 배양을 24시간 및 48시간동안 키우고, 그 후 판토테네이트, β-알라닌 및 발린 생산에 대해 분석시험하였다. 이 실험 결과가 표 16에 나타나 있다. 모균주 (PA340 및 PA342)에 대한 유사한 진탕 플라스크 배양 데이타를 비교용으로 포함시켰다.
진탕 플라스크 배양 24시간 후 PA404 및 PA405에 의한 판토테네이트 생산
균주 배지 보충성분 OD 600 판토테네이트g/ℓ β-알라닌g/ℓ 발린g/ℓ
PA340 없음 20 0.4 <0.1 1.0
PA404 없음 22 1.8 <0.1 0.7
PA342 없음 19 0.3 0.2 0.7
PA405 없음 19 1.4 0.4 0.5
PA340 β-알라닌5 18 3.6 3.2 0.6
PA404 β-알라닌5 18 2.8 5.1 0.7
PA342* β-알라닌5 17 3.3 3.3 0.5
PA405* β-알라닌5 19 1.3 6.5 0.6
*표식에 의해 나타낸 것을 제외하고, 상기 값들은 플라스크 2개의 평균값임.
임의의 배지 첨가물이 없는 경우, PA404 및 PA405는 24시간 내에 그의 동계 모균주에 비해 4 내지 5배 더 많은 판토테네이트를 생산하였다 (표 16). β-알라닌의 공급은 PA340 및 PA342 균주에서 명백하게 제한되었다. 증폭된P26 panD의첨가는 β-알라닌의 공급을 크게 증가시켰다.
실시예 IX: 비. 서브틸리스 ilvD 유전자에 대한 조절의 완화는 판토테네이트 생산을 상승시킨다
ilvD유전자 발현을 탈조절화하기 위해, 표준 방법 (상기 기술됨)을 이용하여 구성적P 26 프로모터 및 인공 리보좀 결합 부위인 RBS2를ilvD코딩 영역의 인접 상류에 삽입하였다.ilvD유전자는 단독으로 존재하며,ilvBNC오페론과 연관되어 있지 않다. 우선,ilvD코딩 영역 및 상류 서열 730 bp를 포함하는 RL-1 염색체의 2.4 kb 영역을 PCR에 의해 pOK12로 불리는 낮은 카피수 벡터 (이. 콜라이 세포 당 약 15 카피) 내로 클로닝하여 도 13에 도시된 pAN257 플라스미드를 얻었다.
천연ilvD유전자 프로모터의 인접 상류에 있는 천연EcoRI 부위 및ilvD출발 코돈에 있는 천연NcoI 부위를 이용하여,P 26 및 RBS2를 포함하는 인공 서열을 pAN257 내로 삽입하여 pAN263 (도 14)을 얻었다. pAN263의 뉴클레오티드 서열은 서열 83에 기재되어 있다. 이 작제물과 병행하여,cat유전자도 pAN257 내로 동일한 상류EcoRI 부위 및ilvD코딩 영역의 가운데에 있는BglII 부위 사이에 삽입하여ilvD유전자의 상당 부분이 결실된 pAN261을 얻었다 (도 15).
그 후, pAN261 및 pAN263을 이용하여 2 단계로P 26 ilvD카세트를 비. 서브틸리스 염색체에 삽입하였다. 첫 번째 단계에서, pAN261을 형질전환에 의해 도입하고, 클로람페니콜 내성으로 선별하고, 그 후 Ilv-표현형인지 확증하였다. 클로람페니콜 감수성에 대해 검사하고, 올바른 국부 구조인지 PCR에 의해 확증하였다.두번째 단계에서, pAN263을 도입하고, Ilv+를 선별하고, 클로람페니콜 감수성을 검사하고, 올바른 국부 구조인지 PCR에 의해 확증하였다.
우선, pAN261을 RL-1 균주 (수용성이 높음) 내로 형질전환하여 PA343 균주 (ΔilvD::cat)를 얻고, 그 후 PA343으로부터의 염색체 DNA를 이용하여 PA340 및 PA342를 Ilv-영양요구주로 형질전환시켜, 각각 PA348 및 PA349로 명명하였다. 비. 서브틸리스를 형질전환하는 경우, 염색체 DNA가 플라스미드 단량체보다 유전적으로 더 효율적이다. 유사하게, pAN263 DNA를 PA343 (수용성이 중간 정도임) 내로 형질전환하여 PA345 균주 (P 26 ilvD)를 얻고, 그 후 PA345 염색체 DNA를 이용하여 PA348 및 PA349를 Ilv+원영양주로 형질전환시켜, 각각 PA374 및 PA354로 명명하였다.
예상한대로, PA374 및 PA354는 판토테네이트 생산이 추가로 증가하여, β-알라닌 5 g/ℓ가 첨가된 SVY 중의 시험관 배양물에서 약 2.5 내지 2.9 g/ℓ이었다 (표 17).
β-알라닌의 부재 하에, PA374 균주 및 PA354 균주는 시험관 배양물에서 판토테네이트 약 0.2 g/ℓ만을 생산하여, PanD 활성이 주목할만한 속도 제한 단계임을 나타내었다.
이러한 한계를 경감시키기 위해, PA401 균주로부터의 증폭 가능한P 26 panD카세트를 삽입하였다. PA401 염색체 DNA를 PA374 및 PA354 내로 형질전환시키고, 테트라싸이클린 15 mg/ℓ에서 Tetr을 선별하여 PA377 및 PA365를 각각 얻었다. 형질전환체를 얻은 후, 상기 균주로 테트라싸이클린 30 및 60 mg/ℓ가 함유된 플레이트 상에서 접종 획선을 그어bpr좌위에 삽입된P 26 panD카세트의 카피수를 재증폭시켰다. α-KIV 또는 β-알라닌 부재 하의 SVY 중에서 증식한 시험관 배양물에서, PA374 및 PA354보다 실질적으로 증가한 판토테네이트 농도를 얻었다 (표 18 및19).
글루코스 존재 하의 SVY 중에서, β-알라닌 5 g/ℓ를 주입함으로써 판토테네이트 생산의 증가가 여전히 이루어졌으며, 이는panD발현의 추가적인 증가가 판토테네이트 생산을 증가시켰음을 시사하는 것이다. 말토스 존재 하의 SVY 중에서, β-알라닌을 주입함으로써 판토테네이트 생산의 증가가 추가로 나타나지 않았으며, 이는 β-알라닌 및(또는) 아스파르테이트 합성이 글루코스에 의해 억제되었음을 시사하는 것이다. PA377 및 PA365 균주는 10 리터 발효기에서 확인되었으며, 이들은 일반적으로 β-알라닌 및 α-KIV 또는 발린의 첨가없이 48시간동안 판토테네이트 20 g/ℓ초과량을 생산하였으며, 이는 하기에서 상세하게 설명하였다.
실시예 X: 판토테네이트-생산 미생물의 10 리터 발효
P 26 ilvBNC및P 26 ilvD카세트를 조작하여 PA342 및 PA354 균주를 얻음으로써 발린 또는 α-KIV를 발효 배지에 첨가하지 않고 판토테네이트를 각각 22 및 26 g/ℓ생산하는 것이 가능하였다 (표 20). 48시간에 두 균주 모두 배지 내로 발린 약 0.5 g/ℓ를 분비하였다.
발효기에서의 판토테네이트 생산
P 26 panD카세트를 PA354 및 PA374 균주에 첨가하여 PA365 및 PA377 균주를 생성시킴으로써, β-알라닌이나 α-KIV를 발효기에 첨가할 필요가 없었다. PA365 균주는 배지에 전구체를 첨가하지 않고 48시간에 판토테네이트 21 g/ℓ, 72시간에 27 g/ℓ를 생산하였다 (표 20). PA377은 좀더 나아서, 36시간에 판토테네이트 18 g/ℓ, 48시간에 22 g/ℓ, 72시간에 31 g/ℓ를 생산하였다. SVYG 배지 중에서 48시간에 발린은 PA365 및 PA377에서 각각 0.85 g/ℓ 및 1.5 g/ℓ로 측정되었다. PA377 균주는 대부분의 발효를 통해 발린은 1 내지 1.5 g/ℓ, β-알라닌은 0.2 내지 0.5 g/ℓ를 유지하였다.
PA377 균주를 10 리터 발효기에서 효모 추출물계 PFMG 배지 중에서 추가로평가하였다. PFMG 및 SVYG 배지의 판토테네이트 수율은 유사하였다. PFMG에서의 경우, PA377은 36시간에 판토테네이트 19 g/ℓ, 48시간에 25 g/ℓ, 72시간에 29 g/ℓ를 생산하였다. SVYG에서의 경우, PA377은 36시간에 판토테네이트 18 g/ℓ, 48시간에 31 g/ℓ, 72시간에 31 g/ℓ를 생산하였다.
실시예 XI: PA377 균주를 트립토판 원영양체로 전환
PY79로부터의 염색체 DNA를 사용하여 PA377 (Trp-)을 Trp+로 형질전환시켜 PA824 균주를 얻었다.P 26 panD카세트의 재증폭 후에, PA824의 판토테네이트 생산을 β-알라닌 5 g/ℓ의 존재 또는 부재 하의 SVY 글루코스 중의 시험관 배양을 통해 PA377과 비교하였다 (표 21).
Trp+균주는 PA377보다 약간 더 높은 밀도로 증식하였다. 외래의 β-알라닌 부재 하에서, 모든 균주는 판토테네이트를 유사한 수준으로 생산하였지만, β-알라닌을 첨가한 경우, Trp+유도체가 어느 정도 더 많은 판토테네이트를 생산하였다.
PA824의 발효기 실험
PA824를 작업 용량 10 리터의 CF3000 Chemap 14리터 용기 중에서 평가하였다. 발효기에서 사용된 매질 2종의 배합량은 표 22 및 23에 나타내었다.
모든 발효는 글루코스 제한 유가 배양법이었다. 접종 직후, 교반을 200 rpm으로 세팅하였다. 초기 회분의 글루코스 2％가 지수 증식기 동안에 소모되었다. 그 후, 60％ 글루코스 용액을 지속적으로 주입하여 글루코스 농도를 0.2 내지 1.0g/ℓ로 유지하였다. 다양한 속도의 주입 펌프가 컴퓨터로 제어되었으며 알고리즘에 의해 탱크 중 용해 산소 농도 [pO2]와 관련되었다. [pO2]가 30％로 떨어지면, 컴퓨터 제어가 자동으로 교반 속도를 조정하기 시작하여 용해 산소 농도를 25 내지 30％ [pO2]에서 유지되도록 하였다. 컴퓨터 제어 및 데이타 기록은 브라운 (Braun) MFCS 소프트웨어에 의한 것이었다.
한 실험에서, PA284를 표 22에서 기술한 배지로 발효기 내에 2개의 온도 (40℃ 및 43℃)에서 배양하였다. 두 실험 결과 초기 시점에서의 가장 높은 판토테네이트량이 43℃에서 생산되는 것으로 나타났다. 균체량은 43℃에서 56시간동안 OD600에서 150 광학 밀도 단위에 이르렀으며, 판토테네이트량은 36시간, 48시간, 72시간동안 각각 21 g/ℓ, 28 g/ℓ 및 36g/ℓ이었다. 40℃에서의 평행 발효에서, 균체량은 56시간동안 OD600에서 120 광학 밀도 단위에 이르렀으며, 판토테네이트량은 36시간, 48시간, 72시간동안 각각 18 g/ℓ, 26 g/ℓ 및 37g/ℓ이었다.
다른 실험에서, PA824를 표23에서 기술한 배지로 43℃의 발효기에서 배양하였다. 균체량은 36시간동안 OD600에서 160 광학 밀도 단위를 초과하였으며, 판토테네이트량은 24시간, 36시간, 48시간, 60시간동안 각각 23 g/ℓ, 34 g/ℓ, 37 g/ℓ 및 40 g/ℓ이었다. 다른 발효의 경우, 글루코스 주입 중 미량 원소의 양을 증가시켜 (예, SM의 농도를 1X에서 2X로 증가) 보다 높은 판토테네이트량을 얻었다.
실시예 XII: 비. 서브틸리스 coaA 유전자산물의 단리 및 특성화
"Subtilist" 웹사이트 상에서 이용 가능한 비. 서브틸리스 게놈 서열의 주석 버전에서는coaA로서 표지된 어떠한 유전자도 포함되지 않았다. 그러나, 이. 콜라이 판토테네이트 키나아제를 질의 서열로서 이용한 상동성 검색에서는 비. 서브틸리스 유전자인yqjS와 잘 매치되었으며, 이는 "알려져 있지 않음: 판토테네이트 키나아제와 유사"라는 주석이 있는 것이다. 이 유전자는 5개의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 오페론의 말단에서 두번째 유전자인 것으로 나타났다 (도 18). 상기 두 오픈 리딩 프레임은 D-세린 데히드라타제 및 "케토아실 리덕타제"와 유사하며, 다른 둘은 알려진 상동성을 가지고 있지 않다.coaA에 대응하는 오픈 리딩 프레임에 대해서, 가능한 출발 코돈이 세개 있으며, 이들 각각은 그에 연관된 가능한 리보좀-결합 부위 (RBS)를 가지고 있다. 상기 세개의 잠재적coaAORF를 가장 긴 것에서부터 가장 짧은 것 순으로coaA1,coaA2및coaA3으로 명명하였다.
세개의 잠재적coaA오픈 리딩 프레임 모두를 그들 각각의 RBS에 따라 클로닝하였고, 그 후 발현 벡터인 pAN229 내로 클로닝하였다. pAN229는 이. 콜라이의 낮은 카피수 벡터이며, SP01 파지P 15 프로모터를 통해 발현시키고 테트라싸이클린 선별을 통한 bpr에서의 단일 교차에 의해 삽입될 수 있다. 대표적으로 생성된 플라스미드인 pAN281을 도 19에 도시하고 있다.
클로닝된 잠재적coaAORF가 실재로 판토테네이트 키나아제 활성을 코딩하는지 결정하기 위해,coaA15 (Ts)대립 유전자를 포함하는 이. 콜라이 균주인 YH1 내로 상기 플라스미드 셋 모두의 수종의 단리물을 형질전환시켰다. 형질전환체로 플레이트 상에 접종 획선을 긋고, 30°및 43℃에서 배양하여 온도 감수성 대립 유전자의 상보성에 대한 시험을 하였다. pAN282의 단리물 하나를 제외하고, 세 coaA 변이체 모두의 단리물 모두 43℃에서 매우 상보적이었으며, 이는 세 플라스미드 작제물 모두 활성 판토테네이트 키나아제를 코딩하고 있음을 나타내는 것이다. 따라서, 비. 서브틸리스yqjS오픈 리딩 프레임은 활성 판토테네이트를 코딩한다고 결론내릴 수 있다.
실시에 XIII: 비. 서브틸리스 게놈으로부터 coaA 유전자의 결실
비. 서브틸리스의coaA유전자 (yqjS)를 비. 서브틸리스 균주의 염색체로부터 통상적인 방법에 의해 결실시켰다.coaA코딩 서열의 대부분을 플라스미드 클론으로부터 결실시키고, 클로람페니콜 내성 유전자 (cat)에 의해 치환하되, 상류 및 하류 서열의 약 1 kb를 남겨두어 염색체 내로 상동성 재조합이 일어나도록 하여 pAN296 플라스미드를 얻었다 (도 17 참조). 그 후, pAN296을 이용하여 비. 서브틸리스 균주 (PY79)를 형질전환시키고, 클로람페니콜 내성에 대해 선별하였다. 형질전환체 대부분은cat유전자로coaA유전자를 효과적으로 치환하는 이중 교차 결과를 나타내었다.coaA결실-cat삽입을 포함하는 형질전환된 균주는 본원에서 기술한 제2의 비. 서브틸리스 판토테네이트 키나아제의 존재로 인해 정상적으로 증식하였다.
실시예 XIV: 판토테네이트 키나아제 활성을 코딩하는 두번째 비. 서브틸리스 유전자의 단리 및 특성화
본 명세서에서 기술한 바와 같이, 판토테네이트 생산을 극대화하기 위해, 예를 들어 판토테네이트로부터 CoA로의 경로에서 첫 번째 효소인 판토테네이트 키나아제의 활성을 감소시킴으로써 코엔자임 A (CoA)로 향하는 판토테네이트의 흐름을 제한할 필요가 있다. 비. 서브틸리스의 염색체로부터 coaA 유전자를 결실시켜도 치사 결과를 나타내지 않는다는 발견을 한 후 (실시예 XIII), 판토테네이트 키나아제는 필수 효소 활성이기 때문에, 비. 서브틸리스는 활성 판토테네이트 키나아제를 코딩하는 제2의 유전자를 포함하고 있음에 틀림없다는 결론을 내렸다.
이. 콜라이 균주인 YH1 (coaA15 (Ts))을 비. 서브틸리스 유전자 뱅크와 상보성 분석을 하고 43℃에서 증식할 수 있는 형질전환체를 선별함으로써 제2의 판토테네이트 키나아제-코딩 유전자를 확인하였다. 상기 형질전환체 중에서 두 가지 군의 플라스미드가 발견되었는데, 각 군 내에서는 제한 효소 맵이 겹치지만, 군과 군 사이의 제한 효소 맵은 겹치지 않았다. 예상한 바와 같이, 한 군의 제한 효소 맵은 이. 콜라이coaA유전자의 상동체에 대해 비. 서브틸리스 게놈 서열 및 주변 서열로부터 예측된 것 (역시coaA로 명명됨 ,상기 참조)과 동일하였다. 다른 군은 첫 번째의 것과 완전히 겹치지 않는 제한 효소 맵을 가졌다.
두번째 군으로부터의 클로닝된 인서트 말단을 DNA 시퀀싱한 결과, 상기 클론은ftsH 유전자의 3' 말단,sul유전자의 5' 말단 및yacB,yacC,yacD,cysK,pabB,pabA및pabC유전자 모두를 포함하는 비. 서브틸리스 염색체의 영역으로부터 유래된 것으로 나타났다. 이들 클로닝된 인서트의 오픈 리딩 프레임 중 어떠한 것도 원핵세포에서나 진핵세포에서 공지된 판토테네이트 키나아제 서열과 상동성을 나타내지 않았다.
비. 서브틸리스 게놈 서열을 통해 클로닝된 인서트 내에 수종의 결실을 생성하였다. 각 결실에 대해 이. 콜라이 온도 감수성 판토테네이트 키나아제의 상보성을 조사하였다. 구체적으로, 클로닝 벡터 내의StuI 부위 내지yacC유전자 내의SwaI 부위의 모든 DNA를 제거한 결실은 클로닝된 인서트 내의 유일한 활성 오픈 리딩 프레임으로서yacB를 남겨두었다 (도 21). 이 결실된 플라스미드는 여전히 이. 콜라이 판토테네이트 키나아제 돌연변이를 보완하였다. 그러나,yacC의SwaI 부위 내지 (이미 잘려진)ftsH유전자의Bst1107I 부위 DNA가 제거된 다른 결실은 이. 콜라이 판토테네이트 키나아제 돌연변이를 보완할 수 없었다. 이들 결과로부터,yacB오픈 리딩 프레임이 상보 활성에 필수적이라는 결론을 얻었다.yacB가 판토테네이트 키나아제 유전자인지 확증하기 위해,yacBORF 및 하류에 달린 112 염기쌍 서열을 두 개의 독립된 반응으로 PCR에 의해 증폭시키고, 구성적 프로모터의 하류에 클로닝하여 pAN341 및 pAN342 플라스미드를 얻었다 (도 22). pAN341 및 pAN342 둘 다 44℃에서 YH1의 결함을 보완하였으나, 동일한 기본 구조를 갖되yacB대신panBCD를 발현하는 대조군 플라스미드는 그렇지 못했다. 이는 YH1에 대한 보완성이yacB오픈 리딩 프레임에 의한 것임을 확증하였다.
그와 같이, 상동성에 의하면 기존의 공지된 판토테네이트 키나아제 유전자는 관련이 없는 비. 서브틸리스의 판토테네이트 키나아제 활성을 코딩하는 신규 유전자를 발견하였다. 이 유전자는 판토테네이트로부터CoaA로의 경로에서 첫 번째 단계를 촉매하는 효소를 코딩하는 제2의, 대체적인 유전자로서coaX로 재명명되었다. CoaA 효소의 활성 감소와 관련하여 상기 기술한coaA결실 방법에 의한 coaX의 결실은 원하는 수준의 판토테네이트 키나아제 활성 감소를 위한 수단을 제공한다.
비. 서브틸리스coaX유전자의 수종의 상동체가yacB(coaX) 오픈 리딩 프레임 서열 및 추정 아미노산 서열 (각각 서열 84 및 85에 기재)을 이용한, 다양한 공용 데이타베이스의 상동성 검색에 의해 확인되었다. 두 가지 경우에 있어서 (미코박테리움 투베르쿨로시스 및 스트렙토마이세스 코엘리칼라, 상동성의coaX유전자가 판토테네이트 생합성 유전자에 인접하거나 거의 인접하고 있어서, 이들 상동체가 판토테네이트 대사에 역할을 하고 있다는 것과 일맥상통하였다. CoaX 단백질은 판토테네이트 키나아제의 CoaA 군 뿐만 아니라 사카로마이세스 세레비지아의 PanK를 위시한 판토테네이트 키나아제의 진핵세포군과 상동성을 나타내지 않았다.
수종의 박테리아 CoaX 상동체의 아미노산 서열을 공개된 비. 서브틸리스 게놈 서열에서 기술된 비. 서브틸리스yacBORF 번역물의 추정 아미노산 서열과 정렬분석 결과, 다른 박테리아로부터의 CoaX 단백질이 카르복시-말단에 추가의 아미노산을 포함하고 있는 것으로 나타났다. 또한, 비. 서브틸리스 유전자 산물의 추정 아미노산을 초과하는 이들 확장 서열은 상대적으로 잘 보존된 서열 단편 2개를 포함하였다.
비. 서브틸리스yacBORF의 정지 코돈으로부터 인접한 하류의 뉴클레오티드 서열을 다른 리딩 프레임으로 번역하면 다른 박테리아 CoaX의 카르복시-말단 확장 서열과 매우 유사한 확장 아미노산 서열의 존재가 나타났다. 따라서, 비. 서브틸리스yacBORF 서열의 공개된 DNA 서열에 오류가 존재하여, 인위적인 하류 아미노산 서열 및 미성숙한 종결을 야기하는 프레임 쉬프트를 일으키는 것으로 여겨진다.
pAN341 및 pAN342 (상기 기술함)에서 비. 서브틸리스CoaX의 PCR로 생성된 서열 은 충분한 하류 인접 서열을 포함하고 있어, 상기 기술한 추정 카르복시-말단 확장 서열을 코딩하고, 이는 상기 클론이 상보성 분석 시험에서 기능성인 결과와 일관된 결과이다. 그러나, 3' PCR 프라이머가 공개된 서열로부터 추정된, 보다 짧은yacBORF만을 포함하고 추정 카르복시-말단 확장 서열은 포함하지 않도록 위치하는 경우, 그렇게 생성된 pAN329 및 pAN330 (pAN341 및 pAN342와 유사한 구조임; 도 22 참조)은 YH1의 결함을 보완하지 못했다. 이 결과는 공개된yacB코딩 서열이 프레임-쉬프트의 오류를 포함하고 있으며, CoaX의 카르복시-말단이 판토테네이트 키나아제 활성에 필수적이라는 견해를 지지하고 있다. 비. 서브틸리스coaX의 추정된 바른 뉴클레오티드 서열은 서열 19에 기재되어 있으며, 번역된 아미노산 서열은 서열 9에 기재되어 있다. 비. 서브틸리스의 CoaX 아미노산 서열 및 그의 상동체 11종에 대한 다중 서열 정렬이 도 23에 기재되어 있다.
실시예 XV: 감소된 활성 또는 온도 감수성 활성을 갖는 판토테네이트 키나아제를 코딩하는 돌연변이 coaA 유전자의 생성
이 실시예는coaX가 게놈으로부터 결실된 후 판토테네이트 키나아제의 활성을 감소시키기 위한coaA유전자의 수식에 대한 전략 (즉, 점돌연변이를 도입함에 의함)을 기술하고 있다.
이. 콜라이 coaA 유전자의 온도 감수성 대립 유전자의 클로닝 및 시퀀싱
각각 다른 돌연변이 CoaA 표현형을 나타내는 두 이. 콜라이 균주를 이. 콜라이 제네틱 스톡 센터 (E.coliGenetic Stock Center)로부터 얻었다. DV62 균주는coaA15 (Ts)대립 유전자를 포함하며, DV79는coaA16 (Fr)돌연변이를 포함하였다. DV62는 43℃에서 온도 감수성이며, 온도 감수성인 판토테네이트 키나아제를 생산하였다. DV79는 DV62의 역위에 의해 온도 내성 균주로서 얻었고, 이는 온도에 대해서 안정한, 피드백 내성의 판토테네이트 키나아제 활성을 생산하였다. 이들 대립 유전자의 DNA 서열은 문헌에서 이용 가능하지 않기 때문에, 상기 두 돌연변이 균주로부터의coaA유전자는 PCR에 의해 클로닝되고,coaA좌위에서 야생형인 균주 (MM294)로부터의coaA유전자와 함께 시퀀싱되었다. 5' 말단의 PCR 프라이머는 출발 코돈에 더하여 4개의 상류 염기 및 임의로 선택된 추가의 리보좀 결합 부위 (RBS)를 포함하도록 설계하였다. PCR 생성 단편 세 개를 pAN229의XbaI및BamHI사이에 각각 리게이션시켜 pAN284 (coaA15(Ts)로부터 유래), pAN285 (야생형coaA로부터 유래) 및 pAN286 (coaA16(Fr)로부터 유래)을 얻었다. pAN229는 pAN229는 이. 콜라이의 낮은 카피수 벡터이며,P 15 프로모터를 통해 발현시키고,bpr에서의 단일 교차에 의해 삽입될 수 있고, 테트라싸이클린으로 선별할 수 있다.
세 플라스미드 모두 상보성 시험을 위해 이. 콜라이 균주인 YH1 내로 형질전환되었다. 세 플라스미드 모두 이. 콜라이 YH1에서 온도 감수성coaA돌연변이를 보완하였다. 이는 pAN284 내의coaA15(Ts)유전자가 아마도 정상 염색체 유전자에 비해 주목할만큼 과발현되어, 과생산이 온도 감수성 결함을 보충하게 된 것으로 여겨진다. 과생산에 의한 결함의 상보성은 이. 콜라이에서 널리 공지된 현상이다.
pAN284, 285 및 286으로부터의 coaA 코딩 영역을 pGEM7 내로 서브클로닝하여pAN306, 307 및 308을 각각 얻고 DNA 시퀀싱을 하였다. 예상한 바와 같이, pAN307 (야생형coaA로부터 유래됨)의 인서트의 DNA 서열은 이. 콜라이 게놈 데이타베이스 (진뱅크 (등록상표), GenBankTM)로부터의coaA서열과 부합되었다. pAN306으로부터의 서열은 S176L 치환을 일으키는 단일 염기 변화를 포함하고 있다 (즉, 서열 2에 기재된 아미노산 서열에서 Ser →Leu 치환). 흥미롭게도, 피드백 내성 균주로부터 유래된 pAN308 인서트의 DNA 서열이 그의 온도 감수성 기원 (pAN306에서 나타남)으로부터 유래된 것과 동일하였다. 이는 온도 감수성 돌연변이의 역위가coaA유전자에 독립적인 제2의 부위에서 일어난 것임을 나타내는 유전적 데이타에 부합한다.
이. 콜라이 판토테네이트 키나아제에서 온도 감수성 결함을 일으킬 것으로 예측된 S176 돌연변이는 비. 서브틸리스의 판토테네이트 키나아제를 비롯하여, 모든 공지된 또는 추정된 박테리아coaA코딩 판토테네이트 키나아제에 보존된 세린 잔기를 바꾸었다 (서열 3 및 그에 대한 정렬 참조). 이에 근거하여, 비. 서브틸리스 판토테네이트 키나아제의 상동성 잔기에서 일어난 세린의 루이신으로의 변화는 온도 감수성 효소 또는 보다 덜 활성인 효소를 생성할 것으로 예측하였다. 따라서, 돌연변이 비. 서브틸리스coaA유전자를 생산하기 위해, 이러한 특이적 변화를 비. 서브틸리스coaA유전자에 도입하였다. 돌연변이 버전을, 예를 들어coaX가 결실된 비. 서브틸리스 균주의 염색체 내에 삽입하고, 상기 재조합 미생물의 온도 감수성을 검사하였다 (예, 43℃에서 증식 감소). 그 후, 돌연변이를 판토테네이트 과생산 균주, 바람직하게는 상기 언급한coaX유전자 결실 균주로 통상적인 방법에의해 도입하여 비. 서브틸리스 내에서 판토테네이트 생산이 유리한 균주, 즉 전형적인 발효 조건 하에서 판토테네이트 키나아제 활성이 감소한 균주를 얻었다.
판토테네이트 키나아제 활성 감소를 일으키는 추가의 coaA 점 돌연변이
물론, 비. 서브틸리스 내의 많은 다른 점 돌연변이 또는 하나 이상의 점 돌연변이의 조합도 활성 감소를 일으킬 것으로 예측된다. 돌연변이 유발 중합 효소 연쇄 반응 및 시험관내 재조합에 의해 적절한 돌연변이를 생성할 수 있고, 이. 콜라이coaA15(Ts)돌연변이를 보완하지 못하는 대립 형질에 대해 스크리닝함으로써 확인할 수 있다. 이 유형의 그러한 돌연변이의 예로는 돌연변이 유발 중합 효소 연쇄 반응에 의해 비. 서브틸리스coaA의 181번 아미노산에 있는 타이로신을 히스티딘으로 치환한 것이 있다 (서열 3 및 도 24의 정렬 중 첫 번째 줄 참조).
단리된 pAN282A는 실시예 XII에서 기술한 중간 크기의 비. 서브틸리스coaA오픈 리딩 프레임으로부터 유래되었다. pAN282A는 이. 콜라이coaA15(Ts)돌연변이를 보완하지 못하였지만, 그러함에도 불구하고 검출 가능한 판토테네이트 수준은 배경 잡음 수준보다 컸다. 이. 콜라이coaA클론에 대해 수행한 바와 같이, pAN282A로부터의 오픈 리딩 프레임을 pGEM7로 서브클로닝하여 pAN303을 얻었다. pAN303에서 인서트의 DNA 서열은 서열 3의 Y181에 해당하는, 타이로신의 히스티딘으로의 아미노산 변화를 일으키는 단일 염기 변화를 나타내었다. 이 타이로신 잔기는 모든 박테리아coaA유전자/진뱅크에서 나타난 상동체에서 보존되어 있다 (도 24). 상기 기술한 이. 콜라이 온도 감수성 판토테네이트 키나아제에서 변화된 상기 타이로신 잔기 및 세린 잔기는 박테리아 판토테네이트 키나아제의 보존성이 높은 영역에서 오직 세 아미노산 잔기에 의해 분리되었지만, pAN282B로부터 유래된, 중간 크기 오픈 리딩 프레임의 두번째 단리물의 DNA 서열은 비. 서브틸리스 게놈 서열 프로젝트에 의한 야생형 서열과 동일하였다. pAN303에서 발견된 단일 염기 변화는 아마도coaA유전자의 PCR 증폭 동안에 일어난 듯 하다.coaA2의 이러한 변이체가 비. 서브틸리스 내에서 충분한 잔기별 생물학적 활성을 갖는 경우, 장래에 판토테네이트 키나아제 활성 감소를 제공하는 데 유용할 수 있다.
coaA오픈 리딩 프레임을 돌연변이시키는 데 대한 기재로서 작용할 수 있는 바람직한 벡터는 pAN294이다 (도 25 및 실시예 XII 참조). 간략하게, AN294를 템플레이트로 사용하여 돌연변이 유발 PCR을 수행하고, 판토테네이트 키나아제 활성이 감소한coaA의 변이체를 상기 기술한 바와 같이 스크리닝하였다. 별법으로, pAN282A에서 단리된 것과 같은 돌연변이를 pAN294 내로 도입할 수 있다. 그 후, 적절한 pAN294 유도체로 형질전환시켜 목적 돌연변이를 비. 서브틸리스 균주의 염색체 내로 도입하고, 클로람페니콜 5 mg/ℓ중에서 내성에 대해 선별하였다. 생성된 돌연변이체 중에서 원하는 돌연변이를 포함하는 것을 단리하였다.
유사한 방식으로,coaX효소의 활성이 감소한 돌연변이를 생성 및 확인할 수 있으며, 그러한 돌연변이를 상기 기술한 바와 같이 CoA 생산 감소에 의한 판토테네이트 생산의 최적화를 위해 이용하였다.
실시예 XVI: 비. 서브틸리스로부터의 제2의 판토테네이트 키나아제 유전자인 coaX 의 결실
coaX의 존재 및 성질에 관하여 상기로부터 얻은 지식으로, 코딩된 활성이 감소하거나coaX로부터 하류의 유전자 발현에 부작용을 미치지 않는, 비. 서브틸리스 염색체로부터의coaX오픈 리딩 프레임의 결실을 생성할 수 있다. 그러한 결실 균주에서는,coaA유전자가 판토테네이트 키나아제를 코딩하는 유일한 유전자이다.
비. 서브틸리스로부터coaX유전자를 결실시키기 위해,coaXORF의 대부분을 카나마이신 내성 유전자로 치환하여 이중 교차를 위한 상류 및 하류의 상동성을 포함하는 pAN336 플라스미드 (서열 92)을 제작하였다 (도 26). PY79 균주를 pAN336에 의해 카나마이신 내성으로 형질전환하고, PCR에 의한 이중 교차로부터 생성되었음을 확증한 단리물을 PA876으로 명명하였다. 예상한 바와 같이,coaX의 결실 자체는 비. 서브틸리스에 치명적이지 않다. 또한, PA876으로부터의 염색체 DNA는 콤피턴트 PA861 (PY79ΔcoaA::cat)을 카나마이신 내성으로 형질전환하지 않았다. 이들 결과는ΔcoaA::cat및ΔcoaX::kan의 조합이 비. 서브틸리스에 치명적임을 나타내며, 비. 서브틸리스가 판토테네이트 키나아제를 코딩하는 두개의 연관되지 않은 유전자,coaA및coaX를 포함하고, 두 유전자 중 어떠한 것이든 단일하게 정상적인 증식 속도를 위한 판토테네이트 키나아제를 충분히 공급 가능함을 확증하였다.
실시예 XVII: 비. 서브틸리스 coaA 유전자의 지정 돌연변이 유발을 일으키도록 설계된 플라스미드의 제작
돌연변이된coaA유전자를 비. 서브틸리스 염색체 내로 용이하게 도입하기 위해,coaA유전자 인근에 항생제 내성 유전자를 도입할 필요가 있었다. 이는 pGEM5 벡터에 (1)coaA및coaA오픈 리딩 프레임(들)로부터 상류의 게놈 서열 2.5kb를 포함하는 3.4 kb DNA 서열, (2) 클로람페니콜 내성 유전자 (cat)를 포함하는 1.1 kb DNA 서열 및 (3)coaA를 포함하는 오페론으로부터의 하류 영역을 포함하는 1.4 kb DNA 서열의 세 DNA 단편을 함께 연결시킴으로써 수행하였다. pAN294로 명명된 생성 플라스미드는cat유전자의 양 말단 옆에 충분한 상동성 서열을 가지고 비. 서브틸리스 염색체로 이중 재조합이 일어나도록 하여 효과적으로yqjT오픈 리딩 프레임 (coaA로부터 인접한 하류의 오픈 리딩 프레임)을cat유전자로 치환하였다 (도 25). pAN294를 비. 서브틸리스 균주 PY79로 형질전환하고, 클로람페니콜 5 mg/ℓ로 내성에 대해 선별하여 동일한 것으로 추정되는 PA836 및 PA837을 얻었다. PA836 및 837을 진단 PCR에 의해 검사하여cat유전자가 단일 교차에 반하여 이중 교차에 의해 삽입되었음을 증명하였다. PA836 및 PA837은 정상적으로 증식하여,yqjT오픈 리딩 프레임이 필수적이지 않을 것이라는 결론을 도출하였다 (즉,yqjT오픈 리딩 프레임은 증식 또는 판토테네이트 생산에 대해 주목할만한 영향 없이 PA836 및 PA837 균주로부터 결실될 수 있었다). 따라서,coaA유전자의 변이 대립 유전자 (즉, 돌연변이)를 pAN294 내로 도입하고, 생성된 플라스미드를 사용하여, 예를 들어 비. 서브틸리스 균주의 염색체 내로 변이 대립 유전자를 도입하였다.
실시예 XVIII: 감소된 활성 또는 온도 감수성 활성을 갖는 판토테네이트 키나아제를 코딩하는 돌연변이 coaX 유전자의 생성
coaX유전자에 점 돌연변이를 도입하고 실시에 XII에서 기술한 바와 같이 이. 콜라이 YH1 균주의 상보성 능력에 대한 생성 돌연변이의 시험을 통해 돌연변이coaX유전자를 생성하였다.coaX유전자 서열에서 바람직한 돌연변이는 다양한 박테리아원으로부터의coaX서열 중에서 보존된 잔기 (예, 도 23에 기재된 보존된 잔기)의 치환을 코딩하는 것들이다. 별법으로, 돌연변이 유발 PCR 및 시험관내 재조합에 의해coaX유전자에서 무작위 돌연변이를 생성시키고, 이. 콜라이coaA15 (Ts)돌연변이를 보완하지 못하는 대립 유전자에 대해 스크리닝함으로써 확인하였다.
그렇게 생성된 돌연변이 (즉,coaX활성이 감소된 돌연변이)를 추가로 조작하여 내생coaA유전자가 결실되도록 할 수 있다 (실시예 XIII에 기술한 바와 같음). 또한, CoaX 활성 감소 돌연변이를 추가로 조작하여 실시예 XV에서 기술한 바와 같이 활성이 감소한 CoaA 유전자 산물을 포함하도록 할 수 있다.
실시예 XIX: 판토테네이트 생합성 효소 1종 이상이 결실된 박테리아를 이용한 판토-화합물의 생산 증가
목적 판토-화합물이 판토테네이트가 아닌 경우, 판토테네이트 과생산 균주로부터 판토테네이트 생합성 유전자 1종 이상을 적절하게 결실시키면 상기 목적 판토-화합물을 생산하는 균주를 제공한다. 이 예에서, 목적 판토-화합물은 판토에이트이다. 예를 들어, PA236, PA313 또는 PA824 균주로 출발하여,panC및panD유전자 중 어느 하나 또는 둘 다를 결실시켰다. 다른 예에서는 케토판토에이트가 목적 판토-화합물이었다. 예를 들어, PA244, PA245 또는 PA824 균주로 출발하여,ilvC,panE1,panC및panD유전자 중 하나, 둘 또는 모두를 출발 균주로부터 결실시켰다. β-알라닌이 목적 판토-화합물인 경우,panB및panC를 결실시킬 수 있으며, PA221, PA235, PA245 또는 PA313 균주로부터panB의 5' 말단 중 작은 일부를panC의 3' 말단 중 작은 일부와 프레임에 맞게 융합하도록 하는 방식이 바람직하다. 상기 언급한 예 모두에서, 판토-화합물을 생산하는 균주는 판토테네이트 영양 요구체이다. 따라서, 배양 배지에는 적절한 증식을 위해 충분한 판토테네이트가 필요하다. 상기 기술한 바와 같이panD를 과발현하도록 설계된 벡터를 상기 균주 내로 형질전환하여 β-알라닌 생산을 추가로 증진시킨다.
상기 언급한 결실은 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들어 항생제 내성 유전자의 삽입 및 표적 유전자(들)이 활성화되기에 충분한 서열을 상기 표적 유전자(들)로부터 제거함에 의해 이루어졌다. 별법으로, 표적 유전자 내에 항생제 내성 유전자를 동시에 도입하지 않고, 상기 표적 서열을 제거한 후 콘그레션 (congression) (임의의 다른 적절한 선별 가능 DNA 서열과 함께 동시-형질전환)에 의해 도입시키고, 그 후 레플리카 플레이팅 (replica plating)에 의해 상기 표적 유전자의 기능 상실을 스크리닝함으로써 결실시켰다.
균등물당업자는 일상적인 실험만을 이용하여 본원에 기술된 발명의 특이적인 실시 태양에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인 가능하다. 그러한 동등물은 하기 청구항에 의해 포함되는 것을 의도한다.

Claims (110)

1종 이상의 바실러스 (Bacillus) 판토테네이트 생합성 효소를 과다발현하는 미생물을 판토-화합물이 생산되는 조건하에서 배양하는 것을 포함하는 판토-화합물의 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 미생물이 1종 이상의 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 판토테네이트 생합성 효소를 과다발현하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 판토테네이트 생합성 효소가 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제, 판토테네이트 신테타제, 아스파테이트-α-데카르복실라제 및 케토판토에이트 리덕타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 2종 이상의 판토테네이트 생합성 효소를 과다발현하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 3종 이상의 판토테네이트 생합성 효소를 과다발현하는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 판토-화합물이 판토테네이트, 판토에이트, 케토판토에이트 및 β-알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
판토-화합물이 생산되는 조건하에서 케토판토에이트 리덕타제-과다발현 (KPAR-O) 미생물을 배양하는 것을 포함하는 판토-화합물의 생산 방법.
제7항에 있어서, 상기 판토-화합물이 판토테네이트 또는 판토에이트인 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 케토판토에이트 리덕타제가 박테리아 유래의 것인 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 케토판토에이트 리덕타제가 바실러스 유래의 것인 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 케토판토에이트 리덕타제가 바실러스 서브틸리스 유래의 것인 방법.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 KPAR-O 미생물이 케토판토에이트 리덕타제를 과다발현하는 것 이외에 1종 이상의 판토테네이트 생합성 효소를 추가로 과다발현하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 KPAR-O 미생물이 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제, 판토테네이트 신테타제 및 아스파테이트-α-데카르복실라제 중 하나 이상을 추가로 과다발현하는 것인 방법.
탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 경로를 갖는 아스파테이트-α-데카르복실라제-과다발현 (AαD-O) 미생물을 판토테네이트가 생산되는 조건하에서 배양하는 것을 포함하는, 전구체 공급에 독립적인 방식으로 판토테네이트를 생산하는 방법.
아스파테이트-α-데카르복실라제-과다발현 (AαD-O) 미생물을 판토테네이트가 생산되는 조건하에서 배양하는 것을 포함하는, 아스파테이트 또는 β-알라닌 공급에 독립적인 방식으로 2 g/ℓ 이상의 판토테네이트를 생산하는 방법.
탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 경로를 갖는 미생물을 판토테네이트가 생산되는 조건하에서 배양하는 것을 포함하는, 발린 또는 α-케토이소발레레이트 공급에 독립적인 방식으로 2 g/ℓ 이상의 판토테네이트를 생산하는 방법.
아스파테이트-α-데카르복실라제-과다발현 (AαD-O) 미생물을 판토테네이트가 생산되는 조건하에서 배양하는 것을 포함하는, 아스파테이트 또는 β-알라닌 공급에 독립적인 방식으로 30 g/ℓ 이상의 판토테네이트를 생산하는 방법.
탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 경로를 갖는 미생물을 판토테네이트가 생산되는 조건하에서 배양하는 것을 포함하는, 발린 또는 α-케토이소발레레이트 공급에 독립적인 방식으로 30 g/ℓ 이상의 판토테네이트를 생산하는 방법.
판토테네이트가 상당히 고수율로 생산되는 조건하에서 조작된 미생물을 배양하는 것을 포함하는, β-알라닌에 독립적으로 고수율로 판토테네이트를 생산하는 방법.
제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 아세토히드록시산 신테타제를 과다발현하는 것이거나, 또는 ilvBN 핵산 서열 또는 alsS 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 것인 방법.
제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 아세토히드록시산 이소메로리덕타제를 과다발현하는 것이거나, 또는 ilvC 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 것인 방법.
제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 디히드록시산 데히드라타제를 과다발현하는 것이거나, 또는 ilvD 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 것인 방법.
제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 아스파테이트-α-데카르복실라제를 과다발현하는 것이거나, 또는 panD 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 것인 방법.
제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로를 추가로 갖는 것인 방법.
제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 돌연변이체 avtA 유전자, 돌연변이체 ilvE 유전자, 돌연변이체 ansB 유전자 및 돌연변이체 alsD 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이체 유전자를 추가로 갖는 것인 방법.
제24항에 있어서, 상기 미생물이 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제, 케토판토에이트 리덕타제, 판토테네이트 신테타제 및 아스파테이트-α-데카르복실라제 중 어느 것을 과다발현하는 것인 방법.
제24항 또는 제26항에 있어서, 상기 미생물이 panBCD 핵산 서열을 포함하는 벡터 또는 panE1 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 것인 방법.
제14항 내지 제16항 및 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 판토테네이트가 10 g/ℓ 초과의 양, 20 g/ℓ 초과의 양 및 40 g/ℓ 초과의 양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 양으로 생산되는 방법.
제20항에 있어서, 상기 미생물이 바실러스로부터 유래한 아세토히드록시산 신테타제를 과다발현하는 것이거나, 또는 바실러스로부터 유래한 ilvBN 핵산 서열 또는 alsS 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 것인 방법.
제21항에 있어서, 상기 미생물이 바실러스로부터 유래한 아세토히드록시산 이소메로리덕타제를 과다발현하는 것이거나, 또는 바실러스로부터 유래한 ilvC 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 것인 방법.
제22항에 있어서, 상기 미생물이 바실러스로부터 유래한 디히드록시산 데히드라타제를 과다발현하는 것이거나, 또는 바실러스로부터 유래한 ilvD 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 것인 방법.
제23항에 있어서, 상기 미생물이 바실러스로부터 유래한 아스파테이트-α-데카르복실라제를 과다발현하는 것이거나, 또는 바실러스로부터 유래한 panD 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 것인 방법.
제24항 또는 제26항에 있어서, 상기 미생물이 바실러스로부터 유래한 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제, 케토판토에이트 리덕타제, 판토테네이트 신테타제 및 아스파테이트-α-데카르복실라제 중 어느 것을 과다발현하는 것인 방법.
제27항에 있어서, 상기 벡터가 바실러스로부터 유래한 panBCD 핵산 서열 또는 panE1 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
판토-화합물이 생산되는 조건하에서, 판토테네이트 생합성 경로 전구체 또는 이소루이신-발린 생합성 경로 전구체 1종 이상을 포함하는 조성물을, 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제, 케토판토에이트 리덕타제, 판토테네이트 신테타제 및 아스파테이트-α-데카르복실라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단리된 바실러스 효소와 접촉시키는 것을 포함하는 판토-화합물의 생산 방법.
β-알라닌이 생산되는 조건하에서 아스파테이트-α-데카르복실라제-과다발현 (AαD-O) 미생물을 배양하는 것을 포함하는 β-알라닌의 생산 방법.
제36항에 있어서, 상기 AαD-O 미생물이 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제, 케토판토에이트 리덕타제 및 판토테네이트 신테타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 판토테네이트 생합성 효소를 코딩하는 핵산 서열에 돌연변이를 갖는 것인 방법.
아스파테이트를 포함하는 조성물을, 단리된 바실러스 아스파테이트-α-데카르복실라제 효소와 β-알라닌이 생산되는 조건하에서 접촉시키는 것을 포함하는 β-알라닌의 생산 방법.
돌연변이체 coaX 유전자를 갖는 돌연변이체 미생물을 판토-화합물의 생산이 증진되는 조건하에서 배양하는 것을 포함하는 판토-화합물 생산의 증진 방법.
제39항에 있어서, 상기 재조합 미생물이 돌연변이체 coaA 유전자를 갖는 것인 방법.
판토-화합물이 상당히 고수율로 생산되는 조건하에서 판토테네이트 키나아제 돌연변이체 미생물 배양하는 것을 포함하는 판토-화합물의 생산 방법.
제41항에 있어서, 상기 돌연변이체 미생물이 돌연변이체 coaA 유전자를 갖는 것인 방법.
제41항에 있어서, 상기 돌연변이체 미생물이 돌연변이체 coaX 유전자를 갖는 것인 방법.
제41항에 있어서, 상기 돌연변이체 미생물이 돌연변이체 coaA 및 coaX 유전자를 갖는 것인 방법.
제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 판토-화합물이 케토판토에이트, 판토에이트 또는 판토테네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 판토-화합물이 판토테네이트인 방법.
제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 판토-화합물이 10 g/ℓ 초과의 양, 20 g/ℓ 초과의 양 및 40 g/ℓ 초과의 양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 양으로 생산되는 방법.
제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 미생물이 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로를 추가로 갖는 것이거나, 또는 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 경로를 추가로 갖는 것인 방법.
제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 미생물이 panD 및 panE를 추가로 과다발현하는 것인 방법.
제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 미생물이 돌연변이체 avtA 유전자, 돌연변이체 ilvE 유전자, 돌연변이체 ansB 유전자 및 돌연변이체 alsD 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이체 유전자를 추가로 갖는 것인 방법.
탈조절된 판토테네이트 생합성 경로를 가지며 또한 판토테네이트 키나아제의 활성 감소를 초래하는 돌연변이를 갖는 미생물을 판토-화합물의 생산이 증진되는 조건하에서 배양하는 것을 포함하는 판토-화합물 생산의 증진 방법.
coaX 유전자에 의해 코딩되는 판토테네이트 키나아제를 발현하는 재조합 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, 상기 시험 화합물이 상기 세포에서 판토테네이트 키나아제 활성을 조절할 수 있는지 측정하는 것을 포함하는, 판토테네이트 키나아제 활성을 조절하는 화합물의 확인 방법.
제52항에 있어서, 상기 세포가 감소된 활성의 판토테네이트 키나아제를 코딩하는 돌연변이체 coaA 유전자를 추가로 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 그람 양성균인 방법.
제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 그람 음성균인 방법.
제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 바실러스, 코리네박테리움 (Corynebacterium), 락토바실러스 (Lactobacillus), 락토코커스 (Lactococci) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속에 속하는 미생물인 방법.
제1항 내지 제51항 및 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 바실러스속에 속하는 것인 방법.
제1항 내지 제51항 및 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 바실러스 서브틸리스인 방법.
제1항 내지 제13항, 제35항, 제39항 내지 제51항 및 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 판토-화합물을 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제14항 내지 제34항 및 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 판토테네이트를 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제14항, 제35항, 제39항 내지 제46항, 제48항 내지 제51항 및 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 판토-화합물이 2 g/ℓ를 초과하는 양으로 생산되는 방법.
1종 이상의 바실러스 판토테네이트 생합성 효소를 과다발현하는 재조합 미생물.
제62항에 있어서, 1종 이상의 바실러스 서브틸리스 판토테네이트 생합성 효소를 과다발현하는 재조합 미생물.
제62항 또는 제63항에 있어서, 판토테네이트 생합성 효소가 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제, 판토테네이트 신테타제, 아스파테이트-α-데카르복실라제 및 케토판토에이트 리덕타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물.
제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 판토테네이트 생합성 효소가 케토판토에이트 리덕타제인 재조합 미생물.
아스파테이트-α-데카르복실라제를 과다발현하며 탈조절된 이소루이신-발린(ilv) 생합성 경로를 갖는 재조합 미생물.
미생물에서 감소된 활성의 판토테네이트 키나아제를 코딩하는 돌연변이체 coaX 유전자를 갖는 재조합 미생물.
제67항에 있어서, 미생물에서 감소된 활성의 판토테네이트 키나아제를 코딩하는 돌연변이체 coaA 유전자를 추가로 갖는 재조합 미생물.
돌연변이체 coaX 유전자를 가지며, 임의로 돌연변이체 coaA 유전자를 갖는, 야생형 coaA 및 coaX 유전자를 갖는 미생물에 비해 감소된 판토테네이트 키나아제 활성을 지닌 재조합 미생물.
단리된 coaX 유전자가 포함된 벡터를 포함하는 재조합 미생물.
탈조절된 판토테네이트 생합성 경로를 가지며, 미생물의 조효소 A (CoA) 합성능 감소를 초래하는 돌연변이 하나 이상을 갖는, 판토-화합물을 과다생산하는 재조합 미생물.
제71항에 있어서, 판토테네이트 키나아제의 활성량 감소를 초래하는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 재조합 미생물.
제72항에 있어서, CoaA 효소의 활성량 감소를 초래하는, coaA 유전자에서의 돌연변이 또는 그의 동족체를 갖는 재조합 미생물.
제72항에 있어서, CoaX 효소의 활성량 감소를 초래하는, coaX 유전자에서의 돌연변이 또는 그의 동족체를 갖는 재조합 미생물.
제72항에 있어서, CoaA 효소의 활성량 감소 및 CoaX 효소의 활성량 감소를 초래하는, coaA 유전자에서의 돌연변이 또는 그의 동족체, 및 coaX 유전자에서의 돌연변이 또는 그의 동족체를 갖는 재조합 미생물.
제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로를 추가로 갖는 재조합 미생물.
제62항 내지 제65항 및 제67항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 경로를 추가로 갖는 재조합 미생물.
제62항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 그람 양성균인 재조합 미생물.
제78항에 있어서, 바실러스, 코리네박테리움, 락토바실러스, 락토코커스 및스트렙토마이세스로 이루어진 군으로부터 선택되는 속에 속하는 재조합 미생물.
제79항에 있어서, 바실러스속에 속하는 재조합 미생물.
제80항에 있어서, 바실러스 서브틸리스인 재조합 미생물.
PA221, PA235, PA236, PA313, PA410, PA402, PA403, PA411, PA412, PA413, PA303, PA327, PA328, PA401, PA340, PA342, PA404, PA405, PA374, PA354, PA365, PA377, PA651 및 PA824로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 미생물.
1종 이상의 바실러스 판토테네이트 생합성효소를 코딩하는 핵산 서열을 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상태로 포함하는, 판토-화합물의 생산에 사용하기 위한 재조합 벡터.
제83항에 있어서, 바실러스 서브틸리스 판토테네이트 생합성 효소 1종 이상을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
제84항에 있어서, 핵산 서열이 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제, 판토테네이트 신테타제, 아스파테이트-α-데카르복실라제 및 케토판토에이트 리덕타제 중 하나 이상을 코딩하는 것인 벡터.
서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29 및 서열 59로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터.
제84항에 있어서, 상기 핵산 서열이 케토판토에이트 리덕타제를 코딩하는 것인 벡터.
활성이 감소된 판토테네이트 키나아제 효소를 코딩하는 돌연변이체 coaX 유전자를 포함하는 벡터.
단리된 coaX 유전자를 포함하는 벡터.
단리된 바실러스 coaX 유전자를 포함하는 벡터.
단리된 바실러스 서브틸리스 coaX 유전자를 포함하는 벡터.
제86항 및 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 조절 서열을 추가로 포함하는 벡터.
제83항 내지 제85항, 제87항 및 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 조절 서열이 구성적으로 활성인 프로모터를 포함하는 것인 벡터.
제93항에 있어서, 구성적으로 활성인 프로모터가 Pveg(서열 41), P15(서열 39) 또는 P26(서열 40) 서열을 포함하는 것인 벡터.
제83항에 있어서, 조절 서열이 1종 이상의 인공 리보솜 결합 부위 (RBS)를 포함하는 것인 벡터.
제95항에 있어서, 인공 RBS가 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56 및 서열 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 벡터.
pAN004, pAN005, pAN006, pAN236, pAN423, pAN428, pAN429, pAN441, pAN442, pAN443, pAN251, pAN267, pAN256, pAN257, pAN263, pAN240, pAN294, pAN296, pAN336, pAN341 및 pAN342로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터.
제86항 또는 제93항의 벡터를 포함하는 재조합 미생물.
1종 이상의 바실러스 판토테네이트 생합성 유전자를 코딩하는 단리된 핵산분자.
제99항에 있어서, 1종 이상의 바실러스 서브틸리스 판토테네이트 생합성 유전자를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
제99항 또는 제100항에 있어서, 케토판토에이트 리덕타제를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
단리된 바실러스 판토테네이트 생합성 효소 폴리펩티드.
단리된 바실러스 서브틸리스 판토테네이트 생합성 효소 폴리펩티드.
단리된 바실러스 케토판토에이트 리덕타제 폴리펩티드.
단리된 바실러스 서브틸리스 케토판토에이트 리덕타제 폴리펩티드.
단리된 바실러스 아스파테이트-α-데카르복실라제 폴리펩티드.
단리된 바실러스 서브틸리스 아스파테이트-α-데카르복실라제 폴리펩티드.
돌연변이체 coaX 유전자를 포함하는 단리된 핵산 분자.
coaX 유전자를 포함하는 단리된 핵산 분자.
coaX 유전자에 의해 코딩되는 단리된 판토테네이트 키나아제 단백질.
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