KR20030075163A - 판토테네이트 생산 증대를 위한 미생물 및 방법 - Google Patents

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알. 로저스 요쿰
토마스 에이. 패터슨
제니스 쥐. 페로
테론 헤르만
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바스프 악티엔게젤샤프트
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Abstract

본 발명은 판토에이트의 생산을 증대시키기 위한 개선된 방법 및 판토테네이트 생합성 효소 활성이 변형되고 메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 효소 활성이 변형된, 판토테네이트를 생산하는 미생물을 특징으로 한다. 특히, 본 발명은 핵심적인 중간체인 케토판토에이트의 합성에 기여하는 효소에 의해 상기 케토판토에이트의 수준을 증가시킴으로써, 원하는 생성물의 생산을 증대시키는 방법을 특징으로 한다. 재조합 미생물 및 이의 배양 방법도 특징으로 한다. 또한, 상기 미생물에 의해 생성된 조성물도 특징으로 한다.

Description

판토테네이트 생산 증대를 위한 미생물 및 방법 {Microorganisms and Processes for Enhanced Production of Pantothenate}
<관련 출원>
본 출원은 2002년 1월 11일자로 출원 (계류 중)된 선행 특허 가출원 제60/347,638호 (발명의 명칭: "Microorganisms and Processes for Enhanced Production of Pantothenate"), 2001년 1월 19일자로 출원 (계류 중)된 선행 특허 가출원 제60/263,053호 및 2001년 1월 19일자로 출원 (계류 중)된 선행 특허 가출원 제60/262,995호의 잇점을 청구한다. 또한, 본 발명은 1999년 9월 21일자로 출원된 미국 특허 출원 제09/400,494호 (포기)의 일부 계속 출원으로서 2000년 9월 21일자로 출원 (계류 중)된 미국 특허 출원 제09/667,569호에 관한 것이다. 미국 특허 출원 제09/667,569호는 또한 2000년 6월 7일자로 출원된 선행 특허 가출원 제60/210,072호 (소멸), 2000년 7월 28일자로 출원된 특허 가출원 제60/221,836호 (소멸) 및 2000년 8월 24일자로 출원된 특허 가출원 제60/227,860호 (소멸)의 잇점도 청구한다. 상기 언급한 출원 문헌들 각각의 전문은 본원에 참고로 도입된다.
판토텐산 또는 비타민 B5라고도 알려진 판토테네이트는 비타민 B 복합체의 구성원이며, 가축 및 인간을 비롯한 포유동물에 필요한 영양소이다 (예를 들어 식품 공급원으로부터, 수용성 비타민 보충물 또는 식품 첨가제로서). 세포에서, 판토테네이트는 주로 조효소 A (CoA) 및 아실 운반 단백질 (ACP)의 생합성에 이용된다. 이들 조효소는 아실 잔기의 대사에서 기능하여, 아실 잔기가 상기 분자 중 4'-포스포판테테인 부분의 술프히드릴기와 티오에스테르를 형성하게 한다. 이들 조효소는 모든 세포에 필수적이며, 세포내 물질대사에서 100가지가 넘는 상이한 중간 반응에 관여한다.
판토테네이트 (특히, 생물활성의 D 이성질체)를 합성하는 통상적인 수단은, 과도한 기질 비용으로 인해 제한을 받고 라세미 중간체의 광학 분할을 필요로 하는 과정인 벌크 화학물질의 화학적 합성을 통한 것이다. 따라서, 본 연구자들은 최근에 판토테네이트 생합성 과정에 유용한 효소를 생산하는 박테리아 또는 미생물 시스템 (박테리아는 그 자체가 판토테네이트를 합성할 수 있기 때문임)을 연구하였다. 특히, 생물전환 (bioconversion) 과정이 판토텐산의 바람직한 이성질체 생산에 우호적인 수단으로서 평가되었다. 또한, 최근에는 D-판토테네이트 생산을 용이하게 하는 수단으로서 직접적인 미생물 합성 방법이 조사되기도 했다.
그러나, 개선된 판토테네이트 생산 방법, 특히 원하는 생성물의 생산 수율 증가를 최적화하는 미생물 방법이 여전히 상당하게 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 판토테네이트를 생산하는 개선된 방법 (예를 들어 미생물에 의한 합성)에 관한 것이다. 판토테네이트 생산 방법은 <관련 출원>의 문헌들에 기재되어 있으며, 이는 예를 들어 판토테네이트 생합성 경로 및 이소루이신-발린 생합성경로 (예를 들어 도 1 참조)의 핵심 효소가 과발현되도록 유전자조작된 미생물을 특징으로 한다. 균주들은 표준 발효 공정으로 50 g/L 초과의 판토테네이트를 생산할 수 있도록 유전자조작되었다 (예를 들어 국제 공개 WO 01/21772 및 미국 특허 출원 제60/262,995호 참조). 특히, panB, panC, panD 및 panE1 유전자의 발현 증가 및 ilvBNC 및 ilvD 유전자의 발현 증가에 의해, 글루코스 (피루베이트)를 상업량의 판토테네이트로 전환시키는 균주가 생성된다.
예를 들어 판토테네이트의 생산 수준을 증대시키기 위해서, 상기 기재한 방법에 대한 다양한 개선 방법들이 현재 개발되고 있다. 예를 들어 미국 특허 출원 제09/667,569호는 변형 (예를 들어 활성이 없거나 감소됨)된 판토테네이트 키나제 효소를 함유하는 생산 균주를 기재하고 있다. 이러한 균주에서는 조효소A ("CoA") 합성을 위한 판토테네이트 이용이 감소되므로, 판토테네이트 수준이 효과적으로 증가된다. 미국 특허 출원 제60/262,995호는 다양한 판토테네이트 생합성 효소 및(또는) 이소루이신-발린 생합성 효소 및(또는) HMBPA로 확인된 별법의 생성물 생산에 사용될 이들 각각의 기질의 이용이 최소화되도록 유전자조작된, 개선된 판토테네이트-생산 균주에 관해 기재하고 있다.
본 발명은 판토테네이트 생합성 경로를 위한 기질을 제공하는 생합성 경로, 즉 메틸렌테트라히드로폴레이트 ("MTF") 생합성 경로를 조정함으로써 판토테네이트 생산을 더욱 증대시키는 방법을 특징으로 한다. 특히, MTF 생합성 경로의 변형을 통한 MTF 수준 증가는 판토테네이트 생합성 경로의 핵심적인 중간체인 케토판토에이트의 수준을 증대시킨다는 것이 발견되었다. 이후, 적절하게 유전자조작된 균주에서의 케토판토에이트 수준 증대는 다시 판토테네이트 생산 수준을 유의하게 증대시킨다. 본질적으로, 본 발명의 발명자들은 예를 들어 panB, pavcC, panD, panE1, ilvBNC 및 ilvD 유전자를 과발현하도록 유전자조작된 균주에 의한 판토-화합물 (예를 들어 판토테네이트) 생산에 있어서의 제한 단계를 확인하였고, MTF 생합성 경로의 변형을 통해 이러한 제한을 극복하는 수단을 본원에 기재하였다.
MTF 생합성 경로를 변형시키기 위한 적어도 3가지 수단을 본원에 기재하였다. 한 측면에서, 판토테네이트를 생산하는 미생물의 배양 배지 중의 세린 수준 증가가 판토-화합물 생산을 증대시킨다는 것이 입증되었다. 또한, 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제 (serA 유전자 생성물)의 합성 또는 활성을 증가시키거나, 세린 히드록시메틸 트랜스퍼라제 (glyA 유전자 생성물)의 합성 또는 활성을 증가시킴으로써, 적절하게 유전자조작된 미생물에서 세린 및 메틸렌테트라히드로폴레이트 생합성이 증대되어 판토-화합물 생산이 증가한다는 것이 입증되었다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 판토테네이트 생합성 효소 활성이 변형되고 메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 효소 활성이 변형된 미생물을 판토테네이트 생산이 증대되는 조건하에 배양하는 단계를 포함하는, 판토에이트 및 판토테네이트의 생산 증대 방법을 특징으로 한다. 다른 측면에서, 본 발명은 판토테네이트 생합성 효소 활성이 변형되고, 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 효소가 변형되고, 메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 효소 활성이 변형된 미생물을 판토테네이트 생산이 증대되는 조건하에 배양하는 단계를 포함하는, 판토에이트 및 판토테네이트의 생산 증대 방법을 특징으로 한다. 특히, 본 발명은 핵심적인 중간체인케토판토에이트의 합성에 기여하는 효소에 의해 상기 케토판토에이트의 수준을 증가시킴으로써, 원하는 생성물 (예를 들어 판토에이트 및(또는) 판토테네이트)의 생산을 증대시키는 방법을 특징으로 한다. 바람직한 방법으로, 미생물 배양 36시간 후에는 판토테네이트가 50, 60, 70 g/L 초과 또는 그 이상의 수준으로 생산되거나, 미생물 배양 36시간 후에 판토테네이트가 60, 70, 80, 90 g/L 이상으로 생산된다. 또한, 본 발명은 재조합 미생물 및 이의 배양 조건에도 특징이 있다. 또한, 이러한 미생물에 의해 생산되는 조성물에도 특징이 있다.
본 발명의 다른 특징 및 잇점은 후술하는 상세한 설명 및 청구의 범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 판토테네이트 및 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 경로의 개요도이다. 판토테네이트 생합성 효소들은 굵은 글씨로 표시하였으며, 이들의 상응하는 유전자들은 이탤릭체로 나타내었다. 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 효소들은 굵은 글씨 및 이탤릭체로 표시하였고, 이들의 상응하는 유전자들은 이탤릭체로 나타내었다.
도 2는 대장균 (및 추정적으로는 바실러스 섭틸리스 (B. subtilis))에서의 메틸렌테트라히드로폴레이트 ("MTF") 생합성 경로의 개요도이다.
도 3은 플라스미드 pAN665 제작물의 개요도이다.
도 4는 플라스미드 pAN670 제작물의 개요도이다.
도 5는 플라스미드 pAN004의 개요도이다.
도 6은 플라스미드 pAN396의 개요도이다.
도 7은 플라스미드 pAN393의 개요도이다.
본 발명은 판토-화합물 (예를 들어 케토판토에이트, 판토에이트 및(또는) 판토테네이트)을 생산하는 개선된 방법 및 이러한 개선된 방법에 사용하도록 유전자조작된 균주에 관한 것이다. 판토테네이트를 50 g/L 초과로 생산할 수 있는 균주는 국제 특허 출원 WO 01/21772 및 미국 특허 출원 제60/262,995호에서 교시된 바에 따라 제작할 수 있다. panB, panC, panD 및 panE1 유전자의 발현을 증가시키고 ilvBNC 및 ilvD 유전자의 발현을 증가시킴으로써 글루코스 (피루베이트)를 상업량의 판토테네이트로 전환시키는 균주 (예를 들어 바실러스 (Bacillus) 균주)를 고안할 수 있다.
그러나, panB 유전자 생성물인 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제 (예를 들어, 미국 특허 출원 제09/667,569호에 기재된 PA824 및 미국 특허 출원 제60/262,995호에 기재된 PA668-24)를 높은 수준으로 발현하도록 유전자조작된 균주에서 판토테네이트 생산을 더욱 증가시키는데 있어서의 제한 단계는 α-케토이소발레레이트 (α-KIV)를 케토판토에이트를 전환시키는 단계임이 현재 발견되었다. α-KIV의 합성 증가 방법은 국제 특허 출원 WO 01/21772 및 미국 특허 출원 제60/262,995호에 이미 기재되어 있다. 본원에서는 MTF의 수준 또는 MTF의 합성 속도가 증가되도록 고안하여 유전자조작함으로써 판토테네이트 생산을 훨씬 더욱 증가시킬 수 있음을 개시하였다.
따라서, 본 발명은 메틸렌테트라히드로폴레이트 ("MTF") 생합성 경로를 조정하는데 특징이 있다. 특히, 판토-화합물을 생산하는 미생물에서의 MTF 수준 증가는 케토판토에이트 생산을 증대시켜, 적절하게-유전자조작된 재조합 미생물에서 판토에이트 및(또는) 판토테네이트 생산을 증대시키는 효과적인 수단이다.
케토판토에이트 히드록시메틸렌트랜스퍼라제는 α-케토이소발레레이트 ("α-KIV") 및 MTF로부터의 케토판토에이트 생산을 촉매한다 (예를 들어 도 1 참조). 특히, 상기 효소는 MTF로부터 α-KIV로의 히드록시메틸기 전달을 촉매하여 케토판토에이트를 생산한다. α-KIV 및 MTF 모두가 이러한 반응의 기질이며, 이들의 합성을 증가시켜 케토판토에이트의 생산을 개선시킬 수 있다. 대장균 (및 추정적으로는 바실러스 섭틸리스)에서의 MTF 생합성 경로를 도 2에 개괄적으로 나타내었다. MTF는 세린 히드록시메틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 glyA 유전자가 촉매하는 반응을 통해 테트라히드로폴레이트 및 세린으로부터 합성된다. MTF 합성을 개선시키기 위해서, 세포는 상기 두가지 기질 모두의 양과 glyA 유전자 생성물의 양을 증가시킬 필요가 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (i) 탈조절된 (deregulated) 판토테네이트 생합성 경로 (예를 들어 1종, 2종, 3종 또는 4종의 판토테네이트 생합성 효소가 탈조절됨) 및 (ii) 탈조절된 메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 경로 (예를 들어 1종 또는 2종 이상의 MTF 생합성 효소가 탈조절됨)를 보유하는 미생물을 판토테네이트 생산이 증대되는 조건하에 배양하는 단계를 포함하는, 판토테네이트의 생산 증대 방법을 특징으로 한다. 예시적인 판토테네이트 생합성 효소로는 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제, 케토판토에이트 리덕타제, 판토테네이트 신테타제및 아스파르테이트-α-데카르복실라제 등이 있다. 예시적인 MTF 생합성 효소로는 serA 유전자 생성물 및 glyA 유전자 생성물 등이 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 (i) 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로 (예를 들어 1종, 2종, 3종 또는 4종의 판토테네이트 생합성 효소가 탈조절됨), (ii) 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 경로 (예를 들어 1종, 2종 또는 3종의 ilv 생합성 효소가 탈조절됨) 및 (iii) 탈조절된 MTF 생합성 경로 (예를 들어 1종 또는 2종 이상의 MTF 생합성 효소가 탈조절됨)를 보유하는 미생물을 판토테네이트 생산이 증대되는 조건하에 배양하는 단계를 포함하는, 판토테네이트의 생산 증대 방법을 특징으로 한다. 예시적인 ilv 생합성 효소로는 아세토히드록시산 신테타제, 아세토히드록시산 이소메로리덕타제 및 디히드록시산 데히드라타제 등이 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로, 탈조절된 ilv 생합성 경로 및 탈조절된 MTF 생합성 경로를 보유하는 미생물을 배양하여, 미생물 배양 36시간 후에 50 g/L 이상의 판토테네이트가 생산되도록 하는 단계, 바람직하게는 미생물 배양 36시간 후에 60 g/L 이상의 판토테네이트가 생산되도록 하는 단계, 더욱 바람직하게는 미생물 배양 36시간 후에 70 g/L 이상의 판토테네이트가 생산되도록 하는 단계를 포함하는, 판토테네이트의 생산 방법을 특징으로 한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로, 탈조절된 ilv 생합성 경로 및 탈조절된 MTF 생합성 경로를 보유하는 미생물을 배양하여, 미생물 배양 48시간 후에 60 g/L 이상의 판토테네이트가 생산되도록 하는 단계, 바람직하게는 미생물 배양 48시간 후에 70 g/L 이상의 판토테네이트가 생산되도록 하는 단계, 더욱 바람직하게는 미생물 배양 48시간 후에 80 g/L 이상의 판토테네이트가 생산되도록 하는 단계를 포함하는, 판토테네이트의 생산 방법을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 기재한 방법에서 판토테네이트 키나제 활성을 조절함 (예를 들어 판토테네이트 키나제 활성을 감소시킴)으로써 판토테네이트 생산을 더욱 증대시키는 것을 추가의 특징으로 한다. 한 실시양태에서, CoaA를 결실시키고 CoaX를 하향조절한다. 다른 실시양태에서, CoaX를 결실시키고 CoaA를 하향조절한다. 다른 실시양태에서, CoaX 및 CoaA를 하향조절한다. 본 발명은 상기 기재한 방법에서 미생물을 과량의 세린 조건하에 배양하는 것을 추가의 특징으로 한다. 본 발명은 상기 기재한 방법에서 미생물이 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로를 보유하여, 판토테네이트 생산이 β-알라닌 공급과 무관한 것을 추가의 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 방법에 따라 합성된 생성물이 본 발명의 방법에 따라 생산된 판토테네이트를 포함하는 조성물이라는 점에도 특징이 있다. 또한, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 재조합 미생물에도 특징이 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로 및 탈조절된 MTF 생합성 경로를 보유하는, 판토테네이트의 생산을 증대시키기 위한 재조합 미생물을 특징으로 한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로, 탈조절된 MTF 생합성 경로 및 탈조절된 ilv 경로를 보유하는, 판토테네이트의 생산을 증대시키기 위한 재조합 미생물을 특징으로 한다. 상기 미생물은 판토테네이트 키나제 활성이 더욱 감소될 수 있다. 바람직한 미생물은 바실러스 속에 속하며, 예를 들어 바실러스 섭틸리스이다.
상기 기재한 바와 같이, 본 발명의 특정 측면은 적어도 판토테네이트 생합성 경로가 탈조절된 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 판토-화합물 (예를 들어 판토에이트 및(또는) 판토테네이트)의 생산 증대 방법을 특징으로 한다. "판토테네이트 생합성 경로"라는 용어는 판토테네이트의 형성 또는 합성에 이용되는 판토테네이트 생합성 효소 (예를 들어 생합성 효소-코딩 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드), 화합물 (예를 들어 기질, 중간체 또는 생성물) 및 보조인자 등을 포함하는 생합성 경로를 포함한다. "판토테네이트 생합성 경로"라는 용어는 미생물에서 판토테네이트가 합성되도록 하는 (예를 들어 생체내 합성) 생합성 경로 및 판토테네이트가 시험관내 합성되도록 하는 생합성 경로를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "탈조절된 판토테네이트 생합성 경로를 보유하는" 미생물은 1종 이상의 판토테네이트 생합성 효소가 탈조절 (예를 들어 과발현) (이들 두 용어 모두가 본원에서 정의한 바와 같음)되어, 판토테네이트 생산이 증대 (예를 들어, 상기 미생물 내에서 상기 생합성 효소를 탈조절하기 전의 판토테네이트 생산과 비교하거나, 야생형 미생물의 경우와 비교함)된 미생물을 포함한다. "판토테네이트"라는 용어는 "판토텐산"이라고 지칭되기도 하는 판토테네이트의 유리 산 형태 뿐 아니라 "판토테네이트 염"이라고 지칭되기도 하는 그의 임의의 염 (예를 들어, 판토테네이트 또는 판토텐산의 산성 수소를 칼슘, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘 등과 같은 양이온으로 치환함으로써 유도함)도 포함한다. 또한, "판토테네이트"라는 용어는 판토테네이트의 알콜 유도체를 포함한다. 바람직한 판토테네이트 염은 칼슘 판토테네이트 또는 나트륨 판토테네이트이다. 바람직한 알콜 유도체는 판토테놀이다. 본 발명의 판토테네이트 염 및(또는) 알콜은 본원에 기재한 유리 산으로부터 통상적인 방법을 통해 제조한 염 및(또는) 알콜을 포함한다. 다른 실시양태에서, 판토테네이트 염은 본 발명의 미생물에 의해 직접 합성된다. 마찬가지로, 본 발명의 판토테네이트 염은 통상의 방법에 의해 판토테네이트 또는 판토텐산의 유리 산 형태로 전환될 수 있다. "판토테네이트"라는 용어는 본원에서 "pan"이라고 약칭되기도 한다.
바람직하게는, "탈조절된 판토테네이트 생합성 경로를 보유하는" 미생물은 1종 이상의 판토테네이트 생합성 효소가 탈조절 (예를 들어 과발현)되어, 판토테네이트 생산이 1 g/L 이상인 미생물을 포함한다. 더욱 바람직하게는, "탈조절된 판토테네이트 생합성 경로를 보유하는" 미생물은 1종 이상의 판토테네이트 생합성 효소가 탈조절 (예를 들어 과발현)되어, 판토테네이트 생산이 2 g/L 이상인 미생물을 포함한다. 훨씬 더욱 바람직하게는, "탈조절된 판토테네이트 생합성 경로를 보유하는" 미생물은 1종 이상의 판토테네이트 생합성 효소가 탈조절 (예를 들어 과발현)되어, 판토테네이트 생산이 10 g/L, 20 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L 이상인 미생물을 포함한다.
"판토테네이트 생합성 효소"라는 용어는 판토테네이트 생합성 경로의 화합물 (예를 들어 중간체 또는 생성물)의 형성에 이용되는 임의의 효소를 포함한다. 예를 들어, α-케토이소발레레이트 (α-KIV)로부터의 판토에이트 합성은 중간체인 케토판토에이트를 통해 진행된다. 케토판토에이트의 형성은 판토테네이트 생합성 효소인 PanB 또는 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제 (panB 유전자 생성물)에의해 촉매된다. 판토에이트의 형성은 판토테네이트 생합성 효소인 PanE1 또는 케토판토에이트 리덕타제 (panE1 유전자 생성물)에 의해 촉매된다. 아스파르테이트로부터의 β-알라닌 합성은 판토테네이트 생합성 효소인 PanD 또는 아스파르테이트-α-데카르복실라제 (panD 유전자 생성물)에 의해 촉매된다. 판토에이트 및 β-알라닌으로부터의 판토테네이트 형성 (예를 들어 축합)은 판토테네이트 생합성 효소인 PanC 또는 판토테네이트 신테타제 (panC 유전자 생성물)에 의해 촉매된다. 판토테네이트 생합성 효소는 본원에 기재한 HMBPA 생합성 경로에서 효소로서 다른 기능을 수행할 수도 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 예를 들어 PanB (또는 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제), PanC (또는 판토테네이트 신테타제), PanD (또는 아스파르테이트-α-데카르복실라제) 및 PanE1 (또는 케토판토에이트 리덕타제)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 판토테네이트 생합성 효소가 탈조절 (예를 들어 탈조절되어 판토테네이트 생산이 증대됨)된 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 판토테네이트의 생산 증대 방법을 특징으로 한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 예를 들어 PanB (또는 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제), PanC (또는 판토테네이트 신테타제), PanD (또는 아스파르테이트-α-데카르복실라제) 및 PanE1 (또는 케토판토에이트 리덕타제)로 구성된 군에서 선택된 2종 이상의 판토테네이트 생합성 효소가 탈조절된 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 판토테네이트의 생산 증대 방법을 특징으로 한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 예를 들어 PanB (또는 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제), PanC (또는 판토테네이트 신테타제),PanD (또는 아스파르테이트-α-데카르복실라제) 및 PanE1 (또는 케토판토에이트 리덕타제)로 구성된 군에서 선택된 3종 이상의 판토테네이트 생합성 효소가 탈조절된 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 판토테네이트의 생산 증대 방법을 특징으로 한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 4종 이상의 판토테네이트 생합성 효소가 탈조절된 미생물, 예를 들어 PanB (또는 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제), PanC (또는 판토테네이트 신테타제), PanD (또는 아스파르테이트-α-데카르복실라제) 및 PanE1 (또는 케토판토에이트 리덕타제)가 탈조절된 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 판토테네이트의 생산 증대 방법을 특징으로 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 탈조절된 이소루이신-발린 생합성 경로를 보유하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 판토테네이트의 생산 증대 방법을 특징으로 한다. "이소루이신-발린 생합성 경로"라는 용어는 피루베이트의 발린 또는 이소루이신으로의 전환의 형성 또는 합성에 이용되는 이소루이신-발린 생합성 효소 (예를 들어 생합성 효소-코딩 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드), 화합물 (예를 들어 기질, 중간체 또는 생성물) 및 보조인자 등을 포함하는 생합성 경로를 포함한다. "이소루이신-발린 생합성 경로"라는 용어는 미생물에서 발린 또는 이소루이신이 합성되도록 하는 (예를 들어 생체내 합성) 생합성 경로 및 발린 또는 이소루이신이 시험관내 합성되도록 하는 생합성 경로를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 경로를 보유하는" 미생물은 1종 이상의 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 효소가 탈조절 (예를 들어 과발현) (이들 두 용어 모두가 본원에서 정의한 바와 같음)되어, 이소루이신및(또는) 발린 및(또는) 발린 전구체인 α-케토이소발레레이트 (α-KIV) 생산이 증대 (예를 들어, 상기 미생물 내에서 상기 생합성 효소를 탈조절하기 전의 이소루이신 및(또는) 발린 및(또는) α-KIV 생산과 비교하거나, 야생형 미생물의 경우와 비교함)된 미생물을 포함한다. 도 1은 이소루이신-발린 생합성 경로의 개요도를 포함한다. 이소루이신-발린 생합성 효소들은 굵은 이탤릭체로 표시하였고, 이들의 상응하는 유전자들은 이탤릭체로 나타내었다. "이소루이신-발린 생합성 효소"라는 용어는 이소루이신-발린 생합성 경로의 화합물 (예를 들어 중간체 또는 생성물)의 형성에 이용되는 임의의 효소를 포함한다. 도 1에 따르면, 피루베이트로부터의 발린 합성은 중간체들인 아세토락테이트, α,β-디히드록시이소발레레이트 (α,β-DHIV) 및 α-케토이소발레레이트 (α-KIV)를 통해 진행된다. 피루베이트로부터의 아세토락테이트 형성은 이소루이신-발린 생합성 효소인 아세토히드록시산 신테타제 (ilvBN 유전자 생성물 또는 별법으로는 alsS 유전자 생성물)에 의해 촉매된다. 아세토락테이트로부터의 α,β-DHIV 형성은 이소루이신-발린 생합성 효소인 아세토히드록시산 이소메로리덕타제 (ilvC 유전자 생성물)에 의해 촉매된다. α,β-DHIV로부터의 α-KIV 합성은 이소루이신-발린 생합성 효소인 디히드록시산 데히드라타제 (ilvD 유전자 생성물)에 의해 촉매된다. 또한, 발린 및 이소루이신은 분지쇄 아미노산 트랜스아미나제에 의해 이들 각각의 α-케토 화합물로 상호전환될 수 있다. 이소루이신-발린 생합성 효소는 본원에 기재한 HMBPA 생합성 경로에서 효소로서 다른 기능을 수행할 수도 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 예를 들어 IlvBN, AlsS (또는 아세토히드록시산 신테타제), IlvC (또는 아세토히드록시산 이소메로리덕타제) 및 IlvD (또는 디히드록시산 데히드라타제)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 효소가 탈조절 (예를 들어 탈조절되어 발린 및(또는) 이소루이신 및(또는) α-KIV 생산이 증대됨)된 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 판토테네이트의 생산 증대 방법을 특징으로 한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 예를 들어 IlvBN, AlsS (또는 아세토히드록시산 신테타제), IlvC (또는 아세토히드록시산 이소메로리덕타제) 및 IlvD (또는 디히드록시산 데히드라타제)로 구성된 군에서 선택된 2종 이상의 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 효소가 탈조절된 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 판토테네이트의 생산 증대 방법을 특징으로 한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 3종 이상의 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 효소가 탈조절된 미생물, 예를 들어 IlvBN, AlsS (또는 아세토히드록시산 신테타제), IlvC (또는 아세토히드록시산 이소메로리덕타제) 및 IlvD (또는 디히드록시산 데히드라타제)가 탈조절된 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 판토테네이트의 생산 증대 방법을 특징으로 한다.
본원에서 언급한 바와 같이, 판토테네이트 생합성 경로 및(또는) 이소루이신-발린 (ilv) 경로의 효소들은 [R]-3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 ("HMBPA")을 합성하는 별법의 활성을 보유하거나 [R]-3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 ("HMBPA") 생합성 경로를 보유한다는 것이 발견되었다. "[R]-3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 ("HMBPA") 생합성 경로"라는 용어는 HMBPA의 형성 또는 합성에 이용되는 판토테네이트 생합성 경로 및(또는) 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 경로와 통상적으로 관련이 있는 생합성 효소 및 화합물 (예를 들어 기질 등)을 포함하는 별법의 생합성 경로를 포함한다. "HMBPA 생합성 경로"라는 용어는 미생물에서 HMBPA가 합성되도록 하는 (예를 들어 생체내 합성) 생합성 경로 및 HMBPA가 시험관내 합성되도록 하는 생합성 경로를 포함한다.
"HMBPA 생합성 효소"라는 용어는 HMBPA 생합성 경로의 화합물 (예를 들어 중간체 또는 생성물)의 형성에 이용되는 임의의 효소를 포함한다. 예를 들어, α-케토이소발레레이트 (α-KIV)로부터의 2-히드록시이소발레르산 (α-HIV) 합성은 panE1 또는 panE2 유전자 생성물 (별법으로, PanE1은 본원에서 케토판토에이트 리덕타제라고 지칭되기도 함)에 의해 촉매되고(되거나) ilvC 유전자 생성물 (별법으로, 본원에서 아세토히드록시산 이소메로리덕타제라고 지칭되기도 함)에 의해 촉매된다. β-알라닌 및 α-HIV로부터의 HMBPA의 형성은 panC 유전자 생성물 (별법으로, 본원에서 판토테네이트 신테타제라고 지칭되기도 함)에 의해 촉매된다.
"[R]-3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 ("HMBPA")"이라는 용어는 "[R]-3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피오네이트"라고도 지칭되는 HMBPA의 유리 산 형태 및 "3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 염" 또는 "HMBPA 염"이라고 지칭되기도 하는 그의 임의의 염 (예를 들어, 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 또는 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피오네이트의 산성 수소를 칼슘, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘 등과 같은 양이온으로 치환함으로써 유도함)을 포함한다. 바람직한 HMBPA 염은 칼슘 HMBPA 또는나트륨 HMBPA이다. 본 발명의 HMBPA 염은 본원에 기재한 유리 산으로부터 통상적인 방법을 통해 제조한 염을 포함한다. 마찬가지로, 본 발명의 HMBPA 염은 통상의 방법에 의해 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 또는 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피오네이트의 유리 산 형태로 전환시킬 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 탈조절된 메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 경로를 보유하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 판토-화합물 (예를 들어 판토에이트 및(또는) 판토테네이트)의 생산 증대 방법을 특징으로 한다. "메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 경로"라는 용어는 PanB 기질인 MTF의 형성 또는 합성에 이용되는 MTF 생합성 효소 (예를 들어, 생합성 효소-코딩 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드), 화합물 (예를 들어 기질, 중간체 또는 생성물), 보조인자 등을 포함하는 생합성 경로를 지칭한다. "메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 경로"라는 용어는 MTF가 생체내 합성되도록 하는 생합성 경로 (예를 들어, 도 2에 나타낸 바와 같은 대장균에서의 경로) 및 MTF가 시험관내 합성되도록 하는 생합성 경로를 지칭한다. "메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 효소"라는 용어는 메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 경로의 화합물 (예를 들어 중간체 또는 생성물) 형성에 이용되는 임의의 효소를 포함한다.
본 발명은 적어도 부분적으로는 특정 MTF 생합성 효소를 탈조절하면, MTF 생산이 증대된다는 발견을 바탕으로 한다. MTF 생합성 효소는 탈조절될 때 MTF 생산이 증대되는 효소로서, "MTF 생합성-증대 효소"라 불린다. 예시적인 "MTF 생합성-증대 효소"는 serA 유전자 생성물 (3-포스포글리세레이트 데히드로게나제) 및 glyA유전자 생성물 (세린 히드록시메틸 트랜스퍼라제)이다. "탈조절된 메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 경로"를 보유하는 미생물은 1종 이상의 MTF 생합성-증대 효소가 탈조절 (예를 들어 과발현)되어, MTF 생산 또는 생합성이 증대 (예를 들어, 상기 미생물 내에서 상기 생합성 효소를 탈조절하기 전의 MTF 생산과 비교하거나, 야생형 미생물의 경우와 비교함)된 미생물이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 정의한 바와 같은 탈조절된 "메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 경로"를 보유하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 판토-화합물 (예를 들어 판토에이트 및(또는) 판토테네이트)의 생산 증대 방법을 특징으로 한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 탈조절된 MTF 생합성-증대 효소를 함유하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 판토-화합물 (예를 들어 판토에이트 및(또는) 판토테네이트)의 생산 증대 방법을 특징으로 한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 탈조절된 glyA 유전자 생성물 (세린 히드록시메틸 트랜스퍼라제) 및(또는) 탈조절된 serA 유전자 생성물 (3-포스포글리세레이트 데히드로게나제)를 함유하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 판토-화합물 (예를 들어 판토에이트 및(또는) 판토테네이트)의 생산 증대 방법을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 측면은 판토테네이트 생산에 유리하도록 선택된 배양 조건하에서 미생물을 배양하는 단계, 예를 들어 배지 중 과량의 세린 (glyA 기질)의 존재하에 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 판토테네이트의 생산 증대 방법을 특징으로 한다. "과량의 세린"이라는 용어는 세린 수준이 해당 미생물의 배양에 일상적으로 이용되는 수준보다 증가되거나 높다는 것을 포함한다. 예를 들어, 본원의실시예에 기재한 바실러스 미생물의 배양은 통상적으로 약 0 내지 2.5 g/L 세린의 존재하에서 수행된다. 따라서, 과량의 세린 수준은 2.5 g/L 초과 수준의 세린, 예를 들어 약 2.5 내지 10 g/L 세린을 포함할 수 있다. 과량의 세린 수준은 5 g/L 초과 수준의 세린, 예를 들어 약 5 내지 10 g/L 세린을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 예를 들어 본원에서 정의한 바와 같은 판토테네이트 및(또는) 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 경로 전구체 및(또는) 중간체를 증가시킴으로써 판토테네이트 생산이 더욱 증가되는 조건하에서 본원에 기재한 미생물을 배양하거나 (예를 들어 과량의 β-알라닌, 발린 및(또는) α-KIV의 존재하에 미생물을 배양함), 별법으로는 상기 미생물이 β-알라닌 공급의 부재하에서 유의한 수준의 β-알라닌을 생산할 수 있도록 미생물을 변형 (즉, 미국 특허 출원 제09/09/667,569호 기재된 바와 같은 β-알라닌-비의존성 미생물)시킴으로써 판토테네이트 생산이 더욱 증가되는 조건하에서 본원에 기재한 미생물을 배양함을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 측면은 판토테네이트-생산 균주에서의 판토테네이트 키나제 활성 조절을 통해 판토테네이트의 생산을 증대시킴을 추가의 특징으로 한다. 판토테네이트 키나제는 판토테네이트로부터의 조효소 A (CoA) 형성을 촉매하는 핵심 효소이다 (예를 들어 미국 특허 출원 제09/09/667,569호 참조). CoA 생산이 감소되도록 판토테네이트 키나제를 조절 (예를 들어 판토테네이트 키나제의 활성 또는 수준을 감소시킴)하는 것은 판토테네이트 축적을 유리하게 한다. 한 실시양태에서, CoaA를 결실시키고 CoaX 활성을 하향조절하여 판토테네이트 키나제 활성을 감소시킨다 (CoaA 및 CoaX는 둘다 특정 미생물에서 CoA 생합성의 제1 단계를 촉매할 수 있음). 다른 실시양태에서, CoaX를 결실시키고 CoaA를 하향조절하여 판토테네이트 키나제 활성을 감소시킨다. 다른 실시양태에서, CoaA 및 CoaX 활성을 하향조절하여 판토테네이트 키나제 활성을 감소시킨다.
본 발명의 다양한 측면은 이후의 하위단락에 더욱 상세히 기재하였다.
I. 다양한 판토테네이트 및(또는) 이소루이신-발린 (ilv) 및(또는) 메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 효소를 코딩하는 유전자의 표적화
한 실시양태에서, 본 발명은 판토테네이트 및(또는) 이소루이신-발린 (ilv) 및(또는) 메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 경로의 다양한 생합성 효소들의 수준을 변형시키거나 증가시킴을 특징으로 한다. 특히, 본 발명은 상기 생합성 효소를 코딩하는 유전자를 변형시키거나 변경시킴으로써, 상기 경로와 관련있는 다양한 효소 활성을 변형시키는 것을 특징으로 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자"라는 용어는 유기체 내에서 유전자간 DNA (즉, 유기체의 염색체 DNA에서 자연적으로 유전자를 플랭킹 (flanking)하고(하거나) 유전자들을 분리시키는 개입 또는 스페이서 DNA)에 의해 다른 유전자(들)로부터 분리될 수 있는 핵산 분자 (예를 들어 DNA 분자 또는 그의 절편)를 포함한다. 별법으로, 유전자는 다른 유전자와 약간 중첩될 수 있는데 (예를 들어 제1 유전자의 3' 말단이 제2 유전자의 5' 말단과 중첩됨), 이렇게 중첩된 유전자들은 유전자간 DNA에 의해 다른 유전자들로부터 분리된다. 유전자는 효소 또는 다른 단백질 분자의 합성을 지시하거나 (예를 들어, 단백질을 코딩하는 연속적인 오픈 리딩 프레임 (ORF) 등과 같은 코딩 서열을 포함할 수 있음), 그 자체로 유기체 내에서 기능적일 수 있다. 유기체 내의 유전자는 본원에 정의된 바와 같은 오페론 내에 클러스터 (cluster)되어 있을 수 있으며, 이 오페론은 유전자간 DNA에 의해 다른 유전자들 및(또는) 오페론들로부터 분리된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "단리된 유전자"라는 용어는 유전자가 유래된 유기체의 염색체 DNA에서 이 유전자를 자연적으로 플랭킹하는 서열이 본질적으로 존재하지 않으며 (즉, 제2의 단백질 또는 별개의 단백질을 코딩하는 인접 코딩 서열 또는 인접 구조 서열 등이 없음), 경우에 따라 5' 및 3' 조절 서열, 예를 들어 프로모터 서열 및(또는) 종결 서열을 포함하는 유전자를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 단리된 유전자는 단백질에 대한 코딩 서열 (예를 들어 바실러스 단백질을 코딩하는 서열)을 주로 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 단리된 유전자는 단백질 (예를 들어 바실러스 단백질)에 대한 코딩 서열 및 이 유전자가 유래된 유기체의 염색체 DNA로부터의 인접한 5' 및(또는) 3' 조절 서열 (예를 들어 인접한 5' 및(또는) 3' 바실러스 조절 서열)을 포함한다. 바람직하게는, 단리된 유전자는 유전자가 유래된 유기체의 염색체 DNA에서 이 유전자를 자연적으로 플랭킹하는, 약 10 kb, 5 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 0.2 kb, 0.1 kb, 50 bp, 25 bp 또는 10 bp 미만의 뉴클레오티드 서열을 함유한다.
"오페론"이라는 용어는 1개 이상의 유전자 또는 ORF의 5' 또는 3' 말단 서열에서 경우에 따라 중첩되어 있는 2개 이상의 인접 유전자 또는 ORF를 포함한다. "오페론"이라는 용어는 1개 이상의 인접 유전자 또는 ORF (예를 들어 생합성 효소 등의 효소를 코딩하는 구조 유전자)와 관련있는 프로모터 및 가능하게는 조절 요소를 함유하는 유전자 발현의 통합 단위를 포함한다. 유전자 (예를 들어 구조 유전자)의 발현은 통합되어 조절될 수 있으며, 예를 들어 조절 단백질이 조절 요소에 결합하거나 전사의 종결을 방지함으로써 통합되어 조절될 수 있다. 오페론의 유전자들 (예를 들어 구조 유전자들)은 모든 단백질들을 코딩하는 단일 mRNA로 전사될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "돌연변이를 포함하는 유전자" 또는 "돌연변이 유전자"는 이러한 돌연변이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질이 야생형 핵산 분자 또는 야생형 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질과 상이한 활성을 나타내도록 하나 이상의 변경 (예를 들어 치환, 삽입, 결실)을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자를 포함한다. 한 실시양태에서, 돌연변이를 포함하는 유전자 또는 돌연변이 유전자는 예를 들어 유사한 조건하에 분석했을 경우 (예를 들어 동일한 온도에서 배양한 미생물에서 분석했을 경우)에 야생형 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질에 비해 활성이 증가된 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "증가된 활성" 또는 "증가된 효소 활성"은 야생형 핵산 분자 또는 야생형 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질의 활성보다 적어도 5％ 더 높은 활성, 바람직하게는 적어도 5 내지 10％ 더 높은 활성, 더욱 바람직하게는 적어도 10 내지 25％ 더 높은 활성, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 25 내지 50％, 50 내지 75％ 또는 75 내지 100％ 더 높은 활성이다. 상기 언급된 수치에 대한 중간 범위, 예를 들어 75 내지 85％, 85 내지 90％, 90 내지 95％도 본 발명에 포함되는 것으로 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "증가된활성" 또는 "증가된 효소 활성"은 또한 야생형 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질의 활성보다 적어도 1.25배 더 높은 활성, 바람직하게는 적어도 1.5배 더 높은 활성, 더욱 바람직하게는 적어도 2배 더 높은 활성, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 더 높은 활성을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 돌연변이를 포함하는 유전자 또는 돌연변이 유전자는 예를 들어 유사한 조건하에 분석했을 경우 (예를 들어 동일한 온도에서 배양한 미생물에서 분석했을 경우)에 야생형 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질에 비해 활성이 감소된 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩한다. 또한, 돌연변이 유전자는 폴리펩티드를 코딩하지 않거나, 야생형 폴리펩티드를 감소된 수준으로 생산할 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "감소된 활성" 또는 "감소된 효소 활성"은 야생형 핵산 분자 또는 야생형 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질의 활성보다 적어도 5％ 더 낮은 활성, 바람직하게는 적어도 5 내지 10％ 더 낮은 활성, 더욱 바람직하게는 적어도 10 내지 25％ 더 낮은 활성, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 25 내지 50％, 50 내지 75％ 또는 75 내지 100％ 더 낮은 활성이다. 상기 언급된 수치에 대한 중간 범위, 예를 들어 75 내지 85％, 85 내지 90％, 90 내지 95％도 본 발명에 포함되는 것으로 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "감소된 활성" 또는 "감소된 효소 활성"은 결실되거나 "녹아웃 (knock out)"된 활성 (예를 들어 야생형 핵산 분자 또는 야생형 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질의 활성보다 대략 100％ 더 적은 활성)을 포함할 수도 있다.
활성은 특정 관심 단백질의 활성 측정에 충분히 허용되는 임의의 분석법에 따라 측정할 수 있다. 활성은 예를 들어 세포 또는 미생물의 조 세포 추출물 중의 단백질 또는 이로부터 단리하거나 정제한 단백질의 활성을 측정함으로써 직접 측정하거나 분석할 수 있다. 별법으로, 활성은 세포 또는 미생물 내에서 또는 세포외 배지에서 측정하거나 분석할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 유전자 (즉, 감소된 효소 활성을 코딩하는 상기 돌연변이)에 대한 분석은, 예를 들어 온도-민감성 (temperature-sensitive, Ts) 효소를 포함하는 돌연변이 미생물과 같은 미생물에서 돌연변이된 유전자를 발현시키고, 이 돌연변이 유전자를 효소 활성에 대하여 온도-민감성 (Ts) 돌연변이를 보완하는 능력에 대하여 분석함으로써 수행할 수 있다. "증가된 효소 활성"을 코딩하는 돌연변이 유전자는, 예를 들어 Ts 돌연변이를 상응하는 야생형 유전자보다 더욱 효과적으로 보완하는 유전자일 수 있다. "감소된 효소 활성"을 코딩하는 돌연변이 유전자는, 예를 들어 Ts 돌연변이를 상응하는 야생형 유전자보다 덜 효과적으로 보완하는 유전자이다.
당업자라면, 핵산 또는 유전자 서열에서 하나만 치환 (예를 들어 상응하는 아미노산 서열에서 하나의 아미노산 변화를 코딩하는 염기 치환)되더라도 상응하는 야생형 폴리펩티드 또는 단백질에 비해 코딩된 폴리펩티드 또는 단백질의 활성에 크게 영향을 미칠 수 있다는 것을 알 것이다. 본원에 정의된 바와 같은 돌연변이 유전자 (예를 들어 돌연변이 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자)는, 이것이 야생형 유전자를 발현하는 상응하는 미생물에 비해 상기 돌연변이 유전자를 발현하거나 상기 돌연변이 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하는 미생물 (즉, 돌연변이미생물)에서 변경된 활성을 나타내는 단백질 또는 폴리펩티드, 경우에 따라서는 상이하거나 별개의 표현형으로 관찰가능한 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩한다는 점에서 단백질 상동체를 코딩하는 핵산 또는 유전자와는 쉽게 구별될 수 있다. 반대로, 단백질 상동체는 미생물에서 생산되는 경우 야생형 유전자를 발현하는 상응하는 미생물에 비해 동일하거나 실질적으로 유사한 활성, 경우에 따라서는 표현형으로는 식별되지 않는 활성을 보유할 수 있다. 따라서, 상동체와 돌연변이체를 구별짓는 역할을 하는 것은, 예를 들어 핵산 분자, 유전자, 단백질 또는 폴리펩티드 사이의 서열 동일성 정도가 아니라, 코딩된 단백질 또는 폴리펩티드의 활성이다. 상동체는 예를 들어 서열 동일성이 낮지만 (예를 들어 30 내지 50％의 서열 동일성) 실질적으로 동등한 기능적 활성을 나타내며, 돌연변이체는 예를 들어 99％의 서열 동일성을 공유하지만 기능적 활성이 크게 다르거나 변경된다.
또한, 당업자는 본 발명에 사용되는 핵산 분자, 유전자, 단백질 또는 폴리펩티드가 MTF 생합성 경로, ilv 생합성 경로 또는 판토테네이트 생합성 경로를 보유하는 임의의 미생물로부터 유래될 수 있음을 알 것이다. 당업자는 상동성 스크리닝 및 서열 비교 등과 같은 공지된 기술을 이용하여 상기 핵산 분자, 유전자, 단백질 또는 폴리펩티드를 확인할 수 있으며, 이들 핵산 분자, 유전자, 단백질 또는 폴리펩티드가 재조합 미생물에서 발현 또는 생산되도록 하는 방식으로 변형 (예를 들어, 본원에 기재되어 있고 당업계에 공지되어 있는 기술에 따른, 적절한 프로모터, 리보솜 결합 부위, 발현 또는 통합 벡터의 사용, 전사가 증가되도록 하는 유전자 서열의 변형 (바람직한 코돈의 사용을 고려함))시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 유전자는 그람 (Gram)-양성 미생물 유기체 (예를 들어 미생물을 둘러싸는 그람-양성 세포벽의 존재로 인해 크리스탈 바이올렛 (crystal violet)과 같은 염기성 염료로 착색되는 미생물)로부터 유래된다. "~로부터 유래된" (예를 들어 그람-양성 미생물"로부터 유래된")이라는 용어는 미생물에 자연적으로 존재하는 유전자 (예를 들어 그람-양성 미생물에 자연적으로 존재하는 유전자)를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 유전자는 바실러스, 코리네박테리움 (Corynebacterium) (예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)), 락토바실러스 (Lactobacillus), 락토콕커스 (Lactococci) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)로 구성된 군에서 선택된 속에 속하는 미생물로부터 유래된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 유전자는 바실러스 속에 속하는 미생물로부터 유래된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 유전자는 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 렌티모르부스 (Bacillus lentimorbus), 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus), 바실러스 피르무스 (Bacillus firmus), 바실러스 판토텐티쿠스 (Bacillus pantothenticus), 바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 시르쿨란스 (Bacillus circulans), 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 푸밀루스 (Bacillus pumilus), 바실러스 투린기엔시스 (Bacillus thuringiensis), 바실러스 할로두란스 (Bacillus halodurans) 및 다른 제1군 바실러스 종, 예를 들어 16S rRNA형을 특징으로 하는 종으로 구성된 군에서 선택된 미생물로부터 유래된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 유전자는 바실러스 브레비스 (Bacillus brevis) 또는 바실러스 스테아로써모필루스 (Bacillus stearothermophilus)로부터 유래된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 유전자는 바실러스 리체니포르미스, 바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스, 바실러스 섭틸리스 및 바실러스 푸밀루스로 구성된 군에서 선택된 미생물로부터 유래된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 유전자는 바실러스 섭틸리스로부터 유래된다 (예를 들어 바실러스 섭틸리스에서 유래함). "바실러스 섭틸리스로부터 유래된" 또는 "바실러스 섭틸리스에서 유래한" 등과 같은 용어는 바실러스 섭틸리스 미생물 내에 자연적으로 존재하는 유전자를 포함한다. 본 발명의 범위에는 바실러스에서 유래한 유전자 (예를 들어 바실러스 섭틸리스에서 유래한 유전자), 예를 들어 바실러스 또는 바실러스 섭틸리스 coaX 유전자, serA 유전자, glyA 유전자, coaA 유전자, pan 유전자 및(또는) ilv 유전자가 포함된다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 유전자는 그람-음성 (염기성 염료로 착색되지 않음) 미생물로부터 유래된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 유전자는 살모넬라 (Salmonella) (예를 들어 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium)), 에쉐리히아 (Escherichia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 세라티아 (Serratia) 및 프로테우스 (Proteus)로 구성된 군에서 선택된 속에 속하는 미생물로부터 유래된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 유전자는 에쉐리히아 속의 미생물로부터 유래된다. 훨씬 더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 유전자는 대장균으로부터 유래된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 유전자는 사카로마이세스(Saccharomyces) (예를 들어 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae))로부터 유래된다.
II. 재조합 핵산 분자 및 벡터
본 발명은 본원에 기재한 유전자 (예를 들어 단리된 유전자), 바람직하게는 바실러스 유전자, 더욱 바람직하게는 바실러스 섭틸리스 유전자, 훨씬 더욱 바람직하게는 바실러스 섭틸리스 판토테네이트 생합성 유전자 및(또는) 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 유전자 및(또는) 메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 유전자를 포함하는 재조합 핵산 분자 (예를 들어 재조합 DNA 분자)를 추가의 특징으로 한다. "재조합 핵산 분자"라는 용어는 이 재조합 핵산 분자가 이것이 유래한 천연 또는 자연 핵산 분자와 뉴클레오티드 서열에서 차이가 있도록 변경, 변형 또는 유전자조작 (예를 들어 1개 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실 또는 치환에 의함)된 핵산 분자 (예를 들어 DNA 분자)를 포함한다. 바람직하게는, 재조합 핵산 분자 (예를 들어 재조합 DNA 분자)는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 단리된 유전자를 포함한다. "조절 서열(들)에 작동가능하게 연결된"이라는 어구는 관심 유전자의 뉴클레오티드 서열이 상기 유전자의 발현 (예를 들어 증대되거나, 증가되거나, 구성적이거나, 기본적이거나, 감쇠 (attenuation)되거나, 감소되거나 또는 억제된 발현), 바람직하게는 상기 유전자에 의해 코딩되는 유전자 생성물의 발현을 허용하는 방식 (예를 들어, 재조합 핵산 분자가 본원에 정의된 바와 같이 재조합 벡터 내에 포함되거나 미생물 내로 도입된 경우임)으로 조절 서열(들)에 연결되어 있음을 의미한다.
"조절 서열"이라는 용어는 다른 핵산 서열 (즉, 유전자)의 발현에 영향을 미치는 핵산 서열 (예를 들어 조정하거나 조절하는 핵산 서열)을 포함한다. 한 실시양태에서, 조절 서열은 조절 서열 및 특정 관심 유전자에 대해 관찰되는 바와 같이, 예를 들어 상기 조절 서열이 자연계에서 나타나는 천연의 위치 및(또는) 방향으로 특정 관심 유전자에 대해 유사하거나 동일한 위치 및(또는) 방향으로 재조합 핵산 분자 내에 포함된다. 예를 들어, 관심 유전자는 자연적 유기체에서 관심 유전자에 동반되거나 그에 인접한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 (예를 들어 "천연" 조절 서열 (예를 들어 "천연" 프로모터)에 작동가능하게 연결됨) 재조합 핵산 분자 내에 포함될 수 있다. 별법으로, 관심 유전자는 자연적 유기체에서 다른 (예를 들어 상이한) 유전자에 동반되거나 그에 인접한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 재조합 핵산 분자 내에 포함될 수 있다. 별법으로, 관심 유전자는 다른 유기체로부터의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 재조합 핵산 분자 내에 포함될 수 있다. 예를 들어, 다른 미생물로부터의 조절 서열 (예를 들어 다른 박테리아의 조절 서열 및 박테리오파지의 조절 서열 등)은 특정 관심 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
한 실시양태에서, 조절 서열은 비-천연 또는 비-자연 발생적인 서열 (예를 들어, 변형, 돌연변이, 치환, 유도체화, 결실된 서열로서, 화학적으로 합성된 서열을 포함함)이다. 바람직한 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 종결 신호, 종결방지 신호 및 다른 발현 제어 요소 (예를 들어, 레프레서 또는 유도인자가 결합되는 서열 및(또는) 예를 들어 전사된 mRNA에서 전사 및(또는) 번역 조절 단백질에 대한결합 부위)를 포함한다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 문헌 [Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재되어 있다. 조절 서열로는 미생물에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 지시하는 서열 (예를 들어 구성적 프로모터 및 강력한 구성적 프로모터), 미생물에서 뉴클레오티드 서열의 유도가능한 발현을 지시하는 서열 (예를 들어 유도가능한 프로모터, 예를 들어 크실로스 유도가능한 프로모터) 및 미생물에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 감쇠시키거나 억제하는 서열 (예를 들어 감쇠 신호 또는 레프레서 서열) 등이 있다. 또한, 조절 서열을 제거하거나 결실시킴으로써 관심 유전자의 발현을 조절하는 것도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 전사의 네가티브 (negative) 조절에 관여하는 서열을 제거하여 관심 유전자의 발현을 증대시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자는 프로모터 또는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 1종 이상의 박테리아 유전자 생성물 (예를 들어, 판토테네이트 생합성 효소, 이소루이신-발린 생합성 효소 및(또는) 메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 효소)을 코딩하는 핵산 서열 또는 유전자를 포함한다. 본 발명의 바람직한 프로모터로는 바실러스 프로모터 및(또는) 박테리오파지 프로모터 (예를 들어, 바실러스를 감염시키는 박테리오파지의 프로모터) 등이 있다. 한 실시양태에서, 상기 프로모터는 바실러스 프로모터, 바람직하게는 강력한 바실러스 프로모터 (예를 들어, 바실러스에서 생화학적 하우스키핑 (housekeeping) 유전자와관련된 프로모터 또는 바실러스에서 해당 (glycolysis) 경로의 유전자와 관련된 프로모터)이다. 다른 실시양태에서, 상기 프로모터는 박테리오파지 프로모터이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 프로모터는 박테리오파지 SP01로부터의 프로모터이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 프로모터는 예를 들어 하기한 각각의 서열을 갖는 P15, P26또는 Pveg로 구성된 군에서 선택된다:. 다른 바람직한 프로모터로는 바실러스 (예를 들어 바실러스 섭틸리스)에서 높은 수준의 발현을 촉진시키는 tef (전사 연장 인자 (TEF) 프로모터) 및 pyc (피루베이트 카르복실라제 (PYC) 프로모터) 등이 있다. 예를 들어 그람-양성 미생물에 이용되는 다른 바람직한 프로모터로는 amy 및 SPO2 프로모터 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어 그람-음성 미생물에 사용되는 추가의 바람직한 프로모터로는 cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIQ, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-PR 또는 λ-PL 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자는 종결 서열(들) (예를 들어 전사 종결 서열)을 포함한다. "종결 서열"이라는 용어는 mRNA의 전사를 종결시키는 작용을 하는 조절 서열을 포함한다. 추가로, 종결 서열 (또는 일렬로 존재하는 전사 종결자)은 예를 들어 뉴클레아제에 대하여 mRNA를 안정화시키는 작용을 할 수 있다 (예를 들어 mRNA에 구조를 부여함).
다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자는 상기 서열을 포함하는 벡터의 검출을 허용하는 서열 (즉, 검출가능하고(하거나) 선별가능한 마커), 예를 들어 항생제 내성 서열을 코딩하는 유전자 또는 영양요구성 돌연변이를 극복하는 유전자, 예를 들어 trpC, 약물 마커, 형광 마커 및(또는) 비색 마커 (예를 들어 lacZ/β-갈락토시다제)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자는 인공 리보솜 결합 부위 (RBS) 또는 인공 RBS로 전사되는 서열을 포함한다. "인공 리보솜 결합 부위 (RBS)"라는 용어는 mRNA 분자 (예를 들어 DNA 내에서 코딩됨) 내에서 리보솜이 결합 (예를 들어 이러한 결합을 통해 번역을 개시함)하는 부위를 포함하는 것로서, 천연 RBS (예를 들어 자연 발생 유전자에서 발견되는 RBS)와는 1개 이상의 뉴클레오티드가 다르다. 바람직한 인공 RBS에는 천연 RBS (예를 들어 관심 유전자의 천연 RBS, 예를 들어 천연panB RBS또는 천연panD RBS와 약 1 내지 2개, 3 내지 4개, 5 내지 6개, 7 내지 8개, 9 내지 10개, 11 내지 12개, 13 내지 15개 이상의 뉴클레오티드가 상이한, 약 5 내지 6개, 7 내지 8개, 9 내지 10개, 11 내지 12개, 13 내지 14개, 15 내지 16개, 17 내지 18개, 19 내지 20개, 21 내지 22개, 23 내지 24개, 25 내지 26개, 27 내지 28개, 29 내지 30개 이상의 뉴클레오티드가 포함된다. 상이한 뉴클레오티드가 치환되어, 비교를 위해 최적으로 정렬했을 때 이들이 이상적인 RBS의 뉴클레오티드 하나 이상과 동일하게 되는 것이 바람직하다. 이상적인 RBS로는
등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 인공 RBS는 특정 유전자와 관련있는 자연 발생 또는 천연 RBS를 대신하여 사용할 수 있다. 인공 RBS는 바람직하게는 특정 유전자의 번역을 증가시킨다. 바람직한 인공 RBS (예를 들어 바실러스 섭틸리스 panB 등과 같은 panB의 번역을 증가시키기 위한 RBS)로는 CCCTCTAGAAGGAGGAGAAAACATG (서열 11) 및 CCCTCTAGAGGAGGAGAAAACATG (서열 12) 등이 있다. 바람직한 인공 RBS (예를 들어 바실러스 섭틸리스 panD 등과 같은 panD의 번역을 증가시키기 위한 RBS)로는
등이 있다.
본원에 기재한 바와 같이, 본 발명은 핵산 분자 (예를 들어 상기 유전자를 포함하는 유전자 또는 재조합 핵산 분자)를 포함하는 벡터 (예를 들어 재조합 벡터)를 추가의 특징으로 한다. "재조합 벡터"라는 용어는 변경, 변형 또는 유전자조작되어 이것이 유래한 천연 또는 자연 핵산 분자에 포함되어 있는 핵산 서열보다더 많거나, 더 적거나 또는 이와는 상이한 핵산 서열을 함유하는 벡터 (예를 들어 플라스미드, 파지, 파스미드, 바이러스, 코스미드 또는 다른 정제된 핵산 벡터)를 포함한다. 상기 재조합 벡터는 조절 서열, 예를 들어 프로모터 서열, 터미네이터 서열 및(또는) 본원에서 정의한 인공 리보솜 결합 부위 (RBS)에 작동가능하게 연결된 상기 유전자를 포함하는 생합성 효소-코딩 유전자 또는 재조합 핵산 분자를 포함하는 것이 바람직하다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 벡터는 박테리아에서의 복제를 증대시키는 서열 (예를 들어 복제-증대 서열)을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 복제-증대 서열은 대장균에서 기능한다. 다른 실시양태에서, 상기 복제-증대 서열은 pBR322에서 유래한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 벡터는 항생제 내성 서열을 포함한다. "항생제 내성 서열"이라는 용어는 숙주 유기체 (예를 들어 바실러스)에 항생제에 대한 내성을 부여하거나 이를 촉진시키는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 항생제 내성 서열은 cat (클로르암페니콜 내성) 서열, tet (테트라사이클린 내성) 서열, erm (에리트로마이신 내성) 서열, neo (네오마이신 내성) 서열, kan (카나마이신 내성) 서열 및 spec (스펙티노마이신 내성) 서열로 구성된 군에서 선택된다. 본 발명의 재조합 벡터는 상동성 재조합 서열 (예를 들어 숙주 유기체의 염색체 내로 관심 유전자가 재조합되도록 고안된 서열)을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 숙주 염색체 내로의 재조합에 대한 상동성 표적으로서 bpr, vpr 또는 amyE 서열을 사용할 수 있다. 추가로, 당업자는 벡터의 고안이 유전공학적으로 유전자조작될 미생물의 선택 및 원하는 유전자 생성물의 발현 수준 등과 같은 인자에따라 맞춰질 수 있음을 알 것이다.
IV. 재조합 미생물
본원에 기재한 바와 같이, 본 발명은 벡터 또는 유전자 (예를 들어 야생형 및(또는) 돌연변이된 유전자)를 포함하는 미생물, 즉, 재조합 미생물을 추가의 특징으로 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "재조합 미생물"이라는 용어는 유전자적으로 변경, 변형 또는 유전자조작 (예를 들어 유전공학적 유전자조작)되어 이것이 유래한 자연 발생의 미생물에 비해 변경 또는 변형되거나, 이와는 상이한 유전자형 및(또는) 표현형 (예를 들어 유전자의 변형이 미생물의 코딩 핵산 서열에 영향을 미침)을 나타내는 미생물 (예를 들어 박테리아, 효모 세포, 진균 세포 등)을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 미생물은 그람-양성 유기체 (예를 들어 미생물을 둘러싼 그람-양성 벽의 존재로 인해 크리스탈 바이올렛 등과 같은 염기성 염료로 착색되는 미생물)이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 재조합 미생물은 바실러스, 코리네박테리움 (예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰), 락토바실러스, 락토코커스 및 스트렙토마이세스로 구성된 군에서 선택된 속에 속하는 미생물이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 상기 재조합 미생물은 바실러스 속이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 재조합 미생물은 바실러스 섭틸리스, 바실러스 렌티모르부스, 바실러스 렌투스, 바실러스 피르무스, 바실러스 판토텐티쿠스, 바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스, 바실러스 세레우스, 바실러스 시르쿨란스, 바실러스 코아굴란스, 바실러스 리체니포르미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 푸밀루스, 바실러스투린기엔시스, 바실러스 할로두란스 및 다른 제1군 바실러스 종, 예를 들어 16S rRNA형을 특징으로 하는 종으로 구성된 군에서 선택된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 재조합 미생물은 바실러스 브레비스 또는 바실러스 스테아로써모필루스이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 재조합 미생물은 바실러스 리체니포르미스, 바실러스 아밀롤리쿠에파시엔스, 바실러스 섭틸리스 및 바실러스 푸밀루스로 구성된 군에서 선택된다.
다른 실시양태에서, 상기 재조합 미생물은 그람-음성 (염기성 염료로 착색되지 않음) 유기체이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 재조합 미생물은 살모넬라 (예를 들어 살모넬라 티피무리움), 에쉐리히아, 클렙시엘라, 세라티아 및 프로테우스로 구성된 군에서 선택된 속에 속하는 미생물이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 상기 재조합 미생물은 에쉐리히아 속이다. 훨씬 더욱 바람직한 실시양태에서, 상기 재조합 미생물은 대장균이다. 다른 실시양태에서, 상기 재조합 미생물은 사카로마이세스 (예를 들어 사카로마이세스 세레비지애)이다.
본 발명의 바람직한 "재조합" 미생물은 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로 또는 효소, 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 경로 또는 효소 및(또는) 변형되거나 탈조절된 메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 경로 또는 효소를 보유하는 미생물이다. "탈조절된" 또는 "탈조절"이라는 용어는 미생물에서 생합성 경로의 효소를 코딩하는 1종 이상의 유전자를 변경 또는 변형시킴으로써, 미생물에서 상기 생합성 효소의 수준 또는 활성이 변경 또는 변형되도록 하는 것을 포함한다. 바람직하게는 생합성 경로의 효소를 코딩하는 1종 이상의 유전자가 변경 또는 변형되어 유전자 생성물이 증대되거나 증가된다. 또한, "탈조절된 경로"라는 어구는 생합성 경로의 효소를 코딩하는 1종 초과의 유전자가 변경 또는 변형되어 생합성 효소 1종 초과의 수준 또는 활성이 변경 또는 변형된 것을 포함할 수도 있다. 몇가지 경우에서, 미생물에서의 경로를 "탈조절"시키는 능력 (예를 들어 주어진 생합성 경로에서 1종 초과의 유전자를 동시에 탈조절시키는 능력)은, 1종 초과의 효소 (예를 들어 2 또는 3종의 생합성 효소)가 "오페론" (하기에서 정의함)이라 불리는 유전자 물질의 연속적인 조각상에서 서로 인접하게 존재하는 유전자에 의해 코딩되는 미생물의 특정 현상으로부터 발생한다. 오페론에 포함된 유전자들의 통합된 조절로 인하여, 단일 프로모터 및(또는) 조절 요소의 변경 또는 변형이 상기 오페론에 의해 코딩되는 각 유전자 생성물의 발현을 변경 또는 변형시킬 수 있다. 조절 요소의 변경 또는 변형은, 내인성 프로모터 및(또는) 조절 요소(들)의 제거, 강력한 프로모터, 유도가능한 프로모터 또는 복수개의 프로모터의 부가 또는 조절 서열의 제거를 통한 유전자 생성물 발현의 변형, 오페론의 염색체 위치 변형, 리보솜 결합 부위 등과 같이 오페론에 인접하거나 오페론에 포함된 핵산 서열의 변경, 오페론의 카피 수 증가, 오페론의 전사 및(또는) 오페론 유전자 생성물의 번역에 관여하는 단백질 (예를 들어 조절 단백질, 서프레서, 인핸서, 전사 활성자 등)의 변형 또는 유전자의 발현을 탈조절하는, 당업계에 흔한 임의의 다른 통상적인 수단 (예를 들어 레프레서 단백질의 발현을 차단하기 위해 안티센스 핵산 분자를 사용하는 것이 포함되나 이에 제한되지는 않음) 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 탈조절은 수득될 1종 이상의 유전자의 코딩 영역 변경, 예를 들어 피드백 내성이거나, 특이적 활성이 더 낮거나 높은 효소도 포함한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 상기 재조합 미생물은 1종 이상의 판토테네이트 생합성 효소, 1종 이상의 이소루이신-발린 생합성 효소 및(또는) 1종 이상의 MTF 생합성 효소를 과발현하도록 고안되거나 유전자조작된다. "과발현된" 또는 "과발현"이라는 용어는 유전자 생성물 (예를 들어 생합성 효소)의 발현 수준이 미생물 조작 전에 발현되던 수준에 비해, 또는 조작되는 않은 동등한 미생물에서 발현되는 수준에 비해 더 높은 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 미생물은 유전자적으로 고안되거나 유전자조작되어, 유전자 생성물을 이러한 유전자조작되지 않은 동등한 미생물에서 발현되는 수준보다 더 높은 수준으로 과발현할 수 있다.
유전공학적 유전자 조작은 특정 유전자의 발현과 관련된 조절 서열 또는 부위의 변경 또는 변형 (예를 들어 강력한 프로모터, 유도가능한 프로모터 또는 복수개 프로모터를 부가하거나, 조절 서열을 제거하여 발현이 구성적으로 이루어지도록 함), 특정 유전자의 염색체 위치 변형, 리보솜 결합 부위 등과 같이 특정 유전자에 인접한 핵산 서열의 변경, 특정 유전자의 카피 수 증가, 특정 유전자의 전사 및(또는) 특정 유전자 생성물의 번역에 관여하는 단백질 (예를 들어 조절 단백질, 서프레서, 인핸서, 전사 활성자 등)의 변형, 또는 특정 유전자의 발현을 탈조절하는, 당업계에 흔한 임의의 다른 통상적인 수단 (예를 들어 레프레서 단백질의 발현을 차단하기 위해 안티센스 핵산 분자를 사용하는 것이 포함되나 이에 제한되지는 않음) 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 유전공학적 유전자 조작은 예를 들어 경로 차단 또는 레프레서의 제거 등과 같은 유전자 결실을 포함할 수도 있다.
다른 실시양태에서, 상기 미생물을 물리적으로 또는 환경적으로 조작하여, 유전자 생성물이 미생물 조작 전에 발현되던 수준에 비해, 또는 조작되는 않은 동등한 미생물에서 발현되는 수준에 비해 더 높은 수준으로 과발현될 수 있다. 예를 들어 미생물을 특정 유전자의 전사 및(또는) 특정 유전자 생성물의 번역을 증가시킨다고 공지되어 있거나 그럴 것이라고 예상되는 작용제로 처리하거나 상기 작용제의 존재하에 배양하여 전사 및(또는) 번역을 증대 또는 증가시킬 수 있다. 별법으로, 미생물을 특정 유전자의 전사 및(또는) 특정 유전자 생성물의 번역을 증가시키도록 선택된 온도에서 배양하여 전사 및(또는) 번역을 증대 또는 증가시킬 수 있다.
V. 재조합 미생물의 배양 및 발효
"배양하는"이라는 용어는 본 발명의 살아있는 미생물을 유지시키고(시키거나) 성장 (예를 들어 배양물 또는 균주의 유지 및(또는) 성장)시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 미생물은 액체 배지에서 배양된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 미생물은 고체 배지 또는 반고체 배지에서 배양된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 미생물은 미생물의 유지 및(또는) 성장에 필수적이거나 유익한 영양물질 (예를 들어 탄소 공급원 또는 탄소 기질, 예를 들어 탄수화물, 탄화수소, 오일, 지방, 지방산, 유기산 및 알콜; 질소 공급원, 예를 들어 펩톤, 효모 추출물, 육류의 추출물, 맥아 추출물, 대두 조분 (soy meal), 대두분 (soy flour), 대두 그릿 (grit), 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄 및 인산암모늄; 인공급원, 예를 들어 인산 및 그의 나트륨염 및 칼륨염; 미량 원소, 예를 들어 마그네슘, 철, 망간, 칼슘, 구리, 아연, 붕소, 몰리브덴 및(또는) 코발트염; 및 성장 인자, 예를 들어 아미노산, 비타민 및 성장 촉진제 등)을 포함하는 배지 (예를 들어 멸균된 액체 배지)에서 배양된다.
바람직하게는, 본 발명의 미생물은 제어된 pH하에서 배양된다. "제어된 pH"라는 용어는 원하는 생성물 (예를 들어 판토에이트 및(또는) 판토테네이트)이 생산되는 임의의 pH를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 미생물은 약 pH 7에서 배양된다. 다른 실시양태에서, 상기 미생물은 pH 6.0 내지 8.5 사이에서 배양된다. 원하는 pH는 당업자에게 공지된 다수의 방법에 의해 유지될 수 있다.
또한 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 제어된 통기하에서 배양된다. "제어된 통기"라는 용어는 원하는 생성물 (예를 들어 판토에이트 및(또는) 판토테네이트)이 생산될 정도의 충분한 공기 (예를 들어 산소) 공급을 포함한다. 한 실시양태에서, 통기는 배양물 중의 산소 수준 조절을 통해, 예를 들어 배양 배지에 용해된 산소의 양 조절을 통해 제어한다. 바람직하게는, 배양물의 통기는 배양물 교반을 통해 제어한다. 교반은 프로펠러 또는 유사한 기계적 교반 장치를 통해, 배양 용기 (예를 들어 튜브 또는 플라스크)를 회전 또는 진탕시키거나, 또는 다양한 펌핑 장치를 사용하여 제공할 수 있다. 통기는 멸균된 공기 또는 산소를 배지를 통해 (예를 들어 발효 혼합물을 통해) 통과시킴으로써 추가로 제어할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 과도한 거품생성이 없이 (예를 들어 소포제의 첨가를 통해) 배양된다.
또한, 본 발명의 미생물은 제어된 온도하에서 배양할 수 있다. "제어된 온도"라는 용어는 원하는 생성물 (예를 들어 판토에이트 및(또는) 판토테네이트)이 생산되는 임의의 온도를 포함한다. 한 실시양태에서, 제어된 온도는 15℃ 내지 95℃ 사이의 온도를 포함한다. 다른 실시양태에서, 제어된 온도는 15℃ 내지 70℃ 사이의 온도를 포함된다. 바람직한 온도는 20℃ 내지 55℃ 사이이며, 더욱 바람직하게는 30℃ 내지 50℃ 사이이다.
미생물은 액체 배지에서 배양 (예를 들어 유지 및(또는) 성장)될 수 있으며, 바람직하게는 정치 배양, 시험관 배양, 진탕 배양 (예를 들어 회전 진탕 배양, 진탕 플라스크 배양 등), 통기 스피너 배양 또는 발효와 같은 통상적인 배양 방법에 의해 연속적으로 또는 간헐적으로 배양된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 미생물은 진탕 플라스크에서 배양된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 상기 미생물은 발효기 (예를 들어 발효 공정)에서 배양된다. 본 발명의 발효 공정에는 배치 (batch), 공급형-배치 (fed-batch) 및 연속 발효 공정 또는 방법 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다. "배치 공정" 또는 "배치 발효"라는 어구는 배지, 영양물질, 보충 첨가물 등의 조성이 발효의 시작 시점에서 설정되어 발효 도중에 변경되지 않는 시스템을 지칭하지만, 배지의 과도한 산성화 및(또는) 미생물 사멸 방지를 위해서 pH 및 산소 농도와 같은 인자들을 제어하기 위한 시도가 수행될 수 있다. "공급형-배치 공정" 또는 "공급형-배치" 발효라는 어구는 발효가 진행됨에 따라 1종 이상의 기질 또는 보충물을 첨가 (예를 들어 증량하여 첨가하거나 연속적으로 첨가)하는 것을 제외하고는 배치 발효와 동일하다. "연속 공정" 또는 "연속 발효"라는 어구는 규정된 발효 배지를 연속적으로 발효기에 첨가하는 동시에, 사용된 배지 또는 "조건화" 배지를 동량만큼 분리하여 바람직하게는 원하는 생성물 (예를 들어 판토에이트 및(또는) 판토테네이트)을 회수하는 시스템을 지칭한다. 위와 같은 다양한 공정들이 개발되어 당업계에 공지되어 있다.
"원하는 화합물이 생산되는 조건하에서 배양하는"이라는 어구는 원하는 화합물을 생산하거나, 또는 생산될 특정 화합물을 원하는 수율로 수득하기에 적절하거나 충분한 조건 (예를 들어 온도, 압력, pH, 기간 등)하에서 미생물을 유지 및(또는) 성장시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 원하는 양의 화합물 (예를 들어 판토에이트 및(또는) 판토테네이트)을 생산하기에 충분한 시간 동안 계속 배양한다. 바람직하게는, 화합물의 적합한 생산량에 실질적으로 도달하기에 충분한 시간 (예를 들어 판토에이트 및(또는) 판토테네이트가 적합한 농도에 도달하기에 충분한 시간 또는 판토에이트 및(또는) 판토테네이트 : HMBPA의 적합한 비율에 도달하기에 충분한 시간) 동안 계속 배양한다. 한 실시양태에서, 약 12 내지 24시간 동안 계속 배양한다. 다른 실시양태에서, 약 24 내지 36시간 동안, 36 내지 48시간 동안, 48 내지 72시간 동안, 72 내지 96시간 동안, 96 내지 120시간 동안, 120 내지 144시간 동안 또는 144시간 초과 동안 계속 배양한다. 다른 실시양태에서, 상기 미생물은 약 5 내지 10 g/L 이상의 화합물이 약 36시간 내에 생산되는 조건, 약 10 내지 20 g/L 이상의 화합물이 약 48시간 내에 생산되는 조건 또는 약 20 내지 30 g/L 이상의 화합물이 약 72시간 내에 생산되는 조건하에 배양한다. 다른 실시양태에서, 상기 미생물은 약 5 내지 20 g/L 이상의 화합물이 약 36시간 내에 생산되는 조건, 약 20 내지 30 g/L 이상의 화합물이 약 48시간 내에 생산되는 조건 또는 약 30 내지 50 또는 60 g/L 이상의 화합물이 약 72시간 내에 생산되는 조건하에 배양한다. 다른 실시양태에서, 상기 미생물은 약 40 내지 60 g/L 이상의 화합물이 약 36시간 내에 생산되는 조건 또는 약 60 내지 90 g/L 이상의 화합물이 약 48시간 내에 생산되는 조건하에 배양한다. 당업자는 상기에 언급한 범위의 상한 값이 본원에 기재한 방법, 예를 들어 특정 발효 운행법 또는 특정 유전자조작된 균주를 사용하여 얻을 수 있음을 알 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 생산 방법에 의해 판토테네이트 생산 수준이 "적절한 대조군에 비해 증대"된다. 본원에서 정의한 바와 같이, "적절한 대조군"이라는 용어는 당업자가 원하는 생성물의 증대, 증가 또는 상승된 수준 결정에 적절하다고 인식한 임의의 대조군을 포함한다. 예를 들어, 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로를 보유하고 탈조절된 MTF 생합성 경로 (즉, 유전자조작되어, 1종 이상의 MTF 생합성 효소가 탈조절, 예를 들어 과발현됨)를 추가로 보유하는 미생물 배양을 특징으로 하는 방법에서, 적절한 대조군은 상기 MTF 효소 또는 경로를 조작하기 전이거나 조작하지 않은 미생물 (즉, 오직 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로만을 보유함) 배양물을 포함한다. 유사하게, 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로 및 탈조절된 ilv 생합성 경로를 보유하고 탈조절된 MTF 생합성 경로 (즉, 1종 이상의 MTF 생합성 효소가 탈조절, 예를 들어 과발현되도록 유전자조작됨)를 추가로 보유하는 미생물 배양을 특징으로 하는 방법에서, 적절한 대조군은 상기 MTF 효소 또는 경로를 조작하기 전이거나 조작하지 않은 미생물 (즉, 오직 판토테네이트 생합성 경로 및ilv 생합성 경로만이 탈조절됨) 배양물을 포함한다. 본 발명에 따라 수행되는 각 방법을 비교할 필요는 없다. 예를 들어, 당업자라면 예를 들어 동일하거나 유사한 조건하에서 수행한 일련의 반응 (예를 들어 시험관 배양, 진탕 플라스크 배양, 발효)으로부터 적절한 대조군을 경험적으로 결정할 수 있다. 당업자는 예를 들어 특정 균주에 의한 통상의 생산 수준을 인지하고, 이러한 수준에 비해 증대, 증가 또는 상승된 수준을 인지할 수 있다. 즉, 적절한 대조군과의 비교는 미리결정된 값 (예를 들어 미리측정한 대조군)과의 비교를 포함한다.
따라서, 적절하게 유전자조작된 균주가 40 g/L의 판토테네이트를 36시간 내에 생산 (판토테네이트 생산을 증대시키는 조작을 하기 전)하는 실시양태에서, 50, 60, 70 g/L 이상의 판토테네이트 생산 (예를 들어 1종 이상의 MTF 생합성 효소가 과발현되는 조작을 한 후)이 생산 증대를 예시한다. 마찬가지로, 적절하게 유전자조작된 균주가 48시간 내에 50 g/L의 판토테네이트를 생산하는 실시양태 (판토테네이트 생산이 증대되는 조작을 하기 전)에서, 60, 70, 80, 90 g/L 이상의 판토테네이트 생산 (예를 들어 1종 이상의 MTF 생합성 효소가 과발현되는 조작을 한 후)이 생산 증대를 예시한다.
본 발명의 방법은 원하는 화합물 (예를 들어 판토에이트 및(또는) 판토테네이트)을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 원하는 화합물의 "회수"라는 용어는 배양 배지로부터 상기 화합물의 추출, 수거, 단리 또는 정제를 포함한다. 화합물의 회수는 통상적인 수지 (예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 수지, 비이온성 흡착 수지 등)로의 처리, 통상적인 흡착제 (예를 들어 활성 목탄, 규산, 실리카겔,셀룰로스, 알루미나 등)로의 처리, pH의 변경, 용매 추출 (예를 들어 알콜, 에틸 아세테이트 및 헥산 등과 같은 통상적인 용매를 사용함), 투석, 여과, 농축, 결정화, 재결정화, pH 조정 및 동결건조 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 당업계에 공지된 임의의 통상적인 단리 또는 정제 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어, 화합물을 배양 배지로부터 회수하기 위해서는 우선 배지에서 미생물을 제거할 수 있다. 이어서, 배지를 양이온 교환 수지를 통해 또는 상기 수지상에 통과시켜 양이온을 제거한 후, 음이온 교환 수지를 통해 또는 상기 수지상에 통과시켜 무기 음이온 및 관심 화합물보다 산도가 더욱 강력한 유기산을 제거한다. 이후, 생성된 화합물은 본원에 기재된 바와 같이 염 (예를 들어 칼슘염)으로 전환될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 원하는 화합물을 "추출", "단리" 또는 "정제"하여 생성된 제제에 다른 배지 성분이 실질적으로 존재하지 않도록 (예를 들어 배지 성분 및(또는) 발효 부산물이 없음) 한다. "다른 배지 성분이 실질적으로 존재하지 않는"이라는 표현은 원하는 화합물이 자신이 생산된 배양물의 배지 성분 또는 발효 부산물로부터 분리된, 원하는 화합물의 제제를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 제제는 원하는 화합물을 약 80％ (건조 중량％) 초과로 함유 (예를 들어 다른 배지 성분 또는 발효 부산물이 약 20％ 미만임)하고, 더욱 바람직하게는 원하는 화합물을 약 90％ 초과로 함유 (예를 들어 다른 배지 성분 또는 발효 부산물이 약 10％ 미만임)하고, 훨씬 더욱 바람직하게는 원하는 화합물을 약 95％ 초과로 함유 (예를 들어 다른 배지 성분 또는 발효 부산물이 약 5％ 미만임)하며, 가장 바람직하게는 원하는 화합물을 약 98 내지 99％ 초과로 함유 (예를 들어 다른 배지 성분 또는 발효 부산물이 약 1 내지 2％ 미만임)한다. 원하는 화합물이 염으로 유도체화된 경우, 상기 화합물은 이러한 염의 형성에 관련되었던 화학적 오염물질도 없는 것이 바람직하다. 원하는 화합물이 알콜로 유도체화된 경우, 상기 화합물은 이러한 알콜의 형성과 관련되었던 화학적 오염물질도 없는 것이 바람직하다.
별법의 실시양태에서, 예를 들어 미생물이 생물학적으로 무해 (예를 들어 안전)할 경우에는 미생물로부터 원하는 화합물을 정제해 내지 않는다. 예를 들어 전체 배양물 (또는 배양 상층액)을 생성물 (예를 들어 조 생성물)의 공급원으로서 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 배양물 (또는 배양 상층액)을 변형시키지 않은 채로 사용한다. 다른 실시양태에서, 상기 배양물 (또는 배양 상층액)을 농축시킨다. 다른 실시양태에서, 상기 배양물 (또는 배양 상층액)은 건조시키거나 동결건조시킨다.
다른 실시양태에서, 원하는 화합물을 부분적으로 정제한다. "부분적으로 정제한"이라는 용어는 적어도 어느 정도 가공한, 예를 들어 시판 수지를 사용하여 처리 (예를 들어 배치 처리)한 배지 제제를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, "부분적으로 정제한" 제제는 원하는 화합물을 약 30％ (건조 중량％) 초과, 바람직하게는 원하는 화합물을 약 40％ 초과, 더욱 바람직하게는 원하는 화합물을 약 50％ 초과, 훨씬 더욱 바람직하게는 원하는 화합물을 약 60％ 초과, 가장 바람직하게는 원하는 화합물을 약 70％ 초과로 함유한다. 또한, "부분적으로 정제한" 제제는 바람직하게는 원하는 화합물을 80％ 이하 (건조 중량％)로 함유한다 (즉, 본원에서 정의한 바와 같이 "추출", "단리" 또는 "정제"한 제제보다 덜 정제됨).
생합성 효소 또는 조작된 생합성 효소들의 조합에 따라, 본 발명의 미생물에 1종 이상의 생합성 전구체를 제공 (예를 들어 공급)하여 원하는 화합물(들)이 생산되도록 하는 것이 바람직하거나 필요할 수 있다. "생합성 전구체" 또는 "전구체"라는 용어는 미생물의 배양 배지에 제공되거나 상기 배지와 접촉하거나 상기 배지에 포함될 경우에 원하는 생성물의 생합성을 증대시키거나 증가시키는 기능을 하는 작용제 또는 화합물을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 생합성 전구체 또는 전구체는 아스파르테이트이다. 다른 실시양태에서, 상기 생합성 전구체 또는 전구체는 β-알라닌이다. 아스파르테이트 또는 β-알라닌의 첨가량은 배양 배지 중의 농도가 미생물의 생산성을 증대시키기에 충분한 농도 (예를 들어 판토에이트 및(또는) 판토테네이트의 생산을 증대시키기에 충분한 농도)가 되는 양인 것이 바람직하다. 본 발명의 생합성 전구체는 농축된 용액 또는 현탁액 (예를 들어 물 또는 완충액 등과 같은 적합한 용매 중)의 형태로 첨가되거나 고체 형태 (예를 들어 분말 형태)로 첨가될 수 있다. 또한, 본 발명의 생합성 전구체는 단일 분취액으로서, 연속적으로 또는 간헐적으로 주어진 시간에 걸쳐 첨가될 수 있다. "과량의 β-알라닌"이라는 용어는 β-알라닌 수준이 해당 미생물의 배양에 일상적으로 이용되는 수준보다 증가되거나 높다는 것을 포함한다. 예를 들어, 실시예에 기재된 바실러스 미생물의 배양은 약 0 내지 0.01 g/L의 β-알라닌의 존재하에 수행되는 것이 일상적이다. 따라서, 과량의 β-알라닌 수준은 약 0.01 내지 1 g/L, 바람직하게는 약 1 내지 20 g/L의 수준을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 상기 생합성 전구체는 발린이다. 다른 실시양태에서,상기 생합성 전구체는 α-케토이소발레레이트이다. 바람직하게는, 발린 또는 α-케토이소발레레이트는 배지 중의 농도가 원하는 생성물 (예를 들어 판토에이트 및(또는) 판토테네이트)의 생산에 충분할 정도인 양으로 첨가한다. "과량의 α-KIV"이라는 용어는 α-KIV 수준이 해당 미생물의 배양에 일상적으로 이용되는 수준보다 증가되거나 높다는 것을 포함한다. 예를 들어, 실시예에 기재된 바실러스 미생물의 배양은 약 0 내지 0.01 g/L의 α-KIV의 존재하에 수행되는 것이 일상적이다. 따라서, 과량의 α-KIV 수준은 약 0.01 내지 1 g/L, 바람직하게는 약 1 내지 20 g/L의 α-KIV를 포함할 수 있다. "과량의 발린"이라는 용어는 발린 수준이 해당 미생물의 배양에 일상적으로 이용되는 수준보다 증가되거나 높다는 것을 포함한다. 예를 들어, 실시예에 기재된 바실러스 미생물의 배양은 약 0 내지 0.5 g/L의 발린의 존재하에 수행되는 것이 일상적이다. 따라서, 과량의 발린 수준은 약 0.5 내지 5 g/L, 바람직하게는 약 5 내지 20 g/L의 수준을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 상기 생합성 전구체는 세린이다. 바람직하게는, 세린은 배지 중의 농도가 원하는 생성물 (예를 들어 판토에이트 및(또는) 판토테네이트)의 생산에 충분할 정도인 양으로 첨가한다. 과량의 세린 (본원에서 정의한 바와 같음)은 본원에 기재한 생산 방법에 따라 첨가되어, 예를 들어 판토테네이트의 생산을 증대시킬 수도 있다. 당업자라면, 극도로 과량의 생합성 전구체는 미생물 독성을 초래할 수 있음을 알 것이다. 생합성 전구체는 본원에서 "보충 생합성 기질"이라고도 부른다.
본 발명의 다른 측면은 본원에 기재한 재조합 미생물의 생물형질전환(biotransformation) 과정을 특징으로 한다. 본원에서 "생물전환 과정"이라고도 지칭하는 "생물형질전환 과정"이라는 용어는, 적절한 기질 및(또는) 원하는 생성물로의 중간체 화합물이 생산되는 생물학적 과정 (예를 들어 형질전환 또는 전환)을 포함한다.
생물형질전환 반응에 사용되는 미생물(들) 및(또는) 효소는 이들의 의도된 기능 (예를 들어 원하는 화합물의 생산)의 수행이 허용되는 형태로 존재한다. 상기 미생물은 온전한 세포이거나, 또는 세포에서 단지 원하는 최종 결과물 수득에 필요한 부분만일 수도 있다. 미생물의 현탁 (예를 들어 완충 용액 또는 배지 등과 같은 적절한 용액 중에 현탁함), 헹굼 (예를 들어 미생물 배양물을 배지가 제거되도록 헹굼), 아세톤-건조, 고정화 (예를 들어 폴리아크릴아미드 겔 또는 k-카라게닌을 사용하여 고정시키거나, 비드, 매트릭스 등의 합성 지지체 상에 고정시킴), 고정, 가교결합 또는 투과화 (예를 들어 투과화된 막 및(또는) 벽을 보유하여 기질, 중간체 또는 생성물 등의 화합물이 상기 막 또는 벽을 더욱 쉽게 통과할 수 있음)가 가능하다.
하기의 실시예를 통해 본 발명을 추가로 예시하지만, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 명세서에서 언급한 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원서의 전문은 본원에 참고로 도입된다.
실시예 I: 판토-화합물 생산 균주
미국 특허 출원 제09/400,494호 및 미국 특허 출원 제09/667,569호에 기재된바와 같이, 판토테네이트를 생산하는 바실러스 균주 개발시에는 판토테네이트 생합성 경로 및 이소루이신-발린 (ilv) 경로 (도 1)에 관여하는 유전자 및 효소에 다양한 유전자 조작을 수행한다. 예를 들어, 탈조절된 panBCD 오페론을 함유하고(하거나) 탈조절된 panE1을 함유하는 균주에서는 판토테네이트 생산 (β-알라닌 및 α-케토이소발레레이트 (α-KIV)의 존재하에 배양할 경우)이 증대되는 것으로 나타난다. ilvBNC 및 ilvD까지도 추가로 탈조절된 균주는 β-알라닌만이 존재하는 경우에 판토테네이트 생산이 증대되는 것으로 나타난다. 또한, panD까지도 추가로 탈조절시킴으로써, β-알라닌으로부터의 독립성 달성이 가능하다.
판토테네이트 생산 균주의 일례는 PA824로서, 트립토판 원영양체, Spec- 및 Tet-내성이고, panBCD 유전자좌위에서 panBCD가 탈조절되고, panE1 유전자좌위에서 panE1가 탈조절 (바실러스 섭틸리스 게놈 내의 2개 유전자가 대장균 panE, panE1 및 panE2에 상동성이 있으며, 주요 케토판토에이트 리덕타제를 코딩하는 전자는 판토테네이트 생산에 관여하는 반면, panE2는 판토테네이트 합성에 기여하지 않음 (미국 특허 출원 제09/400,494호))되고, ilvD 유전자좌위에서 ilvD가 탈조절되고, amyE 유전자좌위에서 ilvBNC 카세트를 과발현하며, bpr 유전자좌위에서 panD를 과발현한다. 통상적으로, 표준 발효 절차 (예를 들어 특허 가출원 제60/263,053호 또는 특허 가출원 제60/262,995호를 참조하며, 상기 문헌은 본원에 참고로 도입됨)에 따라 14 L 발효기 용기에서 48시간 동안 배양한 PA824는 대략 40 내지 50 g/L의 판토테네이트를 생산한다. 간략하게 설명하면, 미량 원소를 함유하는 배치 배지 (4.5 L)에 PA824의 진탕 플라스크 배양물을 접종한다. 온도 (예를 들어 43℃), 용존 산소량 및 pH에 관하여 발효를 제어하고, 글루코스가 제한된 공급형-배치 공정으로 운행한다. 초기 배치의 글루코스가 소모된 후에는 신선한 FEED 배지를 연속 공급함으로써 글루코스 농도를 약 0 내지 1 g/L로 유지한다. pH는 7.2로 설정하여 모니터링하면서, NH3-용액 또는 H3PO4-용액을 공급하여 유지한다. 용존 산소 농도 [pO2]는 교반 및 통기 속도를 조절하여 약 10 내지 30％로 유지한다. 거품형성은 적절한 소포제를 첨가하여 제어한다. 원심분리하여 세포를 제거한 후에, 발효 브로스 (broth) 중의 판토테네이트 역가를 측정 (HPLC 분석을 이용함)한다.
두번째 예시적인 균주는 PA668이다. PA668은 PA824의 유도체로서, vpr 및(또는) panB 유전자좌위에서 증폭된 P26panB의 여분의 카피를 함유한다. PA668은 클로르암페니콜에 의해 복수개 카피 선별이 가능한 panB 발현 벡터 (pAN636)를 사용하여 제작하였다. 간략하게 설명하면, pAN636 NotI 제한 단편 (벡터 서열 제외)을 라이게이션한 후에, 이를 사용하여 PA824를 형질전환시켜 5 ㎍/mL 클로르암페니콜을 함유하는 플레이트상에서 선별하였다. 30 ㎍/mL 클로르암페니콜에 내성이 있는 형질전환체를 단리하여 48시간 시험관 배양시의 판토테네이트 생산에 대해 스크리닝하였다. 상기 단리체는 PA824보다 판토테네이트를 약 10％ 더 생산한다. 10-L 발효시, 첫번째 균주인 PA668-2A는 유사한 조건 (예를 들어 약 45 내지 50 g/L, 36시간)하에 배양한 PA824에 동등한 양으로 판토테네이트를 생산한다. 36시간 후에는 PA824를 사용한 판토테네이트 생산을 통상적으로 서서히 시작하였고, PA668-2A는 판토테네이트를 유의한 수준 (예를 들어 48시간에 약 60 내지 65 g/L의 판토테네이트)으로 계속 생산했다. 두번째 균주인 PA668-24는 판토테네이트를 훨씬 더 빠른 속도로 생산하여, 48시간 후에는 60 내지 70 g/L에 이르렀다.
세번째 생산 균주인 PA721B-39를 다음과 같이 유전자조작시켜, 증폭가능한 P26panBpanD 카세트를 추가로 포함하도록 하였다. 먼저, bpr 유전자좌위에서 panB와 panD를 모두 통합할 수 있는 단일 발현 카세트를 제조하였다. 상기 2개의 유전자 모두를 1개의 발현 카세트에서 합함으로써, 항생제 내성 마커 제거에 의해 생성된 균주를 단순화했다. P26panBpanD 발현 카세트는 2종의 상이한 panD 리보솜 결합 부위 (RBS는 국제 공개 WO 01/21772 및 미국 특허 출원 제60/262,995호에서 이미 합성되어 시험된 바 있음) 각각을 포함하도록 제조했다. 상기 카세트는 합성 panB 유전자 리보솜 결합 부위 (RBS1)를 추가로 포함하였으나, 이러한 고안은 단순한 올리고뉴클레오티드 카세트 치환을 이용한, panB RBS에 대한 이후의 변경을 허용한다. 도 3에서 pAN665의 제조에 관해 예시한 바와 같이, 제조의 제1단계에서는 panB 유전자를 2개의 panD 유전자 카세트에 연결하였다. 도 4에 예시한 바와 같이, 이후에는 생성된 panBpanD 카세트를 바실러스 섭틸리스 발현 벡터 pOTP61로 이동시켰다. 제조된 각각의 플라스미드 (pAN670 및 pAN674)의 본질적인 특징들을 하기 표 1에 요약하여 나타냈다.
다양한 바실러스 섭틸리스 panBpanD 유전자 발현 카세트를 함유하는 플라스미드
플라스미드 panD RBS 벡터 숙주 균주
pAN665 표준 pASK-1BA3 대장균
pAN670 표준 pOTP61 바실러스 섭틸리스
pAN669 ND-C2 pASK-1BA3 대장균
pAN674 ND-C2 pOTP61 바실러스 섭틸리스
이들 신규 플라스미드들은 단일 벡터로부터 여분의 PanB 및 PanD 생산을 조합하고, PA668에 존재하는 panB 발현 벡터 (pAN636)에 비해 PanB를 증가된 수준으로 생산할 것이라고 예측되었다. 판토테네이트 생산 균주 중 P26panBpanD 벡터의 구축 전략은 bpr 및 panE1 사이의 유전자 연결이라는 잇점이 있다. PA930 (panE1::cat)으로부터 단리하여 클로르암페니콜 내성에 대해 선별한 염색체 DNA로 PA824를 형질전환시킴으로써, 기존의 panD 발현 카세트가 보존된 PA824의 유도체를 먼저 제작하였다. 생성된 형질전환체를 테트라사이클린에 대한 민감성에 관해 스크리닝하고, PA715라고 명명한 2개의 Tet-민감성 단리체를 저장하였다. 이 균주는 P26panBpanD 벡터를 시험하기 위한 숙주 균주였다 (하기 참조). PA715에서 P26panE1 카세트를 복구시키기 위해서, 각각의 벡터를 사용하여 먼저 P26panE1을 함유하지만 bpr 유전자좌위에 카세트가 통합되어 있지 않은 균주 (PA328)를 형질전환시켰다. PA328은 P26panBCD 유전자좌위를 함유하지만, α-KIV를 과생산하도록 유전자조작되지 않았다. 2개의 벡터로부터의 적절한 NotI 제한 단편을 사용하여 테트라사이클린에 내성이 있는 PA328 형질전환체를 수득하였고, 생성된 균주를 PA710 및 PA714라고 명명하였다.
다음 단계는 상기 카세트를 PA715로 이동시키는 것으로, 이들을 PA824 균주 백그라운드 (background)에서 평가할 수 있다. 이 단계는 균주 PA710 및 PA714로부터 염색체 DNA를 단리하고, 이들 2종의 DNA 각각을 따로따로 사용하여 PA715를 형질전환시켜 테트라사이클린 내성에 대해 선별함으로써 수행하였다. 테트라사이클린-내성 형질전환체를 클로르암페니콜에 대한 민감성에 관해 스크리닝하였다: bpr 유전자좌위에서 P26panBpanD 카세트와 연결시킴으로써 공여자 DNA로부터의 P26panE1 유전자까지 획득한 원하는 형질전환체를 확인하였다. PA710 또는 PA714 염색체 DNA를 공여자로 사용한 형질전환을 통해 유래된 클로르암페니콜-민감성 단리체를 수득했다. 시험관 배양 분석에서 최고 역가의 판토테네이트를 생산한 단리체를 보관하였다. 이들 균주를 각각 PA717 및 PA721이라고 명명하였다. 이들 신규 균주 뿐 아니라 PA824 및 PA715의 2벌 시험관 배양물을 SVY + 10 g/L 아스파르테이트 중에서 43℃에서 48시간 동안 성장시킨 후에 판토테네이트, HMBPA 및 β-알라닌에 대해 분석하였다. 또한, 상기 균주 각각으로부터의 추출물로 SDS-PAGE 겔을 수행하엿다. 시험관 배양 분석 결과를 하기 표 2에 나타냈다.
예측된 바와 같이, 상기 신규 균주 각각은 PA715보다 판토테네이트와 β-알라닌을 더욱 많이 생산했다. 상기 균주 중 2종 (PA717-24 및 PA721-39)은 PA824만큼의 많은 판토테네이트를 생산했고, PA721-35는 PA824보다 더 많은 판토테네이트를 생산했다. 신규 균주 3종 모두가 HMBPA는 PA824보다 적게 생산했다. 단백질 겔 분석을 통해, 상기 3종의 신규 균주가 임의의 대조군 균주보다 더 많은 양의 PanB를 생산하는 것으로 나타났다.
또한, 균주 PA717-24, PA721-35 및 PA721-39를 대두분 기재 배지 중의 진탕 플라스크 배양물에서도 평가하였다. 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 증폭가능한 P26panBpanD 카세트를 함유하는 이들 균주는, 별도의 증폭가능한 P26panB 및 P26panD카세트를 함유하는 PA668-2 및 PA668-24의 경우에서 나타난 수준과 유사한 수준으로 판토테네이트 및 HMBPA를 생산했다.
조건: 40 mL 배지/200 mL 용량의 (baffled) 진탕 플라스크, 4 ×바이오쉴드 (Bioshield) 커버, 300 rpm, 2.5％ 접종 (1.0 mL).
대두 배지: 20 g/L 카르길 (Cargill) 200/20 대두분, 8 g/L (NH4)2SO4, 5 g/L 글루타메이트, 1 ×PSTE, 0.1 M 인산 (pH 7.2) 및 0.3 M MOPS (pH 7.2), 60 g/L 글루코스 또는 말토스 w/10 mM Mg 및 1.4 mM Ca.
2벌 플라스크의 평균치임.
원하는 판토-화합물을 상업량으로 생산하도록 유전자조작된 특정 균주는 판토테네이트 (및 도 1 및 본원에 기재한 기타 판토-화합물)을 생산할 뿐 아니라, 3-(2-히드록시-3-메틸-부티릴아미노)-프로피온산 (HMBPA) (또한, 본원에서는 "β-알라닌 2-(R)-히드록시이소발레레이트", "β-알라닌 2-히드록시이소발레레이트", "β-알라닐-α-히드록시이소발라레이트" 및(또는) "팬토테네이트"라고 지칭되기도 함)로 확인된 부산물도 생산한다는 것이 입증되었다 (본원에서는 "팬토테네이트"라는 용어를 "fan"이라 약칭하였음).
HMBPA는 PanC 효소에 의해 촉매되는, [R]-α-히드록시이소발레르산 (α-HIV)과 β-알라닌의 축합 생성물이다. α-HIV는 α-KIV의 환원에 의해 생성되는데, 이 반응은 α-케토 리덕타제 PanE (예를 들어 PanE1 및(또는) PanE2) 및(또는) IlvC에 의해 촉매된다. 따라서, 미생물에는 생합성 효소 PanB의 기질인 α-KIV에 대해 경쟁하는 경로가 적어도 2개 (즉, 판토테네이트 생합성 경로 및 HMBPA 생합성 경로) 존재한다고 제안된 바 있다 (α-KIV에 대해 경쟁하는 제3 및 제4 경로는 α-KIV으로부터 발린 또는 루이신을 생산함; 예를 들어 도 1 참조). 적어도 판토테네이트 생합성 경로 및 HMBPA 생합성 경로는, 효소 PanC에 대한 경쟁적 기질, 즉 α-HIV 및 판토에이트를 추가로 생산한다. HMBPA 생산은 판토테네이트 생산에 유의한 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, HMBPA 경로는 판토테네이트 경로와 전구체 (α-KIV 및 β-알라닌) 및 상기 경로 효소 중 일부 (PanC, PanD, PanE1 및(또는) IlvC)에 대해 경쟁할 수 있다. 또한, HMBPA의 구조가 판토테네이트의 구조와 유사하기 때문에, 판토테네이트 경로 중 하나 이상의 단계를 네가티브 조절하는 바람직하지 못한 특성을 보유할 수 있다. HMBPA의 확인을 바탕으로, 미국 특허 가출원제60/262,995호는 HMBPA 생합성 과정에 비해 판토테네이트 생합성 과정에서 기질 (α-KIV 및 β-알라닌) 및(또는) 효소 (PanC, PanD, PanE1 및(또는) IlvC)의 사용을 유리하게 하는 임의의 수단을 통해, 판토테네이트 생산이 개선되거나 최적화될 수 있음을 교시한다.
실시예 II: 세린 이용가능성의 증가를 통한 판토테네이트 생산 증가
판토테네이트 생산을 최적화하는 방법들 중 하나 이상이 미생물 배양시에 세린의 이용가능성을 조절하는 것을 포함한다. 특히, 세린의 이용가능성 증가가 판토테네이트 생산을 증가 (예를 들어 HMBPA 생산에 비해)시키는 반면, 세린의 이용가능성 감소가 판토테네이트 생산을 HMBPA 생산에 비해 감소시킨다는 것을 입증할 수 있다. 상기 방법은 세린에서 유도된 화합물인 메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF)가 판토테네이트 생합성 반응 동안 α-KIV에 히드록시메틸기를 제공하여 케토판토에이트를 생성하게 한다 (예를 들어 도 1 및 도 2 참조)는 이해를 바탕으로 한다. 따라서, 세린 수준의 조절은 적절하게 유전자조작된 미생물에서 케토판토에이트 수준을 효과적으로 조절함으로써 판토에이트 및(또는) 판토테네이트 생산을 조절하는 수단 중 하나이다. 이러한 조절을 입증하기 위해서, PA824를 SVY 글루코스 + 5 g/L β-알라닌 ±5 g/L 세린을 함유하는 시험관 배양으로 48시간 동안 43℃에서 성장시켰다.
상기 표 4에 제시한 데이타로 입증되는 바와 같이, 세린 첨가에 의해 판토테네이트 생산 수준이 증가된다 (그러나, HMBPA 생산은 반대로 감소됨).
실시예 III: glyA 유전자 생성물인 세린 히드록실메틸 트랜스퍼라제의 양이 증가되도록 하는, 박테리아 세포의 유전자조작
세린 공급에 대한 대안으로서, 세린 수준을 증가시키고(시키거나) 세린 이용 수준을 증가시켜 (이에 의해, 메틸렌테트라히드로폴레이트 수준도 증가됨) 판토테네이트 생산 수준을 조절하는 다른 방법은 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제 또는 세린 히드록시메틸 트랜스퍼라제 (각각 serA 및 glyA 유전자 생성물)의 합성 또는 활성을 증가시킴으로써, 적절하게 유전자조작된 미생물에서 세린 및 메틸렌테트라히드로폴레이트 생합성을 증가시키는 것이다.
glyA 유전자 발현은 강력한 구성적 프로모터의 하류에 클로닝된 바실러스 섭틸리스 glyA 유전자를 함유하는 발현 카세트로 형질전환시킴으로써 증가되었다. 발현 카세트를 제작하기 위해서, 바실러스 섭틸리스 PY79로부터 단리한 염색체 DNA를 표 5에 나타낸 프라이머 RY417 및 RY418을 사용하여 PCR시켜 glyA 유전자를 증폭시켰다.
RY417은 XbaI 부위의 바로 하류에 RBS2 합성 리보솜 결합 부위를 함유한다. 이후, 증폭된 DNA를 XbaI 및 BamHI으로 절단하고, 벡터 pAN004 (도 5)의 XbaI과 BamHI 부위 사이에 클로닝하여, 플라스미드 pAN396 (도 6, 서열 24)을 생성했다. pAN004 벡터는 XbaI 클로닝 부위의 바로 상류에 파지 SP01 P26프로모터를 함유하여 클로닝된 glyA 유전자의 발현을 구동한다. pAN396은 발현 카세트의 바로 하류에 바실러스 섭틸리스에서 기능하는 cat 유전자를 함유한다. 바실러스 섭틸리스를 형질전환하기 위해서, pAN396으로부터 P26glyA 카세트 및 cat 유전자를 함유하는 NotI DNA 단편을 단리하여 자가-라이게이션시키고, 바실러스 섭틸리스 PY79의 감응성 세포에 형질전환시켰다. 여러 클로르암페니콜 내성 형질전환체를 선별하여 PA1007 및 PA1008이라고 명명하였다. 이들 균주 각각으로부터 염색체 DNA를 단리하고, 이를 사용하여 PA721B-39 및 PA824의 감응성 세포를 형질전환시켜 각각 균주 PA1011 및 PA1014를 수득했다. PA1011 및 PA1014의 선별된 단리체의 세포 추출물을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동시켜, 이들 균주가 glyA 유전자 생성물을 이들의 모(母) 균주인 PA721B-39 (실시예 I 기재) 및 PA824 (국제 공개 WO 01/21772 기재)에 비해 증가된 양으로 함유한다는 것을 확인하였다. glyA 발현 증가가 판토테네이트 생산에 미치는 효과를 시험하기 위해서, PA1011 및 PA1014를 SVY 글루코스 + 5 g/L β-알라닌을 함유하는 시험관 배양으로 48시간 동안 43℃에서 성장시켰다. 표 6에 제시한 데이타로 알 수 있는 바와 같이, PA1014의 판토테네이트 생산량 (4.5 g/L)은 이의 모 균주인 PA824 (3.2 g/L)보다 더 많았다. 유사하게, PA1011의 평균 판토테네이트 생산량 (4.35 g/L)은 이의 모 균주인 PA721B-39 (4.05 g/L)보다 더 많았다.
실시예 IV: serA 유전자 생성물인 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제의 양이 증가되도록 유전자조작한 박테리아 세포
serA 유전자 생성물인 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제는 세린 생합성경로 (도 2 참조)의 첫번째 개입 (committed) 효소이다. 세린이 MTF 합성을 위한 기질 중 하나이기 때문에, 본 발명자들은 serA 유전자가 과발현되도록 유전자조작하여, 세포 내 세린 수준을 증가시켰다. 실시예 III에서 glyA 유전자에 대해 상기 기재한 바와 유사한 방식으로, 강력한 구성적 프로모터의 하류에 클로닝한 바실러스 섭틸리스 serA 유전자를 함유하는 발현 카세트로 바실러스 섭틸리스 세포를 형질감염시킴으로써 serA 유전자 발현이 증가되었다. 발현 카세트를 제작하기 위해서, 표 5에 나타낸 프라이머 RY405 및 RY406을 사용하여 바실러스 섭틸리스 PY79로부터 단리한 염색체 DNA의 PCR을 통해 serA 유전자를 증폭시켰다. 이어서, 증폭된 DNA를 XbaI 및 Bam HI로 절단하고, 벡터 pAN004 (도 5)의 XbaI과 BamHI 부위 사이에 클로닝하여 플라스미드 pAN393 (도 7, 서열 25)을 수득했다. 바실러스 섭틸리스를 형질전환시키기 위해서, P26serA 카세트 및 cat 유전자를 함유하는 NotI DNA 단편을 pAN393으로부터 단리하여 자가-라이게이션시키고, 바실러스 섭틸리스 PY79의 감응성 세포에 형질전환시켰다. 여러개의 클로르암페니콜 내성 형질전환체를 선별하여 PA1004 및 PA1005로 명명하였다. 이들 균주 각각으로부터 염색체 DNA를 단리하고, 이를 사용하여 PA721B-39 및 PA824의 감응성 세포를 형질감염시켜 각각 균주 PA1010 및 PA1013을 수득했다. PA1010 및 PA1013의 선별된 단리체의 세포 추출물을 사용하여 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행함으로써, 이들 균주가 함유하는 serA 유전자 생성물의 양이 이들의 모 균주 PA721B-39 및 PA824의 경우에 비해 증가되었음을 확인하였다.
판토테네이트 생산에 대한 serA 발현 증가의 효과를 시험하기 위해서, PA1010 및 PA1013을 SVY 글루코스 + 5 g/L β-알라닌을 함유하는 시험관 배양으로 48시간 동안 43℃에서 성장시켰다. 표 7에 제시한 데이타에 나타난 바와 같이, PA1010에 의한 판토테네이트 평균 생산량 (4.7 g/L)은 이의 모 균주 PA721B-39이 생산한 양 (4.1 g/L)보다 많았다. 유사하게, PA1013에 의한 판토테네이트 평균 생산량 (4.1 g/L)은 이의 모 균주 PA824가 생산한 양 (3.1 g/L)보다 많았다.
실시예 V: serA 및 glyA 발현이 증가한 균주를 사용한, 진탕 플라스크 및 발효기 실험
시험관에서의 수행 결과를 바탕으로, 증폭가능한 serA 카세트를 함유하는 2개의 균주 및 증폭가능한 glyA 카세트를 함유하는 2개의 균주를 2가지 모 PA824 및PA721B-39 각각에서 하나씩 선별했다. 상기 4개의 균주를 이들의 모 균주와 함께 진탕 플라스크에서 성장시켰다 (표 8). 대두분 MOPS 글루코스 (SMG) 배지 중에서, 4개 균주 모두는 판토테네이트 생산량이 이들의 모 균주보다 더 많았다. 대두분 MOPS 말토스 (SMM) 배지 중에서, 상기 4개 균주 중 하나는 모 균주보다 더 우수한 것으로 나타났다.
각각의 모 균주로부터의 serA 과발현 균주 및 glyA 과발현 균주를 10-L 케매프 (Chemap) 벤치 발효기 중에서 동시에 운행하였다. SMM 중에서의 판토테네이트 역가가 가장 높았던, PA824로부터 유래한 glyA 과발현 균주인 PA1014-3은 발효기에서도 가장 우수하게 수행하였다 (표 9). 균주 PA1014-3은 36시간 동안 배양 상층액 중에 71 g/L의 판토테네이트를 생산하였고, 48시간 동안 배양 상층액 중에 86 g/L의 판토테네이트를 생산하였는데, 이는 모 PA824에 비해 각각 41 g/L 및 46 g/L의 판토테네이트를 더 생산한 것이다. serA 균주인 PA1012-4도 PA824 대조군보다 유의하게 더 많은 판토테네이트를 생산하여, 36시간 및 48시간 동안 배양 상층액 중에 각각 52 g/L 및 60 g/L을 더 생산했다. 이러한 결과는 glyA 및 serA 모두를 증가시키는 효과를 명백하게 입증하는 것이다.
또한, PA721B-39의 serA 과발현 및 glyA 과발현 유도체는 이들의 모 균주에 비해 명백하게 개선되었다. 둘 모두가 48시간 동안 배양 상층액 중에 약 80 g/L (각각 82 g/L 및 79 g/L)의 판토테네이트를 생산했다. PA824 유도체에 대비한 PA721B-39 유도체에서의 PanB 수준 증가는 그 자체가 HMBPA의 감소 효과를 명백하게 입증하는 것이다. 48시간 후에, PA721B-39 및 이의 유도체는 PA824 또는 심지어 PA668-24보다도 HMBPA를 덜 생산했다. 또한, GlyA 증가는 HMBPA로의 탄소 흐름을 저하시키는 것으로 여겨진다.
모든 데이타는 48시간 후의 진탕 플라스크 2벌의 평균치임.
조건: 40 mL 배지/200 mL 용량의 진탕 플라스크, 4 ×바이오쉴드 커버, 300 rpm, 2.5％ 접종 및 43℃.
배지: 20 g/L 카르길 200/20 대두분, 1 ×PSTE, 8 g/L (NH4)2SO4및 5 g/L 글루타메이트.
완충액: 0.1 M 인산 (pH 7.2) 및 0.3 M MOPS (pH 7.2).
탄소 공급원 (20 ×스톡으로서 따로따로 멸균시킴): 60 g/L 글루코스 또는 말토스 w/10 mM Mg 및 1.4 mM Ca.
사용한 배지는 PFM-222였다. 다음과 같이 변화시켰음을 제외하면, 이는 미국 제60/262,995호 (2001년 1월 19일자 출원)에 기재된 배지 PFM-155와 동일한 것이다: (1) 배치 재료: 앰버렉스 (Amberex) 1003는 사용하지 않았다. 카르길 200/20 (대두분) 40 g/L를 카르길 20-80 (대두 그릿) 50 g/L로 교체하고, MgSO4·7H20를 MgCl2·7H20 1 g/L로 대체하였으며, SM-1000X를 PSTE-1000X (PSTE-1000X = MnCl2·4H2O, 2.0 g/L; ZnSO4·7H2O, 1.5 g/L; CoCl2·6H2O, 2.0 g/L; CuS04·5H20, 0.25 g/L; Na2MoO4·2H2O, 0.75 g/L)로 대체하였다. 공급 재료: SM-1000X를 PSTE-1000X로 교체하였다.
판토테네이트 생산 증가는 단일 균주에서 serA와 glyA의 과발현을 조합하고(하거나) 피드백 내성 serA 또는 glyA 또는 둘다를 유도하는 돌연변이를 도입함으로써 달성할 수도 있다.
균등물 당업자라면, 일상적인 실험만을 이용하여도 본원에 기재한 발명의 구체적인 실시양태에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있다. 이러한 동등물은 하기하는 청구의 범위에 포함되는 것으로 한다.

Claims (40)

  1. 탈조절된 (deregulated) 메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 경로를 보유하는 미생물을 판토테네이트 생산이 증대되는 조건하에 배양하는 단계를 포함하는, 판토테네이트의 생산 증대 방법.
  2. (i) 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로 및 (ii) 탈조절된 메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 경로를 보유하는 미생물을 판토테네이트 생산이 증대되는 조건하에 배양하는 단계를 포함하는, 판토테네이트의 생산 증대 방법.
  3. 제2항에 있어서, 미생물에서 2종 이상의 판토테네이트 생합성 효소가 탈조절된 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 미생물에서 3종 이상의 판토테네이트 생합성 효소가 탈조절된 것인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 미생물에서 4종 이상의 판토테네이트 생합성 효소가 탈조절된 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 미생물이 탈조절된 케토판토에이트 히드록시메틸트랜스퍼라제, 탈조절된 케토판토에이트 리덕타제, 탈조절된 판토테네이트 신테타제 및 탈조절된 아스파르테이트-α-데카르복실라제를 함유하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 경로를 추가로 보유하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 미생물에서 2종 이상의 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 효소가 탈조절된 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 미생물에서 3종 이상의 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 효소가 탈조절된 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 미생물이 탈조절된 아세토히드록시산 신테타제, 탈조절된 아세토히드록시산 이소메로리덕타제 및 탈조절된 디히드록시산 데히드라타제를 함유하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물에서 1종 이상의 MTF 생합성 효소가 탈조절된 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 미생물이 탈조절된 glyA 유전자를 함유하는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 미생물이 탈조절된 serA 유전자를 함유하는 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 미생물이 탈조절된 glyA 유전자 및 탈조절된 serA 유전자를 함유하는 것인 방법.
  15. 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로, 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 경로 및 탈조절된 메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 경로를 보유하여 판토테네이트 생산이 증대된 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 판토테네이트의 생산 증대 방법.
  16. 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로, 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 경로 및 탈조절된 메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 경로를 보유하는 미생물을 배양하여, 미생물 배양 36시간 후에 50 g/L 이상의 판토테네이트가 생산되도록 하는 단계를 포함하는, 판토테네이트의 생산 방법.
  17. 제16항에 있어서, 미생물을 배양하여 미생물 배양 36시간 후에 60 g/L 이상의 판토테네이트가 생산되도록 하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 미생물을 배양하여 미생물 배양 36시간 후에 70 g/L 이상의 판토테네이트가 생산되도록 하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  19. 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로, 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 생합성 경로 및 탈조절된 메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 경로를 보유하는 미생물을 배양하여, 미생물 배양 48시간 후에 60 g/L 이상의 판토테네이트가 생산되도록 하는 단계를 포함하는, 판토테네이트의 생산 방법.
  20. 제19항에 있어서, 미생물을 배양하여 미생물 배양 48시간 후에 70 g/L 이상의 판토테네이트가 생산되도록 하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 미생물을 배양하여 미생물 배양 48시간 후에 80 g/L 이상의 판토테네이트가 생산되도록 하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 판토테네이트 키나제 활성을 조절하여 판토테네이트 생산을 더욱 증대시키는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 판토테네이트 키나제 활성을 감소시키는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, CoaA를 결실시키고 CoaX를 하향조절하는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, CoaX를 결실시키고 CoaA를 하향조절하는 것인 방법.
  26. 제23항에 있어서, CoaX 및 CoaA를 하향조절하는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물을 과량의 세린 조건하에 배양하는 것인 방법.
  28. 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로를 보유하는 미생물을 과량의 세린 조건하에 배양하여 판토테네이트가 생산되도록 하는 단계를 포함하는, 판토테네이트의 생산 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로를 보유하여, 판토테네이트 생산이 β-알라닌 공급과 무관한 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 그람 (Gram)-양성 미생물인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 바실러스 (Bacillus) 속에 속하는 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis)인 것인 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법에 따라 합성된 생성물.
  34. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산된 판토테네이트를 포함하는 조성물.
  35. 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로 및 탈조절된 메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 경로를 보유하여 판토테네이트 생산이 증대된 재조합 미생물.
  36. 탈조절된 판토테네이트 생합성 경로, 탈조절된 메틸렌테트라히드로폴레이트 (MTF) 생합성 경로 및 탈조절된 이소루이신-발린 (ilv) 경로를 보유하여 판토테네이트 생산이 증대된 재조합 미생물.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 감소된 판토테네이트 키나제 활성을 추가로 보유하는 미생물.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 그람-양성 미생물인 미생물.
  39. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 바실러스 속에 속하는 미생물.
  40. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 바실러스 섭틸리스인 미생물.
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