CN108570437B - 提升克雷伯氏肺炎杆菌生产异丁醇的方法及改造菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了提升克雷伯氏肺炎杆菌生产异丁醇的方法及改造菌。所述方法为：失活克雷伯氏肺炎杆菌中的乙酰乳酸脱羧酶；或者失活乙酰乳酸脱羧酶并且高水平表达吲哚‑3‑丙酮酸脱羧酶；或者同时失活乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶，高水平表达吲哚‑3‑丙酮酸脱羧酶。该方法中酶失活和高表达后的克雷伯氏肺炎杆菌为改造菌。将改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到碳源培养基中进行发酵培养，发酵过程中改造的克雷伯氏肺炎杆菌将培养基中的碳源转化成异丁醇。本发明提供的提升克雷伯氏肺炎杆菌生产异丁醇的方法，改造的菌株中未引入外源基因，菌株遗传稳定性高，产物终浓度高，原料范围广。

Description

提升克雷伯氏肺炎杆菌生产异丁醇的方法及改造菌
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及克雷伯氏肺炎杆菌生产异丁醇。
背景技术
异丁醇主要用作原料合成其他化学品，包括乙酸异丁酯、异丁烯等产品。异丁烯作为平台化合物可用于合成甲基叔丁基醚(MTBE)、乙基叔丁基醚(ETBE)、异辛稀、对苯二甲酸等燃料和化学品。MTBE和ETBE可以提高汽油辛烷值，作为汽油添加剂广泛使用。异丁醇具有与汽油接近的能量密度，吸水性弱，挥发性低，辛烷值高，这些特点使得异丁醇成为一种潜在的液体燃料。
异丁醇是一种重要的石油化学品，是石化工业中蒸汽裂化和催化裂化的副产物。除石油工业外，化学法合成异丁醇主要采用合成气为原料。包括直接利用合成气在高温高压下催化合成异丁醇和先在低温下合成甲醇和高级醇，混合醇再在高温下催化形成异丁醇两种方法。另外可以利用甲醇和乙醇溶液作为原料通过催化合成异丁醇。
目前仅发现酿酒酵母等少数微生物可以合成微量的异丁醇，商品异丁醇由化学合成法生产(Nature,2008,451,86-89)。目前报道的其他生物法合成异丁醇都是在宿主细胞中构建新的代谢途径来实现。将来源于将乳脂乳球菌的2-酮酸脱羧酶基因克隆到大肠杆菌，并同时表达alsS，ilvC和ilvD基因，工程菌株可以利用葡萄糖合成3g/L的异丁醇(生物技术通报，2011,8,208-212)。将宿主大肠杆菌基因组的pflB，frdAB，fnr和AdhE基因敲除后，工程菌株的异丁醇产量提高到4.2g/L(生物技术通报，2012,170-175)。利用谷氨酸棒杆菌为宿主，表达来源于枯草芽孢杆菌的alsS基因，来源于谷氨酸棒杆菌的ahdA，ilvC和ilvD基因，来源于乳脂乳球菌的kivd，工程菌株28小时可以合成2.6g/L的异丁醇(ApplMicrobiol Biotechnol,2010,87:1045–1055)。利用枯草芽孢杆菌为宿主细胞，表达枯草芽孢杆菌来源的alsS基因，酿酒酵母来源的adh2基因，来源于乳脂乳球菌的kivd基因，通过其他基因改造后获得的工程菌株可以合成2.62g/L的异丁醇(Appl Microbiol Biotechnol,2011,91:577–589)。
克雷伯氏肺炎杆菌是一种重要的工业微生物，具有生长旺盛、能利用多种碳源进行生长等特点。目前克雷伯氏肺炎杆菌用于1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、2-酮基葡萄糖酸、乙偶姻等生产菌株，具有底物转化率高和产物终浓度高等优点。目前未发现关于克雷伯氏肺炎杆菌生产异丁醇的公开报道。
发明内容
本发明的目的是，提供改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其应用于提升菌株生产异丁醇的方法。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：
提升克雷伯氏肺炎杆菌生产异丁醇的方法，该方法为：失活克雷伯氏肺炎杆菌中的乙酰乳酸脱羧酶；或者失活克雷伯氏肺炎杆菌中的乙酰乳酸脱羧酶并且高水平表达吲哚-3-丙酮酸脱羧酶；或者同时失活乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶，高水平表达吲哚-3-丙酮酸脱羧酶。
本发明还提供了改造的克雷伯氏肺炎杆菌，该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙酰乳酸脱羧酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌；或者乙酰乳酸脱羧酶失活、并且吲哚-3-丙酮酸脱羧酶高水平表达的克雷伯氏肺炎杆菌；或者乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶同时失活、并且吲哚-3-丙酮酸脱羧酶高水平表达的克雷伯氏肺炎杆菌。
所述乙酰乳酸脱羧酶是指催化乙酰乳酸脱羧生成乙偶姻的酶。其在克雷伯氏肺炎杆菌342基因组中的基因阅读框如SEQ ID NO.1所示，Genebank编号为(gene ID206569613)；所述乳酸脱氢酶是指催化丙酮酸还原成乳酸的酶。其在克雷伯氏肺炎杆菌342中基因阅读框如SEQ ID NO.2所示，Genebank编号为(gene ID 206567865)。；所述吲哚-3-丙酮酸脱羧酶是指催化吲哚-3-丙酮酸脱羧成吲哚-3-乙酸的酶。其在克雷伯氏肺炎杆菌342中基因阅读框如SEQ ID NO.3所示，Genebank编号为(gene ID 008803889)。
本发明还提供了所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌在生产异丁醇中的应用。
本发明还提供了所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产异丁醇的方法，该方法为：将所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到碳源培养基中进行发酵培养，发酵过程中菌体将培养基中的碳源转化成异丁醇。
优选地，所述发酵培养基的组成包括：碳源10-200g/L，氮源1-50g/L，无机盐0-10g/L。所述碳源选自能代谢转化成丙酮酸的化合物，具体包括葡萄糖、甘油、木糖、生物质水解液、以及它们的混合物。所述氮源选自玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、豆饼粉、尿素、氨、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐。所述无机盐选自钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。
优选地，所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到碳源培养基中进行发酵培养的条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度25-45℃，发酵过程中供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在5.5-8.5之间。
进一步优选地，所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到碳源培养基中进行发酵培养的条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度30-40℃，发酵过程中微量供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在6.5-7.5之间。
优选地，所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产异丁醇的方法还包括：发酵过程中待碳源消耗至1-20g/L时流加碳源进行补料发酵。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明通过乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶失活，吲哚-3-丙酮酸脱羧酶高水平表达对克雷伯氏肺炎杆菌进行改造，改造后的克雷伯氏肺炎杆菌利用碳源进行发酵培养时，提升了该菌株将碳源转化形成异丁醇的能力，并发酵液中高水平积累异丁醇。本发明提供的方法，生产菌株基因组中未引入外源基因，菌株遗传稳定性高，产物终浓度高，原料范围广。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
实施例1
利用基因重组方法对克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366的菌株(该菌株也称为TUAC01，AC01)乙酰乳酸脱羧酶基因进行失活，来实现乙酰乳酸脱羧酶活性失活。
为CGMCC 1.6366的菌株已经在公开文献(Wei Dong,Wang Min,Shi Jiping,HaoJian.Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiellapneumoniae.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology.2012 39:1219–1226)中也已经公开该菌株。该菌株是一株用于生产1,3-丙二醇，2,3-丁二醇，乙偶姻和2-酮基葡萄糖酸的菌株。该菌分离自土壤，分离过程及性状描述见(Hao Jian,等.Isolationand characterization of microorganisms able to produce 1,3-propanediol underaerobic conditions.World Journal of Microbiology Biotechnology 2008,24:1731-1740)。
1)利用PCR扩增CGMCC 1.6366菌株乙酰乳酸脱羧酶基因序列，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行DNA序列测定。
克雷伯氏肺炎杆菌342是一株用于固氮研究的克雷伯氏肺炎杆菌，其全基因组已经测序，并且提交到了genebank。根据克雷伯氏肺炎杆菌342(Genbank:NC_011283)基因组信息，设计乙酰乳酸脱羧酶基因PCR引物，上游引物budA-s：GAAGATCAGAACATCGCCAGA(SEQID NO.4所示)，下游引物budA-a：CTCTGATGGACCTGCTTCGCCTTAT(SEQ ID NO.5所示)。
通过上述引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得乙酰乳酸脱羧酶基因及相邻片段，通过TA克隆方法连接到pMD-18T simple质粒(商业产品)上，得到的重组质粒命名为pMD18T-budA质粒。测序确定这段DNA序列如(SEQ ID NO.6所示)
2)利用步骤1克隆到的基因序列，制备两侧连有长同源臂中间连接抗性盒的DNA片段。
本步骤中的操作，采用在大肠杆菌中利用Red重组酶催化，具有短同源臂连接抗性盒的DNA片段与pMD18T-budA质粒进行同源重组，获得pMD18T-budA质粒上重组失活的budA基因，利用该质粒作为模板通过PCR扩增具有长的同源臂的DNA片段，该片段两侧连有与budA基因同源的序列，中间连接抗性盒。
本步骤操作原理和使用的质粒和菌株等材料可参见(Wei et.al.Redrecombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae Journal ofIndustrial Microbiology&Biotechnology 2012)，具体步骤如下：
a.pMD18T-budA质粒热击转化到含有pIJ790质粒的大肠杆菌DH5α-pIJ790中，命名为DH5α-pMD18T-budA。
b.设计引物budA-F-s和budA-F-a，序列分别为：
GCCCTGCTGAGCGGGGTTTACGAAGGCAGCACCACCATCATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ IDNO7所示)和TTGCGGTCATCGGTTATAAAGTGCTCGTGATACCCGGCGATGTAGGCTGGAGCTGCTTC
(SEQ ID NO.8所示)。
利用引物budA-F-s和budA-F-a，以质粒pIJ778为模板扩增出长约1.4Kb的DNA片段A。该片段的两端分别具有与budA序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ778质粒的链霉素抗性基因aadA。
c.利用DNA片段A转化感受态DH5α-pMD18T-budA感受态细胞。利用电击转化方法，转化电压为2000V，选择链霉素抗性的菌株，链霉素用量为50mg/L。
DNA片段A两侧的同源序列与质粒pMD18T-budA上的budA同源部分发生重组，获得质粒，并命名为pMD18T-ΔbudA质粒。
d.利用引物budA-s2TGCCTCAGTGCATGGCCTGGTAG(SEQ ID NO.9所示)和budA-a2TGGCCTCCAGCAAGCGGCGTAGC(SEQ ID NO.10所示)，以pMD18T-ΔbudA质粒为模板进行PCR扩增，获得2.8Kb的DNA片段B。
DNA片段B两端具有budA基因序列，该序列作为同源臂。DNA片段B中间具有链霉素抗性基因aadA，DNA片段B用于进行CGMCC1.6366染色体上budA基因重组的线性DNA片段。
3)利用转化将制备的DNA片段B转入到克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366中，DNA片段B与染色体上的乙酰乳酸脱羧酶基因相邻的序列进行同源重组，筛选获得菌株染色体乙酰乳酸脱羧酶重组失活的菌株，具体步骤如下：
将pDK6-red质粒转化到CGMCC 1.6366中，将转化有pDK6-red质粒的CGMCC 1.6366命名为CGMCC 1.6366-pDK6-red菌株，线性DNA片段B电击转化CGMCC 1.6366-pDK6-red感受态细胞。利用链霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为Kp-ΔbudA，该菌株的乙酰乳酸脱羧酶基因通过同源重组而失活。
实施例2
利用基因重组方法构建乙酰乳酸脱羧酶基因和乳酸脱氢酶基因同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌，来实现乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶活性同时失活。
1)利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌乳酸脱氢酶基因序列，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行DNA序列测定。
根据克雷伯氏肺炎杆菌342基因组信息，设计乳酸脱氢酶基因PCR引物，上游引物ldhA-s：AGAGCGCACAGGACCACTATCCA(SEQ ID NO.11所示)，下游引物ldhA-a：TCGGCGAGCTTATAGACCAGCGT(SEQ ID NO.12所示)。
通过上述引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得乳酸脱氢酶基因及相邻片段，通过TA克隆方法连接到pMD-18T simple质粒(商业产品)上，得到的重组质粒命名为pMD18T-ldhA质粒。经过序列测定，其序列如(SEQ ID NO.13所示)
2)利用步骤1克隆到的基因序列，制备两侧连有长同源臂中间连接抗性盒的DNA片段。
本步骤中的操作，采用在大肠杆菌中利用Red重组酶催化，具有短同源臂连接抗性盒的DNA片段与pMD18T-ldhA质粒进行同源重组，获得pMD18T-ldhA质粒上重组失活的ldhA基因，利用该质粒作为模板通过PCR扩增具有长的同源臂的DNA片段，该片段两侧连有与ldhA基因同源的序列，中间连接抗性盒。
具体步骤如下：
a.pMD18T-ldhA质粒热击转化到含有pIJ790质粒的大肠杆菌DH5α-pIJ790中，命名为DH5α-pMD18T-ldhA。
b.设计引物ldhA-F-s和ldhA-F-a，序列分别为：
ACCGCCAAAACCGCCCACGGTTGCGAAGCGGTATGCATATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ IDNO.14所示)和CAGCGCCTCGGCGGTGAGGAACGCCTGATGGCCGGTGAACTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQID NO.15所示)。
利用引物ldhA-F-s和ldhA-F-a，以质粒pIJ773为模板扩增出长约1.4Kb的DNA片段A2。该片段的两端分别具有与乳酸脱氢酶序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ773质粒的安普霉素抗性基因aac(3)IV。
c.利用DNA片段A2转化感受态DH5α-pMD18T-ldhA感受态细胞。利用电击转化方法，转化电压为2000V，选择安普霉素抗性的菌株，安普霉素用量为50mg/L。
DNA片段A2两侧的同源序列与质粒pMD18T-ldhA上的ldhA同源部分发生重组，获得质粒，并命名为pMD18T-ΔldhA质粒。
d.利用引物ldhA-s2CTGCTGCTGCTGGGAACATTC(SEQ ID NO.14所示)和ldhA-a(SEQID NO.11所示)，以pMD18T-ΔldhA质粒为模板进行PCR扩增，获得2.8Kb的DNA片段B2。
DNA片段B2两端具有ldhA基因序列，该序列作为同源臂。DNA片段B2中间具有安普霉素抗性基因aac(3)IV，DNA片段B用于进行CGMCC1.6366染色体上ldhA基因重组的线性DNA片段。
3)利用转化将制备的DNA片段B2转入到克雷伯氏肺炎杆菌Kp-ΔbudA中，DNA片段B2与染色体上的乳酸脱氢酶基因进行同源重组，筛选获得菌株染色体乳酸脱氢酶重组失活的菌株，具体步骤如下：
线性DNA片段B2电击转化已经含有pDK6-red质粒的Kp-ΔbudA感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为Kp-ΔbudA-ΔldhA，该菌株的乙酰乳酸合成酶基因和乳酸脱氢酶基因通过同源重组而同时失活。
实施例3
高水平表达吲哚-3-丙酮酸脱羧酶菌株的构建。
1)利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌吲哚-3-丙酮酸脱羧酶基因序列，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行DNA序列测定。
根据克雷伯氏肺炎杆菌342基因组信息，设计吲哚-3-丙酮酸脱羧酶基因PCR引物，上游引物ipdC-s：AGCTAGAATTCATGCAACCGACCTACACTATTGGGG(SEQ ID NO.16所示)，下游引物ipdC-a：AGCTAGGATCCCTAAACGCGGCTGTTTCGTTCCT(SEQ ID NO.17所示)。所含有的酶切位点分别是EcoR I(GAATTC)和BamH I(GGATCC)。
通过上述引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得吲哚-3-丙酮酸脱羧酶基因片段，该片段两端带有限制性内切酶酶切位点，通过TA克隆方法连接到pMD-18T simple质粒(商业产品)上，得到的重组质粒命名为pMD18T-ipdC质粒。经过序列测定，其序列如(SEQ ID NO.18所示)。
2)构建高水平表达吲哚-3-丙酮酸脱羧酶基因表达载体
利用限制性核酸内切酶EcoR I(GAATTC)和BamH I(GGATCC)将吲哚-3-丙酮酸脱羧酶基因片段从pMD18T-ipdC上切下来，同时，利用相同的内切酶将表达载体pDK6线性化。将ipdC片段和pDK6用连接酶连接，所得质粒命名为pDK6-ipdC。
3)将吲哚-3-丙酮酸脱羧酶表达载体pDK6-ipdC转入克雷伯氏肺炎杆菌Kp-ΔbudA和Kp-ΔbudA-ΔldhA中，具体步骤如下：
表达载体pDK6-ipdC电击转化克雷伯氏肺炎杆菌Kp-ΔbudA和Kp-Δbud-ΔldhA感受态细胞。利用卡那霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为Kp-ΔbudA/pDK6-ipdC和Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC。菌株Kp-ΔbudA/pDK6-ipdC的乙酰乳酸脱羧酶基因失活，同时高水平表达了吲哚-3-丙酮酸脱羧酶基因。菌株Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC的乙酰乳酸脱羧酶基因和乳酸脱氢酶基因同时失活，同时高水平表达了吲哚-3-丙酮酸脱羧酶基因。
实施例4
利用基因重组方法对克雷伯氏肺炎杆菌SARI 01、SARI 02菌株乙酰乳酸脱羧酶基因进行失活，来实现乙酰乳酸脱羧酶活性失活。SARI 01和SARI 02菌株为中国科学院上海高等研究院从土壤中分离到的两株克雷伯氏肺炎杆菌。分离方法与(Hao Jian,等.Isolation and characterization of microorganisms able to produce 1,3-propanediol under aerobic conditions.World Journal of MicrobiologyBiotechnology 2008,24:1731-1740)描述相同。
将pDK6-red质粒转化到SARI 01中，将转化有pDK6-red质粒的SARI 01命名为SARI01-pDK6-red菌株。实施例1中获得的线性DNA片段B电击转化SARI 01-pDK6-red感受态细胞。利用链霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为KpS1-ΔbudA，该菌株的乙酰乳酸脱羧酶基因通过同源重组而失活。
将pDK6-red质粒转化到SARI 02中，将转化有pDK6-red质粒的SARI 02命名为SARI02-pDK6-red菌株。实施例1中获得的线性DNA片段B电击转化SARI 02-pDK6-red感受态细胞。利用链霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为KpS2-ΔbudA，该菌株的乙酰乳酸脱羧酶基因通过同源重组而失活。
同样分别利用SARI 01、SARI 02替代实施例2、3中的CGMCC 1.6366及其衍生菌株，获得KpS1-ΔbudA-ΔldhA、KpS1-ΔbudA/pDK6-ipdC、KpS1-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC、KpS2-ΔbudA-ΔldhA、KpS2-ΔbudA/pDK6-ipdC、KpS2-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC菌株。
实施例5
高水平表达乙酰乳酸合成酶菌株的构建。
来自枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶在大肠杆菌中可以发挥酮酸脱羧功能(ApplEnviron Microbiol,2009,75(19):6306-6311.)。分别构建高水平表达来自克雷伯氏肺炎杆菌和枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶基因的菌株。
1)利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌乙酰乳酸合成酶基因序列，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行DNA序列测定。
根据克雷伯氏肺炎杆菌342基因组信息，设计乙酰乳酸合成酶基因PCR引物，上游引物alsS-s：GATCAGAATTCATGGACAAACAGTATCCGGTACG(SEQ ID NO.19所示)，下游引物alsS-a：GATCGGATCCTTACAGAATCTGACTCAGATGCA(SEQ ID NO.20所示)。所含有的酶切位点分别是EcoR I(GAATTC)和BamH I(GGATCC)。
根据枯草芽孢杆菌164基因组信息，设计乙酰乳酸合成酶基因PCR引物，上游引物alsS-s1：AGCTAGAGCTCTTGACAAAAGCAACAAAAGAACA(SEQ ID NO.21所示)，下游引物alsS-a1：AGCTAGGATCCCTAGAGAGCTTTCGTTTTCATGAG(SEQ ID NO.22所示)。所含有的酶切位点分别是Sac I(GAGCTC)和BamH I(GGATCC)。
以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366基因组DNA为模板，alsS-s和alsS-a为引物，经PCR扩增，获得乙酰乳酸合成酶基因片段，该片段两端带有限制性内切酶酶切位点，通过TA克隆方法连接到pMD-18T simple质粒(商业产品)上，得到的重组质粒命名为pMD18T-alsS(Kp)质粒。经过序列测定，其序列如(SEQ ID NO.23所示)。
以枯草芽孢杆菌164基因组DNA为模板，alsS-s1和alsS-a1为引物，经PCR扩增，获得乙酰乳酸合成酶基因片段，该片段两端带有限制性内切酶酶切位点，通过TA克隆方法连接到pMD-18T simple质粒(商业产品)上，得到的重组质粒命名为pMD18T-alsS(Bs)质粒。经过序列测定，其序列如(SEQ ID NO.24所示)。
2)构建乙酰乳酸合成酶基因表达载体
利用限制性核酸内切酶EcoR I(GAATTC)和BamH I(GGATCC)将乙酰乳酸合成酶基因片段从pMD18T-alsS(Kp)上酶切下来，同时，利用相同的内切酶将表达载体pDK6线性化。将alsS(Kp)片段和pDK6用连接酶连接，所得质粒命名为pDK6-alsS(Kp)。
利用限制性核酸内切酶Sac I(GAGCTC)和BamH I(GGATCC)将乙酰乳酸合成酶基因片段从pMD18T-alsS(Bs)上酶切下来，同时，利用相同的内切酶将表达载体pDK6线性化。将alsS(Bs)片段和pDK6用连接酶连接，所得质粒命名为pDK6-alsS(Bs)。
3)将乙酰乳酸合成酶表达载体pDK6-alsS(Kp)和pDK6-alsS(Bs)分别转入克雷伯氏肺炎杆菌Kp-ΔbudA-ΔldhA中，具体步骤如下：
表达载体pDK6-alsS(Kp)和pDK6-alsS(Bs)分别电击转化克雷伯氏肺炎杆菌Kp-Δbud-ΔldhA感受态细胞。利用卡那霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Kp)和Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Bs)。菌株Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Kp)的乙酰乳酸脱羧酶基因和乳酸脱氢酶基因同时失活，同时高水平表达了克雷伯菌的乙酰乳酸合成酶基因。菌株Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Bs)的乙酰乳酸脱羧酶基因和乳酸脱氢酶基因同时失活，同时高水平表达了枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶基因。
实施例6
将实施例1-5中获得的菌株进行摇瓶批次发酵实验。
将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366、SARI 01、SARI 02和实施例1-5中获得的改造的菌株接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml发酵培养基，摇瓶柜转速100转每分钟，恒温30℃进行发酵培养。Kp-ΔbudA/pDK6-ipdC、KpS1-ΔbudA/pDK6-ipdC、KpS2-ΔbudA/pDK6-ipdC、Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC、KpS1-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC、KpS2-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC、Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Kp)、Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Bs)菌株接种后在培养基中添加终浓度0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。
培养基组分为：葡萄糖10g/L，酵母膏1g/L，碳酸钙0.5g每瓶。
培养24小时，测定发酵液中组分。测定采用液相色谱法测定，利用HPX-87H色谱柱对发酵液组分进行分离，利用视差和紫外检测器检测。流动相0.05mol/L硫酸水溶液，流速0.8ml/min，柱温箱60℃。α-酮异戊酸和α-酮异戊酸盐在本发明中不做区分，都以α-酮异戊酸计。用气相色谱法测定异丁醇，利用DB-WAX色谱柱对组分进行分离，利用氢火焰检测器检测。各菌株发酵结果如表1所示。
表1，摇瓶发酵实验中各菌株的发酵数据结果
Figure BDA0001241169570000111
从表1的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366，SARI 01和SARI 02利用葡萄糖好氧发酵主要合成2,3-丁二醇，不合成α-酮异戊酸和异丁醇。乙酰乳酸脱羧酶活性消除的菌株(Kp-ΔbudA，KpS1-ΔbudA，KpS2-ΔbudA)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸和少量异丁醇。乙酰乳酸脱羧酶活性和乳酸脱氢酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA，KpS1-ΔbudA-ΔldhA KpS2-ΔbudA-ΔldhA)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸和异丁醇能力提高。乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶活性同时消除，高水平表达了克雷伯菌或枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶基因的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Kp)，Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Bs)利用葡萄糖培养合成异丁醇能力没有提高。乙酰乳酸脱羧酶活性消除，吲哚-3-丙酮酸脱羧酶高水平表达的菌株(Kp-ΔbudA/pDK6-ipdC，KpS1-ΔbudA/pDK6-ipdC，KpS2-ΔbudA/pDK6-ipdC)利用葡萄糖培养合成异丁醇能力提高。乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶活性同时消除，吲哚-3-丙酮酸脱羧酶高水平表达的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC，KpS1-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC，KpS2-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC)利用葡萄糖培养合成异丁醇能力提高。
实施例7
将实施例1-5中获得的菌株进行5L发酵罐发酵实验。
将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366、SARI 01、SARI 02和实施例1-5中获得的改造的菌株接种分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50mlα-酮异戊酸种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温30℃进行种子培养。
种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
发酵培养基组成为：甘油100g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L,硫酸铵5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.4g/L。
种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程通风量3L/分钟，搅拌转速300转/分，发酵温度25℃，利用氢氧化钠溶液使发酵液的pH值稳定在5.5，发酵48小时结束，采用实施例6方法测定发酵液中组分。Kp-ΔbudA/pDK6-ipdC、KpS1-ΔbudA/pDK6-ipdC、KpS2-ΔbudA/pDK6-ipdC、Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC、KpS1-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC、KpS2-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC、Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Kp)、Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Bs)菌株接种后在培养基中添加终浓度0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。
各菌株发酵结果如表2所示。
表2，实施例7发酵罐实验中各菌株的发酵数据结果
Figure BDA0001241169570000121
Figure BDA0001241169570000131
从表2的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366，SARI 01和SARI 02利用甘油好氧发酵不合成α-酮异戊酸和异丁醇。乙酰乳酸脱羧酶活性消除的菌株(Kp-ΔbudA，KpS1-ΔbudA，KpS2-ΔbudA)利用甘油培养合成α-酮异戊酸和少量异丁醇。乙酰乳酸脱羧酶活性和乳酸脱氢酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA，KpS1-ΔbudA-ΔldhA KpS2-ΔbudA-ΔldhA)利用甘油培养合成α-酮异戊酸和异丁醇能力提高。乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶活性同时消除，高水平表达了克雷伯菌或枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶基因的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Kp)，Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Bs)利用甘油培养合成异丁醇能力没有提高。乙酰乳酸脱羧酶活性消除，吲哚-3-丙酮酸脱羧酶高水平表达的菌株(Kp-ΔbudA/pDK6-ipdC，KpS1-ΔbudA/pDK6-ipdC，KpS2-ΔbudA/pDK6-ipdC)利用甘油培养合成异丁醇能力提高。乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶活性同时消除，吲哚-3-丙酮酸脱羧酶高水平表达的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC，KpS1-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC，KpS2-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC)利用甘油培养合成异丁醇能力提高。
实施例8
将实施例1-5中获得的菌株进行5L发酵罐发酵实验。
将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366、SARI 01、SARI 02和实施例1-5中获得的改造的菌株接种分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50mlα-酮异戊酸种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。
种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
发酵培养基组成为：葡萄糖200g/L，玉米浆50g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.4g/L。
种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程通风量2L/分钟，搅拌转速300转/分，发酵温度45℃，利用氢氧化钾溶液使发酵液的pH值稳定在8.5，发酵72小时结束，采用实施例6方法测定发酵液中组分。Kp-ΔbudA/pDK6-ipdC、KpS1-ΔbudA/pDK6-ipdC、KpS2-ΔbudA/pDK6-ipdC、Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC、KpS1-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC、KpS2-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC、Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Kp)、Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Bs)菌株接种后在培养基中添加终浓度0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。
各菌株发酵结果如表3所示。
表3，实施例8发酵罐实验中各菌株的发酵数据结果
Figure BDA0001241169570000141
Figure BDA0001241169570000151
从表3的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366，SARI 01和SARI 02利用葡萄糖发酵主要合成2,3-丁二醇，不合成α-酮异戊酸和异丁醇。乙酰乳酸脱羧酶活性消除的菌株(Kp-ΔbudA，KpS1-ΔbudA，KpS2-ΔbudA)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸和少量异丁醇。乙酰乳酸脱羧酶活性和乳酸脱氢酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA，KpS1-ΔbudA-ΔldhA KpS2-ΔbudA-ΔldhA)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸和异丁醇能力提高。乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶活性同时消除，高水平表达了克雷伯菌或枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶基因的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Kp)，Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Bs)利用葡萄糖培养合成异丁醇能力没有提高。乙酰乳酸脱羧酶活性消除，吲哚-3-丙酮酸脱羧酶高水平表达的菌株(Kp-ΔbudA/pDK6-ipdC，KpS1-ΔbudA/pDK6-ipdC，KpS2-ΔbudA/pDK6-ipdC)利用葡萄糖培养合成异丁醇能力提高。乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶活性同时消除，吲哚-3-丙酮酸脱羧酶高水平表达的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC，KpS1-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC，KpS2-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC)利用葡萄糖培养合成异丁醇能力提高。
实施例9
将实施例1-5中获得的菌株进行5L发酵罐发酵实验。
将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366、SARI 01、SARI 02和实施例1-5中获得的改造的菌株接种分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50mlα-酮异戊酸种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。
种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L，木糖30g/L玉米浆30g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.6g/L。
种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程通风量1L/分钟，搅拌转速200转/分，发酵温度30℃，利用氨水保持发酵液的pH值稳定在6.5，发酵48小时结束，采用实施例6方法测定发酵液中组分。Kp-ΔbudA/pDK6-ipdC、KpS1-ΔbudA/pDK6-ipdC、KpS2-ΔbudA/pDK6-ipdC、Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC、KpS1-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC、KpS2-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC、Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Kp)、Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Bs)菌株接种后在培养基中添加终浓度0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。
各菌株发酵结果如表4所示。
表4，实施例9发酵罐实验中各菌株的发酵数据结果
Figure BDA0001241169570000161
从表4的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366，SARI 01和SARI 02利用葡萄糖和木糖发酵培养主要合成2,3-丁二醇，不合成α-酮异戊酸和异丁醇。乙酰乳酸脱羧酶活性消除的菌株(Kp-ΔbudA，KpS1-ΔbudA，KpS2-ΔbudA)利用葡萄糖和木糖培养合成α-酮异戊酸和少量异丁醇。乙酰乳酸脱羧酶活性和乳酸脱氢酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA，KpS1-ΔbudA-ΔldhA KpS2-ΔbudA-ΔldhA)利用葡萄糖和木糖培养合成α-酮异戊酸和异丁醇能力提高。乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶活性同时消除，高水平表达了克雷伯菌或枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶基因的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Kp)，Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Bs)利用葡萄糖和木糖培养合成异丁醇能力没有提高。乙酰乳酸脱羧酶活性消除，吲哚-3-丙酮酸脱羧酶高水平表达的菌株(Kp-ΔbudA/pDK6-ipdC，KpS1-ΔbudA/pDK6-ipdC，KpS2-ΔbudA/pDK6-ipdC)利用葡萄糖和木糖培养合成异丁醇能力提高。乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶活性同时消除，吲哚-3-丙酮酸脱羧酶高水平表达的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC，KpS1-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC，KpS2-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC)利用葡萄糖和木糖培养合成异丁醇能力提高。
实施例10
将实施例1-5中获得的菌株进行5L发酵罐发酵实验。
将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366、SARI 01、SARI 02和实施例1-5中获得的改造的菌株接种分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50mlα-酮异戊酸种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。
种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L，玉米浆30g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.6g/L。
种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程通风量1L/分钟，搅拌转速200转/分，发酵温度40℃，利用氨水保持使发酵液的pH值稳定在7.5，发酵48小时结束，采用实施例6方法测定发酵液中组分。Kp-ΔbudA/pDK6-ipdC、KpS1-ΔbudA/pDK6-ipdC、KpS2-ΔbudA/pDK6-ipdC、Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC、KpS1-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC、KpS2-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC、Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Kp)、Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Bs)菌株接种后在培养基中添加终浓度0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。
各菌株发酵结果如表5所示。
表5，实施例10中各菌株的发酵数据结果
Figure BDA0001241169570000181
从表5的数据结果可以看出：野生型克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366，SARI 01和SARI 02利用葡萄糖好氧发酵主要合成2,3-丁二醇，不合成α-酮异戊酸和异丁醇。乙酰乳酸脱羧酶活性消除的菌株(Kp-ΔbudA，KpS1-ΔbudA，KpS2-ΔbudA)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸和少量异丁醇。乙酰乳酸脱羧酶活性和乳酸脱氢酶活性同时消除的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA，KpS1-ΔbudA-ΔldhA KpS2-ΔbudA-ΔldhA)利用葡萄糖培养合成α-酮异戊酸和异丁醇能力提高。乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶活性同时消除，高水平表达了克雷伯菌或枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶基因的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Kp)，Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-alsS(Bs)利用葡萄糖培养合成异丁醇能力没有提高。乙酰乳酸脱羧酶活性消除，吲哚-3-丙酮酸脱羧酶高水平表达的菌株(Kp-ΔbudA/pDK6-ipdC，KpS1-ΔbudA/pDK6-ipdC，KpS2-ΔbudA/pDK6-ipdC)利用葡萄糖培养合成异丁醇能力提高。乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶活性同时消除，吲哚-3-丙酮酸脱羧酶高水平表达的菌株(Kp-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC，KpS1-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC，KpS2-ΔbudA-ΔldhA/pDK6-ipdC)利用葡萄糖培养合成异丁醇能力提高。
实施例11
将将实施例3-4中获得的菌株进行流加发酵罐发酵实验。
将实施例3-4中获得的改造的菌株接种分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50mlα-酮异戊酸种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。
种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L，玉米浆30g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.6g/L。
培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程通风量1L/分钟，搅拌转速200转/分，发酵温度37℃，利用氢氧化钠稳定发酵液pH 7.0，待发酵液中葡萄糖浓度降低到1-20g/L时，补加50％(g/g)的葡萄糖溶液，发酵82小时结束，采用实施例6方法测定发酵液中组分。接种后在培养基中添加终浓度0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。
各菌株发酵结果如表6所示。
表6，实施例11中各菌株的发酵数据结果
Figure BDA0001241169570000191
从表6的数据可以看出：利用流加发酵，乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶活性同时失活，吲哚-3-丙酮酸脱羧酶高水平表达的菌株可以合成2.9-3.2g/L的α-酮异戊酸，12.8-13.6g/L的异丁醇。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院上海高等研究院
<120> 提升克雷伯氏肺炎杆菌生产异丁醇的方法及改造菌
<130> 2017
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 780
<212> DNA
<213> 克雷伯氏肺炎杆菌342
<400> 1
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ctggaagagc taaaggccca cggcgtgaag tatatcgctc tgcgctgcgc cggatttaac 240
aacgtcgacc tcgaggcggc aaaggagctt ggcctgcgcg tggtccgcgt cccggcgtac 300
tcgccggaag ccgtcgctga gcatgcgatc ggtatgatga tgtcgctcaa ccgtcgcatc 360
caccgcgcct atcagcgtac ccgtgatgcc aacttctccc tcgaaggcct caccggtttc 420
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ggatatgcgc gcatcaaagg ggccggtgcg ctgctgacca cctacggcgt cggcgaactg 240
agcgcgctga acggcattgc gggtagctat gcggaacata ttccggtatt gcatatcgtc 300
ggcgcgccct ctaccggcgc tcagcagcgt ggcgaactgc tgcaccatac cctcggcgat 360
ggcgattttc gccatttcgc ccgcatgagc gagcagatca cctgcagcca ggcgctgctg 420
accgccggca acgcctgcca tgagatcgac cgtgtcctgc gcgatatgct gacgcatcat 480
cggcccggct atctgatgct gccggccgat gtcgccagag cggcagcgat tgccccggcc 540
cagcgcttac tggtggagcc cgctccggcg gatgaaaacc agctcgcggg gttccgcgaa 600
catgccagcc gcctgctgcg gggcagccga cgcatttctc tgctggcgga tttcctggcg 660
caacgctatg gcctgcagaa cacgctccgg gagtgggtgg cgaaaacccc catcgctcac 720
gccaccatgc taatgggcaa ggggttgttc gatgagcagc tgaacgggtt tgtcgggacc 780
tatagcggga tcgccagcgc cccgcagacc cgggaggcga ttgaaaacgc cgacaccatc 840
atctgcattg gtacgcgctt caccgacact atcaccgcgg gattcaccca gcatctggcg 900
cgggagaaga ccattgagat ccagcccttc gccgtcaggg tgggcgacca ctggttcagc 960
ggcgtgccga tggatcaagc tctggctgca ttaatgacgc tttccgcccc gctggcggcg 1020
gagtgggcgg cgcctcaggt cgtggcgccg gaagtggaag aggagggcga aggcgagtta 1080
acccagaaga atttctggtc gacagtgcag gatgcgctgc gccccggcga tattatcctc 1140
gccgatcagg ggacggcggc gtttggcatc gcggcgctta agcttccctc tgaggcatcg 1200
ctgatcgttc agccgctgtg ggggtcgatt ggttttaccc tcccggccgc ctatggcgcg 1260
caaaccgcgg cggcagagcg gcgggtggtg ctgatcgtcg gcgatggcgc cgcccaactg 1320
acgattcagg agatgggctc tatgcttcgc gataagcaaa aaccgcttat tctgttgctg 1380
aataacgaag ggtataccgt ggagcgggcg attcatggcc ctgagcagcg ctacaatgac 1440
atcgccctgt gggactggca gcggctgccg gaagctttcg ccccggacgt tgtttctcgc 1500
tgctggcggg tcacgcacac ggctgagcta cgggaagcga tggcggaaag catcacctcc 1560
gataccctta ccctggtcga agtgatgcta ccgaaaatgg atatccccga tttcctgcgt 1620
gcggtgacgc aggcgctgga ggaacgaaac agccgcgttt ag 1662
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaagatcaga acatcgccag a 21
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctctgatgga cctgcttcgc cttat 25
<210> 6
<211> 2132
<212> DNA
<213> 克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366
<400> 6
gatcagaaca tcgccagaaa gcgtttcacc gtgcgcgagc gctcgaagcg ccgccaggcg 60
atggcgatat cggtcttcag cggtgccccg ctgagcgggt gatagctgac gttcggctgt 120
tgaatgcagg tcatcgactg cgggaccagc gcgaagccga acccggcatt gaccatgctc 180
agcgatgacg aaatctgcga cgactgccag gcgcgctcca tatcgatgcc ggcgcgcagg 240
cagctgttgt acaccagctc atacagcccc ggggccacct cccgcgggaa gaggatcggc 300
gccacgtcgc gcagctgctc cagggccagg gtcggctgcg tcgccagcgg gttatcgcgc 360
ggcagcgcga taaccatcgg ctcctcatcg ataatccgca gattaaaggc tttactgctc 420
tcgcacggca gacggacgaa ggcgatgtcc agctcggcct cgctcagggc ggtcatcaga 480
ttggccatat tgtcttccat ctggtgcagg gtcaccccgg ggtgatcgag ctgaaaacgg 540
tgcagcagcg tgaagatttg cgggtggaaa gcatcagaac tggtaatgcc tagcgacagg 600
ctgccgttca tcccgcgggc aatgcccttg gccttctcca gcgccgcatc gctcatggcg 660
aggatctggc gggcatcctc atagaacgac tcaccggcct cggtgagctc caccccgcgg 720
gtcaaacgcc gaaacagcgg ggtccccacc tcgcgctcaa gccgctgaat ttgctgactt 780
aacggaggct gtgaaatacc cagttccttg gcggcctggg tgaagtgccg cgtcctggcg 840
acggcgacaa aatagcgaag ataacgaagt tccatatcga aaacgtctca aaccagcatg 900
gtttctatat tggaactgtg agctgaatcg ggtcaacatt tatttaacct ttcttatatt 960
tgttgaacga ggaagtggta tatgaatcat tctgctgaat gcacctgcga agagagtctg 1020
tgcgaaaccc tgcgggcgtt ttccgcgcag catcccgaga gcgtgctcta tcagacatcg 1080
ctcatgagcg ccctgctgag cggggtttac gaaggcagca ccaccatcgc ggacctgctg 1140
aagcacggcg atttcggtct cggcaccttt aatgagctgg acggggagct gatcgccttc 1200
agcagtcagg tctatcagct gcgggccgac ggcagcgcgc gcaaagccca gccggatcag 1260
aaaacgccgt tcgcggtgat gacctggttc cagccgcagt accggaaaac cttcgaccat 1320
ccggtgagcc gccagcagct gcacgaggtg atcgaccagc aaatcccctc tgacaacctg 1380
ttctgcgccc tgcgcatcga cggccatttc cgccatgccc atacccgcac cgtgccgcgc 1440
cagacgccgc cgtaccgggc gatgaccgac gtcctcgacg atcagccggt gttccgcttt 1500
aaccagcgcg aaggggtgct ggtcggcttc cgtaccccac agcatatgca ggggatcaac 1560
gtcgccgggt atcacgagca ctttataacc gatgaccgca aaggcggcgg tcacctgctg 1620
gattaccagc tcgaccacgg ggtattgacc ttcggcgaaa ttcacaagct gatgatcgac 1680
ctgcccgccg acagcgcgtt cctgcaggcc aatctgcatc ccgataatct cgatgccgcc 1740
atccgttccg tagaaagtta agggggtcac atggacaaac agtatccggt acgccagtgg 1800
gcgcacggcg ccgatctcgt cgtcagccag ctggaagccc agggggtacg tcaggtgttc 1860
ggcatccctg gcgccaaaat cgacaaggta ttcgactcac tgctggattc ctccattcgc 1920
attattccgg tacgccacga agctaacgcc gcctttatgg ccgccgccgt cgggcgcatt 1980
accggtaaag cgggcgtggc gctggtcacc tccggtccgg gctgttccaa cctgatcacc 2040
ggtatggcca ccgccaacag cgaaggcgac ccggtggtgg ccctgggcgg cgcggtgaaa 2100
cgcgccgata aggccaaaca ggtccaccag ag 2132
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gccctgctga gcggggttta cgaaggcagc accaccatca ttccggggat ccgtcgacc 59
<210> 8
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ttgcggtcat cggttataaa gtgctcgtga tacccggcga tgtaggctgg agctgcttc 59
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgcctcagtg catggcctgg tag 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tggcctccag caagcggcgt agc 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
agagcgcaca ggaccactat cca 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tcggcgagct tatagaccag cgt 23
<210> 13
<211> 2163
<212> DNA
<213> 克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366
<400> 13
tcggcgagct tatagaccag cgtctggtcg gcggtcgcca gcgtcaactg gttttccgtc 60
agatcgacct gcgcgccctc gcgcagcatc ttaccaatgg tcgcgtcaag ggtattgagc 120
tgggcatcgt ggcacagcat ccgggtcatc gccagcgatt taaccttcag ctcgccgtcc 180
gacaccttac cttccccgct gaagccgttg cacatattgc ccgaaacata catattgccc 240
gtaagagtcg tcttctcgcc gaagctcagc tccagcggcc ggtcgcccgc gttcaccgcc 300
tggccgttga cgctggtcaa cacgaaacga tgatgctgta gctgttccgc gccggtggac 360
accttactgt tatagacaca gccggacagc agcaaccctg ccgccagtaa tgccgcaaat 420
ttgttcattt ttactccaaa acattcacat tactaataaa acaaagccag tgtaacggta 480
tcgcagcggg gatctgtggg gattatctga atgtgctccc ccggggagag gagcacaaaa 540
gggaaaggaa tcagacgata gcgttcgggc aggtttcacc gttggcgacc tgctgcagat 600
tgcccagggt ggtctccgaa atgctgatca gcgcctcggc ggtgaggaac gcctgatggc 660
cggtgaacag cacgttgtgg caggcggaga ggcgacggaa gacgtcgtcc tggatcacgt 720
cgttagattt gtcttcgaag aacagatcgc gttcgttctc ataaacgtcc agccccagcg 780
cgccgatttt ctggtgcttc agggcatcga tggccgcctg ggaatcgatc agcgcgccgc 840
ggctggtgtt aatcaccatc accccgtcct tcatctgatc gaaggcctcg cgattgagca 900
gatggtagtt ttcgtcggtg agcgggcagt gcagggagat cacgtccgac tccttgtaca 960
gcgtggccag gtcaacatat tccaccccca gctccagcgc ggcggcgctt gggtacgggt 1020
caaaagccag cagacgcatg ccgaagcctt taaggatccg tagcatcgcc acgccaattt 1080
tcccggtgcc gatcaccccg gcggttttgc cgtacatggt gaaaccggtg aggccttcga 1140
gggagaaatt ggcatcacgg gtacgctggt aggcgcggtg gatgcggcgg ttaagcgaca 1200
tcatcatgcc gatcgcatgt tcagcgaccg cttccggcga gtaggccggg acgcgcacga 1260
cgcgcaggcc aagcgctttc gccgcctcga ggtcgacgtt gttaaacccg gcgcagcgca 1320
gggcgatata cttcacgccg tgggccttca gctcctccag caccggacgg ctgccgtcgt 1380
cattgacgaa gatgcatacc gcttcgcaac cgtgggcggt tttggcggtt ttctctgtca 1440
gcaggaagtc gaagaattcc agttcaaagc cgtaagtatc attaacgtgc tgcaggtact 1500
ttttatcgta ctgcttcgta ctgtaaaccg cgattttcat aagacttttc tccagtgatt 1560
ataacgtcac ggtagcatat ttaaaataat cgtacaatta ttaaaaaata gtttaaatag 1620
caggtgctta tcctaattct agagcatatc gcggatttgc ggaatctctt tgaaagacaa 1680
agttttttca ccacaaactc aggcttaaag cgccggggga gagcagcaga aacggccaca 1740
gcagaccgga ggtgacgtta gccagctgaa acgaccacag cggcaggccg ctggcgccgc 1800
tgaccagggg cagggtggcg cgcaggggag agaggaagcg actgaaaaag accgcccaca 1860
gcccgcggcg ctgaaaaaag agtcgactgc gggccagccg ctcggcggtc agccagcgca 1920
actgcgtgag gcggtgacga tagcgaacgc ctaaccacca cgagagccag aatccgccga 1980
tggcgccgag gctggcgctg gaccacatta acaggaaatg acccaggctg gcggacgcga 2040
atgtccccag cagcagcagg ccggaggtgc ccgggatcgc cagcgacacc agcgcgcagg 2100
atttagtgaa agtgagcagg aaaaccatca gtaataccaa tggatagtgg ccctgtgcgc 2160
tct 2163
<210> 14
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
accgccaaaa ccgcccacgg ttgcgaagcg gtatgcatat tccggggatc cgtcgacc 58
<210> 15
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cagcgcctcg gcggtgagga acgcctgatg gccggtgaac tgtaggctgg agctgcttc 59
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
agctagaatt catgcaaccg acctacacta ttgggg 36
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
agctaggatc cctaaacgcg gctgtttcgt tcct 34
<210> 18
<211> 1674
<212> DNA
<213> 克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366
<400> 18
gaattcatgc aaccgaccta cactattggg gattatctgc tggatcgcct cgtcgactgc 60
ggtattgacc gcttgttcgg cgtgccggga gattacaact tacagtttct cgaccgggtc 120
attgcgcaca gcgcgttggg gtgggtcggc tgcgccaacg agctcaatgc ggcctatgct 180
gctgacggtt atgcacgcat taagggagcc ggtgcgttac ttacaaccta cggcgtcggc 240
gaactgagcg ccctgaacgg cgtggcgggc agctatgcgg agcatattcc ggtattacat 300
atcgtcggcg cgccctccac tggcgctcag cagcgcggcg aactgctgca tcacaccctg 360
ggcgacggcg atttccgcca ttttgcgcgg atgagcgagc agatcacctg tagccaggcg 420
ctgctgaccg ccggcaacgc ctgccatgag atcgaccgtg ttctgcgcga tatgctgacg 480
catcatcggc ctggctatct gatgctgccg gccgatgtcg ccagagcggc agcgattgcc 540
ccagcgcagc gcttgctggt ggaggccgct ccggcggatg aaaaccagct cgccggattc 600
tgcgagcatg ccagccgcct gctgcggggc agtcgacgca tctccctgct ggcggacttc 660
ctcgcgcaac gctatggcct gcaaaacacg ctccgggagt gggtggcgaa aacccccgtc 720
gcccacgcca ccatgctaat gggcaagggg ctgttcgatg agcagcagag aggttttgtc 780
ggcacctaca gcggtatcgc cagcgcgccg cagacccggg aggccatcga aaacgccgac 840
accatcatct gcatcggcac gcgcttcacc gacaccatca ccgcgggatt cacccagcat 900
ctggcgcggg ataagacgat agagatccag cccttcgcgg tcagggtggg cgatcactgg 960
ttcagcggcg tgccgatgga tcaggcactg gctgcgctga tgaccctttc cgcaccgctg 1020
gcggcggagt gggctgcgcc tcaggtcgtg gcgccggaag tggaggaggg ggccgacggc 1080
gaactcacgc agaaaaattt ctgggcgacg gtgcaggggg cgctgcgtcc cggcgatatt 1140
attctcgccg accaggggac ggccgccttc ggcattgccg cgctgaagct gccgtcagag 1200
gcgtcgctga tcgtccagcc gctgtggggc tcgattggtt ttaccctccc ggccgcctat 1260
ggcgcgcaaa ccgcggcggc agagcggcgg gtggtgctga tcgtcggcga tggcgccgcc 1320
cagctgacga ttcaggagat gggctctatg ctgcgcgata agcaaaagcc gcttattctg 1380
ctgctgaata acgaagggta taccgtggaa cgggcgattc acggcccgga gcagcgctac 1440
aatgacattg ccctgtggga ctggcgacgc ctgccggaag ccttcgcccc ggacgttgcc 1500
tcgcgctgct ggcgggttac gcacaccgat gagctacggg aggcgatggc ggagagcatc 1560
acctccgata tgctcaccct ggtggaagtg atgctgccga aaatggatat ccccgatttc 1620
ctgcgcgcgg tgacgcaggc gctggaggaa cgaaacagcc gcgtttaggg atcc 1674
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gatcagaatt catggacaaa cagtatccgg tacg 34
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gatcggatcc ttacagaatc tgactcagat gca 33
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
agctagagct cttgacaaaa gcaacaaaag aaca 34
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
agctaggatc cctagagagc tttcgttttc atgag 35
<210> 23
<211> 1692
<212> DNA
<213> 克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366
<400> 23
gaattcatgg acaaacagta tccggtacgc cagtgggcgc acggcgccga tctcgtcgtc 60
agccagctgg aagcccaggg ggtacgtcag gtgttcggca tccctggcgc caaaatcgac 120
aaggtattcg actcactgct ggattcctcc attcgcatta ttccggtacg ccacgaagct 180
aacgccgcct ttatggccgc cgccgtcggg cgcattaccg gtaaagcggg cgtggcgctg 240
gtcacctccg gtccgggctg ttccaacctg atcaccggta tggccaccgc caacagcgaa 300
ggcgacccgg tggtggccct gggcggcgcg gtgaaacgcg ccgataaggc caaacaggtc 360
caccagagta tggatacggt ggcgatgttc agcccggtga cgaaatacgc cgtcgaggtg 420
accgcgccgg acgcgctggc ggaagtggtc tccaacgcct tccgcgccgc cgagcagggc 480
cggccgggca gcgctttcgt cagcctgccg caggatgtgg tcgatggccc ggtcagcggc 540
aaagtgctgc cggccagcgg ggccccgcag atgggcgccg cgccggatgc cgccatcgac 600
caggtggcga agcttatcgc tcaggcgaag aacccgatct tcctgctcgg cctgatggcc 660
agccagccgg aaaacagcgc ggcgctacgc cgcttgctgg aggccagcca tattccggtc 720
accagcacct atcaggccgc cggggcggtg aatcaggata acttctctcg cttcgccggc 780
cgggtcgggc tgtttaacaa ccaggccggg gaccgtctgc tgcagctcgc cgacctggtg 840
atctgcatcg gctacagccc ggtggaatat gaaccggcga tgtggaacag cggcaacgcg 900
acgctggtgc atatcgacgt cctgcccgcc tatgaagaac gcaactatac cccggacgtc 960
gagctggtgg gcgatatcgc cggcaccctc agcaagctgg cgcaaaatat cgatcgccgg 1020
ctggtgctct ccccgcaggc ggcggagatc ctccgcgacc gccagcacca gcgcgagctg 1080
ctggaccgcc gcggcgcgca gctgaatcag tttgccctgc atccgctgcg tatcgttcgc 1140
gcgatgcagg atatcgtcaa cagcgacgtc acgctgaccg tggacatggg cagcttccat 1200
atctggatcg cccgctacct ttacagcttc cgcgcccgtc aggtgatgat ctccaacggc 1260
cagcagacca tgggcgtcgc cctgccctgg gccatcggcg cctggctggt caatcctgag 1320
cgcaaagtgg tctccgtctc cggcgacggc ggtttcctgc agtcgagcat ggaactggag 1380
accgccgtcc gcctgaaagc caacgtgctg cacctgatct gggtcgataa cggttacaac 1440
atggtggcca tccaggaaga gaaaaaatat cagcgcctgt ccggcgtcga gttcgggccg 1500
atggatttta aagcctatgc cgagtccttc ggcgccaaag ggtttgccgt ggaaagcgct 1560
gaggcgctgg agccgaccct gcgcgcggcg atggacgtcg acggcccggc ggtagtggcc 1620
atcccggtgg attatcgcga taacccgctg ctgatgggtc agctgcatct gagtcagatt 1680
ctgtaaggat cc 1692
<210> 24
<211> 1725
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌164
<400> 24
gagctcctag agagctttcg ttttcatgag ttccccgaat tctttcggaa gcttgtcact 60
tgctaaatta atgttatcac tgtagtcaac cgggacatcg atgatgacag gaccttcagc 120
gttcatgcct tgacgcagaa catctgccag ctggtctggt gattctacgc gcaagccagt 180
tgctccgaag ctttccgcat atttcacgat atcgatattt ccgaaatcga ccgcagatgt 240
acggttatat tttttcaatt gctggaatgc aaccatgtca tatgtgctgt cgttccatac 300
aatgtgtaca attggtgctt ttagtcgaac tgctgtctct aattccattg ctgagaataa 360
gaaaccgccg tcaccagaga cagaaaccac tttttctccc ggtttcacca atgaagcgcc 420
gattgcccaa ggaagcgcaa cgccgagtgt ttgcataccg ttactgatca ttaatgttaa 480
cggctcgtag ctgcggaaat aacgtgacat ccaaatggcg tgcgaaccga tatcgcaagt 540
tactgtaaca tgatcatcga ctgcattacg caactcttta acgatttcaa gagggtgcgc 600
tctgtctgat ttccaatctg caggcacctg ctcaccttca tgcatatatt gttttaaatc 660
agaaaggatt ttctgctcac gctctgcaaa ttccactttc acagcatcgt gttcgatatg 720
attgatcgtg gacggaatgt caccgatcaa ttcaagatca ggctggtaag catgatcaat 780
gtcagcgata atctcgtcta aatggataat tgtccggtct ccattgatat tccagaattt 840
cggatcatat tcaatcgggt catagccgat cgtcagaaca acatctgcct gctctagcag 900
taaatcgcca ggctggttgc ggaacaaacc gatacggcca aaatattgat cctctaaatc 960
tctagaaagg gtaccggcag cttgatatgt ttcaacaaat ggaagctgaa cctttttcaa 1020
aagcttgcga accgctttaa ttgcttccgg tcttccgcct ttcatgccga ccaaaacgac 1080
aggaagtttt gctgtttgga tttttgctat ggccgcactg attgcatcat ctgctgcagg 1140
accgagtttt ggcgctgcaa cagcacgcac gtttttcgta tttgtgactt cattcacaac 1200
atcttgcgga aagctcacaa aagcggcccc agcctgccct gctgacgcta tcctaaatgc 1260
atttgtaaca gcttccggta tattttttac atcttgaact tctacactgt attttgtaat 1320
cggctggaat agcgccgcat tatccaaaga ttgatgtgtc cgttttaaac gatctgcacg 1380
gatcacgttt ccagcaagcg caacgacagg gtctccttca gtgttcgctg tcagcaggcc 1440
tgttgccaag ttagaggcac ccggtcctga tgtgactaac acgactcccg gttttccagt 1500
taaacggccg actgcttggg ccatgaatgc tgcgttttgt tcgtgccggg caacgataat 1560
ttcaggtcct ttatcttgta aagcgtcaaa taccgcatca atttttgcac ctggaatgcc 1620
aaatacatgt gtgacacctt gctccactaa gcaatcaaca acaagctccg cccctctgtt 1680
tttcacaagg gatttttgtt cttttgttgc ttttgtcaag gatcc 1725

Claims (8)

1.提升克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)生产异丁醇的方法，该方法为：失活催化乙酰乳酸脱羧反应的乙酰乳酸脱羧酶并且高水平表达催化吲哚-3-丙酮酸脱羧反应的吲哚-3-丙酮酸脱羧酶；或者同时失活催化乙酰乳酸脱羧反应的乙酰乳酸脱羧酶和催化丙酮酸合成乳酸反应的乳酸脱氢酶，高水平表达催化吲哚-3-丙酮酸脱羧反应的吲哚-3-丙酮酸脱羧酶。
2.改造的克雷伯氏肺炎杆菌，其特征在于：所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌为催化乙酰乳酸脱羧反应的乙酰乳酸脱羧酶失活、并且催化吲哚-3-丙酮酸脱羧反应的吲哚-3-丙酮酸脱羧酶高水平表达的克雷伯氏肺炎杆菌；或者催化乙酰乳酸脱羧反应的乙酰乳酸脱羧酶和催化丙酮酸合成乳酸反应的乳酸脱氢酶同时失活、并且催化吲哚-3-丙酮酸脱羧反应的吲哚-3-丙酮酸脱羧酶高水平表达的克雷伯氏肺炎杆菌。
3.权利要求2所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产异丁醇的方法，该方法为：将所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到碳源培养基中进行发酵培养，发酵过程中菌体将培养基中的碳源转化成异丁醇。
4.如权利要求3所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产异丁醇的方法，其特征在于：所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌发酵培养的条件为：发酵温度为25-45℃，发酵过程中供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在5.5-8.5之间，培养菌体。
5.如权利要求3所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产异丁醇的方法，其特征在于：所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌发酵培养的条件为：发酵温度为30-40℃，发酵过程中微量供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在6.5-7.5之间。
6.如权利要求3所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产异丁醇的方法，其特征在于：发酵过程中待碳源消耗至1-20g/L时流加碳源进行补料发酵。
7.如权利要求3所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产异丁醇的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成包括：碳源10-200g/L，氮源1-50g/L，无机盐0-10g/L；所述碳源选自葡萄糖、甘油、木糖、生物质水解液中的一种或多种；所述氮源选自玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、豆饼粉、尿素、氨、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐；所述无机盐选自钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。
8.权利要求2所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌在生产异丁醇中的应用。
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