CN117402803A - 一种高产d-泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌、构建方法及应用 - Google Patents

一种高产d-泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌、构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因过程技术领域，公开了一种高产D‑泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌、构建方法及应用。本发明通过“来源于pP43NMK的P43启动子和RBS序列置换alsS基因的原有启动子，强化丙酮酸转化为乙酰乳酸；敲除ilvA基因，降低异亮氨酸浓度以增加泛解酸支路通量；同时敲除乳酸途径的基因lctE、mgsA、ywbC基因，敲除乙酰乙酸途径yxjF基因，从而减少乳酸的积累，促进细胞的生长；并敲除乙偶姻途径中的alsD、bdhA基因，削弱副产物的合成”，使得D‑泛酸产量增加，基于此，构建得到一种高产D‑泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌。

Description

一种高产D-泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌、构建方法及 应用
技术领域
本发明涉及基因过程技术领域，尤其涉及一种高产D-泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌、构建方法及应用。
背景技术
泛酸也叫做维生素B5，是一种水溶性维生素。由于水溶性维生素不能被储存在体内，因此，维生素B5只能通过饮食或补品获得。泛酸支持碳水化合物、蛋白质和脂肪代谢及血红蛋白合成。泛酸的作用之一是帮助蛋白质，碳水化合物和脂肪释放能量。简而言之，维生素B5是身体新陈代谢吃的食物必需的。泛酸是辅酶A的辅基。辅酶A是碳水化合物、脂肪和氨基酸代谢过程中许多可逆乙酰化反应的一个重要辅酶。乙酰辅酶A参与乙酰胆碱、乙酰氨基葡萄糖的合成及甾类化合物的生物合成。对脂肪酸、丙酮酸、α-酮戊二酸以及乙醛等具有氧化作用。丙二酸单酰辅酶A在脂肪酸的生物合成过程中起重要作用。脂酰辅酶A衍生物参与甘油三酯和磷脂的合成。因此，泛酸通过辅酶A在所有细胞代谢中发挥作用。泛酸存在D型和L型两种构型，但仅D型(D-PA)具有生物活性。
目前，D-泛酸的生产方法包括物理诱导结晶法、化学拆分法以及微生物法，其中微生物法又包含代谢工程法、发酵法和生物酶法。物理诱导结晶法是将钙化的β-丙氨酸与D,L-泛解酸内酯缩合得到D,L-泛酸钙混合溶液，加入D-泛酸钙晶种诱导结晶拆分D-泛酸钙。物理诱导结晶法工艺成熟，但只能生产泛酸钙，无法用于其他泛酸衍生物的生产。化学拆分法是在D,L-泛解酸内酯消旋物中加入奎宁、氯霉胺和麻黄素等化学拆分试剂拆分得到D-泛解酸内酯，再反应得到D-泛酸钙。化学拆分法是目前最主要的合成方法，但拆分剂价格昂贵分离困难，还存在毒性和环境污染问题。酶拆分法利用特异性酶水解D,L-泛解酸内酯消旋物中的L-泛解酸内酯拆分得到D-泛解酸内酯，再反应得到D-泛酸钙。但特异性酶的生产成本较高，导致酶拆分法的生产成本相对较高。
随着基因工程技术的发展，使用微生物产D-泛酸因其优势日益受到了人们的广泛关注。利用生物发酵法生产D-泛酸产品，可以利用葡萄糖等廉价的工业原料、经过生物体自身代谢反应而得到D-泛酸产品，通过合理运用微生物来生产D-泛酸，不仅能够保证泛酸的拆分质量而且还能降低反应成本。相较化学法，生物法具有更加绿色环保的优点。但由于野生型菌株因为自身的细胞经济性，胞内的D-泛酸生物合成途径受限于竞争途径以及辅因子的供给。目前，生物发酵法生产D-泛酸存在发酵产量不高等问题。
发明内容
为了解决上述生物发酵法生产D-泛酸产量不高的技术问题，本发明提供了一种高产D-泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌、构建方法及应用。本发明以枯草芽孢杆菌为底盘菌，通过代谢工程技术，改造其代谢途径中的关键基因，使之在发酵制备D-泛酸中能高效利用葡萄糖等底物，高效生产D-泛酸。
本发明的具体技术方案为：
一方面，本发明给出了一种高产D-泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌，以枯草芽孢杆菌为底盘菌构建，其构建方法包括以下步骤：
(1)增强alsS基因的表达；
(2)敲除ilvA、lctE、mgsA、yxjF、ywbC、alsD、bdhA基因。
泛酸是由a-酮异戊酸和L-天冬氨酸两种物质经过四步酶促反应生成。最后在泛酸合成酶的催化下由ATP提供能量连接β-丙氨酸和泛解酸生成泛酸。本发明以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为底盘菌，通过代谢工程技术，改造其代谢途径中的关键基因，使之在发酵制备D-泛酸中能高效利用葡萄糖等底物，高效生产D-泛酸。对枯草芽孢杆菌进行改造，得到高产D-泛酸的基因工程菌的具体原理为：
增强alsS基因的表达，强化丙酮酸转化为乙酰乳酸，从而提高D-泛酸合成；同时，将基因组中的ilvA基因敲除，降低支链L-异亮氨酸的合成，降低异亮氨酸浓度以增加泛解酸支路通量，进而增加D-泛酸的合成；另外，敲除乳酸途径的基因lctE、mgsA、ywbC基因，通过减少乳酸的积累，使得D-泛酸产量增加；敲除yxjF基因，降低乙酰乙酸合成，使得D-泛酸产量增加；敲除乙偶姻途径中的alsD、bdhA基因，通过降低支链有机酸、支链氨基酸的合成，使得D-泛酸产量增加。
基于上述原理，对枯草芽孢杆菌进行改造，可以使得枯草芽孢杆菌发酵生产D-泛酸产量增加，构建得到一种高产D-泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌。
其中，上述涉及的基因的序列如下：ilvA基因序列如SEQ ID No.2所示，alsS基因序列如SEQ ID No.3所示，lctE基因序列如SEQ ID No.4所示，mgsA基因序列如SEQ ID No.5所示，ywbC基因序列如SEQ ID No.6所示，alsD基因序列如SEQ ID No.7所示，bdhA基因序列如SEQ ID No.8所示，yxjF基因序列如SEQ ID No.9所示。
作为本发明上述技术方案的优选，所述底盘菌为Bacillus subtilis ATCC 6633。本发明采用基因型为B.subtilis ATCC 6633P43-panBpanCpanD panEilvCilvDserAglyA的B.subtilis ATCC 6633作为底盘菌进行实验，对本发明技术方案进行验证。该基因型菌株可以以Bacillus subtilis ATCC 6633为底盘菌，通过公开号为CN114276972A的专利公开的方法进行构建。
具体地，本发明底盘菌的构建方法包括以下步骤：
(1)以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为底盘菌，运用Cre/loxP基因编辑系统
将其基因组中的panB基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillussubtilis(P43-panB)；
(2)运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis(P43-panB)基因组中的panC基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanC)；
(3)运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanC)基因组中的panD基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanCpanD)；
(4)运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanCpanD)基因组中的panE基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillussubtilis(P43-panBpanCpanDpanE)；
(5)运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanCpanDpanE)基因组中的ilvC基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillussubtilis(P43-panBpanCpanDpanEilvC)；
(6)运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanCpanDpanEilvC)基因组中的ilvD基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanCpanDpanEilvCilvD)；
(7)运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanCpanDpanEilvCilvD)基因组中的serA基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserA)；
(8)运用Cre/lox P基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserA)基因组中的glyA基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserAglyA)，此即为本发明底盘菌。
另一方面，本发明还给出了上述高产D-泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
步骤S1：以枯草芽孢杆菌为底盘菌，增强底盘菌基因组中alsS基因的表达；
步骤S2：敲除底盘菌基因组中的ilvA、lctE、mgsA、yxjF、ywbC、alsD、bdhA基因。
本发明通过上述步骤S1～步骤S2对枯草芽孢杆菌进行改造，改造其代谢途径中的关键基因，使之在发酵制备D-泛酸中能高效利用葡萄糖等底物，高效生产D-泛酸。上述步骤S1～步骤S2的具体原理为：通过步骤S1增强alsS基因的表达，强化丙酮酸转化为乙酰乳酸，从而提高D-泛酸合成；同时，通过步骤S2将基因组中的ilvA基因敲除，降低支链L-异亮氨酸的合成，降低异亮氨酸浓度以增加泛解酸支路通量，进而增加D-泛酸的合成；另外，通过步骤S2敲除乳酸途径的基因lctE、mgsA、ywbC基因，通过减少乳酸的积累，使得D-泛酸产量增加；敲除yxjF基因，降低乙酰乙酸合成，使得D-泛酸产量增加；通过步骤S2敲除乙偶姻途径中的alsD、bdhA基因，通过降低支链有机酸、支链氨基酸的合成，使得D-泛酸产量增加。
作为本发明上述技术方案的优选，所述底盘菌为Bacillus subtilis ATCC 6633。
其中，上述步骤涉及的基因的序列如下：ilvA基因序列如SEQ ID No.2所示，alsS基因序列如SEQ ID No.3所示，lctE基因序列如SEQ ID No.4所示，mgsA基因序列如SEQ IDNo.5所示，ywbC基因序列如SEQ ID No.6所示，alsD基因序列如SEQ ID No.7所示，bdhA基因序列如SEQ ID No.8所示，yxjF基因序列如SEQ ID No.9所示。
作为本发明上述技术方案的优选，增强底盘菌基因组中alsS基因的表达的方法为：将alsS基因的启动子替换为P43启动子。
作为本发明上述技术方案的优选，所述P43启动子的基因序列如SEQ ID No.1所示。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
本发明以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为底盘菌，通过代谢工程技术，改造其代谢途径中的关键基因，具体地，通过“增强alsS基因的表达，强化丙酮酸转化为乙酰乳酸，从而提高D-泛酸合成；同时，将基因组中的ilvA基因敲除，降低支链L-异亮氨酸的合成，降低异亮氨酸浓度以增加泛解酸支路通量，进而增加D-泛酸的合成；另外，敲除乳酸途径的基因lctE、mgsA、ywbC基因，通过减少乳酸的积累，使得D-泛酸产量增加；敲除yxjF基因，降低乙酰乙酸合成，使得D-泛酸产量增加；敲除乙偶姻途径中的alsD、bdhA基因，通过降低支链有机酸、支链氨基酸的合成，使得D-泛酸产量增加”，基于此，构建得到一种高产D-泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌，使枯草芽孢杆菌在发酵制备D-泛酸中能高效利用葡萄糖等底物，高效生产D-泛酸。
附图说明
图1为本发明的D-泛酸代谢途径改造位点示意图；
图2实施例2所构建工程菌OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量结果图；
图3为实施例3所构建工程菌OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量结果图；
图4为实施例4所构建工程菌OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量结果图；
图5为实施例5所构建工程菌OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量结果图；
图6为实施例6所构建工程菌OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量结果图；
图7为实施例7所构建工程菌OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量结果图；
图8为实施例8所构建工程菌OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量结果图；
图9为实施例9所构建工程菌OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明实施例采用基因型为B.subtilis ATCC 6633P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserAglyA的B.subtilis ATCC 6633作为底盘菌进行实验，对本发明技术方案进行验证。该基因型菌株以Bacillus subtilis ATCC 6633为底盘菌，通过公开号为CN114276972A的专利公开的方法进行构建。其构建方法包括以下步骤：
(1)以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为底盘菌，运用Cre/loxP基因编辑系统
将其基因组中的panB基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillussubtilis(P43-panB)；
(2)运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis(P43-panB)基因组中的panC基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanC)；
(3)运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanC)基因组中的panD基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanCpanD)；
(4)运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanCpanD)基因组中的panE基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillussubtilis(P43-panBpanCpanDpanE)；
(5)运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanCpanDpanE)基因组中的ilvC基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillussubtilis(P43-panBpanCpanDpanEilvC)；
(6)运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanCpanDpanEilvC)基因组中的ilvD基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanCpanDpanEilvCilvD)；
(7)运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanCpanDpanEilvCilvD)基因组中的serA基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserA)；
(8)运用Cre/lox P基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserA)基因组中的glyA基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis(P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserAglyA)，此即为本发明底盘菌亲本菌株DPA8(B.subtilis ATCC 6633(P43-panBpanCpanD panEilvCilvDserAglyA)。
D-泛酸代谢途径及本发明改造位点见图1。本发明及实施例中涉及的基因及相应途径见表1。
表1：基因编辑涉及的基因及相应途径
基因名称 涉及途径
ilvA L-异亮氨酸合成
alsS 乙酰乳酸、α,β-二羟基异戊酸合成
lctE、mgsA、ywbC 乳酸途径
alsD、bdhA 乙偶姻途径、2,3-丁二醇途径
yxjF 乙酰乙酸合成
其中，ilvA基因序列如SEQ ID No.2所示，alsS基因序列如SEQ ID No.3所示，lctE基因序列如SEQ ID No.4所示，mgsA基因序列如SEQ ID No.5所示，ywbC基因序列如SEQ IDNo.6所示，alsD基因序列如SEQ ID No.7所示，bdhA基因序列如SEQ ID No.8所示，yxjF基因序列如SEQ ID No.9所示。
本发明实施例中涉及的引物信息见表2。
表2：引物序列
本发明实施例中，如未特别说明，所述博来霉素在培养基中终浓度为0.025mg/L，所述卡那霉素在培养基中终浓度为0.1mg/L，所述IPTG在培养基中终浓度为0.2mmol/L。
实施例1D-泛酸含量的测定
检测方法如下：
色谱条件：C18柱(250×4.6mm，粒径大小5μm，安捷伦)、检测波长200nm、柱温30℃；样品处理：将样品用超纯水稀释，保持D-泛酸含量在0.05g/L到0.40g/L之间；
流动相：乙腈:水:磷酸＝＝50:949:1；
数据采集时间：18min。
实施例2构建菌株DPA8(P43-alsS)及摇瓶发酵
以DPA8(B.subtilis ATCC 6633(P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserAglyA)为出发菌株，使用Cre/loxP基因编辑技术，用来源于pP43NMK的P43启动子(核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)，在基因组上替换掉alsS基因的原有启动子，增强alsS基因的表达强度，进而提高D-泛酸的产量。具体步骤如下：
(1)目的基因alsS上游序列构建：以枯草芽孢杆菌DPA8(B.subtilis ATCC 6633(P43-panBpanC panDpanEilvCilvDserAglyA)基因组为模板，以alsS-L-F和alsS-L-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(2)lox71-zeo-lox66序列构建：以质粒p7z6为模板，以alsS-zeo-F和alsS-zeo-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(3)P43启动子序列构建：以质粒pP43NMK为模板，以alsS-P43-F和alsS-P43-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(4)目的基因alsS序列构建：以枯草芽孢杆菌DPA8(B.subtilis ATCC 6633(P43-panBpanC panDpanEilvCilvDserAglyA)基因组为模板，以alsS-F和alsS-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(5)通过融合PCR技术，将目的基因上游、lox71-zeo-lox66、P 43启动子和alsS目的基因序列进行融合，获得启动子替换框，将启动子替换框转化至枯草芽孢杆菌DPA8(B.subtilis ATCC 6633(P43-panBpanC panDpanEilvCilvDserAglyA)中，使用博来霉素抗性LB平板进行筛选，转化子经PCR验证正确后，转入质粒PDG148；将携带PDG148质粒的转化子接种于含有0.2mmol/L IPTG的液体LB中，培养24h以表达环化重组酶促进lox71位点与lox66位点重组，回收博来霉素抗性基因；之后，取1μL培养液接种于2mL新鲜的LB液体培养基中，在50℃、220rpm条件下振荡培养10h后于无抗LB固体平板划线；用10μL枪头将无抗LB固体平板上长出的菌落分别点于博来霉素、卡那霉素和无抗LB固体平板上，只能于无抗固体平板生长的为消除PDG148质粒的工程菌株DPA8(P43-alsS)。
(6)将DPA8(P43-alsS)菌株，以DPA8(B.subtilis ATCC 6633(P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserAglyA)为对照组，分别接到10mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，接种1mL预培养物到装有50mL的发酵培养基的500mL摇瓶中，然后在43℃、300rpm条件下连续培养48h；发酵结束后取1mL发酵液于12000rpm室温离心3min，将发酵液上清稀释5倍，根据实施例1进行HPLC检测，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图2所示。
由图2可见，基因组替换alsS基因启动子，D-泛酸的产量从2.53g/L增加到2.74g/L，这说明ALAS酶是合成泛酸的关键酶，作为途径的唯一限速酶，ALAS的稳定性和活性对泛酸的产量有一定的作用。alsS基因表达的加强可以有效定向到3-甲基-2-酮丁酸，从而有利于枯草芽孢杆菌D-泛酸的合成。
其中，LB培养基组成为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，溶剂为去离子水，pH值自然。
发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L、硫酸铵16g/L、磷酸二氢钾0.8g/L、硫酸镁0.5g/L，酵母粉2g/L，1mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值6-7，微量元素溶液组成为：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/LZnSO4·7H2O、0.20g/L CuSO4、0.02g/LNiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
实施例3构建菌株DPA8(P43-alsS/△ilvA)及摇瓶发酵以实施例2构建的DPA8(P43-alsS)为出发菌株，使用Cre/loxP基因编辑技术，将基因组中的ilvA基因敲除，降低支链L-异亮氨酸的合成，进而提高D-泛酸的产量。具体步骤如下：
(1)目的基因ilvA上游序列构建：以DPA8(P43-alsS)基因组为模板，以ilvA-L-F和ilvA-L-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(2)lox71-zeo-lox66序列构建：以质粒p7z6为模板，以ilvA-zeo-F和ilvA-zeo-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(3)目的基因ilvA序列构建：以DPA8(P43-alsS)基因组为模板，以ilvA-F和ilvA-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(4)通过融合PCR技术，将目的基因上游、lox71-zeo-lox66和ilvA目的基因序列进行融合，获得启动子替换框，将启动子替换框转化至DPA8(P43-alsS)中，使用博来霉素抗性LB平板进行筛选，转化子经PCR验证正确后，转入质粒PDG148；将携带PDG148质粒的转化子接种于含有0.2mmol/L IPTG的液体LB中，培养24h以表达环化重组酶促进lox71位点与lox66位点重组，回收博来霉素抗性基因；之后，取1μL培养液接种于2mL新鲜的LB液体培养基中，在50℃、220rpm条件下振荡培养10h后于无抗LB固体平板划线；用10μL枪头将无抗LB固体平板上长出的菌落分别点于博来霉素、卡那霉素和无抗LB固体平板上，只能于无抗固体平板生长的为消除PDG148质粒的工程菌株DPA8(P43-alsS/△ilvA)。
(5)将DPA8(P43-alsS/△ilvA)菌株，以DPA8(P43-alsS)为对照组，分别接到10mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，接种1mL预培养物到装有40mL的发酵培养基的500mL摇瓶中，然后在43℃、300rpm条件下连续培养48h；发酵结束后取1mL发酵液于12000rpm室温离心3min，将发酵液上清稀释5倍，根据实施例1进行HPLC检测，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图3所示。
由图3可见，基因组敲除ilvA基因，D-泛酸的产量从2.71g/L增加到2.92g/L。ilvA基因是L-异亮氨酸生物合成途径中关键基因，分析其降低D-泛酸的产量的原因可能为，较高浓度的异亮氨酸可能会对这些共有途径造成抑制，从而降低了泛解酸支路通量影响D-泛酸合成，所以敲除ilvA基因可以提高产量。
实施例4构建菌株DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE)及摇瓶发酵以实施例3构建的DPA8(P43-alsS/△ilvA)为出发菌株，使用Cre/loxP基因编辑技术，将基因组中的lctE基因敲除，减少副产物乳酸的合成，进而提高D-泛酸的产量。具体步骤如下：(1)目的基因lctE上游序列构建：以DPA8(P43-alsS/△ilvA)基因组为模板，以lctE-L-F和lctE-L-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(2)lox71-zeo-lox66序列构建：以质粒p7z6为模板，以lctE-zeo-F和lctE-zeo-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(3)目的基因lctE序列构建：以DPA8(P43-alsS/△ilvA)基因组为模板，以lctE-F和lctE-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(4)通过融合PCR技术，将目的基因上游、lox71-zeo-lox66和lctE目的基因序列进行融合，获得启动子替换框，将启动子替换框转化至DPA8(P43-alsS/△ilvA)中，使用博来霉素抗性LB平板进行筛选，转化子经PCR验证正确后，转入质粒PDG148；将携带PDG148质粒的转化子接种于含有0.2mmol/LIPTG的液体LB中，培养24h以表达环化重组酶促进lox71位点与lox66位点重组，回收博来霉素抗性基因；之后，取1μL培养液接种于2mL新鲜的LB液体培养基中，在50℃、220rpm条件下振荡培养10h后于无抗LB固体平板划线；用10μL枪头将无抗LB固体平板上长出的菌落分别点于博来霉素、卡那霉素和无抗LB固体平板上，只能于无抗固体平板生长的为消除PDG148质粒的工程菌株DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE)。
(5)将DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE)菌株，以DPA8(P43-alsS/△ilvA)为对照组，分别接到10mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，接种1mL预培养物到装有40mL的发酵培养基的500mL摇瓶中，然后在37℃、300rpm条件下连续培养48h；发酵结束后取1mL发酵液于12000rpm室温离心3min，将发酵液上清稀释5倍，根据实施例1进行HPLC检测，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图4所示。
由图4可见，基因组敲除lctE基因，D-泛酸的产量从2.90g/L增加到3.02g/L。进一步分析其原理在于，丙酮酸是枯草芽孢杆菌代谢途径的关键中间产物，可以在乳酸脱氢酶的催化下转化为乳酸，通过缺失乳酸脱氢酶，可以减弱丙酮酸被其他途径利用。敲除lctE基因可以有效增强泛解酸途径中D-泛酸合成，从而有利于枯草芽孢杆菌D-泛酸的合成。
实施例5构建有效菌株DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA)及摇瓶发酵以实施例4构建的DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE)为出发菌株，使用Cre/loxP基因编辑技术，将基因组中的mgsA基因敲除，降低支链氨基酸的合成，进而提高D-泛酸的产量。具体步骤如下：
(1)目的基因mgsA上游序列构建：以DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE)基因组为模板，以mgsA-L-F和mgsA-L-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(2)lox71-zeo-lox66序列构建：以质粒p7z6为模板，以mgsA-zeo-F和mgsA-zeo-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(3)目的基因mgsA序列构建：以DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE)基因组为模板，以mgsA-F和mgsA-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(4)通过融合PCR技术，将目的基因上游、lox71-zeo-lox66和mgsA目的基因序列进行融合，获得启动子替换框，将启动子替换框转化至DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE)中，使用博来霉素抗性LB平板进行筛选，转化子经PCR验证正确后，转入质粒PDG148；将携带PDG148质粒的转化子接种于含有0.2mmol/L的IPTG的液体LB中，培养24h以表达环化重组酶促进lox71位点与lox66位点重组，回收博来霉素抗性基因；之后，取1μL培养液接种于2mL新鲜的LB液体培养基中，在50℃、220rpm条件下振荡培养10h后于无抗LB固体平板划线；用10μL枪头将无抗LB固体平板上长出的菌落分别点于博来霉素、卡那霉素和无抗LB固体平板上，只能于无抗固体平板生长的才为消除PDG148质粒的工程DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA)菌株。
(5)将DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA)菌株，以DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE)为对照组，分别接到10mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，接种1mL预培养物到装有50mL的发酵培养基的500mL摇瓶中，然后在37℃、200rpm条件下连续培养48h；发酵结束后取1mL发酵液于12000rpm室温离心3min，将发酵液上清稀释5倍，根据实施例1进行HPLC检测，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图5所示。
由图5可见，基因组敲除mgsA，D-泛酸的产量从2.99g/L增加到3.12g/L，这说明敲除mgsA基因可以促进细胞生长，减少副产物乳酸的合成，从而有利于枯草芽孢杆菌D-泛酸的合成。
实施例6构建有效菌株DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF)及摇瓶发酵以实施例5构建的DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA)为出发菌株，使用Cre/loxP基因编辑技术，将基因组中的yxjF基因敲除，降低乳酸的生成，进而提高D-泛酸的产量。具体步骤如下：
(1)目的基因yxjF上游序列构建：以DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA)基因组为模板，以yxjF-L-F和yxjF-L-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、cleanup纯化保存备用。
(2)lox71-zeo-lox66序列构建：以质粒p7z6为模板，以yxjF-zeo-F和yxjF-zeo-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(3)目的基因yxjF序列构建：以DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA)基因组为模板，以yxjF-F和yxjF-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(4)通过融合PCR技术，将目的基因上游、lox71-zeo-lox66和yxjF目的基因序列进行融合，获得启动子替换框，将启动子替换框转化至DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA)中，使用博来霉素抗性LB平板进行筛选，转化子经PCR验证正确后，转入质粒PDG148；将携带PDG148质粒的转化子接种于含有0.2mmol/L IPTG的液体LB中，培养24h以表达环化重组酶促进lox71位点与lox66位点重组，回收博来霉素抗性基因；之后，取1μL培养液接种于2mL新鲜的LB液体培养基中，在50℃、220rpm条件下振荡培养10h后于无抗LB固体平板划线；用10μL枪头将无抗LB固体平板上长出的菌落分别点于博来霉素、卡那霉素和无抗LB固体平板上，只能于无抗固体平板生长的才为消除PDG148质粒的工程DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF)菌株。
(5)将DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF)菌株，以DPA8(P43-alsS
/△ilvA/△lctE/△mgsA)为对照组，分别接到10mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，接种1mL预培养物到装有50mL的发酵培养基的500mL摇瓶中，然后在37℃、200rpm条件下连续培养48h；发酵结束后取1mL发酵液于12000rpm室温离心3min，将发酵液上清稀释5倍，根据实施例1进行HPLC检测，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图6所示。
由图6可见，基因组敲除yxjF，D-泛酸的产量从3.12g/L增加到3.24g/L，敲除yxjF基因可以减少3-羟基丁酸分解为乙酰乙酸，从而进入三羧酸循环代谢产能。而有利于枯草芽孢杆菌D-泛酸的合成。
实施例7构建有效菌株DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF/△ywbC)及摇瓶发酵以DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF)为出发菌株，使用Cre/loxP基因编辑技术，将基因组中的ywbC基因敲除，降低乳酸的合成，进而提高D-泛酸的产量。具体步骤如下：(1)目的基因ywbC上游序列构建：以DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF)基因组为模板，以ywbC-L-F和ywbC-L-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(2)lox71-zeo-lox66序列构建：以质粒p7z6为模板，以ywbC-zeo-F和ywbC-zeo-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(3)目的基因ywbC序列构建：以DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF)基因组为模板，以ywbC-F和ywbC-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、cleanup纯化保存备用。
(4)通过融合PCR技术，将目的基因上游、lox71-zeo-lox66和ywbC目的基因序列进行融合，获得启动子替换框，将启动子替换框转化至DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF)中，使用博来霉素抗性LB平板进行筛选，转化子经PCR验证正确后，转入质粒PDG148；将携带PDG148质粒的转化子接种于含有0.2mmol/L IPTG的液体LB中，培养24h以表达环化重组酶促进lox71位点与lox66位点重组，回收博来霉素抗性基因；之后，取1μL培养液接种于2mL新鲜的LB液体培养基中，在50℃、220rpm条件下振荡培养10h后于无抗LB固体平板划线；用10μL枪头将无抗LB固体平板上长出的菌落分别点于博来霉素、卡那霉素和无抗LB固体平板上，只能于无抗固体平板生长的才为消除PDG148质粒的工程菌株DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF/△ywbC)。
(5)将DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF/△ywbC)菌株，以DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF)为对照组，分别接到10mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，接种1mL预培养物到装有50mL的发酵培养基的500mL摇瓶中，然后在37℃、200rpm条件下连续培养48h；发酵结束后取1mL发酵液于12000rpm室温离心3min，将发酵液上清稀释5倍，根据实施例1进行HPLC检测，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图7所示。
由图7可见，基因组敲除ywbC基因，D-泛酸的产量从3.21g/L增加到3.34g/L，敲除ywbC基因可以降低副产物乳酸的合成，从而有利于枯草芽孢杆菌D-泛酸的合成。
实施例8构建有效菌株DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF/△ywbC/△alsD)及摇瓶发酵。
以DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF/△ywbC)为出发菌株，使用Cre/loxP基因编辑技术，将基因组中的alsD基因敲除，降低支链有机酸的合成，进而提高D-泛酸的产量。具体步骤如下：
(1)目的基因alsD上游序列构建：以DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF/△ywbC)基因组为模板，以alsD-L-F和alsD-L-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(2)lox71-zeo-lox66序列构建：以质粒p7z6为模板，以alsD-zeo-F和alsD-zeo-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(3)目的基因alsD序列构建：以DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF/△ywbC)基因组为模板，以alsD-F和alsD-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(4)通过融合PCR技术，将目的基因上游、lox71-zeo-lox66和alsD目的基因序列进行融合，获得启动子替换框，将启动子替换框转化至DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF/△ywbC)中，使用博来霉素抗性LB平板进行筛选，转化子经PCR验证正确后，转入质粒PDG148；将携带PDG148质粒的转化子接种于含有0.2mmol/L IPTG的液体LB中，培养24h以表达环化重组酶促进lox71位点与lox66位点重组，回收博来霉素抗性基因；之后，取1μL培养液接种于2mL新鲜的LB液体培养基中，在50℃、220rpm条件下振荡培养10h后于无抗LB固体平板划线；用10μL枪头将无抗LB固体平板上长出的菌落分别点于博来霉素、卡那霉素和无抗LB固体平板上，只能于无抗固体平板生长的才为消除PDG148质粒的工程菌株DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF/△ywbC/△alsD)。
(5)将DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF/△ywbC/△alsD)菌株，以DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF/△ywbC)为对照组，分别接到10mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，接种1mL预培养物到装有50mL的发酵培养基的500mL摇瓶中，然后在37℃、200rpm条件下连续培养48h；发酵结束后取1mL发酵液于12000rpm室温离心3min，将发酵液上清稀释5倍，根据实施例1进行HPLC检测，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图8所示。
由图8可见，基因组敲除alsD基因，D-泛酸的产量从3.32g/L增加到3.46g/L。分析其原因，由于枯草芽孢杆菌乙酰乳酸的合成是限速步骤，催化这步反应的乙酰乳酸合成酶，乙酰乳酸经α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)的作用生成乙偶姻，所以敲除乙偶姻路径的alsD基因可以有效增强泛解酸途径的，从而有利于枯草芽孢杆菌D-泛酸的合成。
实施例9构建有效菌株DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF/△ywbC/△alsD/△bdhA)及摇瓶发酵以DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF/△ywbC/△alsD)为出发菌株，使用Cre/loxP基因编辑技术，将基因组中的bdhA基因敲除，降低支链氨基酸的合成，进而提高D-泛酸的产量。具体步骤如下：
(1)目的基因bdhA上游序列构建：以DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF/△ywbC/△alsD)基因组为模板，以bdhA-L-F和bdhA-L-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(2)lox71-zeo-lox66序列构建：以质粒p7z6为模板，以bdhA-zeo-F和bdhA-zeo-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(3)目的基因bdhA序列构建：以DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF/△ywbC/△alsD)基因组为模板，以bdhA-F和bdhA-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
(4)通过融合PCR技术，将目的基因上游、lox71-zeo-lox66和bdhA目的基因序列进行融合，获得启动子替换框，将启动子替换框转化至DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF/△ywbC/△alsD)中，使用博来霉素抗性LB平板进行筛选，转化子经PCR验证正确后，转入质粒PDG148；将携带PDG148质粒的转化子接种于含有0.2mmol/L IPTG的液体LB中，培养24h以表达环化重组酶促进lox71位点与lox66位点重组，回收博来霉素抗性基因；之后，取1μL培养液接种于2mL新鲜的LB液体培养基中，在50℃、220rpm条件下振荡培养10h后于无抗LB固体平板划线；用10μL枪头将无抗LB固体平板上长出的菌落分别点于博来霉素、卡那霉素和无抗LB固体平板上，只能于无抗固体平板生长的才为消除PDG148质粒的工程菌株DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF/△ywbC/△alsD/△bdhA)。
(5)将DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF/△ywbC/△alsD/△bdhA)菌株，以DPA8(P43-alsS/△ilvA/△lctE/△mgsA/△yxjF/△ywbC/△alsD)为对照组，分别接到10mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，接种1mL预培养物到装有50mL的发酵培养基的500mL摇瓶中，然后在37℃、200rpm条件下连续培养48h；发酵结束后取1mL发酵液于12000rpm室温离心3min，将发酵液上清稀释5倍，根据实施例1进行HPLC检测，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图9所示。
由图9可见，基因组敲除bdhA基因，D-泛酸的产量从3.39g/L增加到3.52g/L。分析其原因，乙偶姻可以进一步催化可逆反应的2,3-丁二醇脱氢酶(BDH)的作用，去生产2,3-丁二醇，说明敲除bdhA也可以增强泛解酸途径，从而有利于枯草芽孢杆菌D-泛酸的合成。
因此，综上所述，实施例2～9可以看出，通过“来源于pP43NMK的P43启动子和RBS序列置换alsS基因的原有启动子，强化丙酮酸转化为乙酰乳酸；敲除ilvA基因，降低异亮氨酸浓度以增加泛解酸支路通量；同时敲除乳酸途径的基因lctE、mgsA、ywbC基因，敲除乙酰乙酸途径yxjF基因，从而减少乳酸的积累，促进细胞的生长；并敲除乙偶姻途径中的alsD、bdhA基因，削弱副产物的合成”，可以使得D-泛酸产量增加，基于此，可构建得到一种高产D-泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (9)

1.一种高产D-泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于：以枯草芽孢杆菌为底盘菌构建，其构建方法包括以下步骤：
(1)增强alsS基因的表达；
(2)敲除ilvA、lctE、mgsA、yxjF、ywbC、alsD、bdhA基因。
2.如权利要求1所述的一种高产D-泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于：所述底盘菌为Bacillus subtilis ATCC 6633。
3.如权利要求1所述的一种高产D-泛酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于：ilvA基因序列如SEQ ID No.2所示，alsS基因序列如SEQ ID No.3所示，lctE基因序列如SEQ IDNo.4所示，mgsA基因序列如SEQ ID No.5所示，ywbC基因序列如SEQ ID No.6所示，alsD基因序列如SEQ ID No.7所示，bdhA基因序列如SEQ ID No.8所示，yxjF基因序列如SEQ ID No.9所示。
4.如权利要求1～3任一项所述的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤S1：以枯草芽孢杆菌为底盘菌，增强底盘菌基因组中alsS基因的表达；
步骤S2：敲除底盘菌基因组中的ilvA、lctE、mgsA、yxjF、ywbC、alsD、bdhA基因。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述底盘菌为Bacillus subtilis ATCC6633。
6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：ilvA基因序列如SEQ ID No.2所示，alsS基因序列如SEQ ID No.3所示，lctE基因序列如SEQ ID No.4所示，mgsA基因序列如SEQ IDNo.5所示，ywbC基因序列如SEQ ID No.6所示，alsD基因序列如SEQ ID No.7所示，bdhA基因序列如SEQ ID No.8所示，yxjF基因序列如SEQ ID No.9所示。
7.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：增强底盘菌基因组中alsS基因的表达的方法为：将alsS基因的启动子替换为P43启动子。
8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于：所述P43启动子的基因序列如SEQ IDNo.1所示。
9.如权利要求1～3任一项所述的枯草芽孢杆菌基因工程菌或权利要求4～8任一项所述的构建方法构建得到的枯草芽孢杆菌基因工程菌在生产D-泛酸中的应用。
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