HUP0202705A2 - Eljárások és mikroorganizmusok pantovegyületek előállítására - Google Patents

Eljárások és mikroorganizmusok pantovegyületek előállítására

Info

Publication number
HUP0202705A2
HUP0202705A2 HU0202705A HUP0202705A HUP0202705A2 HU P0202705 A2 HUP0202705 A2 HU P0202705A2 HU 0202705 A HU0202705 A HU 0202705A HU P0202705 A HUP0202705 A HU P0202705A HU P0202705 A2 HUP0202705 A2 HU P0202705A2
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
pantothenate
microorganism
gene
bacillus
nucleic acid
Prior art date
Application number
HU0202705A
Other languages
English (en)
Inventor
Theron Hermann
Thomas A. Patterson
Janice G. Pero
Rogers R. Yocum
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Basf Aktiengesellschaft filed Critical Basf Aktiengesellschaft
Publication of HUP0202705A2 publication Critical patent/HUP0202705A2/hu
Publication of HUP0202705A3 publication Critical patent/HUP0202705A3/hu
Publication of HU230509B1 publication Critical patent/HU230509B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1014—Hydroxymethyl-, formyl-transferases (2.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát képezik eljárások pantovegyületek (példáulpantotenát) előállítására olyan mikroorganizmusok alkalmazásával,amelyekben a pantotenát bioszintetikus folyamatsor és/vagy azizoleucin-valin bioszintetikus folyamatsor és/vagy koenzim-Abioszintetikus folyamatsor manipulálva van. A találmány tárgyátképezik ketopantoát reduktázt és aszpartát a-dekarboxilázt túltermelniképes mikroorganizmusok, továbbá eljárások pantovegyületekelőállítására prekurzor-független módon és nagy hozamban. Szintén atalálmány tárgyát képezik a fentebb leírt eljárásokban alkalmazhatórekombináns mikroorganizmusok, vektorok, izolált nukleinsavmolekulák,gének és géntermékek. A találmány tárgyát képezik előzőleg nemazonosított, mikroorganizmusból származó, coaX-jelű pantotenát kináz-gén, valamint eljárások panto-vegyületek termelésére módosítottpantotenát kipáz aktivitással rendelkező mikroorganizmusokalkalmazásával. Szintén a találmány tárgyát képezi eljárás pantotenátkináz modulátorok azonosítására, a találmány szerinti rekombinánsmikroorganizmusok és/vagy tisztított CoaX-fehérjék alkalmazásával. Ó

Description

KIVONAT
Eljárások és mikroorganizmusok panto-vegyületek előállítására
A találmány tárgyát képezik eljárások panto-vegyületek (például pantotenát) előállítására olyan mikroorganizmusok alkalmazásával, amelyekben a pantotenát bioszintetikus folyamatsor és/vagy az izoleucin-valin bioszintetikus folyamatsor és/vagy koenzim-A bioszintetikus folyamatsor manipulálva van. A találmány tárgyát képezik ketopantoát reduktázt és aszpartát a-dekarboxilázt túltermelni képes mikroorganizmusok, továbbá eljárások panto-vegyületek előállítására prekurzor-független módon és nagy hozamban. Szintén a találmány tárgyát képezik a fentebb leírt eljárásokban alkalmazható rekombináns mikroorganizmusok, vektorok, izolált nukleinsavmolekulák, gének és géntermékek. A találmány tárgyát képezik előzőleg nem azonosított, mikroorganizmusból származó, coaX-jelű pantotenát kináz-gén, valamint eljárások panto-vegyületek termelésére módosított pantotenát kináz aktivitással rendelkező mikroorganizmusok alkalmazásával. Szintén a találmány tárgyát képezi eljárás pantotenát kináz modulátorok azonosítására, a találmány szerinti rekombináns mikroorganizmusok és/vagy tisztított CoaX-fehérjék alkalmazásával.
S.B.G.&K.
Η nadímí Iroda
B^apest, Andrássy út m
Telefon: 461-1000, Fax:461-1099
P02002705 '^etetéli ^any A n
Eljárások és mikroorganizmusok panto-vegyületek előállítására
A pantotenát, amely pantoténsavként vagy B5-vitaminként is ismeretes, a B-vitaminkomplex tagja, és emlősszervezetek, például haszonállatok és emberek számára tápanyagszükséglet (például tápanyagforrásokból, vizoldékony vitaminkiegészitésként vagy takarmányhoz adott adalékanyagként). Sejtekben a pantotenát elsősorban koenzim-A (CoA) és acil-„carrier fehérje (ACP) bioszintézisében kerül felhasználásra. Ezeknek . a koenzimeknek az acilcsoport metabolizmusában van szerepük, amelyek tioésztereket képeznek a molekulák 4' -foszfopantetein-részének szulfhidrilcsoportjával. Ezek a koenzimek esszenciálisak valamennyi sejt számára, mivel a celluláris metabolizmus 100-nál több, különböző intermedier-reakciójában játszanak szerepet.
Hagyományosan elterjedt módszer pantotenát szintetizálására (különösen a biológiailag aktív, D-izomer) a kémiai szintézis, nagy mennyiségben rendelkezésre álló vegyszerekből kiindulva, amely eljárást a szubsztrát túlságosan magas költsége, valamint az hátráltatja, hogy racém intermediereket optikai reszolválásnak kell alávetni (például DL-pantolaktont reszolválásával D-pantolaktonhoz jutunk β-alaninnal való kondenzációhoz). Ennek megfelelően, az útóbbi időben a kutatók olyan bakteriális vagy mikrobiológiai rendszereket kerestek, amelyek pantotenát-bioszintézisben szerepet játszó enzimeket termelnek (például olyan baktériumokat, amelyek maguk képesek pantotenát szintetizálására) . Különösen biológiai konverziós eljárásokat vizsgáltak, pantoténsav D-izomerjenek kedvező termeltetésére szolgáló lehe * 2 J·:..: .· .· :.:.
tőségként, például olyan mikroorganizmusok alkalmazásával, amelyek szelektíven képesek DL-pantoténsav-észtert D-pantoténsavvá hidrolizálni; olyan mikroorganizmusok alkalmazásával, amelyek szelektíven képesek L-pantolaktont bontani kizárólag D-pantolakton keletkezése közben; és olyan mikroorganizmusok alkalmazásával, amelyek szelektíven képesek DL-pantolaktont D-pantonsavvá hidrolizálni.
Azonban jelentős igény van javított pantotenát-termelési eljárásokra, különösen olyan eljárásokra, amelyekben csökkentett mennyiségű szubsztrátokra és/vagy olcsóbb szubsztrátokra van szükség. Ebből a célból, a közelmúltban közvetlen mikrobiológiai szintetikus eljárásokat vizsgáltak, javított D-pantotenát-termelés egyik lehetséges eszközeként. Mikroorganizmusokban a pantotenát-bioszintézis többlépéses folyamatson, amely pantoát (aketoizovalerát) és β-alanin kondenzációját eredményezi, D-pantotenátot kialakítva. Az izoleucin-valin (ilv) folyamatsor bioszintetikus enzimei, aceto-hidroxisav szintetáz (az ilvBN- vagy a^sS-gén terméke), aceto-hidroxisav izomeroreduktáz (az ilvC-gén terméke) és dihidroxisav dehidratáz (az ilvD-gén terméke) katalizálja piruvát konverzióját α-ketoizovaleráttá. A reakciókat továbbá a pantotenát (pan) folyamatsor bioszintetikus enzimei katalizálják, ketopantoát hidroxi-metiltranszferáz (a panB-gén terméke), ketopantoát reduktáz (a panE-gén terméke), aszpartát -dekarboxiláz (a panD-gén terméke) és pantotenát szintetáz (a panC-gén terméke).
Pantoténsav bioszintézisében szerepet játszó enzimeket kódoló géneket Salmonella typhimuriumban és Escherichia coliban a kö
74,365/BE zelmúltban azonosították és jellemezték [ Frodyma és Down, J. Bioi. Chem. 273, 5572-5576 (1998) és Jackowski, szerk. Neidhardt et al., Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, 2. kiadás, Am. Soc. Microbiol., Washington, D.C.] Például E. coliban pantoténsav bioszintézise négy kulcslépésből áll. Az első reakciót a panB-géntermék, ketopantoát hidroximetil-transzferáz katalizálja, és L-valin-intermediert, a-keto-izovalerátot használ ketopantoát előállítására, amelyet azt követően a panE-géntermék, ketopantoát reduktáz redukál. A panD-géntermék, aszpartát α-dekarboxiláz működésével β-alanin keletkezik aszpartátból. Azt követően, a panC-géntermék, pantotenát szintetáz β-alanint ligái pantoáttal, amely D-pantotenátot eredményez .
Dusch és munkatársai publikálták Corynebacterium glutamicum panD-gén azonosítását, és leírták, hogy C. glutamicumból származó panD-gén expressziója E. coliban pantotenátot eredményez 140 ng pantotenát/mg (száraz tömeg) specifikus termelékenységgel óránként [ Dusch et al., Appl. Environ. Micorobiol. 65, 1530-1539 (1999)] .
Sahm és Eggeling továbbá azonosították Corynebacterium glutamicum panB- és panC-géneket, és leírtak olyan géntechnológiailag módosított C. glutamicum törzset, amely panBD-géneket fokozott mértékben expresszált [Sahm és Eggeling, Appl. Environ. Microbiol. 65, 1973-1979 (1999)] . A géntechnológiailag módosított törzs pantotenátot termelt, azonban α-ketoizovalerát termeléséért felelős géneket is fokozott mértékben kellett expreszszálni a gazdaszervezetben abból a célból, hogy a pantoténsav
74,365/BE termelést detektálni lehessen. Továbbá, β-alanin hozzáadása nélkül nem halmozódott fel lényegi mennyiségben pantotenát az előállított törzzsel.
Ehhez hasonlóan, leírtak D-pantoténsav termeltetésére szolgá-Ló eljárást, amelyben kihasználták natrium—szalicilát—rezisztens mutáns E. coli törzs előnyét, amely D-pantoténsavat termel, ha βalanin jelenlétében tenyésztették (USP 5,518,906. számú szabadalmi irat) . A szalicilsavon kívül, a-keto-izovaleriánsavra és/vagy α-keto-vajsavra és/vagy α-amino-vajsavra és/vagy β-hidroxi-aszparaginsavra és/vagy O-metil-treoninra rezisztens, mutáns E. coli törzsek előállításával tovább növelték a pantoténsav—termelést. Továbbá, panB—, panC— és panD—géneket tartamazó plazmid-DNS transzformációja szalicilsav-rezisztens mutáns törzsbe megnövekedett mértékű pantotenát-termeléshez vezetett, azonban 20 g/1 vagy több β-alanint adagoltak a megadott példa szerint. A panB-panC-panD-gének klasztert alkotnak az E. coli kromoszómán.
Végül, leírtak D-pantoténsav termelésére szolgáló eljárást, amelyben szalicilsav-rezisztens, a-keto-izovaleriánsav-rezisztens, a-keto-vajsav-rezisztens, α-amino-vaj sav-rezisztens, βhidroxi-aszparaginsav-rezisztens, 0-metil—treonin-re zis ztens, mutáns E. coli törzset transzformáltak pantotenát bioszintézis gént tartalmazó DNS-fragmentumokkal és/vagy elágazó aminosavak bioszintézisét végző enzimeket kódoló DNS-fragmentumokkal, és β-alanin jelenlétében tenyésztették (USP 5,932,457. számú szabadalmi irat).
A pantotenát termelődését baktériumokban pantoát és β-alanin
74.365/BE kondenzációja eredményezi, és a pantotenát bioszintetikus enzimei: ketopantoát hidroxi-metil-transzferáz (a panB-géntermék), ketopantoát reduktáz (a panE-géntermék) aszpartát-a-dekarboxiláz (a panD-géntermék) és pantotenát szintetáz (a panC-géntermék). Bár a pantotenát biológiailag aktív mint vitamin, tovább metabolizálódik minden sejtben koenzim-A-vá (CoA), amely acilcsoport„carrier-ként játszik szerepet a trikarbonsav-ciklusban (TCA), zsírsav-metabolizmusban és az intermedier-metabolizmus számos más reakciójában. Pantotenát koenzim—A—vá (CoA) való konvertálódásának első (és valószínűleg sebességmeghatározó) lépése pantotenát foszforilálása, melyet pantotenát kináz katalizál. Pantotenát kináz aktivitást először Salmonella typhimuriumban olyan hőmérséklet-szenzitív mutánsok szűrésével azonosítottak, amelyek permisszív hőmérsékleteken szintetizáltak CoA-t, de pantotenátot nem-permisszív hőmérsékleteken szekretáltak. A mutációkat Salmonella-kromoszómában térképezték, és a genetikai lókuszt coaA-ként jelölték. Az gén olyan enzimet kódol, amely pantotenát koenzim-A-vá (CoA) való konvertálódásának első lépését katalizálja [ Dunn és Snell, J. Bacteriol. 140, 805-808 (1979)] . Escherichia coli hőmérséklet-szenzitív mutánsokat szintén izoláltak és jellemeztek [ Vallari és Rock, J. Bacetriol. 1M, 5795-5800 (1987)] . Ezek a mutánsok [coaA15(Ts)] detektívek pantotenát CoA-vá való konvertálására nézve, és továbbá hőmérséklet-szenzitív növekedési fenotípust mutatnak, ami azt mutatja, hogy pantotenát kináz aktivitás esszenciális a növekedéshez. Továbbá megjegyezzük, hogy CoA ugyanolyan mértékben gátolt pantotenát kináz-aktivitást mutánsban, mint vad típusú enzimben.
74.365/BE
Olyan feedback-rezisztens E. coli mutánsokat [jelölésük coaA16(Fr)] is izoláltak, amelyek CoA által kifejtett, feedbackgátlásnak ellenálló pantotenát kináz aktivitással rendelkeztek [ Vallari és Jackowski, J. Bacteriol. 170, 3961-3966 (1988)] . A jelenség megfordításáért felelős mutáció, meglepő módon, genetikailag nem kapcsolódik coaA-génhez transzdukcióval. További adatok alátámasztják azt a feltételezést, hogy a celluláris összCoA-mennyiséget a bioszintézisben, a pantotenát kináz lépés, és valószínűleg CoA 4' -foszfo-panteteinné való lebomlásának modulálásával lehet szabályozni.
A vad típusú E. coli coaA-gént hőmérséklet-szenzitív E. coli mutánsok funkcionális komplementációjával klónozták. A vad típusú gén szekvenciáját meghatározták [ Song és Jackowski, J. Bacteriol. 174, 6411-6417 (1992), és Flamm et al. , Gene (Amst.) 7_4, 555-558 (1988)] . Több kópia coaA-gént tartalmazó törzsek pantotenát kinázra 76-szor magasabb specifikus aktivitással rendelkeztek, azonban csak 2,7-szeres növekedés volt CoA stacionárius („staedy state) mennyiségében (Song és Jackowski, mint fent). Továbbá leírták, hogy a prokarióta enzim (coaA kódolja E. coliban és különféle más mikrororganizmusban) CoA feedback-gátlása alatt áll in vivo és in vitro egyaránt, ahol CoA körülbelül ötször hatékonyabb enzim gátlására, mint az acetil-CoA (Song és Jackowski, mint fent; és Vallari et al., mint fent). Továbbá leírták, hogy panB-génterméket E. coliban CoA gátolja [Powers és Snell, J. Biol. Chem. 251, 3786-3793 (1976)] . Ezek az adatok további, hogy pantotenát kináz-aktivitás döntő faktor intracelluláris CoA—koncentráció szabályzására.
74.365/BE
Standard keresési és szekvencia-alárendezési eszközök alkalmazásával coaA-homológokat azonosítottak Hemophilus influenzáéban, Mycobacterium tuberculosisban, Vibrio choleraeben, Streptococcus pyogenesben és Bacillus subtilisben. Ezzel ellentétben, eukarióta sejtekben nem lehetett szignifikánsan hasonló fehérjéket azonosítani, például Saccharomyces cerevisiaeben vagy emlősszervezetekből származó, címkézett expresszált szekvencia—adatbázisokban (EST—adatbázisokban) . Genetikai szelekciós stratégiát alkalmazva, pantotenáz kináz-aktivitást kódoló cDNS-t a közelmúltban azonosítottak Aspergillus nidulans [ Calder et al. , j. Biol. Chem. 274, 2014-2020 (1999)] . Az eukarióta pantotenát kináz gén (panK) eltérő primer struktúrával és egyedi szabályzó tulajdonságokkal rendelkezik, ami alapján világosan megkülönböztethető prokarióta megfelelőitől. Emlősszervezetből is izoláltak pantotenát kináz gént (mpanKla) , amely A. nidulansból származó PanK-fehérj ével és GenBank™ 927798. nyilvántartási számon azonosított, levezetett géntermékkel (S. cerevisiae gemoban) homológ fehérje [Rock et al. , J. Bioi. Chem. 275, 1377-1383 (2000)]
A találmány szerinti megoldás, legalábbis részben, Bacillus subtilisben lévő, pantotenát bioszintetikus folyamatsor kulcsenzimeit kódoló gének felismerésére alapul. A találmány szerinti megoldás kidolgozása során főleg Bacillus subtilisben lévő, panE-gén-t azonosítottunk. A panE-gén fokozott mértékű expreszszálása és deregulálása B. subtilisben panE-géntermék, azaz ketopantoát reduktáz fokozott mértékű termelését eredményezi, amely továbbá pantotenát fokozott mértékű termelődéséhez vezet. Ehhez hasonlóan, mutációk ebben a génben a pantotenát-termelés
74.365/BE
90% nál nagyobb csökkenését eredményezik. A találmány szerinti megoldás kidolgozása során továbbá azonosítottuk a B. subtilisben lévő, feltételezett panBCD-operont, amelynek túltermelése es deregulálása fokozott mértékű pantotenát-termelést eredményez. Továbbá kimutattuk, hogy B. subtilisben lévő, panD-gén fokozott mértékű expressziója és deregulálása (fokozott mértékű panD-géntermék, azaz aszpartát α-dekarboxiláz-termelődést eredményez) továbbá fokozott mértékű pantotenát-termelést eredményez, különösen izoleucin-valin (ilv) bioszintetikus folyamatsor kulcsenzimeit kódoló gének deregulálásával kombinálva.
Ennek megfelelően, a találmány tárgyát képezik eljárások pantotenát valamint a pantotenát bioszintetikus folyamatsor más vegyületeinek (például ketopantoát, pantoát és β-alanin) termeltetésére, amelyekre a leírásban panto-vegyületek kifejezést használjuk, olyan mikroorganizmusok alkalmazásával, amelyekben a pantotenát bioszintetikus folyamatsor és/vagy izoleucin-valin bioszintetikus folyamatsor manipulálva van, így pantotenát vagy más kívánt panto-vegyület termelődik. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás panto-vegyület (például pantotenát vagy pantoát) termeltetésére, amelyben panE-génterméket, ketopantoát reduktázt túltermelni képes mikroorganizmust tenyésztünk, amelyre a leírásban keto-pantoát reduktázt túltermelő (ketopantoate-reductase-overexpressing) vagy KPAR-O-mikroorganizmus kifejezést használjuk, olyan körülmények között, amelyben a panto-vegyület (például pantotenát vagy pantoát) termelődik. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát
74.365/BE ···· képezi eljárás panto-vegyületek (például pantotenát vagy pantoát) termeltetésére, amelyben legalább egy pantotenát bioszintetikus enzimet (például panB—, panC— vagy panD—géntermékek közül legalább egyet) túltermelni képes mikroorganizmust, előnyösen KPAR-O-mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben panto-vegyület (például pantotenát vagy pantoát) termelődik.
A találmány tárgyát képezik még egy vonatkozásában olyan eljárások panto-vegyületek termeltetésére, amelyek függetlenek prekurzor-adagolásra való igény vonatkozásában (például β-alanin vagy aszpartát és/vagy α-ketoizovalerát vagy valin). A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás pantotenát termeltetésére prekurzor-független módon, amelyben aszpartát-a-dekarboxilázt túltermelő, deregulált izoleucin-valin (ilv) folyamatsorral rendelkező mikroorganizmust (AaD-O) tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben pantotenát termelődik. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás pantotenát termeltetésére prekurzor-adagolástól független módon, amelyben deregulált pantotenát (pan) folyamatsorral és deregulált izoleucin-valin (ilv) folyamatsorral rendelkező, AaD-O-mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben pantotenát termelődik. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás pantotenát termeltetésére aszpartát- vagy β-alanin-adagolástól független módon, amelyben AaD-O-mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben pantotenát termelődik. A ta
74.365/BE lálmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás pantotenát termeltetésére valinvagy α-keto-izovalerát-adagolástól független módon, amelyben deregulált izoleucin-valin (ilv) bioszintetikus folyamatsorral rendelkező mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben pantotenát termelődik. A találmány még egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi magas hozamot biztosító termelési eljárás pantotenát termeltetésére, amelyben manipulált mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben pantotenát termelődik jelentősen magas hozamban (például nagyobb koncentrációban, mint 10 g/1, 20 g/1, 30 g/1 vagy 40 g/1) .
A találmány szerinti eljárásokban továbbá olyan mikroorganizmusokat alkalmazunk, amelyek aceto-hidroxisav szintetázt vagy aceto-hidroxisav izomeroreduktázt (például ilvBNC-nukleinsav-szekvenciát tartalmazó vektorral transzformált mikroorganizmusok) túltermelni képes mikroorganizmusok, dihidroxisav dehidratázt (például ilvD-nukleinsavszekvenciát tartalmazó vektorral transzformált mikroorganizmusok) túltermelni képes mikroorganizmusok, aszpartát α-dekarboxilázt (például panD-nukleinsav-szekvenciát tartalmazó vektorral transzformált mikroorganizmusok) túltermelni képes mikroorganizmusok, deregulált izoleucin-valin (ilv) bioszintetikus folyamatsorral· és deregulált pantotenát bioszintetikus folyamatsorral rendelkező mikroorganizmusok (például ketopantoát hidroxi-metil-transz-feráz, ketopantoát reduktáz, pantotenát szintetáz és aszpartát- -dekarboxiláz közül bármelyiket túltermelni képes mikroorganiz74.365/BE
musok, például panBCD-nukleinsavszekvenciát tartalmazó vektorral vagy panE-nukleinsavszekvenciát tartalmazó vektorral transzformált mikroorganizmusok). A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns mikroorganizmus Gram-pozitív (például Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Lactococci vagy Streptomyces nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok). A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns mikroorganizmus Gram—negatív. Különösen előnyösen alkalmazott rekombináns mikroorganizmus a Bacillus-nemzetséghez tartozik (például Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus halodurans; és hasonlók). A találmány tárgyát képezik rekombináns vektorok is, amelyek Bacillusból származó pantotenátot és/vagy izoleucin-valin bioszintetikus enzimeket (például B. subtilisból származó pantotenátot és/vagy izoleucin-valin bioszintetikus enzimeket) kódoló géneket tartalmaznak.
Szintén a találmány tárgyát képezik eljárások β-alanin termeltetésére, amelyekben aszpartát α-dekarboxilázt túltermelő (Aa D~0) mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben β-alanin termelődik, és eljárások β-alanin termeltetésére, amelyekben aszpartátot tartalmazó készítményt érintkeztetünk Bacillusból izolált aszpartát α-dekarboxiláz enzimmel olyan körülmények között, amelyben β-alanin termelődik.
A találmány szerinti termelési eljárásokban továbbá a pantovegyületet (például pantotenát vagy pantoát) kinyerjük.
A találmány tárgyát képezik továbbá rekombináns mikroorganizmusok (például AaD-0 mikroorganizmusok, deregulált izoleucin74.365/BE valin (ilv) folyamatsorral rendelkező mikroorganizmusok, ketopantoát hidroxi-metil-transzferáz (a panB-géntermék), pantotenát szintetáz (a panC-géntermék), aszpartát-a-dekarboiláz (a panD-géntermék), ketopantoát reduktáz (a panEl-géntermék) közül legalább egyet túltermelni képes mikroorganizmusok, és deregulált panBCD-operonnal rendelkező mikroorganizmusok. Szintén találmány tárgyát képezik panB-, panC-, panD-, panE-, ilvB-, ilvN-, alsS-, ilvC- és/vagy ilvD-nukleinsavmolekulák, valamint ilyen nukleinsavmolekulát tartalmazó vektorok és ilyen nukleinsavmolekulák által kódolt géntermékek.
A találmány szerinti eljárásokban továbbá, például legalább e9y pantotenát bioszintetikus enzim túltermelésén kívül, második pantotenát bioszintetikus enzimet deletálunk vagy mutánssá alakítjuk, amely második pantotenát bioszintetikus enzim előnyösen a kívánt terméknél később helyezkedik el a pantotenát bioszintetikus folyamatsorban. Például mutáció bevitele panC-be, a panEgéntermék túltermelésén kívül még a pantoat—termelés tovább fokozását vagy növelését eredményezi. Ennek megfelelően, a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás pantoát termeltetésére, amelyben panE-génterméket túltermelni képes, és panC-génben deléciót tartalmazó mikroorganizmust tenyésztünk. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás pantoát termeltetésére, amelyben panE-génterméket és/vagy panBgénterméket túltermelni képes, és a panC-génben deléciót tartalmazó mikroorganizmust tenyésztünk. A találmány egy másik, példaként szolgáló, előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány 74.365/BE tárgyát képezi eljárás ketopantoát termeltetésére, amelyben panB-génterméket túltermelni képes, és panE-génben deléciót tartalmazó mikroorganizmust tenyésztünk, és eljárás β-alanin termeltetésére, amelyben panD-génterméket túltermelni képes, és panCgénben delécióval rendelkező mikroorganizmust tenyésztünk. A találmány tárgyát képezi eljárás panto-vegyületek termeltetésére is, amelyben legalább egy valin bioszintetikus enzimet túltermelünk olyan mikroorganizmus által, amelyben legalább egy pantotenát bioszintetikus enzim deletálva van.
A találmány szerinti megoldás, legalábbis részben, korábban azonositatlan, mikroorganizmusból származó, pantotenát kinázgén, coaX azonosítására és jellemzésére épül. CoaX-ot először Bacillus subtilisben azonosították, és megfelel a kromoszómális DNS részletben egy olyan nyitott leolvasási fázisnak, amely tartalmazza az ftsH-gén 5' -végét és yacB-, yacC-, yacD-, cysK- és pabB-gén egészét. Kimutattuk, hogy a yacB-jelű nyitott leolvasási fázis új pantotenát kináz—aktivitást kódol, a gén nem volt homológ egyetlen korábban ismert pantotenát kináz-génnel sem. A gént átneveztük coaX-génnek, mivel azt az enzimet kódolja, amely a folyamatsorban az első lépést, pantotenát-CoaA-átalakulást katalizálj a.
Ennek megfelelően, a találmány tárgyát képezik új és javított eljárások pantotenát és a pantotenát bioszintetikus folyamatsor (például panto-vegyületek) más kulcsfontosságú vegyületeinek termeltetésére olyan mikroorganizmusok alkalmazásával, amelyek módosított pantotenát kináz-aktivitással rendelkeznek. A találmány tárgyát különösen coaX-gént tartalmazó, vagy mutáns coaX74.365/BE gént tartalmazó, rekombináns mikroorganizmusok képezik, amelyek csökkent mértékű pantotenát kináz—aktivitással rendelkeznek. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezik olyan rekombináns mikroorganizmusok, amelyekben továbbá a pantotenát bioszintetikus folyamatsor deregulált. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik olyan rekombináns mikroorganizmusok, amelyekben továbbá az izoleucin—valin (ilv) folyamatsor deregulált. A találmány előnyös megvalósítási módja szerint, Bacillusnemzetséghez tartozó (például B. subtilis) mikroorganizmusokat alkalmazunk.
A találmány tárgyát képezik coaX-gént tartalmazó, vagy mutáns coaX-gént tartalmazó, rekombináns mikroorganizmusok (például Bacillus-nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok, például B. subtilis), amelyek csökkent mértékű pantotenát kináz-aktivitással rendelkeznek. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezik olyan rekombináns mikroorganizmusok, amelyekben továbbá a pantotenát bioszintetikus folyamatsor deregulált, vagy amelyekben izoleucin—valin (ilv) folyamatsor deregulált.
A találmány tárgyát képezik olyan vektorok is, amelyek izolált coaX- vagy coaA-gént, valamint mutáns coaX- és/vagy coaAgéneket tartalmaznak. Szintén a találmány tárgyát képezik izolált coaX-géneket vagy mutáns coaX-géneket tartalmazó, izolált nukleinsavmolekulák, az izolált CoaX-fehérjéken és mutáns CoaXfehérjéken kívül.
A fentebb leírt nukleinsavak, vektorok és rekombináns mikro
74.365/BE organizmusok különösen hasznosan alkalmazhatók a találmány szerinti eljárásokban. A találmány tárgyát képezik eljárások panto— vegyület (például ketopantoát, pantoát és/vagy pantotenát) termelésének fokozására, amelyben mutáns coaX-génnel rendelkező, rekombináns mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben a panto-vegyület termelése fokozódik. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns mikroorganizmus továbbá mutáns coaA—gént tartalmaz. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns mikroorganizmus továbbá mutáns avtA— és/vagy mutáns ilvE—gént és/vagy mutáns ansB-gént és/vagy mutáns alsD-gént tartalmaz. A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások pantotenát-modulátorok azonosítására, a találmány szerinti rekombináns mikroorganizmusok és tisztított CoaX-fehérjék alkalmazásával.
A találmány szerinti megoldás más tulajdonságai és előnyei nyilvánvalókká válnak az alábbi részletes leírás és szabadalmi igénypontok alapján.
Az ábrák rövid ismertetése:
Az 1. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a pantotenát bioszintetikus folyamatsort.
A 2. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a pAN240-plazmidot, amely a P26panBCD-kazettától szintézisiránnyal szemben ligáit szekvenciákat tartalmaz, ekvivalens a PA221-törzsbe integrált verzióval.
A 3.A ábrán vázlatosan ábrázoljuk a pAN004-plazmidot, amely P26-ból és RBSl-ből kiindulva expresszált panBCD-operont tartalmazza.
A 3.B ábrán vázlatosan ábrázoljuk a ρΑΝΟΟβ-plazmidot, amely
74.365/BE
P26-ból és RBS2-ből kiindulva expresszált panBCD-operont tartalmazza .
A 4. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a pAN236-plazmidot, amely integrálható és amplifikálható P26-RBS2-panEl expressziós kazettát tartalmaz.
Az 5. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a pAN423-plazmid előállítáA 6. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a pAN426-plazmid és pAN427 előállítását.
A 7. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a pAN428-plazmid és pAN429 előállítását.
A 8. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a pAN431-plazmid előállítáA 9. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a pAN441-plazmid előállítáA 10. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a pAN440-plazmid előállítáA 11. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a pAN251-plazmidot, melyet P26panEl-kazetta egyetlen kópiájának integrálására terveztük a panEl-lókusznál, dupla „crossing over-el.
A 12. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a pAN267-plazmidot, melyet P26-ilvBNS-kazetta egyetlen kópiájának integrálására terveztük az amyE-lókusznál.
A 13. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a pAN257-plazmidot, amely Bacillus subtilis ilvD—t tartalmazó klón, egy alacsony kópiaszá— mú vektorban.
A 14. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a pAN263-plazmidot, melyet
74.365/BE
P26-ilvD-kazetta egyetlen kópiájának integrálására terveztük a ilvD-lókusznál.
A 15. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a pAN261-plazmidot, melyet Bacillus subtilis ilvD-génjének megszakítására terveztünk catgénnel.
A 16. ábrán vázlatosan ábrázoljuk az E. coliban lejátszódó koenzim-A bioszintetikus folyamatsort.
A 17. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a pAN296-plazmidot, melyet Bacillus subtilis coaA-gén nagyobb részének deletálására és annak klóramfenikol-rezisztencia-génnel való helyettesítésére terveztünk .
A 18. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a Bacillus subtilis genom szerkezetét a coaA-gén régiójában. Az egységek bázispárokat jelentenek, és üres nyilak mutatják a jelentősebb nyitott leolvasási fázisokat.
A 19. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a pAN281-plazmidot, amely Bacillus subtilis coaA expresszálására szolgáló plazmid, a bprlókusznál való integrálás után.
A 20. A és 20.B ábrán bemutatjuk hat, mikroorganizmusokból származó, ismert vagy előre látható coaA-gének által kódolt aminosav-szekvenciák többszörös egymás alá rendezését (MSA). A 4-6. és 1-3. számú aminosav-szekvenciák az alábbiaknak felelnek meg: Mycobacterium leprae (SwissProt™ nyilvántartási száma: Q9X795), Mycobacterium tuberculosis (SwissProt™ nyilvántartási száma: 053440), Streptomyces coelicolor (SwissProt™ nyilvántartási száma: 086799), Haemophilus influenzae (SwissProt™ nyilvántartási száma: P44793), Escherichia coli (SwissProt™ nyilvántartási szá
74.365/BE ma: P15044) illetve Bacillus subtilis (SwissProt™ nyilvántartási száma: P54556) . Az alárendezést ClustalW MSA-szoftver alkalmazásával, a GenomeNet CLUSTALW szerveren végeztük (Institute for Chemical Research, Kyoto University). Az alábbi paramétereket alkalmaztuk: Páronként! alárendezés, „K-tuple (word) méret = 1, „Window méret = 5, „Gap Penalty (büntetőpont) = 3, „Number of top diagonals = 5, Pontozási módszer = százalék; többszörös alárendezés, „Gap Open Penality (büntetőpont) = 10, „Gap Extension Penality (büntetőpont) = 0,0, „Weight Transition (súlyozó tényező) = nincs, hidrofil aminosavak = Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gin, Glu, Arg és Lys, hidrofób rések („gaps) = van, és pontozó („scoring) mátrix = BLOSUM.
A 21. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a Bacillus subtilis genom szerkezetét a coaX—gén (yacB—gén) régiójában. Az egységek bázispárokat jelentenek, és üres nyilak mutatják a jelentősebb nyitott leolvasási fázisokat, és megjelöltünk bizonyos előre látható restrikciós fragmentumokat.
A 22. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a pAN341- és pAN342plazmidot, amely B. subtilis yacB—nek (a leírásban átnevezve coaX-ként) megfelelő, PCR-el származtatott, két, független klón.
A 23.A-D ábrákon bemutatjuk 14, mikroorganizmusokból származó, ismert vagy előre látható coaX-gének által kódolt aminosavszekvenciák többszörös egymás alá rendezését (MSA). A 9., 74., 7-8., 75., 11., 10. és 12-18. számú aminosav-szekvenciák az alábbiaknak felelnek meg: Bacillus subtilis (SwissProt™ nyilvántartási száma: P37564), Clostridium acetobutylicum (WIT™ nyilvántartási száma: RCA03301), Streptomyces coelicolor (PÍR™ nyil74.365/BE vántartási száma: T36391), Mycobacterium tuberculosis (SwissProt™ nyilvántartási száma: 006282), Rhodobacter capsulatus (WIT™ nyilvántartási száma: RRC02473), Desulfovibrio vulgaris (DBJ™ nyilvántartási száma: BAA21476.1), Deinococcus radiodurans (SwissProt™ nyilvántartási száma: Q9RX54),
Thermotoga maritima (GenBank™ nyilvántartási száma: AAD35964.1), Treponema pallidum (SwissProt™ nyilvántartási száma: 083446), Borrelia burgdorferi (SwissProt™ nyilvántartási száma: 051477), Aquifex aeolicus (SwissProt™ nyilvántartási száma: 067753), Synechocystis sp. (SwissProt™ nyilvántartási száma: P74045), Heliobacter pylori (SwissProt™ nyilvántartási száma: 025533) illetve Bordetella pertussis (SwissProt™ nyilvántartási száma: Q45338). Az alárendezést ClustalW MSA-szoftver alkalmazásával, a GenomeNet CLUSTALW szerveren végeztük (Institute for Chemical Research, Kyoto University) . Az alábbi paramétereket alkalmaztuk: Páronkénti alárendezés, „K-tuple (word) méret = 1, „Window méret = 5, „Gap Penalty (büntetőpont) = 3, „Number of top diagonals = 5, Pontozási módszer = százalék; többszörös alárendezés, „Gap Open Penality (büntetőpont) = 10, „Gap
Extension Penality (büntetőpont) = 0,0, „Weight Transition (súlyozó tényező) = nincs, hidrofil aminosavak = Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gin, Glu, Arg és Lys, hidrofób rések („gaps) = van, és pontozó („scoring) mátrix = BLOSUM.
A 24. ábrán bemutatjuk az alábbi mikroorganizmusokból származó, coaA-géntermékeknek megfelelő fehérjeszekvenciák részleteinek többszörös egymás alá rendezését: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Mycobacterium leprae,
74.365/BE
Mycobacterium tuberculosis és Streptomyces coelicolor. E. coli coaA15(Ts)-ben és B. subtilis coaA282A-ban azokat az aminosava— kát, amelyeknél mutáció történt, az alárendezés alatt illetve fölött megjelöltük. A részletek megfelelnek a 3. számú szekvenciában a 168-187., a 2. számú szekvenciában 167-186., az 1. számú szekvenciában a 165-184., a 4. számú szekvenciában a 169-188., az 5. számú szekvenciában a 169-188. illetve a 6. számú szekvenciában a 179-1-98. aminosavaknak.
A 25. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a pAN294-plazmid szerkezetét, amely mutagenizált B. subtilis coaA integrálására szolgál natív lókuszánál.
A 26. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a pAN336-plazmid szerkezetét, amelyet B. subtilis coaX kromoszómális lókuszából való deletálására, és annak kanamicin-rezisztencia-génnel való helyettesítésére terveztünk.
A találmány tárgyát új és javított eljárások képezik pantotenát és pantotenát bioszintetikus folyamatsor más kulcsfontosságú vegyületeinek (a leírásban panto-vegyületek, például pantotenát, keto—pantoát, pantoát és β—alanin) termeltetésére olyan mikroorganizmusok alkalmazásával, amelyekben a pantotenát bioszintetikus folyamatsor manipulálva van, így pantotenát vagy más kívánt panto-vegyületet termelődik.
A találmány szerinti javított eljárások szerint pantovegyületeket (például pantotenátot) termeltetünk olyan mikroorganizmusokban, amelyekben a pantotenát bioszintetikus folyamatsorban lévő, legalább egy enzim úgy van manipulálva, hogy pantotenát vagy más kívánt panto-vegyület termelődik (például
74.365/BE fokozott mértékben termeltetünk) . A találmány tárgyát képezik például eljárások panto-vegyületek (például pantotenát) termeltetésére olyan mikroorganizmusokban, amelyekben keto-pantoát hidroxi-metil-transzferáz, ketopantoát reduktáz, pantotenát szintetáz vagy aszpartát α-dekarboxiláz közül legalább az egyik úgy van manipulálva, hogy pantotenát vagy más kívánt pantovegyület termelődik. A találmány szerinti eljárások közé tartozik még eljárás panto-vegyületek (például pantotenát) termeltetésére olyan mikroorganizmusokban, amelyekben legalább egy valinizoleucin bioszintetikus enzim úgy van manipulálva, hogy pantotenát vagy más kívánt panto-vegyületet termelődik. A találmány tárgyát képezik például eljárások panto-vegyületek (például pantotenát) termeltetésére olyan mikroorganizmusokban, amelyekben aceto-hidroxisav szintetáz, aceto-hidroxisav izomeroreduktáz vagy dihidroxisav dehidratáz közül legalább az egyik úgy van manipulálva, hogy pantotenát vagy más kívánt panto-vegyület termelődik.
Szintén találmány tárgyát képezik eljárások panto-vegyületek termeltetésére, amelyekben ketopantoát reduktázt túltermelő mikroorganizmust (KPAR-O) tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben a panto-vegyület termelődik. Szintén a találmány tárgyát képezik eljárások pantotenát termeltetesere prekurzor— független módon, amelyben aszpartát-a-dekarboxilázt túltermelő mikroorganizmust (AaD-O) tenyésztünk olyan körülmények között, hogy pantotenát termelődik. Szintén a találmány tárgyát képezik β-alanin-független, magas hozamot biztosító, pantotenát termelésére szolgáló eljárások, valamint β-alanin termelésére szolgáló eljárások. A találmány tárgyát képezik panto-vegyületek termelé
74.365/BE sének fokozására szolgáló eljárások is, amelyekben pantotenát kináz mutánsokat tenyésztünk. A találmány tárgyát képezik különösen új és javított eljárások pantotenát és a pantotenát bioszintetikus folyamatsor más kulcsfontosságú vegyületeinek (például panto-vegyületek) termeltetésére olyan mikroorganizmusok alkalmazásával, amelyek módosított pantotenát kináz-aktivitással rendelkeznek, például olyan csökkentett pantotenát kináz-aktivitással rendelkező mikroorganzimusok alkalmazásával, amelyek coaX-gén tartalmaznak vagy mutáns coaX-gént tartalmaznak.
A találmány szerinti megoldás könnyebb megértése céljából először néhány szakkifejezést definiálunk.
A leírásban a „pantotenát bioszintetikus folyamatsor kifejezésen olyan bioszintetikus folyamatsort értünk, amely pantotenát bioszintetikus enzimeket (például bioszintetikus enzimet kódoló gén által kódolt polipeptideket), vegyületeket (például prekurzorokat, szubsztrátokat, intermediereket vagy termékeket), kofaktorokat és hasonlókat foglal magában, amelyek pantotenát képződésekor vagy szintézisekor játszanak szerepet. A „pantotenát bioszintetikus folyamatsor kifejezésen értünk olyan bioszintetikus folyamatsort, amely pantotenát szintéziséhez vezet mikroorganizmusokban (például in vivo), valamint olyan bioszintetikus folyamatsort, amely pantotenát szintéziséhez vezet in vitro. Az 1. ábrán vázlatosan bemutatjuk a pantotenát bioszintetikus folyamatsort. Pantotenát bioszintetikus enzimeket vastag betűvel, és a megfelelő géneket dőlt betűvel jelöljük.
A „pantotenát bioszintetikus enzim lehet bármilyen enzim, amely pantotenát bioszintetikus folyamatsorban lévő vegyület
74.365/BE (például intermedier vagy termék) képződésében szerepet játszik. Az 1. ábrán bemutatottak szerint, pantoát szintézise a-keto-izovalerátból (α-KIV) ketopantoát-intermedieren keresztül történik. Ketopantoát képződését pantotenát bioszintetikus enzim, a ketopantoát hidroxi-metil-transzferáz (a panB-géntermék) katalizálja. Pantoát képződését pantotenát bioszintetikus enzim, a ketopantoát reduktáz (a panE-géntermék) katalizálja, β-alanin szintézisét aszpartátból pantotenát bioszintetikus enzim, az aszpartát α-dekarboxiláz (a panD-géntermék) katalizálja. Pantotenát képződését pantoátból és β—alaninból (például kondenzációval) pantotenát bioszintetikus enzim, a pantotenát szinte-táz (a panC-géntermék) katalizálja.
A leírásban az „izoleucin-valin bioszintetikus folyamatsor kifejezésen olyan bioszintetikus folyamatsort értünk, amely izoleucin-valin bioszintetikus enzimeket (például bioszintetikus enzimet kódoló gének által kódolt polipeptideket), vegyületeket (például prekurzorokat, szubsztrátokat, intermediereket vagy termékeket), kofaktorokat és hasonlókat foglal magában, amelyek piruvát képződésében vagy valinná vagy izoleucinná való konverziójában vagy szintézisükben játszanak szerepet. Az „izoleucinvalin bioszintetikus folyamatsor kifejezésen olyan bioszintetikus folyamatsort értünk, amely valin vagy izoleucin szintéziséhez vezet mikroorganizmusokban (például in vivo), valamint olyan bioszintetikus folyamatsort, amely valin vagy izoleucin szintéziséhez vezet in vitro. Az 1. ábrán vázlatosan bemutatjuk az izoleucin-valin bioszintetikus folyamatsort. Izoleucin-valin bioszintetikus enzimeket vastag dőlt betűvel és a megfelelő gé74.365/BE neket dőlt betűvel jelöljük.
Az „izoleucin-valin bioszintetikus enzim lehet bármilyen olyan enzim, amely izoleucin-valin bioszintetikus folyamatsorban lévő vegyület (például intermedier vagy termék) képződésében szerepet játszik. Az 1. ábrán bemutottak szerint, valin szintézise piruvátból intermediereken, acetolaktáton, a, β-dihidroxiizovaleráton (α,β-DHIV) és a-ketoizovaleráton (α-KIV) keresztül megy végbe. Acetolaktát képződését piruvátból izoleucin-valin bioszintetikus enzim, az aceto-hidroxisav szintetáz (az ilvBNgéntermék, vagy alternatív módon az alsS-géntermék) katalizálja. α,β-DHIV képződését acetolaktátból izoleucin-valin bioszintetikus enzim, az aceto-hidroxisav izomero-reduktáz (az ilvC-géntermék) katalizálja. α-KIV szintézisét α,β-DHIV-ből izoleucin-valin bioszintetikus enzim, a dihidroxisav dehidratáz (az ilvD-géntermék) katalizálja. Továbbá, valin és izoleucin egymásba kölcsönösen átalakíthatok elágazó oldalláncú aminosav transzaminázokkal.
A leírásban minden ketopantoát, pantoát, β-alanin és pantotenát „panto-vegyület. A leírásban „panto-vegyület kifejezésen egy vegyületet értünk (például szubsztrátot, intermediert vagy terméket) a pantotenát bioszintetikus folyamatsorban, amely egy konkrét pantotenát bioszintetikus enzimtől a folyamatsorban később szerepel. Az egyik példában leírtak szerint, a panto-vegyület az egyik pantotenát bioszintetikus enzim, a ketopantoát hidroxi-metil-transzferáz (panB-géntermék) után szerepel, és lehet ketopantoát, pantoát és/vagy pantotenát. Egy másik példában leírtak szerint, a panto-vegyület a pantotenát bioszintetikus enzim ketopantoát reduktáz (panE-géntermék) után szerepel, és
74.365/BE lehet pantoát és/vagy pantotenát. Egy másik példában, a pantovegyület a pantotenát bioszintetikus enzim, a pantotenát szintetáz (panC-géntermék) után szerepel, és lehet pantotenát. Még egy további példában leírtak szerint, panto-vegyület a pantotenát bioszintetikus enzim aszpartát-a-dekarboxiláz (panD-géntermék) után szerepel, és lehet β-alanin és/vagy pantotenát.
Előnyösen alkalmazható panto-vegyület lehet pantotenát és pantoát. A leírásban „pantotenát kifejezésen a pantotenát szabad sav formáját értjük, amelyre a „pantoténsav kifejezést is használjuk, valamint a kifejezésen értjük bármilyen sóját is (például amely a pantotenát vagy pantoténsav savas hidrogénjének kationra, például kalciumra, nátriumra, káliumra, ammónium-ionra történő cseréjével származtatható), ezekre a „pantotenát-só kifejezést is használjuk. A „panto-vegyület kifejezésen a pantotenát alkohol-származékait is értjük. Előnyösen alkalmazható pantotenát-só lehet kalcium-pantotenát vagy nátrium-pantotenát. Előnyösen alkalmazható alkohol-származék lehet pantotenol. A találmány szerinti pantotenát-sókat és/vagy alkoholokat szokásos módszerekkel lehet előállítani, a leírás szerinti szabad savakból kiindulva. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, kalcium-pantotenátot közvetlenül a találmány szerinti mikroorganizmus alkalmazásával szintetizálunk. A találmány szerinti pantotenát-só ehhez hasonlóan konvertálható szabad sav formájú pantotenáttá vagy pantoténsavvá, szokásos módszerek alkalmazásával .
A leírásban a „pantoát kifejezésen szabad sav formában lévő pantoátot értünk, amelyre „pantánsav kifejezést is használjuk,
74.365/BE valamint a kifejezésen értjük bármilyen sóját is (például amely a pantoát vagy pantánsav savas hidrogénjének kationra, például kalciumra, nátriumra, káliumra, ammónium-ionra történő cseréjével származtatható), ezekre a „pantoát-só kifejezést is használjuk. Előnyösen alkalmazható pantoát-só lehet kalcium-pantoát vagy nátrium-pantoát. A találmány szerinti pantoát-sókat szokásos módszerekkel lehet előállítani, a leírás szerinti szabad savakból kiindulva. A találmány szerinti pantoát-só ehhez hasonlóan konvertálható szabad sav formájú pantoáttá vagy pantánsavvá, szokásos módszerek alkalmazásával. Továbbá a szabad sav formájú pantoát vagy pantánsav pantolaktonná konvertálható szokásos módszerek alkalmazásával.
A leírásban „CoA bioszintetikus folyamatsor kifejezésen olyan bioszintetikus folyamatsort értünk, amely CoA bioszintetikus enzimeket (például bioszintetikus enzimet kódoló gén által kódolt polipeptideket), vegyületeket (például prekurzorokat, szubsztrátokat, intermediereket vagy termékeket), kofaktorokat és hasonlókat foglal magában, amelyek CoA képződésekor vagy szintézisekor játszanak szerepet. A 16. ábrán vázlatosan bemutatjuk az E. coliban lejátszódó CoA bioszintetikus folyamatsort. (Feltételezzük, hogy az ábrázolt folyamatsor más mikroorganizmusokban is végbemegy). A „CoA bioszintetikus folyamatsor kifejezésen értünk olyan bioszintetikus folyamatsort, amely CoA szintéziséhez vezet mikroorganizmusokban (például in vivo), valamint olyan bioszintetikus folyamatsort, amely CoA szintéziséhez vezet in vitro. A „koenzim-A vagy CoA bioszintetikus enzim lehet bármilyen olyan enzim, amely CoA bioszintetikus folyamat
74.365/BE > 27 .· :.:
·· ·· · · · sorban lévő vegyület (például intermedier vagy termék) képződésében szerepet játszik, például a coaA-, panK- vagy coaXgéntermék, amely pantotenát foszforilálását katalizálja 4' foszfopantotenátot kialakítva, vagy a coaD-géntermék, amely 4' foszfopantetein átalakulását katalizálja defoszfo-koenzim-A-vá.
I. Rekombináns mikroorganizmusok és eljárások mikroorganizmusok tenyésztésére, ezáltal panto-vegyületek termeltetésére
A találmány szerinti eljárásokban olyan mikroorganizmusokat, például rekombináns mikroorganizmusokat alkalmazunk, melyek leírás szerinti, vektorokat vagy géneket (például vad-típusú és/vagy mutáns géneket) tartalmaznak, és/vagy úgy tenyésztjük azokat, hogy az kívánt termék (például panto-vegyület vagy panto-vegyületek) termelődését eredményezze. A rekombináns mikroorganizmus kifejezésen olyan mikroorganizmust (például baktériumokat, élesztő-sejtet, gomba-sejtet) értünk, amely genetikailag megváltoztatott, módosított vagy tervezett (például géntechnológiailag módosított), így megváltoztatott, módosított vagy eltérő genotípust és/vagy fenotípust mutat (például ha a genetikai módosítás hatással van a mikroorganizmus kódoló nukleinsavszekvenciáira), ha olyan természetes körülmények között előforduló mikroorganizmusokhoz hasonlítjuk, amelyből származik. A találmány szerinti rekombináns mikroorganizmus előnyösen géntechnológiailag úgy van módosítva, hogy túltermelni képes legalább egy, leírás szerinti bakteriális gént vagy génterméket (például pantotenát vagy izoleucin—valin bioszintetikus enzimet kódoló gént), előnyösen bioszintetikus enzimet kódoló gént, amelyet leírás szerinti rekombináns vektor tartalmaz,
74.365/BE és/vagy rekombináns vektorból expresszált bioszintetikus enzimet. Szakember számára nyilvánvaló, hogy génterméket expresszáló vagy túltermelő mikroorganizmus a génterméket kódoló nukleinsav-szekvenciák és/vagy gének expresszálásának vagy fokozott mértékű expresszálásának eredményeként termeli vagy túltermeli a génterméket .
A manipulált mikroorganizmus kifejezésen a leírásban olyan mikroorganizmust értünk, amely úgy van átalakítva (például géntechnológiailag) vagy módosítva, hogy a mikroorganizmusban legalább egy, pantotenát bioszintetikus folyamatsorban lévő enzim és/vagy legalább egy, izoleucin-valin bioszintetikus folyamatsorban lévő enzim módosítva van, így pantotenát vagy más kívánt panto-vegyület termelődik. Ilyen mikroorganizmusok módosítása vagy átalakítása leírás szerinti bármilyen eljárás szerint történhet, például bioszintetikus folyamatson deregulálása és/vagy legalább egy bioszintetikus enzim túltermelése. Manipulált enzim (például manipulált bioszintetikus enzim) kifejezésen olyan enzimet értünk, amelynek expresszálása vagy termeltetése úgy van megváltoztatva vagy módosítva, hogy az enzimtől a folyamatsorban korábban vagy később elhelyezkedő prekurzora, szubsztrátja vagy terméke megváltozott vagy módosult, például a megfelelő vad-típusú vagy természetesen előforduló enzimhez hasonlítva .
A túltermelt vagy túltermelés kifejezésen géntermék (például pantotenát bioszintetikus enzim vagy izoleucin—valin bioszintetikus enzim) olyan mértékű expresszióját értjük, amely nagyobb, mint ami a mikroorganizmus manipulálása előtt volt,
74.365/BE vagy mint ami egy összehasonlítható mikroorganizmusban van manipulálás nélkül. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a mikroorganizmus genetikailag manipulálható (például géntechnológiailag módosítható) géntermék túltermelése céljából, amely nagyobb mértékű, mint mint ami a mikroorganizmus manipulálása előtt volt, vagy mint ami egy összehasonlítható mikroorganizmusban van manipulálás nélkül. Genetikai manipuláció lehet, például szabályzó szekvenciák vagy egy konkrét gén expreszsziójával társult helyek megváltoztatása vagy módosítása (például erős promóterek, indukálható promóterek vagy több promoter hozzáadásával, vagy szabályzó szekvenciák eltávolításával, így az expresszió konstitutív), egy konkrét gén kromoszómális helyzetének módosítása, egy konkrét génnel határos nukleinsav-szekvenciák megváltoztatása, például a riboszóma-kötőhely vagy transzkripciós terminátor megváltoztatása, egy konkrét gén kópiaszámának növelése, egy konkrét gén transzkripciójában és/vagy egy konkrét géntermék transzlációjában szerepet játszó fehérjék módosítása (például szabályzó fehérjék, szupresszorok, enhanszerek, transzkripciós aktivátorok és hasonlók), vagy bármely más, a szakterületen rutinszerűen alkalmazott, génexpresszió deregulálására szolgáló, általános elterjedt módszer (például antiszensz nukleinsavmolekulák alkalmazása, például represszorfehérjék expressziójának blokkolása).
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a mikroorganizmus fizikailag vagy környezetileg manipulálható géntermék túltermelése céljából, amely nagyobb mértékű, mint mint ami a mikroorganizmus manipulálása előtt volt, vagy mint ami egy ösz
74.365/BE szehasonlítható mikroorganizmusban van manipulálás nélkül. Például a mikroorganizmust kezelni lehet vagy olyan ágens jelenlétében lehet tenyészteni, amelyről ismeretes vagy feltételezhető, hogy fokozza egy konkrét gén transzkripcióját és/vagy egy konkrét géntermék transzlációját, így a transzkripció és/vagy transzláció fokozódik vagy mértéke növekszik. Más módszer szerint, a mikroorganizmust hőmérsékletre szelektálva lehet tenyészteni konkrét gén transzkripciójának és/vagy egy konkrét géntermék transzlációjának fokozása céljából, így a transzkripció és/vagy transzláció fokozódik vagy mértéke növekszik.
A deregulált vagy dereguláció kifejezéseken a leírásban a mikroorganizmusban lévő, legalább egy olyan gén megváltoztatását vagy módosítását értjük, amely bioszintetikus folyamatsorban elhelyezkedő enzimet kódol, így a mikroorganizmusban lévő bioszintetikus enzim aktivitása megváltozik vagy módosul. Előnyösen, bioszintetikus folyamatsorban lévő enzimet kódoló, legalább egy enzimet megváltoztatunk vagy módosítunk, így a géntermék mennyisége és/vagy aktivitása fokozódik vagy növekszik. A deregulált folyamatsor kifejezésen olyan bioszintetikus folyamatsort értünk, amelyben bioszintetikus folyamatsorban lévő enzimet kódoló, egynél több gén van megváltoztatva vagy módosítva, így egynél több bioszintetikus enzim mennyisége vagy aktivitása van megváltoztatva vagy módosítva. A deregulált folyamatson (például egy adott bioszintetikus folyamatsorban, egyidejűleg egynél több gén van deregulálva) létrehozása egy mikroorganizmusban arra a konkrét jelenségre épül, hogy egynel több enzim (például kettő vagy három bioszintetikus enzim) van kódolva olyan gének
74.365/BE által, amelyek egy folyamatosan összefüggő genetikai anyagon, egy operonban szomszédosán helyezkednek el.
Az „operon kifejezés a génexpresszió koordinált egységét jelenti, amely egy promótert tartalmaz és esetleg szabályzó elemet, amely egy vagy több, előnyösen legalább két strukturális génnel (például enzimeket, bioszintetikus enzimeket kódoló génekkel) társult. A strukturális gének expressziója lehet koordináltan szabályozott, például szabályzó fehérjék szabályzó elemekhez kötődésével, vagy a transzkripció antitermilálásával. A strukturális gének átírhatók egyetlen olyan mRNS-be, amely a strukturális fehérjék mindegyikét kódolja. Az operonban található gének koordinált szabályozásának következtében az egyedüli promoter és/vagy szabályzó elem megváltozása vagy módosulása az operon által kódolt egyes géntermékek megváltozását vagy módosulását eredményezheti. A szabályzó elem megváltozása vagy módosulása jelentheti, de nem korlátozódik az alábbiakra: endogén promoter és/vagy szabályzó elem(ek) eltávolítása, erős promóterek, indukálható promóterek vagy több promoter hozzáadása, vagy szabályzó szekvenciák eltávolítása, így a géntermékek expreszsziója módosul, az operon kromoszómális helyzete módosul, az operonnal határos vagy az operonban található nukleinsav-szekvenciák megváltoznak, például a riboszóma-kötőhely megváltozik, az operon kópiaszáma növekszik, az operon transzkripciójában és/vagy az operon géntermékeinek transzlációjában szerepet játszó fehérjék módosulnak (például szabályzó fehérjék, szupresszorok, enhanszerek, transzkripciós aktivátorok és hasonlók) , vagy bármely más, a szakterületen rutinszerűen alkalma74.365/BE zott, génexpresszió deregulálására szolgáló, általános elterjedt módszer (például antiszensz nukleinsavmolekulák alkalmazása, például represszorfehérjék expressziójának blokkolása). A dereguláció jelentheti egy vagy több gén kódoló régiójának megváltoztatását abból a célból, hogy például feedback-rezisztens, vagy magasabb vagy alacsonyabb specifikus akitivitású enzimhez jussunk.
A találmány szerinti, különösen előnyös „rekomináns mikroorganizmus géntechnológiailag módosítva van, baktériumból származó gén vagy géntermék túltermelésére. A „bakteriális eredetű vagy például baktériumokból „származó kifejezésen természetes körülmények között baktériumokban megtalálható gént vagy génterméket értünk (például ketopantoát hidroxi-metil-transzferázt, ketopantoát reduktázt, pantotenát szintetázt, aszpartát a-dekarboxilázt, aceto-hidroxisav szintetázt, aceto-hidroxisav izomeroreduktázt vagy dihidroxisav dehidratázt), amelyeket bakteriális gén kódol (például panB, panE, panC, panD, ilvB, ilvN, alsS, ilvC vagy ilvD).
A találmány szerinti eljárásokban olyan rekombináns mikoorganizmusokat alkalmazunk, amelyek ketopantoát hidroxi-metil-transzferáz, ketopantoát reduktáz, pantotenát szintetáz és aszpartát α-dekarboxiláz közül legalább egyet képesek túltermelni. A találmány szerinti, különösen előnyös rekombináns mikroorganizmus géntechnológiailag lett módosítva Bacillusból (például Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus halodurans, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, stb.) származó bioszintetikus enzim túltermelésére, például a Bacillus
74.365/BE subtilisből származó ketopantoát reduktáz (a panE —géntermék) (például 30. számú amino-szekvenciával rendelkező, vagy 29. számú nukleinsavszekvencia által kódolt ketopantoát reduktáz), Bacillus subtilisből származó ketopantoát hidroxi-metil-transzferáz (a panB-géntermék) (például 24. számú amino-szekvenciával rendelkező, vagy 23. számú nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsavmolekula által kódolt ketopantoát hidroxi-metil-transzferáz), Bacillus subtilisből származó pantotenát szintetáz (a panC-géntermék) (például 26. számú aminosav-szekvenciával rendelkező, vagy 25. számú nukleotid-szekvenciával rendelkező nukleinsavmolekula által kódolt pantotenát szintetáz) és/vagy Bacillus subtilisből származó aszpartát oc-dekarboxiláz (a panD-géntermék) (például 28. számú aminosav-szekvenciával rendelkező, vagy 27. számú nukleotid-szekvenciával rendelkező nukleinsavmolekula által kódolt aszpartát α-dekarboxiláz) közül legalább egy túltermelésére.
A találmány egy példaként szolgáló, előnyös megvalósítási módja szerint, az találmány szerinti mikroorganizmus (például KPAR-0 mikroorganizmus) panE-nukleinsav-szekvenciát (például 29. számú szekvenciaként bemutatott, panE—nukleinsav—szekvenciát) tartalmazó vektorral lett transzformálva. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, az találmány szerinti mikroorganizmus panB-nukleinsav-szekvenciát (például 23. számú szekvenciaként bemutatott, panB nukleinsavszekvenciát) tartalmazó vektorral, panC-nukleinsavszekvenciát (például 25. számú szekvenciaként bemutatott, panC-nukleinsavszekvenciát) tartalmazó vektorral vagy panD-nukleinsavszekvenciát (például 27. számú
74.365/BE szekvenciaként bemutatott, panD-nukleinsavszekvenciát) tartalmazó vektorral lett transzformálva. A találmány még egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi deregulált panBCD-operonnal (például 59. számú szekvenciával) rendelkező mikroorganizmus.
A találmány szerinti megoldásban másik előnyösen alkalmazott „rekombináns mikroorganizmus deregulált izoleucin-valin (ilv) folyamatsorral rendelkezik. A „deregulált izoleucin-valin (ilv) folyamatsorral rendelkező mikroorganizmus kifejezésen olyan mikroorganizmust értünk, amely izoleucin-valin (ilv) folyamatsorban lévő enzimet kódoló, legalább egy génben változtatást vagy módosítást tartalmaz, vagy egynél több, izoleucin-valin (ilv) folyamatsorban lévő enzimet kódoló gént tartalmazó operonban változtatást vagy módosítást tartalmaz. Előnyös „deregulált izoleucin-valin (ilv) folyamatsorral rendelkező mikroorganizmus úgy van géntechnológiailag módosítva, hogy Bacillisból (például B. subtilisből) származó ilv-bioszintetikus enzimet túltermeljen, például az alábbiak közül legalább egy génterméket túltermeljen: aceto-hidroxisav szintetáz (ilvBNgéntermékek vagy alsS-géntermék) (például olyan aceto-hidroxisav szintetáz, melynek alegységei 32. és 34. számú aminosav-szekvenciával rendelkeznek, vagy a 31. és 33. számú nukleotid-szekvenciával rendelkező nukleinsavmolekulák kódolják, vagy 58. nukleotid-szekvencia 1-2246. nukleotidjai, vagy 86. számú nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsavmolekula által kódolt aceto-hidroxisav szintetáz), aceto-hidroxisav izomero-reduktáz (ilvC-géntermék), (például 36. számú aminosav-szekvenciával ren
74,365/BE delkező, vagy 35. számú nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsav által kódolt aceto-hidroxisav izomeroreduktáz), dihidroxisav dehidratáz (ilvD-géntermék) (például 38. számú aminosav-szekvenciával rendelkező, vagy 37. számú nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsav által kódolt dihidroxisav dehidratáz), és/vagy transzformálva van ilvBNC-nukleinsavszekvenciát (58. számú szekvencia kódoló régiói 1-1725., 1722-2246. és 2263-3291. nukleotidok), és/vagy ilvD-nukleinsavszekvenciát (37. számú szekvencia) tartalmazó vektorral.
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a rekombináns mikroorganizmust úgy van tervezve vagy géntechnológiailag módosítva, hogy mutáns CoaA és/vagy CoaX bioszintetikus enzim expesszálódik, és legalább egy pantotenát bioszintetikus enzim és/vagy legalább egy izoleucin-valin bioszintetikus enzim túltermelődik vagy deregulált.
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti mikroorganizmus túltermelő vagy mutáns egy génre vagy egy bioszintetikus enzimre nézve (például CoAbioszintetikus enzim, pantotenát bioszintetikus enzim vagy izoleucin-valin bioszintetikus enzim), amely bakteriális eredetű. A „bakteriális eredetű vagy például baktériumokból „származó kifejezésen természetes körülmények között baktériumokban megtalálható gént vagy génterméket értünk (például ketopantoát hidroxi-metil-transzferázt, ketopantoát reduktázt, pantotenát szintetázt, aszpartát a-dekarboxilázt, aceto-hidroxisav szintetázt, aceto-hidroxisav izomeroreduktázt vagy dihidroxisav dehidratázt), amelyeket bakteriális gén kódol (például panB,
-365/BE
I panE, panC, panD, ilvB, ilvN, alsS, ilvC vagy ilvD).
A találmány szerinti megoldásban előnyösen alkalmazott rekombináns mikroorganizmusok továbbá mutáns mikroorganizmusok. A leírásban „mutáns mikroorganizmus kifejezésen olyan rekombináns mikroorganizmust értünk, amelyet géntechnológiailag lett módosítva mutáns gén vagy fehérje expresszálására, amelyet a mikroorganizmus normálisan és természetes körülmények között is termel. Egy mutáns mikroorganizmus előnyösen úgy expresszál mutáns gént vagy fehérjét, hogy a mikroorganizmus megváltozott, módosult vagy különböző fenotípust mutat (például mutáns CoaAbioszintetikus enzim, például pantotenát kináz expresszálására lett tervezve). A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, egy mutáns mikroorganizmus úgy van tervezve vagy géntechnológiailag módosítva, hogy mutáns coaX-gént tartalmaz, a fentebb definiáltak szerint. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, egy mutáns mikroorganizmus úgy van tervezve vagy géntechnológiailag módosítva, hogy mutáns coaAgént tartalmaz, a fentebb definiáltak szerint. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, egy mutáns mikroorganizmus úgy van tervezve vagy géntechnológiailag módosítva, hogy a coaX-gén deletálva legyen (azaz a coaX-gén által kódolt fehérje nem termelődik). A mutáns mikroorganizmus előnyösen mutáns coaX- vagy mutáns coaA-génnel rendelkezik, vagy úgy van módosítva, hogy a coaX- és/vagy mutáns coaA-gén deletálva legyen, így a mutáns mikroorganizmus „csökkentett pantotenát kináz aktivitást kódol. Az egész mikroorganizmus vonatkozásában, a „csökkentett pantotenát kináz aktivitás-t meghatározhatjuk a CoA-bioszin
74.365/BE
-t tetikus folyamatsorban lévő intermedier vagy termék csökkenésének mérésével vagy vizsgálatával, például a mikroorganizmusban vagy a mikroorganizmus tenyésztésére szolgáló tápközegben lévő 4' -foszfo-pantotenát, 4' -foszfo-pantotenil-cisztein, 4' -foszfo-pantetein, defoszfo-koenzim-A, koenzim-A, apo-acil-carrier fehérje (apo-ACP) vagy holo-acil-carrier fehérje (ACP) (például a mikroorganizmusból izolált vagy származó lizátumban) mérésével vagy vizsgálatával (lásd például a 16. ábrát). Ezzel alternatív módon, a „csökkentett pantotenát kináz aktivitás-t meghatározhatjuk úgy is, hogy mérjük vagy vizsgáljuk a mikroorganizmus növekedésének csökkenését. Ezzel alternatív módon, a „csökkentett pantotenát kináz aktivitás-t meghatározhatjuk úgy is, hogy mérjük vagy vizsgáljuk a mikroorganizmusban vagy a környező közegben lévő panto-vegyület (például pantotenát) mennyiségének növekedését, mivel a panto-vegyületek a CaoA-bioszintetikus folyamatsorban elől helyezkednek el, amelynek első lépését a pantotenát kináz katalizálja. Szintén a találmány tárgyát képezik rekombináns mikroorganizmusok, amelyek csökkentett pantotenát kináz-aktivitáson kívül (például amelyek mutáns coaAés/vagy mutáns coaX-géneket expresszálnak) deregulált pantotenát bioszintetikus folymatsorral és/vagy deregulált izoleucin-valin (ilv) bioszintetikus folyamatsorral rendelkeznek.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti rekombináns mikroorganizmus Gram-pozitív organizmus (például olyan mikroorganizmus, amely képes megtartani bázikus festéket, például kristályviolát, a mikroorganizmust körülvevő Gram-pozitív sejtfal jelenlétének következtében). A talál
74.365/BE many egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti rekombináns mikroorganizmus az alábbi nemzetségekből származó mikroorganizmus: Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Laktococci és Streptomyces. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti rekombináns mikroorganizmus az alábbiak közül való: Bacillus subtilis, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus firmus, Bacillus pantothenticus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, valamint más, 1. csoporthoz tartozó, Bacillus-faj, például az a típus, amelyet a 16S méretű rRNS jellemez [Priest, Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria című könyvben, szerk. Sonenshein et al., ASM, Washington, D. C., 6. oldal, (1993)] . A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns mikroorganizmus Bacillus brevis vagy Bacillus stearothermophilus. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns mikroorganizmus Bacillus licheniformis, Bacillus amyloquefaciens, Bacillus halodurans, Bacillus subtilis vagy Bacillus pumilus.
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns mikroorganizmus Gram-negatív (bázikus festéket kizár) organizmus. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns mikroorganizmus az alábbi nemzetségekből származó mikroorganizmus: Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Serratia és Proteus. A találmány egy előnyösebb megvalósítási módja szerint, a rekombináns mikroorganizmus Escherichia nemzet
74,365/BE ségből származik. A találmány egy még előnyösebb megvalósítási módja szerint, a rekombináns mikroorganizmus Escherichia coli. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns mikroorganizmus Saccharomyces (például Saccharomyces cerevisiae).
A találmány szerinti megoldás egyik fontos vonatkozása szerint, leírás szerinti mikroorganizmusokat tenyésztünk úgy, hogy kívánt vegyület (például kívánt panto-vegyület) termelődjön. A „tenyésztés kifejezésen értjük találmány szerinti, élő mikroorganizmus fenntartását és/vagy növesztését (például tenyészet vagy törzs fenntartását és/vagy növesztését) . A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti mikroorganizmust folyékony tápközegben tenyésztjük. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti mikroorganizmust szilárd vagy félig szilárd táptalajon tenyésztjük. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti mikroorganizmust olyan tápközegben tenyésztjük, (például steril, folyékony tápközegben), amely a mikroorganizmus fenntartásához és/vagy növekedéséhez esszenciális és jótékony hatású tápanyagokat tartalmaz (például szénforrásokat vagy szénatomot tartalmazó szubsztrátot, például komplex szénhidrátokat, például babot vagy gabonalisztet, keményítőket, cukrokat, cukoralkoholokat, szénhidrogéneket, olajokat, zsírokat, zsírsavakat, szerves savakat és alkoholokat; nitrogénforrásokat, például növényi fehérjéket, peptonokat, gabonafélékből, babokból és hüvelyesekből származó peptideket és aminosavakat, állati eredetű, például húsból, tejből és húsipari melléktermékekből származó
74.365/BE . : : .· .· :.:.
·· ·· · · · fehérjéket, peptideket és aminosavakat, például peptonokat, húskivonatokat és kazein-hidrolizátumokat; szervetlen nitrogénforrásokat, például karbamidot, ammónium-szulfátot, ammónium-kloridot, ammónium-nitrátot és ammónium-foszfátot; foszforforrásokat, például foszforsavat, nátrium- és kálium-sóit; nyomelemeket, például magnézium, vas, mangán, kalcium, réz, cink, bór, molibdén és/vagy kobalt sóit; valamint növekedési faktorokat, például aminosavakat, vitaminokat, növekedést elősegítő anyagokat és hasonlókat) .
A találmány szerinti mikroorganizmust előnyösen ellenőrzött pH-körülmények között tenyésztjük. Az „ellenőrzött pH-körülmények kifejezés jelenthet bármely pH-értéket, amely a kívánt termék (például panto-vegyület) előállítását eredményezi. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a mikroorganizmusokat körülbelül pH 7-en tenyésztjük. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a mikroorganizmusokat 6,0 és 8,5 közötti pH-értéken tenyésztjük. A kívánt pH-érték fenntartására szakember által ismert, számos módszer áll rendelkezésre .
Az is előnyös, ha a találmány szerinti mikroorganizmusokat ellenőrzött levegőztetéssel tenyésztjük. Az „ellenőrzött levegőztetés kifejezésen olyan mértékű levegőztetést (például oxigént) értünk, amely a kívánt termék (például panto-vegyület) termelődését eredményezi. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a levegőztetést a tenyészetben lévő oxigénszint szabályzásával kontrollálják, például a tenyészet tápközegében oldott oxigén mennyiségének szabályzásával. A tenyészet levegőz
74.365/BE . : : .· .· :.:.
·· ·· · * · tetését a tenyészet kevertetésével tartják kézben. A kevertetést propellerrel, vagy hasonló mechanikus keverő berendezéssel lehet biztosítani, a tenyésztő edény (például fermentor) forgatásával vagy rázatásával, vagy különféle pumpákkal. A levegőztetést továbbá steril levegő vagy oxigén tápközegen (például fermentációs reakciókeveréken át) történő átfúvásával is kézben lehet tartani. Szintén előnyös, ha a találmány szerinti mikroorganizmusokat túlzott habzás nélkül tenyésztjük (például habzásgátló ágens adagolása útján).
A találmány szerinti mikroorganizmusokat továbbá ellenőrzött hőmérsékleten lehet tenyészteni. Az „ellenőrzött hőmérséklet kifejezésen bármilyen olyan hőmérsékletet értünk, amely a kívánt termék (például panto-vegyület) termelését eredményezi. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az ellenőrzött hőmérséklet 15°C és 95 C° közötti hőmérséklet-érték lehet. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, az ellenőrzött hőmérséklet 15°C és 70 C° között van. Előnyösen alkalmazható hőmérsékletek 20°C és 55 C° közötti tartományban vannak, előnyösebben 30°C és 45 C° között vagy 30°C és 50 C° között vannak .
A mikroorganizmusokat folyékony tápközegben lehet tenyészteni (például fenntartani és/vagy növeszteni), és előnyösen a tenyésztés, akár folyamatosan, akár szakaszosan, valamelyik általánosan alkalmazott tenyésztési módszerrel történik, például álló tenyésztéssel, kémcsőben végzett tenyésztéssel, rázott tenyésztéssel (például körkörösen rázott tenyészetben, rázott lombikos tenyészetben, stb.), levegőztetett, forgótányéros tenyész
74.365/BE téssel vagy fermentációval. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a mikroorganizmusokat rázott lombikokban tenyésztjük. A találmány egy előnyösebb megvalósítási módja szerint, a mikroorganizmusokat fermentorban tenyésztjük (például fermentációs eljárásban). A találmány szerinti megoldásban alkalmazható fermentációs eljárás lehet a batch (szakaszos), fed-batch (rátáplálásos szakaszos) és folyamatos fermentációs eljárás. A „batch (szakaszos) eljárás vagy „batch fermentáció kifejezések zárt rendszerre utalnak, amelyben a táptalaj összetétele, a tápanyagok, kiegészítő segédanyagok és hasonlók a fermentáció kezdetén kerülnek összeállításra, és nem változnak a fermentáció folyamán, bár meg lehet próbálkozni olyan faktorok szabályzásával, mint a pH és az oxigénkoncentráció, a táptalaj túlzott savanyodásának és/vagy a mikroorganizmus pusztulásának megelőzése céljából. A fed-batch eljárás vagy fed-batch (rátáplálásos) fermentáció szakaszos fermentációra utal azzal a kivétellel, hogy egy vagy több szubsztrát vagy kiegészítő anyag a fermentációs folyamat közben kerül hozzáadásra (például részletekben vagy folyamatosan). A folyamatos eljárás vagy folyamatos fermentáció olyan rendszerre utal, amelyben egy definiált fermentációs tápközeget folyamatosan adagolunk egy fermentorba, és ezzel egyidejűleg azonos mennyiségű elhasznált, kondicionált tápközeget eltávolítunk, előnyösen a kívánt vegyület (például panto-vegyület) kinyerése céljából. Különféle ilyen eljárásokat fejlesztettek ki, és szakember számára jól ismertek .
A olyan körülmények között tenyésztünk, amelyben kívánt ve
74.365/BE gyület (például panto-vegyület, például pantotenát) termelődik kifejezés a leírásban mikroorganizmusok fenntartását és/vagy növesztését jelenti olyan körülmények között (például hőmérséklet, nyomás, pH, időtartam, stb), amely megfelelő vagy elegendő a kívánt vegyület termelődéséhez, vagy a termelendő, konkrét vegyület kívánt hozamának elérésére. Például a tenyésztést annyi ideig folytatjuk, amely elegendő a kívánt mennyiségű panto-vegyület (például pantotenát, pantoát vagy β-alanin) termelődéséhez. Előnyösen a tenyésztést annyi ideig folytatjuk, amely elegendő ahhoz, hogy a termelődött panto-vegyület mennyisége lényegében elérjen egy maximumot. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a tenyésztést körülbelül 12-24 óra hosszáig folytatjuk. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a tenyésztést körülbelül 24-36 óra, 36-48 óra, 48-72 óra, 72-96 óra, 96-120 óra, 120-144 óra, vagy 144 óránál hosszabb ideig folytatjuk. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a tenyésztést annyi ideig folytatjuk, amely elegendő ahhoz, hogy a panto-vegyület elérje termelési hozamát, például a sejteket tenyésztjük, így legalább körülbelül 15-20 g/1 panto-vegyület termelődik, legalább körülbelül 20-25 g/1 panto-vegyület termelődik, legalább körülbelül 25-30 g/1 panto-vegyület termelődik, legalább körülbelül 30-35 g/1 panto-vegyület termelődik, legalább körülbelül 35-40 g/1 panto-vegyület termelődik (például legalább körülbelül 37 g/1 panto-vegyület), vagy legalább körülbelül 40-50 g/1 panto-vegyület termelődik. A találmány még egy előnyös megvalósítási módja szerint, a mikroorganizmusokat olyan körülmények között tenyésztjük, amelyben a panto-vegyület elő
74.365/BE nyös hozamát, például a fentebb leírt tartományokban, körülbelül 24 óra, körülbelül 36 óra, körülbelül 48 óra, körülbelül 72 óra vagy körülbelül 96 óra alatt éri el.
A találmány szerinti eljárásban továbbá kinyerünk egy kívánt vegyületet (például panto-vegyületet). A kívánt vegyület „kinyerése kifejezésen azt értjük, hogy a vegyületet extraháljuk, elkülönítjük, izoláljuk vagy tisztítjuk a tenyésztési tápközegből. A vegyület kinyerését bármilyen, szakember által ismert, általánosan alkalmazott izolálási vagy tisztítási módszerrel végrehajthatjuk, például hagyományos gyantával való kezeléssel (például anion- vagy kationcserélő gyantával, nem-ionos adszorpciós gyantával), hagyományos adszorbenssel való kezeléssel (például aktív szénnel, kovasavval, szilikagéllel, cellulózzal, aluminával stb.), pH-változtatással, oldószeres extrakcióval (például hagyományos oldószerrel, például alkohollal, etilacetáttal, hexánnal és hasonlókkal) , dialízissel, szűréssel, töményítéssel, kristályosítással, újrakristályosítással, pH-állítással, liofilizálással és hasonlókkal. Például egy vegyületet (például panto-vegyületet) úgy lehet kinyerni tenyészet tápközegéből, hogy először eltávolítjuk a mikroorganizmusokat a tenyészetből. Azután a tápközeget felvisszük kationcserélő gyantára, a nem-kívánt kationok eltávolítása céljából, vagy anioncse-rélő gyantára, a nem-kívánt anionok és szerves savak eltávolítása céljából, amelyek erősebben savasak a kérdéses panto-vegyületeknél (például pantotenátnál). Az eredményül kapott panto-vegyületet (például pantotenátot) azután pantotenát-sóvá lehet alakítani (például kalcium-pantotenáttá), a leírás szerint.
74.365/BE
A találmány szerinti, kívánt vegyület előnyösen „extrahálva·, „izolálva vagy „tisztítva van, így az eredményül kapott preparátum lényegében mentes más komponensektől (például mentes tápközeg komponenseitől és/vagy fermentációs melléktermékektől). A „lényegében mentes más komponensektől kifejezésen olyan preparátumokat értünk, amelyekben a kívánt komponens el van választva (például tisztítva vagy részlegesen tisztítva van) olyan tenyészetből származó tápközeg komponenseitől vagy fermentációs melléktermékektől, amelyben termeltettük. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a preparátumban körülbelül 80%-nál (száraz tömegre vonatkoztatva) több kívánt termék van (például körülbelül 20%-nál kevesebb más tápközeg-komponens vagy fermentációs melléktermék), előnyösebben körülbelül 90%-nál több kívánt termék van (például körülbelül 10%-nál kevesebb más tápközeg-komponens vagy fermentációs melléktermék) , még előnyösebben körülbelül 95%-nál több kívánt termék van (például körülbelül 5%-nál kevesebb más tápközeg-komponens vagy fermentációs melléktermék) , és legelőnyösebben körülbelül 98-99%-nál több kívánt termék van (például körülbelül 1-2%-nál kevesebb más tápközegkomponens vagy fermentációs melléktermék). Ha a kívánt vegyület panto-vegyület, amely só-származékká van alakítva (például pantotenát-só vagy pantoát-só), a panto-vegyület előnyösen mentes (például lényegében mentes) a só képződésével társult kémiai szennyező anyagoktól. Ha a kívánt vegyület olyan panto-vegyület, amely alkohol-származékká van alakítva, a panto-vegyület előnyösen mentes (például lényegében mentes) az alkohol képződésével társult kémiai szennyező anyagoktól.
74.365/BE
A találmány egy alternatív előnyös megvalósítási módja szerint, a kívánt panto-vegyületet nem tisztítjuk a mikroorganizmusból, például amikor a mikroorganizmus biológiailag nem veszélyes (például biztonságos) . Például az egész tenyészetet (vagy a tenyészet felülúszóját) módosítás nélkül alkalmazzuk. A találmány másik előnyös megvalósítási módja, a tenyészet (vagy a tenyészet felülúszója) töményítve van. A találmány még egy előnyös megvalósítási módja szerint, a tenyészet (vagy tenyészet felülúszója) szárítva vagy liofilizálva van.
II. Panto-vegyület termeltetésére szolgáló eljárások keto-pantoát reduktázt túltermelő mikroorganizmusok alkalmazásával
A találmány tárgyát képezik egy vonatkozásában eljárások panto-vegyületek előállítására, amelyben ketopantoát reduktázt túltermelni képes (KPAR-O) mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben a panto-vegyület termelődik. A „ketopantát reduktáz-túltermelő (KPAR-O) mikroorganizmus kifejezésen olyan mikroorganizmust értünk, amely úgy van manipulálva, hogy ketopantoát reduktaz (például 30. számú szekvenciával rendelkező, B. subtilisből származó ketopantoát reduktáz-fehérje) túltermelődik, és/vagy panEl-nukleinsavszekvenciát (például 29. számú szekvenciával rendelkező, B. subtilisből származó panEl-nukleinsavszekvenciát) tartalmazó vektorral transzformálva van. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a panto vegyület pantoát. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a ketopantoát reduktáz bakteriális eredetű. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a ketopantoát reduktáz Bacillusból származik (például Bacillus
74.365/BE subtilisből származik). A találmány még egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a KPAR-O-mikroorganizmus Gram-pozitív. A találmány még egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a KPAR-O-mikroorganizmus Bacillus-, Corynebacterium-, Lactobacillus-, Lactococci- vagy Streptomyces-nemzetséghez tartozó mikroorganizmus. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a KPAR-O-mikroorganizmus Bacillus-nemzetséghez tartozó mikroorganizmus. A találmány egy előnyösebb megvalósítási módja szerint, a KPAR-O-mikroorganizmus Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliguefaciens, Bacillus halodurans, Bacillus subtilis vagy Bacillus pumilus. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint, a KPAR-O-mikroorganizmus Bacillus subtilis .
A találmány még egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a KPAR-O-mikroorganizmus továbbá ketopantoát reduktázon kívül, legalább egy pantotenát bioszintetikus enzimet képes túltermelni. A találmány egy példaként bemutatott, előnyös megvalósítási módja szerint, a KPAR-O-mikroorganizmus továbbá keto-pantoát hidroxi-metil-transzferáz, pantotenát szintetáz és aszpartát α-dekarboxiláz közül legalább egyet képes túltermelni. Szintén a találmány tárgyát képezik eljárások panto-vegyületek előállítására, például amely eljárásokban KPAR-O-mikroorganizmust tenyésztünk, és egy további lépésben kinyerjük a pantovegyületet.
III. Panto-vegyületek termeltetésére szolgáló eljárások, amelyekben nem szükséges prekurzor-adagolás
A manipulált bioszintetikus enzimektől vagy bioszintetikus
74.365/BE enzimek kombinációjától függően, a találmány szerinti mikroorganizmus számára kívánatos vagy szükséges lehet legalább egy pantotenát-prekurzort biztosítani (például beadagolni), így pantotenát vagy más, kívánt panto-vegyület termelődik. A „pantotenát bioszintetikus prekurzor vagy „prekurzor kifejezésen olyan ágenst vagy vegyületet értünk, amely, ha mikroorganzimus számára biztosítjuk, érintkeztetjük vele, vagy tenyésztési tápközegébe adagoljuk, akkor fokozza vagy növeli a pantotenát-bioszintézis mértékét. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, pantotenát bioszintetikus prekurzor vagy prekurzor az aszpartát. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, pantotenát bioszintetikus prekurzor vagy prekurzor a β-alanin. A hozzáadott aszpartát vagy β-alanin menynyisége előnyösen akkora mennyiség, amely a tenyésztési tápközegben elegendő koncentrációt eredményez a mikroorganizmus termelékenységének fokozására (például a koncentráció elegendő panto-vegyület, például β-alanin, ketopantoát, pantoát vagy pantotenát). A találmány szerinti pantotenát bioszintetikus prekurzorokat be lehet adagolni tömény oldat vagy szuszpenzió formájában (például alkalmas oldószer, például víz vagy puffer), vagy szilárd anyag formájában (például por formájában) . Továbbá, a találmány szerinti pantotenát bioszintetikus prekurzorokat be lehet adagolni egyetlen alikvotként, folyamatosan vagy szakaszosan egy adott időtartam alatt.
A találmány még egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a pantotenát bioszintetikus prekurzor valin, lásd például a 3. példát. A találmány még egy másik előnyös megvalósítási
74.365/BE módja szerint, a pantotenát bioszintetikus prekurzor a-keto-izovalerát. A hozzáadott valin vagy α-ketoizovalerát mennyisége előnyösen akkora mennyiség, amely a tenyésztési tápközegben elegendő koncentrációt eredményez ahhoz, hogy a kívánt termék (például panto-vegyület) termelődése megtörténjen. A pantotenát bioszintetikus prekurzorokat a leírásban „kiegészítő pantotenát bioszintetikus szubsztrátoknak is nevezzük.
A találmány szerinti, pantotenát bioszintetikus eljárásokban, pantotenát bioszintetikus prekurzorok adagolása magas költségekkel járhat, például ha az eljárásokat nagy hozamú pantovegyületek termeltetésére alkalmazzuk. Ennek megfelelően, a találmány szerinti, előnyös eljárásokban alkalmazott mikroorganizmusokban legalább egy bioszintetikus enzim vagy bioszintetikus enzimek kombinációja (például legalább egy, pantotenát bioszintetikus enzim és/vagy valin-izoleucin bioszintetikus enzim) manipulálva van, így pantotenátot vágy más, kívánt pantovegyületeket prekurzor-adagolástól függetlenül termeltetünk. A „prekurzor-adagolástól független módon kifejezésen, ha kívánt vegyület (például panto-vegyület) termeltetésére utalunk, olyan megközelítést vagy a kívánt vegyület előállítására szolgáló, termelési módszert értünk, amely nem függ, vagy nincs ráutalva a mikroorganizmushoz adagolandó (például rátáplálás) olyan prekurzorokra, amelyeket a kívánt vegyületek termelésében hasznosít. A találmány szerinti eljárásokban alkalmazott mikroorganizmusokat például panto-vegyületek előállítására lehet alkalmazni úgy, hogy nem szükséges aszpartát, β-alanin, valin és/vagy α-KIV prekurzorok rátáplálása.
74.365/BE
A találmány szerinti, alternatív előnyös eljárásokban olyan mikroorganizmusokat alkalmazunk, amelyekben legalább egy bioszintetikus enzim vagy bioszintetikus enzimek kombinációja manipulálva van, így pantotenát vagy más, kívánt panto-vegyület termelődik, lényegében prekurzor-adagolástól független módon. A „lényegében prekurzor-adagolástól független módon kifejezésen olyan megközelítést vagy a kívánt vegyület előállítására szolgáló, termelési módszert értünk, amely kisebb mértékben függ, vagy van ráutalva a mikroorganizmushoz adagolandó (például rátáplálás) olyan prekurzorokra, amelyeket a kívánt vegyületek termelésében hasznosít. A találmány szerinti eljárásokban alkalmazott mikroorganizmusokat például panto-vegyületek előállítására lehet alkalmazni úgy, hogy lényegében csökkentett mennyiségű aszpartát, β-alanin, valin és/vagy α-KIV prekurzor-adagolás szükséges. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezik eljárások panto-vegyületek (például pantotenát) termeltetésére úgy, hogy az eljárásokban 5-10%-al kevesebb prekurzor adagolására van szükség egy kontroll mikroorganizmushoz képest (például olyan mikroorganizmushoz képest, amely például teljesen függ a prekurzor-adagolástól a kívánt vegyület hatékony termelődéséhez). A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezik eljárások panto-vegyületek termeltetésére úgy, hogy az eljárásokban 15-20-5-al kevesebb prekurzor adagolására van szükség egy kontroll mikroorganizmushoz képest. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezik eljárások panto-vegyületek termeltetésére úgy, hogy az eljárásokban
74.365/BE
25-30%-al, 35-40%-al, 45-50%-al vagy 55-60%-al kevesebb prekurzor adagolására van szükség egy kontroll mikroorganizmushoz képest. Az 1-3. példában leírtak szerint, a találmány szerinti eljárásokban alkalmazott, konkrét mikroorganizmusokhoz, például 5 g/1 aszpartát, β-alanin, valin vagy α-KIV hozzáadása szükséges (például kémcsőben végzett tenyészetben vagy rázott lombikos tenyészetben) . Ennek megfelelően, a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezik eljárások panto-vegyületek (például pantotenát) előállítására úgy, hogy 0,25 g/1, 0,5 g/1, 0,75 g/1, 1 g/1, 1,25 g/1, 1,5 g/1, 1,75 g/1, 2 g/1, 2,25 g/1, 2,5 g/1, 2,75 g/1 vagy 3 g/1 mennyiségeknél kevesebb adagolás szükséges.
Kívánt vegyületek (például panto-vegyületek) prekurzor-adagolástól független módon, vagy ezzel alternative, prekurzor-adagolástól lényegében független módon való termeltetésére szolgáló, előnyös eljárásokban olyan mikroorganizmust tenyésztünk, amelyet manipuláltunk (például terveztünk vagy módosítottunk, például géntechnológiailag módosítottunk), így legalább egy pantotenát bioszintetikus enzim, és/vagy legalább egy izoleucinvalin bioszintetikus enzim módosítva van. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, például a mikroorganizmus úgy van manipulálva (például tervezve vagy módosítva) , hogy legalább egy pantotenát bioszintetikus enzim, és/vagy legalább egy izoleucin-valin bioszintetikus enzim termelése deregulálva van. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, például a mikroorganizmus úgy van manipulálva (például tervezve vagy módosítva) , hogy deregulált bioszintetikus folyamatsorral és/vagy
74.365/BE deregulált pantotenát bioszintetikus folyamatsorral és/vagy deregulált izoleucin-valin bioszintetikus folyamatsorral rendelkezik, a leírás szerint. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a mikroorganizmus úgy van manipulálva (például tervezve vagy módosítva), hogy legalább egy pantotenát bioszintetikus enzim, és/vagy legalább egy izoleucin-valin bioszintetikus enzim túl van termeltetve.
Kívánt vegyületek (például panto-vegyületek) prekurzoradagolástól független módon, vagy ezzel alternatív, prekurzoradagolástól lényegében független módon való termeltetésére szolgáló, előnyös eljárások az alábbiak. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás pantotenát termeltetésére prekurzor-adagolástól független módon, amelyben deregulált izoleucin-valin (ilv) folyamatsorral rendelkező, aszpartát α-dekarboxiláz-túltermelő (AaD-O) mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben pantotenát termelődik. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás pantotenát termeltetésére prekurzor-adagolástól független módon, amelyben deregulalt pantotenát (pan) folyamatsorral és deregulált izoleucin-valin (ilv) folyamatsorral rendelkező, aszpartát a-dekarboxiláz-túltermelő (AaD-O) mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben pantotenát termelődik. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgya eljárás pantotenát termeltetésére aszpartát- vagy β-alaninadagolástól független módon, amelyben aszpartát a-dekarboxiláztultermelo (AaD-O) mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmé
74.365/BE nyék között, amelyben pantotenát termelődik. A találmány még egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgya eljárás pantotenát termeltetésére valin- vagy a-ketoizovalerát-adagolástól független módon, amelyben deregulált izoleucin—valin (ilv) folyamatsorral rendelkező, aszpartát a-dekarboxiláz-túltermelő (AaD-O) mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben pantotenát termelődik.
Az „aszpartát dekarboxiláz—túltermelő (ActD—0) mikroorganizmus kifejezésen olyan mikroorganizmust értünk, amely úgy van manipulálva, hogy aszpartát α-dekarboxiláz túltermelődik. Előnyös „aszpartat a—dekarboxíláz — túltermelo (AotD—0) mikroorganizmus B. subtilisből származó panD-nukleinsavszekvenciát (például panD-nukleinsavszekvenciát, amely 28. számú aminosav-szekvenciával rendelkező, aszpartát α-dekarboxiláz-fehérjét kódol), például 27. számú panD-nukleinsavszekvenciát tartalmazó vektorral transzformálva van.
A „deregulált izoleucin-valin (ilv) folyamatsorral rendelkező mikroorganizmus kifejezésen olyan mikroorganizmust értünk, amely izoleucin-valin (ilv) folyamatsorban lévő enzimet kódoló, legalább egy génben változtatást vagy módosítást tartalmaz, vagy egynél több, izoleucin-valin (ilv) folyamatsorban lévő enzimet kódoló gént tartalmazó operonban változtatást vagy módosítást tartalmaz. Előnyös „deregulált izoleucin-valin (ilv) folyamatsorral rendelkező mikroorganizmus aceto-hidroxisav szintetázt (például 32. és 34. számú aminosav-szekvenciákatb tartalmazó alegységekkel rendelkező aceto-hidroxisav szintetáz, vagy 87. számú aminosav-szekvenciával rendelkező aceto-hidroxisav szinte
74.365/BE táz), aceto-hidroxisav izomeroreduktázt (36. számú aminosavszekvenciával rendelkezik) vagy dihidroxisav dehidratázt (38. számú aminosav-szekvenciával rendelkezik) képes túltermelni, és/vagy transzformálva van ilvB-, ilvN-, ilvC-, ilvBN-, ilvBNCvagy alsS-nukleinsavszekvenciákat tartalmazó vektorral (31., 33., 35. számú szekvenciák, 58. számú szekvencia 1-2246. nukleotidja, 1-1725., 1722-2246. és 2263-3291. nukleotidokból álló kódoló régióval rendelkező 58. számú szekvencia, vagy 86. számú szekvencia) és/vagy ilvD-nukleinsavszekvenciával (37. számú szekvencia).
IV. Nagy hozamú termelési eljárás
A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi nagy hozamú termelési eljárás pantotenát termeltetésére, amelyben manipulált mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben pantotenát szignifikánsan nagy hozamban termelődik. A „nagy hozamú termelési eljárás kifejezésen értünk például kívánt vegyületet (például panto-vegyületet) nagy hozamban termelő eljárást, amely eljárás alkalmazása a kívánt vegyület olyan mennyiségben való termelődését eredményezi, amely megnövelt mennyiség vagy fölötte van annak a szintnek, ami szokásosan alkalmazott, összehasonlítható eljárásokkal elérhető. A nagy hozamú termelési eljárás előnyösen a kívánt termék termelődését eredményezi szignifikánsan magas hozamban. A „szignifikánsan magas hozam kifejezés a termelés vagy hozam olyan mennyiségi szintjét jelenti, amely szignifikánsan megnövelt mennyiség vagy fölötte van annak a szintnek, ami szokásosan alkalmazott, összehasonlítható eljárásokkal elérhető,
74,365/BE például amely olyan mennyiségi szint fölé van emelve, amely elegendő a kívánt termék nagybani ipari előállítására (például a termék iparilag megvalósítható költségen való termeléséhez). A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi nagy hozamú termelési eljárás pantotenát termeltetésére, amelyben manipulált mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben a termelt pantotenát 2 g/l-nél nagyobb mennyiségben termelődik. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi nagy hozamú termelési eljárás pantotenát termeltetésére, amelyben manipulált mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben a termelt pantotenát 10 g/l-nél nagyobb mennyiségben termelődik. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi nagy hozamú termelési eljárás pantotenát termeltetésére, amelyben manipulált mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben a termelt pantotenát 20 g/l-nél nagyobb mennyiségben termelődik. A találmány még egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi nagy hozamú termelési eljárás pantotenát termeltetésére, amelyben manipulált mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben a termelt pantotenát 30 g/lnél nagyobb mennyiségben termelődik. A találmány még egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi nagy hozamú termelési eljárás pantotenát termeltetésére, amelyben manipulált mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben a termelt pantotenát 40 g/l-nél nagyobb mennyiségben termelődik.
74.365/BE
A találmány tárgyát képezi nagy hozamú termelési eljárás kívánt vegyület termeltetésére (például panto-vegyület termeltetésére) , amelyben manipulált mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben elegendő mértékben megnövelt menynyiségben termelődik nagybani ipari eljárásban kívánatos időtartam alatt. A találmány egy példaként szolgáló, előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi nagy hozamú termelési eljárás pantotenát termeltetésére, amelyben manipulált mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben a pantotenát 15-20 g/l-nél nagyobb koncentrációban termelődik 36 óra alatt. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi nagy hozamú termelési eljárás pantotenát termeltetésére, amelyben manipulált mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben a pantotenát 25-30 g/l-nél nagyobb koncentrációban termelődik 48 óra alatt. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi nagy hozamú termelési eljárás pantotenát termeltetésére, amelyben manipulált mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben a pantotenát 35-40 g/l-nél nagyobb koncentrációban termelődik 72 óra alatt. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi nagy hozamú termelési eljárás pantotenát termeltetésére, amelyben manipulált mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben a pantotenát 30-40 g/l-nél nagyobb koncentrációban termelődik 60 óra alatt, például 30, 35 vagy 40 g/1 koncentrációban 60 óra alatt. Szintén a találmány tárgyát képezik a fentebb leírt értékek között átmenetet képező tartományok.
74,365/BE
Például pantotenát-termelés legalább 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 és 39 g/1 koncentrációban 60 óra alatt, beleesik a 60 óra alatt termelődött, 30-40 g/l-es tartományba. Egy másik példában, 30-35 g/l-es vagy 35-40 g/l-es tartományok beleesnek a 60 óra alatt termelődött, 30-40 g/l-es tartományba. Továbbá, szakember számára nyilvánvaló, hogy „30-40 g/1 60 óra alatt termelési szintet elért, manipulált organizmus további tenyésztése (például 60 óránál hosszabb ideig), adott esetben még magasabb pantotenát-hozamokat eredményez.
V. Panto-vegyületek előállítására szolgáló módszerek, amaiyokben pantotenát kinázra mutáns mikroorganizmusokat alkaimacink
A találmány tárgyát képezik eljárások pantotenát termeltetésere olyan mikroorganizmusok alkalmazasaval, amelyek géntechno— lógiailag módosítva lettek nagy hozamú pantotenát- vagy más panto-vegyület termeltetésére. Pantotenátot túltermelő sejtekben nagy mennyiségű intracelluláris pantotenát képződik, amely képes legyőzni pantotenáz kináz CoA által kifejtett feedback-gátlását, amely CoA túltermeléséhez vezet. Pantotenát felhasználásán kívül, CoA fokozott mértékű szintézise a PanB-, PanD-, PanE- vagy PanC-reakció feedback-gátlásának növekedését okozhatja, ezáltal limitálhatja a pantotenát termelést. Ennek megfelelően, pantotenát kináz-aktivitás csökkentése a CoA-mennyiségek csökkenéséhez vezet, amely PanB-, PanD-, PanE- vagy PanC-aktivitást és a pantotenát-termelés növekedését eredményezi.
Tehát bizonyos találmány szerinti módszerek, legalábbis részben, B- subtilisből származó coaA-gén azonosítására és jellemzésére alapulnak, és annak bemutatására, hogy a gén nem esszenciá
74.365/BE lis B. subtilis növekedéséhez (azaz coaA-gén deléciója a B. subtilis kromoszómájából nem letális), sem a B. subtilisben lévő pantotenát kináz-aktivitáshoz. Egy második, B. subtilisben előforduló, pantotenát kinázt kódoló gént azonosítottunk és jellemeztünk, jelölése „coaX. Ez a gén képes komplementálni olyan E. coli mutánst, amely hőmérséklet-szenzitív pantotenát kinázt tartalmaz, és homológia alapján nem rendelhető egyik előzőleg már ismert pantotenát kináz-génhez sem.
A találmány szerinti eljárás egyik vonatkozásában, olyan rekombináns mikroorganizmusokat alkalmazunk, amelyek coaX-gént tartalmaznak vagy mutáns coaX-gént tartalmaznak, és amelyek csökkentett pantotenát kináz-aktivitással rendelkeznek. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, olyan rekombináns mikroorganizmusokat alkalmazunk, amelyek továbbá deregulált pantotenát bioszintetikus folyamatsort tartalmaznak. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, olyan rekombináns mikroorganizmusokat alkalmazunk, amelyek továbbá deregulált izoleucin-valin (ilv) bioszintetikus folyamatsort tartalmaznak. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a mikroorganizmusok a Bacillus nemzetséghez tartoznak (például B. subtilishez).
A találmány szerinti eljárásban olyan rekombináns mikroorganizmusokat (például Bacillus-nemzetséghez tartozó mikroorganizmusokat, például B. subtilist) is alkalmazunk, amelyek coaX-gént tartalmaznak vagy mutáns coaX-gént tartalmaznak, adott esetben coaX-gént vagy mutánsát tartalmazzák, és amelyek csökkentett pantotenát kináz-aktivitással rendelkeznek. A találmány egy elő
74.365/BE nyös megvalósítási módja szerint, olyan rekombináns mikroorganizmusokat alkalmazunk, amelyek továbbá deregulált pantotenát bioszintetikus folyamatsort tartalmaznak, vagy amelyek deregulált izoleucin-valin (ilv) bioszintetikus folyamatsort tartalmaznak. A találmány tárgyát képezik izolált coaX- vagy coaA-géneket, vagy mutáns coaX- és/vagy coaA-géneket tartalmazó vektorok. A találmány tárgyát képezik coaX-géneket vagy mutáns coaA-géneket tartalmazó, izolált nukleinsavmolekulák, a CoaXfehérjéken és mutáns CoaX-fehérjéken kívül.
A fentebb leírt nukleinsavmolekulák (például gének), fehérjék, vektorok és rekombináns mikroorganizmusok (például mutáns mikroorganizmusok) különösen alkalmasak panto-vegyületek (például pantotenát) termelésére szolgáló eljárásokban és/vagy panto-vegyület termelésének fokozására szolgáló eljárásokban történő alkalmazásra. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás panto-vegyület (például pantotenát) termeltetésére, amelyben pantotenát kináz mutánst (például rekombináns mikroorganizmust, amely rendellenesen expresszál, például mutáns pantotenát kinázra, a leírás szerint) tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben pantovegyület termelődik. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás panto-vegyület (például pantotenát) termelésének fokozására, amelyben pantotenát kináz mutánst (például rekombináns mikroorganizmust, amely rendellenesen expresszál, például mutáns pantotenát kinázra, a leírás szerint) tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben panto-vegyület termelődik. A leírásban a „fokozás (például a
74,365/BE „termelés fokozás kifejezéssel összefüggésben) szakkifejezésen azt értjük, hogy panto-vegyület (például pantotenát) termelésének mennyisége vagy sebessége növekszik, nem-mutáns mikroorganizmusokban (például normál pantotenát kináz génnel/génekkel és/vagy normál pantotenát termelési sebességekkel és/vagy menynyiségekkel rendelkező mikroorganizmusokban) tapasztalt termelés mennyiségéhez vagy sebességéhez képest.
A találmány szerinti pantotenát kináz mutánsokat alkalmazó eljárásokkal termelt panto-vegyület mennyisége előnyösen legalább 5-6 —kai van megnövelve nem—mutáns (például nem—mutáns pantotenát kinázt expresszáló, rekombináns mikroorganizmus) által termelt mennyiséghez képest. Sőt, előnyösebben panto-vegyület mennyisége legalább 10%—kai van megnövelve nem—mutánsokat alkalmazó eljárások termelődött mennyiséghez képest. Sőt, még előnyösebben a panto-vegyület mennyisége (például pantotenát mennyisége) 20%-, 30%-, 40%-, 50%-, 60%-, 70%-, 80%-, 90%-kal, 2-, 5-, 10-, 50-, 100-szor vagy még nagyobb mértékben van megnövelve nem—mutánsokat alkalmazó eljárások termelődött mennyiséghez képest.
VI. Fokozott pantotenát termelést eredményező további mutációk
Ά találmány szerinti eljárásokban továbbá például pantotenát bioszintetikus enzim és/vagy izoleucin-valin bioszinetikus enzim túltermelésén vagy deregulálásán, vagy pantotenát kinázt kódoló génbe való mutáció bevitelén kívül, olyan enzimet deletálunk vagy alakítunk mutánssá, amely kulcsfontosságú pantotenát bioszintézis-szubsztrátok vagy prekurzorok konverzióját katalizálja felesleges vagy nem-kívánt termékekké. Például az ilvE-génben
74.365/BE
[ Kuramitsu et al., J. Biochem. 97, 993-999 (1985)] vagy homológjaiban (62. vagy 64. számú szekvencia) mutáció létrehozása, ezáltal a-ketoízovalerát valinná való konverziójának limitálása, továbbá pantotenát kinázt kódoló enzimben mutáció létrehozása a pantotenát-termelést előre láthatóan még tovább fokozza vagy mértékét növeli. Ezzel alternatív módon, mutáció létrehozása az alsD-génben [Renna et al., J. Bacteriol. 175, 3863-3875 (1993)] vagy homológjában (68. számú szekvencia), ezáltal acetolakton acetoinná való konverziójának limitálása, továbbá pantotenát kinázt kódoló enzimben mutáció létrehozása a pantotenát-termelést előre láthatóan még tovább fokozza vagy mértékét növeli. Ezzel alternatív módon, mutáció létrehozása alanin-valin transzaminázt kódoló avtA-génben vagy homológjában, ezáltal —keto—izovalerát valinná való konverziójának limitálása, továbbá pantotenát kinázt kódoló enzimben mutáció létrehozása a pantotenát-termelést előre láthatóan még tovább fokozza vagy mértékét növeli. Mutáció létrehozhatunk az avtA-génben, például a 70. számú nukleotidszekvenciával rendelkező avtA-génben (például E. coliból származó avtA-génben) vagy strukturális homológjában (például a 71. számú aminosav-szekvenciával 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95% vagy nagyobb mértékű azonossággal rendelkező fehérjét kódoló homológban) vagy funkcionális homológjában (például alanin-valin transzamináz aktivitással rendelkező, strukturálisan eltérő fehérjét kódoló gén). Ilyen mutációkat a példákban (például a 13., 15., 16. és 17. példákban) leírt módszerekkel lehet létrehozni.
Ennek megfelelően, a találmány egy előnyös megvalósítási mód
74.365/BE ja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás panto-vegyületek előállítására, amelyben mutáns pantotenát kinázt kódoló génnel, továbbá avtA-, ilvE-, ansB- és/vagy alsD-génben delécióval vagy mutációval, vagy homológjával rendelkező mikroorganizmust tenyésztünk. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás panto-vegyületek előállítására, amelyben mutáns pantotenát kinázt kódoló génnel és deregulált bioszintetikus folyamatsorban lévő enzimmel, továbbá avtA-, ilvE-, ansB- és/vagy alsD-génben delécióval vagy mutációval, vagy homológjával rendelkező mikroorganizmust tenyésztünk. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás panto-vegyületek előállítására, amelyben mutáns pantotenát kinázt kódoló génnel és deregulált izoleucin-valin bioszintetikus folyamatsorban lévő enzimmel, továbbá avtA-, ilvE-, ansB- és/vagy alsD-génben delécióval vagy mutációval, vagy homológjával rendelkező mikroorganizmust tenyésztünk.
Az alsD-génben létrehozott mutáció különösen hasznos, ha az alsS-gén fokozott mértékű expressziójával vagy deregulálásával együtt végezzük, például abból a célból, hogy megelőzzük a-KIVtermeléshez hasznosítható szénforrások (például acetolakton) elfogyását a prekurzor-készletből (,,pool-ból) . Ennek megfelelően, az als-lókusz panto-vegyület—termeléshez való hozzájárulásának maximalizálása céljából kívánatos megszakítani az alsD-gént azon kívül, hogy az alsS-gént fokozott mértékben expresszáltatjuk. Az alsD-gén megszakítása céljából, az als-operon megfelelő, alsDgént szegélyező fragmentumait PCR-el amplifikáljuk, és klónozzuk
74.365/BE a homológiához, megszakítások előállítása céljából. Drogrezisztencia-gént, például cat-gént is klónozunk a szegélyező DNSfragmentumok közé, az alsD-gén helyett, és a linearizált DNS-t pantotenát-termelő törzsbe, például PA824-be transzformáljuk, drogrezisztenciára szelektálunk. Az alsS fokozott mértékű expressziója céljából, az alsS-kódoló szekvenciát (például expresszió céljából géntechnológiailag PCR-el tervezett alsSkódoló szekvenciát) expressziós vektorba klónozunk. Az alsS-et expresszáló vektorokat (vagy alternatív módon, alsS-et plusz ilvC-t expresszáló vektorokat) bevisszük pantotenát-termelő törzsekbe (például a PA824-jelű pantotenát-termelő törzsbe).
A találmány szerinti eljárásokban továbbá, például pantotenát bioszintetikus enzim és/vagy izoleucin-valin bioszintetikus enzim túltermelésén vagy deregulálásán kívül, vagy pantotenát kinázt kódoló génben mutáció létrehozásán kívül, deletálunk vagy mutációt hozunk létre egy enzimben, amely kívánt panto-vegyület konverzióját katalizálja felesleges vagy nem-kívánt, a folyamatsorban később elhelyezkedő termékké.
VII. Izolált nukleinsavmolekulák és gének
A találmány tárgyát képezik egy másik vonatkozásában olyan izolált nukleinsavmolekulák, amelyek Bacillus-fehérjéket (például B. subtilisból származó fehérjéket) kódolnak, például Bacillus—eredetű pantotenát bioszintetikus enzimeket (például B. subtilis pantotenát bioszintetikus enzimeket) vagy Bacillus— eredetű valin-izoleucin bioszintetikus enzimeket (például B. subtilis valin-izoleucin bioszintetikus enzimeket). Szintén a találmány tárgyát képezi coaX- és/vagy coaA-nukleinsavmolekulák
74.365/BE (például coaX- és/vagy coaA-gének), valamint olyan izolált nukleinsavmolekulák, amelyek ilyen coaX- és/vagy coaAnukleinsavmolekulákat vagy géneket tartalmaznak.
A „nukleinsavmolekula kifejezésen a leírásban DNSmolekulákat (például lineáris, cirkuláris, cDNS vagy kromoszómális DNS) és RNS-molekulákat és nukleotidanalógokkal előállított DNS- és RNS-analógokat értünk. A nukleinsavmolekula lehet egyszálú vagy dupla szálú, de előnyösen dupla szálú DNS-t alkalmazunk. Az „izolált nukleinsavmolekula kifejezésen olyan nukleinsavmolekulát értünk, amely szabad olyan szekvenciáktól, amelyek természetes körülmények között szegélyezik a nukleinsavmolekulát (azaz a nukleinsavmolekula 5' - és 3' -végénél elhelyezkedő szekvenciákat) olyan organizmus kromoszómális DNS-ében, amelyből a nukleinsav származik. A találmány különböző előnyös megvalósítási módjai szerint, az izolált nukleinsavmolekula kevesebb, mint körülbelül 10 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, 0,1 kb, 50 bp, 25 bp vagy 10 bp méretű, olyan nukleotidszekvenciát tartalmazhat, amely természetes körülmények között szegélyezi a nukleinsavmolekulát olyan organizmus kromoszómális DNS-ében, amelyből a nukleinsav származik. Továbbá, „izolált nukleinsavmolekula, például cDNS-molekula lényegében mentes lehet más celluláris anyagtól, ha rekombináns technikákkal állítjuk elő, vagy lényegében mentes lehet kémiai prekurzoroktól vagy más kémiai anyagoktól, ha kémiailag szintetizáljuk .
A „gén kifejezés jelentése a leírásban olyan nukleinsavmolekula (például DNS-molekula vagy szegmense) , amely például
74.365/BE fehérjét vagy RNS-t kódoló nukleinsavmolekula, amely egy organizmusban gének között elhelyezkedő DNS által (azaz közbeékelt vagy távtartó DNS által, amely természetes körülmények között szegélyezi a gént és/vagy elválaszt géneket az organizmus kromoszómális DNS-ében) el van különítve egy másik géntől vagy más génektől. Egy gén vezérelheti enzim vagy más fehérjemolekula szintézisét (például tartalmazhat kódoló szekvenciákat, például folyamatosan összefüggő nyitott leolvasási fázist, rövidítve ORF-et, amely fehérjét kódol) vagy ömaga lehet működőképes az organizmusban. Egy gén egy organizmusban elhelyezkedhet klaszter formájában egy operonban a fentebb leírtak szerint, amely operont gének közötti DNS választja el más génektől és/vagy operonoktól. Egy operonban lévő egyedi gének átfedhetnek az egyedi gének között lévő, gének közötti DNS-el. A leírásban az „izolált gén kifejezésen olyan gént értünk, amely lényegében szabad olyan szekvenciáktól, amelyek természetes körülmények között szegélyezik a gént olyan organizmus kromoszómális DNS-ében, amelyből a gén származik (azaz mentes szomszédos, második vagy külön fehérje- vagy RNS-molekulát kódoló szekvenciáktól, szomszédos strukturális szekvenciáktól vagy hasonlóktól), és adott esetben 5' - és 3' -végi szabályzó szekvenciákat tartalmaznak, például promóterszekvenciákat és/vagy terminátor szekvenciákat. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az izolált gén túlnyomórészt egy fehérjét kódoló szekvenciákat tartalmaz (például Bacillusban előforduló fehérjéket kódoló szekvenciákat) . A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, az izolált gén egy fehérjét (például Bacillusban előforduló fe
74.365/BE hérjét) kódoló szekvenciát és 5' - és/vagy 3'-végnél szomszédos szabályzó szekvenciákat tartalmaz, amelyek olyan organizmus kromoszómális DNS—ében találhatók, amelyből a gén származik (például 5' - és/vagy 3' -végnél szomszédos, Bacillusban előforduló, szabályzó szekvenciákat). Az izolált gén előnyösen kevesebb, mint körülbelül 10 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, 0,1 kb, 50 bp, 25 bp vagy 10 bp méretű, olyan nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely természetes körülmények között szegélyezi a gént olyan organizmus kromoszómális DNS-ében, amelyből a gén származik.
A találmány tárgyát képezik egy vonatkozásában izolált panB-nukleinsavszekvenciák vagy gének, izolált panC-nukleinsav-szekvenciák vagy gének, izolált panD-nukleinsavszekvenciák vagy gének, izolált panE-nukleinsavszekvenciák vagy gének, izolált ilvB-, ilvN, ilvBN-nukleinsavszekvenciák vagy gének, izolált alsS-nukleinsavszekvenciák vagy gének, izolált ilvC-nukleinsavszekvenciák vagy gének és/vagy izolált ilvD-nukleinsavszekvenciák vagy gének.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a nukleinsav vagy gén Bacillusból származik (például Bacillusszármazék). A „Bacillusból származik vagy „Bacillus—származék kifejezéseken olyan nukleinsavat vagy gént értünk, amely természetes körülmények között megtalálható Bacillus-nemzetséghez tartozó mikroorganizmusokban. A nukleinsav vagy gén előnyösen az alábbi mikroorganizmusokból származik: Bacillus subtilis, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus firmus, Bacillus pantothenticus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus
74.365/BE
Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, és más, I. csoporthoz tartozó Bacillus-faj, például olyan, amelyet 16S-rRNS-tipus jellemez (Priest, mint fent) . A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a nukleinsav vagy gén Bacillus brevisből vagy Bacillus stearothermophilusból származik. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti nukleinsavmolekulák és/vagy gének az alábbi mikroorganzimusok egyikéből származnak: Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus halodurans, Bacillus subtilis és Bacillus pumilus. A találmány egy különösen előnyös megvalósítái módja szerint, a nukleinsav vagy gén Bacillus subtilisből szármázik (például Bacillus subtilis származék) . A „Bacillus subtilisből származik vagy „Bacillus subtilis—származék kifejezéseken olyan nukleinsavat vagy gént értünk, amely természetes körülmények között megtalálható Bacillus subtilisban. A találmány még egy előnyös megvalósítási módja szerint, a nukleinsav vagy gén Bacillus-gén homológja (például Bacillustól eltérő fajból származik, de szignifikáns homológiát mutat a találmány szerinti Bacillus-génnel, például Bacillusból származó pan-gennel vagy Bacillusból származó ilv— génnel).
A találmány tárgyát képezik baktériumból származó nukleinsavmolekulák vagy gének és/vagy Bacillusból származó nukleinsavmolekulák vagy gének (például B. subtilisből származó nukleinsavmolekulák és gének), például általunk azonosított gének, például Bacillusból vagy B. subtilisből származó coaX74.365/BE gének, coaA gének, pan gének és/vagy ilv-gének. A találmány tárgyát képezik továbbá olyan baktériumból származó nukleinsav— molekulák vagy gének és/vagy Bacillusból származó nukleinsavmolekulák vagy gének (például B. subtilisből származó nukleinsavmolekulák és gének) (például B. subtilis nukleinsavmolekulák vagy gének), amelyek különböznek természetesen előforduló bakteriális és/vagy Bacillus nukleinsavmolekuláktól vagy génektől (például B. subtilis nukleinsavmolekuláktól vagy génektől) , például olyan nukleinsavmolekulák vagy gének, amelyek szubsztituált, inszertált vagy deletált nukleinsavakkal rendelkeznek, de amelyek a találmány szerinti, természetes körülmények között előforduló géntermékekhez lényegében hasonló fehérjéket kódolnak. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, egy izolált nukleinsavmolekula a 23., 25., 27., 29., 31., 33. 86., 35. vagy 37. számú nukleotidszekvenciák közül legalább egyet tartalmaz. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, egy izolált nukleinsavmolekula a 23., 25., 27., 29., 31., 33., 86., 35. vagy 37. számú nukleotidszekvenciák közül legalább kettőt, hármat vagy négyet tartalmaz. A találmány szerinti megoldásban előnyösen alkalmazott, izolált nukleinsavmolekula lehet például a 23., 25. és 27. számú nukleotid-szekvencia, előnyösen összekapcsolva, így a 23., 25. és 27. számú nukleotidszekvenciák által kódolt fehérjék mindegyike termelődik, ha az izolált nukleinsavmolekulát mikroorganizmusban expresszáljuk (például az 59. számú szekvenciát). A találmány szerinti megoldásban előnyösen alkalmazott, másik izolált nukleinsavmolekula lehet például a 31. és 33. számú nukleo
74.365/BE tidszekvencia, előnyösen összekapcsolva, így a 31. és 33. számú nukleotidszekvenciák által kódolt fehérjék mindegyike termelődik, ha az izolált nukleinsavmolekulát mikroorganizmusban expresszáljuk (például az 58. számú szekvencia 1-2246. nukleotidját). A találmány szerinti megoldásban előnyösen alkalmazott, másik izolált nukleinsavmolekula lehet például a 86. számú nukeotidszekvencia. A találmány szerinti megoldásban előnyösen alkalmazott, másik izolált nukleinsavmolekula lehet például a 31., 33. és 35. számú nukleotidszekvencia, előnyösen öszszekapcsolva, így a 31., 33. és 35. számú nukleotidszekvenciák által kódolt fehérjék mindegyike termelődik, ha az izolált nukleinsavmolekulát mikroorganizmusban expresszáljuk (például az 58. számú szekvenciát).
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti, izolált nukleinsavmolekula olyan nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely legalább körülbelül 60-65%, előnyösen legalább körülbelül 70-75%, előnyösebben legalább körülbelül 80-85%, sőt, még előnyösebben legalább körülbelül 90-95% vagy nagyobb mértékű azonosságot mutat a 23., 25., 27., 29., 31., 33., 86., 35. vagy 37. számú nukleotidszekvenciával. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, izolált coaXnukleinsavmolekula vagy gén a 7., 8., 10., 11., 12., 13., 14., 15., 16., 17., 18., 74. vagy 75. számú szekvenciák bármelyikével rendelkező polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, egy izolált nukleinsavmolekula sztringens körülmények között hibridizálódni képes a 23., 25., 27., 29., 31., 33., 86., 35. vagy
74,365/BE
37. számú nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsavmolekulához. Ilyen hibridizációs körülmények szakember által jól ismertek, és leírásuk megtalálható a „Current Protocols in Molecular Biology [ szerk. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc. (1995), 6.3.1.-6.3.6. fejezetek] című könyvben. Előnyös sztringens (például nagymértékben sztringens) hibridizációs körülmények lehetnek, amelyre nem kívánjuk a találmány szerinti megoldást korlátozni, hibridizáció 6X nátrium-klorid/nátrium-citrátban (SSC), körülbelül 45°C-on, azt követően egy vagy több mosás 0,2X SSC-t és 0,1% SDS-t tartalmazó oldatban, körülbelül 50-65°C-on. Előnyösen a találmány szerinti, izolált nukleinsavmolekula, amely sztringens körülmények között hibridizálódni képes a 23., 25., 27., 29., 31., 33., 86., 35. vagy 37. számú nukleotidszekvenciához, megfelel természetesen előforduló nukleinsavmolekulának. A leírásban „természetesen előforduló nukleinsavmolekulán olyan RNS- vagy DNS-molekulát értünk, amely természetesen előforduló nukleotidszekvenciával rendelkezik.
A találmány szerinti nukleinsavmolekulát (például a 23., 25., 27., 29., 31., 33., 86., 35. vagy 37. számú nukleotid-szekvenciával rendelkező nukleinsavmolekulát) standard molekuláris biológiai technikák alkalmazásával lehet izolálni, és a szekven— ciainformációkat a leírásban ismertetjük. A nukleinsavmoleku— Iákat például standard hibridizációs és klónozó technikák alkalmazásával lehet izolálni [leírásukat lásd Sambrook, J., Fritsh, E. F. és Maniatis, T., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)] , vagy polimeráz
74.365/BE láncreakcióval lehet azokat izolálni, olyan szintetikus oligonukleotid-primerek alkalmazásával, amelyek a 23., 25., 27., 29., 31., 33., 86., 35. vagy 37. számú nukleotidszekvenciákra alapozva vannak tervezve. A találmány szerinti nukleinsavat templátként cDNS, mRNS vagy más módszer szerint genomi DNS, és megfelelő oligonukleotid-primerek alkalmazásával lehet amplifikálni standard PCR-amplifikációs technikák szerint. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti, izolált nukleinsavmolekula olyan nukleinsavmolekula lehet, amely komplementer a a 23., 25., 27., 29., 31., 33., 86., 35. vagy 37. számú nukleotidszekvenciával.
További panC-nukleinsavszekvenciák lehetnek olyanok, amelyek 25. számú nukleotidszekvenciát tartalmaznak, 26. számú aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptid homológját kódolják (például a 26. számú aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptiddel legalább 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% vagy nagyobb mértékű azonossággal rendelkező polipeptidet kódolnak, és lényegében azonos aktivitással rendelkeznek, mint az említett polipeptid), sztringens körülmények között képesek hibridizálódni 25. számú nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsavmolekula egészéhez vagy részéhez, vagy 26. számú aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptidet kódoló nukleinsavmolekula egészéhez vagy részletéhez, vagy amelyek komplementerek a fentebb leírt panC-nukleotidszekvenciával.
További panD-nukleinsavszekvenciák lehetnek olyanok, amelyek 27. számú nukleotidszekvenciát tartalmaznak, 28. számú aminosavszekvenciával rendelkező polipeptid homológját kódolják (például
74,365/BE a 28. számú aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptiddel legalább 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% vagy nagyobb mértékű azonossággal rendelkező polipeptidet kódolnak, és lényegében azonos aktivitással rendelkeznek, mint az említett polipeptid), sztringens körülmények között képesek hibridizálódni 27. számú nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsavmolekula egészéhez vagy részéhez, vagy 28. számú aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptidet kódoló nukleinsavmolekula egészéhez vagy részletéhez, vagy amelyek komplementerek a fentebb leírt panD-nukleotid-szekvenciával.
További panE-nukleinsavszekvenciák lehetnek olyanok, amelyek 29. számú nukleotidszekvenciát tartalmaznak, 30. számú aminosavszekvenciával rendelkező polipeptid homológját kódolják (például a 30. számú aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptiddel legalább 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% vagy nagyobb mértékű azonossággal rendelkező polipeptidet kódolnak, és lényegében azonos aktivitással rendelkeznek, mint az említett polipeptid), sztringens körülmények között képesek hibridizálódni 29. számú nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsavmolekula egészéhez vagy részéhez, vagy 30. számú aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptidet kódoló nukleinsavmolekula egészéhez vagy részletéhez, vagy amelyek komplementerek a fentebb leírt panE-nukleotid-szekvenciával.
További ilvB-nukleinsavszekvenciák lehetnek olyanok, amelyek 31. számú nukleotidszekvenciát tartalmaznak, 32. számú aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptid homológját kódolják (például a 32. számú aminosav—szekvenciaval rendelkező polipeptiddel
74.365/BE legalább 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% vagy nagyobb mértékű azonossággal rendelkező polipeptidet kódolnak, és lényegében azonos aktivitással rendelkeznek, mint az említett polipeptid) , sztringens körülmények között képesek hibridizálódni 31. számú nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsavmolekula egészéhez vagy részéhez, vagy 32. számú aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptidet kódoló nukleinsavmolekula egészéhez vagy részletéhez, vagy amelyek komplementerek a fentebb leírt ilvB-nukleotid-szekvenciával.
További ilvN-nukleinsavszekvenciák lehetnek olyanok, amelyek 33. számú nukleotidszekvenciát tartalmaznak, 34. számú aminosav— -szekvenciával rendelkező polipeptid homológját kódolják (például a 34. számú aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptiddel legalább 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% vagy nagyobb mértékű azonossággal rendelkező polipeptidet kódolnak, és lényegében azonos aktivitással rendelkeznek, mint az említett polipeptid), sztringens körülmények között képesek hibridizálódni 33. számú nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsavmolekula egészéhez vagy részéhez, vagy 34. számú aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptidet kódoló nukleinsavmolekula egészéhez vagy részletéhez, vagy amelyek komplementerek a fentebb leírt ilvN-nukleotidszekvenciával.
További ilvC-nukleinsavszekvenciák lehetnek olyanok, amelyek 35. számú nukleotidszekvenciát tartalmaznak, 36. számú aminosavszekvenciával rendelkező polipeptid homológját kódolják (például a 36. számú aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptiddel legalább 30-ó, 40s, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% vagy nagyobb mérté
74,365/BE kű azonossággal rendelkező polipeptidet kódolnak, és lényegében azonos aktivitással rendelkeznek, mint az említett polipeptid), sztringens körülmények között képesek hibridizálódni 35. számú nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsavmolekula egészéhez vagy részéhez, vagy 36. számú aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptidet kódoló nukleinsavmolekula egészéhez vagy részletéhez, vagy amelyek komplementerek a fentebb leírt ilvCnukleotidszekvenciával.
További ilvD-nukleinsavszekvenciák lehetnek olyanok, amelyek 37. számú nukleotidszekvenciát tartalmaznak, 38. számú aminosavszekvenciával rendelkező polipeptid homológját kódolják (például a 38. számú aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptiddel legalább 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% vagy nagyobb mértékű azonossággal rendelkező polipeptidet kódolnak, és lényegében azonos aktivitással rendelkeznek, mint az említett polipeptid), sztringens körülmények között képesek hibridizálódni 37. számú nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsavmolekula egészéhez vagy részéhez, vagy 38. számú aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptidet kódoló nukleinsavmolekula egészéhez vagy részletéhez, vagy amelyek komplementerek a fentebb leírt ilvDnukleotidszekvenciával.
További alsS-nukleinsavszekvenciák lehetnek olyanok, amelyek 86. számú nukleotidszekvenciát tartalmaznak, 87. számú aminosavszekvenciával rendelkező polipeptid homológját kódolják (például a 87. számú aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptiddel legalább 30-6, 40-6, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% vagy nagyobb mértékű azonossággal rendelkező polipeptidet kódolnak, és lényegében
74.365/BE azonos aktivitással rendelkeznek, mint az említett polipeptid), sztringens körülmények között képesek hibridizálódni 86. számú nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsavmolekula egészéhez vagy részéhez, vagy 87. számú aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptidet kódoló nukleinsavmolekula egészéhez vagy részletéhez, vagy amelyek komplementerek a fentebb leírt alsSnukleotidszekvenciával.
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, egy izolált nukleinsavmolekula megfelel vagy tartalmazza a coaXgént vagy részletét vagy fragmentumát. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, izolált coaX-nukleinsavmolekula vagy gén 19. számú nukleotidszekvenciát tartalmaz (például B. subtilisből származó coaX-nukleotidszekvenciát tartalmaz). A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, egy izolált coaX-nukleinsavmolekula vagy gén 9. számú aminosav-szekvenciát kódoló nukleotidszekvenciát (például amely B. subtilisből származó CoaX-aminosav-szekvenciát kódol) tartalmaz. A találmány még egy előnyös megvalósítási módja szerint, egy izolált coaX-nukleinsavmolekula vagy gén a 9. számú aminosav-szekvenciával rendelkező CoaX-fehérje homológját kódolja. A leírásban a „homológ kifejezésen olyan fehérjét vagy polipeptidet értünk, amely legalább körülbelül 30-35%, előnyösen legalább körülbelül 35-40%, előnyösebben legalább körülbelül 40-50%, sőt, még előnyösebben legalább körülbelül 60%, 70%, 80%, 90% vagy nagyobb mértékű azonosságot mutat egy leírás szerinti vad típusú fehérje vagy polipeptid aminosav—szekvenciajával, vagy lényegében ekvivalens funkcionális vagy biológiai aktivitást mutat, mint a vad
74.365/BE típusú fehérje vagy polipeptid. Például egy CoaX-homológ legalább körülbelül 30-35%, előnyösen legalább körülbelül 35-40%, előnyösebben legalább körülbelül 40-50%, sőt, még előnyösebben legalább körülbelül 60%, 70%, 80%, 90% vagy nagyobb mértékű azonosságot mutat a 9. számú aminosav-szekvenciával rendelkező fehérjével, vagy lényegében ekvivalens funkcionális vagy biológiai aktivitást mutat (azaz funkcionálisan ekvivalens) a 9. számú aminosav-szekvenciával rendelkező fehérjével (például pantotenát kináz aktivitással lényegében ekvivalens aktivitást mutat). A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, izolált coaX-nukleinsavmolekula vagy gén a 7., 8., 10., 11., 12., 13., 14., 15., 16., 17., 18., 74. vagy 75. számú szekvenciák bármelyikével rendelkező polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, egy izolált coaX-nukleinsavmolekula hibridizálódni képes a 19. számú nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsavmolekula egészéhez vagy részéhez, vagy hibridizálódni képes a 7-18., 74. vagy 75. számú aminosav-szekvenciák bármelyikével rendelkező polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsavmolekula egészéhez vagy részéhez. Ilyen hibridizációs körülmények szakember által jól ismertek, és leírásuk megtalálható a „Current Protocols in Molecular Biology [ szerk. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc. (1995), 2., 4., és 6. fejezetek] című könyvben. Sztringens körülmények további leírását megtalálhatjuk Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), 7., 9. és 11. fejezetek] című könyvben. Előnyös sztringens hibridizációs
74.365/BE körülmények lehetnek, amelyre nem kívánjuk a találmány szerinti megoldást korlátozni, hibridizáció 4X nátrium-klorid/nátriumcitrátban (SSC), körülbelül 65-70°C-on (vagy hibridizáció 4X SSC-t plusz 50% formamidot tartalmazó oldatban, körülbelül 4250°C-on), azt követően egy vagy több mosás IX SSC-ben, körülbelül 65-70°C-on. Előnyösen nagymértékben sztringens hibridizációs körülményeken értünk (amelyre nem kívánjuk a találmány szerinti megoldást korlátozni) hibridizációt IX SSC-ben, körülbelül 6570°C-on (vagy hibridizációt IX SSC-t plusz 50% formamidot tartalmazó oldatban, körülbelül 42-50°C-on), azt követően egy vagy több mosást 0, 3X SSC-ben, körülbelül 65-70°C-on. Előnyösen csökkentett mértékben sztringens hibridizációs körülményeken értünk (amelyre nem kívánjuk a találmány szerinti megoldást korlátozni) hibridizációt 4X SSC-ben, körülbelül 50-60°C-on (vagy ezzel alternatív módon hibridizációt 6X SSC-t plusz 50% formamidot tartalmazó oldatban, körülbelül 40-45°C-on), azt követően egy vagy több mosást 2X SSC-ben, körülbelül 50-60°C-on. Szintén a találmány tárgyát képezik a fentebb leírt értékek között átmenetet képező tartományok, például 65-70°C-on vagy 42-50°C-on végzett hibridizáció. SSC-t (IX SSC: 0,15 M NaCl és 15 mM nátriumcitrát) SSPE-vel (IX SSPE: 0,15 M NaCl, 10 mM NaH2PO4 és 1,25 mM EDTA, pH 7,4) lehet helyettesíteni a hibridizációs és mosó pufferekben; a mosásokat 15 percig végezzük, miután a hibridizáció teljesen végbement. Hibridekre vonatkozó hibridizációs hőmérsékletet előre lehet jelezni, 50 bázispárnál rövidebb hibridek esetén 5-10°C-al alacsonyabbnak kell lennie, mint a hibrid olvadáspontja (TJ , ahol Tm-et az alábbi egyenleteknek megfelelően lehet
74.365/BE meghatározni. 18 bázispárnál rövidebb hibridek esetén Tra(°C) = 2(# A+T bázisok) + 4 (# G+C bázisok) . 18 és 49 bázispár hosszúság közötti hibridekre Tra(°C) = 81,5 + 16,6 (log10[ Na+] ) + 0,41 (%G+C) - (600/N), ahol N jelentése a hibridben lévő bázisok száma, és [ Na+] jelentése a hibridizációs pufferben lévő nátriumionok koncentrációja ([ Na+] IX SSC = 0,165 M) . Gyakorlott szakember számára nyilvánvaló, hogy további reagenseket lehet hozzáadni a hibridizációs és/vagy mosó pufferekhez, nukleinsavmolekulák membránokhoz, például nitro—cellulóz vagy nylon—membránokhoz való, nem-specifikus hibridizációjának csökkentésére, például blokkoló ágenseket (például BSA-t vagy lazac- vagy heringspermából hordozó DNS-t), detergenseket (például SDS-t) , komplexképző ágenseket (például EDTA-t), Ficollt, PVP-t és hasonlókat. Ha nylon membránokat alkalmazunk, további, előnyösen alkalmazott hibridizációs körülmények között 0,25-0,5 M NaH2PO4-t és 7% SDS-t tartalmazó oldatban hibridizálunk 65°C-on, azt követően egy vagy több mosást végzünk 0,02 M NaH2PO4-t és 1% SDS-t tartalmazó oldatban 65°C-on, lásd például Church és Gilbert által leírtakat [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1991-1995 (1984)] (vagy ezzel alternatív módon 0,2X SSC, 1% SDS) . A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, egy izolált nukleinsavmolekula olyan nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely komplementer a leírás szerinti coaA-nukleotidszekvenciával (például teljesen komplementer a 19. számú nukleotidszekvenciával).
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, egy izolált nukleinsavmolekula megfelel vagy tartalmazza a coaAgént, például Bacillusból (például B. subtilisből) származó
74,365/BE coaA-gént, vagy részletét vagy fragmentumát. Az izolált coaXnukleinsavmolekula vagy gén lehet például (1) 20-22. számú nukleotidszekvencia bármelyikét tartalmazó, izolált coaA-nukleinsavmolekula vagy gén; (2) 3. számú aminosav-szekvenciát kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó, izolált coaA-nukleinsavmolekula vagy gén; (3) CoaA-homológot (például olyan aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptidet, amely legalább körülbelül 30-35%, előnyösen legalább körülbelül 35-40%, előnyösebben legalább körülbelül 40-50%, sőt, még előnyösebben legalább körülbelül 60%, 70%, 80%, 90% vagy nagyobb mértékű azonosságot mutat a 3. számú aminosav-szekvenciával, és lényegében azzal ekvivalens enzimaktivitással rendelkezik) kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó, izolált coaA-nukleinsavmolekula vagy gén; (4) 1., 2., 4., 5. vagy 6. számú szekvencia bármelyikével rendelkező polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó, izolált coaA-nukleinsavmolekula vagy gén; (5) olyan izolált nukleinsavmolekula vagy gén, amely sztringens körülmények között hibridizálódni képes a 20., 21. vagy 22. nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsavmolekula egészéhez vagy részéhez, vagy amely hibridizálódni képes a 3. aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsav-szekvencia egészéhez vagy részéhez; és (6) a fentebb leírt coaA-nukleotidszekvenciával komplementer nukleotidszekvenciát (például amely a 20., 21. vagy 22. nukleotidszekvenciával teljesen komplementer) tartalmazó, izolált nukleinsavmolekula vagy gén.
A találmány szerinti nukleinsavmolekulát (például coaX
74.365/BE
-nukleinsavmolekulát vagy gént vagy coaA-nukleinsavmolekulát vagy gént) standard molekuláris biológiai technikák alkalmazásával lehet izolálni, és a szekvenciainformációkat a leírásban ismertetjük. A nukleinsavmolekulákat például standard hibridizációs és klónozó technikák alkalmazásával lehet izolálni [leírásukat lásd Sambrook, J., Fritsh, E. F. és Maniatis, T., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)] , vagy polimeráz láncreakcióval lehet azokat izolálni, olyan szintetikus oligonukleotid-primerek alkalmazásával, amelyek a leírásban bemutatott coaX- vagy coaAnukleotidszekvenciákra vagy azokat szegélyező szekvenciákra alapozva vannak tervezve. A találmány szerinti nukleinsavat (például coaX-nukleinsavmolekulát vagy gént vagy coaA-nukleinsavmolekulát vagy gént) templátként cDNS, mRNS vagy más módszer szerint kromoszómális DNS, és megfelelő oligonukleotid-primerek alkalmazásával lehet amplifikálni standard PCR-amplifikációs technikák szerint.
A találmány még egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi mutáns coaX- és coaA-nukleinsavmolekulák vagy gének. A „mutáns nukleinsavmolekula vagy „mutáns gén kifejezésen a leírásban olyan nukleinsavat vagy gént értünk, amely legalább egy változtatást (például szubsztitúciót, inszerciót, deléciót) tartalmaz nukleotidszekvenciában, így a mutáns által kódolt polipeptid vagy fehérje olyan aktivitással rendelkezik, amely különbözik a vad típusú nukleinsavmolekula vagy gén által kódolt polipeptidtől vagy géntől. A mutáns
74.365/BE nukleinsavmolekula vagy mutáns gén (például mutáns coaA- vagy coaX-gén) előnyösen olyan polipeptidet vagy fehérjét kódol, amely csökkent aktivitással (például csökkent pantotenát kinázaktivitással) rendelkezik vad típusú nukleinsavmolekula vagy gén által kódolt polipeptidhez vagy fehérjéhez viszonyítva, például, ha hasonló körülmények között vizsgáljuk (például ugyanazon a hőmérsékleten tenyésztett mikroorganizmusokban vizsgáljuk). Az is előfordulhat, hogy a mutáns gén nem kódol polipeptidet vagy csökkent mértékben termel vad típusú polipeptidet.
A leírásban a „csökkent aktivitás vagy „csökkent enzimaktivitás kifejezésen azt értjük, hogy az aktivitás legalább 5%-al kisebb, mint a vad típusú nukleinsavmolekula vagy gén által kódolt polipeptid vagy fehérje aktivitása, előnyösen legalább 510%-al kisebb, előnyösebben legalább 10-25%-al kisebb, sőt még előnyösebben legalább 25-50%-al, 50-75%-al vagy 75-100%-al kisebb, mint a vad típusú nukleinsavmolekula vagy gén által kódolt polipeptid vagy fehérje aktivitása. Szintén a találmány tárgyát képezik a fentebb leírt értékek között átmenetet képező tartományok, például 75-85%, 85-90%, 90-95%. A leírásban a „csökkent aktivitás vagy „csökkent enzimaktivitás kifejezésen olyan aktivitást is értünk, amely deletálva van vagy „nincs kifejeződve („knocked out) (például körülbelül 100%-al kisebb aktivitás, mint a vad típusú nukleinsavmolekula vagy gén által kódolt polipeptid vagy fehérje aktivitása). Az aktivitást meghatározhatjuk bármilyen, az adott, kérdéses fehérje aktivitásának mérésére szolgáló, jól elfogadott vizsgálati eljárás szerint. Az aktivitást mérhetjük vagy vizsgálhatjuk közvetlenül, például mér
74.365/BE hetjük sejtből izolált vagy tisztított fehérje aktivitását. Más módszer szerint, az aktivitást mérhetjük sejtben vagy extracelluláris közegben. Például mutáns coaA-gént vagy mutáns coaX-gént (azaz csökkent pantotenát kináz aktivitást kódoló mutánst) vizsgálhatunk úgy, hogy expresszáljuk a mutáns gént egy mikroorganizmusban, például mutáns mikroorganizmusban, amely pantotenát kinázt hőmérséklet-szenzitív módon képes expresszálni, vizsgáljuk a mutáns gént arra vonatkozóan, hogy milyen mértékben képes komplementéin! hőmérséklet-szenzitív (Ts) mutánst pantotenát kináz aktivitásra. „Csökkent pantotenát kináz aktivitást kódoló, mutáns coaX-gén vagy mutáns coaA-gén kevésbé hatékonyan komplementálja a Ts-mutánst, mint például a megfelelő vad típusú coaX-gén vagy coaA-gén.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy egy nukleinsav- vagy génszekvenciában akár egyetlen szubsztitúció (például a megfelelő aminosav-szekvenciában aminosav—cserét kódoló bázis-szubsztitúció) is drámaian képes befolyásolni a kódolt polipeptid vagy fehérje aktivitását, a megfelelő vad típusú polipeptidhez vagy fehérjéhez viszonyítva. A leírás szerinti mutáns (például mutáns polipeptidet vagy fehérjét kódoló) nukleinsav vagy gén könnyen megkülönböztethető a fentebb leírt fehérjehomológot kódoló nukleinsavtól vagy géntől az alapján, hogy a mutáns nukleinsav vagy mutáns gén által kódolt fehérje vagy polipeptid megváltozott aktivitással rendelkezik, amely adott esetben különböző vagy megkülönböztethető fenotípusként figyelhető meg a mutáns gént vagy nukleinsavat expresszáló vagy a mutáns fehérjét vagy polipepti— det termelő mikroorganizmusban (azaz mutáns mikroorganizmusban),
74.365/BE a vad típusú gént vagy nukleinsavat expresszáíó vagy mutáns fehérjét vagy polipeptidet termelő, megfelelő mikroorganizmushoz viszonyítva. Ezzel ellentétben, egy fehérjehomológ azonos vagy lényegében hasonló aktivitással rendelkezik, adott esetben fenotipikusan megkülönböztethetetlen, ha mikroorganizmusban termeltetjük, a vad típusú gént vagy nukleinsavat expresszáíó, megfelelő mikroorganizmushoz viszonyítva. Ennek megfelelően, nem például nukleinsavmolekulák, gének, fehérjék vagy polipeptidek közötti szekvenciaazonosság foka szolgál homológok és mutánsok közötti megkülönböztetésre, hanem a kódolt fehérje vagy polipeptid aktivitása különbözteti meg a homológokat és mutánsokat: például kismértékű (például 30-50% szekvenciaazonosság) szekvenciaazonossággal rendelkező homológok még mutathatnak lényegében ekvivalens funkcionális aktivitásokat, és például 99% szekvenciaazonossággal rendelkező mutánsok még mutathatnak drámai módn különböző vagy megváltozott funkcionális aktivitásokat. Homológokat bemutatunk például a 20. ábrán (azaz CoA-homológokat) és a 23. ábrán (azaz CoaX-homológokat). Mutánsokra leírunk példákat a 15. és 18. példában.
Vili. Rekombináns nukleinsavmolekulák és vektorok
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan rekombináns nukleinsavmolekulák (például rekombináns DNS-molekulák), amelyek leírás szerinti (például izolált nukleinsavmolekulák és/vagy gének) nukleinsavmolekulákat és/vagy géneket, előnyösen Bacillus-géneket, előnyösebben Bacillus subtilisből származó géneket, sőt, még előnyösebben Bacillus subtilisből származó, pantotenát kináz-géneket (például coaX—géneket vagy coaA-géneket) , panto
74.365/BE f
tenát bioszintetikus géneket (például pantotenát bioszintetikus enzimeket kódoló géneket, például ketopantoát hidroxi-meti1-transzferázt kódoló panB-géneket, ketopantoát reduktázt kódoló panE-géneket, pantotenát szintetázt kódoló panC-géneket és/vagy aszpartát-a-dekarboxiláz panD-géneket) és/vagy izoleucin-valin (ilv) bioszintetikus géneket (például aceto-hidroxisav szintetázt kódoló ilvBN- vagy alsS-géneket, aceto-hidroxisav izomeroreduktázt kódoló ilvC-géneket és/vagy dihidroxisav dehidratázt kódoló ilvD-géneket) tartalmaznak.
A találmány tárgyát képezik továbbá vektorok (például rekombináns vektorok) , amelyek a találmány szerinti nukleinsavmolekulákat (például izolált vagy rekombináns nukleinsavmolekulákat és/vagy géneket) tartalmazzák. A rekombináns vektorokat különösen az jellemzi, hogy olyan nukleinsavszekvenciákat tartalmaznak, amelyek a leírás szerinti bakteriális géntermékeket tartalmazzák, előnyösen Bacillus-géntermékeket, előnyösebben Bacillus subtilis géntermékeket, sőt, még előnyösebben Bacillus subtilisből származó pantotenát bioszintetikus géntermékeket (például pantotenát bioszintetikus enzimeket, például keto-pantoát hidroxi-metil-transzferázt, ketopantoát reduktázt, pantotenát szintetázt és/vagy aszpartát α-dekarboxilázt) és/vagy izoleucin-valin bioszinteikus géntermékeket (például aceto-hídroxisav szintetázt, aceto-hidroxisav izomeroreduktázt és/vagy dihidroxisav-dehidratázt).
A „rekombináns nukleinsavmolekula kifejezésen a leírásban olyan nukleinsavmolekulát (például DNS-molekulát) értünk, amely meg van változtatva, módosítva vagy géntechnológiailag módosítva
74.365/BE van, így nukleotidszekvenciában különbözik attól a natív vagy természetes nukleisavmolekulától, amelyből a rekombináns nukleinsavmolekula származik (például egy vagy több nukleotid addíciójával, deléciójával vagy szubsztitúciójával) . Egy rekombináns nukleinsavmolekula (például rekombináns DNS-molekula) előnyösen a találmány szerinti izolált nukleinsavmolekulát vagy gént tartalmazza (például izolált coaX-, coaA-, pan- vagy ílv-gént) működőképesen kapcsolva szabályzó szekvenciákhoz.
A „rekombináns vektor kifejezésen a leírásban olyan vektort (például plazmidot, fágot, fazmidot, vírust, kozmidot vagy más, tisztított nukleinsav-vektort) értünk, amely meg van változtatva, módosítva vagy géntechnológiailag módosítva van, így több, kevesebb vagy különböző nukleinsavszekvenciát tartalmaz, mint az, amely a natív vagy természetes nukleisavmolekulában előfordul, amelyből a rekombináns vektor származik. Egy rekombináns vektor előnyösen a találmány szerinti coaX-, coaA-, pan- vagy ilv-gént vagy ilyen coaX-, coaA-, pan- vagy ilv-gént tartalmazó, rekombináns nukleinsavmolekulát tartalmaz, működőképesen kapcsolva szabályzó szekvenciákhoz, például promóterszekvenciákhoz, terminátorszekvenciákhoz és/vagy mesterséges riboszóma-kötőhelyekhez (RBS), a leírásban definiáltak szerint.
A „működőképesen kapcsolva szabályzó szekvenciá (k)hoz kifejezés azt jelenti, hogy a kérdéses nukleinsavmolekula vagy gén nukleotidszekvenciája úgy vagy szabályzó szekvenciákhoz kapcsolva, amely lehetővé teszi a nukleotidszekvencia (például fokozott, megnövelt mértékű, konstitutív, alap, gyengített, csökkentett mértékű vagy represszált) expresszióját, előnyösen a
74.365/BE nukleotidszekvencia által kódolt géntermék expresszióját (például ha a rekombináns nukleinsavmolekulát rekombináns vektor tartalmazza a leírás szerint definálva, és bevittük egy mikroorganizmusba) .
A „szabályzó szekvencia kifejezés jelentése a leírásban olyan nukleinsavszekvencia, amely hatással van (például modulálja vagy szabályozza) más nukleinsavszekvenciák expresszióját. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, szabályzó szekvenciát egy rekombináns nukleinsavmolekula vagy rekombináns vektor hasonló vagy azonos helyzetben és/vagy orientációban tartalmaz, a kérdéses, konkrét génhez viszonyítva abban a helyzetben és/vagy orientációban, ahogyan az természetes körülmények között megfigyelhető, például natív helyzetben és/vagy orientációban. A kérdéses gént például tartalmazhatja rekombináns nukleinsavmolekula vagy rekombináns vektor működőképesen kapcsolva olyan szabályzó szekvenciához, amely a kérdéses gént kíséri vagy szomszédos vele a természetes organizmusban (például működőképesen van kapcsolva „natív szabályzó szekvenciákhoz, vagy például „natív promóterhez) . Ezzel alternatív módon, a kérdéses gént például tartalmazhatja rekombináns nukleinsavmolekula vagy rekombináns vektor működőképesen kapcsolva olyan szabályzó szekvenciához, amely egy másik (például különböző) gént kísér vagy szomszédos vele a természetes organizmusban. Ezzel alternatív módon, a kérdéses gént például tartalmazhatja rekombináns nukleinsavmolekula vagy rekombináns vektor működőképesen kapcsolva másik organizmusból származó, szabályzó szekvenciához. Más mikroorganizmusokból (például más bakteriális sza
74.365/BE bályzó szekvenciák, bakteriofág szabályzó szekvenciák és hasonlók) származó szabályzó szekvenciák működőképesen lehetnek kapcsolva a kérdéses konkrét génhez.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a szabályzó szekvencia lehet nem-natív vagy természetesen elő nem forduló szekvencia (például olyan szekvencia, amely módosítva, mutálva, szubsztituálva, származékká alakítva, deletálva van, beleértve a kémiailag szintetizált szekvenciákat is). Előnyösen a.1 kalma zhat ó szabályzó szekvenciák közé tartoznak promóterek, enhanszerek, terminációs szignálok, anti-terminációs szignálok és más expressziós szabályzó elemek (például olyan szekvenciák, amelyekhez represszorok vagy indukálószerek képesek kötődni, és/vagy transzkripciós és/vagy transzlációs szabályzó fehérjék kötőhelyei, például az átírt mRNS-ben). Ilyen szabályzó szekvenciákat leírt például Sambrook, J., Fritsh, E. F. és Maniatis, T., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual című könyvben, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) . Szabályzó szekvenciák lehetnek olyanok, amelyek nukleotidszekvencia konstitutív expresszióját vezérlik mikroorganizmusban (például konstitutív promóterek és erős konstitutív promóterek) , olyanok, amelyek nukleotid-szekvencia indukálható expresszióját vezérlik mikroorganizmusokban (például indukálható promóterek, például xilóz indukálható promóterek) és olyanok, amelyek nukleotidszekvencia expresszióját gyengítik vagy represszálják mikroorganizmusban (például gyengítő szignálok vagy represszorszekvenciák). A találmány által igényelt oltalmi körbe tartozik kérdéses gén expressziójának
74,365/BE
szabályzása szabályzó szekvenciák eltávolításával vagy deletálásával. Például transzkripció negatív szabályzásában szerepet játszó szekvenciákat el lehet távolítani, így kérdéses gén expressziója fokozódik.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti rekombináns nukleinsavmolekula vagy rekombináns vektor lehet legalább egy bakteriális génterméket kódoló nukleinsavszekvencia vagy gén (például pantotenát bioszintetikus enzimet, izoleucin-valin bioszintetikus enzimet, vagy CoA bioszintetikus enzimet, például CoA vagy CoX), működőképesen kapcsolva promóterhez vagy promóterszekvenciához. A találmány szerinti megoldásban előnyösen alkalmazható promóterek lehetnek például Bacillusból származó promóterek és/vagy bakteriofág promóterek (például Bacillust fertőző bakteriofágok). A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, promóterként Bacillusból származó promótert alkalmazunk, előnyösen Bacillusból származó, erős promótert alkalmazunk, (például Bacillusban biokémiai „háztartást vezető génnel asszociált promótert vagy Bacillusban glikolitikus folyamatsor génjével asszociált promótert). A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, promóterként bakteriofág promótert alkalmazunk. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a promoter bakteriofág SPOl-ből származik. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint, a promótert az alábbiak közül választjuk ki: P15, P26 vagy Pveg, például a 39., 40. vagy 41. számú szekvenciaként bemutatott promóterek. További előnyösan alkalmazható promoter lehet tef (a transzlációs
74.365/BE elongációs faktor, azaz TEF promótere) és pyc (piruvát dekarboxiláz, azaz PYC promótere), amely nagymértékű expressziót vezérel Bacillusban (például Bacillus subtilisben). Gram-pozitív mikroorganizmusokban való alkalmazásra, további előnyös promoter lehet például az amyE-promoter és a fág SP02-promóterek. Gramnegativ mikroorganizmusokban való alkalmazásra, további előnyös promóterek lehetnek például az alábbi promóterek: tac, trp, tét, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, árny, SPO2, λ-Ρκ vagy λ-Ρη.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerini, rekombináns nukleinsavmolekula vagy rekombináns vektor terminátorszekvenciákat (például transzkripciós terminátorszekvenciákat) tartalmaz. A „terminátorszekvencia kifejezésen értünk szabályzó szekvenciákat, amelyek egy gén transzkripciójának terminálására szolgálnak. Terminátorszekvenciák (vagy tandem transzkripciós terminátorok) szolgálhatnak továbbá mRNS stabilizálására (például egy struktúra mRNS-hez való hozzáadásával), például nukleázokkal szemben.
A találmány még egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti, rekombináns nukleinsavmolekula vagy rekombináns vektor tartalmazhat olyan szekvenciákat, amelyek lehetővé teszik az ilyen szekvenciákat (azaz detektálható és/vagy szelektálható markereket) tartalmazó vektor detektálását, például olyan szekvenciákat, amelyek felülkerekednek auxotróf mutációkon, például ura3- vagy ilvE-jelű fluoreszcens markereket és/vagy kolorimetriás markereket (például lacZ/p-galaktozidázt) és/vagy antibiotikum-rezisztencia-géneket (például amp- vagy
74.365/BE tet-gént).
A találmány még egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti rekombináns nukleinsavmolekula vagy rekombináns vektor mesterséges riboszóma-kötőhelyet (RBS-t) tartalmaz. A „mesterséges riboszóma-kötőhely (RBS) kifejezésen olyan helyet értünk egy mRNS-molekulában (például DNS-ben kódolva), amelyhez riboszóma képes kötődni (például transzláció iniciálására) , amely legalább egy nukleotiddal különbözik a natív RBStől (például egy természetesen előforduló génben található RBStől) . Előnyös mesterséges RBS-ek 5-6, 7-8, 9-10, 11-12, 13-14, 15-16, 17-18, 19-20, 21-22, 23—24, 25-26, 27-28, 29-30 vagy több nukleotid tartalmaznak, amelyek közül 1-2, 3-4, 5-6, 7-8, 9-10, 11 12, 13—15 vagy több különbözik a natív RBS—tői (például a kérdéses génben előforduló natív RBS-től). Előnyösen azokat a nukleotidokat, amelyek különböznek, szubsztituálva vannak, így egy ideális RBS (például a 44., 45., 46., 47. vagy 48. számú szekvenciával) egy vagy több nukleotidjával azonosak, ha optimálisan egymás alá rendezzük azokat összehasonlítás céljából. Mesterséges RBS-ket lehet alkalmazni egy adott génnel asszociált, természetesen előforduló vagy natív RBS helyettesítésére. Előnyös mesterséges RBS-eket (például panB, például B. subtilisből származó panB transzlációjának fokozására szolgáló RBS-ket) bemutatunk az l.A táblázatban (például 49. és 50. számú szekvenciaként) .
74.365/BE
1A. táblázat: Előnyös panB-riboszóma-kötőhelyek
20
-------------AGAAAGGAGGTGA
CCCTCT-AG-AAGGAGGAGAAAACATG CCCTCT-AG--AGGAGGAGAAAACATG TAAACAT-G-AGGAGGAGAAAACATG ideális RBS (44. sz. szekvencia)
RBS1 (49. sz. szekvencia)
RBS2 (50. sz. szekvencia) panB natív RBS (42. sz. szekvencia)
További előnyös mesterséges RBS-ek (például panD, például B. subtilisből származó panD transzlációjának fokozására szolgáló RBS-ket) bemutatunk az l.B táblázatban (például 51., 52., 53. és 54. számú szekvenciaként).
1B. táblázat: Előnyös panD-riboszóma-kötőhelyek
20
CTAGAAAAGGAGGAATTTAAATG
TTAAGAAAGGAGGTGANNNNATG
TTAGAAAGGAGGA7TTAAATATG
TTAGAAAGGAGGT7TTAAATATG
TTAGAAAGGAGGTGATTTAAATG
TTAGAAAGGAGGTGTTTAAAATG
TTAGAAAGGAGGTGANNNNNATG pAN423 RBS (88. sz. szekvencia) ideális RBS (45. sz. szekvencia) új A-tervezés (51. sz. szekvencia) új B-tervezés (52. sz. szekvencia) új C1-tervezés (53. sz. szekvencia) új C2-tervezés (54. sz. szekvencia) ideális RBS (46. sz. szekvencia)
További előnyös mesterséges RBS-ek (például panD, például B. subtilisből származó panD transzlációjának fokozására szolgáló RBS-ket) bemutatunk az l.C táblázatban (például 55., 56. és 57. számú szekvenciaként). Bemutatjuk a levezetett aminosav szekvenciákat a PanC fehérje C—terminálisánál. PanD-transzláció start-kódonját aláhúztuk.
74,365/BE
IC. táblázat: További előnyös panD-riboszóma-kötőhelyek
20
-----A GAA AGG AGG TGA NNN NNN N ATG ideális RBS (47. sz. szék.)
ATT CGA GAA ATG GAG AGA ATA TAA T ATG lie Arg Glu Met Glu Arg lie * Met
-----A GAA AGG AGG TGA NNN NNN N ATG
ATT CGA GAA AGG AGG TGA ATA TAA T ATG
He Arg Glu Arg Arg * Met
ATT CGA GAA AGG AGG TGA ATA TAA - ATG lie Arg Glu Arg Arg * Met
ATT CGT AGA AAG GAG GTG AAT TAA T ATG lie Arg Arg Lys Glu Val Asn * Met natív panD-RBS (43. sz. szék.) 89. sz. szék.
ideális RBS (47. sz. szék.)
NDI (55. sz. szék.) 90. sz. szék.
NDII (56. sz. szék.) 90. sz. szék.
NDIII (57. sz. szék.) 91. sz. szék.
------AGA AAG GAG GTG ANN NNN N ATG ideális RBS (48. sz. szék.)
Ennek megfelelően, a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti vektor 49. vagy 50. számú szekvenciaként bemutatott, mesterséges RBS-t tartalmaz. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti vektor 51., 52., 53. vagy 54. számú szekvenciaként bemutatott, mesterséges RBS—t tartalmaz. A találmány még egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti vektor 55., 56. vagy 57. számú szekvenciaként bemutatott, mesterséges RBS-t tartalmaz.
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti rekombináns vektor olyan szekvenciákat tartalmaz, amely replikációt képes fokozni baktériumokban (például replikáció-fokozó szekvenciákat). A találmány egy előnyös megva74.365/BE lósítási módja szerint, a replikációt fokozó szekvenciák E. coliból származnak. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a replikáció-fokozó szekvenciák pBR322-ből (például bármilyen pAN-vektor pBR322-ből származó részében megtalálható szekvencia, melyet bemutatunk az ábrákon, azaz a 3.A ábrán bemutatott Notl-Notl-szekvenciák körülbelül 5,0 kB-tól 9,0 kBig) származnak.
A találmány még egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti rekombináns vektor antibiotikum-rezisztenciagéneket tartalmaz. Az „antibiotikum-rezisztencia-gének kifejezésen a leírásban olyan szekvenciákat értünk, amelyek antibiotikumokkal szemben rezisztenciát segítenek elő vagy határoznak meg a gazda-organizmusban (például Bacillusban). A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az antibiotikum-rezisztencia-géneket az alábbiak közül választjuk ki: cat- (klóramfenikol-rezisztencia-) , tét- (tetraciklin-rezisztencia-), erm (eritromicin-rezisztencia-), neo- (neomicin-rezisztencia-) gének és spec (spectinomicin-rezisztencia-) gének. A találmány szerinti rekombináns vektorok tartalmazhatnak továbbá homológ rekombinációs szekvenciákat (például olyan szekvenciákat, amelyek úgy lettek tervezve, hogy lehetővé tegyék a kérdéses gén rekombinációját a gazda-organizmus kromoszómájába). Például amyE-szekvenciákat lehet alkalmazni homológ célpontként gazda-kromoszómába való rekombinációhoz.
A találmány szerinti előnyös vektorok lehetnek például a 2-15., 17., 19., 22., 25. és 26. ábrán bemutatott vektorok. Szakember számára továbbá nyilvánvaló, hogy a vektort lehet úgy
74,365/BE tervezni, hogy rövidítve legyen olyan faktoroktól függően, mint a kiválasztott, géntechnológiailag módosítandó mikroorganizmus, a kívánt géntermék expressziójának mértéke és hasonlók.
IX. Izolált fehérjék
A találmány tárgyát képezik egy másik vonatkozásában izolált fehérjék (például izolált pantotenát bioszintetikus enzimek és/vagy valin-izoleucin bioszintetikus enzimek és/vagy izolált CoA-bioszintetikus enzimek, például izolált CoaA vagy CoaX). A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, fehérjéket (például izolált pantotenát bioszintetikus enzimek és/vagy valin-izoleucin bioszintetikus enzimek és/vagy izolált CoA-bioszintetíkus enzimek, például izolált CoaA vagy CoaX) rekombináns DNS-technikákkal termeltetünk, és a találmány szerinti mikroorganizmusokból lehet izolálni megfelelő tisztítási eljárás szerint, standard fehérjetisztítási technikák alkalmazásával. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a fehérjéket standard peptidszintézis-technikák alkalmazásával, kémiailag szintetizáljuk.
„Izolált vagy „tisztított fehérje (például izolált vagy tisztított bioszintetikus enzim) lényegében mentes celluláris anyagtól vagy más fehérjéktől, amelyek abban a mikroorganizmusban fordulnak elő, amelyből a a fehérje származik, vagy lényegében mentes kémiai prekurzoroktól vagy más kémiai anyagoktól, ha kémiailag szintetizáljuk. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az izolált vagy tisztított fehérje körülbelül 30%-nál (száraz tömegre vonatkoztatva) kevesebb szennyező fehérje vagy kémiai anyag van, előnyösebben körülbelül 20%-nál
74.365/BE kevesebb szennyező fehérje vagy kémiai anyag van, és még előnyösebben körülbelül 10%-nál kevesebb szennyező fehérje vagy kémiai anyag van, és legelőnyösebben körülbelül 5%-nál kevesebb szenynyező fehérje vagy kémiai anyag van.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a fehérje vagy géntermék Bacillusból származik (például Bacillusszármazék). A „Bacillusból származik vagy „Bacillus-származék kifejezéseken olyan fehérjét vagy génterméket értünk, amelyet Bacillus-gén kódol. A géntermék előnyösen az alábbi nemzetségekből származó mikroorganizmusokból származik: Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Laktococci és Streptomyces. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti rekombináns mikroorganizmus az alábbiak közül való: Bacillus subtilis, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus firmus, Bacillus pantothenticus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, valamint más, 1. csoporthoz tartozó, Bacillus-faj, például az a típus, amelyet a 16S méretű rRNS jellemez [ Priest, Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria című könyvben, szerk. Sonenshein et al., ASM, Washington, D. C., 6. oldal, (1993)] . A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a fehérje vagy géntermék Bacillus brevisből vagy Bacillus stearothermophilusból származik. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a fehérje vagy géntermék az alábbi mikroorganizmusokból származik: Bacillus licheniformis, Bacillus amyloquefaciens, Bacillus
74.365/BE halodurans, Bacillus subtilis vagy Bacillus pumilus. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint, a fehérje vagy géntermék Bacillus subtilisből származik (például Bacillus subtilis származék). A „Bacillusból származik vagy „Bacillusszármazék kifejezéseken olyan fehérjét vagy génterméket értünk, amelyet Bacillus-gén kódol. A találmány még egy előnyös megvalósítási módja szerint, a fehérjét vagy génterméket Bacillus-gén homológja kódolja (például olyan gén, amely Bacillustól megkülönböztethető fajból származik, de szignifikánsan homológ a találmány szerinti Bacillus-génnel, például Bacillusból származó pan-génnel vagy Bacillusból származó ilv-génnel).
A találmány által igényelt oltalmi körbe tartoznak olyan bakteriális eredetű fehérjék vagy géntermékek és/vagy Bacillusból származó fehérjék vagy géntermékek (például B. subtilisből származó géntermékek), amelyek természetesen előforduló bakteriális és/vagy Bacillus-gének kódolnak (például B. subtilis gének), például általunk azonosított gének, például Bacillusból vagy B. subtilisből származó coaX-gének, coaA-gének, pan-gének és/vagy ilv-gének. A találmány által igényelt oltalmi körbe tartoznak továbbá olyan bakteriális eredetű fehérjék vagy géntermékek, és/vagy Bacillusból származó fehérjék vagy géntermékek (például B. subtilisből származó géntermékek), amelyek különböznek a természetesen előforduló bakteriális és/vagy Bacillus-génektől (B. subtilis génektől), például olyan gének, amelyek mutáns, inszertált vagy deletált nukleinsavakkal rendelkeznek, de amelyek olyan fehérjéket kódolnak, amelyek a találmány szerinti, természetesen előforduló géntermékekhez lényegében hasonlóak.
74.365/BE
Szakember számára nyilvánvaló, hogy például nukleinsavakban olyan mutációkat lehet létrehozni (például szubsztitúciókat), amelyek a genetikai kód degeneráltsága következtében, a természetesen előforduló génekkel azonos aminosavakat kódolnak. Továbbá jól ismert, hogy szakember képes nukleinsavakban olyan mutációkat létrehozni (például szubsztitúciókat), amelyek konzervatív aminosav-szubsztitúciókat kódolnak. Továbbá jól ismert, hogy szakember bizonyos mértékben képes szubsztituálni, hozzáadni vagy deletálni aminosavakat anélkül, hogy az befolyásolná a géntermék funkcióját, természetesen előforduló géntermékhez viszonyítva, amely minden egyes esetet a találmány által igényelt oltalmi körbe tartozónak tekintünk.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti izolált fehérje (például izolált pantotenát bioszintetikus enzimek és/vagy valin-izoleucin bioszintetikus enzimek és/vagy izolált CoA-bioszintetikus enzimek, például izolált CoaA vagy CoaX) 3., 9., 24., 26., 28., 30., 32., 34., 36., 38. vagy 87. számú aminosav-szekvenciával rendelkeznek. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti izolált fehérje 3., 9., 24., 26., 28., 30., 32., 34., 36., 38. vagy 87. számú aminosav-szekvenciával rendelkező fehérjék legalább egyikének homológja, például olyan aminosav—szekvenciát tartalmaz, amely legalább körülbelül 30-40% azonosságot, előnyösen körülbelül 40-50% azonosságot, előnyösebben körülbelül 5060% azonosságot, sőt, még előnyösebben körülbelül 60-70%, 7080%, 80-90%, 90-95% vagy nagy mértékű azonosságot mutat 3., 9., 24., 26., 28., 30., 32., 34., 36., 38. vagy 87. számú aminosav74.365/BE
-szekvenciával, és olyan aktivitással rendelkezik, amely lényegében hasonló olyan fehérje aktivitásához, amellyel 3., 9., 24., 26., 28., 30., 32., 34., 36., 38. vagy 87. számú aminosav-szekvenciával rendelkező fehérje rendelkezik.
Két aminosav-szekvencia vagy két nukleinsavszekvencia közötti százalékos homológra meghatározása céljából, a szekvenciákat egymás- alá rendezzük optimális összehasonlítás céljából (például az első fehérje vagy nukleinsavszekvenciájába be lehet vinni réseket egy második fehérje vagy nukleinsavszekvenciájának optimális alárendezése céljából). Ha az első szekvenciában egy pozíciót ugyanolyan aminosav vagy nukelotid foglal el, mint a második szekvencia megfelelő pozíciójában, akkor a molekulákat azonosnak tekintjük ebben a pozícióban. Két szekvencia közötti százalékos azonosság a szekvenciákban lévő azonos pozíciók számának függvénye (azaz %azonosság = azonos pozíciók száma/összes pozíciók száma x 100), előnyösen figyelembe véve a rések számát és a rések méretét, amely szükséges az optimális alárendezés létrehozására.
Szekvenciák összehasonlítását és két szekvencia közötti százalékos homológia meghatározását szakember által ismert technikák szerint lehet elvégezni, matematikai algoritmus, például Kariin és Altschul által leírt [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264-68 (1990)] és Kariin és Altschul által [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-77 (1993)] módosított algoritmus alkalmazásával. Ilyen algoritmus be van építve az NBLAST- és az XBLASTprogramokba (2.0 verzió) [Altschul és mtsai., J. Mól. Bioi. 215, 403-10 (1990)] . BLAST-nukleotid-kereséseket NBLAST-programmal
74.365/BE lehet végezni, amelyben „score = 100, „wordlength = 12, hogy a találmány szerinti HA-nukleinsavmolekulákkal homológ nukleotid-szekvenciákhoz jussunk. BLAST-fehérje-kereséseket XBLAST-programmal lehet végezni, amelyben „score = 50, „wordlength = 3, hogy a találmány szerinti HA-fehérjemolekulákkal homológ aminosav-szekvenciákhoz jussunk. Réseket tartalmazó egymás alá rendezéshez, összehasonlítási célokból, „Gapped BLAST programot lehet alkalmazni [Altschul és mtsai., Nucleic Acids Res. 25, 33893402 (1997)] . Ha BLAST és „Gapped BLAST programokat alkalmazunk, szakember képes a program (például XBLAST és NBLAST) paramétereinek optimalizálására.
Szekvenciák összehasonlítására alkalmazott másik matematikai algoritmus E. Meyers és W. Miller által leírt [Comput. Appl. Biosci. 4, 11-17 (1988)] algoritmus. Ilyen algoritmus az ALIGNprogramba (2.0 verzió) van beépítve, amely a GCG-szekvenciák egymás alá rendezésére szolgáló szoftvercsomag része. Ha ALIGNprogramot használunk aminosav-szekvenciák összehasonlítására, „PAM120 weight residue táblázatot lehet alkalmazni, ahol „gap length penalty (büntetőpont): 12 és „gap penalty (büntetőpont) : 4. Szekvencia-analízisre szolgáló, további algoritmusok szakember által ismertek, például ADVANCE és ADAM, melyet Torelli és Robitti írtak le [Comput. Appl. Biosci. 10, 3-5 (1994)]; és FASTA, melyet Pearson és Lipman [ PNAS 85, 2444-8 (1988)] írtak le.
Két aminosav-szekvencia közötti százalékos homológiát a GAP-program alkalmazásával is meg lehet határozni, amely a GCG-szoftver-csomagban van (rendelkezésre áll http://www.gcg.com),
74.365/BE
100
Blossom62-mátrix vagy PAM250-mátrix alkalmazásával, ahol a „gap weight (rés-súlyozó tényező) 12, 10, 8, 6, 5 vagy 4, és a „length weight (hossz-súlyozó tényező) 2, 3 vagy 4. Két nukleinsavszekvencia közötti százalékos homológiát a GCGszoftver-csomagban lévő GAP-programmal határozzuk meg, standard paraméterek alkalmazásával, például a „gap weight (rés—súlyozó tényező) 50 és a „length weight (hossz-súlyozó tényező) 3.
X. Biotranszformáció és biokonverzió
A találmány tárgyát képezik egy másik vonatkozásában bio transzformációs eljárások, amelyben leírás szerinti, rekombináns mikroorganizmusokat (például mutáns mikroorganizmusokat) és/vagy izolált CoA, pantotenát vagy izoleucin-valin bioszintetikus enzimeket használunk fel. A biotranszformációs eljárás kifejezésen, melyet a leírásban biokonverziós eljárás kifejezésként is használunk, olyan biológiai folyamatot értünk, amely bármilyen olyan vegyület (például intermedier vagy termék) termelődését (például transzformálódását vagy konverzióját) eredményezi, amely a CoA, pantotenát vagy izoleucin-valin bioszintetikus enzimhez viszonyítva a folyamatsorban előbb helyezkedik el, olyan vegyületté (például szubsztráttá, intermedierré vagy termékké), amely a CoA, pantotenát vagy izoleucin-valin bioszintetikus enzimhez viszonyítva a folyamatsorban később helyezkedik el.
találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi biotranszformációs eljárás panto-vegyület termeltetésére, amelyben legalább egy, pantotenát bioszintetikus enzimet túltermelni képes mikroorganizmust érintkezhetünk legalább egy alkalmas szubsztráttal vagy prekurzorral olyan körül74.365/BE
101 mények között, amelyben a panto-vegyület termelődik, és kinyerjük a panto-vegyületet. A találmány egy hasonló, előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi biotranszformációs eljárás pantoát termeltetésére, amelyben ketopantoát reduktázt (panE-génterméket) túltermelni képes mikroorganizmust érintkeztetünk alkalmas szubsztráttal (például ketopantoáttal) olyan körülmények között, amelyben pantoát termelődik, és kinyerjük a pantoátot. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi biotranszformációs eljárás pantotenát termeltetésére, amelyben ketopantoát reduktázt és pantotenát szintetázt túltermelni képes mikroorganizmust érintkeztetünk alkalmas szubsztráttal (például ketopantoáttal és β-alaninnal) olyan körülmények között, amelyben pantotenát termelődik, és kinyerjük a pantotenátot. A találmány még egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi biotranszformációs eljárás pantotenát termeltetésére, amelyben ketopantoát hidroxi-metil-transzferázt, ketopantoát reduktázt és pantotenát szintetázt túltermelni képes mikroorganizmust érintkeztetünk alkalmas szubsztráttal (például a—ketoizovaleráttal és β-alaninnal) olyan körülmények között, amelyben pantotenát termelődik, és kinyerjük a pantotenátot. A fentebb leírt biotranszformációk végrehajtására előnyösen alkalmazott, rekombináns mikroorganizmusok lehetnek pantotenát kináz mutánsok. Pantoát vagy pantotenát termelésére kedvező körülmények lehetnek olyan körülmények, amelyek a kívánt termék, pantoát vagy pantotenát termelődését eredményezik.
A találmány még egy előnyös megvalósítási módja szerint, a
74.365/BE
102 találmány tárgyát képezi eljárás β-alanin termeltetésére, amelyben aszpartát ot—dekarboxilázt tultermelni képes mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben β-alanin termelődik. Az aszpartát a—dekarboxilázt túltermelni képes mikroorganizmus előnyösen mutációt tartalmaz pantotenát bioszintetikus enzimet, például ketopantoát hidroxi-metil-transzferázt, ketopantoát reduktázt vagy pantotenát szintetázt kódoló nukleinsav-szekvenciában.
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás β-alanin termeltetésére, amelyben aszpartátot tartalmazó készítményt érintkeztetünk B. subtilisből izolált aszpartát α-dekarboxiláz—enzimmel olyan körülmények között, amelyben β-alanin termelődik (például in vitro szintézismódszerrel).
Ά biotranszformaciós reakciókban alkalmazott mikroorganizmus (ok) és/vagy enzimek olyan formában vannak, amely lehetővé teszi, hogy végrehajtsák tervezett funkciójukat (például kívánt vegyületet termeljenek). A mikroorganizmusok lehetnek egész sejtek, vagy lehetnek csak a sejtek olyan részei, amely szükséges a kívánt végtermék előállítására. A mikroorganizmusok lehetnek szuszpendálva (például megfelelő oldatban, például pufferolt oldatokban vagy tápközegekben), mosottak (például a mikroorganizmus tenyésztési tápközegétől mentes mosott), acetonnal szárított, immobilizált (például poliakrilamid-géllel vagy k-carrageenan-al vagy szintetikus hordozókkal, például gyöngyökkel, mátrixokkal és hasonlókkal), fixáltak, keresztkötöttek vagy permeabilizáltak (például permeabilizált membránokkal és/vagy sejtfalakkal rendelkeznek, így vegyületek, például szubsztrátok,
74.365/BE < 103 ·..··..· : : ··:· intermedierek vagy termékek könnyen átjuthatnak a membránon vagy sejtfalon).
Tisztított vagy tisztítatlan CoA-bioszintetikus enzim(ek)et (például CoaA és/vagy CoaX), pantotenát bioszintetikus enzim(ek)et és/vagy valin-izoleucin bioszintetikus enzim(ek)et lehet alkalmazni biotranszformaciós reakciókban. Az enzim olyan formában van, amely lehetővé teszi, hogy végrehajtsák tervezett funkcióját (például a kívánt vegyületet termelje). Az enzim lehet például szabad formában vagy immobilizálva. Tisztított vagy tisztítatlan CoA-bioszintetikus enzim(ek)et (például CoaA és/vagy CoaX), pantotenát bioszintetikus enzim(ek)et és/vagy valin-izoleucin bioszintetikus enzim(ek)et egy vagy több, in vitro reakcióban lehet érintkeztetni megfelelő szubsztráttal (szubsztrátokkal), így előllítjuk a kívánt terméket.
A fentebb leírt, legalább egy módszer (például a találmány szerinti termelési eljárások) tekintetében, a találmány előnyös megvalósítási módjai szerint, a találmány tárgyát képezik legalább egy vonatkozásában eljárások, amelyekben nem Corynebacterium-nemzetségből és/vagy Escherichia-nemzetségből származó mikroorganizmusokat alkalmazunk; eljárások, amelyekben nem Escherichia coli vagy Corynebacterium glutamicum mikroorganizmusokat alkalmazunk; eljárások, amelyekben nem gram negatív mikroonganizmusokat alkalmazunk; a találmány előnyös megvalósítási módjai szerint, az alkalmazott mikroorganzimusok nem tartalmaznak, expresszálnak vagy termelnek olyan nukleinsavakat, géneket vagy fehérjéket (például bioszintetikus enzimeket), amelyek Corynebacterium-nemzetséghez és/vagy Escherichia-nemzetséghez
74.365/BE
104 tartozó mikroorganzimusokból származnak; a találmány előnyös megvalósítási módjai szerint, az alkalmazott mikroorganzimusok nem tartalmaznak, expresszálnak vagy termelnek olyan nukleinsavakat, géneket vagy fehérjéket (például bioszintetikus enzimeket) , amelyek Escherichia coli vagy Corynebacterium glutamicum mikroorganizmusból származnak.
XI. Szűrési vizsgálati eljárások
Mivel CoA esszenciális faktor baktériumokban, CoA-bioszintézisben szerepet játszó fehérjék (például enzimek) értékes eszközt biztosítanak új antibiotikumok kutatásához. A CoaX-fehérje különösen értékes célpont baktericid-vegyületek azonosítására, mivel primer szekvenciája nem emlékeztet emlősszervezetekben előforduló pantotenát kináz enzimekre. Ennek megfelelően, szintén a találmány tárgyát képezi eljárás (melyet a leírásban „szűrési vizsgálati eljárás-nak is nevezünk) olyan modulátorok, azaz kiszemelt vagy tesztvegyületek vagy ágensek (például peptidek, peptidomimetikumok, kisméretű molekulák vagy más drogok) azonosítására, amelyek CoaX-hez képesek kötődni, vagy stimulátor vagy inhibitor-hatást képesek irányában kifejteni, például coaX-expresszióra vagy CoaX-aktivitásra.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezik vizsgálati eljárások kiszemelt vagy tesztvegyületek szűrésére, amelyek CoaX-fehérjékhez vagy biológiailag aktív részletéhez képes kötődni. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezik vizsgálati eljárások kiszemelt vagy tesztvegyületek szűrésére, amelyek CoaX-fehérjék vagy biológiailag aktív részletének aktivitását 74.365/BE
105 képesek modulálni. A találmány szerinti tesztvegyületekhez juthatunk számos megközelítés bármelyikével, szakember által ismert, kombinatorikus könyvtár alkalmazásával, például: biológiai könyvtárak; térben irányítható párhuzamos szilárd fázisú vagy oldat-fázisú könyvtárak; szintetikus könyvtárat alkalmazó módszerek, amelyek dekonvolúciot igényelnek; az „egy gyöngy—egy ve— gyület könyvtárat alkalmazó módszer; és szintetikus könyvtárat alkalmazó módszerek, amelyekben affinitáskromatográfiával szelektálunk. A biológiai könyvtárat alkalmazó módszer peptidkönyvtárakra korlátozódik, míg a többi négy megközelítés alkalmazható peptideket, nem-peptid oligomereket vagy kisméretű molekulákat tartalmazó vegyület-könyvtárakra [Lam, K. S., Anticancer Drug Des. 12, 145 (1997)] .
A szakirodalomban találhatunk molekuláris könyvtárak szintézisére szolgáló módszereket [ DeWitt et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90, 6909 (1993); Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11422 (1994); Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678 (1994); Cho et al., Science 261, 1303 (1993); Carrell et al.,
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059 (1994); Carrell et al.,
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061 (1994); és Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233 (1994)] . Vegyületkönyvtárak lehetnek oldatban [ lásd például Houghten, Biotechniques 13, 412-421 (1992)], vagy gyöngyökön [Lam, Nature 354, 82-84 (1991)] , chipeken [Fodor, Nature 364, 555-556 (1993)], baktériumokon
[Ladner, USP 5,223, 409. számú szabadalmi irat], spórákon
[Ladner, USP 5,223, 409. számú szabadalmi irat], plazmidokon [Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1865-1869 (1992)]
74.365/BE
106 vagy fágokon [Scott és Smith, Science 249, 386-390 (1990); Devlin, Science 249, 404-406 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378-6382 (1990); Felici, J. Mól. Bioi. 222, 301-310 (1991) ; Ladner, mint fent] .
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerinti vizsgálati eljárás mikroorganizmusra alapuló vizsgálati eljárás, amelyben rekombináns mikroorganizmust érintkeztetünk egy tesztvegyülettel, és meghatározzuk, hogy a tesztvegyület milyen mértékben képes CoaX-aktivitást modulálni. Annak meghatározását, hogy a tesztvegyület milyen mértékben képes CoaX-aktivitást modulálni, végezhetjük például intracelluláris foszfopantoát vagy CoA koncentrációinak vagy szekretált pantotenát koncentrációinak követésével (mivel CoaX-et gátolni képes vegyületek pantotenát felhalmozódását eredményezik a teszt-mikroorganizmusban). CoaXszubsztrátot megjelölhetünk radioaktív izotóppal vagy enzimmel, így CoaX-aktivitás modulálását úgy lehet meghatározni, hogy detektáljuk a jelölt szubsztrát konverzióját intermedierré vagy termékké. Például CoaX-szubsztrátokat meg lehet jelölni 32P-vel, 14C-vel vagy 3H-val, közvetlenül vagy közvetve, és a radioaktív izotópot a radioaktív emisszió közvetlen számlálásával vagy szcintillációs számlálással detektáljuk. Annak meghatározását, hogy a tesztvegyület milyen mértékben képes CoaX-aktivitást modulálni, más módszer szerint (detektálható markert, például luciferázt kódoló nukleinsavhoz működőképesen kapcsolt, CoA-reszponzív szabályzó elemet tartalmazó) riportergén indukálódásának detektálásával is meg lehet határozni, vagy CoA-szabályzott celluláris válasz detektálásával.
74.365/BE
107
A találmány még egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti szűrési vizsgálati eljárás olyan sejtmentes vizsgálati eljárás, amelyben CoaX-fehérjét vagy biológiailag aktív részletét érintkeztetjük in vitro egy tesztvegyülettel, és meghatározzuk, hogy a tesztvegyület milyen mértékben képes a CoaX fehérjéhez vagy biológiailag aktív részletéhez kötődni vagy aktivitásukat modulálni. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a vizsgálati eljárásban CoaX-fehérjét vagy biológiailag aktív részletét érintkeztetjük ismert szubsztrátokkal, vizsgálati reakciókeveréket előállítva, a vizsgálati reakciókeveréket érintkeztetjük egy tesztvegyülettel, és meghatározzuk, hogy a tesztvegyület milyen mértékben képes a CoaX szubsztrátjaira kifejtett enzimaktivitását modulálni.
Szűrési vizsgálati eljárásokat végezhetünk bármilyen edényben, amely alkalmas mikroorganizmusok, fehérjék és/vagy reaktánsok érintkeztetésére. Ilyen edények lehetnek például mikrotitertálcák, kémcsövek és mikro-centrifugacsövek. A találmány több előnyös megvalósítási módja szerint, a fentebb leírt, találmány szerinti eljárásokban kívánatos, hogy CoaX-fehérje vagy CoaXfehérjét expresszáló, rekombináns mikroorganizmus immobilizálva legyen, termékek és/vagy szubsztrátok elválasztásának elősegítése céljából, valamint a vizsgálati eljárás automatizálásának lehetővé tétele céljából. Például glutation S-transzferáz/CoaXfúziós fehérjét abszorbeálni lehet glutation-sepharose-gyöngyökre (Sigma Chemical, St. Louis, MO) vagy glutation-származékká alakított mikrotiter-tálcákra. Fehérjék hordozókhoz való immobilizálására szolgáló, más technikákat (például biotin-kon74,365/BE
108 jugaciót és sztreptavidin-immobilizációt vagy antitest-konjugációt) is lehet alkalmazni a találmány szerinti, szűrési vizsgálati eljárásokban.
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, CoaX-expresszió modulátorait olyan eljárásban azonosítjuk, amelyben egy sejtet érintkeztetünk egy kiszemelt vegyülettel, és meghatározzuk coaX-mRNS vagy CoaX-polipeptid expresszióját a sejtben. Az expresszió mértékét a kiszemelt vegyület jelenléteben összahasonlítjuk a kiszemelt vegyület hiányában (vagy egy alkalmas kontroll, például megfelelő puffer-kontroll vagy standard jelenlétében) tapasztalt expresszióval. A kiszemelt vegyületet azután coaX-mRNS vagy CoaX-polipeptid expressziójának modulátoraként azonosítjuk erre az összehasonlításra alapozva.
A találmány tárgyát képezik továbbá a fentebb leírt szűrési vizsgálati eljárásokkal azonosított, új ágensek. Ennek megfelelően, a találmány által igényelt oltalmi körbe tartozik továbbá a leírás szerint azonosított ágensek alkalmazása megfelelő állatmodellben. Például, a leírás szerint azonosított, CoaX-et modulálni képes ágenseket (például anti-baktericid ágenseket) fertőző állatmodellben lehet alkalmazni, ilyen ágensekkel való kezelés hatékonyságának, toxicitásának vagy mellékhatásainak meghatározására .
A találmány szerinti megoldást a továbbiakban az alábbi példákkal szemléltetjük, melyekkel nem kívánjuk a találmány által igényelt oltalmi kört korlátozni. A leírásban idézett valamennyi hivatkozást, szabadalmi leírást, szabadalmi bejelentést és közzétett szabadalmi bejelentést a kitanítás részének tekintünk.
74.365/BE
109
Példák
Általános módszerek
Törzsek. A találmány szerinti Bacillus subtilis törzsek két törzs közül az egyikből származhatnak. Az elsőt különféleképpen nevezik: „168, „1A1 vagy „RL-1. A genotípus trpC2. Ez a törzs a vad típusú „Marburg-törzsből mutagenezissel származtatható, és alapját képezi sok molekuláris biológiai munkának, melyet B. subtilisen végeznek. A második törzs PY79-jelű, 168-jelű törzs prototrofikus származéka, amely Trp+-á a vad típusú W23-törzsből lett származtatva transzdukcióval.
Táptalajok, tápközegek. B. subtilis tenyésztésére alkalmazott standard minimáltápközeg 1 x Spizizen-sókat és 0,5% glükózt tartalmazott. Standard szilárd „gazdag táptalaj-ként „Tryptone Blood Agar Broth-t (Difco) alkalmaztunk, és standard folyékony „gazdag tápközeg-ként VY-t alkalmaztunk, amely „veal infúziós folyadékot es elesztőkivonatot tartalmazott. Pantotenát—termelés tesztelése céljából, folyékony táptalajban, kémcsőben végzett tenyésztéshez VY dúsított formáját alkalmaztuk, melynek elnevezése „Special VY vagy „SVY volt. Szakaszos („batch) fermentációkhoz SVYG-t és PFMG-t alkalmaztunk. A tápközegek összetételét az alábbiakban megadjuk.
VY, gazdag folyékony tápközeg: 25 g Difco „Veal Infusion Broth, 5 g Difco élesztőkivonat („Yeast extract), 1 liter víz (autoklávozva).
TBAB gazdag szilárd táptalaj: 33 g Difco Tryptone Blood Agar Broth, 1 liter víz (autoklávozva).
MIN, minimál-tápközeg: 100 ml 10 x Spizizen-sók: 10 ml 50%
74.365/BE
110 glükóz; 2 ml 10% arginin-HCl*; 10 ml 0,8% triptofán**; vízzel kiegészítve 1 literre. (* Néhány esetben arginint nem tartalmaz, vagy nátrium-glutamáttal van helyettesítve 0,04% végkoncentrációban. B. subtilis általában gyorsabban növekszik minimáltápközegben, mintha bizonyos aminosavakat, például arginint, glutamint, glutamátot vagy prolint adunk nitrogénforrás-kiegészítésként.) (**Triptofán-auxotróf törzsekre rutinszerűen hozzáadunk triptofánt a legtöbb minimáltápközeghez.) lOx Spizizen-sók: 174 g K2HPO4x3H3O; 20 g ammónium-szulfát; 60 g KH2PO4; 10 g Na3-citrátx2H2O; 2 g MgSO4x7H2O; vízzel kiegészítjük 993 ml-re; azután hozzáadunk 3,5 ml FeCl3-oldatot és 3,5 ml nyomelemeket tartalmazó oldatot.
FeCl3-oldat: 4 g FeCl3x6H2O; 197 g Na3citrátx2H2O; vízzel kiegészítve 1 literre (szűréssel sterilizálva).
Nyomelemeket tartalmazó oldat: 0,15 g Na2MoO4x2H2O; 2,5 g H3BO3; 0,7 g CoC12x6H20; 0,25 g CuSO4x5H2O; 1,6 g MnCl2x4H2O; 0,3 g ZnSO4x7H2O; vízzel 1 literrel kiegészítve (szűréssel sterilizálva) .
SVY, Special VY, kiegészített* gazdag tápközeg pantotenáttermelés tesztelésére kémcsőben végzett tenyésztéssel: 25 g Difco „Veal Infusion Broth; 5 g Difco élesztőkivonat; 5 g nátrium-glutamát, 2,7 g ammónium-szulfát; 740 ml víz (autoklávozás); hozzáadunk 200 ml 1 M kálium-foszfátot, pH 7,0; 60 ml 50% glükózt. (*Pantotenát-termelés kémcsőben végzett tesztelése esetén, folyékony SVY-tápközeghez hozzá lehet adni Na-a-keto-izovalerátot és/vagy β-alanint 5 g/1 koncentrációban, szűréssel sterilizált törzsoldatokból.)
74.365/BE
Ill
PFMG, élesztőkivonatra alapuló tápközeg, fermentorokban történő alkalmazásra: 20 g Amberex 1003™ élesztőkivonat,· 5 g nátrium-glutamát, 2 g ammónium-szulfát; 5 g triptofán; 10 g KH2PO4; 20 g K2HPO4x3H3O; 1 g MgCl2x6H2O; 0,1 g CaCl2x2H2O; 1 g nátrium— -citrát; 0,01 g FeSO4x7H2O; 1 ml nyomelemeket tartalmazó oldat; 20 g glükóz; vízzel 1 literre kiegészítve. Szükséges esetben rátáplálunk glükózt vagy más cukrokat. A rátapiáló oldat tartalmazhat ásványi anyagokat, definiált vagy élelmiszer minőségű tápanyagokat.
PF, kémiailag definiált pantotenát-mentes (pantothenate free) tápközeg pantotenát-auxotrófia tesztelésére: 100 ml lOx Spizizen-sók; 100 ml 1 x Difco pantotenát vizsgálati eljárás tápközege; 10 ml 50% glükóz; vízzel 1 literre kiegészítve.
Pantotenát-auxotrófok esetén, 1 mM nátrium-pantotenátot hozzáadunk minimál-tápközeghez és gazdag tápközeghez, mivel általában a gazdag tápközegben nincs elég pantotenát B. subtilis panmutánsok igényeihez. Aminosavakat szükséges esetben 100 mg/liter koncentrációban alkalmazunk. Antibiotikum-rezisztenciára 5 mg/1 klóramfenikol, 100 mg/1 spektinomicin—HC1, 15 mg/1 tetraciklin— HC1 vagy 1 mg/1 eritromicin plusz 26 mg/1 linkomicin jelenlétében szelektálunk.
Pantotenát vizsgálati eljárások: biológiai vizsgálati eljárás.
LactoBacillus plantarum indikátororganizmus növekedéséhez pantotenátra van szükség, és alacsony koncentrációkra (pg/l) is reszponzív. Tehát sorozathígításokat alkalmazva, széles koncentrációtartományban lehet vizsgálni. Kereskedelmi forgalomban rendelkezésre álló tápközeget (például pantotenát vizsgálati eljá74,365/BE
112 rás tápközegét, azaz PAM-ot, Difco) lehet alkalmazni. Azonban pantotenáttal kiegészített Difco-ΡΑΜ nem támogatja ugyanolyan mértékben a növekedést, mint ami a pantotenát vizsgálati eljárásban alkalmazott tápközeg (FM-PAM) frissen kevert változatával elérhető, amelyben az egyes komponenseket a Difco specifikációjának megfelelően, rutinszerűen keverjük össze, a kereskedelmi forgalomban elérhető termék helyett.
Mielőtt B. subtilis tenyészetből származó felülúszókat vizsgálnánk, B. subtilis sejteket el kell különíteni vagy pusztítani. B. subtilis tenyészet felülúszóiban körülbelül ugyanolyan pantotenát-titer van, ha a felülúszókat autoklávozzuk, vagy ha sterilre szűrjük. Ennek megfelelően, rutin eljárásokban a mintákat 5 percig autoklávozzuk a biológiai vizsgálati eljárás előtt.
Pantotenát vizsgálati eljárások: HPLC vizsgálati eljárás. Pantoténsav-termelést HPLC-vel mértünk, a detektor hullámhossza 197 nm volt és a referencia hullámhossza 450 nm. Az alkalmazott eljárás Hewlett-Packard által, vízoldható vitaminokra ajánlott eljárás módosítása volt. A fermentléből vett mintákat megegyező térfogatú, 60% acetonitrillel (ACN) hígítottuk, centrifugáltuk és szűrtük. Analízis előtt tipikusan további 10-szeres hígítással 20-szoros végső hígítást érünk el. A termék magasabb koncentrációi esetén tovább hígxtunk. A vegyületeket C18 Phenomenex 5 μ Aqua 250 x 4, 6 mm oszlopon választjuk el 5% acetonitrilt (ACN) tartalmazó 50 mM Na-foszfát-pufferrel (pH 2,5) . 5%-95% ACN-gradienssel mossuk az oszlopot a minták között. A pantotenát-csúcs görbe alatti területe egyenesen arányos a koncentrációval 5 és 1000 mg/1 között. Más panto-vegyületeket is elvá74.365/BE
113 lasztottunk és mértük mennyiségüket ezzel a módszerrel.
Aminosav-analízis: HPLC vizsgálati eljárás. A fermentációs közegben és a fermentáció alatt jelenlévő aminosavakat HPLC-vel mertük, a detektor hullámhosszá 338 nm volt és a referenciahullámhossza 390 nm. Az alkalmazott eljárás Hewlett-Packard által, aminosav-analizisre ajánlott eljárás módosítása volt. A fermentléből ugyanúgy preparáltunk mintákat, mint a panto-vegyületek analíziséhez. A vegyületeket C18 Hypersil 5 ODS 200 x 2,1 mm oszlopon választjuk el. Az A-oldószer 20 mM Na-acetát-puffér (pH 7,2). A B-oldószer 40% acetonitrilt és 40% metanolt tartalmaz. 100% A-oldószer és 100% B-oldószer közötti gradiens elválasztja az aminosavakat és mossa az oszlopot a minták között.
Szakaszos fermentációk. Pantotenát—termelő törzseket keverte— tett fermentorokban növesztettünk, például CF3000 Chemap 14 literes edényekben, 10 literes munkatérfogatban. A számítógépes vezérlést és az adatgyűjtést kereskedelemben elérhető szoftver, például B. Braun Biotech MFCS-szoftver alkalmazásával végeztük. A fermentációk lehetnek szakaszos eljárások, de előnyösen cukorlimitált, rátáplálásos eljárások. Néhány tápközeg-komponenst (például SVYG és PMFG) a fermentorba adagolunk és helyben sterilizálunk. A tápközegből egyes részeit külön sterilizáljuk, és sterilen adagoljuk a fermentorba. Ez az eljárás ilyen területen jártas szakember számára jól ismert. A tápközegbe kerülő, további nitrogénforrásokat külön sterilizáljuk, és lehűlés után adjuk a szénforrásokhoz.
A tápközeghez a fermentáció előtt hozzáadott cukor körülbelül 6 óra alatt elfogy. Ezután glükózt és más cukrokat adunk hozzá
74.365/BE
114 esetleg ásványi anyagokkal és definiált vagy élelmiszer minőségű tápanyagokkal együtt. Más módszer szerint, a rátáplálás rendje korábbi fermentációkból vett mintákból kialakított, konszenzus tápanyagigény-profilra alapul.
Oltás után viszonylag alacsony sebességgel kevertetünk, például 200 rpm-en. Ha az oldott oxigén [ pOJ leesik 30%-ra, a számítógépes szabályzás automatikusan állítja a kevertetési sebességet, hogy az oldott oxigén koncentrációját 25 és 30% [ pO2] között tartsa.
példa
Panto-vegyületek fokozott mértékű termeltetése pBCD-géntermékeket túltermelő baktériumok alkalmazásával
Ebben a példában leírjuk B. subtilisből származó panBCD-operon klónozását és panBCD-géntermékeket túltermelő mikroorganizmusok előállítását.
B. subtilisből származó panBCD-operon klónozása céljából B. subtilis GP275-plazmidkönyvtár (168 származéka) genomi DNS-ét E. coli BM4062-be (birAts) transzformáltuk, és hőmérséklet-szenzitív kiónokat szelektáltunk 42°C-on. A genomi szekvenciák restrikciós térképeinek összehasonlításával, levezettünk egy konkrét kiónt, amely B. subtilis birA-gént és szomszédos panBCD-géneket tartalmazott. A plazmid jelölése pAN201 volt.
A panBCD-operon túltermeltetése és pantotenát termeltetése céljából a panBCD-operon natív promóterét helyettesítettük B. subtilis SPO-bakteriofágból származó, két erős, konstitutív promoter egyikével. A két promoter jelölése P26 és P15 volt. To
74.365/BE
115 vábbá két mesterséges riboszóma-kötőhelyet (RBS) alkalmaztunk a natív panB-RBS helyettesítése céljából. Előre jelezhető volt, hogy ez két mesterséges RBS (bemutatjuk 49. és 50. számú szekvenciaként) fokozza panBCD transzlációját; szekvenciájukat bemutatjuk az 1.A táblázatban. Ezt a három, géntechnológiailag tervezett panBCD expressziós kazettát beépítettük E. coliban replikálódni képes, cirkuláris plazmidokba. A plazmidokat még az jellemezte, hogy E. coli-ból származó, riboszómális RNS-transzkripciós egységből származó, erős, rho-független transzkripciós terminátort (jelölése T1T2), pC194-ből származó, Gram-pozitív klóramfenikolrezisztencia-gént (cat) és egy pár Notl-jelű restrikciós hasítóhelyet tartalmazott az E. coli replikon és B. subtilisbe való integrálódásra szánt szegmens közötti kapcsolódási helyen. Ebben a sorozatban előállítottunk három plazmidot, pAN004-et, pAN005-t és pAN006-ot. A pAN004-plazmid P26-promótert, RBSl-et és E. coli replikont tartalmazott alacsony kópiaszámban. A pAN005-plazmid P15-promótert, RBSl-et és replikont tartalmazott alacsony kópiaszámban. A pAN006 P26-promótert, RBS2-t és replikont tartalmazott közepes kópiaszámban.
A három panBCD expressziós kazetta a fentebb említett három plazmidot tartalmazta, valamennyit olyan DNS—fragmentumhoz ligáivá, amely a natív panB-géntől szintézisiránnyal szemben elhelyezkedő, természetesen előforduló szekvenciákból állt, és egyetlen kópiában integráltuk homológ rekombinációval B. subtilis RL-1- és PY79-törzsek panBCD-lókuszába, helyettesítve a vad típusú operont. Ezt két lépésben végeztük el. Először egy deléciós szubsztitúciót végeztünk, amelyben a panB-t kódoló ré
74.365/BE
116 .* :.:.
• · ·· · · · gió körülbelül két-harmadát helyettesítettük panB-hez integrált Gram-pozitív spektinomicin-rezisztencia-génnel (spec), így Spec' pantotenát—auxotrófokhoz jutottunk. Ezeket az intermedier—törzseket azután pAN004-, pAN005- és pAN006-jelű panBCD-expressziós kazettákkal transzformáltuk, majd panB-től közvetlenül szintézisiránnyal szemben elhelyezkedő, kromoszómális szekvenciákat tartalmazó DNS-fragmentumhoz ligáltuk azokat. A bemenő kazettát pantotenát-prototrófiára szelektáltuk. Az eredményül kapott törzsek jelölése PA221, PA222 és PA223 (RL-l-ből) , és PA235, PA232 és PA233 (PY79-ből), sorrendben. A szintézisiránnyal szemben kapcsolt szekvenciát tartalmazó plazmád például a pAN240-plazmid integrálva a PA221-törzsbe. A pAN240 nukleotidszekvenciáját bemutatjuk 76. számú szekvenciaként.
Megfelelő primerekkel, polimeráz láncreakciót alkalmaztunk ezekben a géntechnológiailag módosított törzsekben, a korrekt kromoszómális struktúrák igazolása céljából. Amikor PA221-törzs extraktumait SDS-PAGE-val vizsgáltuk, azt találtuk, hogy két fehérje túltermelődött. Az egyik fehérje látszólagos molekulatömege 29.000, a másik fehérje látszólagos molekulatömege 39.000 dalton volt. A 29.000 dalton méretű csík feltételezhetően PanB (előre jelzett molekulatömege 29.761 dalton). A nagyobb fehérjecsík feltételezhetően PanC (előre jelzett molekulatömege 31.960 dalton).
Azt, hogy ezek a törzsek milyen mértékben képesek pantotenátot termelni, kémcsőben végzett tenyésztéseket vizsgáltunk az alábbiak szerint. Az egyes törzseket 5 g/1 -ketoizovaleráttal ( -KIV) és 5 g/1 β-alaninnal kiegészített, SVY-tápközegben növesztettük
74.365/BE
117 annak biztosítása céljából, hogy ezek a prekurzorok nem legyen limitáló mennyiségben. A tenyészet felülúszóit autoklávoztuk, és biológiai vizsgálati eljárással elemeztük. A szülői törzsekhez, RL-1- és PY79-hez képest, a géntechnológiailag módosított törzsek körülbelül 8—30—szór több pantotenátot termeltek, bizonyos esetekben elértek 1 g/1 pantotenátot.
2. táblázat
Pantotenát termeltetése géntechnológiailag módosított B. subtilis törzsekkel, kémcsövekben végzett, 5 g/1 a-KIV-vel és 5 g/1 β-alaninnal kiegészített SVY folyékony tapközegben teszt—tenyésztés alkalmazásával
Kísérlet Törzs Promoter RBS panB-nél Pantotenát (mg/1)
1 RL-1 natív natív 30
PA221 p26 RBS1 990 790
PA222 P15 RBS1 250 250
PA223 ^26 RBS 2 790 790
2 PY7 9 natív natív 40
PA235 ^26 RBS1 930 860
PA221 P26 RBS1 1100 1030
74.365/BE
118
A P26-promóter körülbelül 3-4-szer hatékonyabb volt, mint a pi5~Pr°móter, míg az RBS1 és RBS2 durván ekvivalens. Plazmidok, például pAN004-, pAN005- és pAN006-plazmidok cirkulárissá rekombinálódhatnak B. subtilis vad típusú panBCD-lókuszba, Campbell-típusú integrációval (egyetlen „crossing over), melyeket 5 mg/1 alkalmazásával szelektáltunk klóramfenikol-rezisztenciára. Az így kapott törzsek körülbelül ugyanakkora mennyiségben termeltek pantotenátot, mint a PA221-, PA222- illetve PA223-törzsek. A pAN004-plazmid P2S-promótert, RBSl-et és E. coli replikont tartalmazott alacsony kopiaszamban, es vázlatosan bemutatjuk a 3.A ábrán. A pAN004 nukleotidszekvenciáját bemutatjuk 93. számú szekvenciaként. A pAN006 P26-promótert, RBS2-t és replikont tartalmazott közepes kópiaszámban, és vázlatosan bemutatjuk a 3.B ábrán. A pAN006 nukleotidszekvenciáját bemutatjuk 94. számú szekvenciaként. A panBCD nukleotiszekvenciáját bemutatjuk 59. számú szekvenciaként, és PanB, PanC és PanD levezetett aminosav-szekvenciáit bemutatjuk 24., 26. illetve 28. számú szekvenciaként. Bacillus törzsek manipulálására szolgáló módszereket leírt például Harwood, C. R. és Cutting, S. M. (szerk.), „Molecular Biological Methods for Bacillus (1990) című könyvben, John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, England, amelynek tartalmát a kitanítás részének tekintjük.
2. példa
Panto-vegyületek fokozott mértékű termeltetése panEl-génterméket, azaz ketopantoát reduktázt túltermelő baktériumok alkalmazásával
74.365/BE
119
Ebben a példában leírjuk B. subtilis panEl-gén klónozását és panEl-génterméket túltermelő mikroorganizmusok előállítását.
Pan’ B. subtilis törzseket (például pantoténsav szintézisében blokkolt B. subtilis mutánsokat) régebben már izoláltak, amelyek közül egyről leírták, hogy ketopantoát reduktáz-aktivitása befolyásolva van [ Baigori et al., J. Bacteriol. 173, 4240-4242 (1991)] . Azonban a mutációk ebben a törzsben helytelenül voltak térképezve a B. subtilis genetikai térképén a purE-tre intervallumhoz, amely nem tartalmaz panE- vagy panBCD-géneket. Továbbá a lentebb kimutatottak szerint, panE-mutáns nem rendelkezik Pan’ fenotípussal, mivel az ilvC-géntermék képes helyettesíteni a panE-génterméket B. subtilisben, és más baktériumtörzsben, például E. coliban is. A közelmúltban S. typhimurium panE-gént apbA-hez lokalizálták és alléljaként határozták meg, amely olyan gén, amelyre anaerob purin bioszintézisben van szükség [ Frodyma et al., J. Biol. Chem. 273, 5572-5576 (1998)] . E. coliban nagymértékben homológ gén van ugyanezen a térképezési helyen. A panE-gének azonosítása E. coliban és S. typhimuriumban bonyolult volt amiatt, hogy az ilvC-géntermék, aceto-hidroxisav izomeroreduktáz képes ketopantoát reduktáz reakciót is katalizálni. Ennek eredményeként pantotenát-auxotrófhoz csak úgy jutunk, ha panE-t és ilvC-t is mutáljuk.
B. subtilis panEl-gén azonosítása céljából, a B. subtilis genomot E. coliból vagy S. typhimuriumból származó ApbA (PanE) fehérjeszekvencia alkalmazásával vizsgáltuk, és két nyitott leolvasási fázist azonosítottunk, amelyek homológok ApbA-val, jelölésük ylbQ és ykpB. Ezeket a gének átneveztük panEl-nek és
74.365/BE
120 panE2 nek amiatt, mert fetételezhetően a pantotenát bioszintézisben funkcionálnak. Mind panEl-t, mind panE2-t PCR-termékekként klónoztuk, amelyben RL-1 genomi DNS-t alkalmaztunk templátként. Mindkét gént megszakítottuk sztreptomicin-rezisztencia-génnel (spec) vagy klóramfenikol-rezisztencia-génnel (cat). A megszakított géneket dupla „crossover-el integráltuk PY79-be, így jutottunk PA240-hez (ApanEl:: spec) és PA241-hez (ApanE2:: cat) . Ezek közül egyik törzs sem volt pantotenát£
-auxotróf, pantotenát-mentes (PF) tálcákon tesztelve, bár a ApanEl::spec-et tartalmazó PA240 kissé lassabban növekedett TBAB-on hozzáadott pantotenát nélkül, mint 1 mM pantotenát kiegészítéssel. Összehasonlításképpen, ApanB:: spec—et tartalmazó törzs esetén nem alakult ki egy kolónia sem TBAB—on, valószínűleg amiatt, hogy B. subtilis nem rendelkezett pantotenátot aktívan felvenni képes rendszerrel.
Feltételezzük, hogy a B. subtilisből származó ilvC-gén panEként képes működni, amit E. coliban már kimutattak. Ennek megfelelően, bevittünk panEl- és panE2-megszakításokat CU550-törzsbe, amelyről leírták, hogy trpC2 ilvC4 leuC124. Az egyedüli panElmegszakítást, és a dupla, panEl-panE2-megszakításokat tartalmazó törzsek pantotenát-auxotrófok voltak PF-táptalajon.
74-365/BE
121
3. táblázat.
Különböző panEi- és panE2-mutánsok fenotípusai gazdag és defini ált tápközegben.
Törzs Tápközeg Növekedés*
-pan +pan
PY7 9 TBAB +++ +++
PF ++ ++
PA240 TBAB spec + +++
PF ++ ++
PA241 TBAB cam +++ +++
PF ++ ++
CU550 TBAB + + + + + +
PF ++ ++
PA256 TBAB spec +++
PF ++
PA258 TBAB spec,cam + + +
PF ++
*Az egyes jelek körülbelül 1 mm kolónia-átmérőnek felelnek
meg egy éjszakás, 37°C-os inkubális után.
Tehát panEl és ilvC mutációja egyaránt pantotenát-auxotrófiát eredményez, míg csak panEl mutációja nem, hasonlóan ahhoz, amit leírtak E. colira és S. typhimuriumra.
Ezután vizsgáltuk panEl és panE2 ki nem fejeződésének hatását pantotenátot túltermelő törzsekben (a leírás szerinti PA235-ben). A PA235-ben lévő panEl- és panE2-génekbe, egyikbe vagy mindkettőbe megszakításokat vittünk PA235-ben, PA245 (ApanEl:: spec), PA248
74.365/BE
122 (ApanE2:: cat) és PA244 (ÁpanEl:: cat, ApanE2:: spec) előállítása céljából. Azután teszteltük az egyes mutációk hatását pantotenát-termelésre kémcsőben végzett, folyékony tenyészetekben.
4. táblázat.
Pantotenát termelés panEl- és panE2-megszakításokat tartalmazó PA235-származékokkal
Törzs [ pan] mg/1 % PA235
PA2 35 990 (100)
PA235 940 95
PA245 59 8
PA2 45 82 8
PA2 4 8 1060 106
PA24 8 1030 104
PA244 25 3
PA2 44 50 5
Tehát, deléciós analízis azt mutatta, hogy a panEl-gén több, mint 90%-ban járult hozzá a pantotenát-termeléshez, míg panE2 deléciójának nem volt szignifikáns hatása a pantotenát-termelésre. Tehát azt a következtetést vonhatjuk le, hogy leginkább panEl felelős, de nem szükségszerűen teljes mértékben B. subtilisben lévő ketopantoát reduktáz-aktivitásért. A ketopantoáz reduktáz-aktivitás maradék részét előreláthatóan ilvC biztosítja.
Annak azonosítása után, hogy panEl—gén fontos szerepet játszik pantotenát-termelésben, fokozott mértékű panEl-expressziót teszteltük annak meghatározása céljából, hogy képes-e panto74.365/BE
123 tenát-termelést fokozni törzsekben, például PA221-ben vagy PA235-ben. A panEl-et kódoló szekvenciát bevittük a P26-tól és RBS2-től szintézisirányban, pOTP61-vektorba, amelyet bpr-lókusznál (nem-esszenciális proteáz-gén) vagy a klónozott inszertum lókuszához való integrálásra és amplifikálásra terveztünk. Az eredményül kapott pAN236-plazmidot (4. ábra) PA221-be transzformáltuk, 15 mg/1 tetraciklin-rezisztenciára szelektáltunk. A pAN236 nukleotidszekvenciáját bemutatjuk 77. számú szekvenciaként. Az egyik transzformánst, PA236-ot kiválasztottuk további vizsgálatok céljára.
Kimutattuk, hogy PA236 túltermelt egy körülbelül 31.000 dalton méretű fehérjét, amely közel áll a panEl-fehérje várható, 33.290 daltonos molekulatömegéhez. Röviden összefoglalva, sejtextraktumokat preparáltunk PY79-, RL-1-, PA221-, PA221/pOTP61és PA236- (2 minta) sejtekből. A sejtextraktumokat gélelektroforézissel elválasztottuk, és a géleket megfestettük Coomassieval, a fehérjék láthatóvá tétele céljából. Azokban a sejtekben, amelyek géntechnológiailag panE túltermelésére lettek módosítva (PA236-1 és PA236-2), egy olyan csík volt látható, amelynek molekulatömege körülbelül 31.000 dalton volt (molekulatömegmarkerekhez viszonyítva). Továbbá, PA221 és PA236 fokozott mértékben expresszált egy 29.000 dalton molekulatömegű csíkot, amely megfelelt panB-génterméknek, és egy körülbelül 39.000 dalton molekulatömegű csíkot, amely feltételezhetően megfelelt panC-génterméknek. Továbbá, pAN006-al transzformált E. coli olyan csíkokat expresszált, amely panB- és panC—géntermékekkel van korrelációban, és pAN236-al transzfektált E. coli körülbelül
74.365/BE
124
31.000 dalton molekulatömegű csíkot expresszált, ami megfelel panE-génterméknek.
Ezután PA236-ot összehasonlítottuk az üres pOTP61-vektort tartalmazó PA221-el pantotenát-termelés szempontjából, 5 g/1 β-alaninnal és 5 g/1 α-KIV-el kiegészített kémcsőben végzett, folyékony tenyészetekben.
5. táblázat.
panEl és panE2 túltermelésének hatása pantotenát-termelésre géntechnológiailag módosított törzsekben, kémcsőben végzett, folyékony tenyészetekben.
Törzs További plazmid Túltermelt gén Pantotenát (mg/1)
PA221 pOTP61 nincs 1000
940
PA236 pAN236 panEl 2030
2050
PA238 pAN238 panE2 530
680
A panEl túltermelése kétszeres növekedést idézett elő pantotenát-termelésben, a szülői törzshöz hasonlítva (például kissé 2 g/1 fölött), míg panE2 túltermeltetése olyan törzset eredményezett, amely körülbelül 35%-al kevesebb pantotenátot termelt, mint a szülői törzs. A panEl nukleotidszekvenciáját és levezett aminosav-szekvenciáját bemutatjuk 29. és 30. számú szekvenciaként.
74.365/BE
125
3. példa
Panto-vegyületek túltermeltetése panEl-et vagy panBCD-t túltermelő baktériumok tenyésztésével valin jelenlétében
Annak vizsgálata céljából, hogy a valin képes-e tápközegkiegészitésként funkcionálni (például a-KIV-et helyettesíteni), a panBCD-operont és panEl-et túltermelni képes, géntechnológiailag módosított törzseket vizsgáltunk. Valin közeli szerkezeti rokonságban van α-KIV-el transzamináció útján, olcsóbb, mint az α-KIV, és kereskedelmi forgalomban kilogrammos méretekben áll rendelkezésre. Valinnal helyettesítettünk a-KIV-et SVY-tápközegben, kémcsőben végzett, folyékony tenyészetekben. A valin koncentrációját 5 és 50 g/1 között változtattuk. Bár 5 g/1 valin alig kisebb mértékben volt hatékony, mint α-KIV pantotenát-termelés elősegítésére, 10 vagy 20 g/1 azonos vagy nagyobb mértékben elősegítette a pantotenát-termelést, mint 5 g/1 a-KIV.
4-10. példák
Pantotenátot prekurzor-független módon termelni képes mikroorganizmusok előállítása
B. subtilis törzsekhez, például PA221- és PA235-törzsekhez (géntechnológiailag módosított panBCD túltermelésére) és PA236törzshöz (géntechnológiailag módosított panBCD és panEl túltermelésére) tápanyagként α-keto-izovalerátot (a-KIV-et) (vagy valin) és aszpartátot (vagy β-alanint) szükséges adagolni a maximális pantotenát-termelés elérése céljából, mivel mindkét prekurzor limitáló pantotenát szintéziséhez. Ennek megfelelően, manipulált mikroörganzimusokat terveztünk annak eliminálása céljá
74.365/BE
126 ból, hogy a pantotenát-bioszintézis limitáló prekurzorait adagolni kelljen pantotenát-termelés során. Ezek a törzsek hasznosan alkalmazhatók különböző, pantotenát bioszintetikus folyamatsorban lévő intermedierek előállítására.
4. példa
Pantotenátot aszpartát-(vagy β-alanin)-független módon termelni képes mikroorganizmusok előállítása
A panD-gént pOTP61-jelű, B. subtilis expressziós vektorba klónoztuk, így előállítottunk pAN423-at (5. ábra). pAN423 nukleotid-szekvenciáját bemutatjuk 78. számú szekvenciaként. panD-t tartalmazó, NotI restrikciós fragmentumot izoláltunk pAN423-ból, önligáltuk és PA221 transzformálására alkalmaztuk. Tet15-re, Tet3D-ra és Tet60-ra rezisztens transzformánsokat izoláltunk, és megőriztük azokat további analízisre.
Hat pAN423-transzformánst plusz két kontroll transzformánst növesztettünk 5 g/1 α-KIV-et tartalmazó SVY-ben, 10 g/1 aszpartáttal vagy anélkül, és azután pantotenát-termelésre vizsgáltuk (6. táblázat).
74.365/BE
127
6. táblázat.
PanD túltermelésének hatása pantotenát-termelésre, hozzáadott aszpartáttal és anélkül.
Tenyészet* PA221-transzformánsok Asp (10 g/1) TetR** (μg/ml) od550 Pan. (mg/1)
pOTP61-l - 60 8, 0 76
pOTP61-2 - 60 7,7 91
423#1-1 - 15 8,5 180
423#l-2 - 15 8, 0 150
423#l-3 - 30 8, 3 220
423#l-4 - 30 8, 5 280
423#l-5 - 60 8, 9 580
423#l-6 - 60 8, 8 280
Tenyészet* PA221-transzformánsok Asp (10 g/1) TetR** (gg/ml) OD550 Pan. (mg/1)
pOTP61-l + 60 7, 5 380
pOTP61-2 + 60 6, 9 560
423#1-1 + 15 8, 5 1200
423#l-2 + 15 8, 6 1000
423#l-3 + 30 8, 8 1200
423#l-4 + 30 9,0 1200
423#l-5 + 60 9, 0 1200
423U-6 + 60 9, 0 1200
*Kémcsőben végzett tenyészetek, amelyek esetén SVY + a-KIV (5 g/1) plusz Asp-vel (10 g/1) növesztettünk.
**TetR = A transzformáns megközleítő Tet-rezisztenciája.
74.365/BE
128
A pAN423-transzformánsok legalább kétszer akkora mennyiségű pantotenátot termeltek, mint a kontrollok (azaz annyit, mint amelyet korábbi kísérletekben kaptunk β-alanin tenyészethez való hozzáadásakor). Az adatok azt is mutatják, hogy hozzáadott aszpartát nélkül, további kópia, panD-génnek megfelelő expreszsziós kazettát tartalmazó transzformánsok több pantotenátot termelnek, mint a kontroll transzformánsok. Az egyik transzformáns, a 423#l-5, körülbelül ötször több pantotenátot termelt, mint a kontrollok. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy megnövekedett mennyiségű PanD-fehérje „húzza a rendelkezésre álló aszpartát konverzióját β-alanin felé, és hogy a megnövekedett mértékű panDgénexpresszió eredményezheti a pantotenát-termelés fokozódását hozzáadott aszpartát jelenlétében és anélkül egyaránt.
A 423#l-5-transzformánst átneveztük PA401-törzsre, és tovább vizsgáltuk rázott lombikos fermentációkban. A rázott lombikban alkalmazott tápközeg maltózt tartalmazó SVY volt, glükózt tartalmazó SVY helyett. A rázott lombikos kísérletek eredményei jól egyeztek a kémcsőben végzett kísérletekkel az első 24 órában. Rázott lombikos kísérletekben, β-alanin hozzáadása nélkül, PA401 körülbelül 1,5 g/1 pantotenátot termelt 24 óra alatt. A tenyészet tápközegéhez β—alanin hozzáadása nem növelte tovább a titereket (7. táblázat), ami azt mutatta, hogy ezekkel a törzsekkel és ilyen fermentációs körülmények között, β-alanin nem limitáló pantotenát-termeléshez. Tulajdonképpen, ha nem adunk hozzá β-alanint, megfigyelhetjük, hogy PA401 szignifikáns mennyiségű β-alanint szekretál a tápközegbe.
74,365/BE
129
7. táblázat.
PA401-törzs (panD) rázott lombikos tenyészetei β-alaninnal és anélkül.
Aminosav (g/1) 24 órás
β-Ala kezdeti konc. β-Ala Val PH θΗ600 Pantotenát (g/1)
0 0,7 1,5 7, 5 13, 7 1,5
5 g/1 7,1 1,4 7, 6 12,4 1,5
Az egyes értékek megfelelnek két párhuzamosan kezelt, 250 ml-es, terelőlappal ellátott, rázott lombikból származó eredmény átlagának, amely lombikok 50 ml tápközeget tartalmaztak, 37°C-on rázatva (200 rpm) inkubáltuk azokat.
Alap-tápközeg: SVY 10 g/1 a-KIV-el és 30 g/1 maltózzal 2% oltóanyag: SVY Tet15-el, 24 óra hosszáig növesztve
5. példa
A panD-gén géntechnológiai módosítása, aszpartát dekarboxiláz szintézisének további fokozása és pantotenát fokozott termeltetése céljából
Ebben a példában leírjuk javított riboszóma-kötőhelyek (RBSek) előállítását a panD-génben, panD-mRNS transzlációjának fokozása céljából.
A panD-mRNS transzlációjának fokozása szintetikus panD-RBS-ek előállításával
A panD expresszálására pAN423-ban alkalmazott RBS (88. számú szekvencia) szintetikus RBS volt, es sikeresen alkalmaztuk már fehérjék nagy mennyiségű termeltetésére is B. subtilisben. Azonban
74.365/BE
130 hat, nem egyező bázist tartalmaz, ha az „ideális B. subtilis RBS (45. számú szekvencia) alá rendezzük (például olyan RBS alá, amely a B. subtilis riboszómájában lévő, 16S RNS szekvenciájávak komplementer) . (Lásd például l.B táblázatot, ahol a nem egyező bázisok vastagon vannak szedve.) Két új RBS-t terveztünk, amely strukturálisan nagyon közel áll az ideális RBS-hez. Ezen szintetikus RNS-ek elnevezése „new design-A (NDA) és „new design-B (NDB) (a leírásban RBS3-nak és RBS4-nek is jelöljük ezeket), szekvenciájukat bemutatjuk 51. és 52. számú szekvenciaként, és az ideális RBS alá vannak rendezve az l.B táblázatban.
Az egyes új RBS-ek felső és alsó szálainak megfelelő oligonukleotidokat szintetizáltunk, összehibridizáltuk azokat, azután pAN420-ban lévő RBS-t helyettesítettük ezekkel, így előállítottuk a pAN426— és pAN427-plazmidokat. Ezeket a konstrukciókat bemutatjuk a 6. ábrán. Az NDA- és NDB-RBS-ek jelenlétét pAN426-ban és pAN427-ben DNS-szekvencia-analízissel igazoltuk. Ezután pAN426ból és pAN427-ből származó panD-géneket B. subtilis pOTP61-jelű expressziós vektorba transzferáltuk a 7. ábrán bemutatottak szerint, így előllítottunk pAN428-at és pAN429-et. pAN429 nukleotid—szekvenciáját bemutatjuk 79. számú szekvenciaként.
E. coli vektorszekvenciákat nem tartalmazó, Notl-jelű restrikciós fragmentumokat izoláltunk pAN428-ból és pAN429-ből, önligáltuk és Tetis-re rezisztens PA221-törzs transzformálására alkalmaztuk azokat. Négy, TetL5-re rezisztens izolátumot kivettünk az egyes transzformációkból, és pantotenát- valamint β-alanin-termelésre vizsgáltuk azokat, az üres vektorral (pOTP61) transzformált PA221-el és pAN423-al (PA401) transzformált PA221el együtt (lásd a 8. táblázatot).
74.365/BE
131
8. táblázat.
pAN428-al és pAN429-el transzformált PA221 pantotenát-terme lésének meghatározása kémcsőben végzett tenyésztéssel.
Plazmád Tápközeg kiegészítése θ ^550 Pan g/ι β-Ala g/i
pOTP61 a-KIV5 10 UND 0, 04
pAN423 a-KIV5 10 0,4 0, 04
pAN428-l* a-KIV5 12 0,6 0, 04
pAN428-2 a-KIV5 11 0,5 0, 03
PAN428-3 a-KIV5 11 0, 3 0, 03
pAN428-4 a-KIV5 10 0, 1 UND
pAN429-l a-KIV5 12 0, 6 0, 04
pAN429-2 a-KIV5 11 0,5 0,04
pAN429-3 a-KIV5 11 0,6 0, 05
pAN429-4# a-KIV5 12 0, 8 0,10
pOTP61 a-KIV5 + Asp10 11 0,5 0, 08
pAN423 a-KIV5 + Asp10 12 0, 9 1,32
pAN428-l* a-KIV5 + Asp10 12 0, 8 1, 97
pAN428-2 a-KIV5 + Asp10 12 0, 8 1,51
pAN428-3 a-KIV5 + Asp10 12 0, 9 1,02
pAN428-4 a-KIV5 + Asp10 11 0,8 0,30
pAN429-l a-KIV5 + Asp10 12 0, 8 1,78
pAN429-2 a-KIV5 + Asp10 12 0, 8 1,66
pAN429-3 a-KIV5 + Asp10 12 0, 8 1,78
pAN429-4# a-KIV5 + Asp10 13 0, 8 2,28
UND: a detekciós limit alatt van. *Átnevezve PA402-re. # Átne vezve PA403-ra.
Ha 5 g/1 a-KIV-el (a-KIV5) kiegészített tápközegben növesz
74.365/BE
132 tünk, a pAN428-l-transzf ormáns és mind a négy pAN429-transzformáns több pantotenátot termel, mint a PA401, ami alapján feltételezzük, hogy ezek a transzformánsok több aszpartát dekarboxiláz-aktivitást tartalmaznak. Ha a-KIV5-el és Asp10-el kiegészített tápközegben növesztünk, a pAN428- vagy pAN429-transzformánsok egyike sem termel több pantotenátot, mint a PA401. Azonban, a pAN428-l-transzformáns és mind a négy pAN429-transzformáns szignifikánsan több β-alanint termel, mint PA401. Lehetséges, hogy a hozzáadott aszpartátból termelődött, feleslegben lévő β-alanin a pantotenát-termelés gátlását okozza. Ezzel alternatív módon, β-alanin felhalmozódhat, mivel pantoát limitáló ezekben a törzsekben.
A legtöbb β-alanint termelő törzseket, a pAN428-l- és pAN4294-transzformánsokat átneveztük PA402-re illetve PA403-ra. Ezt a két törzset különböző intermedierekkel kiegészített SVY-tápközegben növesztettük, és újra vizsgáltuk pantotenát- és β-alanintermelésre. PA221-et és PA401-et alkalmaztunk kontrollként. A vizsgálati eljárások eredményeit bemutatjuk a 9. táblázatban.
74.365/BE
133
9. táblázat.
PA402 és PA403 pantotenát-termelésének meghatározása kémcsőben végzett tenyésztéssel.
Törzs Tápközeg kiegészítés od550 Pan g/i β-Ala g/1 Val g/1
PA221 a-KIV5 7,9 UND UND 0,9
PA4 01 a-KIV5 8,7 0,3 0,04 0, 9
PA402 a-KIV5 8,5 0,5 0,04 0,9
PA4 03 a-KIV5 9, 4 0,7 0, 07 0,9
PA221 a-KIV5 + Asp10 9,8 0,4 0,11 0, 8
PA4 01 a-KIV5 + Asp10 9, 1 0, 8 1,15 0, 8
PA402 a-KIV5 + Asp10 9,4 0, 8 2, 02 0, 8
PA403 a-KIVs + Asp10 9,7 0,7 2,40 0, 8
PA221 Pantoát5 8,9 UND UND 0,2
PA401 Pantoát5 8,7 0,3 0,02 0,2
PA402 Pantoát5 10, 6 0,3 0,02 0,2
PA403 Pantoát5 10,5 0,7 0,02 0,2
PA221 Pantoát5 + Asp10 9,5 0,4 0,06 0,2
PA401 Pantoát5 + Asp10 9,2 2,2 0,62 0,2
PA402 Pantoát5 + Asp10 9,1 2,8 1,17 0,2
PA403 Pantoát5 + Asp10 10,2 2,9 1,58 0,2
UND: a detekciós limit alatt van.
Ha a-KIV5-el vagy pantoáttal5 kiegészített tápközegben növesztünk, a PA402 és PA403 szignifikánsan több pantotenátot termel, mint PA401. Ugyanúgy, mint az előző esetben, ugyan PA402 és PA403 szignifikánsan több β-alanint termelt, mint PA401, ha a-KIV -el és Asp10-el kiegészített tápközegben növesztettük, azon
74.365/BE
134 ·/ :
ban mégsem termelt arányosan több pantotenátot. Ha viszont pantoát5 plusz Asp10-el kiegészített tápközegben növesztettünk, PA402 és PA403 egyaránt szignifikánsan több pantotenátot termelt, mint PA401, körülbelül 30%-os volt a növekedés.
Ezekből a kísérletekből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy javított NDA- és NDB-jelű panD-riboszóma-kötőhelyek pAN428ba illetve pAN429-be beépítve megnövekedett aszpartát dekarboxiláz-aktivitáshoz vezetett.
PanD-gén-mRNS transzlációjának fokozása panBCD-operonba beépített, szintetikus panD-RBS-ek előállításával
A natív B. subtilisből származó panD-gén riboszóma kötőhelyét (PBS) (4. számú szekvencia), amelyet a PA221-ben (és más, leírás szerinti, pantotenát-termelésre tervezett törzsekben) lévő P26panBCD-operon kazettában találhatunk, bemutatjuk az l.C táblázatban, az ideális riboszóma kötőhely (47. számú szekvencia) alá rendezve. Az egymás alá rendezésben kimutatunk nem egyező bázisokat a natív B. subtilisből származó panD-gén RBS-ben, amely PanC-t kódoló szekvenciában helyezkedik el, és az ideális RBS között. Előállítottunk három új RBS—t (a P26-panBCD—operon kazettában) a panD-gén-mRNS transzlációjának fokozására, és aszpartát dekarboxiláz fokozott mértékű szintézisének elérése céljából. Ezek a szintetikus RBS-eket (jelölésük NDI, NDII és NDIII, melyeket a leírásban RBS5-, RBS6- illetve RBS7-ként is jelölünk) bemutatjuk 55., 56. illetve 57. számú szekvenciaként, ezeket felsoroljuk az l.C táblázatban. Meg kell jegyeznünk, hogy bár a panBCD-operonban lévő, panD-RBS-ben létrejött változtatások megváltoztatják az operon által kódolt PanC-fehérje amino
74,365/BE
135 sav-szekvenciájának C-terminálisát is, ismert és feltételezett PanC-fehérjék aminosav—szekvenciáinak egymás alá rendezésével kimutattuk, hogy a B. subtilis PanC—fehérje utolsó kilenc amino— savát alkotó szekvencia megváltoztatható anélkül, hogy az ilyen változtatások befolyásolnának bármilyen konzervatív aminosavat, így a változtatásoknem csökentik a pantotenát szintetáz aktivitását vagy expresszióját. Az új RBS-eket megszintetizáltuk és beépítettük a P26anBCD-operon expressziós katettába az alábbiak szerint.
Először PCR-primereket terveztünk, amelyek az alábbi elemeket tartalmazták: (1) panD első öt aminosavát kódoló nukleinsav-szekvencia, amely továbbá egyedi BsiWI-jelű restrikciós hasíthelyet tartalmazott, melyet előzőleg bevittünk panD-génbe PCR-el; (2) stop-kódont panC-génhez; (3) legalább egy szintetikus RBS-t; és (4) 30-39 bp méertű nukleinsavszekenciát, amely 100% azonossággal rendelkezik a panD-RBS-től szintézisiránnyal szemben lévő panC-vel. A primerek jelölése TP102, TP103 és TP104, és NDI, NDII illetve NDIII riboszóma-kötőhelyeket tartalmaztak. Ezt a három prímért az 5'-TPlOl-primerrel együtt alkalmaztuk, amely panC start-kódonjához képes hibridizálódni, három független PCR-reakcióban, NDI-, NDII- és NDIII-jelű PCR-termékek előállítására. A PCR-termékeket tisztítottuk, Xbal-enzimmel emésztettük, azután előzőleg Xbal/Smal-enzimekkel emésztett, pASK-lB3-plazmidvektorba klónoztuk. Az eredményül kapott plazmidok jelölése: pAN431, pAN432 és pAN433. A pAN431-konstrukciót bemutatjuk a 8. ábrán, és ez reprezentatív példaként szolgál mindhárom plazmidkonstrukcióra. A kívánt, szintetikus panD-RBS jelenlétét az
74.365/BE
136 egyes új plazmidokban DNS-szekvenálással igazoltuk.
Ezután az új panD-RBS-eket tartalmazó, módosított panC-géneket a panD-génhez kapcsoltuk az egyedi BsiWI-jelű restrikciós hasítóhely felhasználásával. Ezt úgy végeztük, hogy pAN431, pAN432- és pAN433-ból származó, megfelelő Nsil/BsiWI-jelű restrikciós fragmentumokat izoláltunk, és pAN420-ból származó, 2395 bp méretű, Nsil/BsiWI-jelű restrikciós fragmentummal ligáltuk, amely biztosította a BsiWI-módosított panD-gént. Ezekkel a konstrukciókkal pAN441-, pAN442- illetve pAN443-plazmidokhoz jutottunk. Eyg reprezentatív konstrukciót (pAN441) bemutatunk a 9. ábrán. A pAN443-nukleotidszekvenciát bemutatjuk 80. számú szekvanciaként.
Azután az új panD-gén RBS-ket a P26panBCD-operon expressziós kazettába szubsztituáltuk az alábbiak szerint. Először előállítottunk egy deléciós-inszerciós mutánst, amelyben eltávolítottuk a panC-génnek azt a régióját, amely panD-RBS-t tartalmazott. Ezt úgy állítottuk elő, hogy pAN430-al emésztettünk BspEl/BglII-enzimkeverékkel, és elkülönítettük a 4235 bp méretű fragmentumot, amelyből most hiányzott a panC-gén 3' -vége és a panD-gén 5' -vége. Ezt a fragmentumot pECC4—plazmidból származó, Aval/BamHI-jelű restrikciós fragmentummal ligáltuk, amely kloramfenikol acetiltranszferáz-gént (cat-gént) tartalmazott. Az Aval-emésztéssel létrehozott 5' -hosszabbítás kompatibilis azzal, amit BspEI-el állítottunk el, míg a BglII/BamHI-hosszabbítások szintén kompatibilisek. Az eredményül kapott plazmid jelölése pAN440 volt, és előállítását a 10. ábrán szemléltetjük.
Az eredményül kapott deléciós-inszerciós mutánst P26panBCD
74,365/BE
137
-operonba kereszteztük homológ rekombinációval úgy, hogy PA221et transzforrnáltünk linearizált pAN440—el, és klóramfenikol— -rezisztenciára szelektáltunk 1 mM pantotenátot tartalmazó Cam5-tálcákon. Számos transzformánst teszteltünk, és valamennyi esetén azt találtuk, hogy a várakozásnak megfelelően, 1 mM panto— tenátra volt szüksége növekedéséhez. A transzformánsok közül kettőt átneveztünk PA408A-ra és PA408B-re, és pantotenát-termelésre vizsgáltuk. Egyik törzs sem szintetizált mérhető mennyiségű pantotenátot, még akkor sem, ha pantoátot és β-alanint (5 g/1) tartalmazó, növesztési tápközegben növesztettük, ami azt mutatta, hogy a törzsek deficiensek pantotenát szintetáz-aktivitásra. Ezután az új panD-RBS-ket P26panBCD-operonba kereszteztük úgy, hogy PA408-at transzformáltunk linearizált pAN441-, pAN442- és pAN443-plazmid-DNS-el, és pantotenát-kiegészités nélkül szelektáltunk TBAB-tálcákon való növesztéssel. Kontrollként linearizált pAN430-al (amely natív panD-RBS-t tartalmazott) transzformáltunk, és azt vártuk, hogy a leírt PA221-al azonos transzformánsokhoz jutunk. Az egyes transzformációkból négy izolátumot vizsgáltunk pantotenát- és β-alanin-termelésre, különböző intermedierekkel kiegészített SVY-tápközegben (10. és 11. táblázat).
74.365/BE
138
10. táblázat.
PA410-PA413 pantotenát termelése kémcsőben végzett tenyészetek kel tesztelve.
Törzs RBS Tápközeg od550 Pan β-Ala
kiegészítés g/i g/i
PA221 natív Pantoát5 11 UND UND
PA410-1 NDI Pantoát5 12 UND UND
PA410-2 Pantoát5 12 UND UND
PA410-3 Pantoát5 12 UND UND
PA410-4 Pantoát5 12 UND UND
PA411-1 NDII Pantoát5 12 UND
PA411-2 Pantoát5 12 UND
PA411-3 Pantoát5 12 UND
PA411-4 Pantoát5 12 UND
PA412-1 NDIII Pantoát5 12 UND
PA412-2 Pantoát5 11 UND
PA412-3 Pantoát5 13 UND
PA412-4 Pantoát5 12 UND
PA413-1 NDIII Pantoát5 12 UND
PA413-2 Pantoát5 12 UND
PA413-3 Pantoát5 12 UND
PA413-4 Pantoát5 12 UND
UND: a detekciós limit alatt van.
74.365/BE
139
11. táblázat.
PA410 PA413 pantotenát termelése kémcsőben végzett tenyészetekkel tesztelve.
Törzs RBS Tápközeg 0^550 Pan g/i β-Ala g/i
kiégés zí tés
PA221 natív Pantoát5 + Asp10 11 0, 3 UND
PA410-1 NDI Pantoát5 + Asp10 12 0,4 UND
PA410-2 Pantoát5 + Asp10 12 0, 4 UND
PA410-3 Pantoát5 + Asp10 12 0, 4 UND
PA410-4 Pantoát5 + Asp10 12 0,4 UND
PA411-1 NDII Pantoát5 + Asp10 13 1,7 0,4
PA411-2 Pantoát5 + Asp10 13 1,7 0,4
PA411-3 Pantoát5 + Asp10 13 1,8 0,3
PA411-4 Pantoát5 + Asp10 13 0, 4 UND
PA412-1 NDIII Pantoát5 + Asp10 13 0,4 UND
PA412-2 Pantoát5 + Asp10 12 0,4 UND
PA412-3 Pantoát5 + Asp10 12 1,6 0, 3
PA412-4 Pantoát5 + Asp10 12 1,5 0,2
PA413-1 NDIII Pantoát5 + Asp10 13 1,6 0, 3
PA413-2 Pantoát5 + Asp10 13 1,6 0,4
PA413-3 Pantoát5 + Asp10 13 1,7 0,4
PA413-4 Pantoát5 + Asp10 13 1,7 0,4
UND: a detekciós limit alatt van.
Az előző, PA221-el végzett kísérletek alapján várható volt, hogy a natív panD-RBS-t tartalmazó, egyik transzformáns sem termel mérhető mennyiségű pantotenátot, ha pantotenáttal kiegészí
74.365/BE
140 tett tápközegben növesztjük azokat. Azonban a 12 transzformáns közül kilenc esetén várható volt, hogy módosított panD-RBS-t tartalmaz, amelyek szignifikáns mennyiségű pantotenát (160-230 mg/1) termeltek ilyen körülmények között, ami azt mutatja, hogy fokozott mennyiségű aszpartát dekarboxiláz-aktivitást tartalmaznak. Ha pantoáttal és aszpartáttal kiegészített tápközegben növesztünk, akkor ugyanez a kilenc transzformáns körülbelül négyszer több pantotenátot termel, mint azok, amelyek a natív panDRBS-t tartalmazzák. Továbbá, ez a kilenc transzformáns mérhető mennyiségű β-alanint (230-410 mg/) akkumulál. Valamennyi transzformáns durván ekvivalens mennyiségű pantotenátot termel, ha pantoátot és β-alanint tartalmazó tápközegben növesztjük, ami azt mutatja, hogy minden transzformáns funkcionális pantotenát szintetázt tartalmaz.
Ezek az adatok azt mutatják, hogy szintetikus panD-RBS-ek körülbelül négyszer hatékonyabbak, mint a natív panD-RBS a panDgénnek megfelelő mRNS transzlációjának vezérlésében, és bizonyítják ilyen szintetikus RBS-ek használhatóságát pantotenáttermelés fokozására. Pantotenát-termelés fokozására szolgáló további megközelítés lehet, például a panD-génnel megfelelő mRNS fél-életidejének növelése, panD transzkripciójára szolgáló promoter erősségének növelése és/vagy a panD-fehérje stabilitásának fokozása.
6. példa
Integrált P26panEl-kazettát antibiotikum-rezisztencia-gén nélkül tartalmazó törzsek előállítása
74.365/BE
141
A 2. példában leírtuk olyan enzimet kódoló B. subtilis panElgén azonosítását, amely a ketopantoát reduktáz-aktivitás nagyobb részéért felelős B. subtilisben. PA236 (a pAN236-plazmidot tartalmazta) körülbelül kétszer több pantotenátot (2 g/1) termel, mint a szülői PA221-törzs (1 g/1), 24 órás, kémcsőben végzett SVY-tenyészetekben. PA236 valószínűleg amplifikált (körülbelül 3 kópia) integrált pAN236-plazmidot tartalmazott, tetraciklinrezisztenciára való szelekcióra alapozva (a tetR-génterméket a pAN236-plazmid kódolta, a P26panEl-kazettán kívül). A találmány szerinti eljárásokban olyan törzsek is hasznosan alkalmazhatók, amelyek egyetlen integrált, amplifikálhatatlan P26panEl-kópiát tartalmaznak a panEl-lókusznál, például a törzsben antibiotikumrezisztencia-gén nélkül. Ilyen törzset az alábbiak szerint állítunk elő.
A pAN251-plazmid pAN236-ból származott úgy, hogy további kromoszómális szekvenciákat inszertáltunk a P26panEl-kazettától közvetlenül szintézisiránnyal szemben és közvetlenül szintézisirányban. Ezek a hozzáadott szekvenciákat, amelyek homológiát biztosítottak, lehetővé téve a P26panEl-kazetta integrálását panEl-nél dupla „crossing over-el, PCR-el állítottuk elő, templátként kromoszómális DNS-t alkalmazva. A pAN251-et bemutatjuk a 11. ábrán. A pAN251 nukleotidszekvenciáját bemutatjuk 81. számú szekvenciaként.
Ezután olyan törzset állítottunk elő, amely lehetővé tett szelekciót a bekerülő P26panEl-kazetta számára. A törzs az alábbi három komponenst tartalmazta: (1) P26panBCD; (2) ApanEl; és (3) ilvC, mivel panEl-t és ilvC-t egyaránt mutálni kell Pan
74,365/BE
142 fenotípus előállítása céljából. A kiindulási törzs a CU550-törzs volt (trpC2, ilvC4, leuC124). PA221 kromoszómális DNS-ből származó P26panBCD-kazettát két lépésben vittük be a PA290—törzsbe. Ezután a ApanEl::spec-et PA290-be transzformáltuk, PA240-törzsből származó kromoszómális DNS alkalmazásával, így jutottunk a PA294-törzshöz (trpC2, ilvC4, leuC124, P26panBCD, ApanEl:: spec), amely szigorúan pantotenát-auxotróf volt. Végül, PA294-et transzformáltunk pAN251-plazmiddal, pantotenát-prototrófiára szelektáltunk, így jutottunk PA303-törzshöz. Azt vártuk, hogy trpC2, ilvC4, leuC124, P26panBCD, P26panEl genotípussal rendelkezzen. PA303-at ellenőriztük a pontos kromoszómális struktúrára nézve a panEl-lókusznál PCR-el, olyan primerek alkalmazásával, amelyek a panEl-et közvetlenül szintézisiránnyal szemben lévő P26 inszerciót szegélyezték. PA303-ból származó PCR-termék a várt méretű volt, egyidejűleg elvesztettük a vad típusú panEl-génből származó PCR-terméket, ami összhangban van azzal, hogy valóban megtörtént a kívánt dupla „crossing over. PA303 továbbá tetraciklin-szenzitív volt, amely szintén összhangban van a kívánt dupla „crossing over eseménnyel, ellentétben plazmidok kromoszómába történő Campbell—típusú egyszeri „crossing over eseményével. A szülői törzsből származó trp-, ilv- és leuauxotrófiákat mind PA303-ban tartottuk fent.
órás, kémcsőben végzett, SVY-tenyészetekben, PA303 majdnem ugyanannyi pantotenátot termelt, mint a PA236 pozitív kontroll, és körülbelül kétszer annyit, mint PA221, amely nem tartalmazott géntechnológiailag módosított panEl-et, a 12. táblázatban bemutatottak szerint.
74.365/BE
143
12. táblázat.
PA303 és kontrollok pantotenát-termelése 24 órás, kémcsőben vég zett tenyészetekben, 5 g/1 α-KIV-et és 5 g/1 β-alanint tartalmazó
SVY-tápközegben növesztve.
Törzs od600 [ pan] g/1
PA221-1 10, 9 0,85
PA221-2 10,5 0,85
PA236-1 9,5 1, 74
PA236-2 9, 3 1,70
PA303-1 10,8 1, 66
PA303-2 10,7 _________ 1, 61
7. példa
Pantotenátot α-KIV- (vagy valin-) független módon termelni képes mikroorganizmusok előállítása
Az a-ketoizovalerát (α-KIV) a pantotenát-termelés sebességmeghatározó intermediere bizonyos törzsekben, amelyek dereguláltak pantotenát-szintézisre. α-KIV vagy valin hozzáadása 5 g/1 koncentrációban körülbelül ötszörösére fokozza a pantotenát-termelést kémcsőben végzett tenyészetekben olyan törzsekkel, mint PA221. Abból a célból, hogy csökkentsük α-KIV vagy valin adagolásának szükségességét, olyan törzseket hoztunk létre géntechnológiai módosítással, amelyek fokozott mértékben képesek szintetizálni a-KIV-et.
B. subtilisben α-KIV piruvátból szintetizálódik három, egymás után működő enzim segítségével, amelyeket négy gén kódol, ilvB és ílvN, ilvC és ilvD. A vad típusú B. subtilisben, a négy 74.365/BE
144 közül három gén (ilvB, ilvN és ilvC) a nagy ilv-leu-operon első három génje. A negyedik gén, ilvD, amely α-KIV szintéziséhez szükséges, a kromoszómán máshol helyezkedik el. Feltételezzük, hogy a B. subtilis ilv-leu-operont csak a leucin-szintek szabályozzák. Exogén leucin hozzáadása körülbelül tizenhármadéra csökkenti az ilv-leu-operon transzkripciójának mértékét, valószínűleg a mechanizmus gyengítésével [ Grandoni et al., J. Bacteriol. 17 4, 3212-3219 (1992)] . Az egyetlen ismert feedbackszabályzás az ilv-leu-folyamatsorban a leuA-géntermék gátlása leucinnal.
α-KIV-szintézis deregulálásának első lépése az, hogy vad típusú B. subtilis ilv-leu-operonból származó ilvBNC-régiót PCR-el izoláljuk, és a P26-promóter és az RBS2 mellé építjük pOLL8vektorban, amelyet úgy terveztünk, hogy egyetlen P26 expressziós kazettaként képes integrálódni dupla rekombinációval az amyElókusznál. Az amyE-gén nem-esszenciális α-amilázt kódol, és alkalmas lokusz expressziós kazetták elhelyezésere. Az eredményül kapott pAN267-plazmidot bemutatjuk a 12. ábrán. A pAN267 nukleotid-szekvenciáját bemutatjuk 82. számú szekvenciaként. A pAN267 könnyen létrejön stabil plazmid dupla „crossing over-el B. subtilis törzsek amyE —lókuszanál, lentebb részletesen leírtak szerint.
Leucin-prototróf, pantotenátot túltermelő törzsek előállítása
Először ilvC4-et és ApanEl-et tartalmazó B. subtilis törzset alkalmaztunk egy kópia P26panEl kromoszómába való bevitelére, antibiotikum-rezisztencia-gén alkalmazása nélkül. A dupla mutánst szelektálni kellett a bejutott P26panEl-kazettára, mivel ApanEl
74,365/BE
145
-mutáció egymaga nem eredményez pantotenát-auxotrófiát. CU550-jelű törzshöz jutottunk, amely ilvC4-et tartalmazott, és alapként kívántuk alkalmazni ilyen típusú törzskonstruciókhoz. Azonban CU550 egy közel kapcsolódó leuC124-mutációt is tartalmazott, így CU550-törzsből származó törzsekhez szükség volt leucinra. Miután kimutattuk, hogy P26panBCD és P26panEl kombinációja kedvező volt pantotenát-termelésre, a következő lépésben új összeállítottuk ezt a két kazettát tartalmazó kombinációt egy leucinprototrófban.
Ennek megfelelően, a két kazettát két különböző törzs, RL—1 és PY79 által nyújtott háttérben kombináltuk. Kromoszómális P26panEl PY79- és RL-l-törzsek által biztosított háttérébe való bevitele céljából, antibiotikum-rezisztencia-gén alkalmazása nélkül, olyan stratégiát alkalmaztunk, amely nem ilvC4-re épült. [ A stratégiában kihasználtuk annak a megfigyelésnek az előnyét, hogy a ApanEl-mutáció pantotenát-braditrófiát okoz, amely viszonyiga kevés kolonióban manifesztálódott TBAB (gazdag) tálcákon] . Először ApanB::cat-et és ApanE::spec-et bevittünk mindkét törzsbe. Ezután, az eredményül kapott törzseket egyidejűleg transzformáltuk két törzsből, PA221-ből (P26panBCD) és PA303-ból (P26panEl) származó DNS-el, (Pan+)-ra szelektáltunk TBAB-tálcákon. Két, megkülönböztethető méretű kolóniák növekedtek a szelektív tálcákon, a nagyobb méretű alkotta a kolóniák körülbelül 2%-át. A nagyobb méretű kolóniák feltételezhetően megfeleltek P26panBCDt és P26panEl-et egyaránt kapott transzformánsoknak, és a kisebb méretű kolóniák csak P26panBCD-et kapott transzformánsoknak. Ezzel a feltételezéssel összhangban, a nagyobb kolóniái elvesztet74.365/BE
146 ték Cam t és Specr t, míg a kisebb kolóniák csak a cat-gént vesztették el, és megtartották a spec-gént. Továbbá, egy PY7 9származékot képviselő törzs, PA327, és egy RL-l-származékot képviselő törzs, PA328 egyaránt megnövekedett mértékben termelt pantotenátot kémcsőben végzett tenyészetekben tesztelve, amelynek mennyisége körülbelül 1,6 és 1,7 g/1 volt (13. táblázat).
13. táblázat.
PA327, PA328 és kontrollok pantotenát-termelése 24 órás, kémcsőben végzett tenyészetekben, 5 g/1 a-KIV-et és β-alanint tartalmazó SVY-tápközegben növesztve.
Törzs Háttér P26panEl kópiaszám [ pan] g/1
PA221-1 RL-1 0 0,92
PA221-2 RL-1 0 0,95
PA236-1 RL-1 amplifikált(kb 3) 1,60
PA236-2 RL-1 amplifikált(kb 3) 1,73
PA327-1 PY79 1 1, 66
PA327-2 PY79 1 1, 65
PA328-1 RL-1 1 1,61
PA328-2 RL-1 _________________1 __________ ________1,91_______
Tehát levonhatjuk azt a következtetést, hogy PA327 és PA328 ^26PanBCD-t és P2epanEl-et egyaránt tartalmaz, és ezeket használtuk fel a lentebb leírt, további konstrukciókban. PCR-analízissel igazoltuk a két kazetta jelenlétét.
Stabil P26ilvBNC-kazetta beépítése kétféle eredetű, pantotenátot túltermelni képes törzsbe
74.365/BE
147
PA326 és PA328 előállítása után, amelyek P26panBCD-t és P26panEl-et tartalmazó, PY79 és RL-1 származékai, és amelyek (Leu+)-ak, a következő lépésben bevittük P26ilvBNC stabil kópiáit. Ezt úgy végeztük, hogy PA327-et és PA328-at transzformáltunk pAN267-plazmiddal, Specr-re szelektálva. PCR-es szűréssel kimutattuk, hogy az így kapott transzformánsok körülbelül 85%-a tartalmazott P26ilvBNC-t az amyE—nél, dupla „crossing over eredményeként. Az egyik PA327-transzformánst, amelynek jelölése PA340, és az egyik PA328-transzformánst, amelynek jelölése PA342, választottuk ki további vizsgálatra.
Kémcsőben végzett, 5 g/1 β—alanint tartalmazó (de hozzáadott α-KIV nélkül) SVY-tápközegben végzett tenyésztésben, a várakozásnak megfelelően, PA340 és PA342 egyaránt megnövekedett mértékben termelt pantotenátot PA327-hez és PA328-hoz képest, körülbelül 1,3-2 g/1 mennyiségben (14. táblázat).
14. táblázat.
PA340 és PA342 (mindkettő tartalmaz P26ilvBNC-t) pantotenát- és valin termelése 24 órás, kémcsőben végzett tenyészetekben, 5 g/1 β-alanint tartalmazó SVY-tápközegben, 5 g/1 α-KIV-el vagy nélkül növesztve.
____ od600 [ pan] g/1 [ val] g/ι
Törzs Háttér -a-KIV +a-KIV -α-KIV +a-KIV -α-κιν +a-KIV
PA340-1 PY79 11,8 7,1 2,02 2,10 0, 38 0,90
PA340-2 PY79 10,3 7,5 1, 97 2, 03 0, 40 0, 91
PA342-1 RL-1 10, 2 8,0 1,29 1,89 0,27 0, 78
PA342-2 RL-1 9,6 9,2 1,34 2, 04 0,21 0,79
74.365/BE
148
A két új törzsben kismértékben növekedett a valin-szekréció, ami azt mutatja, hogy az ilvBNC-gének szabályzása megszűnt. Azonban, ha ugyanezeket a törzseket 5 g/1 α-KIV-el növesztettük, tovább növekedett a pantotenát-termelés PA342-ből, ami alapján feltételezzük, hogy α-KIV még sebesség-limitáló ezekben a törzsekben. Hasonló eredményeket tapasztaltunk rázott lombikos tenyészetekben (15. táblázat), csak fokozottabban növekedtek és ezért magasabbak lettek a pantotenát-szintek.
15. táblázat.
PA340 és PA342 (mindkettő tartalmaz P26ilvBNC-t) pantotenát- és valin-termelése 24 órás, rázott lombikos tenyészetekben, 5 g/1 β-alanint tartalmazó SVY-tápközegben, 5 g/1 α-KIV-el vagy nélkül növesztve.
ODgoo [ pan] g/ι [ var g/ι
Törzs Háttér -a-KIV +a-KIV -α-KIV +a-KIV -α-κιν +α-κιν
PA32 7 PY79 21 22 0, 6 3,0 0,5 1, 3
PA340-1 PY79 20 20 3, 5 4,1 1,0 1, 9
PA340-2 PY79 22 19 3, 0 2,1 0,8 1, 4
PA328 RL-1 20 16 1,4 2,7 0, 6 1,3
PA342-1 RL-1 17 16 3, 3 3, 6 0, 9 1, 6
PA342-2 RL-1 18 18 3,1 4,2 0,8 1,4
8. példa
A panD kópiaszámának növelése panEI- és ilvBNC-géntermékek túltermelésére tervezett törzsekben fokozza a pantotenát-termelést
74.365/BE
149
Azokban a kísérletekben, ahol β-alanint rátápláltunk géntechnológiaialag módosított B. subtilis törzsek tenyészeteibe, azt tapasztaltuk, hogy β-alanin volt a sebességmeghatározó intermedier a pantotenát-szintézisben. További hozzáadott panD-kópiák hatását vizsgáltuk a pantotenát-termelésre PA340- és PA342-törzsekben. PA340- és PA342-törzseket PA401-ből izolált, kromoszómális DNS-el transzformáltunk, szelekciót 15 μg/ml tetraciklint tartalmazó tálcákon végeztünk (Tet15-tálcák). Az egyes szülői törzsekből származó transzformánsokat Tetso-tálcákra kentük olyanok azonosítása céljából, amelyek valószínűleg több kópia expressziós kazettát tartalmaztak. Az egyes transzformációkból· 12 transzformánst, amelyek Tet60-on növekedtek, kiónonként szélesztettük erre a táptalajra, azután SVY—tápközegben, kémcsőben végzett tenyészetekben vizsgáltuk pantotenát-termelésre. Az egyes csoportokból egy transzformánsról azt találtuk, 300 mg/1 pantotenátnál többet termel a 24. órában. Ezt a két transzformánst megőriztük, és PA404-nek (PA340-törzs háttere) és PA405-nek (PA342-törzs háttere) jelöltük. Mindkét törzs rezisz— tens volt sztreptomicinre, ami azt mutatja, hogy P26ilvBNC-jelű expressziós kazetta meg jelen van amyE—nél. Az egyes törzsekből izolált kromoszómális DNS PCR-analízise megerősítette, hogy a deregulált panEl-gén szintén megmaradt.
Ezután PA404-et és PA405-t olyan rázott lombíkos tenyészetekben elemeztük, amelyeket szénforrásként maltózt tartalmazó, és különböző intermedierekkel kiegészített SVY-tápközegben növesztettünk. A tenyészeteket 24 és 48 óráig növesztettük, és azután pantotenát-, β-alanin- és valin-termelésre vizsgáltuk. A kísérle
74.365/BE
150 tek eredményeit bemutatjuk az 16. táblázatban. A szülői törzseknek (PA340 és PA342) megfelelő, analóg rázott lombikos tenyészetek adatait is tartalmazza a táblázat összehasonlítás céljából.
16. táblázat.
Pantotenát-termelés PA404 és PA405 alkalmazásával, 24 órás rá zott lombikos tenyészetekben
Törzs Tápközeg kiegészítése OD600 Pan g/i β-Ala g/1 Val g/i
PA34 0 nincs 20 0,4 <0,1 1,0
PA4 04 nincs 22 1, 8 <0,1 o, 7
PA342 nincs 19 0, 3 0,2 0,7
PA4 05 nincs 19 1,4 0,4 0,5
PA34 0 β-alanin5 18 3, 6 3,2 0, 6
PA4 04 β-alanin5 18 2,8 5,1 0, 7
PA342* β-alanin5 17 3,3 3,3 0,5
PA405* β-alanin5 19 1,3 6,5 0, 6
Az értékek két párhuzamos rázott lombikos tenyészet átlagának felelnek meg.
Tápközeg-kiegészítés nélkül, PA404 és PA405 négy-ötször több pantotenátot termelt 24 óra alatt, mint az izogén szülői törzsek (16. táblázat). A tápközegben lévő β-alanin mennyisége nyilvánvalóan limitáló volt a PA340- és PA342-jelű szülői törzsekben. Amplifikált P26panD hozzáadása nagymértékben megnövelte a rendelkezésre álló β-alanin mennyiségét.
74.365/BE
151
9. példa
B. subtilisben lévő ilvD-gén deregulálása fokozza a pantotenát- termelést
Az ilvD-gén deregulálása céljából, (fentebb leírt) standard eljárásokat alkalmaztunk a konstitutív P26-promóter és RBS2-jelű mesterséges riboszóma-kötőhely integrálására, az ilvD-kódoló régiótól közvetlenül szintézisiránnyal szemben. Az ilvD-gén önmagában térképezve nem kapcsolódik az ilvBNC-operonhoz. Először az RL-l-kromoszóma 2,4 kb méretű régióját, amely az ilvD-kódoló régióját és ettől szintézisiránnyal szemben 730 bp méretű szekvenciát tartalmazott, klónoztuk PCR-el az alacsony kópiaszámú (E. coliban körülbelül 15 sejtenként) pOK12-vektorba, így jutottunk a pAN257-plazmidhoz, amit bemutatunk a 13. ábrán.
Kihasználva a natív ilvD-gén promóterétől közvetlenül szintézisiránnyal szemben elhelyezkedő, természetes EcoRI-hasítóhely, és az ilvD-start kódonnál elhelyezkedő, természetes Ncolhasítóhely előnyét, P26-ot és RBS2—t tartalmazó, mesterséges szekvenciát inszertáltunk pAN257-be, így jutottunk pAN263-hoz (14. ábra). pAN263 nukleotidszekvenciáját bemutatjuk 83. számú szekvenciaként. Ezzel a konstrukcióval párhuzamosan, a cat-gént is inszertáltuk pAN257-be, ugyanezen 5' -irányban elhelyezkedő EcoRI-hasítóhely és az ilvD-kódoló régió közepén elhelyezkedő BglII-hasítóhely közé, így jutottunk a pAN261-hez, amely az ilvD-gén nagy részét deletálta (15. ábra). Azután pAN261-et és pAN263-at felhasználva, beépíthettük a P26ilvD-kazettát B. subtilis kromoszómájába, két lépésben. Az első lépésben pAN261et bevittük transzformációval, klóramfenikol-rezisztenciára sze
74.365/BE
152 lektáltunk, és azután igazoltuk az (Ilv )-fenotípust. A második lépésben bevittük a pAN263-at, (Ilv+)-re szelektáltunk, ellenőriztük a klóramfenikol-szenzitivitást és PCR-el igazoltuk a helyes lokális struktúrát.
A pAN261-et először (nagymértékben kompetens) RL-l-törzsbe transzformáltuk, így jutottunk a PA343-törzshöz (Δίΐνϋ:: cat), és azután PA343-ból származó kromoszómális DNS-t alkalmaztunk PA340 és PA342 transzformálására (Ilv')-auxotrófiára, így jutottunk PA348- illetve PA349-jelű törzsekhez. A kromoszómális DNS lényegéből adódóan hatékonyabb, mint a monomer plazmád B. subtilis transzformálására. Ehhez hasonlóan, pAN263-DNS-t transzformáltunk PA343-ba (mérsékelten kompetens), így jutottunk a PA345törzshöz (P26ilvD) , és azután PA345-ből származó kromoszómális DNS-el transzformáltunk PA348-at és PA349 (Ilv+)-prototróffá, így jutottunk a PA374- illetve PA354-törzsekhez.
Amint előre látható volt, PA374-ben és PA354-ben tovább növekedett a pantotenát-termelés mértéke 2,5-2,9 g/l-re, kémcsőben végzett tenyészetekben, 5 g/1 β-alanint tartalmazó SVY-ban növesztve (17. táblázat).
74.365/BE
153
17. táblázat.
Pantotenát- és valintermelés P26ilvD-t tartalmazó, PA374 és PA354 és kontrollok alkalmazásával, 24 órás, kémcsőben végzett tenyésztésben, 5 g/1 β-alanint tartalmazó SVY-ban, 5 g/1 a-KIV-el vagy nélküle.
OD60o [ pan] g/1 [ val] g/1
Törzs Háttér ilvD hely- a-KIV a-KIV a-KIV
zet + + +
PA340 PY7 9 vad tip. 9,2 9,0 2,14 2,23 0,38 0, 90
ΡΆ34 8 PY79 ilvD:: cat 11,7 10,0 0,19 2,23 0,19 0,91
PA374-1 PY7 9 P26ilvD 9,1 7,3 2,93 2,40 0, 58 0, 87
PA374-2 PY79 P26ilvD 8,2 7,7 2,99 2,36 0, 60 0, 95
PA342 RL-1 vad tip. 10,2 8,0 1,29 1,89 0,27 0,78
PA3 4 9 RL-1 ilvD:: cat 8,1 7,7 0,17 1,87 0, 22 0,88
PA354-1 RL-1 P26ilvD 9,6 9,6 2,57 2,03 0,65 1,23
PA354-2 RL-1 P26ilvD 7,5 8,2 2,48 2,24 0, 64 0, 97
Hozzáadott β alanin nélkül, PA374- és PA354-törzsek csak körülbelül 0,2 g/1 pantotenátot termeltek kémcsőben végzett tenyészetekben, ami azt mutatja, hogy a PanD-aktivitás szignifikánsan sebességmeghatározó.
Az említett limitáció enyhítése céljából, beépítettünk PA401törzsből származó, amplifikálható P26panD-kazettát. PA401 kromoszómális DNS-t PA374-be és PA354-be transzformáltunk, 15 mg/1 Tetr-re szelektáltunk, így jutottunk PA377- illetve PA365-törzsekhez. Miután előállítottuk a transzformánsokat, a törzseket
74.365/BE
154 és 60 mg/1 tetraciklint tartalmazó tálcákra szélesztettük, a bpr-lókusznál integrálódott P26panD-kazetta kópiaszámának újraamplifikálása céljából. Kémcsőben végzett tenyészetekben növesztve, a-KIV-et vagy β-alanint nem tartalmazó, SVY-tápközegben, a pantotetenát-titerek lényegi módon javultak PA374 és PA354 törzsek esetén kapott titerekhez képest (18. és 19. táblázat).
18. táblázat.
Pantotenát-termelés amplifikált P26panD-t tartalmazó, PA365 és kontrollok alkalmazásával, 24 órás és 36 órás, kémcsőben végzett tenyésztéssel, glükózt tartalmazó SVY-tápközegben, β—alaninnal vagy α-KIV nélkül.
θ ^600 [ pan] g/1
Törzs Releváns genotípus 24 óra 36 óra 24 óra 36 óra
ΡΆ342-1-1 w.t.ilvD 11,7 CO co b.d. 0,27
PA342-1-2 w.t.ilvD 12,8 8,8 b.d. 0,26
PA354-1-1 P26ilvD n.d. 11, 0 n.d. 0,19
PA354-1-2 P26í1vD n.d. 8,4 n.d. 0,20
PA365-1 P26ilvD, P26panD 9,8 10, 0 1,01 2, 07
PA365-2 P26ilvD, P26panD 9, 9 10, 4 0, 96 2,09
n.d. = nincs meghatározva; b.d. = a detekciós limit alatt van
74.365/BE
155
19. táblázat.
Pantotenát-termelés amplifikált P26panD-t tartalmazó, PA377 és kontrollok alkalmazásával, 27 órás, kémcsőben végzett tenyésztéssel, glükózt tartalmazó SVY- vagy maltózt tartalmazó SVYtápközegben, α-KIV nélkül, és β-alaninnal vagy β-alanin nélkül.
od600
Törzs Releváns genotípus - β-Ala glükóz + β-Ala glükóz - β-Ala maltóz + β-Ala maltóz
PA374-1 P26ilvD 9,4 9,8 7,0 6,4
PA374-2 P26ilvD 9,2 9,6 6, 6 6, 3
PA377-1 P26í1vD, P26panD 10,0 7,6 7,2 6,1
PA377-2 P26ilvD, P26panD 10,5 7,8 9, 4 5, 4
[ pan] g/1
Törzs Releváns genotípus - β-Ala glükóz + β-Ala glükóz - β-Ala maltóz + β-Ala maltóz
PA374-1 P2GilvD 0, 04 2,76 0,14 1,31
PA374-2 P26ilvD 0,10 2, 65 0, 15 1,33
PA377-1 P2GilvD, P26panD 1,25 2,76 1,26 1,10
PA377-2 P26ilvD, P26panD 1,25 2,35 1,31 1,26
Glükózt tartalmazó SVY-ban, 5 g/1 β-alanin rátáplálásával még elérhető a pantotenát-termelés növelése, ami alapján feltételezzük, hogy panD-expresszió mértékének növelése tovább fokozhatja a pantotenát-termelést. Maltózt tartalmazó SVY-ban nem értünk el további növekedést a pantotenát-termelésben β-alanin rátáplálásával, ami alapján feltételezzük, hogy β-alanin és/vagy aszpartát szintézisét a glükóz szupresszálja. PA377— és PA365—törzseket 10 literes fermentorokban vizsgáltuk, ahol ezek tipikusan, körülbe74.365/BE
156 lül 20 g/1 pantotenátot termeltek a 48. órában, β-alanin- és aKIV- vagy valin-kiegészítés nélkül, melyet részletesen lentebb ismertetünk.
10. példa literes fermentációk pantotenát-termelő mikroorganizmusokkal
P26ilvBNC- és P26ilvD-kazetták géntechnológiai előállításával PA342- és PA354-törzsekhez jutottunk, amelyek lehetővé tettek 22 g/1 illetve 26 g/1 pantotenát termelését, valin vagy α-KIV fermentációs tápközegbe való adagolása nélkül (20. táblázat). A 48. órában mindkét törzs körülbelül 0,5 g/1 valint szekretált a tápközegbe .
20. táblázat.
Öt pantotenátot túltermelő törzs 10 literes fermentációja.
Törzs Tápközeg Rátáplálás 40% glükóz plusz θο660 48.ó Valin 48.ó. g/i β-Ala 48.ó. g/i Pantotenát g/i
3 6 . ó 4 8 . ó 72.ó
PA236 SVYG 50 g/1 β-Ala 108 ad. ad. 16 19 21
25 g/1 a-KIV
PA342 SVYG 50 g/1 β-Ala 92 0, 5 ad. 17 22 -
PA354 SVYG 50 g/1 β-Ala 90 0, 5 ad. 19 26 -
PA365 SVYG 25 g/1 YE 77 0, 85 0,4 18 21 27
PA377 SVYG 25 g/1 YE 85 1,5 0,5 18 22 31
PA377 PFMG 25 g/1 YE 96 0,8 0,4 19 25 29
PA377 PFMG - 71 0,7 0,1 16 21 -
ad. = hozzáadva
74.365/BE
157
Pantotenát-szintézis fermentorokban
A P26panD-kazetta PA354- és PA364-törzsekbe való bevitelével előállítottuk a PA365- és PA377-törzseket, amelyek fermentoros tenyészetéhez nem kellett hozzáadni sem β-alanint, sem α-KIV-et. PA365-törzs 21 g/1 pantotenátot termelt a 48. órában, és 27 g/l-t a 72. órában úgy, hogy nem adtunk prekurzorokat a tápközeghez (20. táblázat). PA377-törzs valamivel jobb volt, 18 g/1 pantotenátot termelt a 36. órában, 22 g/l-t a 48. órában és 31 g/l-t a 72. órában. A valin mennyisége 0,85 g/1 és 1,5 g/1 volt ΡΆ365illetve PA377-törzsekre, a 48. órában, SVYG-tápközegben. A PA377-törzs esetén a valin mennyiségét 1-1,5 g/1 és a β-alanin mennyiségét 0,2 és 0,5 g/1 között tartottuk a legtöbb fermentációban .
PA377~törzset tovább vizsgáltuk 10 literes fermentorokban, PFMG-tápközegre alapozott élesztőkivonatban. A pantotenát-hozamok hasonlóak voltak PFMG- és SVYG-tápközegekben. PFMG-ben a PA377-törzs 19 g/1 pantotenátot termelt a 36. órában, 25 g/l-t a 48. órában és 29 g/l-t a 72. órában. SVYG-ben a PA377-törzs 18 g/1 pantotenátot termelt a 36. órában, 22 g/l-t a 48. órában és 31 g/l-t a 72. órában.
11. példa
PA377-törzs konvertálása triptofán-prototróffá
PA377 (Trp~)-et (Trp+)-vá transzformáltunk PY79-ből származó kromoszómális DNS alkalmazásával, így jutottunk a PA824-törzshöz. A P26panD-kazetta újra-amplifikációja után PA824-et PA377hez hasonlítottuk pantotenát-termelés vonatkozásában, kémcsőben
74.365/BE
158 végzett tenyészetekben, SVY-glükóz-tápközegben növesztve, 5 g/1 β
-alaninnal vagy anélkül (21. táblázat).
21. táblázat.
PA377 Trp származékai: Pantotenát—termelés 48 órás, kémcsőben végzett tenyészetekben növesztve, SVY-glükózban + β-alanin.
od600 [ pan] g/1
Törzs trpC-donor - β-Ala + β-Ala - β-Ala + β-Ala
PA377-1 RL-1 8 8 1,5 3,4
PA377-2 RL-1 8 9 1, 6 3, 6
PA824-1 PY7 9 12 10 0,7 3,7
PA824-2 PY7 9 11 11 1, 9 4,9
A (Trp+)-törzsek kissé nagyobb sűrűségben növekedtek, mint a PA377. Exogén β-alanin nélkül az összes törzs hasonló mennyiségben termelt pantotenátot, míg β-alanin hozzáadásával a (Trp+)származékok valamivel több pantotenátot termeltek.
Fermentoros kísérletek PA824-el
PA824-et CF3000 Chemap, 14 literes edényben vizsgáltuk, amelynek munkatérfogata 10 liter. A fermentorokban alkalmazott két tápközeg összetételét megadjuk a 22. és 23. táblázatokban.
74.365/BE
159
22. táblázat:
PFMG-5-tápközeg összetétele
BATCH
ANYAG g/1 (végkonc.)
1 Amberex 1003 10
2 Na-glutamát 5
3 (NH4)2SO4 8
4 MAZU DF 37C 2,5
Sterilizálás után hozzáadva és lehűtve
1 KH2PO4 10
2 K2HPO4 x 3H2O 20
1 glükóz 20
2 MgCl2 x 6H2O 1
3 CaCl2 x 2H2O 0,1
1 nátrium-citrát 1
2 FeSO4 x 7H2O 0, 01
3 SM-1000X 1,0 ml
h2o kiegészítés 6000 ml-re
RÁTÁPLÁLÁS
ANYAG g/i
1 glükóz 600
2 CaCl2 x 2H2O 0,6
h2o kiegészítés 3000 ml-re
74.365/BE
160
23. táblázat:
SVY-4-tápközeg összetétele
BATCH
ANYAG g/1 (végkonc.)
1 „Veal-infúzió 25
2 Élesztőkivonat 5
3 Na-glutamát 5
4 (NHJ2SO4 4
5 MAZU DF 37C 2,5
Sterilizálás után hozzáadva és lehűtve
1 KH2PO4 10
2 K2HPO4 x 3H2O 20
1 glükóz 20
2 MgCl2 x 6H2O 1
3 CaCl2 x 2H2O o, 1
1 nátrium-citrát 1
2 FeSO4 x 7H2O 0, 01
3 SM-1000X 1,0 ml
H2O kiegészítés 6000 ml-re
RÁTÁPLÁLÁS
ANYAG g/i
1 glükóz 600
2 CaCl2 x 2H2O 0,6
h2o kiegészítés 3000 ml-re
74.365/BE
161
Valamennyi fermentáció glükóz-limitált, rátáplálásos, szakaszos eljárás volt. Az oltás után közvetlenül a kevertetést 200 rpm-re állítottuk. A kezdetben hozzáadagolt 2% glükóz az exponenciális növekedési szakasz alatt elfogyott. Ezután a glükózkoncentrációt 0,2 és 1,0 g/1 között tartottuk 60% glükóz-oldat folyamatos rátáplálásával. Változtatható adagolási sebességet biztosító pumpát számítógép szabályozta, és ez egy algoritmussal össze volt kapcsolva a tankban lévő [ pO2] oldott oxigén koncentrációjával. Ha a [ pO2] leesett 30%-ra, a számítógépes szabályzás automatikusan elkezdi állítani a kevertetési sebességet, hogy az oldott oxigén koncentrációját 25 és 30% [ pO2] között tartsa. A számítógépes szabályzást és az adatgyűjtést Braun MFCS-szoftver segítségével végeztük.
Az egyik vizsgálatban PA284-et növesztettünk fermentorokban, két hőmérsékleten (40°C-on és 43°C-on) , a 22. táblázatban leírt tápközegben. A két kísérlet eredményei azt mutatták, hogy a legmagasabb pantotenát-titereket korai időpontokban 43°C-on lehetett elérni. A sejttömeg optikai sűrűsége (OD600 ) megközelítette a 150 egységet az 56. órában, 43°C-on, és a pantotenát-titerek 21 g/1, 28 g/1 és 36 g/1 voltak a 36., 48. és 72. órában, sorrendben. Egy párhuzamosan, 40°C-on végzett fermentációban a sejttömeg optikai sűrűsége (OD600 ) megközelítette a 120 egységet az 56. órában, 43°C-on, és a pantotenát-titerek 18 g/1, 26 g/1 és 37 g/1 voltak a 36., 48. és 72. órában, sorrendben.
Egy másik vizsgálatban PA824-et növesztettünk egy fermentorban, 43°-on, a 23. táblázatban leírt tápközegben. A sejttömeg optikai sűrűsége (OD600) meghaladta a 160 egységet a 36. órában,
74.365/BE
162 és a pantotenát-titerek 23 g/1, 34 g/1, 37 g/1 és 40 g/1 voltak a 24., 36., 48. és 60. órában, sorrendben. Más fermentációkban, növekvő mennyiségű nyomelemeket adagoltunk glükózzal (például növekvő mennyiségű SM-et IX-től 2X-ig), amely még magasabb pantotenát-titereket eredményezett.
12. példa
B. subtilis coaA-géntermék azonosítása és jellemzése
B. subtilis genom szekvenciájának magyarázatokkal ellátott verziója rendelkezésre áll a „Subtilist honlapon, amely nem tartalmaz coaA-ként jelölt gént. Azonban homológia-kutatás, kereső szekvenciaként E. coliból származó pantotenát kináz fehérje-szekvenciáját alkalmazva, jó egyezést adott B. subtilis ygjsgennel, amelyhez fűzött magyarázat: „ismeretlen; pantotenát kinázhoz hasonló. Úgy tűnik, hogy ez a gén az utolsó előtti gén öt nyitott leolvasási fázist tartalmazó operonban (18. ábra). A nyitott leolvasási fázisok közül kettő olyan fehérjét kódol, amely hasonló D-szerin-dehidratázhoz és „ketoacil-reduktázhoz; a kettő másik nem rendelkezik ismert homológiával. A coaA-nak megfelelő nyitott leolvasási fázis esetén három lehetséges start-kódon van; mindegyik rendelkezik társult riboszómakötőhellyel (RBS). A három potenciális coaA-ORF jelölése: coaAl, coaA2 és coaA3, hosszúbbtól a rövidebb felé haladva.
Mindhárom potenciális coaA nyitott leolvasási fázist klónoztuk a megfelelő RBS-ekkel, PCR alkalmazásával, azt követően pAN229-jelű expressziós plazmiddal ligáltuk. pAN229 egy alacsony kópiaszámú vektor E. coliban, amely az SPOl-fág p15
74.365/BE
163 promóteréből kiindulva biztosít expressziót, és egyetlen „crossover-el képes integrálódni bpr-nél tetraciklin szelekcióval. Egy eredményül kapott, reprezentatív plazmidot, pAN281-et bemutatunk a 19. ábrán.
Annak meghatározása céljából, hogy vajon a klónozott, feltételezett coaA-ORF-ek ténylegesen pantotenát kináz-aktivitást kódolnak-e, mindhárom plazmidból néhány izolátumot E. coli YH1törzsbe transzformáltunk, amely coaA15(Ts)-alléit tartalmazott. A transzformánsokat tálcákra szélesztettük, és 30°C-on és 43°Con inkubáltuk annak tesztelése céljából, hogy képesek—e a hőmér— séklet-szenzitív alléit komplementálni. Mindhárom coaA-variáns valamennyi izolátuma, kivéve pAN282 egyik izolátuma jól komplementált 43°C-on, ami azt mutatta, hogy mindhárom plazmidkonstrukció aktív pantotenát kinázt kódol. Ennek megfelelően, levonhatjuk azt a következtetést, hogy a B. subtilis ygjS nyitott leolvasási fázis aktív pantotenát kinázt kódol.
13. példa
A coaA-gén deléciója B. subtilis genomból
B. subtilisből származó coaA-gént (yqjS) deletáltunk B. subtilis kromoszómájából, hagyományos módszerekkel. A coaA kódoló szekvenciájának többségét deletáltuk egy plazmidklónból, és helyettesítettük klóramfenikol-rezisztencia-génnel (cat), miközben meghagytunk körülbelül 1 kb méretű szekvenciát szintézisiránnyal szemben és szintézisirányban, amely lehetővé tett homológ rekombinációt a kromoszómában, így jutottunk a pAN296plazmidhoz (lásd 17. ábrát). Azután a pAN296-t B. subtilis törzs
74.365/BE
164 (PY79) transzformálására alkalmaztuk, klóramfenikol-rezisztenciara szelektálva. A transzformánsok többségé dupla „crossover eredményeként jött létre, amely hatékonyan szubsztituálta a catgént coaA-génre. A coaA-deléciót és cat-inszerciót tartalmazó, transzformált törzs normálisan növekedett annak következtében, hogy jelen volt a leírás szerinti, második B. subtilis eredetű, pantotenát kinázt kódoló gén.
14. példa
Pantotenát kináz-aktivitást kódoló, második B. subtilis gén azonosítása és jellemzése
A leírásban részletezettek szerint, pantotenát—termelés maximalizálása céljából a pantotenát felhasználását koenzim-A (CoA) irányában korlátozni kell, például pantotenát kináz aktivitásának csökkentésével, amely a pantotenáttól CoA felé haladó folyamatsor első enzimje. Miután megbizonyosodtuk arról, hogy a coaAgén deléciója B. subtilis kromoszómájából nem letális (lásd 13. példát), azt a következtetést vontuk le, hogy B. subtilisnek egy második gént is kell tartalmaznia, amely aktív pantotenát kinázt kódol, mivel pantotenát kináz esszenciális enzimaktivitás.
Második pantotenát kinázt kódoló gént úgy azonosítottunk, hogy E. coli YH1 (coaA15(Ts)) törzset komplementáltunk B. subtilisből származó génbankkal, és olyan transzformánsokra szelektáltunk, amelyek 43°C-on képesek növekedni. A transzformánsok között volt két plazmidcsalád, amelyek átfedő restrikciós térképpel rendelkeztek az egyes családokon belül, de a családok között nem volt átfedés. Várakozások szerint az egyik család rest
74,365/BE
165 rikciós térképe azonos volt a B. subtilis genom szekvenciájának azzal a részletével, amely homológ E. coliból származó coaAgénnel (melyet coaA-ként is jelölünk, lásd fentebb) és környező szekvenciákkal. A másik család olyan restrikciós térképpel rendelkezett, amely sehol nem fedett át az elsővel.
A második családból származó klónozott inszertek végeinek DNS-szekvenálásával kimutattuk, hogy a kiónok a B. subtilis kromoszómájának azon régiójából származnak, amely az ftsH-gén 3' végét, a sul-gén 5' -végét és a yacB-, yacC-, yacD-, cysK-, pabB-, pabA- és pabC-géneket egészben tartalmazza. A klónozott inszertumokban lévő nyitott leolvasási fázisok egyike sem mutatott homológiát egyik ismert pantotenát kináz-szekvenciához, sem prokarióta, sem eukarióta szekvenciához.
Számos deléciót hoztunk létre B. subtilis genomi szekvenciájában, a klónozott inszertekben. Az egyes deléciókat E. coli hőmérséklet-szenzitiv pantotenát-kináz komplementálására teszteltük. Különösen az a deléció, amely eltávolította a klónozó vektorban lévő Stul-hasítóhely és a yacC-génben lévő Swal-hasítóhely közötti teljes DNS-szakaszt, a klónozott inszertben meghagyta yacB-t, egyetlen nyitott leolvasási fázisként (lásd 21. ábra) . Ez a deletált plazmád még képes volt komplementéin! az E. coli pantotenát kinéz mutánst. Azonban egy másik deléció, amely eltávolította a yacC-ben lévő Swal-hasítóhelytől az ftsH-génben (amely már rövidített) lévő BstllOVI-hasítóhely közötti DNS-szakaszt, nem volt képes komplementéin! az E. coli pantotenát kinéz mutánst. Ezekből az eredményekből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a yacB nyitott leolvasási fázis volt felelős
74.365/BE
166 a komplementációs aktivitásért. Annak igazolása céljából, hogy yacB a pantotenát kináz-gén, a yacB-ORF-et plusz a szintézisirányban lévő szegélyező szekvenciából 112 bázispárt PCR-el amplifikáltunk két független reakcióban, és egy konstitutív promótertől szintézisirányban klónoztuk, így jutottunk a pAN341és pAN342-plazmidokhoz (22. ábra). A pAN341- és pAN342-plazmidok egyaránt képesek voltak komplementéin! az YHl-ben lévő defektust 44°C-on, míg egy olyan kontroll plazmád nem komplementálta, amely ugyanezzel a vázzal rendelkezett, de panBCD-t expresszált yacB helyett. Ez igazolta, hogy a yacB nyitott leolvasási fázis volt felelős YH1 komplementálásáért.
Tehát felismertünk egy új gént, amely pantotenát kinázaktivitást kódol B. subtilisben, és nem homológ egyik korábban ismert pantotenát kináz-génnel. Ezt a gént átneveztük coaX-nek, egy második, alternatív génként, amely olyan enzimet kódol, amely pantotenáttól CoA-hoz vezető folyamatsor első lépését katalizálja. A coaX-ben fentebb leírt módszerekkel létrehozott deléciók coaA deletálása céljából, együtt a CoaA-enzim aktivitásának csökkentésével, lehetséges eszközt biztosítanak pantotenát kináz-aktivitásának kívánt szintre való csökkentésével.
B. subtilisből származó coaX-gén számos homológját azonosítottuk különböző, nyilvánosan rendelkezésre álló adatbázisok homológia-kutatásával, amelyben yacB (coaX) nyitott leolvasási fázisának közölt szekvenciáját és levezetett aminosav-szekvenciáját (84. és 85. számú szekvenciák) használtuk fel. Két esetben (Mycobacterium tuberculosis és Streptomyces coelicolor) coaX gén homológjai szomszédosak vagy majdnem szomszédosak
74.365/BE
167 pantotenát bioszintetikus-génekkel, amely összhangban van azzal, hogy ezeknek a homológoknak szerepe van a pantotenát-metabolizmusban. A CoaX-fehérjék nem mutatnak homológiát pantotenáz kinázok CoaA—családjával, sem a pantotenát kinázok eukarióta családjával, például Saccharomyces cerevisiaeből származó PanK-hoz.
Számos bakteriális CoaX-homológ aminosav-szekvenciájának és B. subtilis genom közölt szekvenciájában található, B. subtilis yacB-ORF transzlációjából levezetett aminosav-szekvencia egymás alá rendezésével kimutattuk, hogy más baktériumokból származó CoaX-fehérjék további aminosavakat tartalmaznak karboxi-terminá— lis végükön. Ezek a hosszabbodások továbbá túlnyúlnak a B. subtilisből származó géntermék levezetett aminosav-szekvenciájának végén, és két, viszonylag konzervatív szekvenciaszegmenst tartalmaznak.
B. subtilis yacB-ORF-ben lévő stop-kódontól közvetlenül szintézisirányban, különböző nyitott leolvasási fázisokban lévő nukleotidszekvenciák transzlációjával kiderítettük, hogy ezek az aminosav-szekvenciák nagyon hasonlóak más bakteriális CoaX-fehér jék karboxi-terminális hosszabbodásaihoz. Tehát feltételeztük, hogy hiba van B. subtilis yacB-ORF-szekvencia közölt DNSszekvenciájában, amely fázis-eltolódást okoz, amely szintézisirányban elhelyezkedő, műtermék aminosav-szekvenciához és érés előtti terminációhoz vezet.
B. subtilis CoaX, PCR segítségével előállított szekvenciái pAN341-ben és PAN342-ben (a fentebb leírtak szerint), elegendő szintézisirányban szegélyező szekvenciát tartalmaztak a feltételezett, fentebb leírt karboxi-terminális hosszabbodás kódolásá
74.365/BE
168 ra, amely összhangban azzal az eredménnyel, hogy a kiónok funkcionálisak voltak a komplementációs vizsgálati eljárásban. Ha azonban a 3' -végi PCR-primert úgy pozícionáltuk, hogy csak a rövidebb yacB-ORF-et tartalmazza, amely a közölt szekvenciából előre jelezhető, de nem tartalmazza a feltételezett karboxiterminális hosszabbodást, akkor az eredményül kapott pAN329- és pAN330-plazmidok (strukturálisan hasonlóak pAN341-el és pAN342vel; lásd 22. ábrát) nem voltak képesek komplementéin! a defektív YHl-et. Ez az eredmény alátámasztja azt az állítást, hogy CoaX karboxi-terminális vége szükséges pantotenát kináz-aktivitáshoz. B. subtilis coaX előre jelzett, pontos nukleotid-szekvenciáját bemutatjuk 19. számú szekvenciaként, és a transziáit aminosav-szekvenciát bemutatjuk 9. számú szekvenciaként. B. subtilisből származó CoaX és 11 homológjának többi aminosav-szekvenciáját egymás alá rendeztük és bemutatjuk a 23. ábrán.
15. példa
Csökkentett és hőmérséklet-szenzitiv pantotenát kinázaktivitást kódoló, mutáns coaA-gének előállítása
Ebben a példában leírjuk a coaA-gén módosítására szolgáló stratégiákat (azaz pontmutációk bevitelét) pantotenát kináz aktivitásának csökkentése céljából, miután coaX-et deletáltuk a genomból.
E. coliból származó coaA-gén hőmérséklet-szenzitiv alléljének klónozása és szekvenálása
Két E. coli törzset kaptunk az „E. coli Genetic Stock Center, amelyek különböző mutáns fenotípust mutatnak. A DV62-törzs
74.365/BE
169 coaA15(Ts)-alléit tartalmaz, és a DV79-törzs coaA16(Fr)-mutációt tartalmaz. DV62 hőmérséklet-szenzitiv 43°C-on, és hőmérsékletszenzitiv pantotenát kinázt termel. DV79-hez úgy jutunk, hogy DV62-t hőmérséklet-rezisztenssé alakítjuk, és ez hőstabil, feedback-rezisztens pantotenát kináz-aktivitást termel. Mivel ezen DNS-szekvenciák alléljai nem állnak rendelkezésre a szakirodalomban, a két mutáns törzsből származó coaA-géneket PCR-el klónoztuk és szekvenáltuk, továbbá azt a coaA-gént olyan törzsből (MM294), amelyben az vad típusú a coaA-lókusznál. Az 5'-végi PCR-primereket úgy terveztük, hogy start-kódont plusz szintézisiránnyal szemben négy bázist tartalmazzanak, és hozzáadtunk egy önkényesen választott riboszóma-kötőhelyet (RBS). A PCR-el előállított három fragmentumot pAN229 Xbal/BamHI-hasítóhelyei közé ligáltuk, így jutottunk pAN284-hez (coaA15(Ts)-bői), pAN285-höz (vad típusú coaA-ból) és pAN286-hoz (coaA16(Fr)-ból). pAN229 alacsony kópiaszámú E. coli vektor, amely Pls-promóterből kiindulva biztosít expressziót, és egyetlen „crossover-el képes integrálódni B. subtilisben bpr-nél tetraciklin szelekcióval.
Mindhárom plazmidot E. coli YHl-törzsbe transzformáltuk komplementációs tesztelés céljából. Mindhárom plazmid komplementálta azz E. coli YHl-ben lévő, hőmérséklet-szenzitiv coaAmutációt. Feltételezzük, hogy a pAN284-ben lévő coaA15(Ts)-gén valószínűleg szignifikánsan túltermelődik a normál kromoszómális génhez képest, így a túltermelés kompenzálja a hőmérsékletszenzitiv defektust. Egy defektus komplementálása túltermeléssel jól dokumentált jelenség E. coli esetén.
A pAN284-, pAN285- és pAN286-ból származó, coaA-kódoló régió
74.365/BE
170 kát pGEM7-be szubklónoztuk, így jutottunk pAN306-, pAN307- illetve pAN308-plazmidokhoz, DNS-szekvenálás céljából. Várakozások szerint a pAN307-ben lévő (vad típusú coaA-ból származó) inszert DNS-szekvenciája egyezik az E. coli genom adatbázisából (GenBank™) származó coaA-szekvenciával. A pAN306-ból származó szekvencia egyetlen báziscserét tartalmaz, amely S176Lszubsztitúciót okoz (azaz Ser -> Leu szubsztitúciót a 2. számú aminosav-szekvenciában). Érdekes, hogy a pAN308-inszert DNSszekvenciája, amely a feedback-rezisztens törzsből származik, azonos volt azzal, amely a neki megfelelő szülői, hőmérsékletszenzitív törzsből származott (pAN306-ban). Ez összhangban van azzal a genetikai adattal, ami arra utal, hogy a hőmérsékletszenzitív mutáció megfordítása végbemegy egy második helyen, ami nem kapcsolódik a coaA-génhez.
Előre láthatóan az S176L-mutáció okozza a hőmérsékletszenzitív defektust E. coli pantotenát kinázban, a szerin megváltoztatásával, amely konzervatív valamennyi ismert vagy feltételezett, pantotenát kinázt kódoló, bakteriális coaA-ban, beleértve a B. subtilisből származó pantotenát kinázt (lásd a 3. számú szekvenciát és a szekvenciák egymás alá rendezését). Erre alapozva várható, hogy szerin cseréje leucinra a B. subtilisből származó pantotenát kináz homológ csoportjánál hőmérsékletszenzitív enzimet eredményez, vagy olyat, amely kevésbé aktív. Ennek megfelelően, mutáns B. subtilis coaA-gén előállítása céljából, ezt a konkrét változtatást bevittük B. subtilis coaAgénbe. A mutáns verziót beépítettük például olyan B. subtilis törzs kromoszómájába, amelyben coaX deletálva volt, és a
74.365/BE
171 rekombináns mikroorganizmust hőmérséklet-érzékenységre ellenőriztük (például csökkent mértékű növekedés 43°C-on). A mutációt azután bevittük pantotenátot túltermelő törzsbe, előnyösen olyan törzsbe, amelyben a fentebb említett coaX-gén deletálva van standard módszerekkel, így olyan törzshöz jutottunk, amely kedvezett pantotenát termelésnek B. subtilisben, azaz olyan törzshöz, amelyben a pantotenát kináz aktivitás csökkent mértékű volt tipikus fermentációs körülmények között.
További coaA-pontmutációk csökkent pantotenát kináz-aktivitást eredményeznek
Természetesen várható, hogy sok más pontmutáció vagy egynél több pontmutáció kombinációja B. subtilis coaA-ban szintén csökkent aktivitáshoz vezet. Létrehozhatunk megfelelő mutációkat mutagén polimeráz láncreakcióval és in vitro rekombinációval, és azonosítjuk olyan allélekre való szűréssel, amelyek gyengén képesek komplementéin! az E. coli coaA15(Ts)-mutánst. Ilyen típusú mutáció például tirozinról hisztidinre való szubsztitúció B. subtilis coaA 181. aminosavában, melyet mutagén polimeráz láncreakcióval állítottunk elő (lásd 3. számú szekvenciát a 24. ábrán egymás alá rendezett szekvenciák első sorában).
A pAN282A-izolátum a 12. példában leírt, közepes méretű B. subtilis coaA nyitott leolvasási fázisából származik. A pAN282A nagyon gyengén komplementálta az E. coli coaA15(Ts)-mutánst, de annyira mégis, hogy a héttér fölött detektálható volt. Az E. coli coaA-klónok esetén leírtakhoz hasonlóan, pAN282A-ból származó nyitott leolvasási fázist pGEM7-be szubklónoztuk, így jutottunk pAN303. A pAN303-ban lévő inszert DNS-szekvenciájában egyetlen
74.365/BE
172 báziscsere volt, amely tirozin hisztidinre való cseréjéhez vezetett a 3. számú szekvencia Y181. helyzetnek megfelelő tirozinnál. Ez a tirozin konzervatív valamennyi GenBank-ban található bakteriális coaA-génben/homológban (24. ábra). Ezt a tirozint és a fentebb leírt, E. coli hőmérséklet-szenzitív pantotenát kinázban megváltoztatott szerint csak három aminosav választja el egymástól abban a régióban, amely nagymértékben konzervatív bakteriális pantotenát kinázokban, míg pAN282B közepes méretű nyitott leolvasási fázisából származó, második izolátum DNS-szekvenciája azonos volt a B. subtilis genom-szekvenáló projectből származó, vad típusú szekvenciával. pAN303-ban egyetlen báziscserét találtunk, amely valószínűleg a coaA-gén PCR-amplifikációja alatt ment végbe. Ha ez a coaA2-variáns elegendő maradék biológiai aktivitással rendelkezik B. subtilisben, akkor hasznosan lehet a jövőben alkalmazni csökkentett mértékű pantotenát kináz-aktivitás biztosítására.
A pAN294-plazmid előnyösen a coaA nyitott leolvasási fázis mutagenezisének alapjául szolgálhat (lásd például 25. ábrát és 13. példát). Röviden összefoglalva, mutagén PCR-t végeztünk, templátként pAN294-plazmidot alkalmazva, és csökkentett pantotenát kináz-aktivitássl rendelkező coaA-variánsokat szűrtünk a fentebb leírtak szerint. Ezzel alternatív módon, mutációkat lehet beépíteni pAN294-be, például olyat, amelyet pAN282A-ban izoláltunk. A kívánt mutációkat azután transzformációval bevisszük B. subtilis törzs kromoszómájába, a megfelelő pAN294-származékkal, és 5 mg/1 klóramfenikol-rezisztenciára szelektáltunk. Az eredményül kapott transzformánsok olyan izolátumok lesznek, ame
74.365/BE
173 lyek a kívánt mutációt tartalmazzák.
Ehhez hasonló módon, CoaX-enzimaktivitást csökkentő mutációkat lehet előállítani és azonosítani, és ilyen mutációkat lehet alkalmazni pantotenát-termelés optimalizálására, CoA-termelés fentebb leírt csökkentésével.
16. példa
A második pantotenát kináz-gén deletálása B. subtilisből származó coaX-génből
A coaX meglétére és természetére vonatkozó, fentebb nyert ismeretekből előállíthatunk egy olyan deléciót B. subtilis kromoszómájából származó coaX nyitott leolvasási fázisában, amely eltávolítja a kódolt aktivitást, és amely nem fejt ki káros hatásokat coaX-től szintézisirányban elhelyezkedő gének expressziójára. Ilyen deléciós törzsben a coaA-gén lesz az egyetlen gén, amely pantotenát kináz aktivitást kódol.
A coaA-gén B. subtilisből való deléciója céljából, előállítottunk pAN336-plazmidot (92. számú szekvencia), amely szintézisirányban és szintézisiránnyal szemben homológ volt dupla „crossing over-hez, és amelyben kanamicin-rezisztencia-gén helyettesítette a coaX-ORF nagyobb részét (26. ábra). A PY79-törzset kanamicin-rezisztenssé transzformáltunk pAN336-al, és egy izolátumról, amelynek jelölése PA876, PCR-el igazoltuk, hogy a dupla „crossing over eredménye volt. Amint előre látható volt, coaX deléciója önmagában nem letális B. subtilisre. Továbbá, PA876-ból származó kromoszómális DNS nem transzformálná a kompetens PA861-et (PY79 AcoaA::cat) kanamicin-rezisztenssé. Ezek az
74.365/BE
174 eredmények azt mutatják, hogy AcoaA::cat és AcoaX::kan kombinációja letális B. subtilisre, ami alátámasztja, hogy B. subtilis két, pantotenáz kinázt kódoló, nem-kapcsolt gént tartalmaz, coaA-t és coaX-et, és hogy bármelyik gén egymagában képes elegendő pantotenát kináz-aktivitást biztosítani a normál növekedési sebességhez.
17. példa
B. subtilisből származó coaA-gén irányított mutagenezisét lehetővé tevő plazmid előállítása
Mutáns coaA-gének B. subtilis kromoszómájába való könnyű bevitele céljából szükséges volt antibiotikum-rezisztencia-gén elhelyezése a coaA-gén mellé. Ezt úgy végeztük, hogy összekapcsoltuk a pGEM5-vektorban lévő, alábbi három DNS-fragmentumot: (1) 3,4 kb méretű DNS-szekvencia, amely 2,5 kb genomi szekvenciát tartalmaz coaA- és coaX-et kódoló, nyitott leolvasási fázis (ok) tói szintézisiránnyal szemben; (2) 1,1 kb méretű DNS-szekvenciát, amely klóramfenikol-rezisztencia-gént (cat) tartalmaz; és (3) 1,4 kb méretű DNS-szekvenciát, amely a coaA-t tartalmazó operontól szintézisirányban lévő régiót tartalmazta. Az eredményül kapott, pAN294-plazmid hatékonyan helyettesítette a yqjT nyitott leolvasási fázist (coaA-tól közvetlenül szintézisirányban elhelyezkedő nyitott leolvasási fázist) a cat-génnel, a cat-gén mindkét oldalán elegendő mértékben homológ szekvenciákkal ahhoz, hogy lehetővé tegyen dupla rekombinációt B. subtilis kromoszómájába (25. ábra). A pAN294-plazmidot B. subtilis PY79-törzsbe transzformáltuk, 5 mg/1 klóramfenikol74.365/BE
175
-rezisztenciára szelektáltunk, igy jutottunk a PA836- és PA837-törzshöz, amelyek feltételezhetően azonosak. PA836-ról és PA837-től diagnosztikai PCR-el kimutattuk, hogy a cat-gén dupla „crossing over-el integrálódott, az egyszeri „crossing over-el szemben. PA836 és PA837 normálisan növekedett, ami alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy az ygjT nyitott leolvasási fázis nem esszenciális (azaz a ygjT nyitott leolvasási fázist deletálni lehet a PA836— és PA837-ből úgy, hogy az nincs szignifikáns hatással a növekedésre vagy pantotenát-termelésre). így tehát a coaA-gén variáns alléljait (azaz mutánsait) be lehet vinni pAN294-be, és az eredményül kapott plazmidokat lehet alkalmazni a variáns allélok kromoszómába való bevitelére, például B. subtilisbe.
18. példa
Csökkentett vagy hőmérséklet-szenzitív aktivitással rendelkező pantotenát kinázt kódoló, mutáns coaX-gének előállítása
Előállítunk mutáns coaX-géneket úgy, hogy beviszünk pontmutációkat a génbe, és teszteljük az eredményül kapott mutánsokat arra vonatkozóan, hogy milyen mértékben képesek komplementéin! az E. coli YHl-törzset, a 12. példában leírtak szerint. Előnyösen bevihető mutációk a coaX-génszekvenciában olyanok, amelyek különböző bakteriális forrásokból származó CoaX-szekvenciákban konzervatív aminosavak (például a 23. ábrán bemutatott konzervatív csoportok) szubsztitúcióját kódolják. Más módszer szerint, létrehozhatunk random mutációkat a coaX-szekvenciában mutagén PCR-el és in vitro rekombinációval, és olyan allélekre való szű
74.365/BE
176 réssel azonosíthatjuk azokat, amelyek gyengén képesek komplementéin! az E. coli coaA15(Ts)-mutánst.
Az így előállított mutánsokat (azaz csökkent coaX-aktivitással rendelkező mutánsok) tovább lehet géntechnológiailag módosítani, így az endogén coaA-gént deletálhatjuk (a 13. példában leírtak szerint). Csökkentett aktivitással rendelkező CoaXmutánsokat tovább lehet géntechnológiailag módosítani abból a célból is, hogy csökkent aktivitással rendelkező CoaA-géntermékeket tartalmazzanak (a 15. példában leírtak szerint).
19. példa
Panto-vegyületek fokozott mértékű termeltetése olyan baktériumokban, amelyekben egy vagy több pantotenát bioszintetikus enzim deletálva van
Ha a kívánt panto-vegyület nem pantotenát, akkor pantotenátot túltermelő törzsben, egy vagy több, pantotenát bioszintetikus gén megfelelő deléciójával olyan törzshöz jutunk, amely kívánt panto-vegyületet termel. Például PA236-, PA313- vagy PA824-törzsből kiindulva, panC- vagy panD-gént vagy mindkettőt deletáljuk. Egy másik példában ketopantoát a termelni kívánt panto-vegyület. Például PA244-, PA245- vagy PA824-törzsből kiindulva, ilvC-, panEl-, panC- és panD-gének közül egyet, kettőt vagy mindet deletáljuk a szülői törzsből. Ha β-alanin a kívánt panto-vegyület, akkor panB-t és panC-t lehet deletálni, előnyösen úgy, hogy panB 5' -végének kis része egy fázisban marad panC 3' -végének kis részével fuzionálva, amelyek PA221-, PA235-, PA245- vagy PA313-törzsből származnak. A fentebb említett pél
74.365/BE dákban panto-vegyületet termelő törzsek pantotenát-auxotrófok. Ennek megfelelően, a növesztés! tápközegben elegendő pantotenátra van szükség a megfelelő növekedéshez. A fentebb leírt, panD túltermelésére tervezett vektorokat azután a fenti törzsekbe transzformáljuk, tovább fokozva a β-alanin-termelést.
A fentebb említett deléciókat szakember által jól ismert módszerekkel végezzük, például antibiotikum-rezisztencia-gén inszertálásával és a célgén(ek)bői elegendő szekvencia eltávolításával ahhoz, hogy inaktiválja célgén(eke)t. Más módszer szerint, célszekvenciák eltávolítását antibiotikum-rezisztencia-gén célgénbe való, egyidejű bevitele nélkül is végezhetjük, és azután kotranszformációval beviszünk bármilyen más, alkalmas, szelektálható DNS-szekvenciát, azt követően szűrünk a célgén funkciójának elvesztésére replika szélesztéssel.
74.365/BE
178
24. táblázat:
Törzsek (és megfelelő fenotípusok) panto-vegyületek termelésére
Név Fenő- Drog típus réz. panBCD lókusz panE lókusz ilvD lókusz amyE lókusz bpr lókusz szülő
PA221 Trp- P2 6panBCD
PA222 P15panBCD RL-1
PA235 P2 6panBCD
PA236 P26panBCD P26panEl PA221
PA328 Trp- P26panBCD P26panEl PA235
PA34 0 Trp- Spc P26panBCD P2 6panEl P26ilvBNC PA32 7
PA342 Trp- Spc P2 6panBCD P2 6panEl P26ilvBNC PA328
PA354 Trp- Spc P26panBCD P2 6panEl P26ilvD P26ilvBNC PA342
PA365 Trp- Spc, P26panBCD P26panEl P26ilvD P26ilvBNC P26panD423 PA354
Tét
PA37 4 Trp- Spc P2 öpanBCD P2 6panEl P26ilvD P26ilvBNC PA34 0
PA37 7 Trp- Spc, P2 öpanBCD P26panEl P26ilvD P26ilvBNC P26panD423 PA37 4
Tét
PA4 01 Trp- P26panBCD P26panD423 PA221
PA4 02 Trp- P26panBCD P26panD428 PA221
PA4 03 Trp- P26panBCD P26panD429 PA221
PA4 0 4 Trp- Spc, P2 öpanBCD P26panEl P26ilvBNC P26panD423 PA34 0
Tét
PA4 0 5 Trp- Spc, P26panBCD P2 6panEl P26ilvBNC P26panD423 PA342
Tét
PA651 Trp- Spc P2 6panBC*D P26panEl P26ilvD P26ilvBNC PA37 4
PA2 8 4 Trp- Spc, P2 őpanBCD P26panEl P26ilvD P26ilvBNC P26panD423 PA377
Tét
Ekvivalensek: Szakember számára nyilvánvaló, vagy rutin kísérleteknél nem bonyolultabb módszerekkel szakember képes a találmány leírt előnyös megvalósítási módjainak sok ekvivalensét kidolgozni. Ilyen ekvivalenseket szintén a találmány által igényelt oltalmi körbe tartozónak tekintünk.
74.365/BE
179 (SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE)
SEQUENCE LISTING <110> OMNIGENE BIOPRODUCTS <120> METHODS AND MICROORGANISMS FOR PRODUCTION OF PANTO-COMPOUNDS <130> BGI-141CPPC <140> PCT/US00/25993 <141> 2000-09-21 <150> USSN 09/400,494 <151> 1999-09-21 <150> USSN 60/210,072 <151> 2000-06-07 <150> USSN 60/221,836 <151> 2000-07-28 <150> USSN 60/221,836 <151> 2000-08-24 <160> 94 <170> Patentin Ver. 2.0 <210> 1 <211> 311 < 212> PRT < 213> Haemophilus influenzae < 400> 1
Met Glu Phe Ser Thr Gin Gin Thr Pro Phe Leu Ser Phe Asn Arg Glu 1 5 1015
Gin Trp Ala Glu Leu Arg Lys Ser Vai Pro Leu Lys Leu Thr GluGin
2530
Asp Leu Lys Pro Leu Leu Gly Phe Asn Glu Asp Leu Ser Leu Asp Glu 35 4045
Vai Ser Thr lie Tyr Leu Pro Leu Thr Arg Leu lie Asn Tyr Tyr lie 50 5560
Asp Glu Asn Leu His Arg Gin Thr Vai Leu His Arg Phe Leu GlyArg
70 7580
Asn Asn Ala Lys Thr Pro Tyr lie He Ser He Ala Gly Ser VaiAla
9095
74.365/BE *
180
Vai Gly Lys Ser Thr Ser Ala 100
Trp Pro Thr Glu Arg Lys Vai 115
Tyr Pro Leu Asn Lys Leu Lys 130 135
Phe Pro Vai Ser Tyr Asp Thr 145 150
Vai Lys Ser Gly Lys Ser Asn 165
Thr Tyr Asp lie lie Pro Asp 180 lie Leu lie Leu Glu Gly Leu 195
Thr Asp Gin Thr Phe Vai Ser 210 215
Asp Ala Glu Glu Lys Leu Leu 225 230
Lys Phe Arg Glu Ser Ala Phe 245
Tyr Ala Ser Leu Ser Lys Glu 260
Trp Asp Glu He Asn Gly Leu 275
Arg Glu Arg Ala Asn Leu He 290295
Glu Leu lie Lys Leu Arg Lys 305310 lie Leu Gin Ser Leu Leu Ser His
105HO
Leu He Thr Thr Asp Gly Phe Leu 125
Asp Asn Leu Leu Gin Lys Lys Gly 140
Lys Leu He Arg Phe Leu Ala Asp 155160
Thr Ala Pro He Tyr Ser His Leu 170175
Phe Asp Vai Vai Asp Lys Pro Asp 185190
Vai Leu Gin Thr Gly Asn Asn Lys 205
Phe Vai Asp Phe Ser lie Tyr Vai 220
Glu Trp Tyr He Lys Arg Phe Leu 235240
Asp Pro Asn Ser Tyr Phe Lys His 250255
Ala He Ala Thr Ala Ser Lys He 265270
Leu Asn Gin Asn He Leu Pro Thr 285
Lys Lys Gly His Asn His Gin Vai 300 <210> 2 <211> 316 < 212> PRT < 213> Escherichia coli < 400> 2
Met Ser He Lys Glu Gin Thr 1 5
Arg Asn Gin Trp Ala Ala Leu 20
Met Thr Pro Tyr Leu Gin Phe Asp 10 15
Asp Ser Vai Pro Met Thr Leu Ser 25 30
74.365/BE
181
Asp Glu 35 Glu Val 50 lie Alá Arg Leu Lys Gly Ile Asn Glu Asp Leu Ser Leu 40 45 Alá Glu Ile Tyr Leu Pro Leu Ser Arg Leu Leu Asn Phe 55 60
Ile Ser Ser Asn Leu Arg Arg Gin Alá Val Leu Glu Gin Phe Leu 70 75 80
Thr Asn Gly Gin Arg Ile Pro Tyr Ile Ile Ser lie Alá Gly Ser 85 90 95
Alá Val Gly Lys Ser Thr Thr Ala Arg Val Leu Gin Alá Leu Leu 100 105 110
Arg Trp 115 Pro Glu His Arg Arg Val Glu Leu Ile Thr Thr Asp Gly 120 125
Leu His 130 Pro Asn Gin Val Leu Lys Glu Arg Gly Leu Met Lys Lys 135 140
Gly Phe Pro Glu Ser Tyr Asp Met His Arg Leu Val Lys Phe Val 150 155 160
Asp Leu Lys Ser Gly Val Pro Asn Val Thr Alá Pro Val Tyr Ser 165 170 175
Leu Ile Tyr Asp Val Ile Pro Asp Gly Asp Lys Thr Val Val Gin 180 185 190
Asp Ile 195 Leu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Val Leu Gin Ser Gly Met 200 205
Tyr Pro 210 His Asp Pro His His Val Phe Val Ser Asp Phe Val Asp 215 220
Ser Ile Tyr Val Asp Alá Pro Glu Asp Leu Leu Gin Thr Trp Tyr 230 235 240
Asn Arg Phe Leu Lys Phe Arg Glu Gly Alá Phe Thr Asp Pro Asp 245 250 255
Tyr Phe His Asn Tyr Ala Lys Leu Thr Lys Glu Glu Alá Ile Lys 260 265 270
Ala Met 275 Thr Leu Trp Lys Glu Ile Asn Trp Leu Asn Leu Lys Gin 280 285
lie Leu 290 Pro Thr Arg Glu Arg Alá Ser Leu Ile Leu Thr Lys Ser 295 300
Asn His Alá Val Glu Glu Val Arg Leu Arg Lys 310 315
74.365/BE
182 <210> 3 <211> 319 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 3
Met Lys Asn Lys Glu 1 5
Arg Glu Ser Trp Ser 20
Glu Glu Glu Ala Lys 35
Glu Glu Vai Glu Thr 50
His Vai Lys Ser Ala 65
Lys His Pro His Ser 85
Ser Vai Ala Vai Gly 100
Leu Ser Arg Leu Pro 115
Gly Phe Leu Phe Pro 130
Arg Lys Gly Phe Pro 145
Leu Asn Asp Leu Lys 165
Ser His Leu Thr Tyr 180
Gin Ala Asp lie Vai 195
Thr Leu Glu Asp Asp 210
Phe Asp Phe Ser lie 225
Trp Tyr Leu Glu Arg 245
Leu Asn Leu His Thr 10
Gly Phe Gly Gly His 25
Ala Vai Glu Gly Leu 40 lie Tyr lie Pro Leu 55
Ala Glu Arg Asn Lys 70
Ala Lys lie Pro Phe 90
Lys Ser Thr Thr Ala 105
Asp Arg Pro Lys Vai 120
Thr Ala Glu Leu Lys 135
Glu Ser Tyr Asp Vai 150
Ser Gly Lys Asp Ser 170
Asp Arg Glu Glu Gly 185 lie He Glu Gly He 200
Arg Glu Asn Pro Arg 215
Tyr Vai Asp Ala Glu 230
Phe Arg Leu Leu Arg 250
Leu Tyr Thr Gin His Asn 15
Leu Ser He Ala Vai Ser 30
Asn Asp Tyr Leu Ser Vai 45
Vai Arg Leu Leu His Leu 60
His Vai Asn Vai Phe Leu 75 80
He lie Gly He Ala Gly 95
Arg lie Leu Gin Lys Leu 110
Ser Leu lie Thr Thr Asp 125
Lys Lys Asn Met Met Ser 140
Lys Ala Leu Leu Glu Phe 155 160
Vai Lys Ala Pro Vai Tyr 175
Vai Phe Glu Vai Vai Glu 190
Asn Vai Leu Gin Ser Pro 205
He Phe Vai Ser Asp Phe 220
Glu Ser Arg He Phe Thr 235 240
Glu Thr Ala Phe Gin Asn 255
74.365/BE
183
Pro Asp Ser Tyr Phe His Lys Phe 260
Asp Glu Met Ala Ala Ser He Trp 275280
Tyr Glu Asn He Leu Pro Thr Lys 290295
Lys Gly Asp Gly His Lys Vai Glu 305310
Lys Asp Leu Ser Asp Gin Glu Ala
265270
Glu Ser Vai Asn Arg Pro Asn Leu
285
Phe Arg Ser Asp Leu lie Leu Arg
300
Glu Vai Leu Vai Arg Arg Vai
315 <210> 4 <211> 312 < 212> PRT < 213> Mycobacterium leprae < 400> 4
Met Pro Arg Leu Ser Glu Pro Ser 15
Gin Trp Arg Ala Leu Arg Met Ser 20
Glu Leu lie Gly Leu Arg Gly Leu 3540
Vai Glu Glu Vai Tyr Leu Pro Leu 5055
Ala Ala Arg Gin Arg Leu Phe Ala 6570
Pro Gin Gin Asn Pro Gly Arg Pro 85
Gly Ser Vai Ala Vai Gly Lys Ser 100
Leu Leu Ala Arg Trp Asp His His 115120
Asp Gly Phe Leu Tyr Pro Asn Ala 130135
His Arg Lys Gly Phe Pro Glu Ser
145150
Phe Vai Thr Ser Vai Lys Ser Gly 165
Tyr Ser His Leu Arg Tyr Asp Thr 180
Pro Tyr Vai Glu Phe Asp Arg Lys 10 15
Thr Pro Leu Ala Leu Thr Glu Glu 25 30
Gly Glu Gin lie Asp Leu Leu Glu 45
Ala Arg Leu He His Leu Gin Vai 60
Ala Thr Ala Glu Phe Leu Gly Glu 7580
Vai Pro Phe He He Gly Vai Ala 9095
Thr Thr Ala Arg Vai Leu Gin Ala 105HO
Thr Arg Vai Asp Leu Vai Thr Thr 125
Glu Leu Gly Arg Arg Asn Leu Met 140
Tyr Asn Arg Arg Ala Leu Met Arg 155160
Ala Asp Tyr Ala Cys Ala Pro Vai 170175
He Pro Gly Ala Lys His Vai Vai 185190
74.365/BE
184
Arg His Pro Asp lie 195
Gly Pro Thr Leu Met 210
Asp Ala Arg lie Gin 225
Ala Met Arg Gly Thr 245
Tyr Ser Ala Leu Thr 260
Trp Arg Ser He Asn 275
Arg Pro Arg Ala Thr 290
Asn Arg Leu Arg Leu 305
Leu He Leu Glu Gly 200
Vai Ser Asp Leu Phe 215
Asp He Glu Gin Trp 230
Ala Phe Ala Asp Pro 250
Asp Ser Lys Ala lie 265
Arg Pro Asn Leu Vai 280
Leu Vai Leu Arg Lys 295
Arg Lys Leu 310
Leu Asn Vai Leu Gin Thr 205
Asp Phe Ser Leu Tyr Vai 220
Tyr Vai Ser Arg Phe Leu 235 240
Glu Ser His Phe His His 255 lie Ala Ala Arg Glu lie 270
Glu Asn lie Leu Pro Thr 285
Asp Ala Asp His Ser lie 300 <210> 5 <2H> 312 < 212> PRT < 213> Mycobacterium tuberculosis < 400> 5
Met Ser Arg Leu Ser Glu Pro Ser Pro Tyr Vai Glu Phe Asp Arg Arg 1 5 1015
Gin Trp Arg Ala Leu Arg Met Ser Thr Pro Leu Ala Leu Thr Glu Glu 20 2530
Glu Leu Vai Gly Leu Arg Gly Leu Gly Glu Gin He Asp Leu Leu Glu 35 4045
Vai Glu Glu Vai Tyr Leu Pro Leu Ala Arg Leu He His Leu Gin Vai 50 5560
Ala Ala Arg Gin Arg Leu Phe Ala Ala Thr Ala Glu Phe Leu Gly Glu 65 70 7580
Pro Gin Gin Asn Pro Asp Arg Pro Vai Pro Phe He He Gly Vai Ala 85 9095
Gly Ser Vai Ala Vai Gly Lys Ser Thr Thr Ala Arg Vai Leu Gin Ala 100 105HO
Leu Leu Ala Arg Trp Asp His His Pro Arg Vai Asp Leu Vai Thr Thr 115 120125
74.365/BE
185
Asp Gly Phe Leu Tyr 130
His Arg Lys Gly Phe 145
Phe Vai Thr Ser Vai
165
Tyr Ser His Leu His 180
Arg His Pro Asp lie 195
Gly Pro Thr Leu Met 210
Asp Ala Arg He Glu 225
Ala Met Arg Thr Thr
245
Tyr Ala Ala Phe Ser 260
Trp Arg Thr He Asn 275
Arg Pro Arg Ala Thr 290
Asn Arg Leu Arg Leu 305
Pro Asn Ala Glu Leu 135
Pro Glu Ser Tyr Asn 150
Lys Ser Gly Ser Asp 170
Tyr Asp lie lie Pro 185
Leu lie Leu Glu Gly 200
Vai Ser Asp Leu Phe 215
Asp lie Glu Gin Trp 230
Ala Phe Ala Asp Pro
250
Asp Ser Gin Ala Vai 265
Arg Pro Asn Leu Vai 280
Leu Vai Leu Arg Lys 295
Arg Lys Leu 310
Gin Arg Arg Asn Leu Met 140
Arg Arg Ala Leu Met Arg 155 160
Tyr Ala Cys Ala Pro Vai 175
Gly Ala Glu Gin Vai Vai 190
Leu Asn Vai Leu Gin Thr 205
Asp Phe Ser Leu Tyr Vai 220
Tyr Vai Ser Arg Phe Leu 235 240
Glu Ser His Phe His His 255
Vai Ala Ala Arg Glu He 270
Glu Asn lie Leu Pro Thr 285
Asp Ala Asp His Ser He 300 <210> 6 <211> 329 < 212> PRT < 213> Streptomyces coelicolor < 400> 6
Met lie Ser Pro Vai Pro Ser lie Pro Arg Ser Ala His Arg Gin Arg 1 5 1015
Pro Glu Ala Thr Pro Tyr Vai Asp Leu Thr Arg Pro Glu Trp SerAla
2530
Leu Arg Asp Lys Thr Pro Leu Pro Leu Thr Ala Glu Glu Vai Glu Lys 35 4045
Leu Arg Gly Leu Gly Asp Vai lie Asp Leu Asp Glu Vai Arg Aso lie 50 5560
74.365/BE
186
Tyr 65 Leu Pro Leu Ser Arg 70 Leu Leu Asn Leu Tyr 75
Gly Leu Arg Gly Ala 85 Leu Asn Thr Phe Leu 90 Gly
Ser Gly Thr Pro 100 Phe Vai He Gly Vai 105 Ala Gly
Lys Ser Thr Vai Ala Arg Leu Leu Gin Ala Leu
115 120
Vai Gly Ala Thr Asp 80
Glu Gin Gly Ser 95 Gin
Ser Vai Ala 110 Vai Gly
Leu Ser 125 Arg Trp Pro
Glu His 130 Pro Arg Vai Glu Leu 135 Vai Thr Thr Asp Gly 140 Phe Leu Leu Pro
Thr 145 Arg Glu Leu Glu Ala 150 Arg Gly Leu Met Ser 155 Arg Lys Gly Phe Pro 160
Glu Ser Tyr Asp Arg 165 Arg Ala Leu Thr Arg 170 Phe Vai Ala Asp He 175 Lys
Ala Gly Lys Ala 180 Glu Vai Thr Ala Pro 185 Vai Tyr Ser His Leu 190 He Tyr
Asp He Vai 195 Pro Asp Gin Arg Leu 200 Vai Vai Arg Arg Pro 205 Asp He Leu
He Vai 210 Glu Gly Leu Asn Vai 215 Leu Gin Pro Ala Leu 220 Pro Gly Lys Asp
Gly 225 Arg Thr Arg Vai Gly 230 Leu Ala Asp Tyr Phe 235 Asp Phe Ser Vai Tyr 240
Vai Asp Ala Arg Thr 245 Glu Asp He Glu Arg 250 Trp Tyr Leu Asn Arg 255 Phe
Arg Lys Leu Arg 260 Ala Thr Ala Phe Gin 265 Asn Pro Ser Ser Tyr 270 Phe Arg
Lys Tyr Thr 275 Gin Vai Ser Glu Glu 280 Glu Ala Leu Asp Tyr 285 Ala Arg Thr
Thr Trp 290 Arg Thr He Asn Lys 295 Pro Asn Leu Vai Glu 300 Asn Vai Ala Pro
Thr 305 Arg Gly Arg Ala Thr 310 Leu Vai Leu Arg Lys 315 Gly Pro Asp His Lys 320
Vai Gin Arg Leu Ser Leu Arg Lys Leu
325
74.365/BE
187 <210> 7 <211> 265 <212> PRT <213> Streptomyces coelicolor <400> 7
Met Leu Leu Thr He Asp Vai Gly 15
Phe Asp Gly Glu Asp He Vai Glu 20
Arg Arg Thr Ala Asp Glu Leu Ala 3540
Met His Pro Leu Leu Gly Asp Glu 5055
Ala lie Cys Ala Thr Vai Pro Ser 6570
Thr Arg Arg Tyr Tyr Gly Asp Vai 85
Vai Lys Thr Gly Vai Pro lie Leu 100
Ala Asp Arg He He Asn Ala Vai 115120
Pro Ala He Vai Vai Asp Phe Gly 130135
Ser Ala Arg Gly Glu Tyr He Gly 145150
He Ser Vai Glu Ala Leu Gly Vai 165
Glu Vai Ala Arg Pro Arg Ser Vai 180
Met Gin Ser Gly He Vai Tyr Gly 195200
Vai Asn Arg Met Ala Arg Glu Leu 210215
Vai He Ala Thr Gly Gly Leu Ala 225230
Vai He Asp Glu His Glu Pro Trp 245
Asn Thr His Thr Vai Leu Gly Leu 1015
His Trp Arg He Ser Thr Asp Ser 2530
Vai Leu Leu Gin Gly Leu Met Gly 45
Leu Gly Asp Gly He Asp Gly He 60
Vai Leu His Glu Leu Arg Glu Vai 75 80
Pro Ala Vai Leu Vai Glu Pro Gly 90 95
Thr Asp His Pro Lys Glu Vai Gly 105 HQ
Ala Ala Vai Glu Leu Tyr Gly Gly 125
Thr Ala Thr Thr Phe Asp Ala Vai 140
Gly Vai He Ala Pro Gly He Glu 155160
Lys Gly Ala Gin Leu Arg Lys lie 170175
He Gly Lys Asn Thr Vai Glu Ala
185190
Phe Ala Gly Gin Vai Asp Gly Vai 205
Ala Asp Asp Pro Asp Asp Vai Thr 220
Pro Met Vai Leu Gly Glu Ser Ser 235 240
Leu Thr Leu Met Gly Leu Arg Leu 250 255
74.365/BE
188
Vai Tyr Glu Arg Asn Vai Ser Arg Met
260 265 <210> 8 <211> 272 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 8 Met Leu 1 Leu Ala He 5 Asp Vai Arg Asn Thr 10 His Thr Vai Vai Gly 15 Leu
Leu Ser Gly Met 20 Lys Glu His Ala Lys 25 Vai Vai Gin Gin Trp 30 Arg He
Arg Thr Glu 35 Ser Glu Vai Thr Ala 40 Asp Glu Leu Ala Leu 45 Thr He Asp
Gly Leu 50 He Gly Glu Asp Ser 55 Glu Arg Leu Thr Gly 60 Thr Ala Ala Leu
Ser 65 Thr Vai Pro Ser Vai 70 Leu His Glu Vai Arg 75 He Met Leu Asp Gin 80
Tyr Trp Pro Ser Vai 85 Pro His Vai Leu He 90 Glu Pro Gly Vai Arg 95 Thr
Gly He Pro Leu 100 Leu Vai Asp Asn Pro 105 Lys Glu Vai Gly Ala 110 Asp Arg
He Vai Asn 115 Cys Leu Ala Ala Tyr 120 Asp Arg Phe Arg Lys 125 Ala Ala He
Vai Vai 130 Asp Phe Gly Ser Ser 135 He Cys Vai Asp Vai 140 Vai Ser Ala Lys
Gly 145 Glu Phe Leu Gly Gly 150 Ala He Ala Pro Gly 155 Vai Gin Vai Ser Ser 160
Asp Ala Ala Ala Ala 165 Arg Ser Ala Ala Leu 170 Arg Arg Vai Glu Leu 175 Ala
Arg Pro Arg Ser 180 Vai Vai Gly Lys Asn 185 Thr Vai Glu Cys Met 190 Gin Ala
Gly Ala Vai 195 Phe Gly Phe Ala Gly 200 Leu Vai Asp Gly Leu 205 Vai Gly Arg
He Arg 210 Glu Asp Vai Ser Gly 215 Phe Ser Vai Asp His 220 Asp Vai Ala He
Vai 225 Ala Thr Gly His Thr 230 Ala Pro Leu Leu Leu 235 Pro Glu Leu His Thr 240
74.365/BE
189
Vai Asp His Tyr Asp Gin His Leu Thr Leu Gin
245 250
Gly Leu Arg Leu Vai
255
Phe Glu Arg Asn Leu Glu Vai Gin Arg Gly Arg Leu Lys Thr Ala Arg
260 265 270 <210> 9 <211> 258 < 212> PRT < 213> Bacillus subtilis < 400> 9
Leu Leu Leu Vai lie Asp Vai Gly Asn Thr Asn Thr Vai Leu Gly Vai 1 5 1015
Tyr His Asp Gly Lys Leu Glu Tyr His Trp Arg He Glu Thr Ser Arg 20 2530
His Lys Thr Glu Asp Glu Phe Gly Met He Leu Arg Ser Leu Phe Asp 35 4045
His Ser Gly Leu Met Phe Glu Gin He Asp Gly He He He Ser Ser 50 5560
Vai Vai Pro Pro He Met Phe Ala Leu Glu Arg Met Cys Thr Lys Tyr 65 70 7580
Phe His lie Glu Pro Gin He Vai Gly Pro Gly Met Lys Thr Gly Leu 85 9095
Asn He Lys Tyr Asp Asn Pro Lys Glu Vai Gly Ala Asp Arg He Vai 100 105HQ
Asn Ala Vai Ala Ala He His Leu Tyr Gly Asn Pro Leu He Vai Vai U5 120125
Asp Phe Gly Thr Ala Thr Thr Tyr Cys Tyr He Asp Glu Asn Lys Gin 130 135140
Tyr Met Gly Gly Ala lie Ala Pro Gly lie Thr lie Ser Thr GluAla
145 150 155160
Leu Tyr Ser Arg Ala Ala Lys Leu Pro Arg lie Glu lie Thr ArgPro
165 170175
Asp Asn He He Gly Lys Asn Thr Vai Ser Ala Met Gin Ser Gly He 180 185190
Leu Phe Gly Tyr Vai Gly Gin Vai Glu Gly lie Vai Lys Arg Met Lvs 195 200205
74.365/BE
190
Trp Gin Ala Lys Gin Asp Leu Lys
210 215
Pro Leu lie Ala Asn Glu Ser Asp
225 230
Leu Thr Leu Lys Gly Leu Glu Leu
245
Vai He Ala Thr Gly Gly Leu Ala 220
Cys lie Asp He Vai Asp Pro Phe 235 240
He Tyr Glu Arg Asn Arg Vai Gly 250 255
Ser Vai <210> 10 <211> 262 <212> PRT <213> Deinococcus radiopugnans <400> 10
Met Pro Ala Phe Pro Leu Leu Ala 15
Vai Leu Gly Leu Ala Asp Ala Ser 20
He Arg Thr Asn Arg Glu Met Leu 3540
His Gly Leu Phe Thr Leu Ala Gly 5055
Leu Ser Ser Vai Ala Pro Pro Vai 6570
Lys Arg His Phe Met He Asp Ala 85
Pro Asp Vai Thr Vai Glu Leu Asp 100
Arg Leu Cys Asn Leu Phe Gly Ala 115120
Tyr Ala Vai Vai Vai Asp Phe Gly 130135
Gly Arg Gly Arg Arg Phe Leu Gly 145150
Vai Ser Ala Asp Ala Leu Phe Ala 165
Vai Asp He Gly Asn Thr Thr Thr 1015
Gly Ala Leu Thr His Thr Trp Arg 2530
Pro Asp Asp Leu Ala Leu Gin Leu 45
Ala Pro He Pro Arg Ala Ala Vai 60
Gly Glu Asn Tyr Ala Leu Ala Leu 75 80
Phe Ala Vai Ser Ala Glu Asn Leu 90 95
Thr Pro Gly Ser Vai Gly Ala Asp 105 HQ
Glu Lys Tyr Leu Gly Gly Leu Asp 125
Thr Ser Thr Asn Phe Asp Vai Vai 140
Gly He Leu Ala Thr Gly Ala Gin 155 Igo
Arg Ala Ala Lys Leu Pro Arg Tie 170 175
74.365/BE
191
Thr Leu Gin Ala Pro 180
Leu Gin Ser Gly Leu 195
Leu Arg Arg lie Arg 210
Thr Gly Gly Phe Ser 225
Tyr Tyr Asp Glu Thr 245
Ser Arg Ser Glu Vai 260
Glu Thr Ala lie Gly 185
Vai Phe Gly Tyr Ala 200
Ala Glu Leu Pro Gly 215
Arg Thr Vai Gin Gly 230
Leu Thr Leu Arg Gly 250
Arg
Lys Asn Thr Vai His Ala 190
Glu Met Vai Asp Gly Leu 205
Glu Ala Vai Ala Vai Ala 220 lie Cys Gin Glu lie Asp
235 240
Leu Vai Glu Leu Trp Ala 255 <210> 11 <211> 212 <212> PRT <213> Desulfovibrio vulgaris <400> 11
Met Thr Gin His Phe Leu Leu 1 5
He Gly He Ala Vai Glu Thr 20
Thr Asp Pro Gly Gin Thr Thr 35
Vai Leu Arg His Ala Gly Leu 50 55
Ala Ser Ser Vai Vai Pro Gly 65 70
Glu Arg Tyr Leu Tyr Arg Lys 85
He Pro Leu Asp Asn Arg Tyr 100
Arg Leu Vai Ala Ala Tyr Ala 115
Ser Leu Vai Ser Vai Asp Phe
130 135
Glu Gly Gly Ala Tyr Leu Gly 145 150
Phe Asp He Gly Asn Thr Asn Vai Lys 1015
Ala Vai Leu Thr Ser Tyr Vai Leu Pro 2530
Asp Ser He Gly Leu Arg Leu Leu Glu 4045
Gly Pro Ala Asp Vai Gly Ala Cys Vai 60
Vai Asn Pro Leu He Arg Arg Ala Cys 7580
Leu Leu Phe Ala Pro Gly Asp He Ala 9095
Glu Arg Pro Ala Glu Vai Gly Ala Asp 105no
Ala Arg Arg Leu Tyr Pro Gly Pro Arg 120125
Gly Thr Ala Thr Thr Phe Asp Cys Vai 140
Gly Leu He Cys Pro Gly Vai Leu Ser 155160
74.365/BE
192
Ser Ala Gly Ala Leu Ser Ser Arg 165
Leu Glu Vai Glu Glu Asp Ser Pro 180
Ser Leu Asn His Gly Phe He Phe 195200
Vai Leu Ala Ala
210
Thr Ala Lys Leu Pro Arg lie Ser 170175
Vai lie Gly Arg Ser Thr Thr Thr
185190
Gly Phe Ala Ala Met Thr Glu Gly
205 <210> 12 <211> 246 <212> PRT <213> Thermotoga maritima <400> 12
Met Tyr Leu Leu Vai 1 5
Thr Glu Asp Gly Lys 20
Phe Gin Thr Glu Asp 35
Asp Ala Met Arg Glu 50
Thr Gin Asn Thr Vai 65
Ser Pro lie Trp Vai 85
Lys Asn Pro Ser Glu 100
Phe Vai Lys Glu Tyr 115
Ala Thr Thr Vai Asp 130
He Leu Pro Gly Phe 145
Ala Lys Leu Pro Leu 165
Lys Asp Thr Glu Glu 180
Asp Vai Gly Asn Thr His 10
Thr Phe Arg Arg Trp Arg 25
Glu Leu Phe Ser His Leu 40
He Lys Gly lie Gly Vai 55
He Glu Arg Phe Ser Gin 70 75
Lys Ala Lys Asn Gly Cys 90
Vai Gly Ala Asp Arg Vai 105
Gly Lys Asn Gly lie lie 120
Leu Vai Vai Asn Gly Ser 135
Phe Met Met Vai His Ser
150 155
Vai Glu Vai Lys Pro Ala 170
Asn He Arg Leu Gly Vai 185
Ser Vai Phe Ser lie 15
Leu Ser Thr Gly Vai 30
His Pro Leu Leu Gly 45
Ala Ser Vai Vai Pro 60
Lys Tyr Phe His He 80
Vai Lys Trp Asn Vai 95
Ala Asn Vai Vai Ala 110
He Asp Met Gly Thr 125
Tyr Glu Gly Gly Ala 140
Leu Phe Arg Gly Thr 160
Asp Phe Vai Vai Gly 175
Vai Asn Gly Ser Vai 190
74.365/BE
193
Tyr Ala Leu Glu Gly He 195
Leu Pro Vai Vai Leu Thr 210
He Lys His Glu lie Phe
225230
He Gly Arg lie Lys Glu Vai 200205
Gly Gly Gin Ser Lys He Vai 215220
Asp Glu Asp Leu Thr lie Lys 235
Tyr Gly Asp
Lys Asp Met
Gly Vai Tyr
240
His Phe Cys Phe Gly Asp
245 <210> 13 <211> 273 < 212> PRT < 213> Treponema pallidum < 400> 13
Met Leu Leu lie Asp Vai Gly 1 5
Gly Glu Asn Gly Gly Arg Vai 20
Pro Asp Ala Arg Lys Thr Gin 35
Leu Cys Glu Arg Ala Gly Vai 50 55
He Ser Ser Vai Vai Pro Vai 65 70
Ala Gin He Ser Gly Vai Gin 85
Glu His Leu Pro Vai Arg lie 100
Thr Asp Leu Vai Ala Asn Ala 115
Ala Cys Vai Vai Vai Asp Cys 130 135
Asp Gly Thr Gly Leu lie Gin 145 150
Thr Ala Vai Gin Ser Leu His 165
Pro Leu Ala Leu Pro Asp Ser 180
Asn Ser His Vai Vai Phe Gly He Gin 1015
Cys Vai Arg Glu Leu Phe Arg Leu Ala 2530
Asp Glu Tyr Ser Leu Leu He His Ala 4045
Gly Arg Ala Ser Leu Arg Asp Ala Phe 60
Leu Thr Lys Thr He Ala Asp Ala Vai 7580
Pro Vai Vai Phe Gly Pro Trp Ala Tyr 9095
Pro Glu Pro Vai Arg Ala Glu He Gly 105HO
Vai Ala Ala Tyr Vai His Phe Arg Ser 120125
Gly Thr Ala Leu Thr Phe Thr Ala Vai 140
Gly Vai Ala He Ala Pro Gly Leu Arg 155160
Thr Gly Thr Ala Gin Leu Pro Leu Vai 170175
Vai Leu Gly Lys Asp Thr Thr His Ala 185190
74.365/BE
194
Vai Gin Ala Gly Vai Vai Arg Gly
195200 lie Ala Gin Cys Gin Lys Glu Leu
210215
Thr Gly Gly Leu Ser Arg Leu Phe
225230 lie Asp Ala Gin Leu Thr Leu Ser
245
Vai Pro Thr Ser Leu Leu Pro Pro
260
Asn
Thr Leu Phe Vai He Arg Ala. Met 205
Gly Cys Arg Cys Ala Ala Vai He 220
Ser Ser Glu Vai Asp Phe Pro Pro 235240
Gly Leu Ala His He Ala Arg Leu 250255
Ala Thr Vai Ser Gly Ser Ser Gly 265270 <210> 14 <2H> 262 <212> PRT <213> Borrelia burgdorferi <400> 14
Met Asn Lys Pro Leu Leu Ser Glu 15
Ser lie Ala Phe Ala Leu Phe Lys 20
Lys Met Lys Thr Asn Leu Met Leu 3540
Phe Glu Glu Asn Phe Asp Phe Asn 5055
Vai Vai Pro lie Leu Asn Glu Thr 6570
Phe Lys lie Lys Pro Leu Phe lie 85
Thr Phe Asn Pro Tyr Lys Ser Asp 100
Phe Ala Asn Leu Vai Ala Ala lie 115120
Leu Vai Vai Asp Leu Gly Thr Ala 130135
Gin Asp Gly lie Leu Gly Gly lie 145150
Leu He He Asp He Gly Asn Thr 1015
Asp Asn Gin Vai Asn Leu Phe He 2530
Arg Tyr Asp Glu Vai Tyr Ser Phe 45
Vai Asn Lys Vai Phe He Ser Ser 60
Phe Lys Asn Vai lie Phe Ser Phe 7580
Gly Phe Asp Leu Asn Tyr Asp Leu 9095
Lys Phe Leu Leu Gly Ser Asp Vai 105HO
Glu Asn Tyr Ser Phe Glu Asn Vai 125
Cys Thr He Phe Ala Vai Ser Arg 140
He Asn Ser Gly Pro Leu lie Asn
155 160
74.365/BE
195
Phe Asn Ser Leu Leu Asp Asn Ala 165
Ser Thr Pro Asn Asn Leu Leu Glu 180
Ser Gly Leu Phe Tyr Gin Tyr Lys 195200
Asp lie Lys Gin Met Tyr Lys Lys 210215
Gly Asn Ala Asp Leu lie Leu Ser 225230
Asn Tie His Leu Thr Vai Glu Gly 245
Asp Phe Lys Phe Vai Asn 260
Tyr Leu lie Lys Lys Phe Pro lie 170 175
Arg Thr Thr Ser Gly Ser Vai Asn 185 190
Tyr Leu Tie Glu Gly Vai Tyr Arg 205
Lys Phe Asn Leu He He Thr Gly 220
Leu lie Glu Tie Glu Phe Tie Phe 235 240
Vai Arg Tie Leu Gly Asn Ser lie 250 255 <210> 15 <211> 229 <212> PRT <213> Aquifex aeolicus <400> 15
Met Arg Phe Leu Thr Vai Asp Vai 15
Leu Trp Glu Gly Lys Lys Vai Lys 20
Glu Phe Leu Lys Glu Glu Phe Pro 354 o
Vai Lys Gin Ser Phe Ser Glu Lys 5055
Lys Phe Leu Lys Lys Glu Asn Phe
657 0
Pro Glu Thr Leu Gly Thr Asp Arg 85
Lys Phe Tyr Gly Lys Asn Vai Vai 100
Vai lie Asp Leu Vai Leu Glu Gly 115120
Leu Gly Leu Gly Lys Lys Leu Lys 130135
Gly Asn Ser Ser Vai Asp lie Ala 1015
Asp Phe Leu Lys Leu Ser His Glu 2530
Lys Leu Lys Ala Leu Gly lie Ser 45
Vai Arg Gly Lys lie Pro Lys lie 60
Pro Tie Gin Vai Asp Tyr Lys Thr 7580
Vai Ala Leu Ala Tyr Ser Ala Lys 9095
Vai Tie Ser Ala Gly Thr Ala Leu 105HO
Lys Phe Lys Gly Gly Phe He Thr 125
He Leu Ser Asp Leu Ala Glu Gly 140
74.365/BE
196 lie Pro Glu Phe Phe 145
Thr Arg Glu Cys Vai 165 lie Lys Ser Thr Leu 180
Lys Vai Vai lie Thr 195 lie Tyr Asp Pro Leu 210
Leu Tyr His Arg He 225 <210> 16 <211> 257 <212> PRT <213> Synechocystis <400> 16
Met Glu Thr Ser Lys 1 5
Gin Lys Pro Trp Leu 20
Ala Tyr Cys Ser Gly 35
Asn Pro Lys Ser Ala 50
Met Leu Ala Ser Vai 65
Gin Pro Lys He Leu 85
Pro Ser Phe Gly lie 100
Thr Tyr Gly Phe Pro 115
He Thr Gly Phe Asp 130
Pro Gly Leu Gly Leu 145
Pro Glu Glu Vai Glu lie Phe Leu Gly Arg Ser 150 155160
Leu Gly Gly Ala Tyr Arg Glu Ser Thr Glu Phe 170175
Lys Leu Trp Arg Lys Vai Phe Lys Arg Lys Phe 185190
Gly Gly Glu Gly Lys Tyr Phe Ser Lys Phe Gly 200 .205
Leu Vai His Arg Gly Met Arg Asn Leu Leu Tyr 215220 sp.
Pro Gly Cys Gly Leu Ala Leu Asp Asn Asp Lys 1015
Gly Leu Met He Gly Asn Ser Arg Leu His Trp 2530
Asn Ala Pro Leu Gin Thr Trp Vai Thr Asp Tyr 4045
Gin Leu Pro Vai Leu Leu Gly Lys Vai Pro Leu 5560
Vai Pro Glu Gin Thr Glu Vai Trp Arg Vai Tyr 70 7580
Thr Leu Lys Asn Leu Pro Leu Vai Asn Leu Tyr 9095
Asp Arg Ala Leu Ala Gly Leu Gly Thr Gly Leu 105HO
Cys Leu Vai Vai Asp Gly Gly Thr Ala Leu Thr 120125
Gin Asp Lys Lys Leu Vai Gly Gly Ala He Leu 135140
Gin Leu Ala Thr Leu Gly Asp Arg Leu Ala Ala 150 155160
74.365/BE
197
Leu Pro Lys Leu Glu Met Asp Gin Leu Thr Glu Leu Pro Asp Arg Trp 165 170175
Ala Leu Asp Thr Pro Ser Ala lie Phe Ser Gly Val Val Tyr Gly Vai 180 185190
Leu Gly Ala Leu Gin Ser Tyr Leu Gin Asp Trp Gin Lys Leu Phe Pro 195 200205
Gly Ala Ala Met Val lie Thr Gly Gly Asp Gly Lys lie Leu His Gly 210 215220
Phe Leu Lys Glu His Ser Pro Asn Leu Ser Val Ala Trp Asp AspAsn
225 230 235240
Leu Ile Phe Leu Gly Met Ala Ala lie His His Gly Asp Arg Prolie
245 250255
Cys <210> 17 <211> 223 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 17
Met Pro Ala Arg Gin Ser Phe Thr 15
Asp Ile Gly Asn Thr Arg lie His 20
Ser Ser Ala Lys Glu Asp Leu Lys 3540
Phe Tyr Ile Ser Val Asn Glu Glu 5055
Tyr Pro Asn Ala Lys Asn Ile Ala 657 0
Tyr Val Gly Leu Gly Ile Asp Arg 85
Asn Gly Val Val Val Asp Ala Gly 100
Lys Glu Gly Lys His Leu Gly Gly 115120
Tyr Ile His Ala Tyr Lys Lys Ser 130135
Asp Leu Lys Asn Leu Val Leu Cys 1015
Phe Ala Gin Asn Tyr Gin Leu Phe 2530
Arg Leu Gly lie Gin Lys Glu lie 45
Asn Glu Lys Ala Leu Leu Asn Cys 60
Gly Phe Phe His Leu Glu Thr Asp 7580
Gin Met Ala Cys Leu Ala Val Asn 9095
Ser Ala Ile Thr lie Asp Leu lie 105HO
Cys lie Leu Pro Gly Leu Ala Gin 125
Ala Lys Ile Leu Glu Gin Pro Phe 140
74.365/BE
198
Lys 145 Ala Leu Asp Ser Leu 150 Glu Vai Leu Pro Lys 155 Ser Thr Arg Asp Ala 160
Vai Asn Tyr Gly Met Vai Leu Ser Vai He Ala Cys He Gin His Leu
165
170
175
Ala Lys Asn Gin 180 Lys He Tyr Leu Cys 185 Gly Gly Asp Ala Lys 190
Ser Ala Phe Leu Pro His Ser Vai Cys Lys Glu Arg Leu Vai
195 200 205
Gly Met Glu lie Ala Leu Lys Lys Ala Gly He Leu Glu Cys
Tyr
Phe
Lys
210
215
220
Leu
Asp <210> 18 <211> 267 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 18
Met He lie Leu Tie Asp Ser Gly 15
Phe Asp Pro Asp Ala Pro Gin Ala 20
Phe Asp Asn Leu Asp Leu Asp Ala 3540
Pro Arg Arg Pro Gin Arg Ala Leu 5055
Arg Gly Glu Ala lie Ala Ala Thr 6570
Arg Trp Leu Arg Ala Gin Pro Leu 85
Arg Asn Pro Asp Gin Leu Gly Ala 100
Vai Leu Ala Arg Gin Pro Ser Vai 115120
Phe Gly Thr Ala Thr Thr Leu Asp 130135
Pro Gly Gly Leu lie Leu Pro Gly
145150
Ala Tyr Gly Thr Ala His Leu Pro 165
Asn Ser Arg Leu Lys Vai Gly Trp 1015
Ala Arg Glu Pro Ala Pro Vai Ala 2530
Leu Gly Arg Trp Leu Ala Thr Leu 45
Gly Vai Asn Vai Ala Gly Leu Ala 60
Leu Arg Ala Gly Gly Cys Asp lie 7580
Ala Met Gly Leu Arg Asn Gly Tyr 9095
Asp Arg Trp Ala Cys Met Vai Gly 105HO
His Pro Pro Leu Leu Vai Ala Ser 125
Thr lie Gly Pro Asp Asn Vai Phe 140
Pro Ala Met Met Arg Gly Ala Leu 155 160
Leu Ala Asp Gly Leu Vai Ala Asp 170 . 175
74.365/BE
199
Tyr Pro He Asp Thr His Gin Ala 180
Gin Ala Gly Ala lie Vai Arg Gin 195200
Gly Gin Ala Pro Glu lie Tyr Vai 210215
Arg Gin Glu Ala Glu Arg Leu Leu 225230
Ala Thr Pro Gin Pro Thr Tyr Leu 245
Ala Ala Leu Ala Ala Gin Gly Ala 260
He Ala Ser Gly He Ala Ala Ala 185 190
Trp Leu Ala Gly Arg Gin Arg Tyr 205
Ala Gly Gly Gly Trp Pro Glu Vai 220
Ala Vai Thr Gly Ala Ala Phe Gly 235 240
Asp Ser Pro Vai Leu Asp Gly Leu 250 255
Pro Thr Ala
265 <210> 19 <211> 777 < 212> DNA < 213> Bacillus subtilis <220>
< 221> CDS < 222> (1). . (774) <400> 19
ttg tta ctg gtt ate gat gtg ggg aac acc aat act gta ett ggt gta 48
Leu Leu Leu Vai He Asp Val Gly Asn Thr Asn Thr Val Leu Gly Val
1 5 10 15
tat cat gat gga aaa tta gaa tat cac tgg cgt ata gaa aca age agg 96
Tyr His Asp Gly Lys Leu Glu Tyr His Trp Arg He Glu Thr Ser Arg
20 25 30
cat aaa aca gaa gat gag ttt ggg atg att ttg ege tcc tta ttt gat 144
His Lys Thr Glu Asp Glu Phe Gly Met He Leu Arg Ser Leu Phe Asp
35 40 45
cac tcc ggg ett atg ttt gaa cag ata gat ggc att att att teg tea 192
His Ser Gly Leu Met Phe Glu Gin He Asp Gly He He He Ser Ser
50 55 60
gta gtg ccg cca ate atg ttt geg tta gaa aga atg tgc aca aaa tac 240
Vai Vai Pro Pro He Met Phe Ala Leu Glu Arg Met Cys Thr Lys Tyr
65 70 75 80
ttt cat ate gag cet caa att gtt ggt cca ggt atg aaa acc ggt tta 288
Phe His He Glu Pro Gin He Val Gly Pro Gly Met Lys Thr Gly Leu
85 90 95
74.365/BE
200
aat ata aaa tat gac aat ccg aaa gaa gta ggg gca gac aga ate gta 336
Asn He Lys Tyr Asp Asn Pro Lys Glu Vai Gly Ala Asp Arg He Vai
100 105 110
aat get gtc got geg ata cac ttg tac ggc aat cca tta att gtt gtc 384
Asn Ala Vai Ala Ala He His Leu Tyr Gly Asn Pro Leu He Vai Vai
115 120 125
gat ttc gga acc gcc aca acg tac tgc tat att gat gaa aac aaa caa 432
Asp Phe Gly Thr Ala Thr Thr Tyr Cys Tyr He Asp Glu Asn Lys Gin
130 135 140
tac atg ggc ggg geg att gcc cct ggg att aca att teg aca gag geg 480
Tyr Met Gly Gly Ala He Ala Pro Gly He Thr He Ser Thr Glu Ala
145 150 155 160
ctt tac teg cgt gca gca aag ctt cct cgt ate gaa ate acc egg ccc 528
Leu Tyr Ser Arg Ala Ala Lys Leu Pro Arg He Glu He Thr Arg Pro
165 170 175
gac aat att ate gga aaa aac act gtt age geg atg caa tet gga att 576
Asp Asn He lie Gly Lys Asn Thr Vai Ser Ala Met Gin Ser Gly He
180 185 190
tta ttt ggc tat gtc ggc caa gtg gaa gga ate gtt aag ega atg aaa 624
Leu Phe Gly Tyr Vai Gly Gin Vai Glu Gly He Vai Lys Arg Met Lys
195 200 205
tgg cag gca aaa cag gac etc aag gtc att geg aca gga ggc ctg geg 672
Trp Gin Ala Lys Gin Asp Leu Lys Vai He Ala Thr Gly Gly Leu Ala
210 215 220
ccg etc att geg aac gaa tea gat tgt ata gac ate gtt gat cca ttc 720
Pro Leu He Ala Asn Glu Ser Asp Cys He Asp He Vai Asp Pro Phe
225 230 235 240
tta acc eta aaa ggg ctg gaa ttg att tat gaa aga aac ege gta gga 768
Leu Thr Leu Lys Gly Leu Glu Leu He Tyr Glu Arg Asn Arg Vai Gly
245 250 255
agt gta tag
Ser Vai < 210> 20 <211> 960 < 212> DNA < 213> Bacillus subtilis <220>
< 221> CDS < 222> (1)..(957)
74.3 65/BE
201 <400> 20 gtg aaa aat aaa gaa ctt aac eta cat act tta tat aca cag cac aat48
Met Lys Asn Lys Glu Leu Asn Leu His Thr Leu Tyr Thr Gin HisAsn 15 1015 egg gag tet tgg tet ggt ttt ggg ggg cat ttg teg att get gta tet96
Arg Glu Ser Trp Ser Gly Phe Gly Gly His Leu Ser He Ala VaiSer
2530 gaa gaa gag gca aaa get gtg gaa gga ttg aat gat tat eta tet gtt144 lu Glu Glu Ala Lys Ala Vai Glu Gly Leu Asn Asp Tyr Leu SerVai
4045 gaa gaa gtg gag acg ate tat att cég ctt gtt ege ttg ctt cat tta192
Glu Glu Vai Glu Thr He Tyr He Pro Leu Vai Arg Leu Leu HisLeu 50 5560 cat gtc aag tet geg get gaa ego aat aag cat gtc aat gtt ttt ttg240
His Vai Lys Ser Ala Ala Glu Arg Asn Lys His Vai Asn Vai PheLeu 65 7θ 75 aag cac cca cat tea gee aaa att cog ttt att ate ggc att gee ggc288
Lys His Pro His Ser Ala Lys He Pro Phe He He Gly He AlaGly
9095 agt gtc gca gtc gga aaa age acg acg geg egg ate ttg cag aag ctg336
Ser Vai Ala Vai Gly Lys Ser Thr Thr Ala Arg He Leu Gin LysLeu
100 105HO ctt teg cgt ttg cet gac cgt cca aaa gtg age ctt ate acg aca gat384
Leu Ser Arg Leu Pro Asp Arg Pro Lys Vai Ser Leu He Thr ThrAsp 115 120125 ggt ttt tta ttt cct act gee gag ctg aaa aag aaa aat atg atg tea432
Gly Phe Leu Phe Pro Thr Ala Glu Leu Lys Lys Lys Asn Met Met Ser
130 135140 aga aaa gga ttt cct gaa age tat gat gta aag geg ctg etc gaa ttt480
Arg Lys Gly Phe Pro Glu Ser Tyr Asp Vai Lys Ala Leu Leu Glu Phe 145 Í50 155160 ttg aat gac tta aaa tea gga aag gac age gta aag gee ccg gtg tat528
Leu Asn Asp Leu Lys Ser Gly Lys Asp Ser Vai Lys Ala Pro Vai Tvr 165 170175 tee cat eta acc tat gac ege gag gaa ggt gtg ttc gag gtt gta gaa576
Ser His Leu Thr Tyr Asp Arg Glu Glu Gly Vai Phe Glu Vai VaiGlu
180 185190 cag geg gat att gtg att att gaa ggc att aat gtt ctt cag teg ccc624
Gin Ala Asp lie Vai He lie Glu Gly lie Asn Vai Leu Gin SerPro 195 200205
74.365/BE
202 acc ttg gag gat gac egg gaa aac ccg cgt att ttt gtt tee gat ttc 672
Thr Leu Glu Asp Asp Arg Glu Asn Pro Arg He Phe Vai Ser Asp Phe 210 215220 ttt gat ttt teg att tat gtg gat geg gag gaa age egg att ttc act720
Phe Asp Phe Ser He Tyr Vai Asp Ala Glu Glu Ser Arg He PheThr
225 230 235240 tgg tat tta gag cgt ttt ege ctg ett egg gaa aca get ttt caa aat768
Trp Tyr Leu Glu Arg Phe Arg Leu Leu Arg Glu Thr Ala Phe GinAsn
245 250255 cet gat tea tat ttt cat aaa ttt aaa gac ttg tee gat cag gag get816
Pro Asp Ser Tyr Phe His Lys Phe Lys Asp Leu Ser Asp Gin GluAla
260 265270 gac gag atg gca gee teg att tgg gag agt gtc aac egg ccg aat tta864
Asp Glu Met Ala Ala Ser He Trp Glu Ser Vai Asn Arg Pro AsnLeu
275 280285 tat gaa aat att ttg cca act aaa ttc agg tea gat etc att ttg cgt912
Tyr Glu Asn Tie Leu Pro Thr Lys Phe Arg Ser Asp Leu lie LeuArg
290 295300 aag gga gac ggg cat aag gtc gag gaa gtg ttg gta agg agg gta tga960
Lys Gly Asp Gly His Lys Vai Glu Glu Vai Leu Vai Arq ArqVai 305 310315 <210> 21 <211> 882 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220>
<221> CDS <222> (1)..(879)
<400> 21 ttg teg att get gta tet gaa gaa gag gca aaa Ala Vai Ser Glu Glu Glu Ala Lys get gtg gaa gga ttg Glu Gly Leu 15
Met Ser 1 He Ala Vai
5 10
aat gat tat eta tet gtt gaa gaa gtg gag acg ate tat att ccg ett
Asn Asp Tyr Leu Ser Vai Glu Glu Vai Glu Thr He Tyr lie Pro Leu
20 25 30
gtt ege ttg ett cat tta cat gtc aag tet geg get gaa ege aat aag
Vai Arg Leu 35 Leu His Leu His Vai 40 Lys Ser Ala Ala Glu 45 Arg Asn Lys
cat gtc aat gtt ttt ttg aag cac cca cat tea gee aaa att ccq ttt
His Vai Asn Vai Phe Leu Lys His Pro His Ser Ala Lys He Pro Phe
50 55 60
144
192
74.365/BE
203
att ate ggc att gee ggc agt gtc gca gtc gga aaa age acg acg geg He lie Gly He Ala Gly Ser Vai Ala Vai Gly Lys Ser Thr Thr Ala 65 70 75 80 240
egg f ate : ttg [ cag ' aag ctg । ett teg cgt ttg cct gac : cgt cca aaa gtg 288
Arg lie : Leu ; Gin . Lys Leu Leu Ser Arg Leu Pro > Asp Arg Pro Lys Val
85 90 95
age ett ate acg aca gat ggt ttt tta ttt cct act gee gag ctg aaa 336
Ser Leu . He Thr Thr Asp Gly Phe Leu Phe Pro Thr Ala Glu Leu Lys
100 105 110
aag aaa aat atg atg tea aga aaa gga ttt cct gaa age tat gat gta 384
Lys Lys Asn Met Met Ser Arg Lys Gly Phe Pro Glu Ser Tyr Asp Val
115 120 125
aag geg ctg etc gaa ttt ttg aat gac tta aaa tea gga aag gac age 432
Lys Ala Leu Leu Glu Phe Leu Asn Asp Leu Lys Ser Gly Lys Asp Ser
130 135 140
gta aag gee ccg gtg tat tee cat eta ace tat gac ege gag gaa ggt 480
Vai Lys Ala Pro Val Tyr Ser His Leu Thr Tyr Asp Arg Glu Glu Gly
145 150 155 160
gtg ttc gag gtt gta gaa cag geg gat att gtg att att gaa ggc att 528
Vai Phe Glu Val Val Glu Gin Ala Asp He Val He He Glu Gly He
165 170 175
aat gtt ett cag teg ccc ace ttg gag gat gac egg gaa aac ccg cgt 576
Asn Val Leu Gin Ser Pro Thr Leu Glu Asp Asp Arg Glu Asn Pro Arg
180 185 190
att ttt gtt tee gat ttc ttt gat ttt teg att tat gtg gat geg gag 624
He Phe Val Ser Asp Phe Phe Asp Phe Ser lie Tyr Val Asp Ala Glu
195 200 205
gaa age egg att ttc act tgg tat tta gag cgt ttt ege ctg ett egg 672
Glu Ser 210 Arg lie Phe Thr Trp 215 Tyr Leu Glu Arg Phe 220 Arg Leu Leu Arg
gaa aca get ttt caa aat cct gat tea tat ttt cat aaa ttt aaa gac 720
Glu 225 Thr Ala Phe Gin Asn 230 Pro Asp Ser Tyr Phe 235 His Lys Phe Lys Asp 240
ttg tee gat cag gag get gac gag atg gca gee teg att tgg gag agt 768
Leu Ser Asp Gin Glu Ala Asp Glu Met Ala Ala Ser He Trp Glu Ser
245 250 255
gtc , aac egg ccg aat tta tat gaa aat att ttg cca act aaa ttc agg 816
val Asn Arg Pro . 260 Asn i Leu Tyr Glu Asn 265 He Leu Pro Thr Lys 270 Phe . -3 -3 Arg
74.365/BE
204
tea gat etc att ttg cgt aag gga gac ggg cat aag gtc gag gaa gtg
Ser Asp Leu lie Leu Arg Lys Gly Asp Gly His Lys Vai Glu Glu Val
275 280 285
ttg gta agg agg gta tga
Leu Vai Arg Arg Vai
290
864
882 <210> 22 <211> 846 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220>
<221> CDS <222> (1)..(843) <400> 22
gtg gaa gga ttg aat gat tat eta tet gtt gaa gaa gtg gag acg ate 48
Met Glu Gly Leu Asn Asp Tyr Leu Ser Val Glu Glu Val Glu Thr He
1 5 10 15
tat att ccg ett gtt ege ttg ett cat tta cat gtc aag tet geg get 96
Tyr He Pro Leu Val Arg Leu Leu His Leu His Val Lys Ser Ala Ala
20 25 30
gaa ege aat aag cat gtc aat gtt ttt ttg aag cac cca cat tea gcc 144
Glu Arg Asn Lys His Val Asn Val Phe Leu Lys His Pro His Ser Ala
35 40 45
aaa att ccg ttt att ate ggc att gcc ggc agt gtc gca gtc gga aaa 192
Lys lie Pro Phe He He Gly He Ala Gly Ser Val Ala Val Gly Lys
50 55 60
age acg acg geg egg ate ttg cag aag ctg ett teg cgt ttg cet gac 240
Ser Thr Thr Ala Arg He Leu Gin Lys Leu Leu Ser Arg Leu Pro Asp
65 70 75 80
cgt cca aaa gtg age ett ate acg aca gat ggt ttt tta ttt cet act 288
Arg Pro Lys Val Ser Leu He Thr Thr Asp Gly Phe Leu Phe Pro Thr
85 90 95
gcc gag ctg aaa aag aaa aat atg atg tea aga aaa gga ttt cct gaa 336
Ala Glu Leu Lys Lys Lys Asn Met Met Ser Arg Lys Gly Phe Pro Glu
100 105 110
age tat gat gta aag geg ctg etc gaa ttt ttg aat gac tta aaa tea 384
Ser Tyr Asp Val Lys Ala Leu Leu Glu Phe Leu Asn Asp Leu Lys Ser
115 120 125
gga aag gac age gta aag gcc ccg gtg tat tcc cat eta acc tat gac 432
Gly Lys Asp Ser Val Lys Ala Pro Val Tyr Ser His Leu Thr Tyr Asp
130 135 140
74.365/BE
205 cgc gag gaa ggt gtg ttc gag gtt gta gaa cag geg gat att gtg att480
Arg Glu Glu Gly Vai Phe Glu Vai Vai Glu Gin Ala Asp He Vailie 145 150 155i6Q att gaa ggc att aat gtt ett cag teg ccc acc ttg gag gat gac egg528
He Glu Gly He Asn Vai Leu Gin Ser Pro Thr Leu Glu Asp AspArg 165 170175 gaa aac ccg cgt att ttt gtt tee gat ttc ttt gat ttt teg att tat576
Glu Asn Pro Arg He Phe Vai Ser Asp Phe Phe Asp Phe Ser lieTyr
180 185190 gtg gat geg gag gaa age egg att ttc act tgg tat tta gag cgt ttt624
Vai Asp Ala Glu Glu Ser Arg He Phe Thr Trp Tyr Leu Glu ArgPhe
195 200205 ege ctg ett egg gaa aca get ttt caa aat cet gat tea tat ttt cat672
Arg Leu Leu Arg Glu Thr Ala Phe Gin Asn Pro Asp Ser Tyr PheHis
21° 215220 aaa ttt aaa gac ttg tee gat cag gag get gac gag atg gca gee teg720
Lys Phe Lys Asp Leu Ser Asp Gin Glu Ala Asp Glu Met Ala AlaSer
225 230 235240 att tgg gag agt gtc aac egg ccg aat tta tat gaa aat att ttg cca768
He Trp Glu Ser Vai Asn Arg Pro Asn Leu Tyr Glu Asn He LeuPro
245 250255 act aaa ttc agg tea gat etc att ttg cgt aag gga gac ggg cat aag816
Thr Lys Phe Arg Ser Asp Leu He Leu Arg Lys Gly Asp Gly HisLys
260 265270 gtc gag gaa gtg ttg gta agg agg gta tga846
Vai Glu Glu Vai Leu Vai Arg Arg Vai
275280 <210> 23 <211> 831 < 212> DNA < 213> Bacillus subtilis <220>
< 221> CDS < 222> (1)..(831) < 400> 23 atg aaa aca aaa ctg gat ttt eta aaa
Met Lys Thr Lys Leu Asp Phe LeuLys att gtc atg ctg acc get tat gattat lie Vai Met Leu Thr Ala Tyr AspTyr
2025
atg aag gag tet gaa gaa ccg
Met Lys Glu Ser Glu Glu Pro
10 15
ccg gca get aaa ett get gaa
Pro Ala Ala Lys Leu Ala Glu
30
74.365/BE
caa gcg gga gtt Gin Ala Gly Vai 35 gac atg att tta gtc ggt gat tea ett gga atg gtc 144
Asp Met lie Leu Vai Gly Asp Ser Leu Gly Met Vai
40 45
gtc etc ggc ett gat tea act gtc ggt gtg aca gtt gcg gac atg ate 192
Vai Leu Gly Leu 50 Asp Ser Thr 55 Vai Gly Vai Thr Vai Ala Asp Met He 60
cat cat aca aaa gcc gtt aaa agg ggt gcg ccg aat acc ttt att gtg 240
His His Thr Lys 65 Ala Vai Lys 70 Arg Gly Ala Pro Asn Thr Phe He Vai 75 80
aca gat atg ccg ttt atg tet tat cac ctg tet aag gaa gat acg ctg 288
Thr Asp Met Pro Phe Met Ser 85 Tyr His Leu Ser Lys Glu Asp Thr Leu 90 95
aaa aat gca gcg get ate gtt cag gaa age gga get gac gca ctg aag 336
Lys Asn Ala Ala 100 Ala He Vai Gin Glu 105 Ser Gly Ala Asp Ala Leu Lys 110
ett gag ggc gga gaa ggc gtg ttt gaa tcc att ege gca ttg acg ett 384
Leu Glu Gly Gly 115 Glu Gly Vai Phe Glu 120 Ser lie Arg Ala Leu Thr Leu 125
gga ggc att cca gta gtc agt cac tta ggt ttg aca ccg cag tea gtc 432
Gly Gly He Pro 130 Vai Vai Ser 135 His Leu Gly Leu Thr Pro Gin Ser Vai 140
ggc gta Ctg ggc ggc tat aaa gta cag ggc aaa gac gaa caa age gcc 480
Gly Vai Leu Gly 145 Gly Tyr Lys 150 Vai Gin Gly Lys Asp Glu Gin Ser Ala 155 160
aaa aaa tta ata gaa gac agt ata aaa tgc gaa gaa gca gga get atg 528
Lys Lys Leu He Glu Asp Ser 165 He Lys Cys Glu Glu Ala Gly Ala Met 170 175
atg ott gtg ctg gaa tgt gtg ccg gca gaa etc aca gcc aaa att gcc 576
Met Leu Vai Leu 180 Glu Cys Vai Pro Ala 185 Glu Leu Thr Ala Lys He Ala 190
gag acg eta age ata ccg gtc att gga ate ggg get ggt gtg aaa gcg 624
Glu Thr Leu Ser 195 Tie Pro Vai He Gly 200 He Gly Ala Gly Vai Lys Ala 205
gac gga caa gtt etc gtt tat cat gat att ate ggc cac ggt gtt gag 672
Asp Gly Gin Vai 210 Leu Vai Tyr 215 His Asp He He Gly His Gly Vai Glu 220
aga aca cct aaa ttt gta aag caa tat acg ege att gat gaa acc ate 720
Arg Thr Pro Lys 225 Phe Vai Lys 230 Gin Tyr Thr Arg lie Asp Glu Thr He 235 240
74.365/BE
207 gaa aca gca ate age gga tat gtt Glu Thr Ala He Ser Gly Tyr Vai
245 cet gaa caa aag cat tee ttt caa
Pro Glu Gin Lys His Ser Phe Gin
260 ttg tac ggg gga aaa
Leu Tyr Gly Gly Lys
275 cag gat gta aga cat cgt get ttc768
Gin Asp Vai Arg His Arg AlaPhe
250255 atg aac cag aca gtg ett gac ggc816
Met Asn Gin Thr Vai Leu AspGly
265270
831 <210> 24 <211> 277 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 24
Met Lys Thr Lys Leu Asp Phe Leu 15
He Vai Met Leu Thr Ala Tyr Asp 20
Gin Ala Gly Vai Asp Met lie Leu 3540
Vai Leu Gly Leu Asp Ser Thr Vai 5055
His His Thr Lys Ala Vai Lys Arg 6570
Thr Asp Met Pro Phe Met Ser Tyr 85
Lys Asn Ala Ala Ala He Vai Gin 100
Leu Glu Gly Gly Glu Gly Vai Phe 115120
Gly Gly lie Pro Vai Vai Ser His 130135
Gly Vai Leu Gly Gly Tyr Lys Vai
145150
Lys Lys Leu He Glu Asp Ser lie 165
Met Leu Vai Leu Glu Cys Vai Pro . 180
Lys Met Lys Glu Ser Glu Glu Pro 10 15
Tyr Pro Ala Ala Lys Leu Ala Glu 25 30
Vai Gly Asp Ser Leu Gly Met Vai 45
Gly Vai Thr Vai Ala Asp Met He 60
Gly Ala Pro Asn Thr Phe He Vai 7580
His Leu Ser Lys Glu Asp Thr Leu 9095
Glu Ser Gly Ala Asp Ala Leu Lys 105HO
Glu Ser He Arg Ala Leu Thr Leu 125
Leu Gly Leu Thr Pro Gin Ser Vai 140
Gin Gly Lys Asp Glu Gin Ser Ala 155160
Lys Cys Glu Glu Ala Gly Ala Met 170175
Ala Glu Leu Thr Ala Lys He Ala 185190
74.365/BE
208
Glu Thr Leu Ser He 195
Asp Gly Gin Vai Leu 210
Arg Thr Pro Lys Phe 225
Glu Thr Ala lie Ser 245
Pro Glu Gin Lys His 260
Pro Vai lie Gly He 200
Vai Tyr His Asp He 215
Vai Lys Gin Tyr Thr 230
Gly Tyr Vai Gin Asp 250
Ser Phe Gin Met Asn 265
Gly Ala Gly Vai Lys Ala 205
He Gly His Gly Vai Glu 220
Arg lie Asp Glu Thr lie
235 240
Vai Arg His Arg Ala Phe 255
Gin Thr Vai Leu Asp Gly 270
Leu Tyr Gly Gly Lys
275 <210> 25 < 211> 858 < 212> DNA < 213> Bacillus subtilis <220>
< 221> CDS < 222> (1)..(858) <400> 25
atg aga cag att He act Thr 5 gat att tea cag ctg aaa gaa gcc ata aaa caa 48
Met 1 Arg Gin Asp lie Ser Gin Leu 10 Lys Glu Ala He Lys 15 Gin
tac cat tea gag ggc aag tea ate gga ttt gtt ccg acg atg ggg ttt 96
Tyr His Ser Glu 20 Gly Lys Ser lie Gly Phe 25 Vai Pro Thr Met 30 Gly Phe
ctg cat gag ggg cat tta ace tta gca gac aaa gca aga caa gaa aac 144
Leu His Glu 35 Gly His Leu Thr Leu Ala Asp 40 Lys Ala Arg 45 Gin Glu Asn
gac gcc gtt att atg agt att ttt gtg aat cct gca caa ttc ggc cct 192
Asp Ala 50 Vai He Met Ser He Phe Vai Asn 55 Pro Ala 60 Gin Phe Gly Pro
aat gaa gat ttt gaa gca tat ccg ege gat att gag egg gat gca get 240
Asn 65 Glu Asp Phe Glu Ala Tyr Pro Arg Asp 70 He 75 Glu Arg Asp Ala Ala 80
ctt gca gaa aac gcc gga gtc gat att ctt ttt acg cca gat get cat 288
Leu Ala Glu Asn Ala 85 Gly Vai Asp lie Leu 90 Phe Thr Pro Asp Ala 95 His
74.365/BE
209
gat Asp atg tat ccc ggt gaa aag aat gtc acg att cat gta gaa aga ege 336
Met Tyr Pro 100 Gly Glu Lys Asn Vai Thr 105 He His Vai Glu Arg Arg 110
aca gac gtg tta tgc ggg ege tea aga gaa gga cat ttt gac ggg gtc 384
Thr Asp Vai 115 Leu Cys Gly Arg Ser 120 Arg Glu Gly His Phe 125 Asp Gly Vai
gcg ate gta ctg acg aag ett ttc aat eta gtc aag ccg act cgt gee 432
Ala He 130 Vai Leu Thr Lys Leu 135 Phe Asn Leu Vai Lys 140 Pro Thr Arg Ala
tat ttc ggt tta aaa gat gcg cag cag gta get gtt gtt gat ggg tta 480
Tyr 145 Phe Gly Leu Lys Asp 150 Ala Gin Gin Vai Ala 155 Vai Vai Asp Gly Leu 160
ate age gac ttc ttc atg gat att gaa ttg gtt cct gtc gat acg gtc 528
He Ser Asp Phe Phe 165 Met Asp He Glu Leu 170 Vai Pro Vai Asp Thr 175 Vai
aga gag gaa gac ggc tta gee aaa age tet ege aat gta tac tta aca 576
Arg Glu Glu Asp 180 Gly Leu Ala Lys Ser 185 Ser Arg Asn Vai Tyr 190 Leu Thr
get gag gaa aga aaa gaa gcg cet aag ctg tat egg gee ett caa aca 624
Ala Glu Glu 195 Arg Lys Glu Ala Pro 200 Lys Leu Tyr Arg Ala 205 Leu Gin Thr
agt gcg gaa ett gtc caa gee ggt gaa aga gat cct gaa gcg gtg ata 672
Ser Ala 210 Glu Leu Vai Gin Ala 215 Gly Glu Arg Asp Pro 220 Glu Ala Vai He
aaa get gca aaa gat ate att gaa acg act age gga ace ata gac tat 720
Lys 225 Ala Ala Lys Asp He 230 lie Glu Thr Thr Ser 235 Gly Thr He Asp Tyr 240
gta gag ett tat tee tat ccg gaa etc gag cct gtg aat gaa att get 768
Vai Glu Leu Tyr Ser 245 Tyr Pro Glu Leu Glu 250 Pro Vai Asn Glu He 255 Ala
gga aag atg att etc get gtt gca gtt get ttt tea aaa gcg cgt tta 816
Gly ata He Lys gat Asp Met aat Asn 275 He 260 ate He Leu att He Ala att He Vai gat Asp Ala att He 280 Vai 265 ega Arg Ala gaa Glu Phe atg Met Ser gag Glu Lys aga Arg 285 Ala 270 ata He Arg Leu 858
<210> 26 <211> 286 <212> PRT <213> Bacillus subtilis
74.365/BE
210 <400> 26
Met Arg Gin He Thr Asp He Ser Gin Leu Lys Glu Ala He Lys Gin 15 1015
Tyr His Ser Glu Gly Lys Ser Tie Gly Phe Vai Pro Thr Met Gly Phe 20 2530
Leu His Glu Gly His Leu Thr Leu Ala Asp Lys Ala Arg Gin Glu Asn 35 4045
Asp Ala Vai He Met Ser He Phe Vai Asn Pro Ala Gin Phe Glv Pro 50 5560
Asn Glu Asp Phe Glu Ala Tyr Pro Arg Asp He Glu Arg Asp AlaAla 65 70 7580
Leu Ala Glu Asn Ala Gly Vai Asp He Leu Phe Thr Pro Asp AlaHis
9095
Asp Met Tyr Pro Gly Glu Lys Asn Vai Thr He His Vai Glu Arg Arg 100 105110
Thr Asp Vai Leu Cys Gly Arg Ser Arg Glu Gly His Phe Asp Gly Vai 115 120125
Ala He Vai Leu Thr Lys Leu Phe Asn Leu Vai Lys Pro Thr Arg Ala 130 135
Tyr Phe Gly Leu Lys Asp Ala Gin Gin Vai Ala Vai Vai Asp GlyLeu 145 150 155160
He Ser Asp Phe Phe Met Asp He Glu Leu Vai Pro Vai Asp ThrVai 165 170175
Arg Glu Glu Asp Gly Leu Ala Lys Ser Ser Arg Asn Vai Tyr Leu Thr 180 185190
Ala Glu Glu Arg Lys Glu Ala Pro Lys Leu Tyr Arg Ala Leu Gin Thr 195 200205
Ser Ala Glu Leu Vai Gin Ala Gly Glu Arg Asp Pro Glu Ala Vai lie 21° 215220
Lys Ala Ala Lys Asp He He Glu Thr Thr Ser Gly Thr He AsoTvr
225 230 235240
Vai Glu Leu Tyr Ser Tyr Pro Glu Leu Glu Pro Vai Asn Glu HeAla 245 250255
Gly Lys Met lie Leu Ala Vai Ala Vai Ala Phe Ser Lys Ala Arg Leu 260 265270
He Asp Asn Tie He Tie Asp lie Arg Glu Met Glu Arg lie
275
280
285
74.365/BE
211 <210> 27 <211> 381 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220>
<221> CDS <222> (1)..(381)
<400> 27 aaa Lys ett Leu 10 cac agg gca act gtt acg Thr Vai Thr 15 48
atg tat Met Tyr 1 ega aca atg atg age ggc
Arg Thr Met 5 Met Ser Gly His Arg Ala
gaa gca aac ctg aac tat gtg gga age att aca att gat gaa gat etc 96
Glu Ala Asn Leu 20 Asn Tyr Vai Gly Ser 25 He Thr He Asp Glu Asp Leu 30
att gat get gtg gga atg ett cct aat gaa aaa gta caa att gtg aat 144
He Asp Ala Vai 35 Gly Met Leu Pro 40 Asn Glu Lys Vai Gin 45 He Vai Asn-
aat aat aat gga gca cgt ett gaa acg tat att att cct ggt aaa egg 192
Asn Asn 50 Asn Gly Ala Arg Leu 55 Glu Thr Tyr He He 60 Pro Gly Lys Arg
gga age ggc gtc ata tgc tta aac ggt gca gee gca ege ett gtg cag 240
Gly Ser 65 Gly Vai He Cys Leu 70 Asn Gly Ala Ala 75 Ala Arg Leu Vai Gin 80
gaa gga gat aag gtc att att att tee tac aaa atg atg tet gat caa 288
Glu Gly Asp Lys Vai 85 He lie He Ser Tyr 90 Lys Met Met Ser Asp Gin 95
gaa geg gca age cat gag ccg aaa gtg get gtt ctg aat gat caa aac 336
Glu Ala Ala Ser 100 His Glu Pro Lys Vai 105 Ala Vai Leu Asn Asp Gin Asn 110
aaa att Lys He gaa caa Glu Gin 115 atg Met ctg ggg Leu Gly aac Asn 120 gaa Glu cca Pro gcc Ala cgt Arg aca Thr 125 att ttg He Leu 381
<210> 28 <211> 127 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 28
Met Tyr Arg Thr Met Met Ser Gly 1 5
Glu Ala Asn Leu Asn Tyr Vai Gly 20
Lys Leu 10 His Arg Ala Thr Vai 15 Thr
Ser He Thr He Asp Glu Asp Leu
30
74.365/BE
212
lie Asp Ala Vai Gly Met Leu Pro Asn Glu Lys Vai Gin 45 He Vai Asn
35 40
Asn Asn 50 Asn Gly Ala Arg Leu 55 Glu Thr Tyr lie He 60 Pro Gly Lys Arg
Gly 65 Ser Gly Vai He Cys 70 Leu Asn Gly Ala Ala 75 Ala Arg Leu Vai Gin 80
Glu Gly Asp Lys Vai 85 He He He Ser Tyr 90 Lys Met Met Ser Asp 95 Gin
Glu Ala Ala Ser 100 His Glu Pro Lys Vai 105 Ala Vai Leu Asn Asp HO Gin Asn
Lys He Glu 115 Gin Met Leu Gly Asn 120 Glu Pro Ala Arg Thr 125 He Leu
<210> 29 <211> 894 < 212> DNA < 213> Bacillus subtilis <220>
< 221> CDS < 222> (1).. (894) < 400> 29 atg aaa att gga att ate ggc gga ggc tee gtt ggt ett tta tgc gee48
Met Lys He Gly He He Gly Gly Gly Ser Vai Gly Leu Leu CysAla 15 1015 tat tat ttg tea ett tat cac gac gtg act gtt gtg acg agg egg caa96
Tyr Tyr Leu Ser Leu Tyr His Asp Vai Thr Vai Vai Thr Arg ArgGin 20 2530 gaa cag get geg gee att cag tet gaa gga ate egg ett tat aaa ggc144
Glu Gin Ala Ala Ala He Gin Ser Glu Gly lie Arg Leu Tyr LysGly
4045 ggg gag gaa ttc agg get gat tgc agt geg gac acg agt ate aat teg192
Gly Glu Glu Phe Arg Ala Asp Cys Ser Ala Asp Thr Ser He AsnSer 50 5560 gac ttt gac ctg ett gtc gtg aca gtg aag cag cat cag ett caa tet240
Asp Phe Asp Leu Leu Vai Vai Thr Vai Lys Gin His Gin Leu GinSer 65 70 7580 gtt ttt teg teg ett gaa ega ate ggg aag acg aat ata tta ttt ttg288
Vai Phe Ser Ser Leu Glu Arg He Gly Lys Thr Asn He Leu PheLeu
9095
74.365/BE
213
caa aac ggc atg ggg Gin Asn Gly Met Gly cat His ate cac gac eta aaa gac tgg cac gtt ggc Gly 336
lie His Asp 105 Leu Lys Asp Trp His 110 Vai
100
cat tcc att tat gtt gga ate gtt gag cac gga get gta aga aaa teg 384
His Ser He 115 Tyr Vai Gly He Vai 120 Glu His Gly Ala Vai 125 Arg Lys Ser
gat aca get gtt gat cat aca ggc eta ggt geg ata aaa tgg age geg 432
Asp Thr 130 Ala Vai Asp His Thr 135 Gly Leu Gly Ala He 140 Lys Trp Ser Ala
ttc gac gat get gaa cca gac egg ctg aac ate ttg ttt cag cat aac 480
Phe 145 Asp Asp Ala Glu Pro 150 Asp Arg Leu Asn He 155 Leu Phe Gin His Asn 160
cat teg gat ttt cog att tat tat gag acg gat tgg tac cgt ctg ctg 528
His Ser Asp Phe Pro 165 He Tyr Tyr Glu Thr 170 Asp Trp Tyr Arg Leu 175 Leu
acg ggc aag ctg att gta aat geg tgt att aat cet tta act geg tta 576
Thr Gly Lys Leu 180 He Vai Asn Ala Cys 185 He Asn Pro Leu Thr 190 Ala Leu
ttg caa gtg aaa aat gga gaa ctg ctg aca acg cca get tat ctg get 624
Leu Gin Vai 195 Lys Asn Gly Glu Leu 200 Leu Thr Thr Pro Ala 205 Tyr Leu Ala
ttt atg aag ctg gta ttt cag gag gca tgc ege att tta aaa ett gaa 672
Phe Met 210 Lys Leu Vai Phe Gin 215 Glu Ala Cys Arg He 220 Leu Lys Leu Glu
aat gaa gaa aag get tgg gag egg gtt cag gee gtt tgt ggg caa acg 720
Asn 225 Glu Glu Lys Ala Trp 230 Glu Arg Vai Gin Ala 235 Vai Cys Gly Gin Thr 240
aaa gag aat cgt tea tea atg ctg gtt gac gtc att gga ggc egg cag 768
Lys Glu Asn Arg Ser 245 Ser Met Leu Vai Asp 250 Vai He Gly Gly Arg 255 Gin
acg gaa get gac gee att ate gga tac tta ttg aag gaa gca agt ett 816
Thr Glu Ala Asp 260 Ala He He Gly Tyr 265 Leu Leu Lys Glu Ala 270 Ser Leu
caa ggt ett gat gee gtc cac eta gag ttt tta tat ggc age ate aaa 864
Gin gca Ala Gly ttg Leu 290 Leu 275 gag Glu Asp ega Arg Ala aat Asn Vai aca Thr His aac Asn 295 Leu 280 aaa Lys Glu gtc Vai Phe ttt Phe Leu Tyr Gly 285 Ser He Lys 894
74.365/BE
214
<210> 30 <211> 298 <212> PRT <213> Bacillus subtilis
<400> 31 Met Lys 1 3 lie Gly lie 5 lie Gly Gly Gly Ser 10 Val Gly Leu Leu Cys 15 Ala
Tyr Tyr Leu Ser 20 Leu Tyr His Asp Val 25 Thr Val Val Thr Arg Arg 30 Gin
Glu Gin Ala 35 Ala Ala lie Gin Ser 40 Glu Gly lie Arg Leu 45 Tyr Lys Gly
Gly Glu 50 Glu Phe Arg Ala Asp 55 Cys Ser Ala Asp Thr 60 Ser Ile Asn Ser
Asp 65 Phe Asp Leu Leu Val 70 Val Thr Val Lys Gin 75 His Gin Leu Gin Ser 80
Val Phe Ser Ser Leu 85 Glu Arg lie Gly Lys 90 Thr Asn lie Leu Phe 95 Leu
Gin Asn Gly Met 100 Gly His lie His Asp 105 Leu Lys Asp Trp His 110 Val Gly
His Ser lie 115 Tyr Val Gly lie Val 120 Glu His Gly Ala Val 125 Arg Lys Ser
Asp Thr 130 Ala Val Asp His Thr 135 Gly Leu Gly Ala lie 140 Lys Trp Ser Ala
Phe 145 Asp Asp Ala Glu Pro 150 Asp Arg Leu Asn lie 155 Leu Phe Gin His Asn 160
His Ser Asp Phe Pro 165 lie Tyr Tyr Glu Thr 170 Asp Trp Tyr Arg Leu 175 Leu
Thr Gly Lys Leu 180 lie Val Asn Ala Cys 185 lie Asn Pro Leu Thr 190 Ala Leu
Leu Gin Val 195 Lys Asn Gly Glu Leu 200 Leu Thr Thr Pro Ala 205 Tyr Leu Ala
Phe Met 210 Lys Leu Val Phe Gin 215 Glu Ala Cys Arg lie 220 Leu Lys Leu Glu
Asn 225 Glu Glu Lys Ala Trp 230 Glu Arg Val Gin Ala 235 Val Cys Gly Gin Thr 240
Lys Glu Asn Arg Ser 245 Ser Met Leu Val Asp 250 Val lie Gly Gly Arg 255 Gin
74.365/BE
215
Thr Glu Ala Asp Ala He He 260
Gin Gly Leu Asp Ala Vai His 275
Ala Leu Glu Arg Asn Thr Asn 290295
Gly Tyr Leu Leu Lys Glu Ala
265270
Leu Glu Phe Leu Tyr Gly Ser 280285
Lys Vai Phe
Ser Leu
He Lys < 210> 31 < 211> 1725 < 212> DNA < 213> Bacillus subtilis <220>
< 221> CDS < 222> (1)..(1722) < 400> 31 atg ggg act aat gta cag gtg gat tea gca tet gcc gaa tgt aca cag48
Met Gly Thr Asn Vai Gin Vai Asp Ser Ala Ser Ala Glu Cys ThrGin 1 5 1015 acg atg age gga gca tta atg ctg att gaa tea tta aaa aaa gag aaa96
Thr Met Ser Gly Ala Leu Met Leu He Glu Ser Leu Lys Lys GluLvs
2530 gta gaa atg ate ttc ggt tat ccg ggc ggg get gtg ett ccg att tac144
Vai Glu Met He Phe Gly Tyr Pro Gly Gly Ala Vai Leu Pro HeTyr
4045 gat aag eta tac aat tea ggg ttg gta cat ate ett ccc cgt cac gaa192
Asp Lys Leu Tyr Asn Ser Gly Leu Vai His He Leu Pro Arg HisGlu 50 5560 caa gga gca att cat gca geg gag gga tac gca agg gtc tcc gga aaa240
Gin Gly Ala He His Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Vai Ser GlyLys $5 70 75qq ccg ggt gtc gtc att gcc acg tea ggg ccg gga geg aca aac ett gtt288
Pro Gly Vai Vai He Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn LeuVai
9095 aca ggc ett get gat gcc atg att gat tea ttg ccg tta gtc gtc ttt336
Thr Gly Leu Ala Asp Ala Met He Asp Ser Leu Pro Leu Vai VaiPhe
100 105no aca ggg cag gta gca acc tet gta ate ggg age gat gca ttt cag gaa384
Thr Gly Gin Vai Ala Thr Ser Vai lie Gly Ser Asp Ala Phe GinGlu 115 120125
74.365/BE
216
gca gac att tta ggg att Ala Asp He Leu Gly He 130 acg Thr 135 atg cca gta aca aaa cac age tac cag Met Pro Vai Thr Lys His Ser Tyr Gin 140 432
gtt cgc cag ccg gaa gat ctg ccg cgc ate att aaa gaa geg ttc cat 480
Vai Arg Gin Pro Glu Asp 145 150 Leu Pro Arg He He Lys Glu Ala Phe His 155 160
att gca aca act gga aga ccc gga cct gta ttg att gat att ccg aaa 528
He Ala Thr Thr Gly Arg 165 Pro Gly Pro Vai Leu He Asp lie Pro Lys 170 175
gat gta gca aca att gaa gga gaa ttc age tac gat cat gag atg aat 576
Asp Vai Ala Thr lie Glu 180 Gly Glu Phe Ser Tyr Asp His Glu Met Asn 185 190
etc ccg gga tac cag ccg aca aca gag ccg aat tat ttg cag ate cgc 624
Leu Pro Gly Tyr Gin Pro 195 Thr Thr Glu Pro Asn Tyr Leu Gin He Arg 200 205
aag ett gtg gaa gcc gtg age agt geg aaa aaa ccg gtg ate ctg geg 672
Lys Leu Vai Glu Ala Vai 210 Ser 215 Ser Ala Lys Lys Pro Vai He Leu Ala 220
ggt geg ggc gta ctg cac gga aaa geg tea gaa gaa tta aaa aat tat 720
Gly Ala Gly Vai Leu His 225 230 Gly Lys Ala Ser Glu Glu Leu Lys Asn Tyr 235 240
get gaa cag cag caa ate cct gtg gca cac ace ett ttg ggg etc gga 768
Ala Glu Gin Gin Gin He 245 Pro Vai Ala His Thr Leu Leu Gly Leu Gly 250 255
ggc ttc ccg get gac cat ccg ett ttc eta ggg atg geg gga atg cac 816
Gly Phe Pro Ala Asp His 260 Pro Leu Phe Leu Gly Met Ala Gly Met His 265 270
ggt act tat aca gcc aat atg gcc ett cat gaa tgt gat eta tta ate 864
Gly Thr Tyr Thr Ala Asn 275 Met Ala Leu His Glu Cys Asp Leu Leu lie 280 285
agt ate ggc gcc cgt ttt gat gac cgt gtc aca gga aac ctg aaa cac 912
Ser He Gly Ala Arg Phe 290 Asp 295 Asp Arg Vai Thr Gly Asn Leu Lys His 300
ttt gcc aga aac gca aag ata gcc cac ate gat att gat cca get gaa 960
Phe Ala Arg Asn Ala Lys 305 310 He Ala His He Asp He Asp Pro Ala Glu 315 320
ate gga aaa ate atg aaa aca cag att cct gta gtc gga gac age aaa 1008
lie Gly Lys He Met Lys 325 Thr Gin He Pro Vai Vai Gly Asp Ser Lys 330 335
74.365/BE
217
att gtc ctg cag gag ctg ate aaa caa gac ggc aaa caa age gat tea 1056
He Val Leu Gin Glu Leu He Lys Gin Asp Gly Lys Gin Ser Asp Ser
340 345 350
age gaa tgg aaa aaa cag etc gca gaa tgg aaa gaa gag tat ccg etc 1104
Ser Glu Trp Lys Lys Gin Leu Ala Glu Trp Lys Glu Glu Tyr Pro Leu
355 360 365
tgg tat gta gat aat gaa gaa gaa ggt ttt aaa cct cag aaa ttg att 1152
Trp Tyr Val Asp Asn Glu Glu Glu Gly Phe Lys Pro Gin Lys Leu He
370 375 380
gaa tat att cat caa ttt aca aaa gga gag gcc att gtc gca acg gat 1200
Glu Tyr He His Gin Phe Thr Lys Gly Glu Ala He Val Ala Thr Asp
385 390 395 400
gta ggc cag cat caa atg tgg tea geg caa ttt tat ccg ttc caa aaa 1248
Val Gly Gin His Gin Met Trp Ser Ala Gin Phe Tyr Pro Phe Gin Lys
405 410 415
gca gat aaa tgg gtc acg tea ggc gga ett gga acg atg gga ttc ggt 1296
Ala Asp Lys Trp Val Thr Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly Phe Gly
420 425 430
ett ccg geg geg ate ggc gca cag ctg gcc gaa aaa gat get act gtt 1344
Leu Pro Ala Ala He Gly Ala Gin Leu Ala Glu Lys Asp Ala Thr Val
435 440 445
gtc geg gtt gtc gga gac ggc gga ttc caa atg acg ett caa gaa etc 1392
Val Ala Val Val Gly Asp Gly Gly Phe Gin Met Thr Leu Gin Glu Leu
450 455 460
gat gtt att ege gaa tta aat ett ccg gtc aag gta gtg att tta aat 1440
Asp Val He Arg Glu Leu Asn Leu Pro Val Lys Val Val He Leu Asn
465 470 475 480
aac get tgt etc gga atg gtc aga cag tgg cag gaa att ttc tat gaa 1488
Asn Ala Cys Leu Gly Met Val Arg Gin Trp Gin Glu He Phe Tyr Glu
485 490 495
gaa cgt tat tea gaa tet aaa ttc get tet cag cct gac ttc gtc aaa 1536
Glu Arg Tyr Ser Glu Ser Lys Phe Ala Ser Gin Pro Asp Phe Val Lys
500 505 510
ttg tcc gaa gca tac ggc att aaa ggc ate aga att tea tea gaa geg 1584
Leu Ser Glu Ala Tyr Gly He Lys Gly He Arg lie Ser Ser Glu Ala
515 520 525
gaa gca aag gaa aag ctg gaa gag gca tta aca tea aga gaa cct gtt 1632
Glu Ala Lys Glu Lys Leu Glu Glu Ala Leu Thr Ser Arg Glu Pro Val
530 535 540
74.365/BE
218 gtc att gac gtg egg gtt gee age gaa gaa
Vai He Asp Vai Arg Vai Ala Ser Glu Glu
545550 get cég ggg aaa ggg ctg cat gaa atggtg
Ala Pro Gly Lys Gly Leu His Glu MetVai
565570 aaa gta ttc ccg atg gtg 1680
Lys Vai Phe Pro Met Vai
555 560 ggg gtg aaa cct tga 1725
Gly Vai Lys Pro <210> 32 <211> 574 <212> PRT <213> Bacillus subtilis
<400> 32 Met Gly Thr 1 Asn Vai 5 Gin Vai Asp Ser Ala 10 Ser Ala Glu Cys Thr 15 Gin
Thr Met Ser Gly 20 Ala Leu Met Leu He 25 Glu Ser Leu Lys Lys 30 Glu Lys
Vai Glu Met 35 He Phe Gly Tyr Pro 40 Gly Gly Ala Vai Leu 45 Pro He Tyr
Asp Lys 50 Leu Tyr Asn Ser Gly 55 Leu Vai His He Leu 60 Pro Arg His Glu
Gin 65 Gly Ala He His Ala 70 Ala Glu Gly Tyr Ala 75 Arg Vai Ser Gly Lys 80
Pro Gly Vai Vai He 85 Ala Thr Ser Gly Pro 90 Gly Ala Thr Asn Leu 95 Vai
Thr Gly Leu Ala 100 Asp Ala Met He Asp 105 Ser Leu Pro Leu Vai 110 Vai Phe
Thr Gly Gin 115 Vai Ala Thr Ser Vai 120 He Gly Ser Asp Ala 125 Phe Gin Glu
Ala Asp 130 He Leu Gly He Thr 135 Met Pro Vai Thr Lys 140 His Ser Tyr Gin
Vai 145 Arg Gin Pro Glu Asp 150 Leu Pro Arg He He 155 Lys Glu Ala Phe His 160
He Ala Thr Thr Gly 165 Arg Pro Gly Pro Vai 170 Leu He Asp He Pro 175 Lys
Asp Vai Ala Thr 180 He Glu Gly Glu Phe 185 Ser Tyr Asp His Glu 190 Met Asn
Leu Pro Gly 195 Tyr Gin Pro Thr Thr 200 Glu Pro Asn Tyr Leu 205 Gin He Arg
74.365/BE
219
Lys Leu Vai Glu Ala Vai Ser Ser Ala Lys Lys Pro Vai He Leu Ala 210 215220
Gly Ala Gly Vai Leu His Gly Lys Ala Ser Glu Glu Leu Lys AsnTyr
225 230 235240
Ala Glu Gin Gin Gin lie Pro Vai Ala His Thr Leu Leu Gly LeuGly
245 250255
Gly Phe Pro Ala Asp His Pro Leu Phe Leu Gly Met Ala Gly Met His 260 265270
Gly Thr Tyr 275 Thr Ala Asn Met Ala 280 Leu His Glu Cys Asp 285 Leu Leu He
Ser He Gly Ala Arg Phe Asp Asp Arg Vai Thr Gly Asn Leu Lys His
290 295 300
Phe Ala Arg Asn Ala Lys He Ala His He Asp He Asp Pro Ala Glu
305 310 315 320
He Gly Lys lie Met 325 Lys Thr Gin lie Pro 330 Vai Vai Gly Asp Ser 335 Lys
He Vai Leu Gin Glu Leu lie Lys Gin Asp Gly Lys Gin Ser Asp Ser
340 345 350
Ser Glu Trp Lys Lys Gin Leu Ala Glu Trp Lys Glu Glu Tyr Pro Leu
355 360 365
Trp Tyr Vai Asp Asn Glu Glu Glu Gly Phe Lys Pro Gin Lys Leu He 370 375380
Glu Tyr He His Gin Phe Thr Lys Gly Glu Ala He Vai Ala ThrAsp
385 390 395400
Vai Gly Gin His Gin Met Trp Ser Ala Gin Phe Tyr Pro Phe GinLys
405 410415
Ala Asp Lys Trp Vai Thr Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly Phe Gly 420 425430
Leu Pro Ala Ala He Gly Ala Gin Leu Ala Glu Lys Asp Ala Thr Vai 435 440445
Vai Ala Vai Vai Gly Asp Gly Gly Phe Gin Met Thr Leu Gin Glu Leu 450 455460
Asp Vai lie Arg Glu Leu Asn Leu Pro Vai Lys Vai Vai He LeuAsn
465 470 475480
Asn Ala Cys Leu Gly Met Vai Arg Gin Trp Gin Glu He Phe TyrGlu
485 490495
74.365/BE
220
Glu Arg Tyr Ser Glu Ser Lys 500
Leu Ser Glu Ala Tyr Gly He 515
Glu Ala Lys Glu Lys Leu Glu 530 535
Vai He Asp Vai Arg Vai Ala 545 550
Ala Pro Gly Lys Gly Leu His 565
Phe Ala Ser Gin Pro Asp 505
Lys Gly He Arg lie Ser
520 525
Glu Ala Leu Thr Ser Arg 540
Ser Glu Glu Lys Vai Phe 555
Glu Met Vai Gly Vai Lys 570
Phe Vai
510
Ser Glu
Glu Pro
Pro Met
Pro
Lys
Ala
Vai
Vai 560 <210> 33 <211> 525 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220>
<221> CDS <222> (1)..(522) <400> 33 ttg aaa aga att Met Lys Arg He 1 aac egg ate ace
Asn Arg lie Thr 20 att aca gtt gga He Thr Vai Gly 35 gtc gtt cat gtt Vai Vai His Vai 50 etc aac aaa cag Leu Asn Lys Gin 65 teg att gtc cag Ser He Vai Gin tea aca aga aca Ser Thr Arg Thr 100 ate aca ttg act gtg gtg lie Thr Leu Thr Vai Vai
10 ggt eta ttc aca aaa agg Gly Leu Phe Thr Lys Arg 25 cac aca gaa aca gcc ggc His Thr Glu Thr Ala Gly 40 gaa ggt gaa aat gat gtt
Glu Gly Glu Asn Asp Vai 55 att gat gtg ctg aaa gtc He Asp Vai Leu Lys Vai 70 agg gag ctg gcc tta ate
Arg Glu Leu Ala Leu lie 85 90 gag att aat gga ate ata Glu He Asn Gly He lie 105 aac ege tcc ggg gtg tta Asn Arg Ser Gly Vai Leu 15 cat tac aac att gaa age His Tyr Asn lie Glu Ser 30 gtt tcc aga ate ace ttc
Vai Ser Arg lie Thr Phe 45 gaa cag tta acg aaa cag Glu Gin Leu Thr Lys Gin 60 aca gac ate aca aat caa Thr Asp He Thr Asn Gin 75 80 aag gtt gtc tcc gca cct Lys Vai Vai Ser Ala Pro 95 gaa ccg ttt aga gcc tet Glu Pro Phe Arg Ala Ser 110
144
192
240
288
336
74.365/BE
221 gtc gtt gat gtc age aga gac age
Vai Vai Asp Vai Ser Arg Asp Ser
115120 tet aac aaa att gaa geg ettatt
Ser Asn Lys He Glu Ala LeuHe
130135 aaa gaa ate geg aga aca ggtaca
Lys Glu lie Ala Arg Thr GlyThr
145150 aaa agg cgt cat cca ata aaa caa
Lys Arg Arg His Pro He Lys Gin
165 ate gtt gtt cag gtg aca ggt gaa384
He Vai Vai Gin Vai Thr GlyGlu
125 gag tta tta aaa cet tat ggc att432
Glu Leu Leu Lys Pro Tyr GlyHe
140 acg get ttt geg agg gga acc age 480
Thr Ala Phe Ala Arg Gly Thr Ser 155160 tat eta ttg tat aaa aca taa 525
Tyr Leu Leu Tyr Lys Thr
170 <210> 34 <211> 174 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 34
Met Lys Arg He He Thr Leu 1 5
Asn Arg He Thr Gly Leu Phe 20
He Thr Vai Gly His Thr Glu 35
Vai Vai His Vai Glu Gly Glu 50 55
Leu Asn Lys Gin He Asp Vai 65 70
Ser He Vai Gin Arg Glu Leu 85
Ser Thr Arg Thr Glu He Asn 100
Vai Vai Asp Vai Ser Arg Asp 115
Ser Asn Lys He Glu Ala Leu
130 135
Lys Glu He Ala Arg Thr Gly 145 150
Thr Vai Vai Asn Arg Ser Gly Vai Leu 1015
Thr Lys Arg His Tyr Asn He Glu Ser 2530
Thr Ala Gly Vai Ser Arg lie Thr Phe 4045
Asn Asp Vai Glu Gin Leu Thr Lys Gin 60
Leu Lys Vai Thr Asp He Thr Asn Gin 7580
Ala Leu He Lys Vai Vai Ser Ala Pro 9095
Gly lie lie Glu Pro Phe Arg Ala Ser 105no
Ser He Vai Vai Gin Vai Thr Gly Glu 120125
He Glu Leu Leu Lys Pro Tyr Gly lie 140
Thr Thr Ala Phe Ala Arg Gly Thr Ser 155160
74.365/BE
222
Lys Arg Arg His Pro He Lys Gin Tyr Leu Leu Tyr Lys Thr 165 170 <210> 35 <211> 1029 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220>
<221> CDS <222> (1).. (1026)
<400> 35 aac ggt gat ate aaa gag aac gta ttg get 48
atg gta aaa gta tat tat
Met 1 Vai Lys Vai Tyr 5 Tyr Asn Gly Asp He 10 Lys Glu Asn Vai Leu Ala 15
gga aaa aca gta geg gtt ate ggg tac ggt teg caa ggc cac gca cat 96
Gly Lys Thr Vai 20 Ala Vai He Gly Tyr 25 Gly Ser Gin Gly His 30 Ala His
gcc ctg aac ett aaa gaa age gga gta gac gtg ate gtc ggt gtt aga 144
Ala Leu Asn 35 Leu Lys Glu Ser Gly 40 Vai Asp Vai He Vai Gly 45 Vai Arg
caa gga aaa tet ttc act caa gcc caa gaa gac gga cat aaa gta ttt 192
Gin Gly 50 Lys Ser Phe Thr Gin Ala 55 Gin Glu Asp Gly 60 His Lys Vai Phe
tea gta aaa gaa geg gca gcc caa gcc gaa ate ate atg gtt ctg ett 240
Ser 65 Vai Lys Glu Ala Ala 70 Ala Gin Ala Glu He 75 He Met Vai Leu Leu 80
ccg gat gag cag cag caa aaa gta tac gaa get gaa ate aaa gat gaa 288
Pro Asp Glu Gin Gin 85 Gin Lys Vai Tyr Glu 90 Ala Glu lie Lys Asp Glu 95
ttg aca gca gga aaa tea tta gta ttc get cat gga ttt aac gtg cat 336
Leu Thr Ala Gly 100 Lys Ser Leu Vai Phe 105 Ala His Gly Phe Asn 110 Vai His
ttc cat caa att gtt cct ccg geg gat gta gat gta ttc tta gtg gcc 384
Phe His Gin 115 He Vai Pro Pro Ala 120 Asp Vai Asp Vai Phe Leu 125 Vai Ala
cct aaa ggc ccg gga cac ttg gta aga aga aca tat gag caa gga get 432
Pro Lys 130 Gly Pro Gly His Leu Vai 135 Arg Arg Thr Tyr 140 Glu Gin Gly Ala
ggc gta cct gca ttg ttc gca ate tat caa gat gtg act gga gaa gca 480
Gly 145 Vai Pro Ala Leu Phe 150 Ala lie Tyr Gin Asp 155 Vai Thr Gly Glu Ala 160
74.365/BE
223
aga gac aaa gcc etc get tat get aaa gga ate ggc ggc gca aga Arg 175 geg Ala 528
Arg Asp Lys Ala Leu Ala Tyr Ala Lys Gly 170 lie Gly Gly Ala
165
ggc gta tta gaa acg aca ttt aaa gaa gaa aca gaa aca gat ttg ttc 576
Gly Vai Leu Glu 180 Thr Thr Phe Lys Glu 185 Glu Thr Glu Thr Asp 190 Leu Phe
ggt gag caa gca gtt ctt tgc ggc gga tta age geg ctt gtc aaa gcc 624
Gly Glu Gin 195 Ala Vai Leu Cys Gly 200 Gly Leu Ser Ala Leu 205 Vai Lys Ala
gga ttt gaa acc tta act gaa gca ggt tat cag cct gaa ctt gca tac 672
Gly Phe 210 Glu Thr Leu Thr Glu 215 Ala Gly Tyr Gin Pro 220 Glu Leu Ala Tyr
ttc gag tgt ctt cat gag ctg aaa tta ate gta gac ctt atg tac gaa 720
Phe 225 Glu Cys Leu His Glu 230 Leu Lys Leu He Vai 235 Asp Leu Met Tyr Glu 240
gaa gga ctt gca gga atg aga tat tea ate tet gac aca gca cag tgg 768
Glu Gly Leu Ala Gly 245 Met Arg Tyr Ser He 250 Ser Asp Thr Ala Gin 255 Trp
gga gat ttc gta tea ggc cct ege gtt gtg gac gcc aaa gta aaa gaa 816
Gly Asp Phe Vai 260 Ser Gly Pro Arg Vai 265 Vai Asp Ala Lys Vai 270 Lys Glu
tet atg aaa gaa gta tta aaa gat ate caa aac ggt aca ttc gca aaa 864
Ser Met Lys 275 Glu Vai Leu Lys Asp 280 He Gin Asn Gly Thr 285 Phe Ala Lys
gag tgg ate gtc gaa aac caa gta aac cgt cct cgt ttc aac get ate 912
Glu Trp 290 He Vai Glu Asn Gin 295 Vai Asn Arg Pro Arg 300 Phe Asn Ala He
aat gca age gag aac gaa cat caa ate gaa gta gtg gga aga aag ctt 960
Asn 305 Ala Ser Glu Asn Glu 310 His Gin He Glu Vai 315 Vai Gly Arg Lys Leu 320
cgt gaa atg atg ccg ttt gtg aaa caa ggc aag aag aag gaa geg gtg 1008
Arg gtc Vai Glu tee Ser Met gtt Vai Met geg Ala Pro 325 caa Gin Phe aat Asn Vai taa Lys Gin Gly 330 Lys Lys Lys Glu Ala 335 Vai 1029
340 <210> 36 <211> 342 <212> PRT <213> Bacillus subtilis
74.365/BE
I ‘
224 <400> 36
Met Vai Lys
Gly Lys Thr
Ala Leu Asn 35
Gin Gly Lys 50
Ser Vai Lys 65
Pro Asp Glu
Leu Thr Ala
Phe His Gin 115
Pro Lys Gly 130
Gly Vai Pro 145
Arg Asp Lys
Gly Vai Leu
Gly Glu Gin 195
Gly Phe Glu 210
Phe Glu Cys 225
Glu Gly Leu
Gly Asp Phe
Ser Met Lys
275
Vai Tyr Tyr Asn Gly Asp He Lys Glu Asn Vai Leu Ala 5 1015
Vai Ala Vai He Gly Tyr Gly Ser Gin Gly His Ala His 20 2530
Leu Lys Glu Ser Gly Vai Asp Vai lie Vai Gly Vai Arg 4045
Ser Phe Thr Gin Ala Gin Glu Asp Gly His Lys Vai Phe 5560
Glu Ala Ala Ala Gin Ala Glu lie lie Met Vai Leu Leu 70 7580
Gin Gin Gin Lys Vai Tyr Glu Ala Glu lie Lys Asp Glu 85 9095
Gly Lys Ser Leu Vai Phe Ala His Gly Phe Asn Vai His
100 105110 lie Vai Pro Pro Ala Asp Vai Asp Vai Phe Leu Vai Ala 120125
Pro Gly His Leu Vai Arg /Arg Thr Tyr Glu Gin Gly Ala 135140
Ala Leu Phe Ala lie Tyr Gin Asp Vai Thr Gly Glu Ala 150 155160
Ala Leu Ala Tyr Ala Lys Gly He Gly Gly Ala Arg Ala 165 170175
Glu Thr Thr Phe Lys Glu Glu Thr Glu Thr Asp Leu Phe 180 185190
Ala Vai Leu Cys Gly Gly Leu Ser Ala Leu Vai Lys Ala 200205
Thr Leu Thr Glu Ala Gly Tyr Gin Pro Glu Leu Ala Tyr 215220
Leu His Glu Leu Lys Leu lie Vai Asp Leu Met Tyr Glu 230 235240
Ala Gly Met Arg Tyr Ser lie Ser Asp Thr Ala Gin Trp 245 250255
Vai Ser Gly Pro Arg Vai Vai Asp Ala Lys Vai Lys Glu
260 265270
Glu Vai Leu Lys Asp lie Gin Asn Gly Thr Phe Ala Lys 280285
74.365/BE
225
Glu Trp He Vai Glu Asn Gin Vai
290295
Asn Arg
Pro Arg Phe Asn Ala lie
300
Asn Ala Ser Glu Asn 305
Arg Glu Met Met Pro
325
Glu His Gin lie Glu Vai Vai Gly Arg Lys Leu
310 315320
Phe Vai Lys Gin Gly Lys Lys Lys Glu Ala Vai 330335
Vai Ser Vai Ala Gin Asn
340 <210> 37 < 211> 1674 < 212> DNA < 213> Bacillus subtilis <220>
< 221> CDS < 222> (1)..(1674) < 400> 37 atg gca gaa tta ege agt aat atg ate aca caa gga ate gat aga get48
Met Ala Glu Leu Arg Ser Asn Met He Thr Gin Gly He Asp ArgAla
5 1015 ccg cac ege agt ttg ett cgt gca gca ggg gta aaa gaa gag gat ttc96
Pro His Arg Ser Leu Leu Arg Ala Ala Gly Vai Lys Glu Glu AspPhe
2530 ggc aag ccg ttt att gcg gtg tgt aat tea tac att gat ate gtt ccc144
Gly Lys Pro Phe He Ala Vai Cys Asn Ser Tyr He Asp He VaiPro
4045 ggt cat gtt cac ttg cag gag ttt ggg aaa ate gta aaa gaa gca ate192
Gly His Vai His Leu Gin Glu Phe Gly Lys He Vai Lys Glu AlaHe
5560 aga gaa gca ggg ggc gtt ccg ttt gaa ttt aat acc att ggg gta gat240
Arg Glu Ala Gly Gly Vai Pro Phe Glu Phe Asn Thr He Gly VaiAsp 65 70 7580 gat ggc ate gca atg ggg cat ate ggt atg aga tat teg ctg cca age288
Asp Gly lie Ala Met Gly His lie Gly Met Arg Tyr Ser Leu ProSer
9095 cgt gaa att ate gca gac tet gtg gaa acg gtt gta tcc gca cac tgg336
Arg Glu He He Ala Asp Ser Vai Glu Thr Vai Vai Ser Ala HisTrp
100 105HO ttt gac gga atg gtc tgt att ccg aac tgc gac aaa ate aca ccg gga384
Phe Asp Gly Met Vai Cys He Pro Asn Cys Asp Lys He Thr ProGly
I15 120125
74.365/BE
226 atg ctt atg gcg gca atg cgc ate aac att ccg acg att ttt gtc age432
Met Leu Met Ala Ala Met Arg lie Asn lie Pro Thr lie Phe VaiSer
130 135140 ggc gga ccg atg gcg gca gga aga aca agt tac ggg ega aaa ate tec480
Gly Gly Pro Met Ala Ala Gly Arg Thr Ser Tyr Gly Arg Lys lieSer 145 150 155160 ctt tec tea gta ttc gaa ggg gta ggc gee tac caa gca ggg aaa ate528
Leu Ser Ser Vai Phe Glu Gly Vai Gly Ala Tyr Gin Ala Gly LysHe
165 170175 aac gaa aac gag ctt caa gaa eta gag cag ttc gga tgc cca acg tgc576
Asn Glu Asn Glu Leu Gin Glu Leu Glu Gin Phe Gly Cys Pro ThrCys
18° 185190 ggg tet tgc tea ggc atg ttt acg gcg aac tea atg aac tgt ctg tea624
Gly Ser Cys Ser Gly Met Phe Thr Ala Asn Ser Met Asn Cys LeuSer
195 200205 gaa gca ctt ggt ctt get ttg ccg ggt aat gga ace att ctg gca aca672
Glu Ala Leu Gly Leu Ala Leu Pro Gly Asn Gly Thr He Leu AlaThr
210 215220 tet ccg gaa cgc aaa gag ttt gtg aga aaa teg get gcg caa tta atg720
Ser Pro Glu Arg Lys Glu Phe Vai Arg Lys Ser Ala Ala Gin LeuMet 225 230 235240 gaa acg att cgc aaa gat ate aaa ccg cgt gat att gtt aca gta aaa768
Glu Thr lie Arg Lys Asp lie Lys Pro Arg Asp lie Vai Thr VaiLys
245 250255 gcg att gat aac gcg ttt gca etc gat atg gcg etc gga ggt tet aca816
Ala lie Asp Asn Ala Phe Ala Leu Asp Met Ala Leu Gly Gly SerThr
260 265270 aat ace gtt ctt cat acc ctt gcc ctt gca aac gaa gcc ggc gtt gaa864
Asn Thr Vai Leu His Thr Leu Ala Leu Ala Asn Glu Ala Gly VaiGlu
275 280285 tac tet tta gaa cgc att aac gaa gtc get gag cgc gtg ccg cac ttg912
Tyr Ser Leu Glu Arg He Asn Glu Vai Ala Glu Arg Vai Pro HisLeu 290 295300 get aag ctg gcg cct gca teg gat gtg ttt att gaa gat ctt cac gaa960
Ala Lys Leu Ala Pro Ala Ser Asp Vai Phe He Glu Asp Leu HisGlu
305 310 315320 gcg ggc ggc gtt tea gcg get ctg aat gag ctt teg aag aaa gaa gga1008
Ala Gly Gly Vai Ser Ala Ala Leu Asn Glu Leu Ser Lys Lys GluGlv
325 330335
74.365/BE
227
geg ett cat Ala Leu His tta gat Leu Asp 340 geg ctg act gtt aca gga aaa act ett gga gaa 1056
Ala Leu Thr Vai Thr Gly 345 Lys Thr Leu 350 Gly Glu
acc att gcc gga cat gaa gta aag gat tat gac gtc att cac ccg ctg 1104
Thr He Ala 355 Gly His Glu Vai Lys Asp Tyr Asp 360 Vai He 365 His Pro Leu
gat caa cca ttc act gaa aag gga ggc ett get gtt tta ttc ggt aat 1152
Asp Gin Pro 370 Phe Thr Glu Lys Gly Gly Leu Ala 375 Vai 380 Leu Phe Gly Asn
eta get ccg gac ggc get ate att aaa aca ggc ggc gta cag aat ggg 1200
Leu Ala Pro 385 Asp Gly Ala 390 He lie Lys Thr Gly 395 Gly Vai Gin Asn Gly 400
att aca aga cac gaa ggg ccg get gtc gta ttc gat tet cag gac gag 1248
He Thr Arg His Glu . 405 Gly Pro Ala Vai Vai Phe 410 Asp Ser Gin Asp 415 Glu
geg ett gac ggc att ate aac ega aaa gta aaa gaa ggc gac gtt gtc 1296
Ala Leu Asp Gly He 420 He Asn Arg Lys Vai Lys 425 Glu Gly Asp 430 Vai Vai
ate ate aga tac gaa ggg cca aaa ggc gga cct ggc atg ccg gaa atg 1344
lie lie Arg 435 Tyr Glu Gly Pro Lys Gly Gly Pro 440 Gly Met 445 Pro Glu Met
ctg geg cca aca tee caa ate gtt gga atg gga etc ggg cca aaa gtg 1392
Leu Ala Pro 450 Thr Ser Gin He Vai Gly Met Gly 455 Leu 460 Gly Pro Lys Vai
gca ttg att acg gac gga cgt ttt tee gga gcc tee cgt ggc etc tea 1440
Ala Leu lie 465 Thr Asp Gly 470 Arg Phe Ser Gly Ala 475 Ser Arg Gly Leu Ser 480
ate ggc cac gta tea cet gag gcc get gag ggc ggg ccg ett gcc ttt 1488
He Gly His Vai Ser 485 Pro Glu Ala Ala Glu Gly 490 Gly Pro Leu Ala 495 Phe
gtt gaa aac gga gac cat att ate gtt gat att gaa aaa ege ate ttg 1536
Vai Glu Asn Gly Asp 500 His He lie Vai Asp lie 505 Glu Lys Arg 510 He Leu
gat gta caa gtg cca gaa gaa gag tgg gaa aaa ega aaa geg aac tgg 1584
Asp Vai Gin 515 Vai Pro Glu Glu Glu Trp Glu Lys 520 Arg Lys 525 Ala Asn Trp
aaa ggt ttt gaa ccg aaa gtg aaa acc ggc tac ctg gca cgt tat tet 1632
Lys Gly Phe 530 Glu Pro Lys Vai Lys Thr Gly Tyr 535 Leu 540 Ala Arg Tyr Ser
74.365/BE
228 aaa ett gtg aca agt gee aac ace ggc ggt Lys Leu Vai Thr Ser Ala Asn Thr Gly Gly
545
550 att atg lie Met 555 aaa
Lys ate He
167 4 <210> 38 <211> 558 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 38
Met 1 Ala Glu Leu Arg 5 Ser Asn Met He Thr 10 Gin Gly He Asp Arg 15 Ala
Pro His Arg Ser 20 Leu Leu Arg Ala Ala 25 Gly Vai Lys Glu Glu 30 Asp Phe
Gly Lys Pro 35 Phe He Ala Vai Cys 40 Asn Ser Tyr He Asp 45 He Vai Pro
Gly His 50 Vai His Leu Gin Glu 55 Phe Gly Lys He Vai 60 Lys Glu Ala He
Arg 65 Glu Ala Gly Gly Vai 70 Pro Phe Glu Phe Asn 75 Thr He Gly Vai Asp 80
Asp Gly He Ala Met 85 Gly His He Gly Met 90 Arg Tyr Ser Leu Pro 95 Ser
Arg Glu He He 100 Ala Asp Ser Vai Glu 105 Thr Vai Vai Ser Ala 110 His Trp
Phe Asp Gly 115 Met Vai Cys He Pro 120 Asn Cys Asp Lys He 125 Thr Pro Gly
Met Leu 130 Met Ala Ala Met Arg 135 He Asn He Pro Thr 140 He Phe Vai Ser
Gly 145 Gly Pro Met Ala Ala 150 Gly Arg Thr Ser Tyr 155 Gly Arg Lys He Ser 160
Leu Ser Ser Vai Phe Glu Gly Vai Gly Ala Tyr Gin Ala Gly Lys He 165 170175
Asn Glu Asn Glu Leu Gin Glu Leu Glu Gin Phe Gly Cys Pro Thr Cys 180 185190
Gly Ser Cys Ser Gly Met Phe Thr Ala Asn Ser Met Asn Cys Leu Ser 195 200205
Glu Ala Leu Gly Leu Ala Leu Pro Gly Asn Gly Thr He Leu Ala Thr 210 215220
74.365/BE
229
Ser 225 Pro Glu Arg Lys Glu 230 Phe Val Arg Lys Ser 235 Ala Ala Gin Leu Met 240
Glu Thr lie Arg Lys 245 Asp lie Lys Pro Arg 250 Asp lie Val Thr Val 255 Lys
Ala lie Asp Asn 260 Ala Phe Ala Leu Asp 265 Met Ala Leu Gly Gly 270 Ser Thr
Asn Thr Val 275 Leu His Thr Leu Ala 280 Leu Ala Asn Glu Ala 285 Gly Val Glu
Tyr Ser 290 Leu Glu Arg lie Asn 295 Glu Val Ala Glu Arg Val 300 Pro His Leu
Ala 305 Lys Leu Ala Pro Ala 310 Ser Asp Val Phe lie 315 Glu Asp Leu His Glu 320
Ala Gly Gly Val Ser 325 Ala Ala Leu Asn Glu 330 Leu Ser Lys Lys Glu 335 Gly
Ala Leu His Leu 340 Asp Ala Leu Thr Val 345 Thr Gly Lys Thr Leu 350 Gly Glu
Thr Ile Ala 355 Gly His Glu Val Lys 360 Asp Tyr Asp Val lie 365 His Pro Leu
Asp Gin 370 Pro Phe Thr Glu Lys 375 Gly Gly Leu Ala Val Leu 380 Phe Gly Asn
Leu 385 Ala Pro Asp Gly Ala 390 Ile lie Lys Thr Gly 395 Gly Val Gin Asn Gly 400
lie Thr Arg His Glu 405 Gly Pro Ala Val Val 410 Phe Asp Ser Gin Asp 415 Glu
Ala Leu Asp Gly 420 lie lie Asn Arg Lys 425 Val Lys Glu Gly Asp 430 Val Val
lie lie Arg 435 Tyr Glu Gly Pro Lys 440 Gly Gly Pro Gly Met 445 Pro Glu Met
Leu Ala 450 Pro Thr Ser Gin lie 455 Val Gly Met Gly Leu Gly 460 Pro Lys Val
Ala 465 Leu Ile Thr Asp Gly 470 Arg Phe Ser Gly Ala 475 Ser Arg Gly Leu Ser 480
lie Gly His Val Ser 485 Pro Glu Ala Ala Glu 490 Gly Gly Pro Leu Ala 495 Phe
Val Glu Asn Gly 500 Asp His lie lie Val 505 Asp lie Glu Lys Arg 510 Ile Leu
74.365/BE
230
Asp Vai Gin Vai 515
Lys Gly Phe Glu 530
Lys Leu Vai Thr 545
Pro Glu Glu Glu Trp Glu Lys Arg Lys Ala Asn Trp 520525
Pro Lys Vai Lys Thr Gly Tyr Leu Ala Arg Tyr Ser 535540
Ser Ala Asn Thr Gly Gly He Met Lys He 550555 <210> 39 <211> 194 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 22 3> Description of Artificial Sequence:promoter sequence <220>
< 221> -35_signal < 222> (136)..(141) <220>
< 221> -10_signal < 222> (159)..(164) < 400> 39 gctattgacg acagctatgg ttcactgtcc accaaccaaa actgtgctca gtaccgccaa 60 tatttctccc ttgaggggta caaagaggtg tccctagaag agatccacgc tgtgtaaaaa 120 ttttacaaaa aggtattgac tttccctaca gggtgtgtaa taatttaatt acaggcgggg 180 gcaaccccgc ctgt 194 <210> 40 <211> 163 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Description of Artificial Sequence:promoter sequence <220>
<221> -35_signal < 222> (113)..(118) < 22 0>
<221> -10_signal < 222> (136)..(141)
74.365/BE
231
<400> 40
gcctacctag cttccaagaa agatatccta acagcacaag agcggaaaga tgttttgttc 60
tacatccaga acaacctctg ctaaaattcc tgaaaaattt tgcaaaaagt tgttgacttt 120
atctacaagg tgtggtataa taatcttaac aacagcagga cgc 163
<210> 41 <211> 127 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Description of Artificial Sequence:promoter sequence <220>
< 221> -35_signal < 222> (34)..(39) <220>
< 221> -10_signal < 222> (58)..(63) <220>
< 221> -35_signal < 222> (75).. (80) <220>
< 221> -10_signal < 222> (98)..(103) < 400> 41 gaggaatcat agaattttgt caaaataatt ttattgacaa cgtcttatta acgttgatat 60 aatttaaatt ttatttgaca aaaatgggct cgtgttgtac aataaatgta gtgaggtgga 120 tgcaatg 127 < 210> 42 < 211> 24 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Description of Artificial Sequence: ribosome binding site < 400> 42 taaacatgag gaggagaaaa catg 24
74.365/BE
232 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: ribosome binding site <400> 43 attcgagaaa tggagagaat ataatatg 28 <210> 44 <211> 13 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Description of Artificial Sequence: ribosome binding site <400> 44 agaaaggagg tga <210> 45 <211> 23 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: ribosome binding site <400> 45 ttaagaaagg aggtgannnn atg 23 <210> 46 <211> 23 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence < 220>
<223> Description of Artificial Sequence: ribosome binding site <400> 46 ttagaaagga ggtgannnnn atg <210> 47 <211> 23 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Description of Artificial Sequence: ribosome binding site
74.365/BE
233 <400> 47 agaaaggagg tgannnnnnn atg 23 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: ribosome binding site <400> 48 agaaaggagg tgannnnnna tg 22 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: ribosome binding site <400> 49 ccctctagaa ggaggagaaa acatg 25 <210> 50 <211> 24 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Description of Artificial Sequence: ribosome binding site < 400> 50 ccctctagag gaggagaaaa catg 24 < 210> 51 < 211> 23 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: ribosome binding site <400> 51 ttagaaagga ggatttaaat atg 23 <210> 52 <211> 23 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Description of Artificial Sequence:ribosome binding site
74.365/BE
234
<400> 52 ttagaaagga ggtttaatta atg 23
<210> 53 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: ribosome binding site
<400> 53 ttagaaagga ggtgatttaa atg <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: ribosome binding site 23
<400> 54 ttagaaagga ggtgtttaaa atg <210> 55 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: ribosome binding site 23
<400> 55 attcgagaaa ggaggtgaat ataatatg <210> 56 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: ribosome binding site 28
<400> 56 attcgagaaa ggaggtgaat aataatg <210> 57 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: ribosome binding site 27
74.365/BE
Y
235 <400> 57 attcgtagaa aggaggtgaa ttaatatg <210> 58 <211> 3291 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 58
atggggacta atgtacaggt ggattcagca tctgccgaat gtacacagac gatgagcgga 60
gcattaatgc tgattgaatc attaaaaaaa gagaaagtag aaatgatctt cggttatccg 120
ggcggggctg tgcttccgat ttacgataag ctatacaatt cagggttggt acatatcctt 180
ccccgtcacg aacaaggagc aattcatgca gcggagggat acgcaagggt ctccggaaaa 240
ccgggtgtcg tcattgccac gtcagggccg ggagcgacaa accttgttac aggccttgct 300
gatgccatga ttgattcatt gccgttagtc gtctttacag ggcaggtagc aacctctgta 360
atcgggagcg atgcatttca ggaagcagac attttaggga ttacgatgcc agtaacaaaa 420
cacagctacc aggttcgcca gccggaagat ctgccgcgca tcattaaaga agcgttccat 480
attgcaacaa ctggaagacc cggacctgta ttgattgata ttccgaaaga tgtagcaaca 540
attgaaggag aattcagcta cgatcatgag atgaatctcc cgggatacca gccgacaaca 600
gagccgaatt atttgcagat ccgcaagctt gtggaagccg tgagcagtgc gaaaaaaccg 660
gtgatcctgg cgggtgcggg cgtactgcac ggaaaagcgt cagaagaatt aaaaaattat 720
gctgaacagc agcaaatccc tgtggcacac acccttttgg ggctcggagg cttcccggct 780
gaccatccgc ttttcctagg gatggcggga atgcacggta cttatacagc caatatggcc 840
cttcatgaat gtgatctatt aatcagtatc ggcgcccgtt ttgatgaccg tgtcacagga 900
aacctgaaac actttgccag aaacgcaaag atagcccaca tcgatattga tccagctgaa 960
atcggaaaaa tcatgaaaac acagattcct gtagtcggag acagcaaaat tgtcctgcag 1020
gagctgatca aacaagacgg caaacaaagc gattcaagcg aatggaaaaa acagctcgca 1080
gaatggaaag aagagtatcc gctctggtat gtagataatg aagaagaagg ttttaaacct 1140
cagaaattga ttgaatatat tcatcaattt acaaaaggag aggccattgt cgcaacggat 1200
gtaggccagc atcaaatgtg gtcagcgcaa ttttatccgt tccaaaaagc agataaatgg 1260
gtcacgtcag gcggacttgg aacgatggga ttcggtcttc cggcggcgat cggcgcacag 1320
74.365/BE
236 ctggccgaaa aagatgctac tgttgtcgcg gttgtcggag acggcggatt ccaaatgacg 1380 cttcaagaac tcgatgttat tcgcgaatta aatcttccgg tcaaggtagt gattttaaat 1440 aacgcttgtc tcggaatggt cagacagtgg caggaaattt tctatgaaga acgttattca 1500 gaatctaaat tcgcttctca gcctgacttc gtcaaattgt ccgaagcata cggcattaaa 1560 ggcatcagaa tttcatcaga agcggaagca aaggaaaagc tggaagaggc attaacatca 1620 agagaacctg ttgtcattga cgtgcgggtt gccagcgaag aaaaagtatt cccgatggtg 1680 gctccgggga aagggctgca tgaaatggtg ggggtgaaac cttgaaaaga attatcacat 1740 tgactgtggt gaaccgctcc ggggtgttaa accggatcac cggtctattc acaaaaaggc 1800 attacaacat tgaaagcatt acagttggac acacagaaac agccggcgtt tccagaatca 1860 ccttcgtcgt tcatgttgaa ggtgaaaatg atgttgaaca gttaacgaaa cagctcaaca 1920 aacagattga tgtgctgaaa gtcacagaca tcacaaatca atcgattgtc cagagggagc 1980 tggccttaat caaggttgtc tccgcacctt caacaagaac agagattaat ggaatcatag 2040 aaccgtttag agcctctgtc gttgatgtca gcagagacag catcgttgtt caggtgacag 2100 gtgaatctaa caaaattgaa gcgcttattg agttattaaa accttatggc attaaagaaa 2160 tcgcgagaac aggtacaacg gcttttgcga ggggaaccag caaaaggcgt catccaataa 2220 aacaatatct attgtataaa acataacaag ggagagattg aaatggtaaa agtatattat 2280 aacggtgata tcaaagagaa cgtattggct ggaaaaacag tagcggttat cgggtacggt 2340 tcgcaaggcc acgcacatgc cctgaacctt aaagaaagcg gagtagacgt gatcgtcggt 2400 gttagacaag gaaaatcttt cactcaagcc caagaagacg gacataaagt attttcagta 2460 aaagaagcgg cagcccaagc cgaaatcatc atggttctgc ttccggatga gcagcagcaa 2520 aaagtatacg aagctgaaat caaagatgaa ttgacagcag gaaaatcatt agtattcgct 2580 catggattta acgtgcattt ccatcaaatt gttcctccgg cggatgtaga tgtattctta 2640 gtggccccta aaggcccggg acacttggta agaagaacat atgagcaagg agctggcgta 2700 cctgcattgt tcgcaatcta tcaagatgtg actggagaag caagagacaa agccctcgct 2760 tatgctaaag gaatcggcgg cgcaagagcg ggcgtattag aaacgacatt taaagaagaa 2820 acagaaacag atttgttcgg tgagcaagca gttctttgcg gcggattaag cgcgcttgtc 2880 aaagccggat ttgaaacctt aactgaagca ggttatcagc ctgaacttgc atacttcgag 2940
74.365/BE
237
tgtcttcatg agetgaaatt aatcgtagac cttatgtacg aagaaggact tgcaggaatg 3000
agatattcaa tctctgacac agcacagtgg ggagatttcg tatcaggccc tcgcgttgtg 3060
gacgccaaag taaaagaatc tatgaaagaa gtattaaaag atatccaaaa cggtacattc 3120
gcaaaagagt ggategtega aaaccaagta aaccgtcctc gtttcaacgc tatcaatgca 3180
agcgagaacg aacatcaaat egaagtagtg ggaagaaagc ttegtgaaat gatgccgttt 324 0
gtgaaacaag gcaagaagaa ggaagcggtg gtctccgttg egeaaaatta a 3291
<210> 59 <211> 2363 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220>
<221> CDS <222> (242)..(1072) <220>
<221> CDS <222> (1077)..(1934) <220>
<221> CDS <222> (1939)..(2319) <400> 59 ttggtacaag cccgttgatt ttggtatact tccattgggc agtatcgcct gcgaactgca 60 cctattatta aaatagatag acattgcagc agtctgcctt gatccaaaaa aggactggga 120 cagagggatg aaactcgccg aactttagaa agtgaagaat ccttctcgtt gtaacggaag 180 gttttttggc ttgcagaaga aaacggcaga teatctcctc taaacatgag gaggagaaaa 240 c atg aaa aca aaa ctg gat ttt eta aaa atg aag gag tet gaa gaa ccg 289
Met Lys Thr Lys Leu Asp Phe Leu Lys Met Lys Glu Ser Glu Glu Pro 15 1015 att gtc atg ctg acc get tat gat tat ccg gca get aaa ctt get gaa 337
He Vai Met Leu Thr Ala Tyr Asp Tyr Pro Ala Ala Lys Leu Ala Glu 20 2530 caa geg gga gtt gac atg att tta gtc ggt gat tea ctt gga atg gtc385
Gin Ala Gly Vai Asp Met He Leu Vai Gly Asp Ser Leu Gly MetVai
4045 gtc etc ggc ctt gat tea act gtc ggt gtg aca gtt geg gac atg ate433
Vai Leu Gly Leu Asp Ser Thr Vai Gly Vai Thr Vai Ala Asp MetHe 50 55go
74.365/BE
238
cat His 65 cat aca aaa gcc Lys Ala gtt aaa agg ggt geg ccg aat acc ttt att gtg Val 80 481
His Thr Vai Lys 70 Arg Gly Ala Pro 75 Asn Thr Phe He
aca gat atg ccg ttt atg tet tat cac ctg tet aag gaa gat acg ctg 529
Thr Asp Met Pro Phe 85 Met Ser Tyr His Leu 90 Ser Lys Glu Asp Thr 95 Leu
aaa aat gca geg get ate gtt cag gaa age gga get gac gca ctg aag 577
Lys Asn Ala Ala 100 Ala He Vai Gin Glu 105 Ser Gly Ala Asp Ala 110 Leu Lys
ett gag ggc gga gaa ggc gtg ttt gaa tcc att ege gca ttg acg ett 625
Leu Glu Gly 115 Gly Glu Gly Vai Phe 120 Glu Ser He Arg Ala 125 Leu Thr Leu
gga ggc att cca gta gtc agt cac tta ggt ttg aca ccg cag tea gtc 673
Gly Gly 130 He Pro Vai Vai Ser 135 His Leu Gly Leu Thr 140 Pro Gin Ser Val
ggc gta ctg ggc ggc tat aaa gta cag ggc aaa gac gaa caa age gcc 721
Gly 145 Vai Leu Gly Gly Tyr 150 Lys Vai Gin Gly Lys 155 Asp Glu Gin Ser Ala 160
aaa aaa tta ata gaa gac agt ata aaa tgc gaa gaa gca gga get atg 769
Lys Lys Leu He Glu 165 Asp Ser He Lys Cys 170 Glu Glu Ala Gly Ala 175 Met
atg ett gtg ctg gaa tgt gtg ccg gca gaa etc aca gcc aaa att gcc 817
Met Leu Vai Leu 180 Glu Cys Vai Pro Ala 185 Glu Leu Thr Ala Lys 190 He Ala
gag acg eta age ata ccg gtc att gga ate ggg get ggt gtg aaa geg 865
Glu Thr Leu 195 Ser He Pro Vai He 200 Gly lie Gly Ala Gly 205 Val Lys Ala
gac gga caa gtt etc gtt tat cat gat att ate ggc cac ggt gtt gag 913
Asp Gly 210 Gin Vai Leu Vai Tyr 215 His Asp He He Gly 220 His Gly Val Glu
aga aca cct aaa ttt gta aag caa tat acg ege att gat gaa acc ate 961
Arg 225 Thr Pro Lys Phe Vai 230 Lys Gin Tyr Thr Arg 235 He Asp Glu Thr He 240
gaa aca gca ate age gga tat gtt cag gat gta aga cat cgt get ttc 1009
Glu Thr Ala He Ser 245 Gly Tyr Vai Gin Asp 250 Vai Arg His Arg Ala 255 Phe
cct gaa caa aag cat tcc ttt caa atg aac cag aca gtg ett gac ggc 1057
Pro Glu Gin Lys 260 His Ser Phe Gin Met 265 Asn Gin Thr Val Leu 270 Asp Gly
74.365/BE
239 ttg tac ggg gga aaa taag atg aga cag att act gat att tea cag ctg 1106 Leu Tyr Gly Gly Lys Met Arg Gin He Thr Asp lie Ser Gin Leu
275 280 285
aaa gaa gcc ata aaa caa tac cat tea gag ggc aag tea ate gga Gly ttt Phe 1154
Lys Glu Ala 290 He Lys Gin Tyr His 295 Ser Glu Gly Lys Ser 300 He
gtt ccg acg atg ggg ttt ctg cat gag ggg cat tta ace tta gca gac 1202
Vai Pro Thr 305 Met Gly Phe Leu His 310 Glu Gly His Leu 315 Thr Leu Ala Asp
aaa gca aga caa gaa aac gac gcc gtt att atg agt att ttt gtg aat 1250
Lys 320 Ala Arg Gin Glu Asn 325 Asp Ala Vai He Met 330 Ser He Phe Vai Asn 335
cct gca caa ttc ggc cct aat gaa gat ttt gaa gca tat ccg ege gat 1298
Pro Ala Gin Phe Gly Pro 340 Asn Glu Asp Phe 345 Glu Ala Tyr Pro Arg 350 Asp
att gag egg gat gca get ctt gca gaa aac gcc gga gtc gat att ctt 1346
He Glu Arg Asp 355 Ala Ala Leu Ala Glu Asn 360 Ala Gly Vai Asp 365 He Leu
ttt acg cca gat get cat gat atg tat ccc ggt gaa aag aat gtc acg 1394
Phe Thr Pro 370 Asp Ala His Asp Met 375 Tyr Pro Gly Glu Lys 380 Asn Vai Thr
att cat gta gaa aga ege aca gac gtg tta tgc ggg ege tea aga gaa 1442
He His Vai 385 Glu Arg Arg Thr Asp 390 Vai Leu Cys Gly 395 Arg Ser Arg Glu
gga cat ttt gac ggg gtc geg ate gta ctg acg aag ctt ttc aat eta 1490
Gly 400 His Phe Asp Gly Vai 405 Ala lie Vai Leu Thr 410 Lys Leu Phe Asn Leu 415
gtc aag ccg act cgt gcc tat ttc ggt tta aaa gat geg cag cag gta 1538
Vai Lys Pro Thr Arg Ala 420 Tyr Phe Gly Leu 425 Lys Asp Ala Gin Gin 430 Vai
get gtt gtt gat ggg tta ate age gac ttc ttc atg gat att gaa ttg 1586
Ala Vai Vai Asp 435 Gly Leu He Ser Asp Phe 440 Phe Met Asp He 445 Glu Leu
gtt cct gtc gat acg gtc aga gag gaa gac ggc tta gcc aaa age tet 1634
Vai Pro Vai 450 Asp Thr Vai Arg Glu 455 Glu Asp Gly Leu Ala 460 Lys Ser Ser
ege aat gta tac tta aca get gag gaa aga aaa gaa geg cct aag ctg 1682
Arg Asn Vai 465 Tyr Leu Thr Ala Glu 470 Glu Arg Lys Glu 475 Ala Pro Lys Leu
74.365/BE
240
tat egg gee ett caa aca agt geg gaa ett gtc caa gee ggt gaa aga 1730
Tyr Arg Ala Leu Gin Thr Ser Ala Glu Leu Val Gin Ala Gly Glu Arg
480 485 490 495
gat cct gaa geg gtg ata aaa get gca aaa gat ate att gaa acg act 1778
Asp Pro Glu Ala Val He Lys Ala Ala Lys Asp He He Glu Thr Thr
500 505 510
age gga acc ata gac tat gta gag ett tat tee tat ccg gaa etc gag 1826
Ser Gly Thr He Asp Tyr Val Glu Leu Tyr Ser Tyr Pro Glu Leu Glu
515 520 525
cct gtg aat gaa att get gga aag atg att etc get gtt gca gtt get 1874
Pro Val Asn Glu He Ala Gly Lys Met He Leu Ala Val Ala Val Ala
530 535 540
ttt tea aaa geg cgt tta ata gat aat ate att att gat att ega gaa 1922
Phe Ser Lys Ala Arg Leu He Asp Asn He He He Asp He Arg Glu
545 550 555
atg gag aga ata taat 3 ate j tat : ega ace i ate 1 ate j age ggc aae 1 ett : cac 1971
Met Glu Arg He Met Tyr Arg Thr Met Met Ser Gly Lys Leu His
560 565 570
agg gca act gtt acg gaa gca aac ctg aac tat gtg gga age att aca 2019
Arg Ala Thr Val Thr Glu Ala Asn Leu Asn Tyr Val Gly Ser He Thr
575 580 585 590
att gat gaa gat etc att gat get gtg gga atg ett cct aat gaa aaa 2067
He Asp Glu Asp Leu He Asp Ala Val Gly Met Leu Pro Asn Glu Lys
595 600 605
gta caa att gtg aat aat aat aat gga gca cgt ett gaa acg tat att 2115
Vai Gin lie Val Asn Asn Asn Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr He
610 615 620
att cct ggt aaa egg gga age ggc gtc ata tgc tta aac ggt gca gee 2163
He Pro Gly Lys Arg Gly Ser Gly Val He Cys Leu Asn Gly Ala Ala
625 630 635
gca ege ett gtg cag gaa gga gat aag gtc att att att tee tac aaa 2211
Ala Arg Leu Val Gin Glu Gly Asp Lys Val He He He Ser Tyr Lys
640 645 650
atg atg tet gat caa gaa geg gca age cat gag ccg aaa gtg get gtt 2259
Met Met Ser Asp Gin Glu Ala Ala Ser His Glu Pro Lys Val Ala Val
655 660 665 670
ctg aat gat caa aac aaa att gaa caa atg ctg ggg aac gaa cca gee 2307
Leu Asn Asp Gin Asn Lys He Glu Gin Met Leu Gly Asn Glu Pro Ala
675 680 685
74.365/BE
241 cgt aca att ttg tagaagaaaa gcccccttta tcgggggttt tcttttaaga tttt 2363 Arg Thr He Leu
690 < 210> 60 < 211> 293 < 212> PRT < 213> Bacillus subtilis < 400> 60
Met Ser He Ala Vai Ser Glu Glu Glu Ala Lys Ala Vai Glu Gly Leu 15 1015
Asn Asp Tyr Leu Ser Vai Glu Glu Vai Glu Thr He Tyr He Pro Leu 20 2530
Vai Arg Leu Leu His Leu His Vai Lys Ser Ala Ala Glu Arg Asn Lys 35 4045
His Vai Asn Vai Phe Leu Lys His Pro His Ser Ala Lys He Pro Phe 50 5560
He He Gly He Ala Gly Ser Vai Ala Vai Gly Lys Ser Thr ThrAla 65 70 7580
Arg He Leu Gin Lys Leu Leu Ser Arg Leu Pro Asp Arg Pro LysVai
9095
Ser Leu He Thr Thr Asp Gly Phe Leu Phe Pro Thr Ala Glu Leu Lys 100 105HO
Lys Lys Asn Met Met Ser Arg Lys Gly Phe Pro Glu Ser Tyr Asp Vai 115 120125
Lys Ala Leu Leu Glu Phe Leu Asn Asp Leu Lys Ser Gly Lys Asp Ser 130 135140
Vai Lys Ala Pro Vai Tyr Ser His Leu Thr Tyr Asp Arg Glu GluGly 145 150 155160
Vai Phe Glu Vai Vai Glu Gin Ala Asp lie Vai lie He Glu Glylie
165 170175
Asn Vai Leu Gin Ser Pro Thr Leu Glu Asp Asp Arg Glu Asn Pro Arg 180 185190
He Phe Vai Ser Asp Phe Phe Asp Phe Ser He Tyr Vai Asp Ala Glu 195 200205
Glu Ser Arg He Phe Thr Trp Tyr Leu Glu Arg Phe Arg Leu Leu Arg
210 215220
74.365/BE
242
Glu Thr Ala Phe Gin 225
Leu Ser Asp Gin Glu 245
Vai Asn Arg Pro Asn 260
Ser Asp Leu He Leu 275
Leu Vai Arg Arg Vai 290
Asn Pro Asp Ser Tyr Phe 230 235
Ala Asp Glu Met Ala Ala 250
Leu Tyr Glu Asn He Leu 265
Arg Lys Gly Asp Gly His 280
His Lys Phe Lys Asp 240
Ser lie Trp Glu Ser 255
Pro Thr Lys Phe Arg 270
Lys Vai Glu Glu Vai 285 <210> 61 <211> 281 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 61
Met Glu Gly Leu Asn Asp Tyr Leu Ser Vai Glu Glu Vai Glu Thr He 1 5 1015
Tyr He Pro Leu Vai Arg Leu Leu His Leu His Vai Lys Ser AlaAla
2530
Glu Arg Asn Lys His Vai Asn Vai Phe Leu Lys His Pro His Ser Ala 35 4045
Lys He 50 Pro Phe He He Gly 55 lie Ala Gly Ser Vai 60 Ala Vai Gly Lys
Ser 65 Thr Thr Ala Arg He 70 Leu Gin Lys Leu Leu 75 Ser Arg Leu Pro Asp 80
Arg Pro Lys Vai Ser 85 Leu He Thr Thr Asp 90 Gly Phe Leu Phe Pro 95 Thr
Ala Glu Leu Lys Lys Lys Asn Met Met Ser Arg Lys Gly Phe Pro Glu
100 105 HO
Ser Tyr Asp Vai Lys Ala Leu Leu Glu Phe Leu Asn Asp Leu Lys Ser H5 120125
Gly Lys 130 Asp Ser Vai Lys Ala 135 Pro Vai Tyr Ser His 140 Leu Thr Tyr Asp
Arg Glu Glu Gly Vai Phe Glu Vai Vai Glu Gin Ala Asp He Vai He
145 150 155 160
lie Glu Gly He Asn Vai Leu Gin Ser Pro Thr Leu Glu Asp Asp Arg
165 170 175
74.365/BE
243
Glu Asn Pro Arg 180 He Phe Val Ser Asp 185 Phe Phe Asp Phe Ser 190 He Tyr
Val Asp Ala 195 Glu Glu Ser Arg He 200 Phe Thr Trp Tyr Leu 205 Glu Arg Phe
Arg Leu 210 Leu Arg Glu Thr Ala 215 Phe Gin Asn Pro Asp 220 Ser Tyr Phe His
Lys 225 Phe Lys Asp Leu Ser 230 Asp Gin Glu Ala Asp 235 Glu Met Ala Ala Ser 240
He Trp Glu Ser Val 245 Asn Arg Pro Asn Leu 250 Tyr Glu Asn lie Leu 255 Pro
Thr Lys Phe Arg 260 Ser Asp Leu He Leu 265 Arg Lys Gly Asp Gly 270 His Lys
Val Glu Glu Val Leu Val Arg Arg Val
275 280 <210> 62 <211> 1092 < 212> DNA < 213> Bacillus subtilis <220>
< 221> CDS < 222> (1)..(1089) <400> 62
atg Met 1 act aaa caa aca att ege gtt gaa ttg aca tea aca aaa aaa ccg 48
Thr Lys Gin Thr 5 He Arg Val Glu Leu 10 Thr Ser Thr Lys Lys 15 Pro
aaa cca gac cca aat cag ett teg ttc gga aga gtg ttt aca gac cac 96
Lys Pro Asp Pro 20 Asn Gin Leu Ser Phe 25 Gly Arg Val Phe Thr 30 Asp His
atg ttt gta atg gac tat gcc gca gat aaa ggt tgg tac gat cca aga 144
Met Phe Val 35 Met Asp Tyr Ala Ala 40 Asp Lys Gly Trp Tyr 45 Asp Pro Arg
ate att cct tat caa ccc tta tea atg gat cca act gca atg gtc tat 192
He He 50 Pro Tyr Gin Pro Leu 55 Ser Met Asp Pro Thr 60 Ala Met Val Tyr
cac tac ggc caa acc gtg ttt gaa ggg tta aag get tac gtg tea gag 240
His 65 Tyr Gly Gin Thr Val 70 Phe Glu Gly Leu Lys 75 Ala Tyr Val Ser Glu 80
74.365/BE
244 gat gac cat gtt ctg ett ttc aga ccg gaa aaa aat atg gaa ege ctg 288 Asp Asp His Vai Leu Leu Phe Arg Pro Glu Lys Asn Met Glu Arg Leu
9095 aat caa tea aac gac ege etc tgc ate ccg caa att gat gaa gaa cag336
Asn Gin Ser Asn Asp Arg Leu Cys He Pro Gin lie Asp Glu GluGin
100 105110 gtt ett gaa ggc tta aag cag ett gtc gca att gat aaa gac tgg att384
Vai Leu Glu Gly Leu Lys Gin Leu Vai Ala lie Asp Lys Asp TrpLie
115 120125 cca aat geg gag ggc acg tee ett tac ate cgt ccg ttc ate ate gca432
Pro Asn Ala Glu Gly Thr Ser Leu Tyr lie Arg Pro Phe lie HeAla
130 135140 ace gag cct ttc ett ggt gtt geg gca tet cat acg tat aag etc ttg480
Thr Glu Pro Phe Leu Gly Vai Ala Ala Ser His Thr Tyr Lys LeuLeu
145 150 155160 ate att ett tet ccg gtc ggc tet tat tac aaa gaa ggc att aag ccg528 lie He Leu Ser Pro Vai Gly Ser Tyr Tyr Lys Glu Gly lie LysPro
165 170175 gtc aaa ate get gtt gaa agt gaa ttt gtc cgt geg gta aaa ggc gga576
Vai Lys He Ala Vai Glu Ser Glu Phe Vai Arg Ala Vai Lys GlyGly
180 185190 aca gga aat gee aaa ace gca gga aac tat get tea age tta aaa geg624
Thr Gly Asn Ala Lys Thr Ala Gly Asn Tyr Ala Ser Ser Leu LysAla
195 200205 cag cag gta gee gaa gag aaa gga ttt tet caa gta etc tgg ctg gac672
Gin Gin Vai Ala Glu Glu Lys Gly Phe Ser Gin Vai Leu Trp LeuAsp
210 215220 ggc att gag aag aaa tac ate gaa gaa gtc gga age atg aac ate ttc720
Gly lie Glu Lys Lys Tyr He Glu Glu Vai Gly Ser Met Asn HePhe
225 230 235240 ttc aaa ate aac ggt gaa ate gta aca ccg atg ctg aac ggg age ate768
Phe Lys He Asn Gly Glu He Vai Thr Pro Met Leu Asn Gly SerHe
245 250255 ctg gaa ggc att acg ege aat tea gtc ate gee ttg ett aag cat tgg816
Leu Glu Gly He Thr Arg Asn Ser Vai He Ala Leu Leu Lys HisTrp
260 265270 ggc ett caa gtt tea gaa ega aaa att geg ate gat gag gtc ate caa864
Gly Leu Gin Vai Ser Glu Arg Lys He Ala He Asp Glu Vai HeGin
275 280285
74.365/BE
245 gcc cat aaa gac ggc ate ctg gaa gaa gcc ttc gga aca ggt aca gca912
Ala His Lys Asp Gly He Leu Glu Glu Ala Phe Gly Thr Gly ThrAla
290 295300 get gtt att tee cca gtc ggc gag ctg ate tgg cag gat gaa aca ett960
Ala Vai He Ser Pro Vai Gly Glu Leu He Trp Gin Asp Glu ThrLeu 305 310 315320 teg ate aac aac ggt gaa aca gga gaa ate gca aaa aaa eta tat gac1008
Ser He Asn Asn Gly Glu Thr Gly Glu He Ala Lys Lys Leu TyrAsp
325 330335 acg att aca ggc att caa aaa ggc get gtc gca gac gaa ttc gga tgg1056
Thr He Thr Gly He Gin Lys Gly Ala Vai Ala Asp Glu Phe GlyTrp
340 345350 acg acc gaa gtc gca geg ctg act gaa age aag taa1092
Thr Thr Glu Vai Ala Ala Leu Thr Glu Ser Lys
355
360 <210> 63 <211> 363 < 212> PRT < 213> Bacillus subtilis < 400> 63
Met Thr Lys Gin Thr lie Arg Vai Glu Leu Thr Ser Thr Lys Lys Pro 13 1015
Lys Pro Asp Pro Asn Gin Leu Ser Phe Gly Arg Vai Phe Thr Asp His 20 2530
Met Phe Vai Met Asp Tyr Ala Ala Asp Lys Gly Trp Tyr Asp Pro Arg 35 4045
He lie Pro Tyr Gin Pro Leu Ser Met Asp Pro Thr Ala Met Vai Tyr 50 5560
His Tyr Gly Gin Thr Vai Phe Glu Gly Leu Lys Ala Tyr Vai SerGlu 65 70 7580
Asp Asp His Vai Leu Leu Phe Arg Pro Glu Lys Asn Met Glu ArgLeu
9095
Asn Gin Ser Asn Asp Arg Leu Cys He Pro Gin He Asp Glu Glu Gin 100 105HO
Vai Leu Glu Gly Leu Lys Gin Leu Vai Ala lie Asp Lys Asp Trp lie H5 120125
Pro Asn Ala Glu Gly Thr Ser Leu Tyr He Arg Pro Phe He He Ala
130
135
140
74.365/BE
246
Thr 145 Glu Pro Phe Leu Gly 150 Vai Ala Ala Ser His 155 Thr Tyr Lys Leu Leu 160
He He Leu Ser Pro Vai Gly Ser Tyr Tyr Lys Glu Gly He Lys Pro
165 170 175
Vai Lys He Ala Vai Glu Ser Glu Phe Vai Arg Ala Vai Lys Gly Gly
180 185 190
Thr Gly Asn 195 Ala Lys Thr Ala Gly Asn 200 Tyr Ala Ser Ser 205 Leu Lys Ala
Gin Gin Vai Ala Glu Glu Lys Gly Phe Ser Gin Vai Leu Trp Leu Asp
210 215 220
Gly He Glu Lys Lys Tyr He Glu Glu Vai Gly Ser Met Asn He Phe
225 230 235 240
Phe Lys He Asn Gly Glu He Vai Thr Pro Met Leu Asn Gly Ser He 245 250255
Leu Glu Gly He Thr Arg Asn Ser Vai He Ala Leu Leu Lys His Trp 260 265270
Gly Leu Gin Vai Ser Glu Arg Lys He Ala He Asp Glu Vai He Gin 275 280285
Ala His Lys Asp Gly He Leu Glu Glu Ala Phe Gly Thr Gly Thr Ala 290 295300
Ala Vai He Ser Pro Vai Gly Glu Leu He Trp Gin Asp Glu ThrLeu
305 310 315320
Ser lie Asn Asn Gly Glu Thr Gly Glu lie Ala Lys Lys Leu TyrAsp
325 330335
Thr He Thr Gly He Gin Lys Gly Ala Vai Ala Asp Glu Phe Gly Trp 340 345350
Thr Thr Glu Vai Ala Ala Leu Thr Glu Ser Lys
355360 <210> 64 < 211> 1071 < 212> DNA < 213> Bacillus subtilis <220>
< 221> CDS < 222> (1)..(1068)
74.365/BE
247 <400> 64 ttg aat aag ett att gaa ega gaa aaa act gta tat tat aag gaa aag48
Met Asn Lys Leu He Glu Arg Glu Lys Thr Val Tyr Tyr Lys GluLys 15 1015 ccc gac ccg tet tcc ttg ggg ttt gga caa tat ttt aca gat tat atg96
Pro Asp Pro Ser Ser Leu Gly Phe Gly Gin Tyr Phe Thr Asp TyrMet
2530 ttt gtg atg gac tac gaa gag ggg att gga tgg cat cat ccg aga att144
Phe Val Met Asp Tyr Glu Glu Gly lie Gly Trp His His Pro ArgHe
4045 geg ccg tac gca ccg ett acg ett gat ccg tet tea tet gtt ttt cat192
Ala Pro Tyr Ala Pro Leu Thr Leu Asp Pro Ser Ser Ser Val PheHis 50 5560 tac ggc cag get gtt ttt gaa gga tta aaa gca tac aga aca gac gac240
Tyr Gly Gin Ala Val Phe Glu Gly Leu Lys Ala Tyr Arg Thr AspAso 65 70 7580 ggc agg gtg ctg ctg ttc cgt ccg gat caa aat ate aaa egg ctg aac288
Gly Arg Val Leu Leu Phe Arg Pro Asp Gin Asn lie Lys Arg LeuAsn
90'95 aga teg tgt gag ege atg age atg ccc cct tta gac gaa gag ctg gtg336
Arg Ser Cys Glu Arg Met Ser Met Pro Pro Leu Asp Glu Glu LeuVal
100 105no ett gag gca ttg acg caa tta gtt gag ctg gag aaa gat tgg gtt cca384
Leu Glu Ala Leu Thr Gin Leu Val Glu Leu Glu Lys Asp Trp ValPro
115 120125 aag gaa aaa gga acg tea ctg tat att cgt cct ttt gtc att gcc aca432
Lys Glu Lys Gly Thr Ser Leu Tyr He Arg Pro Phe Val He AlaThr
130 135140 gaa ccg agt etc ggt gtg aag gca tcc agg age tat aca ttt atg ate480
Glu Pro Ser Leu Gly Val Lys Ala Ser Arg Ser Tyr Thr Phe MetHe 145 150 155160 gtg ett teg cet gtc ggc tcc tat tat ggc gac gat cag ctg aag ccg528
Val Leu Ser Pro Val Gly Ser Tyr Tyr Gly Asp Asp Gin Leu Lys Pro
165 170Π5 gtt aga ate tat gtc gaa gat gag tat gtg agg geg gtc aac gga gga576
Val Arg He Tyr Val Glu Asp Glu Tyr Val Arg Ala Val Asn Gly Gly
180 185190 gtc ggg ttt gca aaa acg get gga aac tat gcc gcc agt ett cag gca624
Val Gly Phe Ala Lys Thr Ala Gly Asn Tyr Ala Ala Ser Leu Gin Ala 195 200205
74.365/BE
248
cag Gin egg aaa geg aat gaa ctg ggc tat gac cag gta ctg tgg ctg gac 672
Arg 210 Lys Ala Asn Glu Leu Gly Tyr Asp Gin Val Leu Trp Leu Asp
215 220
gcc ate gaa aag aaa tat gtg gaa gaa gta ggg age atg aac ate ttt 720
Ala 225 lie Glu Lys Lys Tyr 230 Val Glu Glu Val Gly 235 Ser Met Asn lie Phe 240
ttc gtc ata aac ggg gaa get gtc aca cct get tta age gga age att 768
Phe Val lie Asn Gly 245 Glu Ala Val Thr Pro 250 Ala Leu Ser Gly Ser 255 lie
tta age ggg gtt aca cgt geg tet geg att gaa ttg att ega age tgg 816
Leu Ser Gly Val 260 Thr Arg Ala Ser Ala 265 lie Glu Leu lie Arg 270 Ser Trp
ggc att ccg gtt cgt gaa gag aga ata teg att gat gag gtg tat geg 864
Gly lie Pro 275 Val Arg Glu Glu Arg 280 lie Ser lie Asp Glu 285 Val Tyr Ala
gcc tet gca ege gga gaa ttg aca gag gtc ttt ggc aca ggc acg gca 912
Ala Ser 290 Ala Arg Gly Glu Leu 295 Thr Glu Val Phe Gly 300 Thr Gly Thr Ala
gca gtc gtt acg cct gtc ggt gaa etc aac ate cat gga aaa acg gtg 960
Ala 305 Val Val Thr Pro Val 310 Gly Glu Leu Asn lie 315 His Gly Lys Thr Val 320
att gta ggc gac ggg caa ate ggg gac etc teg aaa aag ctg tat gaa 1008
lie Val Gly Asp Gly 325 Gin lie Gly Asp Leu 330 Ser Lys Lys Leu Tyr 335 Glu
acg ata aca gat att cag ett ggc aag gta aaa ggc ccg ttt aac tgg 1056
Thr aca Thr lie gtg Val Thr gaa Glu 355 Asp 340 gtg Val lie tga Gin Leu Gly Lys 345 Val Lys Gly Pro Phe 350 Asn Trp 1071
<210> 65 <211> 356 <212> PRT <213> Bacillus subtilis
<400 Met 1 > 65 Asn Lys Leu Ile 5 Glu Arg Glu Lys Thr 10 Val Tyr Tyr Lys Glu 15 Lys
Pro Asp Pro Ser Ser Leu Gly Phe Gly Gin Tyr Phe Thr Asp Tyr Met
20 25 30
74.365/BE
249
Phe Val Met 35
Ala Pro Tyr 50
Tyr Gly Gin 65
Gly Arg Val
Arg Ser Cys
Leu Glu Ala
115
Lys Glu Lys 130
Glu Pro Ser 145
Val Leu Ser
Val Arg He
Val Gly Phe 195
Gin Arg Lys 210
Ala He Glu 225
Phe Val He
Asp Tyr Glu Glu Gly 40
Ala Pro Leu Thr Leu 55
Ala Val Phe Glu Gly 70
Leu Leu Phe Arg Pro 85
Glu Arg Met Ser Met 100
Leu Thr Gin Leu Val 120
Gly Thr Ser Leu Tyr 135
Leu Gly Val Lys Ala 150
Pro Val Gly Ser Tyr 165
Tyr Val Glu Asp Glu 180
Ala Lys Thr Ala Gly 200
Ala Asn Glu Leu Gly 215
Lys Lys Tyr Val Glu 230
Asn Gly Glu Ala Val 245 lie Gly Trp His
Asp Pro Ser Ser 60
Leu Lys Ala Tyr 75
Asp Gin Asn lie 90
Pro Pro Leu Asp 105
Glu Leu Glu Lys
He Arg Pro Phe 140
Ser Arg Ser Tyr 155
Tyr Gly Asp Asp 170
Tyr Val Arg Ala 185
Asn Tyr Ala Ala
Tyr Asp Gin Val 220
Glu Val Gly Ser 235
Thr Pro Ala Leu 250
His Pro Arg lie 45
Ser Val Phe His
Arg Thr Asp Asp 80
Lys Arg Leu Asn 95
Glu Glu Leu Val 110
Asp Trp Val Pro 125
Val He Ala Thr
Thr Phe Met lie 160
Gin Leu Lys Pro 175
Val Asn Gly Gly 190
Ser Leu Gin Ala 205
Leu Trp Leu Asp
Met Asn lie Phe 240
Ser Gly Ser lie 255
Leu Ser Gly Val Thr Arg Ala Ser 260
Gly lie Pro Val Arg Glu Glu Arg 275280
Ala Ser Ala Arg Gly Glu Leu Thr 290295
Ala Val Val Thr Pro Val Gly Glu 305310
Ala lie Glu Leu lie Arg Ser Trp 265 270
He Ser lie Asp Glu Val Tyr Ala 285
Glu Val Phe Gly Thr Gly Thr Ala 300
Leu Asn lie His Gly Lys Thr Val 315 320
74.365/BE
250
He Vai Gly Asp
Thr lie Thr Asp 340
Thr Vai Glu Vai 355
Gly Gin He Gly 325 lie Gin Leu Gly
Asp Leu Ser Lys 330
Lys Vai Lys Gly 345
Lys Leu Tyr Glu
335
Pro Phe Asn Trp
350 <210> 66 <211> 1428 <212> DNA < 213> Bacillus subtilis <220>
< 221> CDS < 222> (1)..(1425)
<400> 66 atg tta aac ggc caa aaa gaa tat cgc gtg gaa aaa gac ttc ett ggg 48
Met 1 Leu Asn Gly Gin Lys Glu Tyr Arg Vai Glu Lys Asp Phe Leu Gly
5 10 15
gaa Glu aaa Lys caa Gin att He 20 gaa Glu gca Ala gat Asp gtt Vai tat Tyr 25 tac Tyr gga Gly att He cág Gin acg Thr 30 etc Leu cgt Arg 96
get Ala tet Ser gaa Glu 35 aat Asn ttt Phe ccg Pro ate He aca Thr 40 gga Gly tac Tyr aaa Lys ate He cat His 45 gag Glu gaa Glu atg Met 144
att He aac Asn 50 gca Ala ctg Leu geg Ala att He gtg Vai 55 aaa Lys aaa Lys get Ala geg Ala get Ala 60 ett Leu gcc Ala aac Asn atg Met 192
gac Asp 65 gtg Vai aaa Lys egg Arg ctg Leu tat Tyr 70 gaa Glu gga Gly att He ggc Gly caa Gin 75 get Ala ate He gta Vai caa Gin gcc Ala 80 240
get Ala gac Asp gag Glu att He ctg Leu 85 gaa Glu ggc Gly aag Lys tgg Trp cac His 90 gat Asp cag Gin ttt Phe ate He gtc Vai 95 gat Asp 288
ccg Pro att lie cag Gin gge Gly 100 ggt Gly gcc Ala gga Gly act Thr tet Ser 105 atg Met aac Asn atg Met aac Asn geg Ala 110 aat Asn gag Glu 336
gtt Vai ate He gga Gly 115 aac Asn egg Arg geg Ala ett Leu gaa Glu 120 ate lie atg Met gga Gly cat His aaa Lys 125 aag Lys gga gat Gly Asp 384
74.365/BE
251
tat ate cat tta agt cca aac aca cat gtg aac atg tea cag tet cag 432
Tyr He His Leu Ser Pro Asn Thr His Vai Asn Met Ser Gin Ser Gin
130 135 140
aac gat gtg ttc ccg act get ate cat att tee aca ttg aag etc tta 480
Asn Asp Vai Phe Pro Thr Ala He His He Ser Thr Leu Lys Leu Leu
145 150 155 160
gaa aaa ctg ctg aaa aca atg gaa gat atg cat agt gtg ttt aaa caa 528
Glu Lys Leu Leu Lys Thr Met Glu Asp Met His Ser Vai Phe Lys Gin
165 170 175
aaa gca cag gag ttt cac tet gtt att aaa atg ggc egg aca cac ett 576
Lys Ala Gin Glu Phe His Ser Vai He Lys Met Gly Arg Thr His Leu
180 185 190
caa gat geg gtt ccg ate cgt ett ggc cag gaa ttc gaa get tac age 624
Gin Asp Ala Vai Pro He Arg Leu Gly Gin Glu Phe Glu Ala Tyr Ser
195 200 205
cgt gtt etc gag cgt gat ate aaa ega ate aag caa teg cgc cag cac 672
Arg Vai Leu Glu Arg Asp He Lys Arg He Lys Gin Ser Arg Gin His
210 215 220
ctg tat gaa gtc aac atg ggc gca act get gtt ggt aca ggg ctg aac 720
Leu Tyr Glu Vai Asn Met Gly Ala Thr Ala Vai Gly Thr Gly Leu Asn
225 230 235 240
get gat cct gaa tat ate aaa cag gta gta aag cac ett get gat att 768
Ala Asp Pro Glu Tyr He Lys Gin Vai Vai Lys His Leu Ala Asp He
245 250 255
age ggg ett cct ett gtc ggc get gat cat ett gtt gat geg aca caa 816
Ser Gly Leu Pro Leu Vai Gly Ala Asp His Leu Vai Asp Ala Thr Gin
260 265 270
aat aca gat gcc tat aca gag gta tea get tea tta aaa gtc tgc atg 864
Asn Thr Asp Ala Tyr Thr Glu Vai Ser Ala Ser Leu Lys Vai Cys Met
275 280 285
atg aac atg teg aag ate gca aac gac ctg cgc tta atg geg teg gga 912
Met Asn Met Ser Lys He Ala Asn Asp Leu Arg Leu Met Ala Ser Gly
290 295 300
ccg cgc gcc gga ett geg gaa att tet ctg cct gca cgt cag ccg ggt 960
Pro Arg Ala Gly Leu Ala Glu He Ser Leu Pro Ala Arg Gin Pro Gly
305 310 315 320
tea tet att atg ccg ggg aaa gtc aat ccg gtt atg geg gag ctg ate 1008
Ser Ser He Met Pro Gly Lys Vai Asn Pro Vai Met Ala Glu Leu He
325 330 335
74.365/BE
252
aac caa att gcg ttc cag gtt ate gga aat gac aat aca ate tgc ctt 1056
Asn Gin He Ala Phe Gin Vai He Gly Asn Asp Asn Thr He Cys Leu
340 345 350
get tea gaa gee ggc cag ctt gag ttg aac gtc atg gag ccc gtg ctt 1104
Ala Ser Glu Ala Gly Gin Leu Glu Leu Asn Vai Met Glu Pro Vai Leu
355 360 365
gtc ttt aat ttg Ctt caa tcc ate age ate atg aac aac ggc ttc cgt 1152
Vai Phe Asn Leu Leu Gin Ser He Ser He Met Asn Asn Gly Phe Arg
370 375 380
teg ttc act gac aac tgc tta aaa ggc att gaa gcc aac gaa aag cgt 1200
Ser Phe Thr Asp Asn Cys Leu Lys Gly He Glu Ala Asn Glu Lys Arg
385 390 395 400
atg aag caa tac gta gaa aaa age gca ggc gtg ate aca get gtc aat 1248
Met Lys Gin Tyr Vai Glu Lys Ser Ala Gly Vai He Thr Ala Vai Asn
405 410 415
ccg cat ett ggg tat gaa gcg gca get aga att gcc agg gaa gca att 1296
Pro His Leu Gly Tyr Glu Ala Ala Ala Arg He Ala Arg Glu Ala He
420 425 430
atg aca ggg caa tet gtc egg gat ctt tgt ctg cag cat gat gtg ctg 1344
Met Thr Gly Gin Ser Vai Arg Asp Leu Cys Leu Gin His Asp Vai Leu
435 440 445
act gaa gaa gaa ttg gat att att tta aac cca tat gag atg acc aaa 1392
Thr Glu Glu Glu Leu Asp He He Leu Asn Pro Tyr Glu Met Thr Lys
450 455 460
cca ggt ate gca ggg aaa gaa eta tta gaa aaa taa 1428
Pro Gly He Ala Gly Lys Glu Leu Leu Glu Lys
465 470 475
<210> 67 <211> 475 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 67
Met 1 Leu Asn Gly Gin 5 Lys Glu Tyr Arg Vai 10 Glu Lys Asp Phe Leu 15 Gly
Glu Lys Gin He 20 Glu Ala Asp Vai Tyr 25 Tyr Gly He Gin Thr 30 Leu Arg
Ala Ser Glu 35 Asn Phe Pro He Thr 40 Gly Tyr Lys He His 45 Glu Glu Met
He Asn 50 Ala Leu Ala He Vai 55 Lys Lys Ala Ala Ala 60 Leu Ala Asn Met
74.365/BE
253
Asp Vai Lys Arg Leu Tyr 65 70
Ala Asp Glu He Leu Glu 85
Pro He Gin Gly Gly Ala 100
Vai He Gly Asn Arg Ala 115
Tyr He His Leu Ser Pro 130
Asn Asp Vai Phe Pro Thr 145 150
Glu Lys Leu Leu Lys Thr 165
Lys Ala Gin Glu Phe His 180
Gin Asp Ala Vai Pro lie 195
Arg Vai Leu Glu Arg Asp 210
Leu Tyr Glu Vai Asn Met 225 230
Ala Asp Pro Glu Tyr lie 245
Ser Gly Leu Pro Leu Vai 260
Asn Thr Asp Ala Tyr Thr 275
Met Asn Met Ser Lys lie 290
Pro Arg Ala Gly Leu Ala
305 310
Ser Ser lie Met Pro Gly 325
Asn Gin lie Ala Phe Gin 340
Glu Gly He Gly Gin 75
Gly Lys Trp His Asp 90
Gly Thr Ser Met Asn 105
Leu Glu lie Met Gly 120
Asn Thr His Vai Asn 135
Ala lie His He Ser 155
Met Glu Asp Met His 170
Ser Vai lie Lys Met 185
Arg Leu Gly Gin Glu 200
He Lys Arg He Lys 215
Gly Ala Thr Ala Vai 235
Lys Gin Vai Vai Lys 250
Gly Ala Asp His Leu 265
Glu Vai Ser Ala Ser 280
Ala Asn Asp Leu Arg 295
Glu lie Ser Leu Pro 315
Lys Vai Asn Pro Vai 330
Vai lie Gly Asn Asp 345
Ala lie Vai Gin Ala 80
Gin Phe Tie Vai Asp 95
Met Asn Ala Asn Glu 110
His Lys Lys Gly Asp 125
Met Ser Gin Ser Gin 140
Thr Leu Lys Leu Leu 160
Ser Vai Phe Lys Gin 175
Gly Arg Thr His Leu 190
Phe Glu Ala Tyr Ser 205
Gin Ser Arg Gin His 220
Gly Thr Gly Leu Asn 240
His Leu Ala Asp lie 255
Vai Asp Ala Thr Gin 270
Leu Lys Vai Cys Met 285
Leu Met Ala Ser Gly 300
Ala Arg Gin Pro Gly 320
Met Ala Glu Leu lie 335
Asn Thr lie Cys Leu 350
74.365/BE
254
Ala Ser Glu Ala Gly Gin Leu Glu Leu Asn Vai Met Glu Pro Vai 355 360365
Vai Phe Asn Leu Leu Gin Ser He Ser lie Met Asn Asn Gly Phe 370 375380
Ser Phe Thr Asp Asn Cys Leu Lys Gly lie Glu Ala Asn Glu Lys 385 390395
Met Lys Gin Tyr Vai Glu Lys Ser Ala Gly Vai lie Thr Ala Vai 405 410415
Pro His Leu Gly Tyr Glu Ala Ala Ala Arg lie Ala Arg Glu Ala 420 425430
Met Thr Gly Gin Ser Vai Arg Asp Leu Cys Leu Gin His Asp Vai 435 440445
Thr Glu Glu Glu Leu Asp Tie He Leu Asn Pro Tyr Glu Met Thr 450 455460
Pro Gly lie Ala Gly Lys Glu Leu Leu Glu Lys
465 470475
Leu
Arg
Arg 400
Asn
He
Leu
Lys
<210> 68 <211> 768 <212> DNA <213> Bacillus subtilis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(765)
<400> 68
atg aaa cga gaa age aac att caa gtg etc age cgt ggt caa aaa gat
Met Lys Arg Glu Ser Asn He Gin Vai Leu Ser Arg Gly Gin Lys Asp
15 10 15
cag cct gtg age cag att tat caa gta tea aca atg act tet eta tta
Gin Pro Vai Ser Gin lie Tyr Gin Vai Ser Thr Met Thr Ser Leu Leu
20 25 30
gac gga gta tat gac gga gat ttt gaa ctg tea gag att ccg aaa tat
Asp Gly Vai Tyr Asp Gly Asp Phe Glu Leu Ser Glu lie Pro Lys Tyr
35 40 45
gga gac ttc ggt ate gga acc ttt aac aag ett gac gga gag ctg att
Gly Asp Phe Gly He Gly Thr Phe Asn Lys Leu Asp Gly Glu Leu He
50 55 60
ggg ttt gac ggc gaa ttt tac cgt ett ege tea gac gga acc gcg aca
Gly Phe Asp Gly Glu Phe Tyr Arg Leu Arg Ser Asp Gly Thr Ala Thr
65 70 75 80
144
192
240
74.365/BE
255
ccg gtc caa aat gga gac cgt tea ccg ttc tgt tea ttt acg ttc Phe 95 ttt Phe 288
Pro Vai Gin Asn Gly 85 Asp Arg Ser Pro Phe 90 Cys Ser Phe Thr
aca ccg gac atg acg cac aaa att gat geg aaa atg aca ege gaa gac 336
Thr Pro Asp Met 100 Thr His Lys He Asp 105 Ala Lys Met Thr Arg 110 Glu Asp
ttt gaa aaa gag ate aac age atg ctg cca age aga aac tta ttt tat 384
Phe Glu Lys 115 Glu He Asn Ser Met 120 Leu Pro Ser Arg Asn 125 Leu Phe Tyr
gca att ege att gac gga ttg ttt aaa aag gtg cag aca aga aca gta 432
Ala He 130 Arg He Asp Gly Leu 135 Phe Lys Lys Val Gin 140 Thr Arg Thr Val
gaa ett caa gaa aaa cet tac gtg cca atg gtt gaa geg gtc aaa aca 480
Glu 145 Leu Gin Glu Lys Pro 150 Tyr Val Pro Met Val 155 Glu Ala Val Lys Thr 160
cag ccg att ttc aac ttc gac aac gtg aga gga acg att gta ggt ttc 528
Gin Pro He Phe Asn 165 Phe Asp Asn Val Arg 170 Gly Thr He Val Gly 175 Phe
ttg aca cca get tat gca aac gga ate gee gtt tet ggc tat cac ctg 576
Leu Thr Pro Ala 180 Tyr Ala Asn Gly He 185 Ala Val Ser Gly Tyr 190 His Leu
cac ttc att gac gaa gga ege aat tea ggc gga cac gtt ttt gac tat 624
His Phe He 195 Asp Glu Gly Arg Asn 200 Ser Gly Gly His Val 205 Phe Asp Tyr
gtg ett gag gat tgc acg gtt acg att tet caa aaa atg aac atg aat 672
Vai Leu 210 Glu Asp Cys Thr Vai 215 Thr lie Ser Gin Lys 220 Met Asn Met Asn
etc aga ett ccg aac aca geg gat ttc ttt aat geg aat ctg gat aac 720
Leu 225 Arg Leu Pro Asn Thr 230 Ala Asp Phe Phe Asn 235 Ala Asn Leu Asp Asn 240
cet Pro gat Asp ttt Phe geg Ala aaa Lys 245 gat Asp ate He gaa Glu aca Thr act Thr 250 gaa Glu gga Gly age Ser cct Pro gaa Glu 255 taa 768
<210> 69 <211> 255 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 69
Met Lys Arg Glu Ser Asn He Gin Vai Leu Ser Arg Gly Gin Lys Asp 1 5 10 15
74.365/BE
256
Gin Pro Val Ser Gin He Tyr Gin Val Ser Thr Met Thr Ser Len Len 20 2530
Asp Gly Val Tyr Asp Gly Asp Phe Glu Leu Ser Glu He Pro Lys Tyr 35 4045
Gly Asp Phe Gly He Gly Thr Phe Asn Lys Leu Asp Gly Glu Leu He 50 5560
Gly 65 Phe Asp Gly Glu Phe 70 Tyr Arg Leu Arg Ser 75 Asp Gly Thr Alá Thr 80
Pro Val Gin Asn Gly Asp Arg Ser Pro Phe Cys Ser Phe Thr Phe Phe
85 90 95
Thr Pro Asp Met Thr His Lys He Asp Alá Lys Met Thr Arg Glu Asp
100 105 110
Phe Glu Lys 115 Glu He Asn Ser Met 120 Leu Pro Ser Arg Asn 125 Leu Phe Tyr
Alá He Arg He Asp Gly Leu Phe Lys Lys Val Gin Thr Arg Thr Val
130 135 140
Glu Leu Gin Glu Lys Pro Tyr Val Pro Met Val Glu Alá Val Lys Thr
145 150 155 160
Gin Pro He Phe Asn Phe Asp Asn Val Arg Gly Thr He Val Gly Phe
165 170175
Leu Thr Pro Alá 180 Tyr Alá Asn Gly He 185 Alá Val Ser Gly Tyr 190 His Leu
His Phe He Asp Glu Gly Arg Asn Ser Gly Gly His Val Phe Asp Tyr
195 200 205
Val Leu Glu Asp Cys Thr Val Thr He Ser Gin Lys Met Asn Met Asn
210 215 220
Leu Arg Leu Pro Asn Thr Ala Asp Phe Phe Asn Alá Asn Leu Asp Asn 225 230 235240
Pro Asp Phe Alá Lys Asp He Glu Thr Thr Glu Gly Ser Pro Glu 245 250255 <210> 70 <211> 1254 < 212> DNA < 213> Escherichia coli <220>
< 221> CDS < 222> (1)..(1251)
74.365/BE
257 <400> 70 atg aca ttc tcc ett ttt ggt gac aaa ttt acc ege cac tee ggc att48
Met Thr Phe Ser Leu Phe Gly Asp Lys Phe Thr Arg His Ser GlyHe
1015 acg ctg ttg atg gaa gat ctg aac gac ggt tta ege acg cct ggc geg96
Thr Leu Leu Met Glu Asp Leu Asn Asp Gly Leu Arg Thr Pro GlyAla
2530 att atg etc ggc ggc ggt aat ccg geg cag ate ccg gaa atg cag gac144
He Met Leu Gly Gly Gly Asn Pro Ala Gin He Pro Glu Met GinAsp
4045 tac ttc cag acg eta ctg acc gac atg ctg gaa agt ggc aaa geg act192
Tyr Phe Gin Thr Leu Leu Thr Asp Met Leu Glu Ser Gly Lys AlaThr
5560 gat gca ctg tgt aac tac gac ggt cca cag ggg aaa acg gag eta etc240
Asp Ala Leu Cys Asn Tyr Asp Gly Pro Gin Gly Lys Thr Glu LeuLeu
70 7580 aca ctg ett gee gga atg ctg ege gag aag ttg ggt tgg gat ate gaa288
Thr Leu Leu Ala Gly Met Leu Arg Glu Lys Leu Gly Trp Asp HeGlu
9095 cca cag aat att gca eta aca aac ggc age cag age geg ttt ttc tac336
Pro Gin Asn He Ala Leu Thr Asn Gly Ser Gin Ser Ala Phe PheTyr
100 105110 tta ttt aac ctg ttt gee gga ege cgt gee gat ggt egg gtc aaa aaa384
Leu Phe Asn Leu Phe Ala Gly Arg Arg Ala Asp Gly Arg Vai LysLys
115 120125 gtg ctg ttc ccg ett gca ccg gaa tac att ggc tat get gac gee gga432
Vai Leu Phe Pro Leu Ala Pro Glu Tyr He Gly Tyr Ala Asp AlaGly
130 135140 ctg gaa gaa gat ctg ttt gtc tet geg cgt ccg aat att gaa ctg ctg480
Leu Glu Glu Asp Leu Phe Vai Ser Ala Arg Pro Asn He Glu LeuLeu
145 150 155ιθο ccg gaa ggc cag ttt aaa tac cac gtc gat ttt gag cat ctg cat att528
Pro Glu Gly Gin Phe Lys Tyr His Vai Asp Phe Glu His Leu HisHe
165 170175 ggc gaa gaa acc ggg atg att tgc gtc tec egg ccg acg aat cca aca576
Gly Glu Glu Thr Gly Met He Cys Vai Ser Arg Pro Thr Asn ProThr
180 185190 ggc aat gtg att act gac gaa gag ttg ctg aag ett gac geg ctg ggc624
Gly Asn Vai lie Thr Asp Glu Glu Leu Leu Lys Leu Asp Ala LeuGly
195 200205
74.365/BE
258
aat caa cac ggc att ccg ctg gtg att gat aac get tat ggc gtc ccg 672
Asn Gin His Gly He Pro Leu Val He Asp Asn Ala Tyr Gly Val Pro
210 215 220
ttc ccg ggt ate ate ttc agt gaa geg ege ccg eta tgg aat ccg aat 720
Phe Pro Gly He He Phe Ser Glu Ala Arg Pro Leu Trp Asn Pro Asn
225 230 235 240
ate gtg ctg tgc atg agt ett tee aag ctg ggt eta cct ggc tee ege 768
He Vai Leu Cys Met Ser Leu Ser Lys Leu Gly Leu Pro Gly Ser Arg
245 250 255
tgc ggc att ate ate gee aat gaa aaa ate ate ace gee ate ace aat 816
Cys Gly He He He Ala Asn Glu Lys He He Thr Ala He Thr Asn
260 265 270
atg aac ggc att ate age ctg gca cct ggc ggt att ggt ccg geg atg 864
Met Asn Gly He He Ser Leu Ala Pro Gly Gly He Gly Pro Ala Met
275 280 285
atg tgt gaa atg att aag cgt aac gat ctg ctg ege ctg tet gaa aca 912
Met Cys Glu Met He Lys Arg Asn Asp Leu Leu Arg Leu Ser Glu Thr
290 295 300
gtc ate aaa ccg ttt tac tac cag cgt gtt cag gaa act ate gee ate 960
Vai He Lys Pro Phe Tyr Tyr Gin Arg Val Gin Glu Thr He Ala He
305 310 315 320
att ege ege tat tta ccg gaa aat ege tgc ctg att cat aaa ccg gaa 1008
He Arg Arg Tyr Leu Pro Glu Asn Arg Cys Leu He His Lys Pro Glu
325 330 335
gga gee att ttc etc tgg eta tgg ttt aag gat ttg ccc att acg ace 1056
Gly Ala He Phe Leu Trp Leu Trp Phe Lys Asp Leu Pro He Thr Thr
340 345 350
aag cag etc tat cag ege ctg aaa gca ege ggc gtg ctg atg gtg ccg 1104
Lys Gin Leu Tyr Gin Arg Leu Lys Ala Arg Gly Val Leu Met Val Pro
355 360 365
ggg cac aac ttc ttc cca ggg ctg gat aaa ccg tgg ccg cat acg cat 1152
Gly His Asn Phe Phe Pro Gly Leu Asp Lys Pro Trp Pro His Thr His
370 375 380
caa tgt atg ege atg aac tac gta cca gag ccg gag aaa att gag geg 1200
Gin Cys Met Arg Met Asn Tyr Val Pro Glu Pro Glu Lys lie Glu Ala
385 390 395 400
ggg gtg aag att ctg geg gaa gag ata gaa aga gee tgg get gaa agt 1248
Gly Val Lys He Leu Ala Glu Glu He Glu Arg Ala Trp Ala Glu Ser
405 410 415
cac taa 1254
His
74.365/BE
259 <210> 71 <211> 417 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 71
Met 1 Thr Phe Ser Leu 5 Phe Gly Asp Lys Phe 10 Thr Arg His Ser Gly 15 He
Thr Leu Leu Met 20 Glu Asp Leu Asn Asp 25 Gly Leu Arg Thr Pro 30 Gly Ala
He Met Leu 35 Gly Gly Gly Asn Pro 40 Ala Gin He Pro Glu 45 Met Gin Asp
Tyr Phe 50 Gin Thr Leu Leu Thr 55 Asp Met Leu Glu Ser 60 Gly Lys Ala Thr
Asp 65 Ala Leu Cys Asn Tyr 70 Asp Gly Pro Gin Gly 75 Lys Thr Glu Leu Leu 80
Thr Leu Leu Ala Gly 85 Met Leu Arg Glu Lys 90 Leu Gly Trp Asp He 95 Glu
Pro Gin Asn lie 100 Ala Leu Thr Asn Gly 105 Ser Gin Ser Ala Phe 110 Phe Tyr
Leu Phe Asn 115 Leu Phe Ala Gly Arg 120 Arg Ala Asp Gly Arg 125 Val Lys Lys
Val Leu 130 Phe Pro Leu Ala Pro 135 Glu Tyr He Gly Tyr 140 Ala Asp Ala Gly
Leu 145 Glu Glu Asp Leu Phe 150 Val Ser Ala Arg Pro 155 Asn He Glu Leu Leu 160
Pro Glu Gly Gin Phe Lys Tyr His Val Asp Phe Glu His Leu His He
165 170 175
Gly Glu Glu Thr Gly Met He Cys Val Ser Arg Pro Thr Asn Pro Thr 180 185 190
Gly Asn Val lie Thr Asp Glu Glu Leu Leu Lys Leu Asp Ala Leu Gly 195 200 205
Asn Gin 210 His Gly He Pro Leu 215 Val He Asp Asn Ala 220 Tyr Gly Val Pro
Phe Pro Gly He He Phe Ser Glu Ala Arg Pro Leu Trp Asn Pro Asn
225 230 235 240
He Val Leu Cys Met Ser Leu Ser Lys Leu Gly Leu Pro Gly Ser Arg
245 250 255
74.365/BE
-* 260 • · • • · · • · •
Cys Gly He He 260 He Ala Asn Glu Lys 265 He He Thr Ala He 270 Thr Asn
Met Asn Gly 275 He He Ser Leu Ala 280 Pro Gly Gly He Gly 285 Pro Ala Met
Met Cys 290 Glu Met He Lys Arg 295 Asn Asp Leu Leu Arg 300 Leu Ser Glu Thr
Vai 305 He Lys Pro Phe Tyr 310 Tyr Gin Arg Vai Gin 315 Glu Thr lie Ala He 320
He Arg Arg Tyr Leu 325 Pro Glu Asn Arg Cys 330 Leu He His Lys Pro 335 Glu
Gly Ala He Phe 340 Leu Trp Leu Trp Phe 345 Lys Asp Leu Pro He 350 Thr Thr
Lys Gin Leu 355 Tyr Gin Arg Leu Lys 360 Ala Arg Gly Vai Leu 365 Met Vai Pro
Gly His 370 Asn Phe Phe Pro Gly 375 Leu Asp Lys Pro Trp 380 Pro His Thr His
Gin 385 Cys Met Arg Met Asn 390 Tyr Vai Pro Glu Pro 395 Glu Lys lie Glu Ala 400
Gly Vai Lys He Leu 405 Ala Glu Glu He Glu 410 Arg Ala Trp Ala Glu 415 Ser
His <210> 72 <211> 8803 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Description of Artificial Sequence: Recombinant pAN294 plasmid < 400> 72 tgcgccgcta cagggcgcgt ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga60 tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga120 ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa180 ttgtaatacg actcactata gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgctgg atgaaaagcc240 gatgaccgct tttcaggtct gtcagcagct ttttcctgct gtatatgaaa aggaattgtt300 tttaacgatg tcagaaacgg caggtcacct tgatgtgttg gaggctgaag aagccatcac360
74.365/BE
261 gtcatattgg catatagcgg gcatacttat ttgatagaaa ctggatgtcg gtactgatta gacatgaaag cttccgcaaa aaaatcgcca tcaaacgctt ggcccgattc gtcggccgct acgaaaaagc ctgtttccag aactgcctgt gattgttgaa cagaaactga ttaccccgtg tttgcacctt tctccgcttt tttcccggaa gcgaggggcg atgcttcagg tcccgctatt ggcgcggcac aaggatctcc gcggtgaacg gaaggaaata gaaaaaggat gcgcggctga tcaaaaggaa gccgcctaga acaatgcagg cgatgtttga tgcttgagca caccgaagtc tgcggatgga agacggactt ggatgcttga gggagatcaa ctcttgtaga ggtggagtgg tgtcagttca ttgatgcaga cagatgagtg acattgccga ttgaggtgca gatggctttt ggatttatga aaaccgatga cgattgctgt tcgggtttcg tccgccaaaa aagggagacg ccgtatactt taaaacaatg aagaggtgaa atgggtgaaa 420 ttggataacc ggcgcttcag gagggcttgg agaaagaatc 480 aggagcccat gtcctgctgt cggctagacg cgaggatcgt 540 aataaccgag gaatggagcg gacagtgtga gatttttcct 600 ggatatcgcc cgggtccgcg atcagatcgg ctcgattgat 660 cttcggtata tttgaaacgg ttttagactc tacattggat 720 tgtgaatgtc ttcggcctga tcgcctgtac aaaagcggtg 780 aaaaaaggga catatcatca atatcgcctc tcaagcgggg 840 tagcctgtat tccgcgacca aacatgccgt gttaggttac 900 gctttcggga accggcattt atgtgacaac agtcaacccg 960 tttttccatt gctgataaag gcggggacta cgccaaaaat 1020 tcctgatgac gtggcagctc aaattacagc tgcaattttt 1080 tcttccgcgt ttaatgaatg ccggcactaa gctgtatcag 1140 aaagctggca ggacgcgcgc tcatgaaaaa ataatgatag 1200 cttgtttctc acggggcagt ttttgatagt ggaagggaga 1260 ttcagaagtc cttcatgctc tgcttaaaga tccgtttatt 1320 gcctgtattc tgggcaaatt caggcaagaa agaggggcca 1380 ggcaaccgag atagcggaag cggaaaaaag aatgcagcgg 1440 ggtgtttcct gagacgaaag gcgctaaagg aatcatcgag 1500 gcatatgaag ggaaagctgg aagcggcata tcagcagcca 1560 aaagtgcgac catgagcttc cgatttcagg atcgattaaa 1620 agtgttaaag tatgctgaaa atctcgcgct tcaagaagga 1680 ttaccgcatc ttacaggaag agcggtttac cgggtttttc 1740 cggttcgaca ggaaatctag gtttaagcat cggcatcatc 1800 cgtgacagtg catatgtccg ccgatgctaa gcagtggaaa 1860 gggagtcact gttatggagt acgaaacaga ttacagtgaa 1920 gcaggcggaa caagatccat tctgttattt tattgatgat 1980
74.365/BE
262 gaacattctc gtcagctgtt cttaggatat gctgttgctg caagccgatt aaaaacacag 2040 cttgactgta tgaatataaa gccaagtctt gagacgccct tgtttgtgta tctgccgtgc 2100 ggagtcggcg gaggaccggg cggtgtagca tttgggctga agcttttata cggagatgat 2160 gttcatgtgt ttttcgcaga accaactcat tcaccttgta tgctgttagg gctttattca 2220 ggacttcacg agaagatctc cgtccaggat atcggcctgg ataatcagac ggctgctgac 2280 ggacttgccg tagggaggcc gtcaggattt gtcggcaagc tgattgaacc gcttctgagc 2340 ggctgttata cggtagagga caatacgctt tatactttgc ttcatatgct ggctgtatct 2400 gaagataaat atttagagcc ctctgctctt gctggcatgt tcgggccggt tcagcttttt 2460 tcgacagaag agggaaggcg ctatgctcag aaatataaga tggaacatgc cgtacatgtc 2520 gtctggggaa cgggaggaag catggttcca aaagatgaaa tggctgcgta taaccgaatc 2580 ggtgctgatt tgctaaaaaa acgaaatgga aaataagcag acagtgaaaa ggttttccgt 2640 tacaatcttt gtaagggttt taacctacag agagtcaggt gtaaacagtg aaaaataaag 2700 aacttaacct acatacttta tatacacagc acaatcggga gtcttggtct ggttttgggg 2760 ggcatttgtc gattgctgta tctgaagaag aggcaaaagc tgtggaagga ttgaatgatt 2820 atctatctgt tgaagaagtg gagacgatct atattccgct tgttcgcttg cttcatttac 2880 atgtcaagtc tgcggctgaa cgcaataagc atgtcaatgt ttttttgaag cacccacatt 2940 cagccaaaat tccgtttatt atcggcattg ccggcagtgt cgcagtcgga aaaagcacga 3000 cggcgcggat cttgcagaag ctgctttcgc gtttgcctga ccgtccaaaa gtgagcctta 3060 tcacgacaga tggtttttta tttcctactg ccgagctgaa aaagaaaaat atgatgtcaa 3120 gaaaaggatt tcctgaaagc tatgatgtaa aggcgctgct cgaatttttg aatgacttaa 3180 aatcaggaaa ggacagcgta aaggccccgg tgtattccca tctaacctat gaccgcgagg 3240 aaggtgtgtt cgaggttgta gaacaggcgg atattgtgat tattgaaggc attaatgttc 3300 ttcagtcgcc caccttggag gatgaccggg aaaacccgcg tatttttgtt tccgatttct 3360 ttgatttttc gatttatgtg gatgcggagg aaagccggat tttcacttgg tatttagagc 3420 gttttcgcct gcttcgggaa acagcttttc aaaatcctga ttcatatttt cataaattta 3480 aagacttgtc cgatcaggag gctgacgaga tggcagcctc gatttgggag agtgtcaacc 3540 ggccgaattt atatgaaaat attttgccaa ctaaattcag gtcagatctc attttgcgta 3600
74.365/BE
263 agggagacgg gcataaggtc gaggaagtgt tggtaaggag ggtatgaaat gtgctgcagc 3660 tcgagcaata gttaccctta ttatcaagat aagaaagaaa aggatttttc gctacgctca 3720 aatcctttaa aaaaacacaa aagaccacat tttttaatgt ggtctttatt cttcaactaa 3780 agcacccatt agttcaacaa acgaaaattg gataaagtgg gatattttta aaatatatat 3840 ttatgttaca gtaatattga cttttaaaaa aggattgatt ctaatgaaga aagcagacaa 3900 gtaagcctcc taaattcact ttagataaaa atttaggagg catatcaaat gaactttaat 3960 aaaattgatt tagacaattg gaagagaaaa gagatattta atcattattt gaaccaacaa 4020 acgactttta gtataaccac agaaattgat attagtgttt tataccgaaa cataaaacaa 4080 gaaggatata aattttaccc tgcatttatt ttcttagtga caagggtgat aaactcaaat 4140 acagctttta gaactggtta caatagcgac ggagagttag gttattggga taagttagag 4200 ccactttata caatttttga tggtgtatct aaaacattct ctggtatttg gactcctgta 4260 aagaatgact tcaaagagtt ttatgattta tacctttctg atgtagagaa atataatggt 4320 tcggggaaat tgtttcccaa aacacctata cctgaaaatg ctttttctct ttctattatt 4380 ccatggactt catttactgg gtttaactta aatatcaata ataatagtaa ttaccttcta 4440 cccattatta cagcaggaaa attcattaat aaaggtaatt caatatattt accgctatct 4500 ttacaggtac atcattctgt ttgtgatggt tatcatgcag gattgtttat gaactctatt 4560 caggaattgt cagataggcc taatgactgg cttttataat atgagataat gccgactgta 4620 ctttttacag tcggttttct aatgtcacta acctgccccg ttagttgaag aaggttttta 4680 tattacagct gtcgactcgt gatcttcgga caggctgttc agctttttct caatgcgatc 4740 cagctgcgct tttcggtttt tcgcatactt gaagcctgta acagccgcaa agacgacagc 4800 ggcaaatata ataaatacaa acagctgaaa catcacatca cctatattca tgttcttcac 4860 ctcatgtttg cgggagagat tcattctctt ccgtttttta tttaaagcgg cttttccaga 4920 cgggaacggt gttttgtggt ctccattttc atttgccgat aggcgaacgc taaaaatggc 4980 aggccgagca gggtaatgcc gctcaggaca gaaaaaatat aaatcggccg gccagcgcca 5040 aacaggtcta tacatatccc cccgacccaa gggccgatga cgtttccgag ctgtggaaaa 5100 ccgattgccc cgaaataagt gccttttaat cctggttttg caatctggtc tacatacaaa 5160 tccatcatag agaataaaag cacttcgccg attgtaaatg tgatgacaat catcacaatt 5220
74.365/BE
264 gatggaacac agcatcagag gccaacacaa atcaaggggt gtgcatagcg aacgcttccc ttaaattgga ggcgtagtcg atattaatag tcagacaaca tttactacaa catccgaaaa ccgtaaaagc gaagctgatg gttgccattc gtattctata gaaattgtta cctggggtgc tccagtcggg gcggtttgcg ttcggctgcg caggggataa aaaaggccgc atcgacgctc cccctggaag ccgcctttct gttcggtgta cgtgtgatac ggtgaaaatg gccatgctga tgctaaccat cacattaccg 5280 aacaaagcgg cgaaaaccgt tttgcaaaat ggacaatggg aaattgcgtc 5340 cgattgcgtt taatgtcagc atcagcccat acagcttcgt tccattgccg 5400 tctgcgccat atactgaggg aatgtggaac tgaattgtga gtagccgaag 5460 taatgccgac caaagcaatg gtaaaaagat aatccttttg cgtgaccata 5520 gcacgctcat atttcgggac tgggctggtg ctgataagga tggatgtttt 5580 gggcaagcac aattccgtat agtccgtaaa tgactgcagg caccaaaaag 5640 attgcgatga gccgaaatat aggccaagca caggtccgaa gacaacgccg 5700 ccgcatagcg taaattaaaa actagcagtc tcgttttttc ttctgtcata 5760 aggcctttga agcgggctca aacagtgatt tgcaaagacc gtttaatgcg 5820 aaaacaccca gagattagat gctgccgcaa agcctgcaaa taccagcatc 5880 tcgatacaag catcatgttt tttctgccga atttatctga gatatatccg 5940 ttgcgaggat gccgactgat gagctcgcgg cgatgaccag ccctgcatag 6000 cgccttggac ggctgtcaaa taaatcgcta aaaaaggaat gctcatcgat 6060 tgccgaaaat ggttccgatt ataattgtac gcgttggatg catagcttga 6120 gtgtcaccta aatagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt 6180 tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag 6240 ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 6300 aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 6360 tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 6420 gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 6480 cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 6540 gttgctggcg tttttcgata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 6600 aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 6660 ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 6720 cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 6780 ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 6840
74.365/BE
265 accgctgcgc .cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 6900 cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 6960 cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 7020 gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 7080 aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 7140 aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 7200 actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 7260 taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 7320 gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 7380 tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 7440 ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 7500 accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 7560 agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 7620 acgttgttgg cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 7680 tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 7740 cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 7800 tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 7860 ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata ccgcgcccgg cgaccgagtt 7920 gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata gtgtatgaca tagcagaact ttaaaagtgc 7980 tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 8040 ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 8100 gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 8160 cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 8220 gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 8280 ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgtatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg 8340 cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgaaa ttgtaaacgt taatattttg ttaaaattcg 8400 cgttaaatat ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc 8460
74.365/BE
266 cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga 8520 gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg 8580 atggcccact acgtgaacca tcacccaaat caagtttttt gcggtcgagg tgccgtaaag 8640 ctctaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga 8700 acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg 8760 tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taa 8803 <210> 73 <211> 8320 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Description of Artificial Sequence: Recombinant pAN296 plasmid < 400> 73 tgcgccgcta cagggcgcgt ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga60 tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga120 ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa180 ttgtaatacg actcactata gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgctgg atgaaaagcc240 gatgaccgct tttcaggtct gtcagcagct ttttcctgct gtatatgaaa aggaattgtt300 tttaacgatg tcagaaacgg caggtcacct tgatgtgttg gaggctgaag aagccatcac360 gtcatattgg gaaggaaata ccgtatactt taaaacaatg aagaggtgaa atgggtgaaa420 catatagcgg gaaaaaggat ttggataacc ggcgcttcag gagggcttgg agaaagaatc480 gcatacttat gcgcggctga aggagcccat gtcctgctgt cggctagacg cgaggatcgt540 ttgatagaaa tcaaaaggaa aataaccgag gaatggagcg gacagtgtga gatttttcct600 ctggatgtcg gccgcctaga ggatatcgcc cgggtccgcg atcagatcgg ctcgattgat660 gtactgatta acaatgcagg cttcggtata tttgaaacgg ttttagactc tacattggat720 gacatgaaag cgatgtttga tgtgaatgtc ttcggcctga tcgcctgtac aaaagcggtg780 cttccgcaaa tgcttgagca aaaaaaggga catatcatca atatcgcctc tcaagcgggg840 aaaatcgcca caccgaagtc tagcctgtat tccgcgacca aacatgccgt gttaggttac900 tcaaacgctt tgcggatgga gctttcggga accggcattt atgtgacaac agtcaacccg960
74.365/BE
267 ggcccgattc agacggactt tttttccatt gctgataaag gcggggacta cgccaaaaat 1020 gtcggccgct ggatgcttga tcctgatgac gtggcagctc aaattacagc tgcaattttt 1080 acgaaaaagc gggagatcaa tcttccgcgt ttaatgaatg ccggcactaa gctgtatcag 1140 ctgtttccag ctcttgtaga aaagctggca ggacgcgcgc tcatgaaaaa ataatgatag 1200 aactgcctgt ggtggagtgg cttgtttctc acggggcagt ttttgatagt ggaagggaga 1260 gattgttgaa tgtcagttca ttcagaagtc cttcatgctc tgcttaaaga tccgtttatt 1320 cagaaactga ttgatgcaga gcctgtattc tgggcaaatt caggcaagaa agaggggcca 1380 ttaccccgtg cagatgagtg ggcaaccgag atagcggaag cggaaaaaag aatgcagcgg 1440 tttgcacctt acattgccga ggtgtttcct gagacgaaag gcgctaaagg aatcatcgag 1500 tctccgcttt ttgaggtgca gcatatgaag ggaaagctgg aagcggcata tcagcagcca 1560 tttcccggaa gatggctttt aaagtgcgac catgagcttc cgatttcagg atcgattaaa 1620 gcgaggggcg ggatttatga agtgttaaag tatgctgaaa atctcgcgct tcaagaagga 1680 atgcttcagg aaaccgatga ttaccgcatc ttacaggaag agcggtttac cgggtttttc 1740 tcccgctatt cgattgctgt cggttcgaca ggaaatctag gtttaagcat cggcatcatc 1800 ggcgcggcac tcgggtttcg cgtgacagtg catatgtccg ccgatgctaa gcagtggaaa 1860 aaggatctcc tccgccaaaa gggagtcact gttatggagt acgaaacaga ttacagtgaa 1920 gcggtgaacg aagggagacg gcaggcggaa caagatccat tctgttattt tattgatgat 1980 gaacattctc gtcagctgtt cttaggatat gctgttgctg caagccgatt aaaaacacag 2040 cttgactgta tgaatataaa gccaagtctt gagacgccct tgtttgtgta tctgccgtgc 2100 ggagtcggcg gaggaccggg cggtgtagca tttgggctga agcttttata cggagatgat 2160 gttcatgtgt ttttcgcaga accaactcat tcaccttgta tgctgttagg gctttattca 2220 ggacttcacg agaagatctc cgtccaggat atcggcctgg ataatcagac ggctgctgac 2280 ggacttgccg tagggaggcc gtcaggattt gtcggcaagc tgattgaacc gcttctgagc 2340 ggctgttata cggtagagga caatacgctt tatactttgc ttcatatgct ggctgtatct 2400 gaagataaat atttagagcc ctctgctctt gctggcatgt tcgggccggt tcagcttttt 2460 tcgacagaag agggaaggcg ctatgctcag aaatataaga tggaacatgc cgtacatgtc 2520 gtctggggaa cgggaggaag catggttcca aaagatgaaa tggctgcgta taaccgaatc 2580
74.365/BE ♦ · · « . · ·
268 .* :.:.
• · · · · · · ggtgctgatt tgctaaaaaa acgaaatgga aaataagcag acagtgaaaa ggttttccgt 2640 tacaatcttt gtaagggttt taacctacag agagtcaggt gtaaacagtg aaaaataaag 2700 aacttaacct acatacttta tatacacagc acaatcggga gtcttctgca gctcgagcaa 2760 tagttaccct tattatcaag ataagaaaga aaaggatttt tcgctacgct caaatccttt 2820 aaaaaaacac aaaagaccac attttttaat gtggtcttta ttcttcaact aaagcaccca 2880 ttagttcaac aaacgaaaat tggataaagt gggatatttt taaaatatat atttatgtta 2940 cagtaatatt gacttttaaa aaaggattga ttctaatgaa gaaagcagac aagtaagcct 3000 cctaaattca ctttagataa aaatttagga ggcatatcaa atgaacttta ataaaattga 3060 tttagacaat tggaagagaa aagagatatt taatcattat ttgaaccaac aaacgacttt 3120 tagtataacc acagaaattg atattagtgt tttataccga aacataaaac aagaaggata 3180 taaattttac cctgcattta ttttcttagt gacaagggtg ataaactcaa atacagcttt 3240 tagaactggt tacaatagcg acggagagtt aggttattgg gataagttag agccacttta 3300 tacaattttt gatggtgtat ctaaaacatt ctctggtatt tggactcctg taaagaatga 3360 cttcaaagag ttttatgatt tatacctttc tgatgtagag aaatataatg gttcggggaa 3420 attgtttccc aaaacaccta tacctgaaaa tgctttttct ctttctatta ttccatggac 3480 ttcatttact gggtttaact taaatatcaa taataatagt aattaccttc tacccattat 3540 tacagcagga aaattcatta ataaaggtaa ttcaatatat ttaccgctat ctttacaggt 3600 acatcattct gtttgtgatg gttatcatgc aggattgttt atgaactcta ttcaggaatt 3660 gtcagatagg cctaatgact ggcttttata atatgagata atgccgactg tactttttac 3720 agtcggtttt ctaatgtcac taacctgccc cgttagttga agaaggtttt tatattacag 3780 ctgtcgacta aggtcgagga agtgttggta aggagggtat gaaatgtgca tcatattgaa 3840 ctgtatgtct ctgatttgga ggcgtctagg cggttttggg gctggttctt aaaagaactt 3900 ggttataaag agtatcaaaa atggagctca ggcatcagct ggaagaaaga tcgtttttac 3960 ctagtgattg tgcaggcgaa agagccattt ctagagccgg aataccatag atgccgagtc 4020 ggtctgaacc atctcgcatt tcatgctgaa tccaagcttc aagtcgatca gatgactgaa 4080 aaattgacgg caaaaggcta tcgtgtgttg taccgagaca ggcatccttt tgccggagga 4140 gacgggcatt atgcagtctt ttgtgaggat ccagaccgga ttaaggtaga gctcgttgcc 4200
74.365/BE
269
ccaagctgtt aatcgtgatc ttcggacagg ctgttcagct ttttctcaat gcgatccagc 4260 tgcgcttttc ggtttttcgc atacttgaag cctgtaacag ccgcaaagac gacagcggca 4320 aatataataa atacaaacag ctgaaacatc acatcaccta tattcatgtt cttcacctca 4380 tgtttgcggg agagattcat tctcttccgt tttttattta aagcggcttt tccagacggg 4440 aacggtgttt tgtggtctcc attttcattt gccgataggc gaacgctaaa aatggcaggc 4500 cgagcagggt aatgccgctc aggacagaaa aaatataaat cggccggcca gcgccaaaca 4560 ggtctataca tatccccccg acccaagggc cgatgacgtt tccgagctgt ggaaaaccga 4620 ttgccccgaa ataagtgcct tttaatcctg gttttgcaat ctggtctaca tacaaatcca 4680 tcatagagaa taaaagcact tcgccgattg taaatgtgat gacaatcatc acaattgatg 4740 gaacaccgtg tgatacggtg aaaatggcca tgctgatgct aaccatcaca ttaccgagca 4800 tcagagaaca aagcggcgaa aaccgttttg caaaatggac aatgggaaat tgcgtcgcca 4860 acacaacgat tgcgtttaat gtcagcatca gcccatacag cttcgttcca ttgccgatca 4920 aggggttctg cgccatatac tgagggaatg tggaactgaa ttgtgagtag ccgaaggtgc 4980 atagcgtaat gccgaccaaa gcaatggtaa aaagataatc cttttgcgtg accataaacg 5040 cttcccgcac gctcatattt cgggactggg ctggtgctga taaggatgga tgttttttaa 5100 attggagggc aagcacaatt ccgtatagtc cgtaaatgac tgcaggcacc aaaaagggcg 5160 tagtcgattg cgatgagccg aaatataggc caagcacagg tccgaagaca acgccgatat 5220 taatagccgc atagcgtaaa ttaaaaacta gcagtctcgt tttttcttct gtcatatcag 5280 acaacaaggc ctttgaagcg ggctcaaaca gtgatttgca aagaccgttt aatgcgttta 5340 ctacaaaaaa cacccagaga ttagatgctg ccgcaaagcc tgcaaatacc agcatccatc 5400 cgaaaatcga tacaagcatc atgttttttc tgccgaattt atctgagata tatccgccgt 5460 aaaagcttgc gaggatgccg actgatgagc tcgcggcgat gaccagccct gcataggaag 5520 ctgatgcgcc ttggacggct gtcaaataaa tcgctaaaaa aggaatgctc atcgatgttg 5580 ccattctgcc gaaaatggtt ccgattataa ttgtaacgcg ttggatgcat agcttgagta 5640 ttctatagtg tcacctaaat agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa 5700 attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct 5760 ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc 5820
74.365/BE
270
agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 5880 gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 5940 ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 6000 gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 6060 aggccgcgtt gctggcgttt ttcgataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 6120 gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 6180 ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 6240 cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 6300 cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 6360 gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 6420 cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 6480 agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg 6540 ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 6600 ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 6660 gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 6720 cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 6780 attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 6840 accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 6900 ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 6960 gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 7020 agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 7080 ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 7140 ttgttggcat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 7200 gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 7260 ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 7320 tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 7380 tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaataccg cgcccggcga ccgagttgct 7440
74.365/BE
271 cttgcccggc gtcaatacgg gataatagtg tatgacatag cagaacttta aaagtgctca 7500 tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 7560 gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 7620 tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 7680 ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 7740 attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc 7800 cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt 7860 aaggagaaaa taccgcatca ggcgaaattg taaacgttaa tattttgtta aaattcgcgt 7920 taaatatttg ttaaatcagc tcatttttta accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt 7980 ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc 8040 cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg 8100 gcccactacg tgaaccatca cccaaatcaa gttttttgcg gtcgaggtgc cgtaaagctc 8160 taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg 8220 tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag 8280 cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg ccgcgcttaa 8320 <210> 74 <211> 250 <212> PRT <213> Clostridium acetobutylicum <400> 74
Asn Lys Arg Ala 1
Lys Val He Leu 20 lie Tyr Asn Asp 35
Val Leu Arg Ser 50
Gin Gin Asp Lys 65
Ser Val Val Pro
Ala Phe Met Leu 5
Val Leu Asp Val
Thr Lys Leu Thr 40
Ala Asp Glu Tyr 55
Leu Asp Pro Thr 70
Asn lie Met Tyr 85
Leu Leu Phe Leu 10
Gly Asn Thr Asn 25
Ala Glu Trp Arg
Gly lie Gin Val 60
Leu Val Glu Gly 75
Ser Leu Glu His 90
Arg Ser Val Leu 15 lie Val Leu Gly 30
Leu Ser Thr Asp 45
Met Asn Leu Phe
Val lie lie Ser 80
Met Ile Arg Lys 95
74.365/BE
272
Tyr Phe Lys He Asn Pro Leu Val Val Gly Pro Gly He Lys Thr Gly
100
105
110
He Asn He Lys Tyr Asp Asn Pro Lys Glu Val Gly Ala Asp Arg He 115 120125
Val Asn Ala Val Ala Ala His Glu He Tyr Lys Arg Ser Leu He He 130 135140 lie Asp Phe Gly Thr Ala Thr Thr Phe Cys Ala Val Arg Glu AsnGly
145 150 155160
Asp Tyr Leu Gly Gly Ala He Cys Pro Gly He Lys Val Ser SerGlu
165 170175
Ala Leu Phe Glu Lys Ala Ala Lys Leu Pro Arg Val Glu Leu He Lys 180 185190
Pro Ala Tyr Ala He Cys Lys Asn Thr He Ser Ser He Gin Ser Gly 195 200205
He Val Tyr Arg Tyr Leu Arg Gin Val Lys Tyr Leu Phe Glu Lys Leu 210 215220
Lys Glu Asn Leu Pro Asp Gly Arg Arg Thr Arg Thr Ser Leu Val Leu 225 230 235240
Ala Thr Gly Gly Leu Ala Lys Leu lie Asn
245
250 <210> 75 <211> 258 <212> PRT <213> Rhodobacter capsulatus <400> 75
Met Leu Leu Cys He Asp Cys Gly Asn Thr Asn Thr Val Phe Ser Val 15 1015
Trp Asp Gly Thr Asp Phe Ala Ala Thr Trp Arg He Ala Thr Asp His 20 2530
Arg Arg Thr Ala Asp Glu Tyr Phe Val Trp Leu Asn Thr Leu Met Gin 35 4045
Leu Lys Gly Leu Gin Gly Arg He Ser Glu Ala He He Ser Ser Thr 50 5560
Ala Pro Arg Val Val Phe Asn Leu Arg Val Leu Cys Asn Arg Tyr Phe 65 70 7580
Asp Cys Arg Pro Tyr Val Val Gly Lys Pro Gly Cys Glu Leu Pro Val
74.365/BE
273
Ala Pro Arg Vai 100 Asp Pro Gly Thr Thr 105 Vai Gly Pro Asp Arg 110 Leu Vai
Asn Thr Vai 115 Ala Gly Tyr Asp Arg 120 His Gly Gly Asp Leu 125 He Vai Vai
Asp Phe 130 Gly Thr Ala Thr Thr 135 Phe Asp Vai Vai Ala 140 Pro Asp Gly Ala
Tyr He Gly Gly Vai He Ala Pro Gly Vai Asn Leu Ser Leu Glu Ala
145 150 155 160
Leu His Met Ala Ala Ala Ala Leu Pro His Vai Asp Vai Thr Lys Pro 165 170175
Gin Gly Vai He Gly Thr Asn Thr Vai Ala Cys lie Gin Ser Gly Vai 180 185190
Tyr Trp Gly Tyr lie Gly Leu Vai Glu Gly lie Vai Arg Gin lie Arg 195 200205
Met Glu Arg Asp Arg Pro Met Lys Vai He Ala Thr Gly Gly Leu Ala 210 215220
Ser Leu Phe Asp Leu Gly Phe Asp Leu Phe Asp Lys Vai Glu AspAsp
225 230 235240
Leu Thr Met His Gly Leu Arg Leu lie Phe Asp Tyr Asn Lys GlyLeu
245 250255
Gly Ala <210> 76 <211> 10801 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Description of Artificial Sequence: Recombinant pAN240 plasmid
<400> 76 gaattttgcg gccgcttcga aagctgtaat ataaaaacct tcttcaacta acggggcagg 60
ttagtgacat tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa 120
gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat 180
aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt 240
tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat 300
74.365/BE
274 ttaagttaaa gtataggtgt ataaatcata tagatacacc cgtcgctatt aaataaatgc tatcaatttc cttttctctt tttttatcta ttttttaaaa ccaattttcg aatgtggtct tatcttgata ggccatccgt ctgcccgcca tcctactcag actgagcctt acactaccat accgcgctac atctgtatca cggcaaaacc ttctacaaaa ttcagaacag gaaataataa atgacgccgc ttattcacaa tcaattgtaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag 360 tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt 420 aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt 480 atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc 540 gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga 600 agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa 660 tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct 720 ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa 780 aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta gaatcaatcc 840 gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt ttaaaaatat cccactttat 900 tttgttgaac taatgggtgc tttagttgaa gaataaagac cacattaaaa 960 tttgtgtttt tttaaaggat ttgagcgtag cgaaaaatcc ttttctttct 1020 ataagggtaa ctattgaatt cggtaccaag agtttgtaga aacgcaaaaa 1080 caggatggcc ttctgcttaa tttgatgcct ggcagtttat ggcgggcgtc 1140 ccctccgggc cgttgcttcg caacgttcaa atccgctccc ggcggatttg 1200 gagagcgttc accgacaaac aacagataaa acgaaaggcc cagtctttcg 1260 tcgttttatt tgatgcctgg cagttcccta ctctcgcatg gggagacccc 1320 cggcgctacg gcgtttcact tctgagttcg gcatggggtc aggtgggacc 1380 tgccgccagg caaattctgt tttatcagac cgcttctgcg ttctgattta 1440 ggctgaaaat cttctctcat ccgccaaaac aggatcctac ggaaatggag 1500 gttttactct caaaatctta aaagaaaacc cccgataaag ggggcttttc 1560 ttgtacgggc tggttcgttc cccagcattt gttcaatttt gttttgatca 1620 ccactttcgg ctcatggctt gccgcttctt gatcagacat cattttgtag 1680 tgaccttatc tccttcctgc acaaggcgtg cggctgcacc gtttaagcat 1740 ttccccgttt accaggaata atatacgttt caagacgtgc tccattatta 1800 tttgtacttt ttcattagga agcattccca cagcatcaat gagatcttca 1860 tgcttcccac atagttcagg tttgcttccg taacagttgc cctgtgaagt 1920
74.365/BE
275 ttgccgctca gatattatct agcaatttca tccgctagtc accggcttgg tctttcctca gaccgtatcg aacagctacc gaaaagcttc taacacgtct atgagcatct ctcaatatcg aaaaatactc cccctcatgc ttgttttatg cgtacaagcc cacgatgtct gcgtatattg aaacgagaac gcgtctcggc ctcctgcttc tgccctgtac tgactactgg cctcaagctt tatcttcctt gcgcacccct ttgaatcaag tcattgttcg atacatatta tattctctcc atttctcgaa tatcaataat 1980 attaaacgcg cttttgaaaa agcaactgca acagcgagaa tcatctttcc 2040 ttcacaggct cgagttccgg ataggaataa agctctacat agtctatggt 2100 gtttcaatga tatcttttgc agcttttatc accgcttcag gatctctttc 2160 acaagttccg cacttgtttg aagggcccga tacagcttag gcgcttcttt 2220 gctgttaagt atacattgcg agagcttttg gctaagccgt cttcctctct 2280 acaggaacca attcaatatc catgaagaag tcgctgatta acccatcaac 2340 tgctgcgcat cttttaaacc gaaataggca cgagtcggct tgactagatt 2400 gtcagtacga tcgcgacccc gtcaaaatgt ccttctcttg agcgcccgca 2460 gtgcgtcttt ctacatgaat cgtgacattc ttttcaccgg gatacatatc 2520 ggcgtaaaaa gaatatcgac tccggcgttt tctgcaagag ctgcatcccg 2580 cgcggatatg cttcaaaatc ttcattaggg ccgaattgtg caggattcac 2640 ataataacgg cgtcgttttc ttgtcttgct ttgtctgcta aggttaaatg 2700 agaaacccca tcgtcggaac aaatccgatt gacttgccct ctgaatggta 2760 gcttctttca gctgtgaaat atcagtaatc tgtctcatct tattttcccc 2820 gtcaagcact gtctggttca tttgaaagga atgcttttgt tcagggaaag 2880 tacatcctga acatatccgc tgattgctgt ttcgatggtt tcatcaatgc 2940 ctttacaaat ttaggtgttc tctcaacacc gtggccgata atatcatgat 3000 ttgtccgtcc gctttcacac cagccccgat tccaatgacc ggtatgctta 3060 aattttggct gtgagttctg ccggcacaca ttccagcaca agcatcatag 3120 ttcgcatttt atactgtctt ctattaattt tttggcgctt tgttcgtctt 3180 tttatagccg cccagtacgc cgactgactg cggtgtcaaa cctaagtgac 3240 aatgcctcca agcgtcaatg cgcgaatgga ttcaaacacg ccttctccgc 3300 cagtgcgtca gctccgcttt cctgaacgat agccgctgca tttttcagcg 3360 agacaggtga taagacataa acggcatatc tgtcacaata aaggtattcg 3420 tttaacggct tttgtatgat ggatcatgtc cgcaactgtc acaccgacag 3480 gccgaggacg accattccaa gtgaatcacc gactaaaatc atgtcaactc 3540
74.365/BE
276 ccgcttgttc agcaagttta gctgccggat aatcataagc ggtcagcatg acaatcggtt 3600 cttcagactc cttcattttt agaaaatcca gttttgtttt catgttttct cctccttcta 3660 gagcgtcctg ctgttgttaa gattattata ccacaccttg tagataaagt caacaacttt 3720 ttgcaaaatt tttcaggaat tttagcagag gttgttctgg atgtagaaca aaacatcttt 3780 ccgctcttgt gctgttagga tatctttctt ggaagctagg taggcctcga gttatggcag 3840 ttggttaaaa ggaaacaaaa agaccgtttt cacacaaaac ggtctttttc gatttctttt 3900 tacagtcaca gccacttttg caaaaaccgg acagcttcat gccttataac tgctgtttcg 3960 gtcgacgatg atctgccgtt ttcttctgca agccaaaaaa ccttccgtta caacgagaag 4020 gattcttcac tttctaaagt tcggcgagtt tcatccctct gtcccagtcc ttttttggat 4080 caaggcagac tgctgcaatg tctatctatt ttaataatag gtgcagttcg caggcgatac 4140 tgcccaatgg aagtatacca aaatcaacgg gcttgtacca acacattagc ccaattcgat 4200 atcggcagaa tagatttttt taatgccttc gttcgtttct aaaagcagaa cgccttcatc 4260 atctatacct aacgccttac cgtaaaaggt tccgtttaac gttctggctc tcatattagt 4320 gccaataccg agcgcatagc tttcccataa aagcttaatc ggcgtaaatc cgtgcgtcat 4380 ataatcccgg taccgtttct caaagcatag taaaatatgc tggatgacgc cggcccgatc 4440 aattttttcc ccagcagctt ggctgaggct tgtcgcgatg tccttcaatt catctggaaa 4500 atcattaggc tgctggttaa cgttaatgcc gatcccaatg atcactgaac gtacgcggtc 4560 ttcttcagcc tgcatttccg ttaggatacc gactgttttt tttccgttaa tcaaaatatc 4620 atttggccat ttaatatccg tttggatgcc tgctgcctct tctattccct gcacaacagc 4680 tactgcagca agcagagtca gctgcggtgt tttttggagc ggaatgtcag gccgcaaaat 4740 caggctcatc caaacaccgt ttccttcttg agaatgccat accctagaca ttcggcccct 4800 tccggctgtt tgtttgtcag ccaccacaag ggtgccttcc ggtgcgttat tattcgcgag 4860 ctcatgagcc gttttttgcg tgcttgaaag aacgtcatgg taaataagat gctggcccat 4920 cacttccgtt tttaatccaa aacgaatttc gctttcactg agttttccgg gttttttgat 4980 gagccgatat ccttttcttc taacggcttc tacttcataa ccctctttcc gaagctcttc 5040 aatatgcttc cacacagcag ttcttgaaca gccgagagca tcactgattt tttggccgga 5100 aataaattca ttgccggcct gagaaaataa ttcaataagg tcttttctta atgttgaccg 5160
74.365/BE
277 catgtcttca gccactcctc tatgtgtttc ttttgattgg agagcttccc tgtcacaaca 5220 gcctgctcga tccactgtaa ttcttctgac acccattttc cggccggccg gtttcgaagc 5280 gcaagcaagt ccttacccgt gatatcaaga tccttaaggc ttttgatcgg caggttttga 5340 taagcgtact gaatgtcctt cagtttcttt tcatccagtt tttcgttttg ccgaagctgc 5400 gatattttgg ccgctgagag cagtgctttt ttcccagctc tgtacattgt cattgcgtca 5460 aggctctggc caaacgtatc ggcaatgtga atggcttcct tgatcacttt tcccgggagc 5520 ttccaggctt tcaggaaaag gggcgcgtct ttcaaaacta tgccaaggtt aattaaaaga 5580 gcagcccaaa gctcctcacg ggatgttaaa gagaagaatg gaaactcact cgttgaaatc 5640 aggttttctc gtttatgata aaaaccagga agctcttcat acaatctcgt ttgaatgagt 5700 gtttgaagcg cctggcgaga agctcttccc tgcagcaatt tctcaaactc tatagttttt 5760 cgttcgactg aaacatggga gaggagtgat ttttctttcg caatggcttc ttctgtttcc 5820 ggtgaaagcg taaagccaag ctggctcata aagcgtacgg ctctcagcat acgaagcgca 5880 tcctcttgaa atctatcctc aggctttcca acggttcgaa tcactttctg atcaatatct 5940 ttcttgccgc caaaataatc aagcaccttc ccgtccgctg tcatggccat cgcattgatc 6000 gttaaatctc tgcgttttag atcctcttct aatgatgaga taaattgcac ttctgacggt 6060 cttctgaaat caacataatc agattcagtc cggaatgtcg tgacttcata ggtttcatcc 6120 tcccagagca caataatggt cccgtgctct ttgcctacat caacagtccg ctgaaacagc 6180 cgttctactt gatcaggtgc cgcatctgtc gcgatatcga catctccgat cgttcgtttc 6240 atatagctgt cacgaactgc gcccccgaca aaataagcct gatggcccgc ttcgattaag 6300 atgcggagca cgggaagtgc tttgataaaa actttttcca tgtgatcact ccggttctgc 6360 taaatcggca taaatctgtt catactggct gacaattttt ttagaagaaa attcattttc 6420 aagcatctct attgccgcct ttgtaaaacg attgcttagc tgttcatctt ctaaaatgct 6480 catcgcgcgg gctgttgcgg ccgtaacatc accgacatcc accaaaaatc cgctcacatt 6540 gttttttata acctcaggga taccgccaat gtttgttcca atacaaggca ctccgcaagc 6600 catcgcttca agcaggacaa ggccaaagct ttctttttca gatagcagca gcttcaaatc 6660 gctaatagaa taaagatctt caacacggtc ttgatttcca agcattaaga cttggtcttc 6720 caagccatat tttctgataa gctcgcaggc tgtcgatttc tccggaccgt ctccgactaa 6780 .365/BE
278 aagcagcttc gcgtgcagcc cttgaagtgg gctgaagcca cgctggtagc tcaagaagat ttaagggatt aaaatgaagt atgcttaatc ctgactcccc tgcaatgata agccggaagg taattgttgc tgccattgct cggttcccaa ctccttcggt tatggcagca tggtgagtac cccggcgtca tggaaaacgt gatgtaaccc tgggtgagca atgttgaata tctcatgagc cacatttccc ctataaaaat caactgcggg gctttcgttt tgccagcgat attgcggaac acacggatga catcctgcac 6840 actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 6900 tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct 6960 gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 7020 ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 7080 cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 7140 ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 7200 tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca 7260 agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 7320 gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 7380 ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 7440 gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 7500 cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 7560 acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 7620 cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 7680 cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 7740 ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 7800 tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 7860 atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 7920 tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 7980 actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 8040 aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 8100 ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 8160 ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 8220 cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac 8280 aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgca tgcggatcag tgagggtttg 8340 tcaaggatct ggatttcgat cacggcacga tcatcgtgcg ggagggcaag 8400
74.365/BE
279 ggctccaagg atcgggcctt gatgttaccc gagagcttgg cacccagcct gcgcgagcag 8460 gggaattgat ccggtggatg accttttgaa tgacctttaa tagattatat tactaattaa 8520 ttggggaccc tagaggtccc cttttttatt ttaaaaattt tttcacaaaa cggtttacaa 8580 gcataacggg ttttgctgcc cgcaaacggg ctgttctggt gttgctagtt tgttatcaga 8640 atcgcagatc cggcttcagg tttgccggct gaaagcgcta tttcttccag aattgccatg 8700 attttttccc cacgggaggc gtcactggct cccgtgttgt cggcagcttt gattcgataa 8760 gcagcatcgc ctgtttcagg ctgtctatgt gtgactgttg agctgtaaca agttgtctca 8820 ggtgttcaat ttcatgttct agttgctttg ttttactggt ttcacctgtt ctattaggtg 8880 ttacatgctg ttcatctgtt acattgtcga tctgttcatg gtgaacagct ttaaatgcac 8940 caaaaactcg taaaagctct gatgtatcta tcttttttac accgttttca tctgtgcata 9000 tggacagttt tccctttgat atctaacggt gaacagttgt tctacttttg tttgttagtc 9060 ttgatgcttc actgatagat acaagagcca taagaacctc agatccttcc gtatttagcc 9120 agtatgttct ctagtgtggt tcgttgtttt tgcgtgagcc atgagaacga accattgaga 9180 tcatgcttac tttgcatgtc actcaaaaat tttgcctcaa aactggtgag ctgaattttt 9240 gcagttaaag catcgtgtag tgtttttctt agtccgttac gtaggtagga atctgatgta 9300 atggttgttg gtattttgtc accattcatt tttatctggt tgttctcaag ttcggttacg 9360 agatccattt gtctatctag ttcaacttgg aaaatcaacg tatcagtcgg gcggcctcgc 9420 ttatcaacca ccaatttcat attgctgtaa gtgtttaaat ctttacttat tggtttcaaa 9480 acccattggt taagcctttt aaactcatgg tagttatttt caagcattaa catgaactta 9540 aattcatcaa ggctaatctc tatatttgcc ttgtgagttt tcttttgtgt tagttctttt 9600 aataaccact cataaatcct catagagtat ttgttttcaa aagacttaac atgttccaga 9660 ttatatttta tgaatttttt taactggaaa agataaggca atatctcttc actaaaaact 9720 aattctaatt tttcgcttga gaacttggca tagtttgtcc actggaaaat ctcaaagcct 9780 ttaaccaaag gattcctgat ttccacagtt ctcgtcatca gctctctggt tgctttagct 9840 aatacaccat aagcattttc cctactgatg ttcatcatct gagcgtattg gttataagtg 9900 aacgataccg tccgttcttt ccttgtaggg ttttcaatcg tggggttgag tagtgccaca 9960 cagcataaaa ttagcttggt ttcatgctcc gttaagtcat agcgactaat cgctagttca 10020
74.365/BE
280 tttgctttga aaacaactaa ttcagacata catctcaatt ggtctaggtg attttaatca 10080 ctataccaat tgagatgggc tagtcaatga taattactag tccttttcct ttgagttgtg 10140 ggtatctgta aattctgcta gacctttgct ggaaaacttg taaattctgc tagaccctct 10200 gtaaattccg ctagaccttt gtgtgttttt tttgtttata ttcaagtggt tataatttat 10260 agaataaaga aagaataaaa aaagataaaa agaatagatc ccagccctgt gtataactca 10320 ctactttagt cagttccgca gtattacaaa aggatgtcgc aaacgctgtt tgctcctcta 10380 caaaacagac cttaaaaccc taaaggctta agtagcaccc tcgcaagctc gggcaaatcg 10440 ctgaatattc cttttgtctc cgaccatcag gcacctgagt cgctgtcttt ttcgtgacat 10500 tcagttcgct gcgctcacgg ctctggcagt gaatgggggt aaatggcact acaggcgcct 10560 tttatggatt catgcaagga aactacccat aatacaagaa aagcccgtca cgggcttctc 10620 agggcgtttt atggcgggtc tgctatgtgg tgctatctga ctttttgctg ttcagcagtt 10680 cctgccctct gattttccag tctgaccact tcggattatc ccgtgacagg tcattcagac 10740 tggctaatgc acccagtaag gcagcggtat catcaacagg cttacccgtc ttactgtcaa 10800 c 10801 <210> 77 <211> 8654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Recombinant pAN236 plasmid <400> 77
ctcgaggcct acctagcttc caagaaagat atcctaacag cacaagagcg gaaagatgtt 60
ttgttctaca tccagaacaa cctctgctaa aattcctgaa aaattttgca aaaagttgtt 120
gactttatct acaaggtgtg gtataataat cttaacaaca gcaggacgct ctagaggagg 180
agacatcatg aaaattggaa ttatcggcgg aggctccgtt ggtcttttat gcgcctatta 240
tttgtcactt tatcacgacg tgactgttgt gacgaggcgg caagaacagg ctgcggccat 300
tcagtctgaa ggaatccggc tttataaagg cggggaggaa ttcagggctg attgcagtgc 360
ggacacgagt atcaattcgg actttgacct gcttgtcgtg acagtgaagc agcatcagct 420
tcaatctgtt ttttcgtcgc ttgaacgaat cgggaagacg aatatattat ttttgcaaaa 480
74.365/BE
281 cggcatgggg aatcgttgag tgcgataaaa gcataaccat caagctgatt agaactgctg ccgcatttta gcaaacgaaa agctgacgcc ccacctagag ttgagctttt cctgttttgg gcggtctgat tgccgaactc gagtagggaa cgttttatct gatttgaacg gccaggcatc actcttggta tgtctgccgc cagccgatga atgcagacca aggttatgga ggcagctttt caactgacgg gatatgatgg cggcattaaa catatccacg acctaaaaga ctggcacgtt ggccattcca tttatgttgg 540 cacggagctg taagaaaatc ggatacagct gttgatcata caggcctagg 600 tggagcgcgt tcgacgatgc tgaaccagac cggctgaaca tcttgtttca 660 tcggattttc cgatttatta tgagacggat tggtaccgtc tgctgacggg 720 gtaaatgcgt gtattaatcc tttaactgcg ttattgcaag tgaaaaatgg 780 acaacgccag cttatctggc ttttatgaag ctggtatttc aggaggcatg 840 aaacttgaaa atgaagaaaa ggcttgggag cgggttcagg ccgtttgtgg 900 gagaatcgtt catcaatgct ggttgacgtc attggaggcc ggcagacgga 960 attatcggat acttattgaa ggaagcaagt cttcaaggtc ttgatgccgt 1020 tttttatatg gcagcatcaa agcattggag cgaaatacaa acaaagtctt 1080 tcggtaacat gctatactca tttcggatca ctaactattt attggaggat 1140 cggatgagag aagattttca gcctgataca gattaaatca gaacgcagaa 1200 aaaacagaat ttgcctggcg gcagtagcgc ggtggtccca cctgacccca 1260 agaagtgaaa cgccgtagcg ccgatggtag tgtggggtct ccccatgcga 1320 ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt 1380 gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg 1440 ttgcgaagca acggcccgga gggtggcggg caggacgccc gccataaact 1500 aaattaagca gaaggccatc ctgacggatg gcctttttgc gtttctacaa 1560 cccagaaaaa gcggcaaaag cggctgttaa aaaagcgaaa tcgaagaagc 1620 taagacggaa tatcaaaagc gttctgctgt tgtgtcatct ttaaaagtca 1680 atcccagcaa gatgtcctaa aatacttgaa cacccagaaa gataaaggaa 1740 aattcattct tattatgtgg tgaacgggat tgctgttcat gcctcaaaag 1800 aaaagtggtg cagtttcccg aagtggaaaa ggtgcttcct aatgagaaac 1860 taagtcatcc tccccattta atatgaaaaa agcacagaaa gctattaaag 1920 tgtggaatgg aatgtagacc aaatcgatgc cccaaaagct tgggcacttg 1980 aactggcacg gttgttgcgt ccattgatac cggggtggaa tggaatcatc 2040 agagaaatat cgcggatata atccggaaaa tcctaatgag cctgaaaatg 2100
74.365/BE
282 aaatgaactg gtatgatgcc gtagcaggcg aggcaagccc ttatgatgat ttggctcatg 2160 gaacccacgt gacaggcacg atggtgggct ctgaacctga tggaacaaat caaatcggtg 2220 tagcacctgg cgcaaaatgg attgctgtta aagcgttctc tgaagatggc ggcactgatg 2280 ctgacatttt ggaagctggt gaatgggttt tagcaccaaa ggacgcggaa ggaaatcccc 2340 acccggaaat ggctcctgat gttgtcaata actcatgggg agggggctct ggacttgatg 2400 aatggtacag agacatggtc aatgcctggc gttcggccga tattttccct gagttttcag 2460 cggggaatac ggatctcttt attcccggcg ggcctggttc tatcgcaaat ccggcaaact 2520 atccagaatc gtttgcaact ggagcgactg agaattccaa ttccccatgg agagaaaaga 2580 aaatcgctaa tgttgattac tttgaacttc tgcatattct tgaatttaaa aaggctgaaa 2640 gagtaaaaga ttgtgctgaa atattagagt ataaacaaaa tcgtgaaaca ggcgaaagaa 2700 agttgtatcg agtgtggttt tgtaaatcca ggctttgtcc aatgtgcaac tggaggagag 2760 caatgaaaca tggcattcag tcacaaaagg ttgttgctga agttattaaa caaaagccaa 2820 cagttcgttg gttgtttctc acattaacag ttaaaaatgt ttatgatggc gaagaattaa 2880 ataagagttt gtcagatatg gctcaaggat ttcgccgaat gatgcaatat aaaaaaatta 2940 ataaaaatct tgttggtttt atgcgtgcaa cggaagtgac aataaataat aaagataatt 3000 cttataatca gcacatgcat gtattggtat gtgtggaacc aacttatttt aagaatacag 3060 aaaactacgt gaatcaaaaa caatggattc aattttggaa aaaggcaatg aaattagact 3120 atgatccaaa tgtaaaagtt caaatgattc gaccgaaaaa taaatataaa tcggatatac 3180 aatcggcaat tgacgaaact gcaaaatatc ctgtaaagga tacggatttt atgaccgatg 3240 atgaagaaaa gaatttgaaa cgtttgtctg atttggagga aggtttacac cgtaaaaggt 3300 taatctccta tggtggtttg ttaaaagaaa tacataaaaa attaaacctt gatgacacag 3360 aagaaggcga tttgattcat acagatgatg acgaaaaagc cgatgaagat ggattttcta 3420 ttattgcaat gtggaattgg gaacggaaaa attattttat taaagagtag ttcaacaaac 3480 gggccatatt gttgtataag tgatgaaata ctgaatttaa aacttagttt atatgtggta 3540 aaatgtttta atcaagttta ggaggaatta attatgaagt gtaatgaatg taacagggtt 3600 caattaaaag agggaagcgt atcattaacc ctataaacta cgtctgccct cattattgga 3660 gggtgaaatg tgaatacatc ctattcacaa tcgaatttac gacacaacca aattttaatt 3720
74.365/BE
283 tggctttgca cctgatattg tttatgttaa atcaaaaggt gttggccatt gctgcatttc ggtaaagcat attggtggaa acaattatca cattttgata acaacatcat aaacatatca tttatgattg atggttcctt attattttcc gatagaagag ttaactgctt gttttaggtg aaacagcagg ggaacaggta ttacctatgg ggaatcattg ttctaaatcg cagttcgaag aggttaatgt tgcgcggaac gacaataacc ttttatcttt ttttagcgta ttaaatgaaa tggttttgaa cgtctcatta 3780 caaatgattt taataaacca cctgcgagta caaactgggt gaacacagcc 3840 ccttttccat tggaacagct gtatatggaa agctatctga tcaattaggc 3900 tactcctatt tggaattata ataaattgtt tcgggtcggt aattgggttt 3960 ctttcttttc cttacttatt atggctcgtt ttattcaagg ggctggtgca 4020 cagcactcgt aatggttgta gttgcgcgct atattccaaa ggaaaatagg 4080 ttggtcttat tggatcgata gtagccatgg gagaaggagt cggtccagcg 4140 tgatagccca ttatattcat tggtcctatc ttctactcat tcctatgata 4200 ctgttccgtt tcttatgaaa ttattaaaga aagaagtaag gataaaaggt 4260 tcaaaggaat tatactaatg tctgtaggca ttgtattttt tatgttgttt 4320 atagcatttc ttttettate gttagcgtgc tgtcattcct gatatttgta 4380 ggaaagtaac agatcctttt gttgatcccg gattagggaa aaatatacct 4440 gagttctttg tgggggaatt atatttggaa cagtagcagg gtttgtctct 4500 atatgatgaa agatgttcac cagctaagta etgeegaaat cggaagtgta 4560 ctggaacaat gagtgteatt attttcggct acattggtgg gatacttgtt 4620 gtcctttata cgtgttaaac ateggagtta catttctttc tgttagcttt 4680 cctttctttt agaaacaaca tcatggttca tgacaattat aatcgtattt 4740 ggctttcgtt caccaaaaca gttatatcaa caattgtttc aagtagettg 4800 aagctggtgc tggaatgagt ttgcttaact ttaccagctt tttatcagag 4860 ttgcaattgt aggtggttta ttatccatac ccttacttga tcaaaggttg 4920 aagttgatca gteaaettat ctgtatagta atttgttatt acttttttca 4980 tcattagttg gctggttacc ttgaatgtat ataaacattc tcaaagggat 5040 ttaagggatc aactttggga gagagttcaa aattgatcct ttttttataa 5100 cggccgcaat tcttgaagac gaaagggcct egtgataege ctatttttat 5160 catgataata atggtttctt agaegteagg tggcactttt cggggaaatg 5220 ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga 5280 etgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac 5340
74.365/BE
284
atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc 5400
cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca 5460
tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc 5520
caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg 5580
ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac 5640
cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca 5700
taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg 5760
agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac 5820
cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gcagcaatgg 5880
caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat 5940
taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg 6000
ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg 6060
cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc 6120
aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc 6180
attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt 6240
tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt 6300
aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 6360
gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 6420
cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 6480
gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 6540
agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 6600
ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 6660
cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 6720
acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga 6780
gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc 6840
ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg 6900
agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 6960
74.365/BE
285 cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt 7020 tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc 7080 gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcctgatgc 7140 ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc actctcagta 7200 caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 7260 ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 7320 gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 7380 gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 7440 gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 7500 aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 7560 ggtcacttga tgcctccgtg taagggggaa tttctgttca tgggggtaat gataccgatg 7620 aaacgagaga ggatgctcac gatacgggtt actgatgatg aacatgcccg gttactggaa 7680 cgttgtgagg gtaaacaact ggcggtatgg atgcggcggg accagagaaa aatcactcag 7740 ggtcaatgcc agcgcttcgt taatacagat gtaggtgttc cacagggtag ccagcagcat 7800 cctgcgatgc agatccggaa cataatggtg cagggcgctg acttccgcgt ttccagactt 7860 tacgaaacac ggaaaccgaa gaccattcat gttgttgctc aggtcgcaga cgttttgcag 7920 cagcagtcgc ttcacgttcg ctcgcgtatc ggtgattcat tctgctaacc agtaaggcaa 7980 ccccgccagc ctagccgggt cctcaacgac aggagcacga tcatgcgcac ccgtggccag 8040 gacccaacgc tgcccgagat gcgccgcgtg cggctgctgg agatggcgga cgcgatggat 8100 atgttctgcc aagggttggt ttgcgcattc acagttctcc gcaagaattg attggctcca 8160 attcttggag tggtgaatcc gttagcgagg tgccgccggc ttccattcag gtcgaggtgg 8220 cccggctcca tgcaccgcga cgcaacgcgg ggaggcagac aaggtatagg gcggcgccta 8280 caatccatgc caacccgttc catgtgctcg ccgaggcggc ataaatcgcc gtgacgatca 8340 gcggtccagt gatcgaagtt aggctggtaa gagccgcgag cgatccttga agctgtccct 8400 gatggtcgtc atctacctgc ctggacagca tggcctgcaa cgcgggcatc ccgatgccgc 8460 cggaagcgag aagaatcata atggggaagg ccatccagcc tcgcgtcggc ggccgcttcg 8520 tcgaccgaaa cagcagttat aaggcatgaa gctgtccggt ttttgcaaaa gtggctgtga 8580
74.365/BE
286 ctgtaaaaag aaatcgaaaa agaccgtttt gtgtgaaaac ggtctttttg tttcctttta 8640 accaactgcc ataa 8654 <210> 78 <211> 8093 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Description of Artificial Sequence: Recombinant pAN423 plasmid < 400> 78 ggcggccgct tcgtcgaccg aaacagcagt tataaggcat gaagctgtcc ggtttttgca60 aaagtggctg tgactgtaaa aagaaatcga aaaagaccgt tttgtgtgaa aacggtcttt120 ttgtttcctt ttaaccaact gccataactc gaggcctacc tagcttccaa gaaagatatc180 ctaacagcac aagagcggaa agatgttttg ttctacatcc agaacaacct ctgctaaaat240 tcctgaaaaa ttttgcaaaa agttgttgac tttatctaca aggtgtggta taataatctt300 aacaacagca ggacgctcta gaaaaggagg aatttaaatg tatcgtacga tgatgagcgg360 caaacttcac agggcaactg ttacggaagc aaacctgaac tatgtgggaa gcattacaat420 tgatgaagat ctcattgatg ctgtgggaat gcttcctaat gaaaaagtac aaattgtgaa480 taataataat ggagcacgtc ttgaaacgta tattattcct ggtaaacggg gaagcggcgt540 catatgctta aacggtgcag ccgcacgcct tgtgcaggaa ggagataagg tcattattat600 ttcctacaaa atgatgtctg atcaagaagc ggcaagccat gagccgaaag tggctgttct660 gaatgatcaa aacaaaattg aacaaatgct ggggaacgaa ccagcccgta caattttgta720 aaggatcctg ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac780 gcagaagcgg tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg840 accccatgcc gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg gggtctcccc900 atgcgagagt agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg960 gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg1020 ggagcggatt tgaacgttgc gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca1080 taaactgcca ggcatcaaat taagcagaag gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt1140 ctacaaactc ttggtaccca gaaaaagcgg caaaagcggc tgttaaaaaa gcgaaatcga1200
74.365/BE
287 agaagctgtc tgccgctaag acggaatatc aaaagcgttc tgctgttgtg tcatctttaa 1260 aagtcacagc cgatgaatcc cagcaagatg tcctaaaata cttgaacacc cagaaagata 1320 aaggaaatgc agaccaaatt cattcttatt atgtggtgaa cgggattgct gttcatgcct 1380 caaaagaggt tatggaaaaa gtggtgcagt ttcccgaagt ggaaaaggtg cttcctaatg 1440 agaaacggca gctttttaag tcatcctccc catttaatat gaaaaaagca cagaaagcta 1500 ttaaagcaac tgacggtgtg gaatggaatg tagaccaaat cgatgcccca aaagcttggg 1560 cacttggata tgatggaact ggcacggttg ttgcgtccat tgataccggg gtggaatgga 1620 atcatccggc attaaaagag aaatatcgcg gatataatcc ggaaaatcct aatgagcctg 1680 aaaatgaaat gaactggtat gatgccgtag caggcgaggc aagcccttat gatgatttgg 1740 ctcatggaac ccacgtgaca ggcacgatgg tgggctctga acctgatgga acaaatcaaa 1800 tcggtgtagc acctggcgca aaatggattg ctgttaaagc gttctctgaa gatggcggca 1860 ctgatgctga cattttggaa gctggtgaat gggttttagc accaaaggac gcggaaggaa 1920 atccccaccc ggaaatggct cctgatgttg tcaataactc atggggaggg ggctctggac 1980 ttgatgaatg gtacagagac atggtcaatg cctggcgttc ggccgatatt ttccctgagt 2040 tttcagcggg gaatacggat ctctttattc ccggcgggcc tggttctatc gcaaatccgg 2100 caaactatcc agaatcgttt gcaactggag cgactgagaa ttccaattcc ccatggagag 2160 aaaagaaaat cgctaatgtt gattactttg aacttctgca tattcttgaa tttaaaaagg 2220 ctgaaagagt aaaagattgt gctgaaatat tagagtataa acaaaatcgt gaaacaggcg 2280 aaagaaagtt gtatcgagtg tggttttgta aatccaggct ttgtccaatg tgcaactgga 2340 ggagagcaat gaaacatggc attcagtcac aaaaggttgt tgctgaagtt attaaacaaa 2400 agccaacagt tcgttggttg tttctcacat taacagttaa aaatgtttat gatggcgaag 2460 aattaaataa gagtttgtca gatatggctc aaggatttcg ccgaatgatg caatataaaa 2520 aaattaataa aaatcttgtt ggttttatgc gtgcaacgga agtgacaata aataataaag 2580 ataattctta taatcagcac atgcatgtat tggtatgtgt ggaaccaact tattttaaga 2640 atacagaaaa ctacgtgaat caaaaacaat ggattcaatt ttggaaaaag gcaatgaaat 2700 tagactatga tccaaatgta aaagttcaaa tgattcgacc gaaaaataaa tataaatcgg 2760 atatacaatc ggcaattgac gaaactgcaa aatatcctgt aaaggatacg gattttatga 2820
74.365/BE
288 ccgatgatga agaaaagaat ttgaaacgtt tgtctgattt ggaggaaggt ttacaccgta 2880 aaaggttaat ctcctatggt ggtttgttaa aagaaataca taaaaaatta aaccttgatg 2940 acacagaaga aggcgatttg attcatacag atgatgacga aaaagccgat gaagatggat 3000 tttctattat tgcaatgtgg aattgggaac ggaaaaatta ttttattaaa gagtagttca 3060 acaaacgggc catattgttg tataagtgat gaaatactga atttaaaact tagtttatat 3120 gtggtaaaat gttttaatca agtttaggag gaattaatta tgaagtgtaa tgaatgtaac 3180 agggttcaat taaaagaggg aagcgtatca ttaaccctat aaactacgtc tgccctcatt 3240 attggagggt gaaatgtgaa tacatcctat tcacaatcga atttacgaca caaccaaatt 3300 ttaatttggc tttgcatttt atcttttttt agcgtattaa atgaaatggt tttgaacgtc 3360 tcattacctg atattgcaaa tgattttaat aaaccacctg cgagtacaaa ctgggtgaac 3420 acagccttta tgttaacctt ttccattgga acagctgtat atggaaagct atctgatcaa 3480 ttaggcatca aaaggttact cctatttgga attataataa attgtttcgg gtcggtaatt 3540 gggtttgttg gccattcttt cttttcctta cttattatgg ctcgttttat tcaaggggct 3600 ggtgcagctg catttccagc actcgtaatg gttgtagttg cgcgctatat tccaaaggaa 3660 aataggggta aagcatttgg tcttattgga tcgatagtag ccatgggaga aggagtcggt 3720 ccagcgattg gtggaatgat agcccattat attcattggt cctatcttct actcattcct 3780 atgataacaa ttatcactgt tccgtttctt atgaaattat taaagaaaga agtaaggata 3840 aaaggtcatt ttgatatcaa aggaattata ctaatgtctg taggcattgt attttttatg 3900 ttgtttacaa catcatatag catttctttt cttatcgtta gcgtgctgtc attcctgata 3960 tttgtaaaac atatcaggaa agtaacagat ccttttgttg atcccggatt agggaaaaat 4020 atacctttta tgattggagt tctttgtggg ggaattatat ttggaacagt agcagggttt 4080 gtctctatgg ttccttatat gatgaaagat gttcaccagc taagtactgc cgaaatcgga 4140 agtgtaatta ttttccctgg aacaatgagt gtcattattt tcggctacat tggtgggata 4200 cttgttgata gaagaggtcc tttatacgtg ttaaacatcg gagttacatt tctttctgtt 4260 agctttttaa ctgcttcctt tcttttagaa acaacatcat ggttcatgac aattataatc 4320 gtatttgttt taggtgggct ttcgttcacc aaaacagtta tatcaacaat tgtttcaagt 4380 agcttgaaac agcaggaagc tggtgctgga atgagtttgc ttaactttac cagcttttta 4440
74.365/BE
289 tcagagggaa caggtattgc aattgtaggt ggtttattat ccataccctt acttgatcaa 4500 aggttgttac ctatggaagt tgatcagtca acttatctgt atagtaattt gttattactt 4560 ttttcaggaa tcattgtcat tagttggctg gttaccttga atgtatataa acattctcaa 4620 agggatttct aaatcgttaa gggatcaact ttgggagaga gttcaaaatt gatccttttt 4680 ttataacagt tcgaagcggc cgcaattctt gaagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat 4740 ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg 4800 gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc 4860 tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta 4920 ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg 4980 ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg 5040 gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac 5100 gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg 5160 acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt 5220 actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg 5280 ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac 5340 cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt 5400 gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgcag 5460 caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc 5520 aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc 5580 ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta 5640 tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg 5700 ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga 5760 ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac 5820 ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 5880 tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 5940 cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 6000 taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 6060
74.365/BE
290 gcttcagcag acttcaagaa ctgctgccag ataaggcgca cgacctacac aagggagaaa gggagcttcc gacttgagcg gcaacgcggc ctgcgttatc ctcgccgcag tgatgcggta tcagtacaat tgactgggtc ttgtctgctc tcagaggttt gtggtcgtga ctccagaagc ctgtttggtc ccgatgaaac ctggaacgtt actcagggtc cagcatc,ctg agactttacg ttgcagcagc aggcaacccc ggccaggacc agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc 6120 ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 6180 tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 6240 gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 6300 cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 6360 ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 6420 agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 6480 tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 6540 ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc 6600 ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg 6660 ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc 6720 ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc 6780 ctgetctgat gccgcatagt taagccagta tacactccgc tategetacg 6840 atggetgege cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc 6900 ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg 6960 tcaccgtcat caccgaaacg cgcgaggcag etgeggtaaa gctcatcagc 7020 agcgattcac agatgtctgc ctgttcatcc gcgtccagct cgttgagttt 7080 gttaatgtct ggettetgat aaagcgggcc atgttaaggg cggttttttc 7140 aettgatgee teegtgtaag ggggaatttc tgttcatggg ggtaatgata 7200 gagagaggat gctcacgata cgggttactg atgatgaaca tgcccggtta 7260 gtgagggtaa acaactggcg gtatggatgc ggcgggacca gagaaaaatc 7320 aatgccagcg ettegttaat acagatgtag gtgttccaca gggtagccag 7380 egatgeagat ceggaacata atggtgeagg gegetgaett ccgcgtttcc 7440 aaacacggaa accgaagacc attcatgttg ttgctcaggt egeagaegtt 7500 agtegettea cgttcgctcg cgtatcggtg attcattctg ctaaccagta 7560 gccagcctag ccgggtcctc aacgacagga gcacgatcat gcgcacccgt 7620 caacgctgcc egagatgege cgcgtgcggc tgctggagat ggcggacgcg 7680
74.365/BE
291
atggatatgt tctgccaagg gttggtttgc gcattcacag ttctccgcaa gaattgattg 7740
gctccaattc ttggagtggt gaatccgtta gcgaggtgcc gccggcttcc attcaggtcg 7800
aggtggcccg gctccatgca ccgcgacgca acgcggggag gcagacaagg tatagggcgg 7860
cgcctacaat ccatgccaac ccgttccatg tgctcgccga ggcggcataa atcgccgtga 7920
cgatcagcgg tccagtgatc gaagttaggc tggtaagagc cgcgagcgat ccttgaagct 7980
gtccctgatg gtcgtcatct acctgcctgg acagcatggc ctgcaacgcg ggcatcccga 8040
tgccgccgga agcgagaaga atcataatgg ggaaggccat ccagcctcgc gtc 8093
<210> 79 <211> 8098 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Recombinant pAN429 plasmid <400> 79 ggcggccgct tcgtcgaccg aaacagcagt aaagtggctg tgactgtaaa aagaaatcga ttgtttcctt ttaaccaact gccataactc ctaacagcac aagagcggaa agatgttttg tcctgaaaaa ttttgcaaaa agttgttgac aacaacagca ggacgctcta gattagaaag agcggcaaac ttcacagggc aactgttacg acaattgatg aagatctcat tgatgctgtg gtgaataata ataatggagc acgtcttgaa ggcgtcatat gcttaaacgg tgcagccgca attatttcct acaaaatgat gtctgatcaa gttctgaatg atcaaaacaa aattgaacaa ttgtaaagga tcctgttttg gcggatgaga agaacgcaga agcggtctga taaaacagaa acctgacccc atgccgaact cagaagtgaa tataaggcat gaagctgtcc ggtttttgca 60 aaaagaccgt tttgtgtgaa aacggtcttt 120 gaggcctacc tagcttccaa gaaagatatc 180 ttctacatcc agaacaacct ctgctaaaat 240 tttatctaca aggtgtggta taataatctt 300 gaggtttaat taatgtatcg tacgatgatg 360 gaagcaaacc tgaactatgt gggaagcatt 420 ggaatgcttc ctaatgaaaa agtacaaatt 480 acgtatatta ttcctggtaa acggggaagc 540 cgccttgtgc aggaaggaga taaggtcatt 600 gaagcggcaa gccatgagcc gaaagtggct 660 atgctgggga acgaaccagc ccgtacaatt 720 gaagattttc agcctgatac agattaaatc 780 tttgcctggc ggcagtagcg cggtggtccc 840 acgccgtagc gccgatggta gtgtggggtc 900
74.365/BE
292 tccccatgcg agagtaggga actgccaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag960 actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc1020 cgccgggagc ggatttgaac gttgcgaagc aacggcccgg agggtggcgg gcaggacgcc1080 cgccataaac tgccaggcat caaattaagc agaaggccat cctgacggat ggcctttttg1140 cgtttctaca aactcttggt acccagaaaa agcggcaaaa gcggctgtta aaaaagcgaa1200 atcgaagaag ctgtctgccg ctaagacgga atatcaaaag cgttctgctg ttgtgtcatc1260 tttaaaagtc acagccgatg aatcccagca agatgtccta aaatacttga acacccagaa1320 agataaagga aatgcagacc aaattcattc ttattatgtg gtgaacggga ttgctgttca1380 tgcctcaaaa gaggttatgg aaaaagtggt gcagtttccc gaagtggaaa aggtgcttcc1440 taatgagaaa cggcagcttt ttaagtcatc ctccccattt aatatgaaaa aagcacagaa1500 agctattaaa gcaactgacg gtgtggaatg gaatgtagac caaatcgatg ccccaaaagc1560 ttgggcactt ggatatgatg gaactggcac ggttgttgcg tccattgata ccggggtgga1620 atggaatcat ccggcattaa aagagaaata tcgcggatat aatccggaaa atcctaatga1680 gcctgaaaat gaaatgaact ggtatgatgc cgtagcaggc gaggcaagcc cttatgatga1740 tttggctcat ggaacccacg tgacaggcac gatggtgggc tctgaacctg atggaacaaa1800 tcaaatcggt gtagcacctg gcgcaaaatg gattgctgtt aaagcgttct ctgaagatgg1860 cggcactgat gctgacattt tggaagctgg tgaatgggtt ttagcaccaa aggacgcgga1920 aggaaatccc cacccggaaa tggctcctga tgttgtcaat aactcatggg gagggggctc1980 tggacttgat gaatggtaca gagacatggt caatgcctgg cgttcggccg atattttccc2040 tgagttttca gcggggaata cggatctctt tattcccggc gggcctggtt ctatcgcaaa2100 tccggcaaac tatccagaat cgtttgcaac tggagcgact gagaattcca attccccatg2160 gagagaaaag aaaatcgcta atgttgatta ctttgaactt ctgcatattc ttgaatttaa2220 aaaggctgaa agagtaaaag attgtgctga aatattagag tataaacaaa atcgtgaaac2280 aggcgaaaga aagttgtatc gagtgtggtt ttgtaaatcc aggctttgtc caatgtgcaa2340 ctggaggaga gcaatgaaac atggcattca gtcacaaaag gttgttgctg aagttattaa2400 acaaaagcca acagttcgtt ggttgtttct cacattaaca gttaaaaatg tttatgatgg2460 cgaagaatta aataagagtt tgtcagatat ggctcaagga tttcgccgaa tgatgcaata2520
74.365/BE
293 taaaaaaatt aataaaaatc ttgttggttt tatgcgtgca acggaagtga caataaataa 2580 taaagataat tcttataatc agcacatgca tgtattggta tgtgtggaac caacttattt 2640 taagaataca gaaaactacg tgaatcaaaa acaatggatt caattttgga aaaaggcaat 2700 gaaattagac tatgatccaa atgtaaaagt tcaaatgatt cgaccgaaaa ataaatataa 2760 atcggatata caatcggcaa ttgacgaaac tgcaaaatat cctgtaaagg atacggattt 2820 tatgaccgat gatgaagaaa agaatttgaa acgtttgtct gatttggagg aaggtttaca 2880 ccgtaaaagg ttaatctcct atggtggttt gttaaaagaa atacataaaa aattaaacct 2940 tgatgacaca gaagaaggcg atttgattca tacagatgat gacgaaaaag ccgatgaaga 3000 tggattttct attattgcaa tgtggaattg ggaacggaaa aattatttta ttaaagagta 3060 gttcaacaaa cgggccatat tgttgtataa gtgatgaaat actgaattta aaacttagtt 3120 tatatgtggt aaaatgtttt aatcaagttt aggaggaatt aattatgaag tgtaatgaat 3180 gtaacagggt tcaattaaaa gagggaagcg tatcattaac cctataaact acgtctgccc 3240 tcattattgg agggtgaaat gtgaatacat cctattcaca atcgaattta cgacacaacc 3300 aaattttaat ttggctttgc attttatctt tttttagcgt attaaatgaa atggttttga 3360 acgtctcatt acctgatatt gcaaatgatt ttaataaacc acctgcgagt acaaactggg 3420 tgaacacagc ctttatgtta accttttcca ttggaacagc tgtatatgga aagctatctg 3480 atcaattagg catcaaaagg ttactcctat ttggaattat aataaattgt ttcgggtcgg 3540 taattgggtt tgttggccat tctttctttt ccttacttat tatggctcgt tttattcaag 3600 gggctggtgc agctgcattt ccagcactcg taatggttgt agttgcgcgc tatattccaa 3660 aggaaaatag gggtaaagca tttggtctta ttggatcgat agtagccatg ggagaaggag 3720 tcggtccagc gattggtgga atgatagccc attatattca ttggtcctat cttctactca 3780 ttcctatgat aacaattatc actgttccgt ttcttatgaa attattaaag aaagaagtaa 3840 ggataaaagg tcattttgat atcaaaggaa ttatactaat gtctgtaggc attgtatttt 3900 ttatgttgtt tacaacatca tatagcattt cttttcttat cgttagcgtg ctgtcattcc 3960 tgatatttgt aaaacatatc aggaaagtaa cagatccttt tgttgatccc ggattaggga 4020 aaaatatacc ttttatgatt ggagttcttt gtgggggaat tatatttgga acagtagcag 4080 ggtttgtctc tatggttcct tatatgatga aagatgttca ccagctaagt actgccgaaa 4140
74.365/BE
294 tcggaagtgt ggatacttgt ctgttagctt taatcgtatt caagtagctt ttttatcaga atcaaaggtt tacttttttc ctcaaaggga tttttttata cctattttta tcggggaaat tccgctcatg gagtattcaa ttttgctcac agtgggttac agaacgtttt tattgacgcc tgagtactca cagtgctgcc aggaccgaag tcgttgggaa tgcagcaatg ccggcaacaa ggcccttccg cggtatcatt gacggggagt aattattttc cctggaacaa tgagtgtcat tattttcggc tacattggtg 4200 tgatagaaga ggtcctttat acgtgttaaa catcggagtt acatttcttt 4260 tttaactgct tcctttcttt tagaaacaac atcatggttc atgacaatta 4320 tgttttaggt gggctttcgt tcaccaaaac agttatatca acaattgttt 4380 gaaacagcag gaagctggtg ctggaatgag tttgcttaac tttaccagct 4440 gggaacaggt attgcaattg taggtggttt attatccata cccttacttg 4500 gttacctatg gaagttgatc agtcaactta tctgtatagt aatttgttat 4560 aggaatcatt gtcattagtt ggctggttac cttgaatgta tataaacatt 4620 tttctaaatc gttaagggat caactttggg agagagttca aaattgatcc 4680 acagttcgaa gcggccgcaa ttcttgaaga cgaaagggcc tcgtgatacg 4740 taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt 4800 gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 4860 agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 4920 catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 4980 ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 5040 atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 5100 ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 5160 gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 5220 ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 5280 ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 5340 gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 5400 ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 5460 gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 5520 ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 5580 gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 5640 gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 5700 caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 5760
74.365/BE
295 actgattaag aaaacttcat caaaatccct aggatcttct accgctacca aactggcttc ccaccacttc agtggctgct accggataag gcgaacgacc tcccgaaggg cacgagggag cctctgactt cgccagcaac ctttcctgcg taccgctcgc gcgcctgatg cactctcagt ctacgtgact cgggcttgtc atgtgtcaga tcagcgtggt agtttctcca ttttcctgtt tgataccgat ggttactgga aaatcactca cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 5820 ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 5880 taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 5940 tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 6000 gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 6060 agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 6120 aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 6180 gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 6240 gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 6300 tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 6360 agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 6420 cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 6480 gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 6540 gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 6600 ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 6660 cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 6720 cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg 6780 acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagtatacac tccgctatcg 6840 gggtcatggc tgcgccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga 6900 tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc 6960 ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga ggcagctgcg gtaaagctca 7020 cgtgaagcga ttcacagatg tctgcctgtt catccgcgtc cagctcgttg 7080 gaagcgttaa tgtctggctt ctgataaagc gggccatgtt aagggcggtt 7140 tggtcacttg atgcctccgt gtaaggggga atttctgttc atgggggtaa 7200 gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 7260 acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 7320 gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 7380
74.365/BE
296 gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 7440 tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 7500 acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 7560 cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 7620 cccgtggcca ggacccaacg ctgcccgaga tgcgccgcgt gcggctgctg gagatggcgg 7680 acgcgatgga tatgttctgc caagggttgg tttgcgcatt cacagttctc cgcaagaatt 7740 gattggctcc aattcttgga gtggtgaatc cgttagcgag gtgccgccgg cttccattca 7800 ggtcgaggtg gcccggctcc atgcaccgcg acgcaacgcg gggaggcaga caaggtatag 7860 ggcggcgcct acaatccatg ccaacccgtt ccatgtgctc gccgaggcgg cataaatcgc 7920 cgtgacgatc agcggtccag tgatcgaagt taggctggta agagccgcga gcgatccttg 7980 aagctgtccc tgatggtcgt catctacctg cctggacagc atggcctgca acgcgggcat 8040 cccgatgccg ccggaagcga gaagaatcat aatggggaag gccatccagc ctcgcgtc 8098 <210> 80 <211> 4450 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Description of Artificial Sequence: Recombinant pAN443 plasmid < 400> 80 ccatcgaatg gccagatgat taattcctaa tttttgttga cactctatca ttgatagagt 60 tattttacca ctccctatca gtgatagaga aaagtgaaat gaatagttcg acaaaaatct 120 agattagaaa ggaggattta aatatgagac agattactga tatttcacag ctgaaagaag 180 ccataaaaca ataccattca gagggcaagt caatcggatt tgttccgacg atggggtttc 240 tgcatgaggg gcatttaacc ttagcagaca aagcaagaca agaaaacgac gccgttatta 300 tgagtatttt tgtgaatcct gcacaattcg gccctaatga agattttgaa gcatatccgc 360 gcgatattga gcgggatgca gctcttgcag aaaacgccgg agtcgatatt ctttttacgc 420 cagatgctca tgatatgtat cccggtgaaa agaatgtcac gattcatgta gaaagacgca 480 cagacgtgtt atgcgggcgc tcaagagaag gacattttga cggggtcgcg atcgtactga 540 cgaagctttt caatctagtc aagccgactc gtgcctattt cggtttaaaa gatgcgcagc 600
74.365/BE
297
aggtagctgt tgttgatggg ttaatcagcg acttcttcat ggatattgaa ttggttcctg 660
tcgatacggt cagagaggaa gacggcttag ccaaaagctc tcgcaatgta tacttaacag 720
ctgaggaaag aaaagaagcg cctaagctgt atcgggccct tcaaacaagt gcggaacttg 780
tccaagccgg tgaaagagat cctgaagcgg tgataaaagc tgcaaaagat atcattgaaa 840
cgactagcgg aaccatagac tatgtagagc tttattccta tccggaactc gagcctgtga 900
atgaaattgc tggaaagatg attctcgctg ttgcagttgc tttttcaaaa gcgcgtttaa 960
tagataatat cattattgat attcgtagaa aggaggtgaa ttaatatgta tcgtacgatg 1020
atgagcggca aacttcacag ggcaactgtt acggaagcaa acctgaacta tgtgggaagc 1080
attacaattg atgaagatct cattgatgct gtgggaatgc ttcctaatga aaaagtacaa 1140
attgtgaata ataataatgg agcacgtctt gaaacgtata ttattcctgg taaacgggga 1200
agcggcgtca tatgcttaaa cggtgcagcc gcacgccttg tgcaggaagg agataaggtc 1260
attattattt cctacaaaat gatgtctgat caagaagcgg caagccatga gccgaaagtg 1320
gctgttctga atgatcaaaa caaaattgaa caaatgctgg ggaacgaacc agcccgtaca 1380
attttgtaaa ggatcccccg gggatccctc gaggtcgacc tgcaggggga ccatggtctc 1440
agcgcttgga gccacccgca gttcgaaaaa taataagctt gacctgtgaa gtgaaaaatg 1500
gcgcacattg tgcgacattt tttttgtctg ccgtttaccg ctactgcgtc acggatctcc 1560
acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg 1620
ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca 1680
cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta 1740
gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc 1800
catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg 1860
gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat 1920
aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta 1980
acgcgaattt taacaaaata ttaacgctta caatttcagg tggcactttt cggggaaatg 2040
tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga 2100
gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac 2160
atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc 2220
74.365/BE
298 cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact cagtcacaga aaagcatctt acggatggca taaccatgag tgataacact gcggccaact agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg tgatagactg gatggaggcg gataaagttg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag cagcactggg gccagatggt aagccctccc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga attggtagga attaatgatg tctcgtttag agctgcttaa tgaggtcgga atcgaaggtt gtgtagagca gcctacattg tattggcatg tagccattga gatgttagat aggcaccata ggcaagattt tttacgtaat aacgctaaaa atggagcaaa agtacattta ggtacacggc atcaattagc ctttttatgc caacaaggtt gcgcagtggg gcattttact ttaggttgcg aagaagaaag ggaaacacct actactgata aattatttga tcaccaaggt gcagagccag gcggattaga aaaacaactt aaatgtgaaa cgtgatggta acttcactag tttaaaagga tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca 2280 ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc 2340 gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg 2400 attctcagaa tgacttggtt gagtactcac 2460 tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca 2520 tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg 2580 atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac 2640 agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg 2700 aactacttac tctagcttcc cggcaacaat 2760 caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg 2820 ccggtgagcg tggctctcgc ggtatcattg 2880 gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc 2940 tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc 3000 ataaaagtaa agtgattaac agcgcattag 3060 taacaacccg taaactcgcc cagaagctag 3120 taaaaaataa gcgggctttg ctcgacgcct 3180 ctcacttttg ccctttagaa ggggaaagct 3240 gttttagatg tgctttacta agtcatcgcg 3300 ctacagaaaa acagtatgaa actctcgaaa 3360 tttcactaga gaatgcatta tatgcactca 3420 tattggaaga tcaagagcat caagtcgcta 3480 gtatgccgcc attattacga caagctatcg 3540 ccttcttatt cggccttgaa ttgatcatat 3600 gtgggtctta aaagcagcat aacctttttc 3660 tctaggtgaa gatccttttt gataatctca 3720 tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 3780 tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 3840
74.365/BE
299 aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 3900 aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt 3960 taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt 4020 taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 4080 agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct 4140 tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 4200 cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag 4260 agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 4320 gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 4380 aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca 4440 tgacccgaca 4450 <210> 81 <211> 10212 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Description of Artificial Sequence: Recombinant pAN251 plasmid < 400> 81 gcggccgcta aaaagagctt gaggatttgc ggagtgaaaa tcagacattg cggaatcagc60 tagagatgac agaagaggat tacaaggcac tgatcgatat catggatcgg gccagaaaaa120 tggttgtttc gaaggaagac ggaagaatga aaaaagcggc tcaagaaacg taaagaaacg180 cctgaaatga accggcccta tagtaagaat aggccggttg ttttgatttc tatgcagact240 ctcccggtgt catttcgcga tccatatcag gatgccagat gagcgggtct tcccctttgt300 cccgcgccat atcatactta acagttttaa agttcatttt gttccaaaat tccgctgatt360 tcattctcgg atttgtccgg atcggcattt tgaatgattt tgcaaattca accaaggctc420 tcccgtatcc cctgttctgg tagcccggaa gaacctcaag cttccacagc tccaaataat480 cctggcggtt gtcaaaatag ggattcgatt tgccgttaac ttgatacaga ctcattcgtg540 ctacaagttt atcgccaaaa taaatcccgt aaaaaggcga ggtgctgtca ttttcaataa600 tattatcctg aagttcttca agcattgaaa gctcctgaat gccgtattct ttgaatttct660
74.365/BE
300 tgaattcttc cagcgtttta tagttgataa gcagacgttc tacctttgtc aaacaaatct720 ccccctttgt tgtttctaca tatattgtaa acgctttatt taaaaaatcc aaatatttaa780 actttaattt taagcacatg ggatctttga gaagtaattt cttcttactt ctgctatgat840 aatacgtaaa tgcgtcgacc gaaacagcag ttataaggca tgaagctgtc cggtttttgc900 aaaagtggct gtgactgtaa aaagaaatcg aaaaagaccg ttttgtgtga aaacggtctt960 tttgtttcct tttaaccaac tgccataact cgaggcctac ctagcttcca agaaagatat1020 cctaacagca caagagcgga aagatgtttt gttctacatc cagaacaacc tctgctaaaa1080 ttcctgaaaa attttgcaaa aagttgttga ctttatctac aaggtgtggt ataataatct1140 taacaacagc aggacgctct agaggaggag acatcatgaa aattggaatt atcggcggag1200 gctccgttgg tcttttatgc gcctattatt tgtcacttta tcacgacgtg actgttgtga1260 cgaggcggca agaacaggct gcggccattc agtctgaagg aatccggctt tataaaggcg1320 gggaggaatt cagggctgat tgcagtgcgg acacgagtat caattcggac tttgacctgc1380 ttgtcgtgac agtgaagcag catcagcttc aatctgtttt ttcgtcgctt gaacgaatcg1440 ggaagacgaa tatattattt ttgcaaaacg gcatggggca tatccacgac ctaaaagact1500 ggcacgttgg ccattccatt tatgttggaa tcgttgagca cggagctgta agaaaatcgg1560 atacagctgt tgatcataca ggcctaggtg cgataaaatg gagcgcgttc gacgatgctg1620 aaccagaccg gctgaacatc ttgtttcagc ataaccattc ggattttccg atttattatg1680 agacggattg gtaccgtctg ctgacgggca agctgattgt aaatgcgtgt attaatcctt1740 taactgcgtt attgcaagtg aaaaatggag aactgctgac aacgccagct tatctggctt1800 ttatgaagct ggtatttcag gaggcatgcc gcattttaaa acttgaaaat gaagaaaagg1860 cttgggagcg ggttcaggcc gtttgtgggc aaacgaaaga gaatcgttca tcaatgctgg1920 ttgacgtcat tggaggccgg cagacggaag ctgacgccat tatcggatac ttattgaagg1980 aagcaagtct tcaaggtctt gatgccgtcc acctagagtt tttatatggc agcatcaaag2040 cattggagcg aaatacaaac aaagtctttt gagctttttc ggtaacatgc tatactcatt2100 tcggatcact aactatttat tggagaaagg aagttctaga agatgcagct aactgaactt2160 tccatcaaaa atcagaatgt gtttgtacag cactatatag atggcaaaga agaaatgtct2220 tctttttttg attacagtat tcatcataag gacatgtggc gcgaaagact ggaagactta2280
74.365/3E
301
tcttcccggt ttttcgcaag agaggaattg gcggcgtact taacctctta ccataataaa 2340
ttcggttcaa gtgcgatgca gtctgctatt gagaagctga aggacccgtc aagtgccgct 2400
gtagtcggcg gacagcaggc aggactttta acaggaccgc tttacaccat acataaaatc 2460
atttcaatca ttgttttagc aaagcaacaa gaaaaggaac tgcaagtgcc tgtcatacca 2520
atcttctggg tggctggaga agaccacgat ttggatgaga ttaattttgt tcacacatct 2580
gaagagaatg ggcctgtgaa aaaaaagctg cctcagtctt attggaagaa atcatcagca 2640
gcgagtacat cgcttgatca ggaaaagtgt gccgcgtgga tagatgatgt ttttgccgct 2700
tttgaagaaa cagaccatac gaatacactt ctcgacaatg tgaaacgatg tttaagggaa 2760
tctgttacgt ttactgactt ctttgaactg ctgatcgcgg atttgttcca agaagagggc 2820
ttagttttat taaattctgg ggatcctgtt ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga 2880
tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct ggcggcagta 2940
gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg 3000
gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag 3060
gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg 3120
agtaggacaa atccgccggg agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg 3180
cgggcaggac gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc catcctgacg 3240
gatggccttt ttgcgtttct acaaactctt ggtacccaga aaaagcggca aaagcggctg 3300
ttaaaaaagc gaaatcgaag aagctgtctg ccgctaagac ggaatatcaa aagcgttctg 3360
ctgttgtgtc atctttaaaa gtcacagccg atgaatccca gcaagatgtc ctaaaatact 3420
tgaacaccca gaaagataaa ggaaatgcag accaaattca ttcttattat gtggtgaacg 3480
ggattgctgt tcatgcctca aaagaggtta tggaaaaagt ggtgcagttt cccgaagtgg 3540
aaaaggtgct tcctaatgag aaacggcagc tttttaagtc atcctcccca tttaatatga 3600
aaaaagcaca gaaagctatt aaagcaactg acggtgtgga atggaatgta gaccaaatcg 3660
atgccccaaa agcttgggca cttggatatg atggaactgg cacggttgtt gcgtccattg 3720
ataccggggt ggaatggaat catccggcat taaaagagaa atatcgcgga tataatccgg 3780
aaaatcctaa tgagcctgaa aatgaaatga actggtatga tgccgtagca ggcgaggcaa 3840
gcccttatga tgatttggct catggaaccc acgtgacagg cacgatggtg ggctctgaac 3900
74.365/BE
302 ctgatggaac aaatcaaatc ggtgtagcac ctggcgcaaa atggattgct gttaaagcgt 3960 tctctgaaga tggcggcact gatgctgaca ttttggaagc tggtgaatgg gttttagcac 4020 caaaggacgc ggaaggaaat ccccacccgg aaatggctcc tgatgttgtc aataactcat 4080 ggggaggggg ctctggactt gatgaatggt acagagacat ggtcaatgcc tggcgttcgg 4140 ccgatatttt ccctgagttt tcagcgggga atacggatct ctttattccc ggcgggcctg 4200 gttctatcgc aaatccggca aactatccag aatcgtttgc aactggagcg actgagaatt 4260 ccaattcccc atggagagaa aagaaaatcg ctaatgttga ttactttgaa cttctgcata 4320 ttcttgaatt taaaaaggct gaaagagtaa aagattgtgc tgaaatatta gagtataaac 4380 aaaatcgtga aacaggcgaa agaaagttgt atcgagtgtg gttttgtaaa tccaggcttt 4440 gtccaatgtg caactggagg agagcaatga aacatggcat tcagtcacaa aaggttgttg 4500 ctgaagttat taaacaaaag ccaacagttc gttggttgtt tctcacatta acagttaaaa 4560 atgtttatga tggcgaagaa ttaaataaga gtttgtcaga tatggctcaa ggatttcgcc 4620 gaatgatgca atataaaaaa attaataaaa atcttgttgg ttttatgcgt gcaacggaag 4680 tgacaataaa taataaagat aattcttata atcagcacat gcatgtattg gtatgtgtgg 4740 aaccaactta ttttaagaat acagaaaact acgtgaatca aaaacaatgg attcaatttt 4800 ggaaaaaggc aatgaaatta gactatgatc caaatgtaaa agttcaaatg attcgaccga 4860 aaaataaata taaatcggat atacaatcgg caattgacga aactgcaaaa tatcctgtaa 4920 aggatacgga ttttatgacc gatgatgaag aaaagaattt gaaacgtttg tctgatttgg 4980 aggaaggttt acaccgtaaa aggttaatct cctatggtgg tttgttaaaa gaaatacata 5040 aaaaattaaa ccttgatgac acagaagaag gcgatttgat tcatacagat gatgacgaaa 5100 aagccgatga agatggattt tctattattg caatgtggaa ttgggaacgg aaaaattatt 5160 ttattaaaga gtagttcaac aaacgggcca tattgttgta taagtgatga aatactgaat 5220 ttaaaactta gtttatatgt ggtaaaatgt tttaatcaag tttaggagga attaattatg 5280 aagtgtaatg aatgtaacag ggttcaatta aaagagggaa gcgtatcatt aaccctataa 5340 actacgtctg ccctcattat tggagggtga aatgtgaata catcctattc acaatcgaat 5400 ttacgacaca accaaatttt aatttggctt tgcattttat ctttttttag cgtattaaat 5460 gaaatggttt tgaacgtctc attacctgat attgcaaatg attttaataa accacctgcg 5520
74.365/BE
303 agtacaaact gggtgaacac agcctttatg ttaacctttt ccattggaac agctgtatat 5580 ggaaagctat ctgatcaatt aggcatcaaa aggttactcc tatttggaat tataataaat 5640 tgtttcgggt cggtaattgg gtttgttggc cattctttct tttccttact tattatggct 5700 cgttttattc aaggggctgg tgcagctgca tttccagcac tcgtaatggt tgtagttgcg 5760 cgctatattc caaaggaaaa taggggtaaa gcatttggtc ttattggatc gatagtagcc 5820 atgggagaag gagtcggtcc agcgattggt ggaatgatag cccattatat tcattggtcc 5880 tatcttctac tcattcctat gataacaatt atcactgttc cgtttcttat gaaattatta 5940 aagaaagaag taaggataaa aggtcatttt gatatcaaag gaattatact aatgtctgta 6000 ggcattgtat tttttatgtt gtttacaaca tcatatagca tttcttttct tatcgttagc 6060 gtgctgtcat tcctgatatt tgtaaaacat atcaggaaag taacagatcc ttttgttgat 6120 cccggattag ggaaaaatat accttttatg attggagttc tttgtggggg aattatattt 6180 ggaacagtag cagggtttgt ctctatggtt ccttatatga tgaaagatgt tcaccagcta 6240 agtactgccg aaatcggaag tgtaattatt ttccctggaa caatgagtgt cattattttc 6300 ggctacattg gtgggatact tgttgataga agaggtcctt tatacgtgtt aaacatcgga 6360 gttacatttc tttctgttag ctttttaact gcttcctttc ttttagaaac aacatcatgg 6420 ttcatgacaa ttataatcgt atttgtttta ggtgggcttt cgttcaccaa aacagttata 6480 tcaacaattg tttcaagtag cttgaaacag caggaagctg gtgctggaat gagtttgctt 6540 aactttacca gctttttatc agagggaaca ggtattgcaa ttgtaggtgg tttattatcc 6600 atacccttac ttgatcaaag gttgttacct atggaagttg atcagtcaac ttatctgtat 6660 agtaatttgt tattactttt ttcaggaatc attgtcatta gttggctggt taccttgaat 6720 gtatataaac attctcaaag ggatttctaa atcgttaagg gatcaacttt gggagagagt 6780 tcaaaattga tccttttttt ataacagttc gaagcggccg caattcttga agacgaaagg 6840 gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt 6900 caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac 6960 attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa 7020 aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat 7080 tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc 7140
74.365/BE
304 agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga 7200 gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg 7260 cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc 7320 agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag 7380 taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc 7440 tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg 7500 taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg 7560 acaccacgat gcctgcagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac 7620 ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac 7680 cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg 7740 agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg 7800 tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg 7860 agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac 7920 tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg 7980 ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 8040 tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 8100 aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 8160 tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 8220 agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 8280 taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 8340 caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 8400 agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 8460 aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 8520 gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 8580 tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 8640 gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 8700 ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct 8760
74.365/BE
305
ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg 8820
aggaagcgga agagcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 8880
accgcatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtata 8940
cactccgcta tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc 9000
tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt 9060
ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagct 9120
gcggtaaagc tcatcagcgt ggtcgtgaag cgattcacag atgtctgcct gttcatccgc 9180
gtccagctcg ttgagtttct ccagaagcgt taatgtctgg cttctgataa agcgggccat 9240
gttaagggcg gttttttcct gtttggtcac ttgatgcctc cgtgtaaggg ggaatttctg 9300
ttcatggggg taatgatacc gatgaaacga gagaggatgc tcacgatacg ggttactgat 9360
gatgaacatg cccggttact ggaacgttgt gagggtaaac aactggcggt atggatgcgg 9420
cgggaccaga gaaaaatcac tcagggtcaa tgccagcgct tcgttaatac agatgtaggt 9480
gttccacagg gtagccagca gcatcctgcg atgcagatcc ggaacataat ggtgcagggc 9540
gctgacttcc gcgtttccag actttacgaa acacggaaac cgaagaccat tcatgttgtt 9600
gctcaggtcg cagacgtttt gcagcagcag tcgcttcacg ttcgctcgcg tatcggtgat 9660
tcattctgct aaccagtaag gcaaccccgc cagcctagcc gggtcctcaa cgacaggagc 9720
acgatcatgc gcacccgtgg ccaggaccca acgctgcccg agatgcgccg cgtgcggctg 9780
ctggagatgg cggacgcgat ggatatgttc tgccaagggt tggtttgcgc attcacagtt 9840
ctccgcaaga attgattggc tccaattctt ggagtggtga atccgttagc gaggtgccgc 9900
cggcttccat tcaggtcgag gtggcccggc tccatgcacc gcgacgcaac gcggggaggc 9960
agacaaggta tagggcggcg cctacaatcc atgccaaccc gttccatgtg ctcgccgagg 10020
cggcataaat cgccgtgacg atcagcggtc cagtgatcga agttaggctg gtaagagccg 10080
cgagcgatcc ttgaagctgt ccctgatggt cgtcatctac ctgcctggac agcatggcct 10140
gcaacgcggg catcccgatg ccgccggaag cgagaagaat cataatgggg aaggccatcc 10200
agcctcgcgt eg 10212
74.365/BE
306 <210> 82 <211> 10432 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Description of Artificial Sequence: Recombinant pAN267 plasmid < 400> 82 aacaaaattc tccagtcttc acatcggttt gaaaggagga agcggaagaa tgaagtaaga 60 gggatttttg actccgaagt aagtcttcaa aaaatcaaat aaggagtgtc aagaatgttt 120 gcaaaacgat tcaaaacctc tttactgccg ttattcgctg gatttttatt gctgtttcat 180 ttggttctgg caggaccggc ggctgcgagt gctgaaacgg cgaacaaatc gaatgagctt 240 acagcaccgt cgatcaaaag cggaaccatt cttcatgcat ggaattggtc gttcaatacg 300 ttaaaacaca atatgaagga tattcatgat gcaggatata cagccattca gacatctccg 360 attaaccaag taaaggaagg gaatcaagga gataaaagca tgtcgaactg gtactggctg 420 tatcagccga catcgtatca aattggcaac cgttacttag gtactgaaca agaatttaaa480 gaaatgtgtg cagccgctga agaatatggc ataaaggtca ttgttgacgc ggtcatcaat540 cataccacca gtgattatgc cgcgatttcc aatgaggtta agagtattcc aaactggaca600 catggaaaca cacaaattaa aaactggtct gatcgaaata gtacataatg gatttcctta660 cgcgaaatac gggcagacat ggcctgcccg gttattatta tttttgacac cagaccaact720 ggtaatggta gcgaccggcg ctcaggatcg tctcggtacc aagagtttgt agaaacgcaa780 aaaggccatc cgtcaggatg gccttctgct taatttgatg cctggcagtt tatggcgggc840 gtcctgcccg ccaccctccg ggccgttgct tcgcaacgtt caaatccgct cccggcggat900 ttgtcctact caggagagcg ttcaccgaca aacaacagat aaaacgaaag gcccagtctt960 tcgactgagc ctttcgtttt atttgatgcc tggcagttcc ctactctcgc atggggagac1020 cccacactac catcggcgct acggcgtttc acttctgagt tcggcatggg gtcaggtggg1080 accaccgcgc tactgccgcc aggcaaattc tgttttatca gaccgcttct gcgttctgat1140 ttaatctgta tcaggctgaa aatcttctct catccgccaa aacaggatcc atcacgaagc1200 gtcgtatcga aaaaattaat tttgcgcaac ggagaccacc gcttccttct tcttgccttg1260 tttcacaaac ggcatcattt cacgaagctt tcttcccact acttcgattt gatgttcgtt1320 ctcgcttgca ttgatagcgt tgaaacgagg acggtttact tggttttcga cgatccactc1380
74.365/BE
307 ttttgcgaat gtaccgtttt ggatatcttt taatacttct ttcatagatt cttttacttt1440 ggcgtccaca acgcgagggc ctgatacgaa atctccccac tgtgctgtgt cagagattga1500 atatctcatt cctgcaagtc cttcttcgta cataaggtct acgattaatt tcagctcatg1560 aagacactcg aagtatgcaa gttcaggctg ataacctgct tcagttaagg tttcaaatcc1620 ggctttgaca agcgcgctta atccgccgca aagaactgct tgctcaccga acaaatctgt1680 ttctgtttct tctttaaatg tcgtttctaa tacgcccgct cttgcgccgc cgattccttt1740 agcataagcg agggctttgt ctcttgcttc tccagtcaca tcttgataga ttgcgaacaa1800 tgcaggtacg ccagctcctt gctcatatgt tcttcttacc aagtgtcccg ggcctttagg1860 ggccactaag aatacatcta catccgccgg aggaacaatt tgatggaaat gcacgttaaa1920 tccatgagcg aatactaatg attttcctgc tgtcaattca tctttgattt cagcttcgta1980 tactttttgc tgctgctcat ccggaagcag aaccatgatg atttcggctt gggctgccgc2040 ttcttttact gaaaatactt tatgtccgtc ttcttgggct tgagtgaaag attttccttg2100 tctaacaccg acgatcacgt ctactccgct ttctttaagg ttcagggcat gtgcgtggcc2160 ttgcgaaccg tacccgataa ccgctactgt ttttccagcc aatacgttct ctttgatatc2220 accgttataa tatactttta ccatttcaat ctctcccttg ttatgtttta tacaatagat2280 attgttttat tggatgacgc cttttgctgg ttcccctcgc aaaagccgtt gtacctgttc2340 tcgcgatttc tttaatgcca taaggtttta ataactcaat aagcgcttca attttgttag2400 attcacctgt cacctgaaca acgatgctgt ctctgctgac atcaacgaca gaggctctaa2460 acggttctat gattccatta atctctgttc ttgttgaagg tgcggagaca accttgatta2520 aggccagctc cctctggaca atcgattgat ttgtgatgtc tgtgactttc agcacatcaa2580 tctgtttgtt gagctgtttc gttaactgtt caacatcatt ttcaccttca acatgaacga2640 cgaaggtgat tctggaaacg ccggctgttt ctgtgtgtcc aactgtaatg ctttcaatgt2700 tgtaatgcct ttttgtgaat agaccggtga tccggtttaa caccccggag cggttcacca2760 cagtcaatgt gataattctt ttcaaggttt cacccccacc atttcatgca gccctttccc2820 cggagccacc atcgggaata ctttttcttc gctggcaacc cgcacgtcaa tgacaacagg2880 ttctcttgat gttaatgcct cttccagctt ttcctttgct tccgcttctg atgaaattct2940 gatgccttta atgccgtatg cttcggacaa tttgacgaag tcaggctgag aagcgaattt3000
74.365/BE
308 agattctgaa taacgttctt catagaaaat agcgttattt aaaatcacta ccttgaccgg ttgaagcgtc atttggaatc cgccgtctcc ggccagctgt gcgccgatcg ccgccggaag cgtgacccat ttatctgctt tttggaacgg gcctacatcc gttgcgacaa tggcctctcc tttctgaggt ttaaaacctt cttcttcatt ccattctgcg agctgttttt tccattcgct cagctcctgc aggacaattt tgctgtctcc tccgatttca gctggatcaa tatcgatgtg caggtttcct gtgacacggt catcaaaacg atgaagggcc atattggctg tataagtacc atggtcagcc gggaagcctc cgagccccaa ttcagcataa ttttttaatt cttctgacgc gatcaccggt tttttcgcac tgctcacggc cggctctgtt gtcggctggt atcccgggag ttcaattgtt gctacatctt tcggaatatc tgcaatatgg aacgcttctt taatgatgcg gctgtgtttt gttactggca tcgtaatccc cccgattaca gaggttgcta cctgccctgt ggcatcagca aggcctgtaa caaggtttgt acccggtttt ccggagaccc ttgcgtatcc acggggaagg atatgtacca accctgaatt cccgcccgga taaccgaaga tcatttctac taatgctccg ctcatcgtct gtgtacattc ccccatttta tctcctcctc tagagcgtcc tgtagataaa gtcaacaact ttttgcaaaa ttcctgccac tgtctgacca ttccgagaca 3060 aagatttaat tcgcgaataa catcgagttc 3120 gacaaccgcg acaacagtag catctttttc 3180 accgaatccc atcgttccaa gtccgcctga 3240 ataaaattgc gctgaccaca tttgatgctg 3300 ttttgtaaat tgatgaatat attcaatcaa 3360 atctacatac cagagcggat actcttcttt 3420 tgaatcgctt tgtttgccgt cttgtttgat 3480 gactacagga atctgtgttt tcatgatttt 3540 ggctatcttt gcgtttctgg caaagtgttt 3600 ggcgccgata ctgattaata gatcacattc 3660 gtgcattccc gccatcccta ggaaaagcgg 3720 aagggtgtgt gccacaggga tttgctgctg 3780 ttttccgtgc agtacgcccg cacccgccag 3840 ttccacaagc ttgcggatct gcaaataatt 3900 attcatctca tgatcgtagc tgaattctcc 3960 aatcaataca ggtccgggtc ttccagttgt 4020 cggcagatct tccggctggc gaacctggta 4080 taaaatgtct gcttcctgaa atgcatcgct 4140 aaagacgact aacggcaatg aatcaatcat 4200 cgctcccggc cctgacgtgg caatgacgac 4260 ctccgctgca tgaattgctc cttgttcgtg 4320 gtatagctta tcgtaaatcg gaagcacagc 4380 tttctctttt tttaatgatt caatcagcat 4440 ggcagatgct gaatccacct gtacattagt 4500 tgctgttgtt aagattatta taccacacct 4560 tttttcagga attttagcag aggttgttct 4620
74.365/BE
309 ggatgtagaa caaaacatct ttccgctctt gtgctgttag gatatctttc ttggaagcta4680 ggtaggcctc gagttatggc agttggttaa aaggaaacaa aaagaccgtt ttcacacaaa4740 acggtctttt tcgatttctt tttacagtca cagccacttt tgcaaaaacc ggacagcttc4800 atgccttata actgctgttt cggtcgacga agcggccgcc gtttaaacga attcctgcag4860 ctggcgaatg gcgattttcg ttcgtgaata catgttataa taactataac taataacgta4920 acgtgactgg caagagatat ttttaaaaca atgaataggt ttacacttac tttagtttta4980 tggaaatgaa agatcatatc atatataatc tagaataaaa ttaactaaaa taattattat5040 ctagataaaa aatttagaag ccaatgaaat ctataaataa actaaattaa gtttatttaa5100 ttaacaacta tggatataaa ataggtacta atcaaaatag tgaggaggat atatttgaat5160 acatacgaac aaattaataa agtgaaaaaa atacttcgga aacatttaaa aaataacctt5220 attggtactt acatgtttgg atcaggagtt gagagtggac taaaaccaaa tagtgatctt5280 gactttttag tcgtcgtatc tgaaccattg acagatcaaa gtaaagaaat acttatacaa5340 aaaattagac ctatttcaaa aaaaatagga gataaaagca acttacgata tattgaatta 5400 acaattatta ttcagcaaga aatggtaccg tggaatcatc ctcccaaaca agaatttatt 5460 tatggagaat ggttacaaga gctttatgaa caaggataca ttcctcagaa ggaattaaat 5520 tcagatttaa ccataatgct ttaccaagca aaacgaaaaa ataaaagaat atacggaaat 5580 tatgacttag aggaattact acctgatatt ccattttctg atgtgagaag agccattatg 5640 gattcgtcag aggaattaat agataattat caggatgatg aaaccaactc tatattaact 5700 ttatgccgta tgattttaac tatggacacg ggtaaaatca taccaaaaga tattgcggga 5760 aatgcagtgg ctgaatcttc tccattagaa catagggaga gaattttgtt agcagttcgt 5820 agttatcttg gagagaatat tgaatggact aatgaaaatg taaatttaac tataaactat 5880 ttaaataaca gattaaaaaa attataaaaa aattgaaaaa atggtggaaa cacttttttc 5940 aatttttttg ttttattatt taatatttgg gaaatattca ttctaattgg taatcagatt 6000 ttagaaaaca ataaaccctt gcataggggg atcgatatcc gtttaggctg ggcggtgata 6060 gcttctcgtt caggcagtac gcctcttttc ttttccagac ctgagggagg cggaaatggt 6120 gtgaggttcc cggggaaaag ccaaataggc gatcgcggga gtgctttatt tgaagatcag 6180 gctatcactg cggtcaatag atttcacaat gtgatggctg gacagcctga ggaactctcg 6240
74.365/BE
310 aacccgaatg gaaacaacca gatatttatg aatcagcgcg gctcacatgg cgttgtgctg 6300 gcaaatgcag gttcatcctc tgtctctatc aatacggcaa caaaattgcc tgatggcagg 6360 tatgacaata aagctggagc gggttcattt caagtgaacg atggtaaact gacaggcacg 6420 atcaatgcca ggtctgtagc tgtgctttat cctgatgata ttgcaaaagc gcctcatgtt 6480 ttccttgaga attacaaaac aggtgtaaca cattctttca atgatcaact gacgattacc 6540 ttgcgtgcag atgcgaatac aacaaaagcc gtttatcaaa tcaataatgg accagacgac 6600 aggcgtttaa ggatggagat caattcacaa tcggaaaagg agatccaatt tggcaaaaca 6660 tacaccatca tgttaaaagg aacgaacagt gatggtgtaa cgaggaccga gaaatacagt 6720 tttgttaaaa gagatccagc gtcggccaaa accatcggct atcaaaatcc gaatcattgg 6780 agccaggtaa atgcttatat ctataaacat gatgggagcc gagtaattga attgaccgga 6840 tcttggcctg gaaaaccaat gactaaaaat gcagacggaa tttacacgct gacgctgcct 6900 gcggacacgg atacaaccaa cgcaaaagtg atttttaata atggcagcgc ccaagtgccc 6960 ggtcagaatc agcctggctt tgattacgtg ctaaatggtt tatataatga ctcgggctta 7020 agcggttctc ttccccattg agggcaaggc tagacgggac ttaccgaaag aaaccatcaa 7080 tgatggtttc ttttttgttc ataaatcaga caaaactttt ctcttgcaaa agtttgtgaa 7140 gtgttgcaca atataaatgt gaaatacttc acaaacaaaa agacatcaaa gagaaacata 7200 ccctgcaagg atgctgatat tgtctgcatt tgcgccggag caaaccaaaa acctggtgag 7260 acacgccttg aattagtaga aaagaacttg aagattttca aaggcatcgt tagtgaagtc 7320 atggcgagcg gatttgacgg cattttctta gtcgggcggc acctcgctaa cggattcacc 7380 actccaagaa ttggagccaa tcaattcttg cggagaactg tgaatgcgca aaccaaccct 7440 tggcagaaca tatccatcgc gtccgccatc tccagcagcc gcacgcggcg catctcgggc 7500 agcgttgggt cctggccacg ggtgcgcatg atcgtgctcc tgtcgttgag gacccggcta 7560 ggctggcggg gttgccttac tggttagcag aatgaatcac cgatacgcga gcgaacgtga 7620 agcgactgct gctgcaaaac gtctgcgacc tgagcaacaa catgaatggt cttcggtttc 7680 cgtgtttcgt aaagtctgga aacgcggaag tcagcgccct gcaccattat gttccggatc 7740 tgcatcgcag gatgctgctg gctaccctgt ggaacaccta catctgtatt aacgaagcgc 7800 tggcattgac cctgagtgat ttttctctgg tcccgccgca tccataccgc cagttgttta 7860
74.365/BE
311 ccctcacaac gttccagtaa ccgggcatgt tcatcatcag taacccgtat cgtgagcatc7920 ctctctcgtt tcatcggtat cattaccccc atgaacagaa atccccctta cacggaggca7980 tcagtgacca aacaggaaaa aaccgccctt aacatggccc gctttatcag aagccagaca8040 ttaacgcttc tggagaaact caacgagctg gacgcggatg aacaggcaga catctgtgaa8100 tcgcttcacg accacgctga tgagctttac cgcagctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac8160 ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat8220 gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca8280 gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag8340 agcagattgt actgagagtg caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga8400 gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg8460 ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat8520 caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta8580 aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 8640 atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 8700 cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 8760 ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 8820 gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 8880 accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 8940 cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 9000 cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 9060 gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 9120 aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 9180 aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 9240 actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 9300 taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 9360 gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 9420 tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 9480
74.365/BE
312 ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 9540 accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 9600 agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 9660 acgttgttgc cattgctgca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 9720 tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 9780 cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 9840 tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 9900 ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 9960 gctcttgccc ggcgtcaaca cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 10020 tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 10080 ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 10140 gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 10200 cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 10260 gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 10320 ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga 10380 cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tcttcaagaa tt 10432 <210> 83 <211> 4191 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Description of Artificial Sequence: Recombinant pAN263 plasmid < 400> 83 ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag cccggatccg60 aaagaagagg atatcccggt tttacagaag gcattggatg atccaaaggt gtccatcaga120 agacaggctg ttgtgtactt aggaatgatt gaaacacctg atgttcttcc tctattgtat180 aaagcacttg aggacaaagc tgtatcagtc agaagaacgg ccggagactg cctgtctgat240 atcggcgatc ctcaagccat tcctgctatg atcaagtcat taagcgactc cagcaagctt300
74.365/BE
313
gttcgctggc gtgccgccat gttcctgtac gaagtcggcg atgaaagtgc aattgaagct 360
ttgcgcgctg ccgaagatga ccccgaattt gaggtcagcc ttcaagtcaa aatggcgctt 420
gaacgtattg agcatggaga agaagcaaaa ggttctgttt ggaaacaaat gacggaaagc 480
agaaaaaaag gcgaataaag ataaaaaagg tgcagatcat gcaccttttt tatgtgaatt 540
ggtcgaccga aacagcagtt ataaggcatg aagctgtccg gtttttgcaa aagtggctgt 600
gactgtaaaa agaaatcgaa aaagaccgtt ttgtgtgaaa acggtctttt tgtttccttt 660
taaccaactg ccataactcg aggcctacct agcttccaag aaagatatcc taacagcaca 720
agagcggaaa gatgttttgt tctacatcca gaacaacctc tgctaaaatt cctgaaaaat 780
tttgcaaaaa gttgttgact ttatctacaa ggtgtggtat aataatctta acaacagcag 840
gacgctctag aggaggagac accatggcag aattacgcag taatatgatc acacaaggaa 900
tcgatagagc tccgcaccgc agtttgcttc gtgcagcagg ggtaaaagaa gaggatttcg 960
gcaagccgtt tattgcggtg tgtaattcat acattgatat cgttcccggt catgttcact 1020
tgcaggagtt tgggaaaatc gtaaaagaag caatcagaga agcagggggc gttccgtttg 1080
aatttaatac cattggggta gatgatggca tcgcaatggg gcatatcggt atgagatatt 1140
cgctgccaag ccgtgaaatt atcgcagact ctgtggaaac ggttgtatcc gcacactggt 1200
ttgacggaat ggtctgtatt ccgaactgcg acaaaatcac accgggaatg cttatggcgg 1260
caatgcgcat caacattccg acgatttttg tcagcggcgg accgatggcg gcaggaagaa 1320
caagttacgg gcgaaaaatc tccctttcct cagtattcga aggggtaggc gcctaccaag 1380
cagggaaaat caacgaaaac gagcttcaag aactagagca gttcggatgc ccaacgtgcg 1440
ggtcttgctc aggcatgttt acggcgaact caatgaactg tctgtcagaa gcacttggtc 1500
ttgctttgcc gggtaatgga accattctgg caacatctcc ggaacgcaaa gagtttgtga 1560
gaaaatcggc tgcgcaatta atggaaacga ttcgcaaaga tatcaaaccg cgtgatattg 1620
ttacagtaaa agcgattgat aacgcgtttg cactcgatat ggcgctcgga ggttctacaa 1680
ataccgttct tcataccctt gcccttgcaa acgaagccgg cgttgaatac tctttagaac 1740
gcattaacga agtcgctgag cgcgtgccgc acttggctaa gctggcgcct gcatcggatg 1800
tgtttattga agatcttcac gaagcgggcg gcgtttcagc ggctctgaat gagctttcga 1860
agaaagaagg agcgcttcat ttagatgcgc tgactgttac aggaaaaact cttggagaaa 1920
74.365/BE
314 ccattgccgg acatgaagta aaggattatg acgtcattca cccgctggat caaccattca 1980 ctgaaaaggg aggccttgct gttttattcg gtaatctagc tccggacggc gctatcatta 2040 aaacaggcgg cgtacagaat gggattacaa gacacgaagg gccggctgtc gtattcgatt 2100 ctcaggacga ggcgcttgac ggcattatca accgaaaagt aaaagaaggc gacgttgtca 2160 tcatcagata cgaagggcca aaaggcggac ctggcatgcc ggaaatgctg gcgccaacat 2220 cccaaatcgt tggaatggga ctcgggccaa aagtggcatt gattacggac ggacgttttt 2280 ccggagcctc ccgtggcctc tcaatcggcc acgtatcacc tgaggccgct gagggcgggc 2340 cgcttgcctt tgttgaaaac ggagaccata ttatcgttga tattgaaaaa cgcatcttgg 2400 atgtacaagt gccagaagaa gagtgggaaa aacgaaaagc gaactggaaa ggttttgaac 2460 cgaaagtgaa aaccggctac ctggcacgtt attctaaact tgtgacaagt gccaacaccg 2520 gcggtattat gaaaatctag acccctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc 2580 ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atgagcttgc gccgtcccgt caagtcagcg 2640 taatgctctg ccagtgttac aaccaattaa ccaattctga ttagaaaaac tcatcgagca 2700 tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat accatatttt tgaaaaagcc 2760 gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagttcca taggatggca agatcctggt 2820 atcggtctgc gattccgact cgtccaacat caatacaacc tattaatttc ccctcgtcaa 2880 aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac tgaatccggt gagaatggca 2940 aaaggttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca gccattacgc tcgtcatcaa 3000 aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca ttcgtgattg cgcctgagcg agacgaaata 3060 cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga atgcaaccgg cgcaggaaca 3120 ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata ttcttctaat acctggaatg 3180 ctgttttccc agggatcgca gtggtgagta accatgcatc atcaggagta cggataaaat 3240 gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt tagtctgacc atctcatctg 3300 taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa caactctggc gcatcgggct 3360 tcccatacaa tcaatagatt gtcgcacctg attgcccgac attatcgcga gcccatttat 3420 acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg cctcgacgag caagacgttt 3480 cccgttgaat atggctcata acaccccttg tattactgtt tatgtaagca gacagtttta 3540
74.365/BE
315 ttgttcatga tgatatattt ttatcttgtg caatgtaaca tcagagattt tgagacactc 3600 gacaagatga tcttcttgag atcgttttgg tctgcgcgta atctcttgct ctgaaaacga 3660 aaaaaccgcc ttgcagggcg gtttttcgaa ggttctctga gctaccaact ctttgaaccg 3720 aggtaactgg cttggaggag cgcagtcacc aaaacttgtc ctttcagttt agccttaacc 3780 ggcgcatgac ttcaagacta actcctctaa atcaattacc agtggctgct gccagtggtg 3840 cttttgcatg tctttccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 3900 cggactgaac ggggggttcg tgcatacagt ccagcttgga gcgaactgcc tacccggaac 3960 tgagtgtcag gcgtggaatg agacaaacgc ggccataaca gcggaatgac accggtaaac 4020 cgaaaggcag gaacaggaga gcgcacgagg gagccgccag gggaaacgcc tggtatcttt 4080 atagtcctgt cgggtttcgc caccactgat ttgagcgtca gatttcgtga tgcttgtcag 4140 gggggcggag cctatggaaa aacggctttg ccgcggccct ctcacttccc t 4191 <210> 84 <211> 702 < 212> DNA < 213> Bacillus subtilis <220>
< 221> CDS < 222> (1)..(699) < 400> 84 ttg tta ctg gtt ate gat
Met Leu Leu Vai He Asp 1 5 tat cat gat gga aaa tta Tyr His Asp Gly Lys Leu 20 cat aaa aca gaa gat gag His Lys Thr Glu Asp Glu 35 cac tec ggg ctt atg ttt His Ser Gly Leu Met Phe 50 gta gtg ccg cca ate atg
Vai Vai Pro Pro He Met 65 70 gtg ggg aac ace aat act Vai Gly Asn Thr Asn Thr 10 gaa tat cac tgg cgt ata Glu Tyr His Trp Arg lie 25 ttt ggg atg att ttg ege Phe Gly Met lie Leu Arg 40 gaa cag ata gat ggc att
Glu Gin He Asp Gly lie 55 60 ttt geg tta gaa aga atg Phe Ala Leu Glu Arg Met 75 gta ctt ggt gta 48
Vai Leu Gly Vai gaa aca age agg 96
Glu Thr Ser Arg tec tta ttt gat 144
Ser Leu Phe Asp att att teg tea 192
He lie Ser Ser tgc aca aaa tac 240
Cys Thr Lys Tyr 80
74.365/BE
316 ttt cat ate gag cct caa att gtt
Phe His He Glu Pro Gin lieVal aat ata aaa tat gac aat ccgaaa
Asn He Lys Tyr Asp Asn ProLys
100 aat get gtc get geg ata cacttg
Asn Ala Val Ala Ala He HisLeu
115120 gat ttc gga acc gee aca acgtac
Asp Phe Gly Thr Ala Thr ThrTyr
130135 tac atg ggc ggg geg att geecct
Tyr Met Gly Gly Ala He AlaPro
145150 ett tac teg cgt gca gca aag ett
Leu Tyr Ser Arg Ala Ala Lys Leu
165 gac aat att ate gga aaa aac act
Asp Asn lie He Gly Lys Asn Thr
180 tta ttt ggc tat gtc ggc caa gtg
Leu Phe Gly Tyr Val Gly GinVal
195200 tgg cag gca aaa cag gac ccaagg
Trp Gin Ala Lys Gin Asp ProArg
210215 ggt cca ggt atg aaa acc Gly Pro Gly Met Lys Thr 90 gaa gta ggg gca gac aga Glu Val Gly Ala Asp Arg 105 HO tac ggc aat cca tta att Tyr Gly Asn Pro Leu He 125 tgc tat att gat gaa aac Cys Tyr He Asp Glu Asn 140 ggg att aca att teg aca gag geg
Gly lie Thr lie Ser Thr Glu Ala
155160 cct cgt ate gaa ate acc eggccc
Pro Arg He Glu He Thr ArgPro
170175 gtt age geg atg caa tet ggaatt
Val Ser Ala Met Gin Ser GlyHe
185190 gaa gga ate gtt aag ega atgaaa
Glu Gly lie Val Lys Arg MetLys
205 tea ttg ega cag gag gee tgg ege
Ser Leu Arg Gin Glu Ala Trp Arg
220 ggt tta Gly Leu 95 ate gta He Val gtt gtc
Val Val aaa caa
Lys Gin
288
336
384
432
480
528
576
624
672 ege tea ttg ega acg aat Arg Ser Leu Arg Thr Asn 225 230 cag att gta tag
Gin He Val
702 <210> 85 <211> 233 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 85
Met Leu Leu Val lie Asp Val Gly Asn 1 5
Tyr His Asp Gly Lys Leu Glu Tyr His
25
Thr Asn Thr Val Leu Gly Val 10 15
Trp Arg He Glu Thr Ser Arg 30
74.365/BE
317
His Lys Thr Glu Asp Glu Phe Gly 3540
His Ser Gly Leu Met Phe Glu Gin 5055
Vai Vai Pro Pro He Met Phe Ala 6570
Phe His He Glu Pro Gin He Vai 85
Asn lie Lys Tyr Asp Asn Pro Lys 100
Asn Ala Vai Ala Ala He His Leu 115120
Asp Phe Gly Thr Ala Thr Thr Tyr 130135
Tyr Met Gly Gly Ala He Ala Pro 145150
Leu Tyr Ser Arg Ala Ala Lys Leu 165
Asp Asn lie lie Gly Lys Asn Thr 180
Leu Phe Gly Tyr Vai Gly Gin Vai 195200
Trp Gin Ala Lys Gin Asp Pro Arg 210215
Arg Ser Leu Arg Thr Asn Gin Tie 225230
Met lie Leu Arg Ser Leu Phe Asp 45
He Asp Gly He He He Ser Ser 60
Leu Glu Arg Met Cys Thr Lys Tyr 7580
Gly Pro Gly Met Lys Thr Gly Leu 9095
Glu Vai Gly Ala Asp Arg lie Vai
105HO
Tyr Gly Asn Pro Leu He Vai Vai 125
Cys Tyr He Asp Glu Asn Lys Gin 140
Gly lie Thr Tie Ser Thr Glu Ala 155160
Pro Arg He Glu He Thr Arg Pro 170175
Vai Ser Ala Met Gin Ser Gly He 185190
Glu Gly Tie Vai Lys Arg Met Lys 205
Ser Leu Arg Gin Glu Ala Trp Arg 220
Vai <210> 86 <211> 1623 < 212> DNA < 213> Bacillus subtilis <220>
< 221> CDS < 222> (1).. (1620) <400> 86 atg tat ttg gca
Met Tyr Leu Ala ttc cag gtg caa Phe Gin Vai Gin aaa ttg atg egg Lys Leu Met Arg 10 tat ttg acg ett Tyr Leu Thr Leu 15
74.365/BE
318 tac aag ata aag gac ctg aaa tta teg ttg ccc ggc acg aac aaa acg 96 Tyr Lys He Lys Asp Leu Lys Leu Ser Leu Pro Gly Thr Asn Lys Thr
2530 cag caa ttc atg gee caa gca gtc ggc cgt tta act gga aaa ccg gga144
Gin Gin Phe Met Ala Gin Ala Vai Gly Arg Leu Thr Gly Lys ProGly
4045 gtc gtg tta gtc aca tea gga ccg ggt gee tet aac ttg gca aca ggc192
Vai Vai Leu Vai Thr Ser Gly Pro Gly Ala Ser Asn Leu Ala ThrGly
55go ctg ctg aca geg aac act gaa gga gac cet gtc gtt geg ett get gga240
Leu Leu Thr Ala Asn Thr Glu Gly Asp Pro Vai Vai Ala Leu AlaGly 65 70 7580 aac gtg ate cgt gca tat cgt tta aaa egg aca cat caa tet ttg gat288
Asn Vai He Arg Ala Tyr Arg Leu Lys Arg Thr His Gin Ser LeuAsp
9095 aat geg geg eta ttc cag ccg att aca aaa tac agt gta gaa gtt caa336
Asn Ala Ala Leu Phe Gin Pro lie Thr Lys Tyr Ser Vai Glu VaiGin
100 105HO gat gta aaa aat ata ccg gaa get gtt aca aat gca ttt agg ata geg384
Asp Vai Lys Asn He Pro Glu Ala Vai Thr Asn Ala Phe Arg HeAla
115 120125 tea gca ggg cag get ggg gee get ttt gtg age ttt ccg caa gat gtt432
Ser Ala Gly Gin Ala Gly Ala Ala Phe Vai Ser Phe Pro Gin AspVai
130 135140 gtg aat gaa gtc aca aat acg aaa aac gtg cgt get gtt gca geg cca480
Vai Asn Glu Vai Thr Asn Thr Lys Asn Vai Arg Ala Vai Ala AlaPro 145 150 155i aaa etc ggt cet gca gca gat gat gca ate agt geg gee ata gca aaa528
Lys Leu Gly Pro Ala Ala Asp Asp Ala He Ser Ala Ala He AlaLys 165 170175 ate caa aca gca aaa ett cet gtc gtt ttg gtc ggc atg aaa ggc gga576
He Gin Thr Ala Lys Leu Pro Vai Vai Leu Vai Gly Met Lys GlyGly
180 185190 aga ccg gaa gca att aaa geg gtt ege aag ett ttg aaa aag gtt cag624
Arg Pro Glu Ala lie Lys Ala Vai Arg Lys Leu Leu Lys Lys VaiGin
195 200205 ott cca ttt gtt gaa aca tat caa get gcc ggt acc ett tet aga gat672
Leu Pro Phe Vai Glu Thr Tyr Gin Ala Ala Gly Thr Leu Ser ArqAso
210 215220
74.365/BE
319 tta gag gat caa tat ttt ggc cgt ate ggt ttg ttc ege aac cag cct720
Leu Glu Asp Gin Tyr Phe Gly Arg He Gly Leu Phe Arg Asn GinPro
225 230 235240 ggc gat tta ctg eta gag cag gca gat gtt gtt ctg acg ate ggc tat768
Gly Asp Leu Leu Leu Glu Gin Ala Asp Vai Vai Leu Thr He GlyTyr
245 250255 gac ccg att gaa tat gat ccg aaa ttc tgg aat ate aat gga gac egg816
Asp Pro He Glu Tyr Asp Pro Lys Phe Trp Asn He Asn Gly AspArg
260 265270 aca att ate cat tta gac gag att ate get gac att gat cat get tac864
Thr He He His Leu Asp Glu He He Ala Asp He Asp His AlaTyr
275 280285 cag cct gat ett gaa ttg ate ggt gac att ccg tee acg ate aat cat912
Gin Pro Asp Leu Glu Leu He Gly Asp He Pro Ser Thr He AsnHis
290 295300 ate gaa cac gat get gtg aaa gtg gaa ttt gca gag cgt gag cag aaa960 lie Glu His Asp Ala Vai Lys Vai Glu Phe Ala Glu Arg Glu GinLys 305 310 315320 ate ett tet gat tta aaa caa tat atg cat gaa ggt gag cag gtg cct1008
He Leu Ser Asp Leu Lys Gin Tyr Met His Glu Gly Glu Gin VaiPro
325 330335 gca gat tgg aaa tea gac aga geg cac cct ett gaa ate gtt aaa gag1056
Ala Asp Trp Lys Ser Asp Arg Ala His Pro Leu Glu He Vai LysGlu
340 345350 ttg cgt aat gca gtc gat gat cat gtt aca gta act tgc gat ate ggt1104
Leu Arg Asn Ala Vai Asp Asp His Vai Thr Vai Thr Cys Asp HeGly
355 360365 teg cac tee att tgg atg tea cgt tat ttc ege age tac gag ccg tta1152
Ser His Ser He Trp Met Ser Arg Tyr Phe Arg Ser Tyr Glu ProLeu
370 375380 aca tta atg ate agt aac ggt atg caa aca etc ggc gtt geg ett cct1200
Thr Leu Met He Ser Asn Gly Met Gin Thr Leu Gly Vai Ala LeuPro
385 390 395400 tgg gca ate ggc get tea ttg gtg aaa ccg gga gaa aaa gtg gtt tet1248
Trp Ala He Gly Ala Ser Leu Vai Lys Pro Gly Glu Lys Vai VaiSer
405 410415 gtc tet ggt gac ggc ggt ttc tta ttc tea gca atg gaa tta gag aca1296
Vai Ser Gly Asp Gly Gly Phe Leu Phe Ser Ala Met Glu Leu GluThr
420 425430
74.365/BE
320 gca gtt cga eta aaa gca cca att gta
Ala Val Arg Leu Lys Ala Pro lieVal
435440 aca tat gac atg gtg cat ttc cagcaa
Thr Tyr Asp Met Val His Phe GinGin
450455 tet geg gtc gat ttc gga aat ategat
Ser Ala Val Asp Phe Gly Asn HeAsp
465470 ttc gga gca act geg ttg ege gta gaa
Phe Gly Ala Thr Ala Leu Arg Val Glu
485 gtt ctg cgt caa ggc atg aac get gaa
Val Leu Arg Gin Gly Met Asn Ala Glu
500505 ccg gtt gac tac agt gat aac attaat
Pro Val Asp Tyr Ser Asp Asn HeAsn
515520
cac att gta tgg Trp 445 aac Asn gac age 1344
His He Val Asp Ser
ttg aaa aaa tat aac cgt aca 1392
Leu Lys Lys 460 Tyr Asn Arg Thr
ate gtg aaa tat geg gaa age 1440
He Val 475 Lys Tyr Ala Glu Ser 480
tea cca gac cag ctg gca gat 1488
Ser 490 Pro Asp Gin Leu Ala 495 Asp
ggt cct gtc ate ate gat gtc 1536
Gly Pro Val He He 510 Asp Val
tta gca agt gac aag ett ccg 1584
Leu Ala Ser Asp 525 Lys Leu Pro
1623 aaa gaa ttc ggg gaa etc atg Lys Glu Phe Gly Glu Leu Met 530535 aaa acg aaa get etc tag Lys Thr Lys Ala Leu
540 <210> 87 <211> 540 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 87
Met 1 Tyr Leu Ala Phe 5 Gin Val Gin Lys Leu 10 Met Arg Tyr Leu Thr 15 Leu
Tyr Lys He Lys 20 Asp Leu Lys Leu Ser 25 Leu Pro Gly Thr Asn 30 Lys Thr
Gin Gin Phe 35 Met Ala Gin Ala Val 40 Gly Arg Leu Thr Gly 45 Lys Pro Gly
Val Val 50 Leu Val Thr Ser Gly 55 Pro Gly Ala Ser Asn 60 Leu Ala Thr Gly
Leu 65 Leu Thr Ala Asn Thr 70 Glu Gly Asp Pro Val 75 Val Ala Leu Ala Gly 80
Asn Val He Arg Ala 85 Tyr Arg Leu Lys Arg 90 Thr His Gin Ser Leu 95 Asp
74.365/BE
321
Asn Ala Ala Leu 100 Phe Gin Pro He Thr 105 Lys Tyr Ser Vai Glu 110 Vai Gin
Asp Vai Lys 115 Asn He Pro Glu Ala 120 Vai Thr Asn Ala Phe 125 Arg He Ala
Ser Ala 130 Gly Gin Ala Gly Ala 135 Ala Phe Vai Ser Phe 140 Pro Gin Asp Vai
Vai 145 Asn Glu Vai Thr Asn 150 Thr Lys Asn Vai Arg 155 Ala Vai Ala Ala Pro 160
Lys Leu Gly Pro Ala 165 Ala Asp Asp Ala He 170 Ser Ala Ala He Ala 175 Lys
He Gin Thr Ala 180 Lys Leu Pro Vai Vai 185 Leu Vai Gly Met Lys 190 Gly Gly
Arg Pro Glu 195 Ala He Lys Ala Vai 200 Arg Lys Leu Leu Lys 205 Lys Vai Gin
Leu Pro 210 Phe Vai Glu Thr Tyr 215 Gin Ala Ala Gly Thr 220 Leu Ser Arg Asp
Leu 225 Glu Asp Gin Tyr Phe 230 Gly Arg He Gly Leu 235 Phe Arg Asn Gin Pro 240
Gly Asp Leu Leu Leu 245 Glu Gin Ala Asp Vai 250 Vai Leu Thr He Gly 255 Tyr
Asp Pro He Glu 260 Tyr Asp Pro Lys Phe 265 Trp Asn He Asn Gly 270 Asp Arg
Thr He He 275 His Leu Asp Glu He 280 He Ala Asp He Asp 285 His Ala Tyr
Gin Pro 290 Asp Leu Glu Leu He 295 Gly Asp He Pro Ser 300 Thr He Asn His
He 305 Glu His Asp Ala Vai 310 Lys Vai Glu Phe Ala 315 Glu Arg Glu Gin Lys 320
He Leu Ser Asp Leu 325 Lys Gin Tyr Met His 330 Glu Gly Glu Gin Vai 335 Pro
Ala Asp Trp Lys 340 Ser Asp Arg Ala His 345 Pro Leu Glu He Vai 350 Lys Glu
Leu Arg Asn 355 Ala Vai Asp Asp His 360 Vai Thr Vai Thr Cys 365 Asp He Gly
Ser His 370 Ser He Trp Met Ser 375 Arg Tyr Phe Arg Ser 380 Tyr Glu Pro Leu
74.365/BE
322
Thr Leu Met He Ser Asn Gly Met 385 390
Trp Ala He Gly Ala Ser Leu Val 405
Val Ser Gly Asp Gly Gly Phe Leu 420
Ala Val Arg Leu Lys Ala Pro lie 435440
Thr Tyr Asp Met Val His Phe Gin 450455
Ser Ala Val Asp Phe Gly Asn lie 465470
Phe Gly Ala Thr Ala Leu Arg Val 485
Val Leu Arg Gin Gly Met Asn Ala 500
Pro Val Asp Tyr Ser Asp Asn lie 515520
Gin Thr Leu Gly Val Ala Leu Pro 395400
Lys Pro Gly Glu Lys Val Val Ser 410415
Phe Ser Ala Met Glu Leu Glu Thr
425430
Val His lie Val Trp Asn Asp Ser 445
Gin Leu Lys Lys Tyr Asn Arg Thr 460
Asp lie Val Lys Tyr Ala Glu Ser 475480
Glu Ser Pro Asp Gin Leu Ala Asp 490495
Glu Gly Pro Val lie lie Asp Val 505510
Asn Leu Ala Ser Asp Lys Leu Pro 525
Lys
Glu Phe Gly Glu Leu Met Lys Thr Lys Ala Leu 530 535 540 <210> 88 <211> 23 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Description of Artificial Sequence: ribosome binding site <220>
< 223> All occurrences of n indicate any nucleotide < 400> 88 agaaaggagg tgannnnnnn atg < 210> 89 < 211> 7 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Description of Artificial Sequence: PanC C terminus
74.365/BE
323 <400> 89
He Arg Glu Met Glu Arg lie
5 <210> 90 < 2H> 5 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Description of Artificial Sequence: PanC C terminus < 400> 90 lie Arg Glu Arg Arg
5 <210> 91 < 211> 7 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Description of Artificial Sequence: PanC C terminus <400> 91
He Arg Arg Lys Glu Vai Asn
5 <210> 92 <2H> 6688 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Description of Artificial Sequence: Recombinant pAN336 plasmid < 400> 92 tgcgccgcta cagggcgcgt ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 60 tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 120 ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa 180 ttgtaatacg actcactata gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgcacc aggcttctca 240 ggcgctgact tagaaaacct cttgaatgaa gctgcgcttg tagcggctcg tcaaaacaag 300 aaaaaaatcg atgcgcgtga tattgacgaa gcgacggacc gtgtaattgc cggacccgct 360 aagaagagcc gcgttatctc caagaaagaa cgcaatatcg tggcttatca cgaaggcgga 420
74.365/BE
324 cacaccgtta tcggtctcgt tttagatgag gcagatatgg ttcataaagt aacgattgtt480 cctcggggcc aggctggcgg ttatgctgtt atgctgccaa gagaagaccg ttatttccaa540 acaaagccgg agctgcttga taaaattgtc ggcctcttgg gcggacgtgt tgctgaagag600 attatcttcg gtgaagtcag cacaggggcg cacaatgact tccagcgtgc gacgaatatt660 gcaagacgaa tggttacaga attcggtatg tcagaaaaac tgggaccgtt gcaatttgga720 cagtctcagg gcggtcaggt attcttaggc gatcaaatcg cttacgaaat tgatcaggaa cgtgcgaaac aaatcctgac tgaaaatcgt ctgaaagttg aaacgcttga cgctgaacaa cctgagcgta atttctcaga tgatgaaaag aaaacagaag aaaagaaaga cgatacgaaa ccggctgacg ctggcagttt ttttatgtaa atccaattct ggtatcgatt tgtttacaaa atgtttgtaa aaagtaaagt agagaaacta ttatcgatgt ggggaacacc ctgcagctcg aaataccgca tcaggcgata aacccagcga gaggtatgaa aacgagaatt ggacctttac aagctaccaa gacgaagagg atgaagagga caatactgat aagataatat atcttttata gggggcaagg cataggcagc gcgcttatca acttgcatgg actaatgctt gaaacccagg ataattgtgg tttcaaaatc ggctccgtcg actttgaaaa agctgttttc tggtatttaa agttcgtctt gttataatta gcttcttggg gaaataataa atggctaaaa tgagaatatc ccgctgcgta aaagatacgg aaggaatgtc aaatgaaaac ctatatttaa aaatgacgga cgtgatttca acaacgaaca gaactacagt 780 attcagcgca tcatcaaaga atgttatgag 840 gacaagcttg aattgattgc ccaaacgctt 900 atcaaacacc ttatcgatca tggaacatta 960 aacgatgatg tgaaagtaaa cattctgaca 1020 gagtaattcg ctttctttct aaaaaaactg 1080 atgattggct cagctgcggc ttttacaatc 1140 tgagccgctg atcgtgtatg gtattgtaga 1200 ttcaaaagtg gtgatagagg ttgttactgg 1260 agtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 1320 accatttgag gtgataggta agattatacc 1380 agaattactc tatgaagcgc catatttaaa 1440 tgaggaggca gattgccttg aatatattga 1500 tagaagatat cgccgtatgt aaggatttca 1560 atatatctat agaatgggca aagcataaaa 1620 acaataacct tatagcttgt aaattctatc 1680 atactatgtt atacgccaac tttcaaaaca 1740 ggttttagaa tgcaaggaac agtgaattgg 1800 gtatctttaa atactgtaga aaagaggaag 1860 accggaattg aaaaaactga tcgaaaaata 1920 tcctgctaag gtatataagc tggtgggaga 1980 cagccggtat aaagggacca cctatgatgt 2040
74.365/BE
325 ggaacgggaa aaggacatga tgctatggct ggaaggaaag ctgcctgttc caaaggtcct 2100 gcactttgaa cggcatgatg gctggagcaa tctgctcatg agtgaggccg atggcgtcct 2160 ttgctcggaa gagtatgaag atgaacaaag ccctgaaaag attatcgagc tgtatgcgga 2220 gtgcatcagg ctctttcact ccatcgacat atcggattgt ccctatacga atagcttaga 2280 cagccgctta gccgaattgg attacttact gaataacgat ctggccgatg tggattgcga 2340 aaactgggaa gaagacactc catttaaaga tccgcgcgag ctgtatgatt ttttaaagac 2400 ggaaaagccc gaagaggaac ttgtcttttc ccacggcgac ctgggagaca gcaacatctt 2460 tgtgaaagat ggcaaagtaa gtggctttat tgatcttggg agaagcggca gggcggacaa 2520 gtggtatgac attgccttct gcgtccggtc gatcagggag gatatcgggg aagaacagta 2580 tgtcgagcta ttttttgact tactggggat caagcctgat tgggagaaaa taaaatatta 2640 tattttactg gatgaattgt tttagtacct agatttagat gtctaaaaag ctttaactac 2700 aagcttttta gacatctaat cttttctgaa gtacatccgc aactgtccat actctgatgt 2760 tttatatctt ttctaaaagt tcgctagata ggggtcccga gcgcctacga ggaatttgta 2820 tcgccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc ggtcgactgg 2880 caggcaaaac aggacccaag gtcattgcga caggaggcct ggcgccgctc attgcgaacg 2940 aatcagattg tatagacatc gttgatccat tcttaaccct aaaagggctg gaattgattt 3000 atgaaagaaa ccgcgtagga agtgtatagg aggtttagta atggattatt tagtaaaagc 3060 acttgcgtat gacggaaaag ttcgggctta tgcagcgaga acgactgata tggtaaatga 3120 ggggcagaga cgccatggta cgtggccgac agcatccgct gcactaggcc gtacaatgac 3180 agcttcactt atgctcggcg ctatgctgaa gggcgatgat aagctgaccg tgaaaatcga 3240 gggcggaggt ccgatcggag ctattgtagc tgatgccaat gccaaaggag aagtcagagc 3300 ctatgtctct aacccgcaag ttcattttga tttaaatgaa caaggtaagc ttgatgtcag 3360 acgtgcggtt ggaacaaacg gaacgttaag tgtcgtaaaa gatttaggtt tgcgcgagtt 3420 cttcacagga caagtagaaa tcgtttcagg agaattagga gatgatttta cttactatct 3480 tgtgtcatct gagcaggttc cttcatcagt gggcgtaggt gtgctcgtaa atcctgacaa 3540 taccattctt gcggcagggg gctttattat tcagctgatg ccgggaacag atgatgaaac 3600 aatcacaaaa attgaacagc gtctatctca agtagagccg atttctaagc tcatccaaaa 3660
74.365/BE
326 agggctgaca ccagaagaaa ttttagaaga agtcctaggc gagaaacctg agattttgga 3720 aacgatgcct gtcagattcc attgcccttg ttcaaaagaa cggttcgaaa cagccatttt 3780 aggactaggc aaaaaagaaa ttcaagatat gatagaagaa gatggacaag ccgaagcagt 3840 atgccatttt tgtaatgaaa agtacttatt tacaaaagaa gagctggaag ggcttcgtga 3900 ccaaactacc cgctaagctc tttagcgggt ttttaatttg agaaaagggg ctgaaagcag 3960 gtttgaaatc aagaacaatc tggacgcgtt ggatgcatag cttgagtatt ctatagtgtc 4020 acctaaatag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc 4080 tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat 4140 gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc 4200 tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 4260 ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 4320 cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 4380 gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 4440 tggcgttttt cgataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 4500 agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 4560 tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 4620 cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 4680 ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 4740 ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 4800 ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 4860 ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 4920 cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 4980 gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 5040 atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 5100 ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 5160 gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 5220 tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 5280
74.365/BE
327 ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 5340 taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 5400 gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 5460 gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttggcattg 5520 ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 5580 aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 5640 gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 5700 cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 5760 actcaaccaa gtcattctga gaataccgcg cccggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 5820 caatacggga taatagtgta tgacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 5880 gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 5940 ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 6000 caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 6060 tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 6120 gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 6180 cccgaaaagt gccacctgta tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata 6240 ccgcatcagg cgaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatatttgtt 6300 aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag 6360 aatagaccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga 6420 acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg 6480 aaccatcacc caaatcaagt tttttgcggt cgaggtgccg taaagctcta aatcggaacc 6540 ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg 6600 aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc 6660 gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaa 6688 <210> 93 <211> 8503 <212> DNA <213> Artificial Sequence
74.365/BE
328 <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Recombinant pAN004 plasmid <400> 93 gaattttgcg gccgcttcga aagctgtaat ataaaaacct tcttcaacta acggggcagg 60 ttagtgacat tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa 120 gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat 180 aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt 240 tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat 300 ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag 360 gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt 420 ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt 480 tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc 540 cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga 600 aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa 660 tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct 720 cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa 780 tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta gaatcaatcc 840 ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt ttaaaaatat cccactttat 900 ccaattttcg tttgttgaac taatgggtgc tttagttgaa gaataaagac cacattaaaa 960 aatgtggtct tttgtgtttt tttaaaggat ttgagcgtag cgaaaaatcc ttttctttct 1020 tatcttgata ataagggtaa ctattgaatt cggtaccaag agtttgtaga aacgcaaaaa 1080 ggccatccgt caggatggcc ttctgcttaa tttgatgcct ggcagtttat ggcgggcgtc 1140 ctgcccgcca ccctccgggc cgttgcttcg caacgttcaa atccgctccc ggcggatttg 1200 tcctactcag gagagcgttc accgacaaac aacagataaa acgaaaggcc cagtctttcg 1260 actgagcctt tcgttttatt tgatgcctgg cagttcccta ctctcgcatg gggagacccc 1320 acactaccat cggcgctacg gcgtttcact tctgagttcg gcatggggtc aggtgggacc 1380 accgcgctac tgccgccagg caaattctgt tttatcagac cgcttctgcg ttctgattta 1440 atctgtatca ggctgaaaat cttctctcat ccgccaaaac aggatcctac ggaaatggag 1500
74.365/BE
329 cggcaaaacc gttttactct caaaatctta ttctacaaaa ttgtacgggc tggttcgttc ttcagaacag ccactttcgg ctcatggctt gaaataataa tgaccttatc tccttcctgc atgacgccgc ttccccgttt accaggaata ttattcacaa tttgtacttt ttcattagga tcaattgtaa tgcttcccac atagttcagg ttgccgctca tcattgttcg atacatatta gatattatct attaaacgcg cttttgaaaa agcaatttca ttcacaggct cgagttccgg tccgctagtc gtttcaatga tatcttttgc accggcttgg acaagttccg cacttgtttg tctttcctca gctgttaagt atacattgcg gaccgtatcg acaggaacca attcaatatc aacagctacc tgctgcgcat cttttaaacc gaaaagcttc gtcagtacga tcgcgacccc taacacgtct gtgcgtcttt ctacatgaat atgagcatct ggcgtaaaaa gaatatcgac ctcaatatcg cgcggatatg cttcaaaatc aaaaatactc ataataacgg cgtcgttttc cccctcatgc agaaacccca tcgtcggaac ttgttttatg gcttctttca gctgtgaaat cgtacaagcc gtcaagcact gtctggttca cacgatgtct tacatcctga acatatccgc gcgtatattg ctttacaaat ttaggtgttc aaacgagaac ttgtccgtcc gctttcacac gcgtctcggc aattttggct gtgagttctg aaagaaaacc cccgataaag ggggcttttc 1560 cccagcattt gttcaatttt gttttgatca 1620 gccgcttctt gatcagacat cattttgtag 1680 acaaggcgtg cggctgcacc gtttaagcat 1740 atatacgttt caagacgtgc tccattatta 1800 agcattccca cagcatcaat gagatcttca 1860 tttgcttccg taacagttgc cctgtgaagt 1920 tattctctcc atttctcgaa tatcaataat 1980 agcaactgca acagcgagaa tcatctttcc 2040 ataggaataa agctctacat agtctatggt 2100 agcttttatc accgcttcag gatctctttc 2160 aagggcccga tacagcttag gcgcttcttt 2220 agagcttttg gctaagccgt cttcctctct 2280 catgaagaag tcgctgatta acccatcaac 2340 gaaataggca cgagtcggct tgactagatt 2400 gtcaaaatgt ccttctcttg agcgcccgca 2460 cgtgacattc ttttcaccgg gatacatatc 2520 tccggcgttt tctgcaagag ctgcatcccg 2580 ttcattaggg ccgaattgtg caggattcac 2640 ttgtcttgct ttgtctgcta aggttaaatg 2700 aaatccgatt gacttgccct ctgaatggta 2760 atcagtaatc tgtctcatct tattttcccc 2820 tttgaaagga atgcttttgt tcagggaaag 2880 tgattgctgt ttcgatggtt tcatcaatgc 2940 tctcaacacc gtggccgata atatcatgat 3000 cagccccgat tccaatgacc ggtatgctta 3060 ccggcacaca ttccagcaca agcatcatag 3120
74.365/BE
330 ctcctgcttc ttcgcatttt atactgtctt ctattaattt tttggcgctt tgttcgtctt 3180 tgccctgtac tttatagccg cccagtacgc cgactgactg cggtgtcaaa cctaagtgac 3240 tgactactgg aatgcctcca agcgtcaatg cgcgaatgga ttcaaacacg ccttctccgc 3300 cctcaagctt cagtgcgtca gctccgcttt cctgaacgat agccgctgca tttttcagcg 3360 tatcttcctt agacaggtga taagacataa acggcatatc tgtcacaata aaggtattcg 3420 gcgcacccct tttaacggct tttgtatgat ggatcatgtc cgcaactgtc acaccgacag 3480 ttgaatcaag gccgaggacg accattccaa gtgaatcacc gactaaaatc atgtcaactc 3540 ccgcttgttc agcaagttta gctgccggat aatcataagc ggtcagcatg acaatcggtt 3600 cttcagactc cttcattttt agaaaatcca gttttgtttt catgttttct cctccttcta 3660 gagcgtcctg ctgttgttaa gattattata ccacaccttg tagataaagt caacaacttt 3720 ttgcaaaatt tttcaggaat tttagcagag gttgttctgg atgtagaaca aaacatcttt 3780 ccgctcttgt gctgttagga tatctttctt ggaagctagg taggcctcga gttatggcag 3840 ttggttaaaa ggaaacaaaa agaccgtttt cacacaaaac ggtctttttc gatttctttt 3900 tacagtcaca gccacttttg caaaaaccgg acagcttcat gccttataac tgctgtttcg 3960 gtcgacaagc ttcgcgaagc ggccgcaaaa ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga 4020 ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag 4080 ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa 4140 tggcgaatgg cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg 4200 catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca 4260 cccgccaaca cccgctgact atgcttgtaa accgttttgt gaaaaaattt ttaaaataaa 4320 aaaggggacc tctagggtcc ccaattaatt agtaatataa tctattaaag gtcattcaaa 4380 aggtcatcca ccggatcagc ttagtaaagc cctcgctaga ttttaatgcg gatgttgcga 4440 ttacttcgcc aactattgcg ataacaagaa aaagccagcc tttcatgata tatctcccaa 4500 tttgtgtagg gcttattatg cacgcttaaa aataataaaa gcagacttga cctgatagtt 4560 tggctgtgag caattatgtg cttagtgcat ctaacgcttg agttaagccg cgccgcgaag 4620 cggcgtcggc ttgaacgaat tgttagacat tatttgccga ctaccttggt gatctcgcct 4680 ttcacgtagt ggacaaattc ttccaactga tctgcgcgcg aggccaagcg atcttcttct 4740
74.365/BE
331 tgtccaagat aagcctgtct agcttcaagt atgacgggct gatactgggc cggcaggcgc 4800 tccattgccc agtcggcagc gacatccttc ggcgcgattt tgccggttac tgcgctgtac 4860 caaatgcggg acaacgtaag cactacattt cgctcatcgc cagcccagtc gggcggcgag 4920 ttccatagcg ttaaggtttc atttagcgcc tcaaatagat cctgttcagg aaccggatca 4980 aagagttcct ccgccgctgg acctaccaag gcaacgctat gttctcttgc ttttgtcagc 5040 aagatagcca gatcaatgtc gatcgtggct ggctcgaaga tacctgcaag aatgtcattg 5100 cgctgccatt ctccaaattg cagttcgcgc ttagctggat aacgccacgg aatgatgtcg 5160 tcgtgcacaa caatggtgac ttctacagcg cggagaatct cgctctctcc aggggaagcc 5220 gaagtttcca aaaggtcgtt gatcaaagct cgccgcgttg tttcatcaag ccttacggtc 5280 accgtaacca gcaaatcaat atcactgtgt ggcttcaggc cgccatccac tgcggagccg 5340 tacaaatgta cggccagcaa cgtcggttcg agatggcgct cgatgacgcc aactacctct 5400 gatagttgag tcgatacttc ggcgatcacc gcttccctca tgatgtttaa ctttgtttta 5460 gggcgactgc cctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata acatcaaaca tcgacccacg 5520 gcgtaacgcg cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtaccccaaa aaaacagtca 5580 taacaagcca tgaaaaccgc cactgcgccg ttaccaccgc tgcgttcggt caaggttctg 5640 gaccagttgc gtgagcgcat acgctacttg cattacagct tacgaaccga acaggcttat 5700 gtccactggg ttcgtgcctt catccgtttc cacggtgtgc gtcacccggc aaccttgggc 5760 agcagcgaag tcgaggcatt tctgtcctgg ctggcgaacg agcgcaaggt ttcggtctcc 5820 acgcatcgtc aggcattggc ggccttgctg ttcttctacg gcaaggtgct gtgcacggat 5880 ctgccctggc ttcaggagat cggaagacct cggccgtcgc ggcgcttgcc ggtggtgctg 5940 accccggatg aagtggttcg catcctcggt tttctggaag gcgagcatcg tttgttcgcc 6000 cagcttctgt atggaacggg catgcggatc agtgagggtt tgcaactgcg ggtcaaggat 6060 ctggatttcg atcacggcac gatcatcgtg cgggagggca agggctccaa ggatcgggcc 6120 ttgatgttac ccgagagctt ggcacccagc ctgcgcgagc aggggaattg atccggtgga 6180 tgaccttttg aatgaccttt aatagattat attactaatt aattggggac cctagaggtc 6240 ccctttttta ttttaaaaat tttttcacaa aacggtttac aagcataacg ggttttgctg 6300 cccgcaaacg ggctgttctg gtgttgctag tttgttatca gaatcgcaga tccggcttca 6360
74.365/BE
332 ggtttgccgg ctgaaagcgc tatttcttcc agaattgcca tgattttttc cccacgggag 6420 gcgtcactgg ctcccgtgtt gtcggcagct ttgattcgat aagcagcatc gcctgtttca 6480 ggctgtctat gtgtgactgt tgagctgtaa caagttgtct caggtgttca atttcatgtt 6540 ctagttgctt tgttttactg gtttcacctg ttctattagg tgttacatgc tgttcatctg 6600 ttacattgtc gatctgttca tggtgaacag ctttaaatgc accaaaaact cgtaaaagct 6660 ctgatgtatc tatctttttt acaccgtttt catctgtgca tatggacagt tttccctttg 6720 atatctaacg gtgaacagtt gttctacttt tgtttgttag tcttgatgct tcactgatag 6780 atacaagagc cataagaacc tcagatcctt ccgtatttag ccagtatgtt ctctagtgtg 6840 gttcgttgtt tttgcgtgag ccatgagaac gaaccattga gatcatgctt actttgcatg 6900 tcactcaaaa attttgcctc aaaactggtg agctgaattt ttgcagttaa agcatcgtgt 6960 agtgtttttc ttagtccgtt acgtaggtag gaatctgatg taatggttgt tggtattttg 7020 tcaccattca tttttatctg gttgttctca agttcggtta cgagatccat ttgtctatct 7080 agttcaactt ggaaaatcaa cgtatcagtc gggcggcctc gcttatcaac caccaatttc 7140 atattgctgt aagtgtttaa atctttactt attggtttca aaacccattg gttaagcctt 7200 ttaaactcat ggtagttatt ttcaagcatt aacatgaact taaattcatc aaggctaatc 7260 tctatatttg ccttgtgagt tttcttttgt gttagttctt ttaataacca ctcataaatc 7320 ctcatagagt atttgttttc aaaagactta acatgttcca gattatattt tatgaatttt 7380 tttaactgga aaagataagg caatatctct tcactaaaaa ctaattctaa tttttcgctt 7440 gagaacttgg catagtttgt ccactggaaa atctcaaagc ctttaaccaa aggattcctg 7500 atttccacag ttctcgtcat cagctctctg gttgctttag ctaatacacc ataagcattt 7560 tccctactga tgttcatcat ctgagcgtat tggttataag tgaacgatac cgtccgttct 7620 ttccttgtag ggttttcaat cgtggggttg agtagtgcca cacagcataa aattagcttg 7680 gtttcatgct ccgttaagtc atagcgacta atcgctagtt catttgcttt gaaaacaact 7740 aattcagaca tacatctcaa ttggtctagg tgattttaat cactatacca attgagatgg 7800 gctagtcaat gataattact agtccttttc ctttgagttg tgggtatctg taaattctgc 7860 tagacctttg ctggaaaact tgtaaattct gctagaccct ctgtaaattc cgctagacct 7920 ttgtgtgttt tttttgttta tattcaagtg gttataattt atagaataaa gaaagaataa 7980
74.365/BE
333 aaaaagataa aaagaataga tcccagccct gtgtataact cactacttta gtcagttccg 8040 cagtattaca aaaggatgtc gcaaacgctg tttgctcctc tacaaaacag accttaaaac 8100 cctaaaggct taagtagcac cctcgcaagc tcgggcaaat cgctgaatat tccttttgtc 8160 tccgaccatc aggcacctga gtcgctgtct ttttcgtgac attcagttcg ctgcgctcac 8220 ggctctggca gtgaatgggg gtaaatggca ctacaggcgc cttttatgga ttcatgcaag 8280 gaaactaccc ataatacaag aaaagcccgt cacgggcttc tcagggcgtt ttatggcggg 8340 tctgctatgt ggtgctatct gactttttgc tgttcagcag ttcctgccct ctgattttcc 8400 agtctgacca cttcggatta tcccgtgaca ggtcattcag actggctaat gcacccagta 8460 aggcagcggt atcatcaaca ggcttacccg tcttactgtc aac 8503 <210> 94 <211> 7381 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> Description of Artificial Sequence: recombinant pAN006 plasmid < 400> 94 ttgcggccgc ttcgaaagct gtaatataaa aaccttcttc aactaacggg gcaggttagt60 gacattagaa aaccgactgt aaaaagtaca gtcggcatta tctcatatta taaaagccag120 tcattaggcc tatctgacaa ttcctgaata gagttcataa acaatcctgc atgataacca180 tcacaaacag aatgatgtac ctgtaaagat agcggtaaat atattgaatt acctttatta240 atgaattttc ctgctgtaat aatgggtaga aggtaattac tattattatt gatatttaag300 ttaaacccag taaatgaagt ccatggaata atagaaagag aaaaagcatt ttcaggtata360 ggtgttttgg gaaacaattt ccccgaacca ttatatttct ctacatcaga aaggtataaa420 tcataaaact ctttgaagtc attctttaca ggagtccaaa taccagagaa tgttttagat480 acaccatcaa aaattgtata aagtggctct aacttatccc aataacctaa ctctccgtcg540 ctattgtaac cagttctaaa agctgtattt gagtttatca cccttgtcac taagaaaata600 aatgcagggt aaaatttata tccttcttgt tttatgtttc ggtataaaac actaatatca660 atttctgtgg ttatactaaa agtcgtttgt tggttcaaat aatgattaaa tatctctttt720 ctcttccaat tgtctaaatc aattttatta aagttcattt gatatgcctc ctaaattttt780
74.365/BE
334 atctaaagtg aatttaggag gcttacttgt ctgctttctt cattagaatc aatccttttt840 taaaagtcaa tattactgta acataaatat atattttaaa aatatcccac tttatccaat900 tttcgtttgt tgaactaatg ggtgctttag ttgaagaata aagaccacat taaaaaatgt960 ggtcttttgt gtttttttaa aggatttgag cgtagcgaaa aatccttttc tttcttatct1020 tgataataag ggtaactatt gaattcggta ccaagagttt gtagaaacgc aaaaaggcca1080 tccgtcagga tggccttctg cttaatttga tgcctggcag tttatggcgg gcgtcctgcc1140 cgccaccctc cgggccgttg cttcgcaacg ttcaaatccg ctcccggcgg atttgtccta1200 ctcaggagag cgttcaccga caaacaacag ataaaacgaa aggcccagtc tttcgactga1260 gcctttcgtt ttatttgatg cctggcagtt ccctactctc gcatggggag accccacact1320 accatcggcg ctacggcgtt tcacttctga gttcggcatg gggtcaggtg ggaccaccgc1380 gctactgccg ccaggcaaat tctgttttat cagaccgctt ctgcgttctg atttaatctg1440 tatcaggctg aaaatcttct ctcatccgcc aaaacaggat cctacggaaa tggagcggca1500 aaaccgtttt actctcaaaa tcttaaaaga aaacccccga taaagggggc ttttcttcta1560 caaaattgta cgggctggtt cgttccccag catttgttca attttgtttt gatcattcag1620 aacagccact ttcggctcat ggcttgccgc ttcttgatca gacatcattt tgtaggaaat1680 aataatgacc ttatctcctt cctgcacaag gcgtgcggct gcaccgttta agcatatgac1740 gccgcttccc cgtttaccag gaataatata cgtttcaaga cgtgctccat tattattatt1800 cacaatttgt actttttcat taggaagcat tcccacagca tcaatgagat cttcatcaat1860 tgtaatgctt cccacatagt tcaggtttgc ttccgtaaca gttgccctgt gaagtttgcc1920 gctcatcatt gttcgataca tattatattc tctccatttc tcgaatatca ataatgatat1980 tatctattaa acgcgctttt gaaaaagcaa ctgcaacagc gagaatcatc tttccagcaa2040 tttcattcac aggctcgagt tccggatagg aataaagctc tacatagtct atggttccgc2100 tagtcgtttc aatgatatct tttgcagctt ttatcaccgc ttcaggatct ctttcaccgg2160 cttggacaag ttccgcactt gtttgaaggg cccgatacag cttaggcgct tcttttcttt2220 cctcagctgt taagtataca ttgcgagagc ttttggctaa gccgtcttcc tctctgaccg2280 tatcgacagg aaccaattca atatccatga agaagtcgct gattaaccca tcaacaacag2340 ctacctgctg cgcatctttt aaaccgaaat aggcacgagt cggcttgact agattgaaaa2400
74.365/BE
335 gcttcgtcag tacgatcgcg accccgtcaa aatgtccttc tcttgagcgc ccgcataaca 2460 cgtctgtgcg tctttctaca tgaatcgtga cattcttttc accgggatac atatcatgag 2520 catctggcgt aaaaagaata tcgactccgg cgttttctgc aagagctgca tcccgctcaa 2580 tatcgcgcgg atatgcttca aaatcttcat tagggccgaa ttgtgcagga ttcacaaaaa 2640 tactcataat aacggcgtcg ttttcttgtc ttgctttgtc tgctaaggtt aaatgcccct 2700 catgcagaaa ccccatcgtc ggaacaaatc cgattgactt gccctctgaa tggtattgtt 2760 ttatggcttc tttcagctgt gaaatatcag taatctgtct catcttattt tcccccgtac 2820 aagccgtcaa gcactgtctg gttcatttga aaggaatgct tttgttcagg gaaagcacga 2880 tgtcttacat cctgaacata tccgctgatt gctgtttcga tggtttcatc aatgcgcgta 2940 tattgcttta caaatttagg tgttctctca acaccgtggc cgataatatc atgataaacg 3000 agaacttgtc cgtccgcttt cacaccagcc ccgattccaa tgaccggtat gcttagcgtc 3060 tcggcaattt tggctgtgag ttctgccggc acacattcca gcacaagcat catagctcct 3120 gcttcttcgc attttatact gtcttctatt aattttttgg cgctttgttc gtctttgccc 3180 tgtactttat agccgcccag tacgccgact gactgcggtg tcaaacctaa gtgactgact 3240 actggaatgc ctccaagcgt caatgcgcga atggattcaa acacgccttc tccgccctca 3300 agcttcagtg cgtcagctcc gctttcctga acgatagccg ctgcattttt cagcgtatct 3360 tccttagaca ggtgataaga cataaacggc atatctgtca caataaaggt attcggcgca 3420 ccccttttaa cggcttttgt atgatggatc atgtccgcaa ctgtcacacc gacagttgaa 3480 tcaaggccga ggacgaccat tccaagtgaa tcaccgacta aaatcatgtc aactcccgct 3540 tgttcagcaa gtttagctgc cggataatca taagcggtca gcatgacaat cggttcttca 3600 gactccttca tttttagaaa atccagtttt gttttcatgt tttctcctcc tctagagcgt 3660 cctgctgttg ttaagattat tataccacac cttgtagata aagtcaacaa ctttttgcaa 3720 aatttttcag gaattttagc agaggttgtt ctggatgtag aacaaaacat ctttccgctc 3780 ttgtgctgtt aggatatctt tcttggaagc taggtaggcc tcgagttatg gcagttggtt 3840 aaaaggaaac aaaaagaccg ttttcacaca aaacggtctt tttcgatttc tttttacagt 3900 cacagccact tttgcaaaaa ccggacagct tcatgcctta taactgctgt ttcggtcgac 3960 ctgcaggcat gcaagcttcg cgaagcggcc gccgacgcga ggctggatgg ccttccccat 4020
74.365/BE
336 tatgattctt ctcgcttccg gcggcatcgg gatgcccgcg ttgcaggcca tgctgtccag 4080 gcaggtagat gacgaccatc agggacagct tcaaggatcg ctcgcggctc ttaccagcct 4140 aacttcgatc actggaccgc tgatcgtcac ggcgatttat gccgcctcgg cgagcacatg 4200 gaacgggttg gcatggattg taggcgccgc cctatacctt gtctgcctcc ccgcgttgcg 4260 tcgcggtgca tggagccggg ccacctcgac ctgaatggaa gccggcggca cctcgctaac 4320 ggattcacca ctccaagaat tggagccaat caattcttgc ggagaactgt gaatgcgcaa 4380 accaaccctt ggcagaacat atccatcgcg tccgccatct ccagcagccg cacgcggcgc 4440 atctcgggca gcgttgggtc ctggccacgg gtgcgcatga tcgtgctcct gtcgttgagg 4500 acccggctag gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga atgaatcacc gatacgcgag 4560 cgaacgtgaa gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct gagcaacaac atgaatggtc 4620 ttcggtttcc gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt cagcgccctg caccattatg 4680 ttccggatct gcatcgcagg atgctgctgg ctaccctgtg gaacacctac atctgtatta 4740 acgaagcgct ggcattgacc ctgagtgatt tttctctggt cccgccgcat ccataccgcc 4800 agttgtttac cctcacaacg ttccagtaac cgggcatgtt catcatcagt aacccgtatc 4860 gtgagcatcc tctctcgttt catcggtatc attaccccca tgaacagaaa ttccccctta 4920 cacggaggca tcaagtgacc aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc cgctttatca 4980 gaagccagac attaacgctt ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag 5040 acatctgtga atcgcttcac gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc ctcgcgcgtt 5100 tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc 5160 tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt 5220 gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta 5280 tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag 5340 atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 5400 gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 5460 atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 5520 caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 5580 gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 5640
74.365/BE
337 ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 5700 cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 5760 taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 5820 cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 5880 acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 5940 aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt 6000 atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 6060 atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 6120 gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 6180 gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 6240 ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 6300 ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt 6360 tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt 6420 accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt 6480 atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc 6540 cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa 6600 tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg 6660 tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt 6720 gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc 6780 agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt 6840 aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg 6900 gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac 6960 tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc 7020 gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt 7080 tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg 7140 aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag 7200 catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa 7260
74.365/BE
338 acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat 7320 tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaaga 7380

Claims (110)

1. Eljárás panto-vegyület termeltetésére, azzal jellemezve, hogy legalább egy, Bacillusban előforduló, pantotenát bioszintetikus enzimet túltermelni képes mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben a panto-vegyület termelődik.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább egy, Bacillus subtilisben előforduló, pantotenát bioszintetikus enzimet túltermelni képes mikroorganizmust tenyésztünk .
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pantotenát bioszintetikus enzimként például ketopantoát hidroxi-metil-transzferázt, pantotenát szintetázt, aszpartát a-dekarboxilázt vagy ketopantoát reduktázt túltermelni képes mikroorganizmust tenyésztünk.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább két pantotenát bioszintetikus enzimet túltermelni képes mikroorganizmust tenyésztünk.
5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább három pantotenát bioszintetikus enzimet túltermelni képes mikroorganizmust tenyésztünk.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy panto-vegyületként pantotenátot, pantoátot, ketopantoátot vagy β-alanint termeltetünk.
7. Eljárás panto-vegyület termeltetésére, azzal jellemezve, hogy ketopantoát reduktázt túltermelni (KPAR-O) képes mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben a panto-
74.365/BE ·»·£ ^·· ·♦»» *·»· · 340 \>:J / /*Η· vegyület termelődik.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy panto-vegyületként pantotenátot vagy pantoátot termeltetünk.
9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy bakteriális eredetű ketopantoát reduktázt túltermelni képes mikroorganizmust tenyésztünk.
10. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Bacillusból származó ketopantoát reduktázt túltermelni képes mikroorganizmust tenyésztünk.
11. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Bacillus subtilisből származó ketopantoát reduktázt túltermelni képes mikroorganizmust tenyésztünk.
12. A 7-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ketopantoát reduktáz túltermelésén kívül, továbbá legalább egy pantotenát bioszintetikus enzim túltermelésére képes KPAR-0 mikroorganizmust tenyésztünk.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy továbbá ketopantoát hidroxi-metil-transzferáz, pantotenát szintetáz és aszpartát α-dekarboxiláz közül legalább egyet túltermelni képes KPAR-0 mikroorganizmust tenyésztünk.
14. Eljárás pantotenát termeltetésére prekurzor-adagolástól független módon, azzal jellemezve, hogy deregulált izoleucinvalín (ilv) folyamatsorral rendelkező, aszpartát-a-dekarboxilázt túltermelő mikroorganizmust (AaD-0) tenyésztünk olyan körülmények között, hogy pantotenát termelődik.
15. Eljárás legalább 2 g/1 pantotenát termeltetésére aszpartát- vagy β-alanin-adagolástól független módon, azzal jel- it .365/BE
341 lemezve, hogy aszpartát-a-dekarboxilázt túltermelő mikroorganizmust (AaD-O) tenyésztünk olyan körülmények között, hogy pantotenát termelődik.
16. Eljárás legalább 2 g/1 pantotenát termeltetésére valinvagy α-ketoizovalerát-adagolástól független módon, azzal jellemezve, hogy deregulált izoleucin-valin (ilv) folyamatsorral rendelkező mikroorganizmust (AaD-O) tenyésztünk olyan körülmények között, hogy pantotenát termelődik.
17. Eljárás legalább 30 g/1 pantotenát termeltetésére aszpartát- vagy β-alanin-adagolástól független módon, azzal jellemezve, hogy aszpartát-a-dekarboxilázt túltermelő mikroorganizmust (AaD-O) tenyésztünk olyan körülmények között, hogy pantotenát termelődik.
18. Eljárás legalább 30 g/1 pantotenát termeltetésére valinvagy α-ketoizovalerát-adagolástól független módon, azzal jellemezve, hogy deregulált izoleucin-valin (ilv) folyamatsorral rendelkező mikroorganizmust (AaD—0) tenyésztünk olyan körülmények között, hogy pantotenát termelődik.
19. Eljárás pantotenát β-alanintól független, magas hozamú termeltetésere, azzal jellemezve, hogy manipulált mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, hogy pantotenát termelődik.
20. A 14-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aceto-hidroxisav szintetázt túltermelni képes, vagy ilvBN-nukleinsav-szekvenciát vagy alsS-szekvenciát tartalmazó vektorral transzformált mikroorganizmust tenyésztünk.
21. A 14-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal
74.365/BE
342 jellemezve, hogy aceto-hidroxisav izomeroreduktázt túltermelni képes, vagy ilvC-nukleinsav-szekvenciát tartalmazó vektorral transzformált mikroorganizmust tenyésztünk.
22. A 14-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dihidroxisav dehidratázt túltermelni képes, vagy ilvD-nukleinsav-szekvenciát tartalmazó vektorral transzformált mikroorganizmust tenyésztünk.
23. A 14-22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aszpartát α-dekarboxilázt túltermelni képes, vagy panD-nukleinsav-szekvenciát tartalmazó vektorral transzformált mikroorganizmust tenyésztünk.
24. A 14-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy továbbá deregulált pantotenát bioszintetikus folyamatsorral rendelkező mikroorganizmust tenyésztünk.
25. A 14-24. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy továbbá mutáns avtA-gén, mutáns ilvE-gén, mutáns ansB-gén és mutáns alsD-gén közül legalább egy mutáns gént tartalmazó mikroorganizmust tenyésztünk.
26. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ketopantoát hidroxi-metil-transzferáz, ketopantoát reduktáz, pantotenát szintetáz és aszpartát α-dekarboxiláz bármelyikét túltermelni képes mikroorganizmust tenyésztünk.
27. A 24. vagy 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmust panBCD-nukleinsavszekvenciát tartalmazó vektorral vagy panEl-nukleinsavszekvenciát tartalmazó vektorral transzformáljuk.
28. A 14-16. és 19-27. igénypontok bármelyike szerinti eljá
74.365/BE
343 rás, azzal jellemezve, hogy 10 g/l-nél magasabb, 20 g/l-nél magasabb vagy 40 g/1 magasabb koncentrációban termeltetünk pantotenátot.
29. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Bacillusból származó aceto-hidroxisav szintetázt túltermelni képes, vagy Bacillusból származó, ilvBN-nukleinsav-szekvenciát vagy alsS-szekvenciát tartalmazó vektorral transzformált mikroorganizmust tenyésztünk.
30. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Bacillusból származó aceto-hidroxisav izomeroreduktázt túltermelni képes, vagy Bacillusból származó ilvC-nukleinsav-szekvenciát tartalmazó vektorral transzformált mikroorganizmust tenyésztünk .
31. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Bacillusból származó dihidroxisav dehidratázt túltermelni képes, vagy Bacillusból származó ilvD-nukleinsav-szekvenciát tartalmazó vektorral transzformált mikroorganizmust tenyésztünk.
32. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Bacillusból származó aszpartát α-dekarboxilázt túltermelni képes, vagy Bacillusból származó panD-nukleinsav-szekvenciát tartalmazó vektorral transzformált mikroorganizmust tenyésztünk.
33. A 24. vagy 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Bacillusból származó ketopantoát hidroxi-metiltranszferáz, ketopantoát reduktáz, pantotenát szintetáz és aszpartát α-dekarboxiláz bármelyikét túltermelni képes mikroorganizmust tenyésztünk.
34. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy
74.365/BE
344
Bacillusból származó, panBCD-nukleinsavszekvenciát vagy panElnukleinsavszekvenciát tartalmazó vektorral transzformálunk.
35. Eljárás panto-vegyület termeltetésére, azzal jellemezve, hogy legalább egy pantotenát bioszintetikus folyamatsorban lévő prekurzort vagy izoleucin-valin bioszintetikus folyamatsorban lévő prekurzort tartalmazó készítményt legalább egy, Bacillusból izolált enzimmel, például ketopantoát hidroxi-metil-transzferázzal, ketopantoát reduktázzal, pantotenát szintetázzal vagy aszpartát oc-dekarboxilázzal érintkeztetünk olyan körülmények között, amelyben panto-vegyület termelődik.
36. Eljárás β-alanin termeltetésére, azzal jellemezve, hogy aszpartát ct—dekarboxilázt tultermelni képes (AotD—O) mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben β-alanin termelődik.
37. A 36. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pantotenát bioszintetikus enzimet, például ketopantoát hidroximetil-transzferázt, ketopantoát reduktázt vagy pantotenát szintetázt kódoló nukleotidszekvenciában mutációval rendelkező AaD-0 mikroorganizmust tenyésztünk.
38. Eljárás β-alanin termeltetésére, azzal jellemezve, hogy aszpartátot tartalmazó készítményt érintkeztetünk Bacillusból izolált aszpartát α-dekarboxiláz-enzimmel olyan körülmények között, amelyben a panto-vegyület termelése fokozott.
39. Eljárás panto-vegyület termelésének fokozására, azzal jellemezve, hogy mutáns coaX-génnel rendelkező, mutáns mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben a panto-vegyület termelése fokozott.
7 4.3 65/BE
345
40. A 39. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mutáns coaA-génnel rendelkező, rekombináns mikroorganizmust tenyésztünk.
41. Eljárás panto-vegyület termeltetésére, azzal jellemezve, hogy pantotenát kináz mutáns mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben a panto-vegyület termelése szignifikánsan nagy hozamú.
42. A 41. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mutáns coaA-génnel rendelkező, mutáns mikroorganizmust tenyésztünk .
43. A 41. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mutáns coaX-génnel rendelkező, mutáns mikroorganizmust tenyésztünk .
44. A 41. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mutáns coaA- és coaX-génnel rendelkező, mutáns mikroorganizmust tenyésztünk.
45. A 39-44. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pato-vegyületként ketopantoát, pantoát vagy pantotenát termelését fokozzuk.
46. A 39-44. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pato-vegyületként pantotenát termelését fokozzuk .
47. A 39-44. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy például 10 g/l-nél nagyobb, 20 g/l-nél nagyobb vagy 40 g/l-nél nagyobb mennyiségben termeltetünk pantovegyületet.
48. A 39-44. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal
74.365/BE
346 jellemezve, hogy továbbá deregulált pantotenát bioszintetikus folyamatsorral, vagy továbbá deregulált izoleucin-valin (ilv) bioszintetikus folyamatsorral rendelkező, rekombináns mikroorganizmust tenyésztünk.
49. A 39-44. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy továbbá panD-t és panE-t túltermelni képes, rekombináns mikroorganizmust tenyésztünk.
50. A 39-44. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy továbbá mutáns avtA-gén, mutáns ilvE-gén, mutáns ansB-gén és mutáns alsD-gén közül legalább egy, mutáns gént tartalmazó, rekombináns mikroorganizmust tenyésztünk.
51. Eljárás panto-vegyület termelésének fokozására, azzal jellemezve, hogy deregulált pantotenát bioszintetikus folyamatsorral, és csökkentett pantotenát kináz-aktivitást eredményező mutációval is rendelkező mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, amelyben a panto-vegyület termelése fokozódik.
52. Eljárás pantotenát kináz-aktivitást modulálni képes vegyületek azonosítására, azzal jellemezve, hogy coaX-gén által kódolt pantotenát kinázt expresszáló, rekombináns sejtet érintkeztetünk egy teszt-vegyülettel, és meghatározzuk, hogy a tesztvegyület milyen mértékben képes modulálni pantotenát kináz-aktivitást a sejtben.
53. Az 52. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy továbbá mutáns coaA-gén által kódolt, csökkentett aktivitással rendelkező pantotenát kinázt tartalmazó sejtet érintkeztetünk.
54. Az 1-51. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Gram-pozitív mikroorganizmust alkalmazunk.
74.365/BE
347
55. Az 1-51. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Gram-negativ mikroorganizmust alkalmazunk.
56. Az 1-51. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Bacillus, Corynebacterium, LactoBacillus, Lactococci vagy Streptomyces nemzetséghez tartozó mikroorganizmust alkalmazunk.
57. Az 1-51. és 54-56. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Bacillus nemzetséghez tartozó mikroorganizmust alkalmazunk.
58. Az 1-51. és 54-57. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Bacillus subtilist alkalmazunk.
59. Az 1-13., 35., 39-51. és 54-58. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy továbbá kinyerjük a panto-vegyületet.
60. Az 14-34. és 54-58. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy továbbá kinyerjük a pantotenátot.
61. Az 1-14., 35., 39-46., 48-51. és 54-59. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 2 g/l-nél nagyobb mennyiségben termeltetünk panto-vegyületet.
62. Rekombinás mikroorganizmus, amely legalább egy, Bacillusból származó, pantotenát bioszintetikus enzimet képes túltermelni .
63. A 62. igénypont szerinti rekombináns mikroorganizmus, amely legalább egy, Bacillus subtilisből származó, pantotenát bioszintetikus enzimet képes túltermelni.
64. A 62. vagy 63. igénypont szerinti rekombináns mikroorga-
74.365/BE
348 :.:.
• * ·* · · · nizmus, amely pantotenát bioszintetikus enzimként ketopantoát hidroxi-metil-transzferázt, pantotenát szintetázt, aszpartát α-dekarboxilázt vagy ketopantoát reduktázt képes túltermelni.
65. A 62-64. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns mikroorganizmus, amely pantotenát bioszintetikus enzimként ketopantoát reduktázt képes túltermelni.
66. Rekombináns mikroorganizmus, amely aszpartát a-dekarboxilázt képes túltermelni, és deregulált izoleucin-valin (ilv) bioszintetikus folyamatsorral rendelkezik.
67. Rekombináns mikroorganizmus, amely mutáns coaX-génnel rendelkezik, amely mutáns coaX-gén csökkentett pantotenát kinázaktivitást kódol a mikroorganizmusban.
68. A 67. igénypont szerinti rekombináns mikroorganizmus, amely továbbá mutáns coaA—génnél rendelkezik, amely mutáns coaA— gén csökkentett pantotenát kináz—aktivitást kódol a mikroorganizmusban .
69. Rekombináns mikroorganizmus, amely mutáns coaX-génnel rendelkezik, és adott esetben mutáns coaA-génnel rendelkezik, amely mutáns mikroorganizmus csökkentett pantotenát kináz aktivitással rendelkezik vad típusú coaA- és coaX-génekkel rendelkező mikroorganizmushoz hasonlítva.
70. Rekombináns mikroorganizmus, amely izolált coaX-gént tartalmazó vektort tartalamaz.
71. Rekombináns mikroorganizmus, amely panto-vegyületet képes túltermelni, amely mikroorganizmus deregulált pantotenát bioszintetikus folyamatsorral és legalább egy, olyan mutációval rendelkezik, amely csökkenti a mikroorganizmus koenzim-A-t (CoA)
74.365/BE
349 . : : .· .· :.:, ·· «* · ♦ · szintetizáló képességét.
72. A 71. igénypont szerinti rekombináns mikroorganizmus, amely csökkentett szintű pantotenát kináz-aktivitást eredményező, legalább egy mutációval rendelkezik.
73. A 72. igénypont szerinti rekombináns mikroorganizmus, amely csökkentett szintű CoaA-enzimaktivitást eredményező, coaAgénben vagy homológjában legalább egy mutációval rendelkezik.
74. A 72. igénypont szerinti rekombináns mikroorganizmus, amely csökkentett szintű CoaX-enzimaktivitást eredményező, coaXgénben vagy homológjában legalább egy mutációval rendelkezik.
75. A 72. igénypont szerinti rekombináns mikroorganizmus, amely csökkentett szintű CoA-enzimaktivitást és csökkentett mértékű CoaX-enzimaktivitást eredményező, coaA-génben vagy homológjában mutációval rendelkezik és coaX-génben vagy homológjában mutációval rendelkezik.
76. A 66-70. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns mikroorganizmus, amely továbbá deregulált pantotenát bioszintetikus folyamatsorral rendelkezik.
77. A 62-65. és 67-75. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns mikroorganizmus, amely továbbá deregulált izoleucinvalin (ilv) bioszintetikus folyamatsorral rendelkezik.
78. A 62-77. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns mikroorganizmus, amely Gram-pozitiv.
79. A 78. igénypont szerinti rekombináns mikroorganizmus, amely Bacillus, Corynebacterium, LactoBacillus, Lactococci vagy Streptomyces nemzetséghez tartozik.
80. A 79. igénypont szerinti rekombináns mikroorganizmus,
74.365/BE
350 amely Bacillus nemzetséghez tartozik.
81. A 80. igénypont szerinti rekombináns mikroorganizmus, amely Bacillus subtilis.
82. Rekombináns mikroorganizmus, amely PA221, PA235, PA236, PA313, PA410, PA402, PA403, PA411, PA412, PA413, PA303, PA327, PA328, PA401, PA340, PA342, PA404, PA405, PA374, PA354, PA365, PA377, PA651 vagy PA824.
83. Rekombináns vektor panto-vegyületek termeltetésére történő alkalmazásra, amely vektor legalább egy, Bacillusból származó, pantotenát bioszintetikus enzimet kódoló nukleinsav— -szekvenciát tartalmaz szabályzó szekvenciákhoz működőképesen kapcsolva.
84. A 83. igénypont szerinti vektor, amely legalább egy, Bacillus subtilisből származó, pantotenát bioszintetikus enzimet kódoló nukleinsavszekvenciát tartalmaz.
85. A 84. igénypont szerinti vektor, amely ketopantoát hidroxi-metil-transzferáz, pantotenát szintetáz, aszpartát α-dekarboxiláz és ketopantoát reduktáz közül legalább egyet kódoló nukleinsavszekvenciát tartalmaz.
86. Rekombináns vektor, amely 23., 25., 27., 29. és 59. számú nukleotidszekvenciák közül legalább egyet tartalmaz.
87. A 84. igénypont szerinti vektor, amely ketopantoát reduktázt kódoló nukleinsavszekvenciát tartalmaz.
88. Vekor, amely mutáns coaX-gént tartalmaz, amely mutáns csökkentett aktivitással rendelkező pantotenát kináz enzimet kódol .
89. Vektor, amely izolált coaX-gént tartalmaz.
74.365/BE
351
90. Vektor, amely izolált, Bacillusból származó coaX-gént tartalmaz.
91. Vektor, amely izolált, Bacillus subtilis coaX-gént tartalmaz .
92. A 86. és 89-91. igénypontok bármelyike szerinti vektor, amely továbbá szabályzó szekvenciákat tartalmaz.
93. A 83-85. és 87-92. igénypontok bármelyike szerinti vektor, amely konstitutiven aktív promótert tartalmazó, szabályzó szekvenciákat tartalmaz.
94. A 93. igénypont szerinti vektor, amely konstitutiven aktív promóterként Pveg (41. számú szekvencia), Pveg (39. számú szekvencia) vagy Pveg (40. számú szekvencia) szekvenciákat tartalmaz.
95. A 83. igénypont szerinti vektor, amely legalább egy, mesterséges riboszóma-kötőhelyet (RBS-t) tartalmazó, szabályzó szekvenciát tartalmaz.
96. A 95. igénypont szerinti vektor, amely mesterséges RBSként 49., 50., 51., 52., 53., 54., 55., 56. vagy 57. számú nukleotidszekvenciát tartalmaz.
97. Vektor, amely pAN004, pAN005, pAN006, pAN236, pAN423, pAN428, pAN429, pAN441, pAN442, pAN443, pAN251, pAN267, pAN256, pAN257, pAN263, pAN240, pAN294, pAN296, pAN336, pAN341 vagy pAN342.
98. Rekombináns mikroorganizmus, amely 86. vagy 93. igénypont szerinti vektort tartalmaz.
99. Izolált nukleinsavmolekula, amely legalább egy, Bacillusból származó pantotenát bioszintetikus gént tartalmaz.
100. A 99. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, amely leg-
74.365/BE
352 alább egy, Bacillus subtilisből származó pantotenát bioszintetikus gént tartalmaz.
101. Ά 99. vagy 100. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, amely ketopantoát reduktázt kódol.
102. Izolált, Bacillusból származó, pantotenát bioszintetikus enzim-polipeptid.
103. Izolált, Bacillus subtilisből származó, pantotenát bioszintetikus enzim-polipeptid.
104. Izolált, Bacillusból származó, ketopantoát reduktázpolipeptid.
105. Izolált, Bacillus subtilisből származó, ketopantoát reduktáz-polipeptid.
106. Izolált, Bacillusból származó, aszpartát a-dekarboxiláz-polipeptid.
107. Izolált, Bacillus subtilisből származó, aszpartát a-dekarboxiláz-polipeptid.
108. Izolált nukleinsavmolekula, amely mutáns coaX-gént tartalmaz .
109. Izolált nukleinsavmolekula, amely coaX-gént tartalmaz.
110. Izolált pantotenát kináz-fehérje, melyet coaX-gén kódol.
HU0202705A 1999-09-21 2000-09-21 Eljárások és mikroorganizmusok panto-vegyületek előállítására HU230509B1 (hu)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US40049499A 1999-09-21 1999-09-21
US09/400,494 1999-09-21
US21007200P 2000-06-07 2000-06-07
US60/210,072 2000-06-07
US22183600P 2000-07-28 2000-07-28
US60/221,836 2000-07-28
US22786000P 2000-08-24 2000-08-24
US60/227,860 2000-08-24
PCT/US2000/025993 WO2001021772A2 (en) 1999-09-21 2000-09-21 Methods and microorganisms for production of panto-compounds

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0202705A2 true HUP0202705A2 (hu) 2002-12-28
HUP0202705A3 HUP0202705A3 (en) 2011-02-28
HU230509B1 HU230509B1 (hu) 2016-09-28

Family

ID=27498789

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0202705A HU230509B1 (hu) 1999-09-21 2000-09-21 Eljárások és mikroorganizmusok panto-vegyületek előállítására

Country Status (16)

Country Link
EP (2) EP2163629B1 (hu)
JP (1) JP5392957B2 (hu)
KR (1) KR20020092912A (hu)
CN (1) CN1420931A (hu)
AU (1) AU7708700A (hu)
BR (1) BRPI0014115B8 (hu)
CA (1) CA2385497A1 (hu)
CZ (1) CZ20021013A3 (hu)
HU (1) HU230509B1 (hu)
IL (1) IL148786A0 (hu)
MX (1) MXPA02003017A (hu)
NO (1) NO20021382L (hu)
PL (1) PL356566A1 (hu)
SK (1) SK5222002A3 (hu)
TR (1) TR200200751T2 (hu)
WO (1) WO2001021772A2 (hu)

Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6830898B2 (en) 2000-08-24 2004-12-14 Omnigene Bioproducts, Inc. Microorganisms and assays for the identification of antibiotics
DE10101501A1 (de) * 2001-01-12 2002-08-01 Forschungszentrum Juelich Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pantothensäure
PL369009A1 (en) * 2001-01-19 2005-04-18 Basf Aktiengesellschaft Microorganisms and processes for enhanced production of pantothenate
BR0206587A (pt) * 2001-01-19 2005-12-13 Basf Ag Processo para a produção de uma composição de pantotenato livre de hmbpa, produto, composição de pantotenato livre de hmbpa, composição sintetizada por um microorganismo possuindo uma rota biossintética de pantotenato desregulada, microorganismo recombinante para a produção de composições de pantotenato livres de hmbpa, e, processo para a produção de uma composição de pantotenato: hmbpa seletivamente misturada
DE10108225A1 (de) 2001-02-21 2002-10-10 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln
DE10108223A1 (de) 2001-02-21 2002-10-10 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln
RU2003128532A (ru) 2001-02-21 2005-03-27 Басф Акциенгезелльшафт (De) Способ получения d-пантотеновой кислоты и/или ее солей, используемых в качестве добавок при производстве кормов для животных
CN1294271C (zh) 2001-02-21 2007-01-10 巴斯福股份公司 制备作为动物饲料添加剂的d－泛酸和/或其盐的方法
EP1247868A3 (de) * 2001-04-03 2002-10-30 Degussa AG Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen
EP1402047A1 (en) * 2001-07-03 2004-03-31 Degussa AG Process for the fermentative preparation of d-pantothenic acid and/or salts thereof
EP1402046A1 (en) * 2001-07-03 2004-03-31 Degussa AG Process for the fermentative preparation of d-pantothenic acid and/or salts thereof
DE10132178A1 (de) 2001-07-03 2003-01-23 Degussa Verfahren zur fermantativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen
EP1404840A2 (en) 2001-07-07 2004-04-07 Degussa AG Process for the preparation of d-pantothenic acid and/or salts thereof
EP1672073A1 (en) * 2001-07-07 2006-06-21 Degussa AG Process for the preparation of D-pantothenic acid and/or salts thereof
US7309597B2 (en) 2002-01-18 2007-12-18 Cargill, Incorporated Alanine 2,3-Aminomutase
US20060099692A1 (en) * 2002-07-03 2006-05-11 Yocum R R Microorganisms and processes for enhanced production of pantothenate
MXPA04012812A (es) * 2002-07-03 2005-02-24 Basf Ag Microorganismos y proceso para la produccion aumentada de pantotenato.
KR101185656B1 (ko) * 2003-06-18 2012-09-24 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 포자를 형성할 수 없는 미생물을 사용한 판토텐산염의 제조방법
WO2006104124A1 (ja) * 2005-03-29 2006-10-05 Kaneka Corporation 新規パントテン酸キナーゼ遺伝子及びその利用方法
US9303225B2 (en) 2005-10-26 2016-04-05 Butamax Advanced Biofuels Llc Method for the production of isobutanol by recombinant yeast
EP1948814B1 (en) 2005-10-26 2018-11-21 Butamax (TM) Advanced Biofuels LLC Fermentive production of four carbon alcohols
US8273558B2 (en) 2005-10-26 2012-09-25 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Fermentive production of four carbon alcohols
CN101448950B (zh) 2006-05-16 2014-02-12 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于生产泛醇的工艺
EP1918383A1 (en) * 2006-11-02 2008-05-07 DSMIP Assets B.V. Semi-continuous fermentation process for pantothenate production
EP2118266A4 (en) 2007-02-09 2010-05-19 Univ California BIOFUEL PRODUCTION BY RECOMBINANT MICROORGANISMS
MX298012B (es) 2007-07-06 2012-11-04 Basf Se Metodo para la produccion de una solucion de glucosa acuosa a partir de maiz.
EP3351619A1 (en) * 2008-03-27 2018-07-25 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of adipic acid and other compounds
EP2157174A1 (en) * 2008-08-12 2010-02-24 DSM IP Assets B.V. Increased production of pantothenate (vitamin B5)
CN103492560B (zh) * 2011-02-07 2016-09-28 威廉马什莱斯大学 逆向β氧化途径
US8765426B2 (en) * 2011-04-07 2014-07-01 E I Du Pont De Nemours And Company Pantothenic acid biosynthesis in zymomonas
EP2723878B1 (en) 2011-06-21 2020-05-20 DSM IP Assets B.V. Vitamin b5 production
WO2012175574A1 (en) 2011-06-21 2012-12-27 Dsm Ip Assets B.V. Increased pantothenate (vitamin b5) production
WO2014087184A1 (en) * 2012-12-03 2014-06-12 Metabolic Explorer Neopentyl glycol fermentative production by a recombinant microorganism
US9896464B2 (en) 2013-10-25 2018-02-20 Retrophin, Inc. Pantothenate derivatives for the treatment of neurological disorders
CN104593398B (zh) * 2013-11-01 2017-06-06 中国科学院微生物研究所 一种高L‑天冬氨酸α羧化酶活性的工程菌及其在生产β‑丙氨酸中的应用
CN105368758B (zh) * 2015-03-16 2018-06-19 鲁东大学 一株高产天冬氨酸脱羧酶的菌株及用于生产丙氨酸的方法
CN108486110A (zh) * 2015-03-31 2018-09-04 中国农业科学院生物技术研究所 一种启动子和重组表达载体及其用途
EP3386995A1 (en) 2015-12-08 2018-10-17 Retrophin, Inc. Cyclic phosphates and cyclic phosphoramidates for the treatment of neurologic disorders
CA3068459A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Ptt Global Chemical Public Company Limited Microorganism with stabilized copy number of functional dna sequence and associated methods
CN108456701B (zh) * 2018-03-23 2020-10-16 精晶药业股份有限公司 一种d-泛解酸内酯的制备方法
US20220119821A1 (en) * 2018-06-25 2022-04-21 Lygos, Inc. Recombinant host cells and methods for the production of aspartic acid and b-alanine
JP7491588B2 (ja) * 2018-07-09 2024-05-28 コデクシス， インコーポレイテッド 操作されたパントテン酸キナーゼ改変体酵素
WO2021178805A1 (en) 2020-03-06 2021-09-10 Gevo, Inc. Novel nkr variants for increased production of isobutanol
EP4174185A4 (en) * 2020-06-28 2024-05-22 Mint Biotechnologies Co., Ltd. Methods for preparing pantoic acid, pantothenic acid and panthenol as well as salts thereof
KR102389327B1 (ko) * 2020-07-01 2022-04-20 씨제이제일제당 (주) 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물, 및 이의 용도
CN115109736B (zh) * 2021-03-23 2024-05-07 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种产泛解酸的微生物及其构建方法和应用
EP4323331A1 (en) 2021-04-15 2024-02-21 DSM IP Assets B.V. Production of panthenol
EP4108654A1 (en) 2021-06-23 2022-12-28 DSM IP Assets B.V. Production of panthenol
CN114085820B (zh) * 2021-11-19 2023-10-20 万华化学集团股份有限公司 来源于Candida viswanathii的酮基泛解酸内酯还原酶
CN114437988B (zh) * 2022-02-28 2023-05-23 贵州医科大学 纤维素降解菌及菌剂、制备方法、应用和降解酒糟的方法
CN115595314B (zh) * 2022-03-07 2025-06-24 中国科学院微生物研究所 表达天冬氨酸脱氢酶的工程菌及发酵生产维生素b5的方法
CN115595328B (zh) * 2022-03-07 2026-02-13 中国科学院微生物研究所 天冬氨酸脱羧酶在发酵生产维生素b5中的应用
KR20250110877A (ko) 2022-11-21 2025-07-21 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 판테놀 제조
EP4378923A1 (en) 2022-12-01 2024-06-05 DSM IP Assets B.V. Production of panthenol
KR102879056B1 (ko) 2023-01-27 2025-10-30 씨제이제일제당 (주) 글루타미시박터 할로피토콜라 유래 판토에이트-베타-알라닌 리가아제의 활성이 강화된 미생물 및 이의 용도
KR102879057B1 (ko) 2023-01-27 2025-10-30 씨제이제일제당 (주) 아르카노박테리움 포시시마일 유래 판토에이트-베타-알라닌 리가아제의 활성이 강화된 미생물 및 이의 용도
CN116463272A (zh) * 2023-02-22 2023-07-21 浙江工业大学 一种高产d-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用
CN116590209A (zh) * 2023-06-13 2023-08-15 浙江工业大学 一种产d-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用
CN119709733B (zh) * 2023-09-28 2025-11-28 安徽华恒生物科技股份有限公司 一种动态调控系统、泛解酸生产菌株及其制备方法和应用
CN119220576B (zh) * 2024-12-03 2025-07-25 浙江工业大学 基于一碳单位供应的产d-泛酸基因工程菌及构建与应用
CN120060194B (zh) * 2025-02-27 2025-10-28 中国农业科学院植物保护研究所 一种用于提高放线菌聚酮类天然产物产量的组合模块及含有其重组菌的构建与应用
CN121046335B (zh) * 2025-11-06 2026-02-24 诸城市浩天药业有限公司 一种耐热、半衰期长的泛酸合成酶突变体

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5024943A (en) * 1985-11-07 1991-06-18 Gist-Brocades Regulatory region cloning and analysis plasmid for bacillus
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
JP3710497B2 (ja) 1992-09-25 2005-10-26 ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト Ｄ−パント酸、ｄ−パントテン酸およびそれらの塩の製造法
AU6943696A (en) 1995-09-13 1997-04-01 Takeda Chemical Industries Ltd. Process for producing d-pantoic acid and d-pantothenic acid or salts thereof
US5834259A (en) * 1996-10-28 1998-11-10 Monsanto Company Process and composition for preparing D-aspartic acid
DE19855312A1 (de) * 1998-12-01 2000-06-08 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien
DE19855313A1 (de) * 1998-12-01 2000-06-08 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure durch Verstärkung des panD-Gens in Mikroorganismen

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0014115B8 (pt) 2021-05-25
EP1214420B1 (en) 2016-03-23
NO20021382L (no) 2002-05-16
TR200200751T2 (tr) 2004-08-23
WO2001021772A2 (en) 2001-03-29
BRPI0014115B1 (pt) 2015-05-05
PL356566A1 (en) 2004-06-28
KR20020092912A (ko) 2002-12-12
EP2163629B1 (en) 2017-03-08
BR0014115A (pt) 2002-05-21
EP2163629A3 (en) 2010-06-02
CZ20021013A3 (en) 2002-12-11
AU7708700A (en) 2001-04-24
HUP0202705A3 (en) 2011-02-28
EP1214420A2 (en) 2002-06-19
WO2001021772A9 (en) 2002-12-05
HU230509B1 (hu) 2016-09-28
NO20021382D0 (no) 2002-03-20
EP2163629A2 (en) 2010-03-17
CN1420931A (zh) 2003-05-28
JP5392957B2 (ja) 2014-01-22
JP2003527828A (ja) 2003-09-24
SK5222002A3 (en) 2003-03-04
WO2001021772A3 (en) 2002-03-07
MXPA02003017A (es) 2004-09-06
IL148786A0 (en) 2002-09-12
CA2385497A1 (en) 2001-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
MXPA02003017A (es) Metodos y microorganismos para la produccion de panto-compuestos.
Bork et al. A new family of carbon‐nitrogen hydrolases
WO2002083869A3 (en) Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
CA2396052A1 (en) Increased lysine production by gene amplification
EP1961826A3 (en) A method for direct nucleic acid sequencing
BR9909409A (pt) Processo para produzir bactérias corineformes tendo uma melhorada produtividade de aminoácido ou ácido nucleico, genes sintetizando ácido glutâmico, e arginina sintetase, bactérias corineformes produzindo ácido glutâmico, e produzindo arginina e, processos para produzir um aminoácido ou ácido nucleico por fermentação, e para produzir ácido l-glutâmico por fermentação.
DE88166T1 (de) Verfahren zum exprimieren eines gens.
AU2001274537A1 (en) Novel glucose-6-phosphate dehydrogenase
WO2004080386A3 (en) Optimization of bacterial sucab expression by promoter mutagenesis for efficient l-glutamic acid production
AU2967497A (en) Enhancement of gene expression
KR100323899B1 (ko) 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 단백질 및 이것을 코딩하는 유전자
US9840700B2 (en) DNA cleavage enzyme
AU7854694A (en) Genes for butyrobetaine/crotonobetaine-l-carnitine metabolism and their use for the microbiological production of l-carine
WO2003040180A3 (de) Gene von corynebacterium glutamicum, die für genetische stabilitäts-, genexpressions- und faltungsproteine kodieren
HUP0101569A2 (hu) Egy génklaszterből származó gének
WO2024071429A1 (ja) Ｄｎａライブラリー調製法
DK1639119T3 (da) Fremgangsmåde til mikrobiologisk isomerisering af alpha-hydroxycarboxylsyrer
US20050214912A1 (en) Method for producing an optically active amino acid
Ohshiro et al. Novel L-specific cleavage of the urethane bond of t-butoxycarbonylamino acids by whole cells of Corynebacterium aquaticum
SHIMURA et al. Processing of tRNA
장호성 Excision of 5-hydroxymethylcytosine by DEMETER DNA glycosylase from Arabidopsis
ATE159048T1 (de) Modifizierung des zellmetabolismus durch extrazellulöse nukleasen
JPWO2003085108A1 (ja) ヒダントイナーゼ遺伝子及びカルバミラーゼ遺伝子を有する組換えｄｎａ、並びにアミノ酸製造方法
RU94032791A (ru) Фрагменты днк, рекомбинантная плазмидная днк и способ получения нитрил-гидратазы
TH37378A (th) ยีนเพลนิซิลลินเอซิเสและโปรตีนที่ประมวลรหัสไว้ใน?ยีนดังกล่าวและสายพันธ์ B.megaterium ที่มีดีเอ็น?เอสายผสมที่มียีนเพลนิซิลินเอซิเลส

Legal Events

Date Code Title Description
FH91 Appointment of a representative

Free format text: FORMER REPRESENTATIVE(S): BELICZAY LASZLO, S.B.G. & K. SZABADALMI UEGYVIVOEI IRODA, HU

Representative=s name: RATHONYI ZOLTAN, S.B.G. & K. SZABADALMI UEGYVI, HU

FH92 Termination of representative

Representative=s name: BELICZAY LASZLO, S.B.G. & K. SZABADALMI UEGYVI, HU

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees