CN104789564B - 一种启动子和重组表达载体及其用途和表达外源蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种启动子，该启动子的长度为150‑1000bp，其中，所述启动子具有如SEQ ID NO.1所示的核酸片段，并且所述启动子能够启动在枯草芽孢杆菌中的转录。本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体能够允许插入阅读框并使所插入的阅读框在细菌中表达出蛋白质，所述重组表达载体中的启动子包括如上所述的启动子。本发明还提供了一种表达外源蛋白的方法，其中，该方法包括：将编码所述外源蛋白的阅读框插入如上所述的重组表达载体得到重组表达质粒。本发明还提供了如上所述的启动子在制备重组表达载体和/或表达质粒中的用途。通过上述技术方案，本发明在不进行诱导的条件下显著地提高了外源蛋白的表达量。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种启动子、一种重组表达载体、一种表达外源蛋白的方法和该启动子的用途。
背景技术
启动子是一段位于结构基因5'端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。因为基因的特异性转录取决于酶与启动子能否有效地形成二元复合物，故RNA聚合酶如何有效地找到启动子并与之相结合是转录起始过程中首先要解决的问题。有实验表明，对许多启动子来说，RNA聚合酶与之相结合的速率至少比布朗运动中的随机碰撞高100倍。
不同的启动子的转录活性差别较大，其中，转录活性较强的启动子在基因工程中具有非常重要的应用价值。例如，在枯草芽孢杆菌中经常用到的P43组成型启动子和淀粉诱导启动子。这些启动子可以用于构建用于表达外源蛋白的表达载体。携带这些启动子的表达载体上能够插入编码外源蛋白的阅读框，从而形成用于表达外源蛋白的表达质粒。启动子的转录活性的强弱，能够显著地影响外源蛋白在宿主中的表达量。
枯草芽孢杆菌作为一种重要的工业微生物，是目前生产各种工业蛋白酶的理想表达宿主。强而可控的启动子是外源蛋白高效表达的关键因素之一，稳定期特异性高效表达启动子相较于常用的依赖诱导物的诱导型启动子而言，更适合工业化大规模生产。但是，上面提到的P43启动子的转录活性较低，而淀粉诱导启动子需要额外添加淀粉作为诱导物，存在操作复杂成本过高的缺陷。
发明内容
本发明的目的是克服现有的不需要诱导的启动子转录活性较低的缺陷，提供一种不需要诱导但转录活性较高的启动子。
为了实现上述目的，本发明提供了一种启动子，该启动子的长度为150-1000bp，其特征在于，所述启动子具有如SEQ ID NO.1所示的核酸片段，并且所述启动子能够启动在枯草芽孢杆菌中的转录。
本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体能够允许插入阅读框并使所插入的阅读框在细菌中表达出蛋白质，所述重组表达载体中的启动子包括如上所述的启动子。
本发明还提供了一种表达外源蛋白的方法，其中，该方法包括：将编码所述外源蛋白的阅读框插入如上所述的重组表达载体得到重组表达质粒，并将所述重组表达质粒导入感受态细菌中得到表达菌株，然后培养所述表达菌株。
本发明还提供了如上所述的启动子在制备重组表达载体和/或表达质粒中的用途。
通过上述技术方案，本发明在不进行诱导的条件下显著地提高了外源蛋白的表达量。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是启动子重组载体F0-bgaB：pUBC19的结构示意图。
图2是使用F0启动子的菌株和使用P43启动子的菌株提取菌体蛋白并进行电泳的电泳图，泳道1为使用P43启动子的菌株的菌体蛋白电泳结果，泳道2为使用F0启动子的菌株的菌体蛋白电泳结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种启动子，该启动子的长度为150-1000bp，其特征在于，所述启动子具有如SEQ ID NO.1所示的核酸片段，并且所述启动子能够启动在枯草芽孢杆菌中的转录。
在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“启动子”是指位于结构基因5'端上游的能被RNA聚合酶特异性识别并活化RNA聚合酶的DNA序列。本发明中，启动子是指原核生物的启动子。其中，如SEQ ID NO.1所示的核酸片段的长度为121bp，是启动子的核心片段，具有该核心片段是核酸能够具有启动子功能的必要条件，其本身也可以作为启动子；也可以在该核心片段的5’端进行适当的延长直至达到150-1000bp的长度，只要延长后得到的核酸还能够启动在枯草芽孢杆菌中的转录即可。
其中，优选地，所述启动子具有如SEQ ID NO.2所示的核酸片段。其中，如SEQ IDNO.2所示的核酸片段长度为197bp，其本身也可以作为启动子使用；也可以在SEQ ID NO.2所示的核酸片段的5’端进行适当的延长直至达到200-1000bp的长度，只要延长后得到的核酸还能够启动在枯草芽孢杆菌中的转录即可。
其中，优选地，所述启动子具有如SEQ ID NO.3所示的核酸片段。其中，如SEQ IDNO.3所示的核酸片段长度为276bp，其本身也可以作为启动子使用；也可以在SEQ ID NO.3所示的核酸片段的5’端进行适当的延长直至达到280-1000bp的长度，只要延长后得到的核酸还能够启动在枯草芽孢杆菌中的转录即可。
其中，优选地，所述启动子具有如SEQ ID NO.4所示的核酸片段。其中，如SEQ IDNO.4所示的核酸片段长度为424bp，其本身也可以作为启动子使用；也可以在SEQ ID NO.4所示的核酸片段的5’端进行适当的延长直至达到430-1000bp的长度，只要延长后得到的核酸还能够启动在枯草芽孢杆菌中的转录即可。
其中，优选地，所述启动子具有如SEQ ID NO.5所示的核酸片段。其中，如SEQ IDNO.5所示的核酸片段长度为619bp，其本身也可以作为启动子使用；也可以在SEQ ID NO.5所示的核酸片段的5’端进行适当的延长直至达到620-1000bp的长度，只要延长后得到的核酸还能够启动在枯草芽孢杆菌中的转录即可。
本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体能够允许插入阅读框并使所插入的阅读框在细菌中表达出蛋白质，其中，所述重组表达载体中的启动子包括如上所述的启动子。
其中，待表达的蛋白质的阅读框序列可以通过查询或测序的方式确定，待表达的蛋白质的阅读框的DNA可以通过常规的分子生物学手段获得，例如全序列合成、PCR扩增和限制性酶切。通常地，所述重组表达载体上可以具有一些常规的元件，例如复制起始点、筛选基因、多克隆位点和转录终止信号等。
其中，优选地，所述重组表达载体具有如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ IDNO.7所示的序列。
本发明还提供了一种表达外源蛋白的方法，其中，该方法包括：将编码所述外源蛋白的阅读框插入如上所述的重组表达载体得到重组表达质粒，并将所述重组表达质粒导入感受态细菌中得到表达菌株，然后培养所述表达菌株。
其中，所述感受态细菌可以为常规使用的各种生物工程用的细菌，例如枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、解淀粉芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌中的至少一种，优选地，所述感受态细菌为枯草芽孢杆菌。
其中，本发明的启动子在细菌培养生长的对数期晚期和平台期时能够具有更高的转录活性，因此特别优选地，上述表达外源蛋白的方法包括：培养所述表达菌株至对数期晚期或平台期。
本发明还提供了如上所述的启动子在制备重组表达载体和/或表达质粒中的用途。可以将已有的重组表达载体和/或表达质粒中的启动子中的一个或多个用常规的基因工程手段(例如限制性酶切和/或PCR的方式)替换为本发明如上所述的启动子。
以下通过实施例进一步详细说明本发明。以下实施例中，制备感受态细菌所用的枯草芽孢杆菌WB600菌株购自江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心，CICIM编号B0033。
实施例1
本实施例用于说明本发明的启动子的获得方法。
采用天根细菌基因组提取试剂，按其说明书进行操作，使用枯草芽孢杆菌WB600菌株制备得到DNA。使用如表1所示的引物，对制备得到的DNA进行扩增，对扩增产物进行DNA测序，结果表明扩增产物分别为带有限制性内切酶位点及保护基的不同长度的如SEQ IENO.1-5所示的启动子。
表1
对比例1
使用PCR定点突变方法，对F4启动子进行突变，将F4启动子中的第74位的T突变为A，得到突变后的F4-M假启动子(序列为SEQ ID NO.12)。
使用扩增假启动子的引物(包括序列为ATACTGCAGTAAAGCGTTTACAATATATGTAG(SEQID NO.13)的上游引物和序列为ATACTCGAGACGTTCTACCTTTGTCAAACAA的下游引物(SEQ IDNO.11))，对制备得到的DNA进行扩增，对扩增产物进行DNA测序，结果表明扩增产物为序列为SEQ ID NO.14的F5假启动子。
使用扩增已知启动子P43的引物(包括序列为ATACTGCAGTGATAGGTGGTATGTTTTCG(SEQ ID NO.15)的上游引物和序列为ATACTCGAGGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAA的下游引物(SEQ ID NO.16))，对制备得到的DNA进行扩增，对扩增产物进行DNA测序，结果表明扩增产物为序列为SEQ ID NO.17的P43启动子。
测试实施例1
本测试实施例用于测试本发明的启动子的转录活性。
参考图1，pUBC19载体如文献(利用枯草芽孢杆菌ytkA和ywo F基因启动子与信号肽重组分泌表达mpd基因，生物工程学报，2006年)，bgaB报告基因的核酸片段通过DNA化学合成的方法获得，序列如SEQ ID NO.21所示。实施例1和对比例1获得的启动子的核酸片段的5’端带有PstI的酶切位点，3’端带有XhoI的酶切位点。bgaB报告基因的核酸片段的5’端带有XhoI的酶切位点，3’端带有BamHI的酶切位点。将不同的启动子的核酸片段分别与bgaB报告基因的核酸片段经XhoI酶切后连接，然后分别经PstI和BamHI酶切连接至pUBC19载体中得到bgaB报告基因的表达质粒，其中携带F0启动子和bgaB报告基因的质粒(即F0-bgaB：pUBC19质粒，参见图1)的序列如SEQ ID NO.18所示。
将上述得到的bgaB报告基因的表达质粒转化至枯草芽孢杆菌WB600菌株中。将转化得到的菌株分别在37℃的温度200rpm培养18小时，按照文献(JH,M.(1972)Experimentsin Molecular Genetics.Cold Spring Harbor Laboratory)中的方法，使用底物邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖(ONPG)测定β-半乳糖苷酶的活性，结果如表2所示。取使用F0启动子的菌株和使用P43启动子的菌株提取菌体蛋白并进行电泳，结果如图2所示，图2中，泳道1为使用P43启动子的菌株的菌体蛋白电泳结果，泳道2为使用P43启动子的菌株的菌体蛋白电泳结果。
表2
| 含不同启动子重组载体的WB600菌株 | β-半乳糖苷酶酶活(Miller-U) |
| F0 | 5021.5±116.4 |
| F1 | 4770.6±87.0 |
| F2 | 5092.4±120.4 |
| F3 | 4914.6±209.8 |
| F4 | 5692.4±713.7 |
| F5 | 139.4±8.5 |
| F4-M | 102.3±5.5 |
| P43 | 610.6±39.1 |
根据表2的数据和图2的结果可见，本发明的启动子具有较高的转录活性，能够显著地增加启动子下游的基因的表达量。
测试实施例2
本测试实施例用于测试比较本发明的启动子F0与淀粉酶诱导启动子Pamy的转录活性。
将携带中温淀粉酶诱导启动子Pamy和信号肽(命名为ZDpS)，并表达高温淀粉酶的ZDpS-高温淀粉酶质粒(序列如SEQ ID NO.19所示，即ZDpS-GD:pUBC19)作为对照质粒，将该质粒中的淀粉酶诱导启动子Pamy替换为发明的启动子F0，得到F0-ZDs-高温淀粉酶质粒(序列如SEQ ID NO.20所示，即F0-ZDs-GD:pUBC19)。
将上述得到的ZDpS-高温淀粉酶质粒和F0-ZDs-高温淀粉酶质粒分别转化至枯草芽孢杆菌WB600菌株中。按照文献(JH,M.(1972)Experiments in MolecularGenetics.Cold Spring Harbor Laboratory)中的方法，将转化得到的ZDpS-高温淀粉酶阳性克隆子菌株于LB+1％的淀粉(即100mL LB培养基中加入1g淀粉)培养基中培养，相对应的将转化得到的F0-ZDs-高温淀粉酶阳性克隆子菌株于相同LB培养基(但无添加淀粉)中培养，培养18小时后，测定高温淀粉酶酶活，结果如表3所示。
表3
| 含不同启动子的质粒转化的WB600菌株 | 高温淀粉酶酶活(U/mL) |
| F0-ZDs‐高温淀粉酶质粒 | 13.6±0.6 |
| ZDpS-高温淀粉酶质粒 | 12.2±0.4 |
表3结果表明，本发明的启动子与淀粉诱导启动子有相当甚至更高的转录活性，在工业生产应用可以减少诱导物淀粉的生产成本。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (3)
1.一种表达外源蛋白的方法，其特征在于，该方法包括：将编码所述外源蛋白的阅读框插入重组表达载体得到重组表达质粒，并将所述重组表达质粒导入感受态细菌中得到表达菌株，然后培养所述表达菌株；所述重组表达载体中的启动子为SEQ ID NO.5所示的启动子；所述感受态细菌为枯草芽孢杆菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述感受态细菌为枯草芽孢杆菌WB600。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括：培养所述表达菌株至对数期晚期或平台期。
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