KR20180086206A - 바실루스로부터의 변형된 양방향성 카탈라제 프로모터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일반적으로 발효 기술 및 이러한 발효에 유용한 미생물의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 미생물의 발효 특징을 변경시키는 데 유용한 핵산 및 단백질을 포함하는 물질, 및 이러한 핵산 및/또는 단백질을 포함하는 미생물에 관한 것이다.

Description

바실루스로부터의 변형된 양방향성 카탈라제 프로모터

본 발명은 일반적으로 발효 기술 및 이러한 발효에 유용한 미생물의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 미생물의 발효 특징을 변경시키는 데 유용한 핵산 및 단백질을 포함하는 물질, 및 이러한 핵산 및/또는 단백질을 포함하는 미생물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 산화적 스트레스에 대한 미생물 스트레스 내성을 부여하거나, 변형시키거나, 감소시키는 물질 및 방법에 관한 것이다.

관심 물질의 생명공학적 생산은 산업적 규모 상에서 일반적으로 미생물을 액체 배지에서 배양함으로써 수행되며, 여기서, 상기 미생물은 상기 관심 물질을 배양 조건 하에서 생산할 수 있다. 이러한 액체 발효 동안, 개별 미생물 세포는 시간 경과에 따라 크게 및 복잡한 방식으로 달라지는 조건을 경험한다. 이러한 변화하는 조건에 반응하여, 미생물 세포는 유전자 발현을 변경시킴으로써 반응할 수 있으며, 이는 다시 관심 물질의 바람직하지 않은 낮은 생산을 초래할 수 있다. 상응하게, 바람직하지 않은 발효 조건에 대한 개선된 회복력을 갖고, 따라서, 필적하는 미생물에 비해 관심 물질의 증가된 생산을 허용하는 미생물을 제공할 필요가 있다.

따라서, 이러한 스트레스 조건에 대한 그들의 회복력을 개선시키기 위해, 발효 동안 스트레스 조건을 결정하고, 미생물의 유전적 구성을 변형시키는 것이 빈번히 시도되었다. 불행하게도, 개별 미생물 세포에 의해 경험된 조건의 발효 및 이러한 조건에 대한 그들의 유전적 반응의 분석은 매우 곤란하다. 비간트 (Wiegand) 등 (Fermentation stage-dependent adaptations of Bacillus licheniformis during enzyme production; Microbial Cell Factories 2013, 12:120)은 이러한 분석을 시도하였다. 그러나, 발효 조건의 이해는 여전히 크게 불완전하게 남아 있다.

비간트 등은 시간 경과에 따른 식물 카탈라제 (KatA) 단백질 축적이 수브틸리신 프로테아제의 액체 발효 생산 동안 바실루스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis)에서 관찰될 수 없음을 보고하였지만, 본 발명자들은 놀랍게도 증가된 카탈라제 활성이 예를 들어 프로테아제의 액체 발효 생산에 있어서 예를 들어 비. 리케니포르미스의 전반적 발효 특징을 개선시킴을 밝혀내었다. 이는, 비간트 등에 따르면, O2 분압 (pO2)이 이러한 발효의 근본적으로 모든 단계 전반에 걸쳐 심각하게 감소되기 때문에, 훨씬 더 놀라웠다. 따라서, 주요 스트레서로서의 과산화수소의 형성은 예상되지 않았다.

따라서, 본 발명의 목적은 발효를 개선시키는 물질 및 방법을 제공하는 것이었다. 또한, 본 발명의 목적은 산화적 스트레스에 대한 미생물 스트레스 저항성을 부여하거나, 변형시키거나, 감소시키는 물질 및 방법을 제공하는 것이었다.

발명의 간단한 요약

따라서, 본 발명은 링커 섹션에 의해 서로로부터 분리된 -10 유형 박스 및 -35 유형 박스를 포함하는 프로모터이며, 각각의 박스가 -10 유형 박스에 대해 표 1에 따라 및 -35 유형 박스에 대해 표 2에 따라 각각의 위치에서 각각의 뉴클레오티드에 대한 값을 할당함으로써 수득가능한 각각의 점수를 갖는 각각의 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, -10 유형 박스에 대한 점수가 적어도 471이고, -35 유형 박스에 대한 점수가 적어도 159이고, 링커 섹션이 적어도 14개 뉴클레오티드의 길이 및 적어도 57％의 A/T 함량을 갖는 것인 프로모터를 제공한다.

<표 1>

<표 2>

본 발명의 프로모터는 바람직하게는 양방향성 프로모터이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 프로모터를 포함하는 핵산, 및 상기 핵산을 포함하는 원핵생물 숙주 세포를 제공한다.

본 발명은 또한 a) 발효 생성물을 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된 본 발명에 따른 프로모터를 포함하는 핵산을 포함하는 원핵생물 숙주 세포를 제공하는 단계, 및

b) 원핵생물 숙주 세포를 발효 생성물을 코딩하는 상기 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계

를 포함하는, 발효 생성물을 제조하기 위한 발효 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 a) 카탈라제를 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된 본 발명에 따른 프로모터를 포함하는 핵산을 포함하는 원핵생물 숙주 세포를 제공하는 단계, 및

b) 원핵생물 숙주 세포를 카탈라제를 코딩하는 상기 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계

를 포함하는, 발효 생성물을 제조하기 위한 발효 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 a) 한 가닥 상의 발효 생성물을 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결되고, 동시에 역 가닥 상의 카탈라제를 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된 본 발명의 양방향성 프로모터를 포함하는 핵산을 포함하는 원핵생물 숙주 세포를 제공하는 단계, 및

b) 원핵생물 숙주를 발효 생성물을 코딩하는 상기 유전자 및 카탈라제를 코딩하는 상기 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계

를 포함하는, 발효 생성물을 제조하기 위한 발효 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 프로모터를 카탈라제를 코딩하는 유전자와 작동가능하게 연결시키는 단계를 포함하는, 원핵생물 숙주 세포에서 카탈라제 발현 및/또는 카탈라제 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.

도 1은 본 발명의 바람직한 프로모터에 대한 바실루스 리케니포르미스의 야생형 KatA 프로모터의 정렬을 나타낸다.
도 2는 야생형 프로모터 및 본 발명에 따른 프로모터를 갖는 바실루스 리케니포르미스에서의 KatA 및 KatX 유전자의 유전자 발현 특징을 나타낸다.
도 3은 야생형 바실루스 리케니포르미스 ("야생형"으로 표지됨)에서의 및 KatA 유전자의 프로모터가 도 1에 나타내어진 본 발명에 따른 바람직한 프로모터에 의해 대체된 바실루스 리케니포르미스 ("돌연변이체"로 표지됨)에서의 총 카탈라제 활성의 비교를 나타낸다.
도 4는 야생형 바실루스 리케니포르미스에서의 KatA/KatX 프로모터의 조직을 나타낸다.
도 5는 프로모터 서열 서열식별번호 (SEQ ID NO): 1 (본 발명에 따른 것이 아님) 및 서열식별번호: 56 내지 71의 서열 정렬을 나타낸다. 단지 서열식별번호: 1만 전체 서열이 지시되어 있다. 모든 다른 서열에 대해, 점은 상응하는 위치에서의 서열식별번호: 1에서와 동일한 뉴클레오티드를 나타내고, 상응하는 위치에서의 서열식별번호: 1의 것과 상이한 뉴클레오티드가 철자화되어 있다. 예를 들어, 서열식별번호: 71은 5개 뉴클레오티드만큼 서열식별번호: 1과 상이하다.
도 6은 프로모터 서열 서열식별번호: 2 (본 발명에 따른 것이 아님) 및 서열식별번호 72 내지 87의 서열 정렬을 나타낸다. 단지 서열식별번호: 2만 전체 서열이 지시되어 있다. 모든 다른 서열에 대해, 점은 상응하는 위치에서의 서열식별번호: 2에서와 동일한 뉴클레오티드를 나타내고, 상응하는 위치에서의 서열식별번호: 2의 것과 상이한 뉴클레오티드가 철자화되어 있다. 예를 들어, 서열식별번호: 87은 5개 뉴클레오티드만큼 서열식별번호: 2와 상이하다.

본 발명은 특히 이하에 기재된 바와 같은 원핵생물 숙주 세포에 대한 프로모터와 관련된다. 본 발명의 프로모터는 링커 섹션에 의해 서로로부터 분리된 -10 유형 박스 및 -35 유형 박스를 포함한다. 이러한 일반적인 프로모터 구조는 원핵생물 세포에 대해 통상적이며, 예를 들어 문헌 [Jarmer et al., Microbiology 2001, 2417-2424]에 의해 분석되었다.

예로서, 본 발명자들은 본 발명에서 놀랍게도 바실루스 리케니포르미스 KatA 유전자의 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자의 발현이 상기 프로모터의 -10 유형 박스 및 -35 유형 박스를 연결시키는 링커 섹션의 길이를 변경시킴으로써 상당히 증가될 수 있음을 밝혀내었다. 이는 바실루스 리케니포르미스에서의 프로모터가 도 4에 개요된 바와 같이 역 ("마이너스") 가닥 상의 KatX 유전자의 발현을 지정하는 프로모터와 중첩하기 때문에 특히 놀라웠다. 따라서, KatA 프로모터 뉴클레오티드 서열의 임의의 변경은 상기 KatX 카탈라제의 발현을 감소시키거나 폐지할 위험을 수반함으로써, 바실루스 리케니포르미스에서의 전반적 카탈라제 발현을 잠재적으로 감소시켰으며, 이는 발효 특징에 대한 바람직하지 않은 영향, 및 특히 발효에 있어서 상기 바실루스의 사용에 의해 통상적으로 수득가능한 바람직한 발효 생성물의 수득을 가질 것이다.

본 발명의 프로모터는 일반적으로 시그마-A 의존적 프로모터의 부류에 속한다. 자르머 (Jarmer) 등이 기재한 바와 같이, 이러한 프로모터는 RNA 폴리머라제에 의해 전사를 개시시키는 데 요구되는 "박스"로도 지칭되는 2개의 다소 보존된 뉴클레오티드 서열 모티프를 포함한다. 비록 박테리아 게놈 및 예를 들어 바실루스 수브틸리스 (Bacillus subtilis)의 게놈은 완전히 및 반복적으로 시퀀싱되었지만, 이러한 박테리아에서의 유전자의 수 및 상응하게 프로모터의 수는 규정하기 힘들게 남아 있다. 또한, 뉴클레오티드 서열이 주어진 숙주 세포에서의 시그마-A 유형 프로모터로서 기능적일지 여부를 신뢰성 있게 예측하는 것은 일반적으로 가능하지 않다. 본 발명은 이 예측불가능성을 극복하거나 경감시키기 위한 지침을 제공한다.

본 발명에 따르면, -10 유형 박스 및 -35 유형 박스는 각각 각각의 점수를 갖는 각각의 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 점수는 임의의 갭 없이 5' 내지 3' 방향으로 각각의 위치에서의 각각의 뉴클레오티드에 대한 값을 할당함으로써 수득가능하다. -10 유형 박스의 뉴클레오티드 서열에 대해, 값은 표 1에 따라 선택되고, -35 유형 박스에 대해, 값은 표 2에 따라 선택된다. -10 유형 박스에 대한 점수는 적어도 497이고, -35 유형 박스에 대한 점수는 적어도 179이다. 따라서, 본 발명의 프로모터는 -10 유형 박스 및 -35 유형 박스의 각각의 뉴클레오티드 서열의 관점에서 일반적으로 상기 프로모터의 발현 강도를 손상시키지 않고 바람직한 또는 견딜만한 프로모터 가변성을 설명하기 위한 제한된 유연성을 허용한다.

통상의 기술자는 본 발명에 따른 프로모터의 -10 유형 박스가 예를 들어 바실루스 수브틸리스 프로모터의 표준적인 -10 유형 박스보다 더 길다는 것을 이해하고 있다. 이러한 연장된 -10 유형 박스는 예를 들어 헬만 (Helmann)에 의해 바실루스 수브틸리스 프로모터에 대해 기재되었다 (Nucleic Acids Research, 1995, 2351 to 2360). 그러나, 저자는 연장된 -10 유형 박스의 발생 또는 비-발생 및 링커 섹션의 길이 사이에 명백한 상관관계가 없음을 확립하였다. 따라서, 링커 섹션의 길이를 증가시킴으로써, 본 발명에 따른 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자의 발현이 상당히 증가될 수 있었음은 놀라웠다. 본 발명이 먼저 실행되었던 프로모터는 링커 섹션의 길이의 임의의 변경으로부터 이익을 얻지 않을 것으로 예상되어야 했는데, 이는 바실루스 리케니포르미스의 구성적 카탈라제의 발현을 지정하는 이 프로모터는 산소 스트레스 조건 하에서 이 미생물의 생존에 필수적이기 때문이다. 따라서, 이러한 프로모터는 그의 최대 발현 강도로의 진화에 의해 최적화되었던 것으로 예상되어야 했다. 이러한 우려와 반대로, 본 발명자들은 심지어 바실루스 리케니포르미스의 KatA 유전자의 발현을 지정하는 프로모터가 본 발명에 따라 기재된 바와 같은 링커 섹션의 증가된 길이로부터 이익을 얻음을 밝혀내었다.

링커 섹션은 -10 유형 박스 및 -35 유형 박스에 인접하여 위치하고, 이를 연결한다. 본 발명에 따르면, 링커 섹션은 적어도 14개 뉴클레오티드의 길이 및 적어도 73％의 A/T 함량을 갖는다. 이러한 길이의 링커는 링커 섹션이 단지 13개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 상응하는 프로모터에 비해 유전자 발현을 증가시키는 것을 허용한다.

바람직하게는, 링커 섹션의 뉴클레오티드 서열은 상기 각각의 서열의 뉴클레오티드 위치 1 내지 5 중 임의의 것의 앞에 1개 이상의 티미딘 및/또는 아데노신 뉴클레오시드의 삽입에 의해 서열 서열식별번호: 3 내지 18 중 임의의 것과 상이하다. 이처럼, 링커 섹션의 요구되는 A/T 함량은 유지되거나, 심지어 증가될 수 있으며, 이는 본 발명의 프로모터로부터의 유전자 발현의 증가를 용이하게 한다. 링커 섹션의 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 위치 1 내지 5 중 임의의 것 앞에 1개 이상의 티미딘 뉴클레오시드의 삽입에 의해 상기언급된 서열 서열식별번호: 3 내지 18 중 임의의 것과 상이한 것이 특히 바람직하다. 더욱이, 링커 섹션은 5' 내지 3' 방향으로 카운팅하여 링커 섹션의 최초 5개 및 최후 3개의 뉴클레오티드 내에 구아노신 또는 시티딘 뉴클레오시드를 포함하지 않는 것이 바람직하다.

또한 바람직하게는, 링커 섹션의 뉴클레오티드 서열은 상기 각각의 서열의 최후 뉴클레오티드 위치 바로 앞에 또는 바로 뒤에 1개 이상의 티미딘 및/또는 아데노신 뉴클레오티드의 삽입에 의해 서열 서열식별번호: 3 내지 18 중 임의의 것과 상이하다. 이처럼, 링커 섹션의 요구되는 A/T 함량은 또한 유지되거나, 심지어 증가될 수 있다. 본 발명의 프로모터가 마이너스 가닥 상의 -35 유형 박스를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 양방향성 프로모터인 경우, 링커 섹션 (즉, "플러스 가닥" 링커 섹션)의 말단에서의 아데노신 및/또는 티미딘 뉴클레오시드(들)의 삽입은 마이너스 가닥 상의 -10 유형 박스 및 -35 유형 박스의 거리를 변화시키지 않고 상기 링커 섹션의 길이를 증가시키는 것을 허용한다.

본 발명의 프로모터의 링커 섹션은 바람직하게는 많아야 18개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 보다 긴 링커 섹션에 대해, -10 유형 박스 및 -35 유형 박스 사이의 분리는 너무 커서 RNA 전사의 효율적인 개시를 허용하지 않는다. 바람직하게는, 링커 섹션은 14 내지 16개 뉴클레오티드의 길이를 갖고, 보다 더 바람직하게는 14 또는 15개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 이러한 링커 길이에 대해, -10 유형 박스 및 -35 유형 박스 사이의 분리는 시그마-A 유형의 원핵생물 RNA 폴리머라제에 의한 RNA 전사의 개시를 위해 최적에 가깝다. 가장 바람직하게는, 링커 섹션은 14개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.

링커 섹션의 A/T 함량은 바람직하게는 적어도 57％, 보다 더 바람직하게는 적어도 69％, 보다 더 바람직하게는 적어도 71％, 보다 더 바람직하게는 적어도 76％, 보다 더 바람직하게는 적어도 77％, 보다 더 바람직하게는 57％ 내지 92％, 보다 더 바람직하게는 69％ 내지 92％, 보다 더 바람직하게는 71％ 내지 92％, 보다 더 바람직하게는 76％ 내지 92％, 보다 더 바람직하게는 77％ 내지 92％, 보다 더 바람직하게는 85％ 내지 92％, 보다 더 바람직하게는 57％ 내지 85％, 보다 더 바람직하게는 69％ 내지 85％, 보다 더 바람직하게는 71％ 내지 85％, 보다 더 바람직하게는 76％ 내지 85％, 보다 더 바람직하게는 77％ 내지 85％이다. 보다 더 바람직하게는 A/T 함량은 88％, 또는 가장 바람직하게는, 77％이다.

본 발명에 따른 프로모터에서, -10 유형 박스의 뉴클레오티드 서열은 많아야 1개 뉴클레오티드만큼 서열 서열식별번호: 19 내지 31 중 임의의 것과 상이하고, 보다 더 바람직하게는 서열 서열식별번호: 19 내지 31로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, -10 유형 박스의 뉴클레오티드 서열은 많아야 1개 뉴클레오티드만큼 서열 서열식별번호: 19와 상이하거나, 보다 더 바람직하게는, 서열 서열식별번호: 19로 이루어진다. 이 서열은 바실루스 리케니포르미스 KatA 유전자의 야생형 프로모터 서열에서 마주치며, 유효한 것으로 나타났다.

따라서, -10 유형 박스의 점수는 바람직하게는 적어도 497, 보다 더 바람직하게는 적어도 508, 보다 더 바람직하게는 적어도 601, 보다 더 바람직하게는 적어도 620, 보다 더 바람직하게는 적어도 632, 보다 더 바람직하게는 적어도 640, 보다 더 바람직하게는 497 내지 708, 보다 더 바람직하게는 508 내지 708, 보다 더 바람직하게는 601 내지 708, 보다 더 바람직하게는 620 내지 708, 보다 더 바람직하게는 632 내지 708, 보다 더 바람직하게는 640 내지 708, 보다 더 바람직하게는 660 내지 708, 보다 더 바람직하게는 620 내지 660, 보다 더 바람직하게는 632 내지 660, 보다 더 바람직하게는 640 내지 660이다. 보다 더 바람직하게는 점수는 508, 또는 가장 바람직하게는, 640이다.

또한, -35 유형 박스의 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 많아야 1개 뉴클레오티드만큼 서열 서열식별번호: 32 내지 41 중 임의의 것과 상이하고, 보다 더 바람직하게는 서열 서열식별번호: 32 내지 41 중 임의의 것으로 이루어진다. 서열 서열식별번호: 32는 바실루스 리케니포르미스 KatA 야생형 프로모터에서 마주친다. 따라서, -35 유형 박스의 뉴클레오티드 서열은 많아야 1개 뉴클레오티드만큼 이 서열과 상이하고, 바람직하게는 이 서열 서열식별번호: 32로 이루어진다.

또한, -35 유형 박스의 점수는 바람직하게는 적어도 179, 보다 더 바람직하게는 적어도 280, 보다 더 바람직하게는 적어도 317, 보다 더 바람직하게는 적어도 322, 보다 더 바람직하게는 적어도 329, 보다 더 바람직하게는 179 내지 439, 보다 더 바람직하게는 280 내지 439, 보다 더 바람직하게는 317 내지 439, 보다 더 바람직하게는 322 내지 439, 보다 더 바람직하게는 329 내지 439, 보다 더 바람직하게는 280 내지 414, 보다 더 바람직하게는 317 내지 414, 보다 더 바람직하게는 322 내지 414, 보다 더 바람직하게는 329 내지 414, 보다 더 바람직하게는 317 내지 367, 보다 더 바람직하게는 322 내지 367, 보다 더 바람직하게는 329 내지 367이다. 보다 더 바람직하게는 점수는 322, 또는 가장 바람직하게는, 329이다.

프로모터 가변성의 경계는 또한 -35 및 -10 유형 박스의 점수의 합계에 의해 표현될 수 있다. 이 파라미터는 저-점수화 -35 유형 박스가 보다 높은 점수화 -10 유형 박스에 의해 보상될 수 있고, 역도 마찬가지임을 설명한다. 점수의 합계는 바람직하게는 적어도 826, 보다 더 바람직하게는 적어도 830, 보다 더 바람직하게는 적어도 931, 보다 더 바람직하게는 적어도 960, 보다 더 바람직하게는 적어도 969, 보다 더 바람직하게는 826 내지 1139, 보다 더 바람직하게는 830 내지 1139, 보다 더 바람직하게는 931 내지 1139, 보다 더 바람직하게는 960 내지 1139, 보다 더 바람직하게는 969 내지 1139, 보다 더 바람직하게는 826 내지 1043, 보다 더 바람직하게는 830 내지 1043, 보다 더 바람직하게는 931 내지 1043, 보다 더 바람직하게는 960 내지 1043, 보다 더 바람직하게는 969 내지 1043, 보다 더 바람직하게는 830 내지 998, 보다 더 바람직하게는 931 내지 998, 보다 더 바람직하게는 960 내지 998, 보다 더 바람직하게는 969 내지 998, 보다 더 바람직하게는 830, 또는 가장 바람직하게는, 969이다. 점수의 합계가 증가하는 경우, 바실루스 리케니포르미스 KatA 야생형 프로모터의 것과의 프로모터 뉴클레오티드 서열의 유사성이 증가한다. 따라서, 통상의 기술자는 선택된 프로모터 서열이 기능적일 것이며, 본 발명의 이익을 실현하는 것을 허용할 것임을 보다 확신할 수 있다.

상응하게, -10 유형 박스의 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 서열식별번호: 19 내지 22에 따른 서열로부터 선택되고, 동시에 -35 유형 박스의 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 서열식별번호: 32 내지 34에 따른 서열로부터 선택된다.

-10 유형 박스, 링커 섹션 및 -35 유형 박스 외에도, 본 발명의 프로모터는 바람직하게는 20개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 상류 섹션을 포함한다. 상류 섹션은 -35 유형 박스의 5' 방향 상류에 및 그에 인접하여 위치한다. 상류 섹션의 A/T 함량은 적어도 70％이고, 상류 영역의 A 함량은 적어도 35％이다. 이러한 높은 A/T 함량은 특히 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자의 강한 발현을 용이하게 한다. 바람직하게는, 상류 섹션의 A/T 함량은 적어도 77％, 보다 더 바람직하게는 적어도 80％, 보다 더 바람직하게는 적어도 87％ 및 보다 더 바람직하게는 적어도 89％이다. 더욱 바람직하게는, 상류 영역의 A/T 함량은 많아야 100％이고, 덜 바람직하게는 상류 영역이 A/T 함량은 많아야 95％이고, 보다 덜 바람직하게는 A/T 함량은 많아야 90％이다. 상응하게, 상류 섹션은 바람직하게는 아데노신 및 티미딘 뉴클레오티드로 전체적으로 구성된 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 덜 바람직하게는 상류 섹션은 아데노신 또는 티미딘이 아닌 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드를 포함한다. 상류 섹션에서, 아데노신도 티미딘도 아닌 뉴클레오티드는 바람직하게는 서로 인접하지 않는다. 더욱 바람직하게는, 상류 섹션의 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 연속적으로 반복되지 않는 뉴클레오티드의 수가 많아야 10 및 적어도 5개이도록, 보다 바람직하게는 많아야 8 및 적어도 6개이도록 하는 것이다. 예를 들어, 서열식별번호: 42에 따른 바람직한 상류 섹션 서열은 서열 위치 1, 2, 5, 10, 11, 15, 19 및 20에 8개의 이러한 단리된 뉴클레오티드를 갖는다. 서열 서열식별번호: 55에 대해, 수는 11개일 것이고, 단리된 뉴클레오티드의 상응하는 위치는 1, 2, 3, 4, 7, 12, 13, 17, 18, 19 및 20이다. 단리되거나 비-반복적인 뉴클레오티드의 이들 경계에 관하여, 상류 섹션 뉴클레오티드 서열은 2개 이상의 반복하는 뉴클레오티드의 대략 5개 스트레치를 함유할 것이고, 그 중 바람직하게는 적어도 4개는 반복하는 아데노신 뉴클레오티드의 스트레치임이 보장된다. 이러한 반복은 RNA 폴리머라제의 결합에 대해 바람직하며, 따라서, 본 발명의 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자의 높은 발현을 허용한다. 동일한 이유로, 상류 섹션의 A 함량은 바람직하게는 적어도 45％, 보다 더 바람직하게는 적어도 52％이고, 보다 더 바람직하게는 적어도 60％이다. 의심의 여지를 없애기 위해, 본 발명에 대해 용어 "A 함량"은 임의의 갭 없는 총 서열 길이, 즉, 상류 섹션에 대해 20개에 비한 아데노신 뉴클레오티드의 수를 의미한다. 상응하게, 용어 "A/T 함량"은 총 서열 길이의 퍼센트로서 표현되는 아데노신 또는 티미딘 중 어느 하나인 뉴클레오티드의 수를 지시한다. 바람직한 상류 섹션 서열은 본원에서 서열식별번호: 42 내지 55로서 주어지며, 여기서, 서열식별번호: 42에 따른 상류 섹션 서열이 가장 바람직하다. 덜 바람직한 것은 1개 뉴클레오티드만큼 서열식별번호: 42에 따른 서열과 상이한 그러한 상류 서열이다. 보다 덜 바람직한 것은 2개 뉴클레오티드만큼 서열 서열식별번호: 42와 상이한 상류 섹션에 대한 서열이다. 보다 덜 바람직한 것은 3개 뉴클레오티드만큼 서열식별번호: 42에 따른 서열과 상이한 상류 서열이다. 특히 바람직한 상류 서열은 서열식별번호: 43, 44, 45, 46 및 47 중 임의의 것에 따른 것들이다.

상류에 46개 뉴클레오티드가 연장된 ("리드-인 섹션"), 즉, 상류 섹션의 5' 방향에 있는 서열의 A/T 함량은 적어도 70％인 것이 임의적이지만 바람직하다. 서열식별번호: 2에 따른 서열에서, 이 46개 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 56 내지 101에 위치한다.

본 발명에 따른 특히 바람직한 프로모터는 많아야 15개 뉴클레오티드, 보다 더 바람직하게는 많아야 14개 뉴클레오티드, 보다 더 바람직하게는 많아야 13개 뉴클레오티드, 보다 더 바람직하게는 많아야 12개 뉴클레오티드, 보다 더 바람직하게는 많아야 11개 뉴클레오티드, 보다 더 바람직하게는 많아야 10개 뉴클레오티드, 보다 더 바람직하게는 많아야 9개 뉴클레오티드, 보다 더 바람직하게는 많아야 8개 뉴클레오티드만큼, 보다 바람직하게는 많아야 7개 뉴클레오티드만큼, 보다 더 바람직하게는 많아야 6개 뉴클레오티드만큼, 보다 더 바람직하게는 많아야 5개 뉴클레오티드만큼, 보다 더 바람직하게는 많아야 4개 뉴클레오티드만큼, 보다 더 바람직하게는 많아야 3개 뉴클레오티드만큼, 보다 더 바람직하게는 많아야 2개 뉴클레오티드만큼 및 보다 더 바람직하게는 1개 뉴클레오티드만큼 서열식별번호: 1에 따른 서열과 상이하며, 여기서, 각각의 경우, 하나의 이러한 상이한 뉴클레오티드는 서열식별번호: 1에 따른 위치 70 내지 85 중 임의의 것에서의, 바람직하게는 위치 70 내지 76 중 임의의 것에서의 아데노신 또는 티미딘 뉴클레오티드의 삽입이다. 가장 바람직하게는, 삽입된 뉴클레오티드는 서열식별번호: 1 또는 2의 7개의 연속적 티미딘 뉴클레오티드의 스트레치가 8개의 티미딘 뉴클레오티드의 스트레치가 되도록 연장되도록 하는 티미딘이다. 이러한 서열의 예는 본원에서 서열식별번호: 56으로서 주어진다. 양방향성 프로모터에 관하여 하기 기재된 바와 같이, 뉴클레오티드는 또한 링커 섹션의 최후 뉴클레오티드 앞에 또는 뒤에 삽입될 수 있다. 상기 지시된 바와 같이, -10 유형 박스, -35 유형 박스의 및 링커 섹션의 뉴클레오티드 서열은 또한 다양할 수 있으며, 상응하는 서열의 예는 본원에서 서열식별번호: 57 내지 71로서 주어진다. 또한 상기 지시된 바와 같이, 상류 섹션의 서열 및 상류 섹션의 상류에 46개 뉴클레오티드가 연장된 서열은 또한 서열 서열식별번호: 56 내지 71의 상응하는 섹션과 상이할 수 있다. 본 발명에 따르면, 서열식별번호: 56에 따른 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프로모터가 특히 바람직하며, 실시예에 보다 상세히 기재되어 있다. 동등하게 바람직한 것은 서열식별번호: 2에 따른 서열에서, 서열식별번호: 1에 따른 하위서열을 서열식별번호: 56에 따른 서열에 의해 대체함으로써 수득가능한 프로모터이다.

본 발명의 프로모터는 바람직하게는 양방향성 프로모터이다. 본원에 기재된 바와 같이, 프로모터는 mRNA 전사 기구의 맥락에서, mRNA 전사가 개시되고, 프로모터의 3' 방향에서 하류에 위치한 유전자의 서열이 상응하는 뉴클레오티드 서열의 mRNA 분자 내로 전사되도록, 일반적으로 이중-가닥 DNA에의 RNA 폴리머라제의 결합을 제어한다. DNA의 이중-가닥꼬임으로 인해, 프로모터는 DNA의 임의의 가닥 상에 위치할 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "양방향성 프로모터"는 중첩하는 뉴클레오티드 서열의 2개의 프로모터의 세트를 지시하는 데 사용되며, 여기서, 하나의 프로모터는 하나의 DNA 가닥 ("플러스 가닥"으로도 지칭됨) 상에서 그에 작동가능하게 연결된 유전자의 mRNA 전사를 제어하고, 제2 프로모터는 반대 가닥 ("역 가닥" 또는 "마이너스 가닥"으로도 지칭됨) 상에서 그에 작동가능하게 연결되고 위치한 제2 유전자의 발현을 제어한다. 본원에서 구체적으로 지시되지 않는다면, 프로모터, 서열, -10 유형 박스, -35 유형 박스, 링커 섹션, 상류 섹션 등에 대한 모든 언급은 플러스 가닥을 지칭한다.

양방향성 프로모터의 예는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2에 따른 핵산이며, 이는 바실루스 리케니포르미스의 KatA 및 KatX 유전자 둘 다의 야생형 프로모터이다. 이들 서열에서, 마이너스 가닥 상의 프로모터의 -35 박스는 상기 정의된 바와 같은 플러스 가닥 상의 링커 섹션에 해당한다. 따라서, 본 발명의 프로모터에서 (플러스-가닥) 링커 섹션의 길이를 증가시킴으로써, 역 가닥 상의 -35 유형 박스 및 -10 유형 박스 사이의 거리는 또한 증가될 수 있다. -10 유형 박스 및 -35 유형 박스 사이의 거리에 대한 RNA 폴리머라제의 민감성으로 인해, 이들 박스 사이의 거리의 변화는 마이너스 가닥 상의 프로모터의 RNA 전사 강도의 감소를 초래할 것으로 예상되어야 했다. 그러나, 놀랍게도, 마이너스 가닥 프로모터의 전사 효율의 이러한 원하지 않는 감소는 관찰되지 않거나, 적어도 과도하게 강하지 않다.

본 발명의 양방향성 프로모터의 마이너스 가닥 프로모터는 또한 -10 유형 박스, 링커 섹션 및 -35 유형 박스를 포함한다. 이들 요소에 대한 상기 지시된 제한은 또한 마이너스 가닥 프로모터의 상응하는 요소에 반드시 적용되지는 않는다. 그러나, 본 발명의 바람직한 실시양태에서 -10 유형 박스 및 -35 유형 박스에 관한 정의 및 제한은 또한 마이너스 가닥 프로모터의 이들 요소에 적용된다. 따라서, 마이너스 가닥 프로모터의 -10 유형 박스의 점수는 바람직하게는 적어도 497, 보다 더 바람직하게는 적어도 508, 보다 더 바람직하게는 497 내지 708, 보다 더 바람직하게는 508 내지 708, 보다 더 바람직하게는 497 내지 660, 보다 더 바람직하게는 508 내지 660이고, -가닥 프로모터의 -35 유형 박스의 점수는 바람직하게는 적어도 179, 보다 더 바람직하게는 적어도 280, 보다 더 바람직하게는 적어도 317, 보다 더 바람직하게는 적어도 322, 보다 더 바람직하게는 적어도 329, 보다 더 바람직하게는 179 내지 439, 보다 더 바람직하게는 280 내지 439, 보다 더 바람직하게는 317 내지 439, 보다 더 바람직하게는 322 내지 439, 보다 더 바람직하게는 280 내지 414, 보다 더 바람직하게는 317 내지 414, 보다 더 바람직하게는 322 내지 414, 보다 더 바람직하게는 317 내지 367, 보다 더 바람직하게는 322 내지 367이다. 가장 바람직하게는, 마이너스 가닥 프로모터의 -10 및 -35 유형 박스의 점수의 합계는 플러스 가닥 프로모터의 -10 및 -35 유형 박스의 점수의 합계 미만이다.

또한 바람직하게는, 마이너스 가닥 프로모터의 -35 유형 박스는 플러스 가닥 프로모터의 링커 섹션 내에 위치한다. 이에 따라, 플러스 가닥 프로모터 및 마이너스 가닥 프로모터 사이의 최소 간섭을 갖고, 따라서, 플러스 및 마이너스 가닥 프로모터의 -35 유형 박스 및 -10 유형 박스의 정확한 서열에 관하여 유연성을 갖는 조밀한, 짧은 길이 양방향성 프로모터가 수득된다.

바람직하게는, 마이너스 가닥 상의 10 유형 박스 및 -35 유형 박스 사이의 거리는 (플러스 가닥) 링커 섹션의 길이를 증가시킴으로써 증가되지 않는다. 이는 1개 이상의 뉴클레오티드를 마이너스 가닥 상의 -35 박스 "뒤의" 링커 섹션 내로, 예를 들어 플러스 가닥 상의 -10 유형 박스 및 링커 섹션 바로 사이에 삽입함으로써 달성될 수 있다. 이는 또한 링커 섹션에 삽입된 뉴클레오티드의 수 이상의 플러스 가닥의 상류 섹션에서의 다수의 뉴클레오티드를 결실시킴으로써 달성될 수 있다.

본 발명은 또한 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 본 발명의 프로모터를 포함하는 핵산을 제공한다. 본원에 지시된 바와 같은 용어 "작동가능하게 연결된"은 RNA 폴리머라제가 각각의 DNA 가닥의 전사를 개시시켜 각각의 유전자 서열의 전사체를 포함하는 mRNA를 생성할 수 있도록, 유전자 서열이 프로모터의 -10 유형 박스의 3' 방향에 위치함을 지시한다. 전형적으로, mRNA 전사는 시작 코돈의 5' 방향에서 시작되고; 따라서, -10 유형 박스 및 시작 코돈은 바람직하게는 리보솜 결합 부위를 포함하는 핵산에 의해 연결된다. 본 발명의 프로모터에 대해, 상기 기재된 -10 유형 박스는 바람직하게는 20 내지 50개 뉴클레오티드 길이의 핵산에 의해 시작 코돈으로부터 분리된다. 서열 서열식별번호: 2로부터 유래된 프로모터에 대해, 시작 코돈은 -10 유형 박스의 최후 뉴클레오티드 ("...caT" 상의 서열 서열식별번호: 2에서 종결) 및 시작 코돈의 최초 뉴클레오티드 사이의 거리가 37이도록, 최후 뉴클레오티드에 바로 인접하여 부착될 수 있다. 이러한 배치형태는 실시예에 기재된 바와 같이 바실루스 리케니포르미스의 KatA 프로모터에서 마주치고, 실시예에 기재된 바와 같이, KatA 유전자의 특히 강한 발현을 허용한다.

따라서, 본 발명에 따른 핵산은 본 발명의 프로모터 및 그에 작동가능하게 연결된 표적 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 본 발명의 프로모터가 양방향성 프로모터인 경우, 본 발명의 핵산은 바람직하게는 각각의 가닥에 대해, 각각의 가닥의 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나의 유전자를 포함한다. 이러한 배치형태에서 본 발명의 프로모터는 2개의 유전자 사이에 "샌드위치되며", 즉, 어느 하나의 가닥 상에 하나의 유전자가 있다. 이 배치형태는 본 발명의 프로모터에 의해 부여되는 이익을 완전히 사용하는 것을 허용하며, 특히 원핵생물 숙주 세포에서 강하게 발현되는 둘 다의 유전자를 갖는 것을 허용한다.

본 발명에 따른 핵산은, 그것이 본원에 기재된 바와 같은 적어도 1개의 뉴클레오티드의 삽입에 의해 바실루스 리케니포르미스의 야생형 KatA 프로모터와 상이하기 때문에 재조합 핵산이다.

표적 유전자는 바람직하게는 효소를 코딩한다. 효소는 바람직하게는 카탈라제, 프로테아제, 아밀라제, 카르보히드라제, 리파제, 셀룰라제, 풀루라나제, 큐티나제, 펙티나제, 만나나제, 아라비나제, 갈락타나제, 크실라나제, 옥시다제, 예를 들어 락카제, 퍼옥시다제, 이소머라제, 트랜스퍼라제, 키나제, 및 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서, 바람직한 프로테아제는 수브틸리신 프로테아제이다. 특히 바람직한 유전자는 카탈라제를 코딩하는 유전자이고, 이들 중에서 바실루스 (Bacillus) 종의 카탈라제 유전자 KatA 및 KatX, 보다 더 바람직하게는 유니프로트 (Uniprot) 데이터베이스에 수탁 번호 B4AFT4_BACPU, A8FBF9_BACP2, A0A063Z4T4_BACPU, A0A0B0QA43_9BACI, M5RKX5_9BACI, K2MHE7_9BACI, W8QL66_BACPU, W6ANB4_BACPU, A0A0B4S5R6_9BACI, A0A059NBL2_9BACI, A0A0C2PYN3_BACPU 및 A0A081LAW9_9BACI 중 임의의 것 하에 기록된 바실루스 푸밀루스 (Bacillus pumilus)의 KatX2 카탈라제를 코딩하거나, 상기언급된 유니프로트 수탁 번호 중 임의의 것 하에 기록된 KatX2 카탈라제와 적어도 90％ 아미노산 서열 동일성을 갖는 카탈라제를 코딩하는 카탈라제 유전자이다. 의심의 여지를 없애기 위해, 각각의 서열은 2015년 11월 9일에 데이터베이스에 기록된 것들이다.

본 발명에 따른 핵산은 바람직하게는 원핵생물 숙주 세포가 구축물 또는 발현 벡터로 형질전환될 수 있도록 하는 구축물 또는 발현 벡터이다. 형질전환 후, 본 발명의 핵산은 예를 들어 상동 재조합에 의해 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있다. 이러한 통합의 결과로서, 숙주 세포 게놈은 본 발명에 따른 프로모터의 제어 하에서 표적 유전자를 포함한다. 이처럼 숙주 세포에 의한 표적 유전자의 안정한 발현은 심지어 많은 세대의 숙주 세포 생식 후에도, 바람직하게는 심지어 항생제 저항성 유전자와 같은 선택 마커의 부재 하에서도 달성될 수 있다.

본 발명에 따르면, 핵산은 숙주 세포 게놈 내로 통합될 필요는 없으며, 대신 그로부터 분리되어 유지될 수 있다. 이러한 경우, 본 발명에 따른 핵산은 바람직하게는 플라스미드이고, 그 자신의 복제 원점을 포함한다. 이처럼, 본 발명의 핵산의 높은 카피 수는 숙주 세포에서 달성될 수 있으며, 따라서, 표적 유전자 또는 유전자들의 발현을 추가로 증가시킨다.

또한, 본 발명에 따른 핵산은 원핵생물 숙주 세포의 게놈일 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 이는 구축물을 원핵생물 숙주 세포의 야생형 게놈 내로 통합함으로써 달성될 수 있다. 바람직하게는, 통합은 본 발명의 프로모터와 유사한 야생형 프로모터가 바람직하게는 상동 재조합에 의해 본 발명의 상기 프로모터에 의해 대체되도록 하는 것이다. 이처럼, 본 발명의 이익 및 특히 상응하는 야생형에 비해 표적 유전자의 발현 강도의 증가는 많은 세대 동안, 바람직하게는 심지어 선택 마커의 부재 하에서도 숙주 세포에서 유지될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 프로모터는 바실루스 리케니포르미스의 야생형 KatA 프로모터를 대체한다. 실시예에 기재된 바와 같이, 이러한 대체는 KatX 카탈라제 유전자의 발현을 상당히 손상시키지 않고, 유익하게는 또한 바실루스 리케니포르미스의 발효 동안 KatX 카탈라제 발현의 증가를 손상시키지 않고, 카탈라제 유전자 KatA의 발현을 증가시키는 것을 허용한다.

원핵생물 숙주 세포의 게놈은 본 발명에 따를 수 있고, 또한 프로모터-표적 유전자 조합의 각각의 카피에 대해 상이할 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 상응하는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 본 발명의 프로모터의 2개 이상의 카피를 포함한다. 이는 원핵생물 숙주 세포의 발효 동안 표적 유전자의 높은 발현 강도를 유지하는 것을 허용한다.

본 발명에 따른 원핵생물 숙주 세포는 바람직하게는 바실루스(Bacillus)의 분류학적 강에, 바람직하게는 바실랄레스 (Bacillales) 또는 락토바실랄레스 (Lactobacillales) 목에, 보다 바람직하게는 알리시클로바실라세아에 (Alicyclobacillaceae), 바실라세아에 (Bacillaceae), 리스테리아세아에 (Listeriaceae), 파에니바실라세아에 (Paenibacillaceae), 파스테우리아세아에 (Pasteuriaceae), 플라노코카세아에 (Planococcaceae), 스포로락토바실라세아에 (Sporolactobacillaceae), 스타필로코카세아에 (Staphylococcaceae) 및 테르모악티노미세타세아에 (Thermoactinomycetaceae)로부터 선택되는 과에, 및 가장 바람직하게는 바실루스 속에 속한다. 이 속 내에서, 본 발명의 원핵생물 숙주 세포는 바람직하게는 바실루스 아비살리스 (Bacillus abyssalis), 바실루스 악시디셀러 (Bacillus acidiceler), 바실루스 악시디콜라 (Bacillus acidicola), 바실루스 악시디프로두센스 (Bacillus acidiproducens), 바실루스 악시도풀룰리티쿠스 (Bacillus acidopullulyticus), 바실루스 악시도보란스 (Bacillus acidovorans), 바실루스 아에올리우스 (Bacillus aeolius), 바실루스 아에리스 (Bacillus aeris), 바실루스 아에리우스 (Bacillus aerius), 바실루스 아에로필루스 (Bacillus aerophilus), 바실루스 아에스투아리이 (Bacillus aestuarii), 바실루스 아이딩겐시스 (Bacillus aidingensis), 바실루스 아키바이 (Bacillus akibai), 바실루스 알칼리이눌리누스 (Bacillus alcaliinulinus), 바실루스 알칼로필루스 (Bacillus alcalophilus), 바실루스 알기콜라 (Bacillus algicola), 바실루스 알칼리니트릴리쿠스 (Bacillus alkalinitrilicus), 바실루스 알칼리세디미니스 (Bacillus alkalisediminis), 바실루스 알칼리텔루리스 (Bacillus alkalitelluris), 바실루스 알칼리톨레란스 (Bacillus alkalitolerans), 바실루스 알칼로가이아 (Bacillus alkalogaya), 바실루스 알티투디니스 (Bacillus altitudinis), 바실루스 알베아이우엔시스 (Bacillus alveayuensis), 바실루스 아밀리엔시스 (Bacillus amiliensis), 바실루스 안드레에세니이 (Bacillus andreesenii), 바실루스 아퀴마리스 (Bacillus aquimaris), 바실루스 아르부티니보란스 (Bacillus arbutinivorans), 바실루스 아리아브하타이 (Bacillus aryabhattai), 바실루스 아사히이 (Bacillus asahii), 바실루스 아우란티아쿠스 (Bacillus aurantiacus), 바실루스 아조토포르만스 (Bacillus azotoformans), 바실루스 바디우스 (Bacillus badius), 바실루스 바에크리웅겐시스 (Bacillus baekryungensis), 바실루스 바타비엔시스 (Bacillus bataviensis), 바실루스 베이징겐시스 (Bacillus beijingensis), 바실루스 벤조에보란스 (Bacillus benzoevorans), 바실루스 베링겐시스 (Bacillus beringensis), 바실루스 베르켈레이이 (Bacillus berkeleyi), 바실루스 베베리드게이 (Bacillus beveridgei), 바실루스 보고리엔시스 (Bacillus bogoriensis), 바실루스 봄비셉티쿠스 (Bacillus bombysepticus), 바실루스 보로니필루스 (Bacillus boroniphilus), 바실루스 부타놀리보란스 (Bacillus butanolivorans), 바실루스 카나베랄리우스 (Bacillus canaveralius), 바실루스 카르보니필루스 (Bacillus carboniphilus), 바실루스 카사만센시스 (Bacillus casamancensis), 바실루스 카테눌라투스 (Bacillus catenulatus), 바실루스 세셈벤시스 (Bacillus cecembensis), 바실루스 셀룰로실리티쿠스 (Bacillus cellulosilyticus), 바실루스 세레우스 (Bacillus cereus) 군, 바실루스 추정종 푸밀루스 (Bacillus cf. pumilus) SG2, 바실루스 카간노렌시스 (Bacillus chagannorensis), 바실루스 칸디가르헨시스 (Bacillus chandigarhensis), 바실루스 쿵강겐시스 (Bacillus chungangensis), 바실루스 시비 (Bacillus cibi), 바실루스 시르쿨란스 (Bacillus circulans), 바실루스 클라우시이 (Bacillus clausii), 바실루스 코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실루스 코아후일렌시스 (Bacillus coahuilensis), 바실루스 코오니이 (Bacillus cohnii), 바실루스 콤포스티 (Bacillus composti), 바실루스 코니페룸 (Bacillus coniferum), 바실루스 달리엔시스 (Bacillus daliensis), 바실루스 다낭겐시스 (Bacillus danangensis), 바실루스 데키시프론디스 (Bacillus decisifrondis), 바실루스 데콜로라티오니스 (Bacillus decolorationis), 바실루스 데라미피칸스 (Bacillus deramificans), 바실루스 데세르티 (Bacillus deserti), 바실루스 디이벨로렌시스 (Bacillus djibelorensis), 바실루스 드렌텐시스 (Bacillus drentensis), 바실루스 에이세니아에 (Bacillus eiseniae), 바실루스 엔도피티쿠스 (Bacillus endophyticus), 바실루스 엔도라디키스 (Bacillus endoradicis), 바실루스 파라기니스 (Bacillus farraginis), 바실루스 파스티디오수스 (Bacillus fastidiosus), 바실루스 페라리아룸 (Bacillus ferrariarum), 바실루스 피르미스 (Bacillus firmis), 바실루스 피르무스 (Bacillus firmus), 바실루스 플라보칼다리우스 (Bacillus flavocaldarius), 바실루스 플렉수스 (Bacillus flexus), 바실루스 포라미니스 (Bacillus foraminis), 바실루스 포르디이 (Bacillus fordii), 바실루스 포르티스 (Bacillus fortis), 바실루스 푸코시보란스 (Bacillus fucosivorans), 바실루스 푸마리올리 (Bacillus fumarioli), 바실루스 푸니쿨루스 (Bacillus funiculus), 바실루스 갈락토시딜리티쿠스 (Bacillus galactosidilyticus), 바실루스 갈리키엔시스 (Bacillus galliciensis), 바실루스 기브소니이 (Bacillus gibsonii), 바실루스 긴셍기솔리 (Bacillus ginsenggisoli), 바실루스 긴셍기 (Bacillus ginsengi), 바실루스 긴셍기후미 (Bacillus ginsengihumi), 바실루스 긴셍기솔리 (Bacillus ginsengisoli), 바실루스 고트헬리이 (Bacillus gottheilii), 바실루스 그라미니스 (Bacillus graminis), 바실루스 그라나덴시스 (Bacillus granadensis), 바실루스 하켄사키이 (Bacillus hackensackii), 바실루스 할마팔루스 (Bacillus halmapalus), 바실루스 할로카레스 (Bacillus halochares), 바실루스 할로두란스 (Bacillus halodurans), 바실루스 할로사카로보란스 (Bacillus halosaccharovorans), 바실루스 헤미셀룰로실리티쿠스 (Bacillus hemicellulosilyticus), 바실루스 헤미센트로티 (Bacillus hemicentroti), 바실루스 헤르베르스테이넨시스 (Bacillus herbersteinensis), 바실루스 호리코쉬이 (Bacillus horikoshii), 바실루스 호르네키아에 (Bacillus horneckiae), 바실루스 호르티 (Bacillus horti), 바실루스 후미 (Bacillus humi), 바실루스 후나넨시스 (Bacillus hunanensis), 바실루스 화진포엔시스 (Bacillus hwajinpoensis), 바실루스 이드리엔시스 (Bacillus idriensis), 바실루스 인디쿠스 (Bacillus indicus), 바실루스 인판티스 (Bacillus infantis), 바실루스 인페르누스 (Bacillus infernus), 바실루스 인테르메디우스 (Bacillus intermedius), 바실루스 이라넨시스 (Bacillus iranensis), 바실루스 이사벨리아에 (Bacillus isabeliae), 바실루스 이스라엘리 (Bacillus israeli), 바실루스 이스로넨시스 (Bacillus isronensis), 바실루스 제오트갈리 (Bacillus jeotgali), 바실루스 코키이 (Bacillus kochii), 바실루스 코레엔시스 (Bacillus koreensis), 바실루스 코를렌시스 (Bacillus korlensis), 바실루스 크리벤시스 (Bacillus kribbensis), 바실루스 크룰위키아에 (Bacillus krulwichiae), 바실루스 레헨시스 (Bacillus lehensis), 바실루스 렌투스 (Bacillus lentus), 바실루스 리토랄리스 (Bacillus litoralis), 바실루스 로키살리스 (Bacillus locisalis), 바실루스 롱기쿠아에시툼 (Bacillus longiquaesitum), 바실루스 롱기스포루스 (Bacillus longisporus), 바실루스 루시페렌시스 (Bacillus luciferensis), 바실루스 루테올루스 (Bacillus luteolus), 바실루스 망그로벤시스 (Bacillus mangrovensis), 바실루스 만나닐리티쿠스 (Bacillus mannanilyticus), 바실루스 마르코레스팅크툼 (Bacillus marcorestinctum), 바실루스 마리스플라비 (Bacillus marisflavi), 바실루스 마르마렌시스 (Bacillus marmarensis), 바실루스 마실로아노렉시우스 (Bacillus massilioanorexius), 바실루스 마실리오세네갈렌시스 (Bacillus massiliosenegalensis), 바실루스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실루스 메카테리움 (Bacillus meqaterium), 바실루스 메타놀리쿠스 (Bacillus methanolicus), 바실루스 메틸로트로피쿠스 (Bacillus methylotrophicus), 바실루스 무랄리스 (Bacillus muralis), 바실루스 무리마르티니 (Bacillus murimartini), 바실루스 난하이이세디미니스 (Bacillus nanhaiisediminis), 바실루스 네알소니이 (Bacillus nealsonii), 바실루스 네이즈호우엔시스 (Bacillus neizhouensis), 바실루스 네마토시다 (Bacillus nematocida), 바실루스 니아벤시스 (Bacillus niabensis), 바실루스 니아시니 (Bacillus niacini), 바실루스 니트리토필루스 (Bacillus nitritophilus), 바실루스 노발리스 (Bacillus novalis), 바실루스 오세아니세디미니스 (Bacillus oceanisediminis), 바실루스 오벤시스 (Bacillus ohbensis), 바실루스 오크헨시스 (Bacillus okhensis), 바실루스 오쿠히덴시스 (Bacillus okuhidensis), 바실루스 올레로니우스 (Bacillus oleronius), 바실루스 올리바에 (Bacillus olivae), 바실루스 오리자에 (Bacillus oryzae), 바실루스 오스히멘시스 (Bacillus oshimensis), 바실루스 파키스타넨시스 (Bacillus pakistanensis), 바실루스 파나시테라에 (Bacillus panaciterrae), 바실루스 파타고니엔시스 (Bacillus patagoniensis), 바실루스 페르시쿠스 (Bacillus persicus), 바실루스 페르바구스 (Bacillus pervagus), 바실루스 피키노티이 (Bacillus pichinotyi), 바실루스 플라코르티디스 (Bacillus plakortidis), 바실루스 포케오넨시스 (Bacillus pocheonensis), 바실루스 폴리페르멘티쿠스 (Bacillus polyfermenticus), 바실루스 폴리고니 (Bacillus polygoni), 바실루스 슈달칼리필루스 (Bacillus pseudalcaliphilus), 바실루스 슈도피르무스 (Bacillus pseudofirmus), 바실루스 슈도메가테리움 (Bacillus pseudomegaterium), 바실루스 슈도미코이데스 (Bacillus pseudomycoides), 바실루스 시크로사카롤리티쿠스 (Bacillus psychrosaccharolyticus), 바실루스 푸밀루스, 바실루스 푸르가티오니레시스텐스 (Bacillus purgationiresistens), 바실루스 킹다오넨시스 (Bacillus qingdaonensis), 바실루스 라세밀락티쿠스 (Bacillus racemilacticus), 바실루스 리조스파에라에 (Bacillus rhizosphaerae), 바실루스 루리스 (Bacillus ruris), 바실루스 사펜시스 (Bacillus safensis), 바실루스 살라리우스 (Bacillus salarius), 바실루스 살리필루스 (Bacillus saliphilus), 바실루스 살수스 (Bacillus salsus), 바실루스 셀레나타르세나티스 (Bacillus selenatarsenatis), 바실루스 세네갈렌시스 (Bacillus senegalensis), 바실루스 세오하에아넨시스 (Bacillus seohaeanensis), 바실루스 사클레토니이 (Bacillus shackletonii), 바실루스 샨동겐시스 (Bacillus shandongensis), 바실루스 시아멘시스 (Bacillus siamensis), 바실루스 시밀리스 (Bacillus similis), 바실루스 심플렉스 (Bacillus simplex), 바실루스 시랄리스 (Bacillus siralis), 바실루스 스미티이 (Bacillus smithii), 바실루스 솔리 (Bacillus soli), 바실루스 송클렌시스 (Bacillus songklensis), 바실루스 스포로테르모두란스 (Bacillus sporothermodurans), 바실루스 스트라토스페리쿠스 (Bacillus stratosphericus), 바실루스 스트라토스페리쿠시 (Bacillus stratosphericusi), 바실루스 수브테라네우스 (Bacillus subterraneus), 바실루스 수브틸리스 군, 바실루스 타에아넨시스 (Bacillus taeanensis), 바실루스 테퀼렌시 (Bacillus tequilensi), 바실루스 타온히엔시스 (Bacillus thaonhiensis), 바실루스 테르모알칼로필루스 (Bacillus thermoalkalophilus), 바실루스 테르모아밀롤리쿠에파시엔스 (Bacillus thermoamyloliquefaciens), 바실루스 테르모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans), 바실루스 테르모코프리아에 (Bacillus thermocopriae), 바실루스 테르모락티스 (Bacillus thermolactis), 바실루스 테르모필루스 (Bacillus thermophilus), 바실루스 테르모프로테올리티쿠스 (Bacillus thermoproteolyticus), 바실루스 테르모테레스트리스 (Bacillus thermoterrestris), 바실루스 테르모톨레란스 (Bacillus thermotolerans), 바실루스 테르모제아마이즈 (Bacillus thermozeamaize), 바실루스 티오파란스 (Bacillus thioparans), 바실루스 티안무엔시스 (Bacillus tianmuensis), 바실루스 티모넨시스 (Bacillus timonensis), 바실루스 티프키랄리스 (Bacillus tipchiralis), 바실루스 트리폭실리콜라 (Bacillus trypoxylicola), 바실루스 비에트나멘시스 (Bacillus vietnamensis), 바실루스 비레티 (Bacillus vireti), 바실루스 비스코수스 (Bacillus viscosus), 바실루스 비텔리누스 (Bacillus vitellinus), 바실루스 와코엔시스 (Bacillus wakoensis), 바실루스 크시아옥시엔시스 (Bacillus xiaoxiensis) 또는 바실루스 잔지앙겐시스 (Bacillus zhanjiangensis) 종에, 보다 바람직하게는 바실루스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스 브레비스 (Bacillus brevis), 바실루스 클라우시이, 바실루스 코아굴란스, 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 푸밀루스 또는 바실루스 수브틸리스 종에, 보다 더 바람직하게는 바실루스 수브틸리스, 바실루스 리케니포르미스 또는 바실루스 푸밀루스 종에, 및 가장 바람직하게는 바실루스 리케니포르미스 종에 속한다. 다른 바람직한 숙주 세포는 코리네박테리움 (Corynebacterium), 미셀리오프토라 (Myceliophthora) 및 바스피아 (Basfia) 속에, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 미셀리오프토라 테르모필라 (Myceliophthora thermophila) C1 및 바스피아 숙시니시프로두센스 (Basfia succiniciproducens) 종 중 임의의 것에 속한다.

본 발명은 또한 발효 생성물을 제조하기 위한 발효 방법을 제공한다. 발효 생성물은 바람직하게는 적어도 5개 아미노산 길이, 보다 더 바람직하게는 적어도 20개 아미노산의 단백질 또는 폴리펩티드이다. 특히, 발효 생성물은 상기 기재된 바와 같은 표적 유전자에 의해 코딩될 수 있다. 그러나, 발효 생성물은 또한 다른 곳에 위치한 1개 이상의 유전자에 의해 코딩되고, 본 발명에 따른 프로모터 외의 각각의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있으며; 이러한 프로모터-유전자 조합은 예를 들어 발효 숙주 세포에서 게놈에 또는 게놈외 핵산에, 예를 들어 1개 이상의 플라스미드 상에 위치할 수 있다. 경제적 관점에서, 본 발명에 따른 발효 방법의 가치는 전에 기재된 바와 같이 바로 그 발효 생성물, 즉, 단백질 또는 폴리펩티드에 있는 것이 아니라, 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 작용에 의해 수득가능하거나 수득된 대사물에 있을 수 있다. 이러한 작용의 예는 한 물질의 또다른 물질로의 전환, 예를 들어 영양분, 예를 들어 당, 지방산 및/또는 단백질의 분해에 의한 에너지 등가물 (예를 들어 ATP)의 생성이다. 그러나, 이러한 대사 프로세스는 단백질 또는 폴리펩티드의 및 전형적으로 효소의 사전 형성에 의존한다. 따라서, 본 발명의 목적을 위해 이들 단백질 또는 폴리펩티드 및 특히 이들 효소를 "발효 생성물"로 지칭하는 것이 타당하다.

본 발명에 따른 바람직한 발효 방법은 발효 생성물을 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된 본 발명에 따른 프로모터를 포함하는 핵산을 포함하는 원핵생물 숙주 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 또다른 바람직한 발효 방법은 제1 프로모터로서, 카탈라제를 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된 본 발명에 따른 프로모터를 포함하고, 또한 동일한 또는 또다른 핵산 분자 상에, 또는 양방향성 프로모터의 경우 핵산 분자의 마이너스 가닥 상에, 발효 생성물을 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 핵산을 포함하는 원핵생물 숙주 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 어느 하나의 바람직한 방법은 원핵생물 숙주 세포를 발효 생성물을 코딩하는 상기 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계를 더 포함한다. 원핵생물 숙주 세포가 본 발명에 따른 프로모터에 작동가능하게 연결된 카탈라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 그러한 경우, 원핵생물 숙주 세포를 배양하는 것은 또한 카탈라제를 코딩하는 상기 유전자의 발현을 허용하는 그러한 조건 하에서의 배양을 수반한다. 본 발명에 따른 발효 방법은 본 발명의 프로모터에 의해 부여되는 이익을 사용하는 것을 허용하고, 특히 발효 생성물을 코딩하는 유전자의 높은 수준의 발현을 보장함으로써 특히 발효 동안 발효 생성물 (이는 전에 기재된 바와 같이 카탈라제일 수 있음)을 코딩하는 많은 양의 유전자를 생성하는 것을 허용한다. 발효 방법이 카탈라제 유전자에 작동가능하게 연결된 본 발명에 따른 프로모터를 사용하는 그러한 경우, 발효 방법은 바실루스 리케니포르미스의 야생형 KatA 프로모터에 비해 카탈라제 유전자 발현의 및 상응하게 카탈라제 활성의 증가로부터 이익을 얻는다. 이 점에 있어서, 추가의 상세사항은 특히 수반되는 실시예에 의해 주어진다.

상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 프로모터는 바람직하게는 예를 들어 서열 서열식별번호: 72 내지 87 중 임의의 것에 따른 양방향성 프로모터이다. 바실루스 리케니포르미스의 KatA 및 KatX 유전자의 야생형 양방향성 프로모터와의 유사점에 의해 본 발명의 프로모터를 기재하면, 본 발명은 마치 KatA 및/또는 KatX를 코딩하는 유전자가 대체될 것처럼, 2개의 독립적 유전자를 양방향성 프로모터에 작동가능하게 연결시키는 것을 허용한다. 실시예에 기재된 "KatA 측" 상의 유전자의 발현 특징은 프로모터의 "KatX 측" 상의 유전자의 것과 상이하고: "KatA 측" 상의 유전자는 발효 동안 구성적으로 높은 수준으로 전사되고 발현될 수 있으며, "KatX 측"의 유전자는 "KatA 측" 상의 유전자의 발현 강도에 도달하기 위해 발효 시간 동안 그의 전사 및 발현이 증가되게 할 수 있다. 따라서, 본원에 나타내어진 본 발명의 프로모터의 서열에 대해 마이너스 가닥, 즉 "KatX 측" 상에 유전자를 정치함으로써, 발효 동안 증가하는 강도로 이 유전자가 발현되게 하고, 따라서, 상응하는 유전자 생성물의 생산을 발효 공정의 후기 단계까지 지연시킬 수 있다. 이는 이러한 유전자 생성물이 시간 경과에 따른 손상에 대해 감수성인 경우, 또는 유전자 생성물의 형성이 발효 공정의 초기 단계 동안 상응하는 숙주 세포의 성장을 바람직하지 않게 감소시킬 경우 특히 유리하다. 따라서, 본 발명은 유익하게는 발효 방법의 구체적인 필요에 따라, 및 또한 해당 발효 생성물에 의해 부과되는 제약의 관점에서 유전자 발현을 조정하는 것을 허용한다.

본 발명은 상응하게 또한

a) 한 가닥 (플러스 가닥) 상의 발효 생성물을 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결되고, 동시에 마이너스 가닥 상의 카탈라제를 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된 본 발명의 양방향성 프로모터를 포함하는 핵산을 포함하는 원핵생물 숙주 세포를 제공하는 단계, 및

b) 원핵생물 숙주를 발효 생성물을 코딩하는 상기 유전자 및 카탈라제를 코딩하는 상기 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계

를 포함하는, 발효 생성물을 제조하기 위한 발효 방법을 제공한다.

이처럼, 본 발명의 발효 공정은 둘 다의 유전자, 즉, 발효 생성물을 코딩하는 유전자 및 카탈라제를 코딩하는 유전자의 강하고 시의적절한 발현으로부터 이익을 얻는다. 본 발명의 프로모터 (플러스 또는 마이너스 가닥 상의)에 의한 카탈라제를 코딩하는 유전자의 발현은 유익하게는 산화적 스트레스에 대한 원핵생물 숙주 세포 회복력을 증가시키고, 그에 의해 숙주 세포의, 그의 대사 생성물 중 임의의 것 및/또는 발효 생성물의 산화에 대한 보호를 부여하거나 증가시킴으로써 발효 생성물의 생산에 도움이 된다.

상기 기재된 바와 같이, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 프로모터를 카탈라제를 코딩하는 유전자와 작동가능하게 연결시키는 단계를 포함하는, 야생형 바실루스 리케니포르미스에서의 각각 카탈라제 발현 및/또는 카탈라제 활성에 비해 원핵생물 숙주 세포에서의 카탈라제 발현 및/또는 카탈라제 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 의심의 여지를 없애기 위해, "발현의 증가"는 생화학적으로 바실루스 리케니포르미스의 야생형 KatA 프로모터에 비해 상응하는 mRNA 농도의 증가를 의미한다.

본 발명의 맥락에서 언급된 핵산 서열은 특히

이다.

본 발명은 이하 실시예에 의해 추가로 설명되며; 실시예는 단지 예시적 목적으로 제공되고, 본 발명 또는 청구항의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예

실시예 1: 야생형 바실루스 리케니포르미스 프로모터의 및 본 발명에 따른 바람직한 프로모터의 서열의 비교. 도 1은 야생형 바실루스 리케니포르미스 프로모터 (서열식별번호: 1) 및 서열식별번호: 56에 따른 프로모터의 정렬을 나타낸다. 정렬은 16의 갭 개방 페널티 및 4의 갭 연장 페널티을 갖는 니들만-운쉬 (Needleman-Wunsch) 알고리즘에 따라 수행하였다. 서열은 링커 섹션에서 1개의 티미딘의 삽입에 의해 상이하다 (또한 도 4를 비교).

실시예 2: 야생형 균주 및 실시예 1의 본 발명에 따른 프로모터를 포함하는 상응하는 균주에 대한 바실루스 리케니포르미스에서의 KatA 및 KatX 카탈라제 발현의 비교

바실루스 리케니포르미스 야생형 및 돌연변이체 균주의 배양을 위한 발효 조건:

발효 공정을 주요 탄소 공급원으로서 글루코스 및 복합 화합물을 갖는 배지에서 pH, pO2 및 온도 프로브를 갖는 칸막이형 교반 탱크 반응기 (STR, 다스깁 (Dasgip))에서 수행하였다. O2 및 CO2의 농도를 기체 분석에 의해 모니터링하였다. 배양을 위해, 공급배치 모드를 1 L의 시작 작업 부피로 선택하였다. 생물반응기로서, 6개의 블레이드를 갖는 3개의 루쉬톤 터빈을 갖는 2 L 유리 용기를 사용하였다.

배지:

시드 및 주요 배양 배지에 대한 배지 제조 및 멸균은 각각 진탕 플라스크 및 생물반응기에서 일어났다. PPG2000을 모든 배양에서 소포제로서 사용하였다.

배지는 30 g/L 글루코스, 120 g/L 복합 식물 단백질, 7.7 g/L KH2PO4, 2.8 g/L (NH4)2SO4, 0.09 g/L Mn(II)SO4 ^*H2O, 0.05 g/L Fe(II)SO4^* 7H2O, 0.3 g/L CaCl2^* 2 H2O, 1.4 mL7L PPG2000, 0.025 g/L 카나마이신을 함유하였다. pH는 pH 8로 조정하였다. 배지를 생물반응기에서 교반 조건 (600 rpm) 하에서 60분 동안 123℃에서 멸균하였다.

시드 배양물:

시드 배양물을 16시간 공정 (39℃, pH 7.5, 200 rpm) 동안 배치 배양으로서 동일한 배지를 갖는 진탕 플라스크에서 제조하였다. 샘플을 규칙적으로 취하고, pH, OD, 당 및 유기산 (HPLC) 뿐만 아니라 프로테아제 활성을 측정하였다. 진탕 플라스크를 신선한 LB 플레이트로부터 접종하고, 16시간 후 지수기의 종료 시에 주요 배양물로 옮겼다.

주요 배양물:

접종을 위해 시작 작업 부피의 2.7％를 사용하였다. 주요 배양을 39℃에서, 30 g/L 시작 글루코스 농도 및 350 내지 1400 rpm의 pO2 의존적 교반 캐스케이드 및 1.46 vvm의 통기 속도로 수행하였다.

샘플링 및 총 RNA 단리:

발효 동안 10 ml 샘플을 취하고, RNA레이터 용액 (RNAlater Solution) (라이프 테크놀로지즈 (Life Technologies))과 1:1 비로 혼합하고, 즉시 드라이 아이스 상에 정치하였다. 샘플을 얼음 상에서 주의깊게 해동시키고, 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 총 RNA를 페크골드 박테리아 RNA 키트 (peqGOLD Bacterial RNA Kit) (페크랩 (peqlab))를 제조자 프로토콜에 따라 사용하여 세포로부터 단리하였다. RNA 농도를 100 ng/μl의 농도로 희석한 후 260 nM에서의 흡광도를 측정하여 측정하였다. RNA 샘플을 -80℃에서 저장하였다.

역전사

역전사를 250 ng 총 RNA로 랜덤 육량체 올리고뉴클레오티드로 고스크립트 역전사 시스템 (GoScript Reverse Transcription System) (A5000) (프로메가 (Promega))으로 제조자 프로토콜에 따라 수행하였다. 반응을 ABI 젠앰프 PCR 시스템 9700 -사이클러 (ABI Genamp PCR System 9700 -Cycler)에서 수행한다.

qPCR:

정량적 PCR (qPCR)을 각각 20 μL PCR-반응 부피 및 10 pmol 올리고뉴클레오티드를 갖는 라이트사이클러 (LightCycler)480 II (로슈 (Roche)) 및 고택 (GoTaq)® qPCR 마스터 믹스 (Master Mix) (A6001-프로메가)로 수행하였다. SYBR 그린 (SYBR Green)을 FAM/SYBR 채널에서 470 nm에서 여기시키고, 형광을 510 nm에서 검출하였다.

사이클링 프로그램

5분 95℃

--------------------------------

0:10분 95℃

0:20분 60℃ x45

0:20분 72℃

-------------------------------

0:10분 95℃

1:00분 65℃ 용융 곡선

97℃ 램핑 속도 0.11 ℃/s

------------------------------

40℃ 영구

데이터 평가를 소프트웨어 패키지 아이디어스 (Ideas) 2.0 (로슈 버전 1.5.1.62)으로 수행하였다. ct 값은 '이계도 함수 극대화'의 방법에 의해 측정한다. 지시된 표적 유전자의 상대 ct 값 (-dCT)은 하기와 같이 계산한다:

-dCT = -(ct(TARGET) - ct(REF))

qPCR 프라이머

도 2는 이 실시예의 결과를 나타낸다. 패널 A에서 발현 특징은 야생형 바실루스 리케니포르미스에 대해 주어지고, 패널 B에서 발현 특징은 KatA 유전자의 프로모터가 도 1에 나타내어진 본 발명의 프로모터 서열에 의해 대체된 점에서 패널 A의 야생형 균주와 상이한 재조합 바실루스 리케니포르미스에 대해 주어진다. 유전자 발현은 각각 KatA 및 KatX 단백질을 코딩하는 mRNA의 정량적 PCR에 의해 측정된다. 패널 B는 본 발명에 따른 바람직한 프로모터가 KatX 유전자의 발현을 과도하게 감소시키지 않고 KatA 유전자의 구성적으로 증가된 발현을 초래함과, 또한 KatX 유전자의 발현이 발효 동안 여전히 유도됨을 입증한다.

실시예 3: 야생형 균주 및 실시예 1의 본 발명에 따른 프로모터를 포함하는 상응하는 균주에 대한 바실루스 리케니포르미스에서의 총 카탈라제 활성의 비교

1 ml 샘플을 원심분리 후 배양물로부터 취하였다. 세포를 1 mM PMSF를 갖는 검정 완충제에 재현탁시키고 (하기 참조), 리보라이저 (Ribolyser) (MP 바이오메디칼즈 (MP Biomedicals))를 사용하여 파괴하였다. 원심분리 후, 상청액을 회수하고, 카탈라제 활성 검정에 사용하였다.

카탈라제 활성을 아미노안티피린-페놀 방법에 의해 검정하였다. 이를 위해 카탈라제 함유 샘플 10 μL를 pH 7의 166 mM 포스페이트 완충제에 용해된 0.86 mM H2O2 60 μL와 함께 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 잔류 H2O2를, 50 mM 페놀, 2.6 mM 4-아미노안티피린 및 90 U/mL 서양고추냉이 퍼옥시다제 (시그마 77332)를 함유하는 혼합물 30 μL를 520 nM에서 미세역가 플레이트 판독기에서 첨가함으로써 분광광도법적으로 검출하였다. 보정을 위해, 소 간으로부터의 카탈라제 (시그마 C40)를, 500 U/mL 내지 0.5 U/mL의 연속 희석을 취함으로써 사용하였다. 정규화 목적으로, 카탈라제 활성을 미세-BCA 단백질 측정 키트 (피어스 (Pierce))에 의해 측정된 총 단백질 농도에 대해 정규화하였다.

이 실시예의 결과를 도 3에 나타낸다. 상기 도면은 전반적 카탈라제 활성이 야생형 균주에 비해 적어도 10배만큼, 및 발효 공급시작 후 최초 5시간 동안은 100배만큼 증가됨을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> BASF SE <120> MATERIALS AND METHODS FOR FERMENTATIONS <130> PF78056 <160> 105 <170> According WIPO Std. 25 <210> 1 <211> 101 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <220> promoter <223> wt promoter <400> 1 attcagcatt tatcatgatc aaatcaacga taataaattt ttctttataa taattataaa 60 taaatattgt ttttttcttg agaaatgtta tcattgtttt g 101 <210> 2 <211> 186 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <220> promoter <223> wt promoter <400> 2 tcttcttcct cctttatttg taattaacaa taatttatcc caatccagaa aagttattca 60 gcatttatca tgatcaaatc aacgataata aatttttctt tataataatt ataaataaat 120 attgtttttt tcttgagaaa tgttatcatt gttttgtaat taaaatttac gcgaggtgat 180 cctttg 186 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <220> misc_signal <223> 77% A/T content wt linker <400> 3 ttttcttgag aaa 13 <210> 4 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 77% A/T content linker; minus strand comprises "TTGACA" -3 5 type box <400> 4 ttttcttgtc aaa 13 <210> 5 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 77% A/T content linker; minus strand comprises "TTCTCA" Ka tX -35 type box <400> 5 ttgttttgag aaa 13 <210> 6 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 77% A/T content linker; minus strand comprises "TTCTCA" Ka tX -35 type box <400> 6 tttcttgaga aaa 13 <210> 7 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 77% A/T content linker; minus strand comprises "TTGTCA" sc ore 395 -35 type box <400> 7 ttagattgac aaa 13 <210> 8 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 69% A/T content linker; minus strand comprises "TTCTCA" Ka tX -35 type box <400> 8 ttgcattgag aaa 13 <210> 9 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 69% A/T content linker; minus strand comprises "TTGTCA" sc ore 395 -35 type box <400> 9 tttgagtgac aaa 13 <210> 10 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 69% A/T content linker; minus strand comprises "TTGATT" sc ore 373 -35 type box, cf. SEQ ID NO. 36 <400> 10 tccaaatcaa aga 13 <210> 11 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 69% A/T content linker; minus strand comprises "TTCTCA" Ka tX -35 type box <400> 11 ttgagtgaga aaa 13 <210> 12 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 69% A/T content linker; minus strand comprises "TTGTCA" sc ore 395 -35 type box <400> 12 ttttcttgac aag 13 <210> 13 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 69% A/T content linker; minus strand comprises "TTTACA" sc ore 367 -35 type box, cf. SEQ ID NO. 37 <400> 13 ttttgtgtaa agg 13 <210> 14 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 85% A/T content linker; minus strand comprises "TTTTCA" sc ore 323 -35 type box, cf. SEQ ID NO. 38 <400> 14 ttttcttgaa aaa 13 <210> 15 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 85% A/T content linker; minus strand comprises "TTGTAA" sc ore 357 -35 type box <400> 15 ttttctttac aaa 13 <210> 16 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 85% A/T content linker; minus strand comprises "TTCTCA" Ka tX -35 type box <400> 16 attttttgag aaa 13 <210> 17 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 85% A/T content linker; minus strand comprises "TTCTCA" Ka tX -35 type box <400> 17 tttatgagaa taa 13 <210> 18 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 92% A/T content linker; minus strand comprises "TTGTTT" Ka tA -35 type box <400> 18 ttttttaaac aaa 13 <210> 19 <211> 9 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <220> misc_signal <223> 640 score KatA wt -10 type box <400> 19 tgttatcat 9 <210> 20 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 708 score -10 type box <400> 20 tgttataat 9 <210> 21 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 641 score -10 type box <400> 21 tgttatgat 9 <210> 22 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 632 score -10 type box <400> 22 tgatatcat 9 <210> 23 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 558 score -10 type box <400> 23 tgttattaa 9 <210> 24 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 608 score -10 type box <400> 24 tattataat 9 <210> 25 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 600 score -10 type box <400> 25 taatataat 9 <210> 26 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 572 score -10 type box <400> 26 tattaaaat 9 <210> 27 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 492 score -10 type box <400> 27 tattatgtt 9 <210> 28 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 508 score -10 type box <400> 28 atttataat 9 <210> 29 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 472 score -10 type box <400> 29 atttaaaat 9 <210> 30 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 502 score -10 type box <400> 30 ttttatttt 9 <210> 31 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 462 score -10 type box <400> 31 tttttttat 9 <210> 32 <211> 6 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <220> misc_signal <223> 329 score KatA wt -35 type box <400> 32 ttgttt 6 <210> 33 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 439 score -35 type box <400> 33 ttgaca 6 <210> 34 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 414 score -35 type box <400> 34 ttgact 6 <210> 35 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 401 score -35 type box <400> 35 ttgaaa 6 <210> 36 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 373 score -35 type box <400> 36 ttgatt 6 <210> 37 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 367 score -35 type box <400> 37 tttaca 6 <210> 38 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 323 score -35 type box <400> 38 ttttca 6 <210> 39 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 322 score -35 type box <400> 39 ttctca 6 <210> 40 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 300 score -35 type box <400> 40 ttcatt 6 <210> 41 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> 281 score -35 type box <400> 41 ttctta 6 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <220> misc_signal <223> wt upstream box <400> 42 ataataatta taaataaata 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> upstream box <400> 43 tataataatt ataaataaat 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> upstream box <400> 44 ttataataat tataaataaa 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> upstream box <400> 45 tttataataa ttataaataa 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> upstream box <400> 46 ctttataata attataaata 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> upstream box <400> 47 tctttataat aattataaat 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> upstream box <400> 48 ataataatta taaataaatc 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> upstream box <400> 49 tataataatt ataaataaac 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> upstream box <400> 50 ttataataat tataaataac 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> upstream box <400> 51 tttataataa ttataaatac 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> upstream box <400> 52 ctttataata attataaatc 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> upstream box <400> 53 tctttataat aattataaac 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> upstream box <400> 54 cataataatt ataaatagac 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> upstream box <400> 55 tcataataat tataaatgac 20 <210> 56 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> promotor variant <400> 56 attcagcatt tatcatgatc aaatcaacga taataaattt ttctttataa taattataaa 60 taaatattgt tttttttctt gagaaatgtt atcattgttt tg 102 <210> 57 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> promotor variant with SEQ ID NO. 20 <400> 57 attcagcatt tatcatgatc aaatcaacga taataaattt ttctttataa taattataaa 60 taaatattgt tttttttctt gagaaatgtt ataattgttt tg 102 <210> 58 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> promotor variant with SEQ ID NO. 33 <400> 58 attcagcatt tatcatgatc aaatcaacga taataaattt ttctttataa taattataaa 60 taaatattga catttttctt gagaaatgtt atcattgttt tg 102 <210> 59 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> promotor variant with SEQ ID NO. 20 and SEQ ID NO. 33 <400> 59 attcagcatt tatcatgatc aaatcaacga taataaattt ttctttataa taattataaa 60 taaatattga catttttctt gagaaatgtt ataattgttt tg 102 <210> 60 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> promotor variant with SEQ ID NO. 4 <400> 60 attcagcatt tatcatgatc aaatcaacga taataaattt ttctttataa taattataaa 60 taaatattgt tttttttctt gtcaaatgtt atcattgttt tg 102 <210> 61 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> promotor variant with SEQ ID NO. 4 and SEQ ID NO. 20 <400> 61 attcagcatt tatcatgatc aaatcaacga taataaattt ttctttataa taattataaa 60 taaatattgt tttttttctt gtcaaatgtt ataattgttt tg 102 <210> 62 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> promotor variant with SEQ ID NO. 4 and SEQ ID NO. 33 <400> 62 attcagcatt tatcatgatc aaatcaacga taataaattt ttctttataa taattataaa 60 taaatattga catttttctt gtcaaatgtt atcattgttt tg 102 <210> 63 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> promotor variant with SEQ ID NO. 4 and SEQ ID NO. 20 and S EQ ID NO. 33 <400> 63 attcagcatt tatcatgatc aaatcaacga taataaattt ttctttataa taattataaa 60 taaatattga catttttctt gtcaaatgtt ataattgttt tg 102 <210> 64 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> promotor variant with SEQ ID NO. 5 <400> 64 attcagcatt tatcatgatc aaatcaacga taataaattt ttctttataa taattataaa 60 taaatattgt tttttgtttt gagaaatgtt atcattgttt tg 102 <210> 65 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> promotor variant with SEQ ID NO. 5 and SEQ ID NO. 20 <400> 65 attcagcatt tatcatgatc aaatcaacga taataaattt ttctttataa taattataaa 60 taaatattgt tttttgtttt gagaaatgtt ataattgttt tg 102 <210> 66 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> promotor variant with SEQ ID NO. 5 and SEQ ID NO. 33 <400> 66 attcagcatt tatcatgatc aaatcaacga taataaattt ttctttataa taattataaa 60 taaatattga catttgtttt gagaaatgtt atcattgttt tg 102 <210> 67 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> promotor variant with SEQ ID NO. 5 and SEQ ID NO. 20 and S EQ ID NO. 33 <400> 67 attcagcatt tatcatgatc aaatcaacga taataaattt ttctttataa taattataaa 60 taaatattga catttgtttt gagaaatgtt ataattgttt tg 102 <210> 68 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> promotor variant with SEQ ID NO. 6 <400> 68 attcagcatt tatcatgatc aaatcaacga taataaattt ttctttataa taattataaa 60 taaatattgt ttttttcttg agaaaatgtt atcattgttt tg 102 <210> 69 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> promotor variant with SEQ ID NO. 6 and SEQ ID NO. 20 <400> 69 attcagcatt tatcatgatc aaatcaacga taataaattt ttctttataa taattataaa 60 taaatattgt ttttttcttg agaaaatgtt ataattgttt tg 102 <210> 70 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> promotor variant with SEQ ID NO. 6 and SEQ ID NO. 33 <400> 70 attcagcatt tatcatgatc aaatcaacga taataaattt ttctttataa taattataaa 60 taaatattga cattttcttg agaaaatgtt atcattgttt tg 102 <210> 71 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> promotor variant with SEQ ID NO. 6 and SEQ ID NO. 20 and S EQ ID NO. 33 <400> 71 attcagcatt tatcatgatc aaatcaacga taataaattt ttctttataa taattataaa 60 taaatattga cattttcttg agaaaatgtt ataattgttt tg 102 <210> 72 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> bidirectional promotor variant <400> 72 tcttcttcct cctttatttg taattaacaa taatttatcc caatccagaa aagttattca 60 gcatttatca tgatcaaatc aacgataata aatttttctt tataataatt ataaataaat 120 attgtttttt ttcttgagaa atgttatcat tgttttgtaa ttaaaattta cgcgaggtga 180 tcctttg 187 <210> 73 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> bidirectional promotor variant with SEQ ID NO. 20 <400> 73 tcttcttcct cctttatttg taattaacaa taatttatcc caatccagaa aagttattca 60 gcatttatca tgatcaaatc aacgataata aatttttctt tataataatt ataaataaat 120 attgtttttt ttcttgagaa atgttataat tgttttgtaa ttaaaattta cgcgaggtga 180 tcctttg 187 <210> 74 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> bidirectional promotor variant with SEQ ID NO. 33 <400> 74 tcttcttcct cctttatttg taattaacaa taatttatcc caatccagaa aagttattca 60 gcatttatca tgatcaaatc aacgataata aatttttctt tataataatt ataaataaat 120 attgacattt ttcttgagaa atgttatcat tgttttgtaa ttaaaattta cgcgaggtga 180 tcctttg 187 <210> 75 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> bidirectional promotor variant with SEQ ID NO. 20 and SEQ ID NO. 33 <400> 75 tcttcttcct cctttatttg taattaacaa taatttatcc caatccagaa aagttattca 60 gcatttatca tgatcaaatc aacgataata aatttttctt tataataatt ataaataaat 120 attgacattt ttcttgagaa atgttataat tgttttgtaa ttaaaattta cgcgaggtga 180 tcctttg 187 <210> 76 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> bidirectional promotor variant with SEQ ID NO. 4 <400> 76 tcttcttcct cctttatttg taattaacaa taatttatcc caatccagaa aagttattca 60 gcatttatca tgatcaaatc aacgataata aatttttctt tataataatt ataaataaat 120 attgtttttt ttcttgtcaa atgttatcat tgttttgtaa ttaaaattta cgcgaggtga 180 tcctttg 187 <210> 77 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> bidirectional promotor variant with SEQ ID NO. 4 and SEQ I D NO. 20 <400> 77 tcttcttcct cctttatttg taattaacaa taatttatcc caatccagaa aagttattca 60 gcatttatca tgatcaaatc aacgataata aatttttctt tataataatt ataaataaat 120 attgtttttt ttcttgtcaa atgttataat tgttttgtaa ttaaaattta cgcgaggtga 180 tcctttg 187 <210> 78 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> bidirectional promotor variant with SEQ ID NO. 4 and SEQ I D NO. 33 <400> 78 tcttcttcct cctttatttg taattaacaa taatttatcc caatccagaa aagttattca 60 gcatttatca tgatcaaatc aacgataata aatttttctt tataataatt ataaataaat 120 attgacattt ttcttgtcaa atgttatcat tgttttgtaa ttaaaattta cgcgaggtga 180 tcctttg 187 <210> 79 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> bidirectional promotor variant with SEQ ID NO. 4 and SEQ I D NO. 20 and SEQ ID NO. 33 <400> 79 tcttcttcct cctttatttg taattaacaa taatttatcc caatccagaa aagttattca 60 gcatttatca tgatcaaatc aacgataata aatttttctt tataataatt ataaataaat 120 attgacattt ttcttgtcaa atgttataat tgttttgtaa ttaaaattta cgcgaggtga 180 tcctttg 187 <210> 80 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> bidirectional promotor variant with SEQ ID NO. 5 <400> 80 tcttcttcct cctttatttg taattaacaa taatttatcc caatccagaa aagttattca 60 gcatttatca tgatcaaatc aacgataata aatttttctt tataataatt ataaataaat 120 attgtttttt gttttgagaa atgttatcat tgttttgtaa ttaaaattta cgcgaggtga 180 tcctttg 187 <210> 81 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> bidirectional promotor variant with SEQ ID NO. 5 and SEQ I D NO. 20 <400> 81 tcttcttcct cctttatttg taattaacaa taatttatcc caatccagaa aagttattca 60 gcatttatca tgatcaaatc aacgataata aatttttctt tataataatt ataaataaat 120 attgtttttt gttttgagaa atgttataat tgttttgtaa ttaaaattta cgcgaggtga 180 tcctttg 187 <210> 82 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> bidirectional promotor variant with SEQ ID NO. 5 and SEQ I D NO. 33 <400> 82 tcttcttcct cctttatttg taattaacaa taatttatcc caatccagaa aagttattca 60 gcatttatca tgatcaaatc aacgataata aatttttctt tataataatt ataaataaat 120 attgacattt gttttgagaa atgttatcat tgttttgtaa ttaaaattta cgcgaggtga 180 tcctttg 187 <210> 83 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> bidirectional promotor variant with SEQ ID NO. 5 and SEQ I D NO. 20 and SEQ ID NO. 33 <400> 83 tcttcttcct cctttatttg taattaacaa taatttatcc caatccagaa aagttattca 60 gcatttatca tgatcaaatc aacgataata aatttttctt tataataatt ataaataaat 120 attgacattt gttttgagaa atgttataat tgttttgtaa ttaaaattta cgcgaggtga 180 tcctttg 187 <210> 84 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> bidirectional promotor variant with SEQ ID NO. 6 <400> 84 tcttcttcct cctttatttg taattaacaa taatttatcc caatccagaa aagttattca 60 gcatttatca tgatcaaatc aacgataata aatttttctt tataataatt ataaataaat 120 attgtttttt tcttgagaaa atgttatcat tgttttgtaa ttaaaattta cgcgaggtga 180 tcctttg 187 <210> 85 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> bidirectional promotor variant with SEQ ID NO. 6 and SEQ I D NO. 20 <400> 85 tcttcttcct cctttatttg taattaacaa taatttatcc caatccagaa aagttattca 60 gcatttatca tgatcaaatc aacgataata aatttttctt tataataatt ataaataaat 120 attgtttttt tcttgagaaa atgttataat tgttttgtaa ttaaaattta cgcgaggtga 180 tcctttg 187 <210> 86 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> bidirectional promotor variant with SEQ ID NO. 6 and SEQ I D NO. 33 <400> 86 tcttcttcct cctttatttg taattaacaa taatttatcc caatccagaa aagttattca 60 gcatttatca tgatcaaatc aacgataata aatttttctt tataataatt ataaataaat 120 attgacattt tcttgagaaa atgttatcat tgttttgtaa ttaaaattta cgcgaggtga 180 tcctttg 187 <210> 87 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> promoter <223> bidirectional promotor variant with SEQ ID NO. 6 and SEQ I D NO. 20 and SEQ ID NO. 33 <400> 87 tcttcttcct cctttatttg taattaacaa taatttatcc caatccagaa aagttattca 60 gcatttatca tgatcaaatc aacgataata aatttttctt tataataatt ataaataaat 120 attgacattt tcttgagaaa atgttataat tgttttgtaa ttaaaattta cgcgaggtga 180 tcctttg 187 <210> 88 <211> 37 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <220> misc_signal <223> wt downstream box <400> 88 tgttttgtaa ttaaaattta cgcgaggtga tcctttg 37 <210> 89 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> downstream box <400> 89 ttagttgtac ttaactttca ctcctatgag gtgatccttt g 41 <210> 90 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> downstream box <400> 90 tattttgtaa tgaaatttaa cgcgaggtga tccttta 37 <210> 91 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> downstream box <400> 91 tttttggtgt aattaaaatt tacgcgaggt gatcctttg 39 <210> 92 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> downstream box <400> 92 tgttttgtaa tttaaattta cgcgaggtga tcctttg 37 <210> 93 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> downstream box <400> 93 tttttagtgt aattaaaatt tacgcgaggt gatcctttg 39 <210> 94 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> downstream box <400> 94 gttttgaaat taaaatttac gcgaggtgat cctttg 36 <210> 95 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> downstream box <400> 95 ttttttttaa ttaaaattta cgcgaggtga tcctttg 37 <210> 96 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> downstream box <400> 96 tgttttataa ttaaaattta cgcgaggtga tcctttg 37 <210> 97 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> downstream box <400> 97 tttttttaat taaaatttac gcgaggtgat cctttg 36 <210> 98 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> downstream box <400> 98 ggtgttgtaa ttaaaattta cgcgaggtga tcctttg 37 <210> 99 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> misc_signal <223> downstream box <400> 99 tggattataa ttaaaattta acgcgaggtg atcctttg 38 <210> 100 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer: katA_forward <400> 100 ccgcctcttg agcgaaga 18 <210> 101 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer: katA_reverse <400> 101 tgcttcatcg aacctacgat attg 24 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer: katX_forward <400> 102 tccttgtcgc attgcttcag 20 <210> 103 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer: katX_reverse <400> 103 ccccgtgcga ccaaag 16 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer: 16S rRNA_forward <400> 104 gagggtttcc gccctttagt 20 <210> 105 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer: 16S rRNA _reverse <400> 105 cccaggcgga gtgcttaa 18

Claims (13)

1. 링커 섹션에 의해 서로로부터 분리된 -10 유형 박스 및 -35 유형 박스를 포함하는 프로모터이며,
   각각의 박스가 -10 유형 박스에 대해 표 1에 따라 및 -35 유형 박스에 대해 표 2에 따라 각각의 위치에서 각각의 뉴클레오티드에 대한 값을 할당함으로써 수득가능한 각각의 점수를 갖는 각각의 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, -10 유형 박스에 대한 점수가 적어도 497이고, -35 유형 박스에 대한 점수가 적어도 179이고,
   링커 섹션이 적어도 14개 뉴클레오티드의 길이 및 적어도 57％의 A/T 함량을 갖는 것인 프로모터.
2. 제1항에 있어서, 링커 섹션의 뉴클레오티드 서열이 이들 서열의 위치 1 내지 5 중 임의의 것 앞에 티미딘의 삽입에 의해 서열 서열식별번호 (SEQ ID NO): 3 내지 18 중 임의의 것과 상이한 것인 프로모터.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 링커 섹션이 많아야 18개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것인 프로모터.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, -10 유형 박스의 뉴클레오티드 서열이 많아야 1개 뉴클레오티드만큼 서열 서열식별번호: 19 내지 31 중 임의의 것과 상이한 것인 프로모터.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, -35 유형 박스의 뉴클레오티드 서열이 많아야 1개 뉴클레오티드만큼 서열 서열식별번호: 32 내지 41 중 임의의 것과 상이한 것인 프로모터.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 20개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 상류 섹션이 -35 유형 박스의 5' 방향 상류에 및 그에 인접하여 위치하고, 상류 섹션의 A/T 함량이 적어도 70％이고, 상류 영역의 A 함량이 적어도 35％이고, 바람직하게는 상류 영역의 상류에 46개 뉴클레오티드가 연장된 서열 ("리드-인 서열")의 A/T 함량이 적어도 70％의 A/T 함량을 갖고, 바람직하게는 -10 유형 박스의 하류에 및 그에 인접하여 위치하며 시작 코돈으로 연장된 서열이 적어도 30개 뉴클레오티드의 길이를 갖고, 리보솜 결합 부위를 포함하는 것인 프로모터.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 양방향성 프로모터인 프로모터.
8. 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 프로모터를 포함하는 핵산.
9. 제8항에 있어서, 표적 유전자가 효소를 코딩하고, 효소가 바람직하게는 카탈라제, 프로테아제, 아밀라제, 카르보히드라제, 리파제, 셀룰라제, 풀루라나제, 큐티나제, 펙티나제, 만나나제, 아라비나제, 갈락타나제, 크실라나제, 옥시다제, 예를 들어 락카제, 퍼옥시다제, 이소머라제, 트랜스퍼라제, 키나제, 및 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직한 프로테아제가 수브틸리신 프로테아제인 핵산.
10. 바람직하게는 바실루스 (Bacillus)의 분류학적 강으로부터, 보다 더 바람직하게는 바실랄레스 (Bacillales) 또는 락토바실랄레스 (Lactobacillales) 목으로부터, 또는 코리네박테리움 (Corynebacterium), 미셀리오프토라 (Myceliophthora) 및 바스피아 (Basfia) 속 중 임의의 것으로부터 선택되는 제9항에 따른 핵산을 포함하는 원핵생물 숙주 세포.
11. i) 발효 생성물을 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 프로모터를 포함하는 핵산을 포함하는 원핵생물 숙주 세포를 제공하는 단계, 및
    ii) 숙주 세포를 발효 생성물을 코딩하는 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계, 및
    iii) 임의로 발효 생성물을 정제하는 단계
    를 포함하는, 발효 생성물을 제조하기 위한 발효 방법.
12. 제11항에 있어서, 프로모터가 카탈라제를 코딩하는 유전자에 작동가능하게 또한 연결된 양방향성 프로모터이고, 배양이 카탈라제 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에서 수행되는 것인 발효 방법.
13. 카탈라제를 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 프로모터를 포함하는 핵산을 원핵생물 숙주 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 원핵생물 숙주 세포에서 카탈라제 발현 또는 활성을 증가시키는 방법.

Images