JP6609274B2 - 組換え微生物細胞における奇数鎖脂肪酸誘導体の生成 - Google Patents

組換え微生物細胞における奇数鎖脂肪酸誘導体の生成 Download PDF

Info

Publication number
JP6609274B2
JP6609274B2 JP2017011738A JP2017011738A JP6609274B2 JP 6609274 B2 JP6609274 B2 JP 6609274B2 JP 2017011738 A JP2017011738 A JP 2017011738A JP 2017011738 A JP2017011738 A JP 2017011738A JP 6609274 B2 JP6609274 B2 JP 6609274B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polypeptide
activity
fatty acid
coa
recombinant microbial
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2017011738A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2017131219A (ja
Inventor
グレイス・ジェイ・リー
ジョン・アール・ハリバートン
フ・ジーハオ
アンドレアス・ヴェー・シルマー
Original Assignee
アールイージー ライフ サイエンシズ リミテッド ライアビリティ カンパニー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US13/232,927 external-priority patent/US8372610B2/en
Application filed by アールイージー ライフ サイエンシズ リミテッド ライアビリティ カンパニー filed Critical アールイージー ライフ サイエンシズ リミテッド ライアビリティ カンパニー
Publication of JP2017131219A publication Critical patent/JP2017131219A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6609274B2 publication Critical patent/JP6609274B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1018—Carboxy- and carbamoyl transferases (2.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01003—Homoserine dehydrogenase (1.1.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01085—3-Isopropylmalate dehydrogenase (1.1.1.85)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/03—Carboxy- and carbamoyltransferases (2.1.3)
    • C12Y201/03001—Methylmalonyl-CoA carboxytransferase (2.1.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01041—Beta-ketoacyl-acyl-carrier-protein synthase I (2.3.1.41)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
    • C12Y207/02004—Aspartate kinase (2.7.2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01005—Lysophospholipase (3.1.1.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01067—Fatty-acyl-ethyl-ester synthase (3.1.1.67)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/02—Thioester hydrolases (3.1.2)
    • C12Y301/02001—Acetyl-CoA hydrolase (3.1.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/02—Thioester hydrolases (3.1.2)
    • C12Y301/02014—Oleoyl-[acyl-carrier-protein] hydrolase (3.1.2.14), i.e. ACP-thioesterase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01041—Methylmalonyl-CoA decarboxylase (4.1.1.41)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/03—Oxo-acid-lyases (4.1.3)
    • C12Y401/03022—Citramalate lyase (4.1.3.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/03—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
    • C12Y402/03001—Threonine synthase (4.2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y403/00—Carbon-nitrogen lyases (4.3)
    • C12Y403/01—Ammonia-lyases (4.3.1)
    • C12Y403/01019—Threonine ammonia-lyase (4.3.1.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y504/00—Intramolecular transferases (5.4)
    • C12Y504/99—Intramolecular transferases (5.4) transferring other groups (5.4.99)
    • C12Y504/99002—Methylmalonyl-CoA mutase (5.4.99.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
    • C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)

Description

関連出願の相互参照
本出願は、特にその全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１１年９月１４日出願の米国特許出願第１３／２３２，９２７号および２０１０年９月１５日出願の米国特許仮出願第６１／３８３，０８６号の一部継続出願であり、それらの優先権利益を主張する。
電子提出資料の参照による組み込み
本出願は、ＥＦＳ−ＷｅｂによってＡＳＣＩＩ形式で提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１２年３月７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーはＬＳ００３３ＰＣ．ｔｘｔと称し、３５０，７７６バイトの大きさである。
原油は、広範な炭化水素を含有する非常に複雑な混合物である。原油は、精油所において様々な化学的プロセスを経て多種多様な燃料および化学物質に変換される。原油は、輸送燃料の供給源ならびに石油化学製品を製造する原料の供給源である。石油化学製品は、プラスチック、樹脂、繊維、エラストマー、医薬品、潤滑剤およびゲルなどの専門的な化学物質を作製するために使用される。
最も重要な輸送燃料、すなわち、ガソリン、ディーゼルおよびジェット燃料は、最適なエンジン性能に合わせて調製された独特の炭化水素の様々な混合物を含有する。例えば、ガソリンは、一般的に炭素原子が約４個から１２個の範囲の直鎖、分枝鎖および芳香族炭化水素を含み、一方ディーゼルは主に、炭素原子が約９個から２３個の範囲の直鎖炭化水素を含む。ディーゼル燃料の品質は、セタン価、動粘度、酸化的安定性および曇り点などのパラメータによって評価される（Ｋｎｏｔｈｅ Ｇ．，Ｆｕｅｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．８６：１０５９−１０７０（２００５）（非特許文献１））。これらのパラメータは、とりわけ炭化水素鎖の長さならびに炭化水素の枝分かれの程度または飽和度に影響を受ける。
微生物が生成する脂肪酸誘導体は、遺伝子操作によって特別に調製することができる。代謝操作によって、微生物株は、例えば、燃料基準または他の商業的に関連した製品規格に合致するか、または上回るように最適化させることができる脂肪酸誘導体の様々な混合物を生成することが可能である。微生物種は、通常石油から得られる化学物質または前駆体分子を生成するように操作することができる。場合によっては、暫定的に効率よく適合させるか、または代用するために、既存の製品の製品プロファイル、例えば、既存の石油由来の燃料もしくは化学製品の製品プロファイルを模倣することが望ましい。本明細書で記載した組換え細胞および方法は、例えば、炭化水素をベースにした燃料および化学物質の構造および機能を正確に制御する手段として、奇数：偶数の長さの鎖の比が様々な脂肪酸誘導体の微生物による生成を実証する。
探索、抽出、長距離輸送または十分な精製を必要とせず、石油の加工に付随する環境被害問題を回避できる対費用効果の高い石油製品代替物が必要とされている。同様の理由で、通常石油から得られる化学物質の代替源が必要とされている。再生可能エネルギー源からの高品質のバイオ燃料、燃料代替物および化学物質の効率的で対費用効果の高い生成方法も必要とされている。
所望する鎖長（例えば、奇数の炭素を有する鎖）を有する脂肪酸前駆体分子およびそれらから作製された脂肪酸誘導体を生成するように操作された組換え微生物細胞、これらの組換え微生物細胞を使用して所望するアシル鎖長および所望する奇数：偶数の長さの鎖の比を有する脂肪酸誘導体を含む組成物を生成する方法ならびにこれらの方法によって生成される組成物が、これらの必要性を解決する。
本発明は、奇数鎖長脂肪酸誘導体を生成する新規の組換え微生物細胞およびこのような新規の組換え微生物細胞を含む細胞培養物を提供する。本発明はまた、本発明の組換え微生物細胞の培養を含む奇数鎖長脂肪酸誘導体を含む組成物の作製方法、このような方法によって作製された組成物およびさらなる調査によって明らかとなった他の特性（ｆｅａｔｕｒｅ）を提供する。
第１の態様では、本発明は、プロピオニル−ＣｏＡの生成を増加させるために有効な酵素活性を欠如しているか、または量が低下している親微生物細胞におけるプロピオニル−ＣｏＡの生成に対して、細胞においてプロピオニル−ＣｏＡの生成を増加させるために有効な前記酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え微生物細胞であって、細胞を炭素源の存在下で、ポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で培養したとき、奇数鎖脂肪酸誘導体を含む脂肪酸誘導体組成物を生成する組換え微生物細胞を提供する。組換え微生物細胞は、（ａ）増加した量のプロピオニル−ＣｏＡを生成するために有効な酵素活性を欠如しているか、または量が低下している親微生物細胞において生成するプロピオニル−ＣｏＡの量に対して、組換え微生物細胞において増加した量のプロピオニル−ＣｏＡを生成するために有効な前記酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、ポリペプチドが組換え微生物細胞にとって外来性であるか、またはポリヌクレオチドの発現が親微生物細胞におけるポリヌクレオチドの発現と比較して組換え微生物細胞においてモジュレートされているポリヌクレオチド、（ｂ）基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素（「ＦａｂＨ」）活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび（ｃ）脂肪酸誘導体酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、組換え微生物細胞は、炭素源の存在下で、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）によるポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で培養したとき、奇数鎖脂肪酸誘導体を含む脂肪酸誘導体組成物を生成する。いくつかの実施形態では、（ａ）による少なくとも１種のポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドの外来性プロモーターへの操作可能な連結などによるポリヌクレオチドの過剰発現によってモジュレートされている。
いくつかの実施形態では、第１の態様の微生物細胞によって生成される組成物における脂肪酸誘導体の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が奇数鎖脂肪酸誘導体である。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞は、炭素源を含有する培養培地中で、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）によるポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で培養したとき、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０００ｍｇ／Ｌまたは少なくとも１００００ｍｇ／Ｌの奇数鎖脂肪酸誘導体を生成する。
いくつかの実施形態では、（ａ）による組換え微生物細胞において増加した量のプロピオニル−ＣｏＡを生成するために有効な酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、（ｉ）アスパルトキナーゼ活性、ホモセリン脱水素酵素活性、ホモセリンキナーゼ活性、スレオニン合成酵素活性またはスレオニンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１種または複数のポリヌクレオチド、（ｉｉ）（Ｒ）−シトラマル酸合成酵素活性、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性またはベータ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードする１種または複数のポリヌクレオチドおよび（ｉｉｉ）メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性、メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシルトランスフェラーゼ活性またはメチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１種または複数のポリヌクレオチドから選択される。いくつかの実施形態では、微生物細胞は、（ｉ）による１種または複数のポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）による１種または複数のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、微生物細胞は、（ｉ）および／または（ｉｉ）による１種または複数のポリヌクレオチドおよび（ｉｉｉ）による１種または複数のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドは組換え微生物細胞にとって外来性である。さらに特定の実施形態では、組換え微生物細胞にとって内在性のβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドの発現は減衰している。
脂肪酸誘導体酵素活性は、内在性（「天然」）であっても外来性であってもよい。いくつかの実施形態では、脂肪酸誘導体酵素活性にはチオエステラーゼ活性が含まれ、組換え微生物細胞によって生成される脂肪酸誘導体組成物には奇数鎖脂肪酸および偶数鎖脂肪酸が含まれる。いくつかの実施形態では、組成物における脂肪酸の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が奇数鎖脂肪酸である。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞は、炭素源を含有する培養培地中で、ポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で培養したとき、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０００ｍｇ／Ｌまたは少なくとも１００００ｍｇ／Ｌの奇数鎖脂肪酸を生成する。
第１の態様のいくつかの実施形態では、脂肪酸誘導体酵素活性にはエステル合成酵素活性が含まれ、組換え微生物によって生成される脂肪酸誘導体組成物には奇数鎖脂肪エステルおよび偶数鎖脂肪エステルが含まれる。いくつかの実施形態では、組成物における脂肪エステルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が奇数鎖脂肪エステルである。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞は、炭素源を含有する培養培地中で、ポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で培養したとき、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０００ｍｇ／Ｌまたは少なくとも１００００ｍｇ／Ｌの奇数鎖脂肪エステルを生成する。
第１の態様のいくつかの実施形態では、脂肪酸誘導体酵素活性には脂肪アルデヒド生合成活性が含まれ、組換え微生物細胞によって生成される脂肪酸誘導体組成物には奇数鎖脂肪アルデヒドおよび偶数鎖脂肪アルデヒドが含まれる。いくつかの実施形態では、組成物における脂肪アルデヒドの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が奇数鎖脂肪アルデヒドである。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞は、炭素源を含有する培養培地中で、ポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で培養したとき、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０００ｍｇ／Ｌまたは少なくとも１００００ｍｇ／Ｌの奇数鎖脂肪アルデヒドを生成する。
第１の態様のいくつかの実施形態では、脂肪酸誘導体酵素活性には脂肪アルコール生合成活性が含まれ、組換え微生物細胞によって生成される脂肪酸誘導体組成物には奇数鎖脂肪アルコールおよび偶数鎖脂肪アルコールが含まれる。いくつかの実施形態では、組成物における脂肪アルコールの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が奇数鎖脂肪アルコールである。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞は、炭素源を含有する培養培地中で、ポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で培養したとき、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０００ｍｇ／Ｌまたは少なくとも１００００ｍｇ／Ｌの奇数鎖脂肪アルコールを生成する。
第１の態様のいくつかの実施形態では、脂肪酸誘導体酵素活性には炭化水素生合成活性が含まれ、組換え微生物細胞によって生成される脂肪酸誘導体組成物は、アルカン組成物、アルケン組成物、末端オレフィン組成物、内部オレフィン組成物またはケトン組成物などの炭化水素組成物であり、この炭化水素組成物には奇数鎖炭化水素および偶数鎖炭化水素が含まれる。いくつかの実施形態では、組成物における炭化水素の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が偶数鎖炭化水素である。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞は、炭素源を含有する培養培地中で、ポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で培養したとき、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０００ｍｇ／Ｌまたは少なくとも１００００ｍｇ／Ｌの偶数鎖炭化水素を生成する。
様々な実施形態では、炭素源には、糖などの炭水化物、例えば、単糖、二糖、オリゴ糖または多糖が含まれる。いくつかの実施形態では、炭素源はセルロース加水分解物などのバイオマスから得られる。
様々な実施形態では、親（例えば、宿主）微生物細胞は、糸状菌、藻類、酵母または細菌などの原核細胞である。様々な好ましい実施形態では、宿主細胞は細菌細胞である。より好ましい実施形態では、宿主細胞はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞である。
偶数鎖脂肪酸誘導体および奇数鎖脂肪酸誘導体を作製するための経路の例をそれぞれ図１Ａおよび１Ｂに示す。図２および３は、奇数鎖脂肪酸誘導体生成を増加させるためにプロピオニル−ＣｏＡを通る代謝流を対象とした様々なアプローチの全体像であり、図２は、中間体α−ケト酪酸を通る経路の例を示しており、図３は中間体メチルマロニル−ＣｏＡを通る経路の例を示している。
一実施形態では、第１の態様による組換え微生物細胞は、基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性、好ましくはＥＣ２．３．１．１８０として分類されるβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドはｆａｂＨ遺伝子によってコードされる。一実施形態では、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドは、親微生物細胞にとって内在性である。別の実施形態では、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドは、親微生物細胞にとって外来性である。別の実施形態では、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現は、組換え微生物細胞においてモジュレートされている。場合によっては、ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドが組換え微生物細胞において過剰発現するように、ポリヌクレオチドを外来性プロモーターに操作可能に連結することによってモジュレートされる。別の実施形態では、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドは、基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用し、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）において、好ましくはインビボにおいて、奇数鎖アシル−ＡＣＰを形成するためにプロピオニル−ＣｏＡとマロニル−ＡＣＰの縮合を触媒するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有する、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４６、１４７、１４８もしくは１４９から選択される配列またはそれらの変異体または断片を含む。別の実施形態では、基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドは、配列番号１４〜１９から選択される１種または複数の配列モチーフを含み、インビトロまたはインビボにおいて、好ましくはインビボにおいて、奇数鎖アシル−ＡＣＰを形成するためにプロピオニル−ＣｏＡとマロニル−ＡＣＰの縮合を触媒する。
一実施形態では、第１の態様による組換え微生物細胞は、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、内在性ｆａｂＨ遺伝子）を含むが、組換え微生物細胞におけるこのような内在性ポリヌクレオチド配列の発現は減衰している。いくつかの実施形態では、内在性ポリヌクレオチドの発現は、組換え微生物細胞における内在性ポリヌクレオチドの配列の全てまたは一部の欠失によって減衰している。減衰した内在性β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素遺伝子を含むこのような組換え微生物細胞はさらに、基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有する外来性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むことが好ましい。
一実施形態では、第１の態様による組換え微生物細胞は、ＥＣ２．７．２．４として分類されるアスパルトキナーゼ活性（図２、経路（Ａ））を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドは、ｔｈｒＡ、ｄａｐＧまたはｈｏｍ３遺伝子によってコードされる。一実施形態では、アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドは親微生物細胞にとって内在性であるか、または親微生物細胞にとって外来性である。別の実施形態では、アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現は、組換え微生物細胞においてモジュレートされている。場合によっては、ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドが組換え微生物細胞において過剰発現するように、ポリヌクレオチドを外来性プロモーターに操作可能に連結することによって調節される。別の実施形態では、アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドは、アスパルトキナーゼ活性を有し、インビトロまたはインビボにおいて、好ましくはインビボにおいて、アスパラギン酸からアスパルチルリン酸への変換を触媒する、配列番号２０、２１、２２、２３、２４から選択される配列またはそれらの変異体または断片を含む。
一実施形態では、第１の態様による組換え微生物細胞は、ＥＣ１．１．１．３として分類されるホモセリン脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ホモセリン脱水素酵素活性を有するポリペプチドは、ｔｈｒＡ、ｈｏｍまたはｈｏｍ６遺伝子によってコードされる。一実施形態では、ホモセリン脱水素酵素活性を有するポリペプチドは親微生物細胞にとって内在性であるか、または親微生物細胞にとって外来性である。別の実施形態では、ホモセリン脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現は、組換え微生物細胞において調節されている。場合によっては、ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドが組換え微生物細胞において過剰発現するように、ポリヌクレオチドを外来性プロモーターに操作可能に連結することによってモジュレートされる。別の実施形態では、ホモセリン脱水素酵素活性を有するポリペプチドは、ホモセリン脱水素酵素活性を有し、インビトロまたはインビボにおいて、好ましくはインビボにおいて、アスパラギン酸セミアルデヒドからホモセリンへの変換を触媒する、配列番号２０、２１、２５、２６、２７から選択される配列またはそれらの変異体または断片を含む。
特定の実施形態では、第１の態様による組換え微生物細胞は、アスパルトキナーゼおよびホモセリン脱水素酵素活性の両方を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、アスパルトキナーゼおよびホモセリン脱水素酵素活性を有するポリペプチドは親微生物細胞にとって内在性であるか、または親微生物細胞にとって外来性である。別の実施形態では、アスパルトキナーゼおよびホモセリン脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現は、組換え微生物細胞においてモジュレートされている。場合によっては、ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドが組換え微生物細胞において過剰発現するように、ポリヌクレオチドを外来性プロモーターに操作可能に連結することによってモジュレートされる。一実施形態では、アスパルトキナーゼおよびホモセリン脱水素酵素活性を有するポリペプチドは、インビトロまたはインビボにおいて、好ましくはインビボにおいて、アスパラギン酸からアスパラチルリン酸への変換およびアスパラギン酸セミアルデヒドからホモセリンへの変換を触媒する、配列番号２０または配列番号２１などのそれらの変異体または断片を含む。
一実施形態では、第１の態様による組換え微生物細胞は、ＥＣ２．７．１．３９として分類されるホモセリンキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ホモセリンキナーゼ活性を有するポリペプチドは、ｔｈｒＢ遺伝子またはｔｈｒＩ遺伝子によってコードされる。一実施形態では、ホモセリンキナーゼ活性を有するポリペプチドは親微生物細胞にとって内在性であるか、または親微生物細胞にとって外来性である。別の実施形態では、ホモセリンキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現は、組換え微生物細胞においてモジュレートされている。場合によっては、ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドが組換え微生物細胞において過剰発現するように、ポリヌクレオチドを外来性プロモーターに操作可能に連結することによってモジュレートされる。別の実施形態では、ホモセリンキナーゼ活性を有するポリペプチドは、ホモセリンキナーゼ活性を有し、インビトロまたはインビボにおいて、好ましくはインビボにおいて、ホモセリンからＯ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンへの変換を触媒する、配列番号２８、２９、３０、３１から選択される配列またはそれらの変異体または断片を含む。
一実施形態では、第１の態様による組換え微生物細胞は、ＥＣ４．２．３．１として分類されるスレオニン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、スレオニン合成酵素活性を有するポリペプチドは、ｔｈｒＣ遺伝子によってコードされる。一実施形態では、スレオニン合成酵素活性を有するポリペプチドは、親微生物細胞にとって内在性であるか、または親微生物細胞にとって外来性である。別の実施形態では、スレオニン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現は、組換え微生物細胞においてモジュレートされている。場合によっては、ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドが組換え微生物細胞において過剰発現するように、ポリヌクレオチドを外来性プロモーターに操作可能に連結することによってモジュレートされる。別の実施形態では、スレオニン合成酵素活性を有するポリペプチドは、スレオニン合成酵素活性を有し、インビトロまたはインビボにおいて、好ましくはインビボにおいて、Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンからスレオニンへの変換を触媒する、配列番号３２、３３、３４から選択される配列またはそれらの変異体または断片を含む。
一実施形態では、第１の態様による組換え微生物細胞は、ＥＣ４．３．１．１９として分類されるスレオニンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、スレオニンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドは、ｔｄｃＢ遺伝子またはｉｌｖＡ遺伝子によってコードされる。一実施形態では、スレオニンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドは親微生物細胞にとって内在性であるか、または親微生物細胞にとって外来性である。別の実施形態では、スレオニンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現は、組換え微生物細胞においてモジュレートされている。場合によっては、ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドが組換え微生物細胞において過剰発現するように、ポリヌクレオチドを外来性プロモーターに操作可能に連結することによってモジュレートされる。別の実施形態では、スレオニンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドは、スレオニンデアミナーゼ活性を有し、インビトロまたはインビボにおいて、好ましくはインビボにおいて、スレオニンから２−ケト酪酸への変換を触媒する、配列番号３５、３６、３７、３８、３９から選択される配列またはそれらの変異体または断片を含む。
一実施形態では、第１の態様による組換え微生物細胞は、ＥＣ２．３．１．１８２として分類される（Ｒ）−シトラマル酸合成酵素活性（図２、経路（Ｂ））を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、（Ｒ）−シトラマル酸合成酵素活性を有するポリペプチドはｃｉｍＡ遺伝子によってコードされる。一実施形態では、（Ｒ）−シトラマル酸合成酵素活性を有するポリペプチドは親微生物細胞にとって内在性であるか、または親微生物細胞にとって外来性である。別の実施形態では、（Ｒ）−シトラマル酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現は、組換え微生物細胞においてモジュレートされている。場合によっては、ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドが組換え微生物細胞において過剰発現するように、ポリヌクレオチドを外来性プロモーターに操作可能に連結することによってモジュレートされる。別の実施形態では、（Ｒ）−シトラマル酸合成酵素活性を有するポリペプチドは、（Ｒ）−シトラマル酸合成酵素活性を有し、インビトロまたはインビボにおいて、好ましくはインビボにおいて、アセチル−ＣｏＡおよびピルビン酸から（Ｒ）−シトラマル酸への反応を触媒する、配列番号４０、４１、４２、４３から選択される配列またはそれらの変異体または断片を含む。
一実施形態では、第１の態様による組換え微生物細胞は、ＥＣ４．２．１．３３として分類されるイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドは、ｌｅｕＣＤ遺伝子によってコードされる大サブユニットおよび小サブユニットを含む。一実施形態では、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドは親微生物細胞にとって内在性であるか、または親微生物細胞にとって外来性である。別の実施形態では、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現は、組換え微生物細胞においてモジュレートされている。場合によっては、ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドが組換え微生物細胞において過剰発現するように、ポリヌクレオチドを外来性プロモーターに操作可能に連結することによってモジュレートされる。別の実施形態では、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドは大サブユニットおよび小サブユニットを含む。他の実施形態では、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドは、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性を有し、インビトロまたはインビボにおいて、好ましくはインビボにおいて、（Ｒ）−シトラマル酸からシトラコン酸およびシトラコン酸からベータ−メチル−Ｄ−リンゴ酸への変換を触媒する、配列番号４４および４６から選択される大サブユニット配列および配列番号４５および４７から選択される小サブユニット配列またはそれらの変異体または断片を含む。
一実施形態では、第１の態様による組換え微生物細胞は、ＥＣ１．１．１．８５として分類されるベータ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ベータ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドは、ｌｅｕＢ遺伝子またはｌｅｕ２遺伝子によってコードされる。一実施形態では、ベータ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドは、親微生物細胞にとって内在性であるか、または親微生物細胞にとって外来性である。別の実施形態では、ベータ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現は、組換え微生物細胞においてモジュレートされている。場合によっては、ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドが組換え微生物細胞において過剰発現するように、ポリヌクレオチドを外来性プロモーターに操作可能に連結することによってモジュレートされる。別の実施形態では、ベータ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドは、ベータ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、インビトロまたはインビボにおいて、好ましくはインビボにおいて、ベータ−メチル−Ｄ−リンゴ酸から２−ケト酪酸への変換を触媒する、配列番号４８、４９、５０から選択される配列またはそれらの変異体または断片を含む。
一実施形態では、第１の態様による組換え微生物細胞は、ＥＣ５．４．９９．２として分類されるメチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性（図３）を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性を有するポリペプチドは、ｓｃｐＡ（ｓｂｍとしても知られている）遺伝子によってコードされる。一実施形態では、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性を有するポリペプチドは、親微生物細胞にとって内在性であるか、または親微生物細胞にとって外来性である。別の実施形態では、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現は、組換え微生物細胞においてモジュレートされている。場合によっては、ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドが組換え微生物細胞において過剰発現するように、ポリヌクレオチドを外来性プロモーターに操作可能に連結することによってモジュレートされる。別の実施形態では、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性を有するポリペプチドは、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性を有し、インビトロまたはインビボにおいて、好ましくはインビボにおいて、スクシニル−ＣｏＡからメチルマロニル−ＣｏＡへの変換を触媒する、配列番号５１、５２、５３、５４，５５、５６、５７、５８から選択される配列またはそれらの変異体または断片を含む。
一実施形態では、第１の態様による組換え微生物細胞は、ＥＣ４．１．１．４１として分類されるメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、ｓｃｐＢ（ｙｇｆＧとしても知られている）遺伝子によってコードされる。一実施形態では、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、親微生物細胞にとって内在性であるか、または親微生物細胞にとって外来性である。別の実施形態では、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現は、組換え微生物細胞においてモジュレートされている。場合によっては、ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドが組換え微生物細胞において過剰発現するように、ポリヌクレオチドを外来性プロモーターに操作可能に連結することによってモジュレートされる。別の実施形態では、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有し、インビトロまたはインビボにおいて、好ましくはインビボにおいて、メチルマロニル−ＣｏＡからプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する、配列番号５９、６０、６１から選択される配列またはそれらの変異体または断片を含む。
一実施形態では、第１の態様による組換え微生物細胞は、ＥＣ２．１．３．１として分類されるメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、親微生物細胞にとって内在性であるか、または親微生物細胞にとって外来性である。別の実施形態では、メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現は、組換え微生物細胞においてモジュレートされている。場合によっては、ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドが組換え微生物細胞において過剰発現するように、ポリヌクレオチドを外来性プロモーターに操作可能に連結することによってモジュレートされる。別の実施形態では、メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシルトランスフェラーゼ活性を有し、インビトロまたはインビボにおいて、好ましくはインビボにおいて、メチルマロニル−ＣｏＡからプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する、配列番号６２の配列またはその変異体または断片を含む。
一実施形態では、第１の態様による組換え微生物細胞は、ＥＣ５．１．９９．１として分類されるメチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ活性を有するポリペプチドは、親微生物細胞にとって内在性であるか、または親微生物細胞にとって外来性である。別の実施形態では、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現は、組換え微生物細胞においてモジュレートされている。場合によっては、ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドが組換え微生物細胞において過剰発現するように、ポリヌクレオチドを外来性プロモーターに操作可能に連結することによってモジュレートされる。別の実施形態では、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ活性を有するポリペプチドは、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ活性を有し、インビトロまたはインビボにおいて、好ましくはインビボにおいて、（Ｒ）−メチルマロニル−ＣｏＡから（Ｓ）−メチルマロニル−ＣｏＡへの変換を触媒する配列番号６３の配列またはその変異体または断片を含む。
一実施形態では、第１の態様による組換え微生物細胞は、プロピオニル−ＣｏＡ：：スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、内在性ｓｃｐＣ遺伝子（ｙｇｆＨとしても知られている））を含み、組換え微生物細胞におけるこのような内在性ポリヌクレオチドの発現は減衰している。いくつかの実施形態では、内在性ポリヌクレオチドの発現は、組換え微生物細胞における内在性ポリヌクレオチドの配列の全てまたは一部の欠失によって減衰している。
一実施形態では、第１の態様による組換え微生物細胞は、アシル−ＣｏＡ脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、内在性ｆａｄＥ遺伝子）を含み、組換え微生物細胞におけるこのような内在性ポリヌクレオチド配列の発現は減衰していてもよく、または減衰していなくてもよい。
他の実施形態では、第１の態様による組換え微生物細胞は、脂肪酸誘導体酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、組換え微生物細胞は、炭素源の存在下で培養したとき、奇数鎖脂肪酸誘導体を含む脂肪酸誘導体組成物を生成する。
様々な実施形態では、脂肪酸誘導体酵素活性には、チオエステラーゼ活性、エステル合成酵素活性、脂肪アルデヒド生合成活性、脂肪アルコール生合成活性、ケトン生合成活性および／または炭化水素生合成活性が含まれる。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞は、２種以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、各ポリペプチドが脂肪酸誘導体酵素活性を有するポリヌクレオチドを含む。さらに特定の実施形態では、組換え微生物細胞は、（１）チオエステラーゼ活性を有するポリペプチド、（２）デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド、（３）カルボン酸レダクターゼ活性を有するポリペプチド、（４）アルコール脱水素酵素活性を有するポリペプチド（ＥＣ１．１．１．１）、（５）アルデヒドデカルボニラーゼ活性を有するポリペプチド（ＥＣ ４．１．９９．５）、（６）アシル−ＣｏＡ−レダクターゼ活性を有するポリペプチド（ＥＣ１．２．１．５０）、（７）アシル−ＡＣＰレダクターゼ活性を有するポリペプチド、（８）エステル合成酵素活性を有するポリペプチド（ＥＣ３．１．１．６７）、（９）ＯｌｅＡ活性を有するポリペプチド、または（１０）ＯｌｅＣＤもしくはＯｌｅＢＣＤ活性を有するポリペプチドから選択される脂肪酸誘導体酵素活性を有する１種または複数のポリペプチドを発現するかまたは過剰発現し、組換え微生物細胞は、奇数鎖脂肪酸、奇数鎖脂肪エステル、奇数鎖ワックスエステル、奇数鎖脂肪アルデヒド、奇数鎖脂肪アルコール、偶数鎖アルカン、偶数鎖アルケン、偶数鎖内部オレフィン、偶数鎖末端オレフィンまたは偶数鎖ケトンを含む組成物を生成する。
一実施形態では、脂肪酸誘導体酵素活性は、チオエステラーゼ活性を含み、組換え微生物細胞を含む培養物は、炭素源の存在下で培養したとき、奇数鎖脂肪酸を含む脂肪酸組成物を生成する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＥＣ３．１．１．５、ＥＣ３．１．２．−またはＥＣ３．１．２．１４に分類されるチオエステラーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドは、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｆａｔＡまたはｆａｔＢ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドは親微生物細胞にとって内在性であるか、または親微生物細胞にとって外来性である。別の実施形態では、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現は、組換え微生物細胞においてモジュレートされている。場合によっては、ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドが組換え微生物細胞において過剰発現するように、ポリヌクレオチドを外来性プロモーターに操作可能に連結することによってモジュレートされる。別の実施形態では、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドは、チオエステラーゼ活性を有し、インビトロまたはインビボにおいて、好ましくはインビボにおいて、奇数鎖アシル−ＡＣＰの奇数鎖脂肪酸への加水分解を触媒するかまたは奇数鎖アシル−ＡＣＰの奇数鎖脂肪エステルへの加アルコール分解を触媒する、配列番号６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１および７２から選択される配列またはそれらの変種または断片を含む。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第１の態様による組換え微生物細胞は、炭素源の存在下で培養したとき、炭素源を含有する培養培地中でポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で培養したとき、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０００ｍｇ／Ｌまたは少なくとも２０００ｍｇ／Ｌの奇数鎖脂肪酸を生成する。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第１の態様による組換え微生物細胞は、奇数鎖脂肪酸および偶数鎖脂肪酸を含む脂肪酸組成物を生成する。いくつかの実施形態では、組成物における脂肪酸の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が奇数鎖脂肪酸である。
本発明は、第１の態様による組換え微生物細胞を含む細胞培養物を含む。
第２の態様では、本発明は、組換え微生物細胞における奇数鎖脂肪酸誘導体（または奇数鎖脂肪酸誘導体を含む脂肪酸誘導体組成物）の生成方法であって、細胞内におけるプロピオニル−ＣｏＡの生成を増加させるために有効な酵素活性を有する組換えポリペプチドを細胞内で発現させることと、炭素源の存在下で組換えポリペプチドを発現し、奇数鎖脂肪酸誘導体を生成するために有効な条件下で細胞を培養することとを含む方法を含む。
一実施形態では、奇数鎖脂肪酸誘導体を含む脂肪酸誘導体組成物の作製方法は、第１の態様による組換え微生物細胞を得ることと、炭素源を含有する培養培地中で、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）によるポリヌクレオチドを発現し、奇数鎖脂肪酸誘導体を含む脂肪酸誘導体組成物を生成するために有効な条件下で細胞を培養することと、適宜培養培地から組成物を回収することとを含む。
いくつかの実施形態では、第２の態様による方法によって生成される脂肪酸誘導体組成物は、奇数鎖脂肪酸誘導体および偶数鎖脂肪酸誘導体を含み、組成物中の脂肪酸誘導体の少なくとも５重量％、少なくとも６重量％、少なくとも８重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも８０重量％または少なくとも９０重量％が奇数鎖脂肪酸誘導体である。いくつかの実施形態では、脂肪酸誘導体組成物は、奇数鎖脂肪酸誘導体を少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００００ｍｇ／Ｌまたは少なくとも２００００ｍｇ／Ｌの量（例えば、力価）で含む。
第２の態様の様々な実施形態では、脂肪酸誘導体酵素活性には、チオエステラーゼ活性、エステル合成酵素活性、脂肪アルデヒド生合成活性、脂肪アルコール生合成活性、ケトン生合成活性および／または炭化水素生合成活性が含まれる。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞は、２種以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、各ポリペプチドが脂肪酸誘導体酵素活性を有するポリヌクレオチドを含む。さらに特定の実施形態では、組換え微生物細胞は、（１）チオエステラーゼ活性を有するポリペプチド、（２）デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド、（３）カルボン酸レダクターゼ活性を有するポリペプチド、（４）アルコール脱水素酵素活性を有するポリペプチド（ＥＣ１．１．１．１）、（５）アルデヒドデカルボニラーゼ活性を有するポリペプチド（ＥＣ４．１．９９．５）、（６）アシル−ＣｏＡ−レダクターゼ活性を有するポリペプチド（ＥＣ１．２．１．５０）、（７）アシル−ＡＣＰレダクターゼ活性を有するポリペプチド、（８）エステル合成酵素活性を有するポリペプチド（ＥＣ３．１．１．６７）、（９）ＯｌｅＡ活性を有するポリペプチド、または（１０）ＯｌｅＣＤもしくはＯｌｅＢＣＤ活性を有するポリペプチドから選択される脂肪酸誘導体酵素活性を有する１種または複数のポリペプチドを発現するかまたは過剰発現し、組換え微生物細胞は、１種または複数の奇数鎖脂肪酸、奇数鎖脂肪エステル、奇数鎖ワックスエステル、奇数鎖脂肪アルデヒド、奇数鎖脂肪アルコール、偶数鎖アルカン、偶数鎖アルケン、偶数鎖内部オレフィン、偶数鎖末端オレフィンおよび偶数鎖ケトンを含む組成物を生成する。
本発明は、第２の態様による方法によって生成される奇数鎖脂肪酸誘導体を含む脂肪酸誘導体組成物を含む。
第３の態様では、本発明は、親微生物細胞よりも高い力価または高い割合の奇数鎖脂肪酸誘導体を生成する組換え微生物細胞の作製方法であって、脂肪酸誘導体酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む親微生物細胞を得ることと、同じ条件下で培養したとき、親微生物細胞によって生成されるプロピオニル−ＣｏＡの量よりも多量のプロピオニル−ＣｏＡを生成する、または生成することができる組換え微生物細胞を得るために親微生物細胞を操作することとを含み、組換え微生物細胞が、炭素源の存在下で、組換え微生物細胞においてプロピオニル−ＣｏＡおよび脂肪酸誘導体を生成するために有効な条件下で培養したとき、同じ条件下で培養した親微生物細胞によって生成される奇数鎖脂肪酸誘導体の力価または割合に対して、より高い力価または高い割合の奇数鎖脂肪酸誘導体を生成する方法を含む。
第４の態様では、本発明は、微生物細胞によって生成される奇数鎖脂肪酸誘導体の力価または割合を増加させる方法であって、脂肪酸誘導体を生成することができる親微生物細胞を得ることと、同じ条件下で培養したとき、親微生物細胞によって生成されるプロピオニル−ＣｏＡの量よりも多量のプロピオニル−ＣｏＡを生成する、または生成することができる組換え微生物細胞を得るために親微生物細胞を操作することとを含み、組換え微生物細胞が、炭素源の存在下で、組換え微生物細胞においてプロピオニル−ＣｏＡおよび脂肪酸誘導体を生成するために有効な条件下で培養したとき、同じ条件下で培養した親微生物細胞によって生成される奇数鎖脂肪酸誘導体の力価または割合に対して、より高い力価またはより高い割合の奇数鎖脂肪酸誘導体を生成する方法を含む。
第３または第４の態様によるいくつかの実施形態では、親微生物細胞を操作する工程は、（ａ）アスパルトキナーゼ活性、ホモセリン脱水素酵素活性、ホモセリンキナーゼ活性、スレオニン合成酵素活性およびスレオニンデアミナーゼ活性を有する１種または複数のポリペプチド、（ｂ）（Ｒ）−シトラマル酸合成酵素活性、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性およびベータ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有する１種または複数のポリペプチド、ならびに（ｃ）メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性、メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシルトランスフェラーゼ活性およびメチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ活性を有する１種または複数のポリペプチドから選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現するために細胞を操作することを含み、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）による少なくとも１種のポリペプチドが親微生物細胞にとって外来性であるか、または（ａ）、（ｂ）または（ｃ）による少なくとも１種のポリヌクレオチドの発現が、親微生物細胞におけるポリヌクレオチドの発現と比較して、組換え微生物細胞においてモジュレートされている。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドの外来性プロモーターへの操作可能な連結などによるポリヌクレオチドの過剰発現によってモジュレートされる。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、（ａ）による１種または複数のポリペプチドおよび（ｂ）による１種または複数のポリペプチドを発現する。
第３または第４の態様によるいくつかの実施形態では、親微生物細胞は、基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞は、基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドを発現するか、または内在性ポリヌクレオチドを過剰発現するために操作される。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞は、基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドを発現するように操作されており、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチドの発現は減衰している。いくつかの実施形態では、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、内在性ポリヌクレオチドの改変された、突然変異型または変異型の形態あり、改変されていない内在性ポリヌクレオチドに対して、基質としてのプロピオニル−ＣｏＡに対する増強された親和性または活性で選択されている。改変された突然変異体または変異体ポリヌクレオチドを生成するための数多くの方法は当技術分野では周知で、その例を本明細書で以下に記載する。
[本発明1001]
（ａ）プロピオニル−ＣｏＡを生成するために有効な酵素活性を欠如しているか、または量が低下している親微生物細胞において生成されるプロピオニル−ＣｏＡの量に対して、増加した量のプロピオニル−ＣｏＡを組換え微生物細胞において生成するために有効な前記酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが組換え微生物細胞にとって外来性であるか、または前記ポリヌクレオチドの発現が親微生物細胞におけるポリヌクレオチドの発現と比較して組換え微生物細胞においてモジュレートされているポリヌクレオチド、
（ｂ）基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ｃ）脂肪酸誘導体酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含む組換え微生物細胞であって、
組換え微生物細胞が、炭素源の存在下で、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）によるポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で培養したとき、奇数鎖脂肪酸誘導体を含む脂肪酸誘導体組成物を生成し、
前記脂肪酸誘導体組成物における脂肪酸誘導体の少なくとも１０％が奇数鎖脂肪酸誘導体である、組換え微生物細胞。
[本発明1002]
脂肪酸誘導体組成物における脂肪酸誘導体の少なくとも20％が奇数鎖脂肪酸誘導体である、本発明1001の組換え微生物細胞。
[本発明1003]
奇数鎖脂肪酸誘導体を少なくとも100ｍｇ／Ｌ生成する、本発明1001の組換え微生物細胞。
[本発明1004]
（ａ）による少なくとも1種のポリヌクレオチドの発現が、組換え微生物細胞におけるポリヌクレオチドの過剰発現によってモジュレートされる、本発明1001の組換え微生物細胞。
[本発明1005]
（ａ）によるポリヌクレオチドが、
（ｉ）アスパルトキナーゼ活性、ホモセリン脱水素酵素活性、ホモセリンキナーゼ活性、スレオニン合成酵素活性およびスレオニンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1種または複数のポリヌクレオチド；
（ｉｉ）（Ｒ）−シトラマル酸合成酵素活性、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性およびベータ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードする1種または複数のポリヌクレオチド；ならびに
（ｉｉｉ）メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性およびメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1種または複数のポリヌクレオチド、
からなる群から選択される、本発明1001の組換え微生物細胞。
[本発明1006]
（ｉ）による1種または複数のポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）による1種または複数のポリヌクレオチドを含む、本発明1005の組換え微生物細胞。
[本発明1007]
基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドが組換え微生物細胞にとって外来性であり、組換え微生物細胞にとって内在性であるβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドの発現が減衰している、本発明1001の組換え微生物細胞。
[本発明1008]
脂肪酸誘導体酵素活性がチオエステラーゼ活性を含み、組換え微生物細胞が奇数鎖脂肪酸を含む脂肪酸組成物を生成し、組成物中の脂肪酸の少なくとも10％が奇数鎖脂肪酸である、本発明1001の組換え微生物細胞。
[本発明1009]
脂肪酸誘導体酵素活性がエステル合成酵素活性を含み、組換え微生物細胞が奇数鎖脂肪エステルを含む脂肪エステル組成物を生成し、組成物中の脂肪エステルの少なくとも10％が奇数鎖脂肪エステルである、本発明1001の組換え微生物細胞。
[本発明1010]
脂肪酸誘導体酵素活性が脂肪アルデヒド生合成活性を含み、組換え微生物細胞が奇数鎖脂肪アルデヒドを含む脂肪アルデヒド組成物を生成し、組成物中の脂肪アルデヒドの少なくとも10％が奇数鎖脂肪アルデヒドである、本発明1001の組換え微生物細胞。
[本発明1011]
脂肪酸誘導体酵素活性が脂肪アルコール生合成活性を含み、組換え微生物細胞が奇数鎖脂肪アルコールを含む脂肪アルコール組成物を生成し、組成物中の脂肪アルコールの少なくとも10％が奇数鎖脂肪アルコールである、本発明1001の組換え微生物細胞。
[本発明1012]
脂肪酸誘導体酵素活性が炭化水素生合成活性を含み、組換え微生物細胞が偶数鎖炭化水素を含む炭化水素組成物を生成し、組成物中の炭化水素の少なくとも10％が偶数鎖炭化水素である、本発明1001の組換え微生物細胞。
[本発明1013]
本発明1001の組換え微生物細胞を含む細胞培養物。
[本発明1014]
奇数鎖脂肪酸誘導体を含む脂肪酸誘導体組成物の作製方法であって、
本発明1001の組換え微生物細胞を得ること、
炭素源を含有する培養培地中で、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）によるポリヌクレオチドを発現し、奇数鎖脂肪酸誘導体を含む脂肪酸誘導体組成物を生成するために有効な条件下で組換え微生物細胞を培養することであって、組成物中の脂肪酸誘導体の少なくとも10％が奇数鎖脂肪酸誘導体であること、および
任意に、培養培地から奇数鎖脂肪酸誘導体組成物を回収すること、
を含む方法。
[本発明1015]
組換え微生物細胞が、
（1）チオエステラーゼ活性を有するポリペプチド；
（2）デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド；
（3）カルボン酸レダクターゼ活性を有するポリペプチド；
（4）アルコール脱水素酵素活性を有するポリペプチド（ＥＣ1．1．1．1）；
（5）アルデヒドデカルボニラーゼ活性を有するポリペプチド（ＥＣ4．1．99．5）；
（6）アシル−ＣｏＡ−レダクターゼ活性を有するポリペプチド（ＥＣ1．2．1．50）；
（7）アシル−ＡＣＰレダクターゼ活性を有するポリペプチド；
（8）エステル合成酵素活性を有するポリペプチド（ＥＣ3．1．1．67）；
（9）ＯｌｅＡ活性を有するポリペプチド；および
（10）ＯｌｅＣＤまたはＯｌｅＢＣＤ活性を有するポリペプチド、
からなる群から選択される脂肪酸誘導体酵素活性を有するポリペプチドをコードする1種または複数のポリヌクレオチドを発現し、
組換え微生物細胞が、奇数鎖脂肪酸、奇数鎖脂肪エステル、奇数鎖脂肪アルデヒド、奇数鎖脂肪アルコール、偶数鎖アルカン、偶数鎖アルケン、偶数鎖末端オレフィン、偶数鎖内部オレフィンまたは偶数鎖ケトンの1種または複数を含む組成物を生成する、本発明1014の方法。
[本発明1016]
親微生物細胞によって生成されるよりも高い力価または高い割合の奇数鎖脂肪酸誘導体を生成する組換え微生物細胞の作製方法であって、
基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび脂肪酸誘導体酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む親微生物細胞を得ること、および
同じ条件下で培養したとき、親微生物細胞によって生成されるプロピオニル−ＣｏＡの量よりも多量のプロピオニル−ＣｏＡを生成する、または生成することができる組換え微生物細胞を得るために親微生物細胞を操作すること、を含み、
組換え微生物細胞が炭素源の存在下で、ポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で培養したとき、同じ条件下で培養した親微生物細胞によって生成される奇数鎖脂肪酸誘導体の力価または割合に対してより高い力価または高い割合の奇数鎖脂肪酸誘導体を生成する方法。
[本発明1017]
親微生物細胞を操作する工程が、
（ａ）アスパルトキナーゼ活性、ホモセリン脱水素酵素活性、ホモセリンキナーゼ活性、スレオニン合成酵素活性およびスレオニンデアミナーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｂ）（Ｒ）−シトラマル酸合成酵素活性、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性およびベータ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド；ならびに
（ｃ）メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性またはメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシルトランスフェラーゼ活性のどちらかおよび適宜メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ活性を有するポリペプチド、
からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現するために親微生物細胞を操作することを含み、
（ａ）、（ｂ）または（ｃ）による少なくとも1種のポリペプチドが親微生物細胞に対して外来性であるか、または（ａ）、（ｂ）または（ｃ）による少なくとも1種のポリヌクレオチドの発現が、親微生物細胞におけるポリヌクレオチドの発現と比較して、組換え微生物細胞においてモジュレートされている、本発明1016の方法。
[本発明1018]
組換え微生物細胞が、基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドを発現するように操作されており、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチドの発現が減衰している、本発明1016の方法。
[本発明1019]
微生物細胞によって生成される奇数鎖脂肪酸誘導体の力価または割合を増加させる方法であって、
脂肪酸誘導体を生成する親微生物細胞を得ること、および
同じ条件下で培養したとき、親微生物細胞によって生成されるプロピオニル−ＣｏＡの量よりも多量のプロピオニル−ＣｏＡを生成する、または生成することができる組換え微生物細胞を得るために親微生物細胞を操作すること、を含み、
組換え微生物細胞が、炭素源の存在下で、組換え微生物細胞においてプロピオニル−ＣｏＡおよび脂肪酸誘導体を生成するために有効な条件下で培養したとき、同じ条件下で培養した親微生物細胞によって生成される奇数鎖脂肪酸誘導体の力価または割合に対してより高い力価または高い割合の奇数鎖脂肪酸誘導体を生成する方法。
[本発明1020]
本発明1014の方法によって生成される脂肪酸誘導体組成物。
本発明のこれらおよび他の目的および特性は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を読むとより完全に明らかとなろう。
図１Ａおよび１Ｂは、異なるアシル−ＣｏＡ「プライマー」分子を供給したときの脂肪酸生合成経路の中間体および生成物の例を比較する。図１Ａは、２炭素プライマーアセチル−ＣｏＡを利用する反応経路の例を示しており、この経路で偶数鎖長のβ−ケトアシル−ＡＣＰ中間体アセトアセチル−ＡＣＰが生成され、偶数鎖（ｅｃ）−アシル−ＡＣＰ中間体およびそれから生成される偶数鎖脂肪酸誘導体が導かれる。図１Ｂは、３炭素プライマープロピオニル−ＣｏＡを利用する反応経路を示しており、この経路で奇数鎖長のβ−ケトアシル−ＡＣＰ中間体３−オキソバレリル−ＡＣＰが生成され、奇数鎖（ｏｃ）−アシル−ＡＣＰ中間体およびそれらから生成される奇数鎖脂肪酸誘導体が導かれる。 図２は、本明細書で記載したようなスレオニン生合成経路（経路（Ａ））およびシトラマル酸生合成経路（経路（Ｂ））による、中間体α−ケト酪酸を介したプロピオニル−ＣｏＡの生成増加のための経路の例を示す。 図３は、本明細書で記載したようなメチルマロニル−ＣｏＡ生合成経路（経路（Ｃ））を介したプロピオニル−ＣｏＡの生成増加のための経路の一例を示す。
本明細書で記載した特定の組成物および方法はもちろん変化することがあるので、本発明は、それらだけに限定はされない。本明細書で使用した用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのものにすぎず、本発明の範囲を制限するものではないことも理解されたい。
受託番号：本記載を通じて配列受託番号は、米国の国立衛生研究所によって管理されているＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）によって提供されるデータベースから（本明細書では、「ＮＣＢＩ受託番号」あるいは「ＧｅｎＢａｎｋ受託番号」と識別される）、スイスバイオインフォマティクス研究所によって提供されるＵｎｉＰｒｏｔ知識データベース（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）およびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースから（本明細書では「ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号」と識別される）得られた。特に明確に指示されていなければ、ＮＣＢＩ／ＧｅｎＢａｎｋ受託番号によって識別された配列は、バージョン番号１である（すなわち、配列のバージョン番号は「受託番号１」である）。本明細書で提供されたＮＣＢＩおよびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号は、２０１１年８月２日時点で最新であった。
酵素分類（ＥＣ）番号：ＥＣ番号は、国際生化学および分子生物学連合（ＩＵＢＭＢ）の命名委員会によって確立され、その記述はワールドワイドウェブのＩＵＢＭＢ酵素命名ウェブサイトで利用可能である。ＥＣ番号は、触媒する反応に応じて酵素を分類する。本明細書で参考にしたＥＣ番号は、一部を東京大学によって支援されているＫｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって維持されているＫＥＧＧリガンドデータベースから得られる。特に指示がなければ、ＥＣ番号は、２０１１年８月２日時点のＫＥＧＧデータベースに提供されている通りである。
特に定義しなければ、本明細書で使用した技術的および科学的用語は全て、本発明が属する当分野の技術者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載したものと類似または同等のいかなる材料および方法も、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい組成物および方法をここで記載する。
定義
本明細書では、「脂肪酸」という用語は、式Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＨを有するカルボン酸を指し、式中、Ｒは長さが炭素原子約４個と約３６個の間、より一般的には長さが炭素原子約４個と約２２個の間であってもよい炭素鎖を表す。脂肪酸は、飽和しているか、または不飽和であってもよい。不飽和の場合、Ｒは１個または複数の不飽和点を有していてもよく、すなわち、Ｒはモノ不飽和またはポリ不飽和であってもよい。Ｒは、直鎖（本明細書ではまた「直線状鎖（ｌｉｎｅａｒ ｃｈａｉｎ）」と称する）または分枝鎖であってもよい。「脂肪酸」という用語は、１種または複数の異なる脂肪酸誘導体または脂肪酸誘導体の混合物を含むことができる「脂肪酸誘導体」を指すために本明細書では使用してもよい。
本明細書で使用される場合、「奇数鎖脂肪酸」（「ｏｃ−ＦＡ」と略す）は、カルボニル炭素を含めて、奇数の炭素原子を含有する直鎖状炭素鎖を有する脂肪酸分子を指す。ｏｃ−ＦＡの非限定的例には、飽和ｏｃ−ＦＡであるトリデカン酸（Ｃ１３：０）、ペンタデカン酸（Ｃ１５：０）およびヘプタデカン酸（Ｃ１７：０）および不飽和（すなわちモノ不飽和）ｏｃ−ＦＡであるヘプタデカン酸（Ｃ１７：１）が含まれる。
本明細書で使用される場合、「β−ケトアシル−ＡＣＰ」という用語は、図１Ａおよび１Ｂで示した経路の部分（Ｄ）によって表されるようなベータケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性（例えば、ＥＣ２．３．１．１８０）を有する酵素によって触媒されるアシル−ＣｏＡプライマー分子とマロニル−ＡＣＰとの縮合生成物を指す。アシル−ＣｏＡプライマー分子は、図１Ａで示したアセチル−ＣｏＡなどの偶数の炭素原子を含有するアシル基を有していてもよく、この場合、得られたβ−ケトアシル−ＡＣＰ中間体はアセトセチル−ＡＣＰで、これは偶数鎖（ｅｃ−）β−ケトアシル−ＡＣＰである。アシル−ＣｏＡプライマー分子は、図１Ｂで表したようなプロピオニル−ＣｏＡなどの奇数の炭素原子を含有するアシル基を有していてもよく、この場合、得られたβ−ケトアシル−ＡＣＰ中間体は３−オキソバレリル−ＡＣＰで、これは奇数鎖（ｏｃ−）β−ケトアシル−ＡＣＰである。β−ケトアシル−ＡＣＰ中間体は、図１Ａおよび１Ｂの（Ｅ）部に表した脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）サイクルに入り、一巡の伸長反応を受け（すなわち、ケト還元、脱水およびエノイル還元）、アシル鎖に２個の炭素単位を付加し、その後さらに伸長サイクルを行い、それぞれのサイクルは、別のマロニル−ＡＣＰ分子との縮合、ケト還元、脱水およびエノイル還元が関与しており、したがってアシル−ＡＣＰのアシル鎖は伸長サイクル１回当たり２個の炭素単位が伸長される。
「アシル−ＡＣＰ」は一般的に、β−ケトアシル−ＡＣＰ中間体の１回または複数のＦＡＳ触媒伸長による生成物を指す。アシル−ＡＣＰは、アルキル鎖のカルボニル炭素とアシル運搬タンパク質（ＡＣＰ）の４’−ホスホパンテチオニル部分のスルフヒドリル基との間で形成されたアシルチオエステルであり、直鎖状炭素鎖の場合、通常、式ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ｓ−ＡＣＰを有し、式中、ｎは偶数（例えば、「偶数鎖アシル−ＡＣＰ」または「ｅｃ−アシル−ＡＣＰ」で、例えば、アセチル−ＣｏＡがプライマー分子のとき生成される、図１Ａ参照）または奇数（例えば、「奇数鎖アシル−ＡＣＰ」または「ｏｃ−アシル−ＡＣＰ」で、例えば、プロピオニル−ＣｏＡがプライマー分子のとき生成される、図１Ｂ参照）であってもよい。
特に記載がなければ、「脂肪酸誘導体」（略して「ＦＡ誘導体」）は、少なくとも一部が組換え微生物細胞の脂肪酸生合成経路によって作製されたいかなる生成物も含むものとする。脂肪酸誘導体はまた、少なくとも一部がアシル−ＡＣＰ中間体などの脂肪酸経路中間体によって作製されたいかなる生成物も含む。本明細書で記載した脂肪酸生合成経路は、脂肪酸誘導体を生成するために操作することができる脂肪酸誘導体酵素を含むことができ、場合によっては、例えば、所望する数の炭素原子を含有する炭素鎖を有する脂肪酸誘導体の組成物または奇数の炭素鎖を含有する誘導体の所望する割合などを有する脂肪酸誘導体の組成物などの、所望する炭素鎖特性を有する脂肪酸誘導体を生成するために、さらに酵素を発現させることができる。脂肪酸誘導体は、限定はしないが、脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステル（ワックスなど）、炭化水素（アルカンおよびアルケンなど（末端オレフィンおよび内部オレフィンを含む））およびケトンを含む。
「奇数鎖脂肪酸誘導体」（略して「ｏｃ−ＦＡ誘導体」）という用語は、上記で定義したように、ｏｃ−アシル−ＡＣＰと１種または複数の脂肪酸誘導体酵素との反応の生成物を指す。脂肪酸誘導体がそれ自体ｏｃ−ＦＡ誘導体またはｏｃ−アシル−ＡＣＰの脱カルボニル化または脱カルボキシル化の生成物でなければ、すなわち、得られたｏｃ−ＦＡ誘導体が偶数の炭素原子を有する場合でなければ、例えば、脂肪酸誘導体がｏｃ−脂肪アルデヒドの脱カルボニル化によって生成したｅｃ−アルカンまたはｅｃ−アルケン、ｏｃ−脂肪酸の脱カルボキシル化によって生成したｅｃ末端オレフィン、ｏｃ−アシル−ＡＣＰの脱カルボキシル化によって生成したｅｃ−ケトンもしくはｅｃ−内部オレフィンなどであるときでなければ、同様にして得られた脂肪酸誘導体生成物は、奇数の炭素原子を含有する直鎖状炭素鎖を有する。ｏｃ−ＦＡ誘導体またはｏｃ−アシル−ＡＣＰ前駆体分子のこのような偶数鎖長生成物は、偶数の炭素原子を含有する直鎖状鎖を有するけれども、それでも「ｏｃ−ＦＡ誘導体」の定義に入ると見なされるものと理解されたい。
「内在性」ポリペプチドとは、組換え細胞が操作された（または「得られた」）親微生物細胞（「宿主細胞」とも称する）のゲノムによってコードされるポリペプチドを指す。
「外来性」ポリペプチドとは、親微生物細胞のゲノムによってコードされていないポリペプチドを指す。変異体（すなわち、突然変異体）ポリペプチドは、外来性ポリペプチドの一例である。
ポリヌクレオチド配列が内在性ポリペプチドをコードする本発明の実施形態では、場合によっては内在性ポリペプチドは過剰発現している。本明細書で使用される場合、「過剰発現」とは、同じ条件下で対応する親細胞（例えば、野生型細胞）において通常生成されるよりも高い濃度で、細胞においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドを生成すること、あるいは生成を引き起こすことを意味する。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、同じ条件下で同種の非組換え微生物細胞（例えば、親微生物細胞）における濃度と比較して、組換え微生物細胞においてより高い濃度で存在するとき、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組換え微生物細胞において「過剰発現」することができる。過剰発現は、当技術分野で公知の任意の適切な手段によって実現することができる。
いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞における内在性ポリペプチドの過剰発現は、外来性調節要素の使用によって実現することができる。「外来性調節要素」という用語は一般的に、宿主細胞の外から生じる調節要素（例えば、発現制御配列または化合物）を指す。しかし、ある種の実施形態では、「外来性調節要素」（例えば、「外来性プロモーター」）という用語は、組換え細胞において内在性ポリペプチドの発現を制御するためにその機能が複製されているかまたは奪われている宿主細胞から得られた調節要素を指し得る。例えば、宿主細胞がＥ．コリ細胞の場合、ポリペプチドは内在性ポリペプチドであり、組換え細胞における内在性ポリペプチドの発現は別のＥ．コリ遺伝子から得られたプロモーターによって制御され得る。いくつかの実施形態では、内在性ポリペプチドの発現および／または活性のレベルの増加を引き起こす外来性調節要素は、低分子などの化合物である。
いくつかの実施形態では、内在性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、内在性ポリヌクレオチド）の発現を制御する外来性調節要素は、組換え組み込みによって内在性ポリヌクレオチドを宿主細胞のゲノムに操作可能に連結される発現制御配列である。ある種の実施形態では、発現制御配列は、当技術分野で公知の方法を使用して相同組換えによって宿主細胞染色体に組み込まれる（例えば、Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９７（１２）：
６６４０−６６４５ （２０００））。
発現制御配列は、当技術分野では公知で、例えば、宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現をもたらすプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）などを含む。発現制御配列は、転写に関与した細胞タンパク質と特異的に相互作用する（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６： １２３７−１２４５ （１９８７））。発現制御配列の例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０）に記載されている。
本発明の方法では、発現制御配列は、ポリヌクレオチド配列に操作可能に連結する。「操作可能に連結した」とは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が発現制御配列（複数可）に結合したとき、遺伝子発現を可能にするような様式でポリヌクレオチド配列および発現制御配列（複数可）が接続することを意味する。操作可能に連結したプロモーターは、転写および翻訳の方向の観点から選択されるポリヌクレオチド配列の上流に位置する。操作可能に連結したエンハンサーは、選択されるポリヌクレオチドの上流、内部または下流に位置することができる。選択マーカー、精製部分、標的タンパク質などをコードする核酸配列などのさらなる核酸配列は、さらなる核酸配列がポリヌクレオチド配列と一緒に発現するように、ポリヌクレオチド配列に操作可能に連結することができる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列に操作可能に連結したプロモーターを含む組換えベクターによって組換え細胞に与えられる。ある種の実施形態では、プロモーターは、発生調節された、細胞内小器官特異的、組織特異的、誘導性、構成的または細胞特異的プロモーターである。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、連結した別の核酸、すなわちポリヌクレオチド配列を輸送することができる核酸分子を指す。有用なベクターの１種は、エピソーム（すなわち、染色体外での複製が可能な核酸）である。有用なベクターは、連結した核酸の自己複製および／または発現を可能にするベクターである。操作可能に連結した遺伝子の発現を対象とすることができるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称する。一般的に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、ベクター形態で染色体に結合しない環状２本鎖ＤＮＡループを通常指す「プラスミド」の形態であることが多い。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるので、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」という用語は同義に使用される。しかし、同等の機能を果たし、今後当技術分野で公知になる発現ベクターのこのような他の形態も含まれる。
いくつかの実施形態では、組換えベクターは、（ａ）ポリヌクレオチド配列に操作可能に連結した発現制御配列、（ｂ）ポリヌクレオチド配列に操作可能に連結した選択マーカー、（ｃ）ポリヌクレオチド配列に操作可能に連結したマーカー配列、（ｄ）ポリヌクレオチド配列に操作可能に連結した精製部分、（ｅ）ポリヌクレオチド配列に操作可能に連結した分泌配列、および（ｆ）ポリヌクレオチド配列に操作可能に連結した標的配列からなる群から選択される少なくとも１種の配列を含む。
本明細書で記載した発現ベクターは、宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現に適切な形態の本明細書で記載したポリヌクレオチド配列を含む。当業者であれば、発現ベクターの設計は、形質転換する宿主細胞の選択、所望するポリペプチドの発現レベルなどの要因に左右され得ることなどを理解するだろう。本明細書で記載した発現ベクターは、本明細書で記載したポリヌクレオチド配列によってコードされる融合ポリペプチドを含むポリペプチドを生成するために宿主細胞に導入することができる。
原核細胞、例えば、Ｅ．コリにおけるポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、融合または非融合ポリペプチドのどちらかの発現を対象とする構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターで実施することが多い。融合ベクターは、ベクター内でコードされるポリペプチドに、通常組換えポリペプチドのアミノまたはカルボキシ末端にいくつかのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは通常、以下の３つの目的の１つまたは複数に役立つ：（１）組換えポリペプチドの発現の増加、（２）組換えポリペプチドの溶解性の増加および（３）アフィニティ精製においてリガンドとして作用することによる組換えポリペプチドの精製の補助。しばしば、融合発現ベクターでは、タンパク質分解切断部位を融合部分および組換えポリペプチドの接合部に導入する。これによって、融合ポリペプチドの精製後、融合部分から組換えポリペプチドを分離することが可能になる。このような酵素および同族認識配列の例には、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。融合発現ベクターの例には、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ６７： ３１−４０ （１９８８））、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）およびｐＲＩＴＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．）が含まれ、それぞれ標的組換えポリペプチドにグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを融合させる。
ベクターは、従来の形質転換または遺伝子導入技術によって原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書で使用される場合、「形質転換」および「遺伝子導入」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストランによる遺伝子導入、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含む、外来性核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当技術分野で確認された様々な技術を指す。宿主細胞を形質転換または遺伝子導入するために適切な方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記）に見出すことができる。
細菌細胞の安定した形質転換のために、使用する発現ベクターおよび形質転換技術に応じて、細胞の小画分のみを取り出し、発現ベクターを複製することが知られている。これらの形質転換体を同定し選択するために、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を目的の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入することができる。選択可能なマーカーには、限定はしないが、アンピシリン、カナマイシン、クラムフェニコールまたはテトラサイクリンなどの薬物に対する耐性を付与するマーカーが含まれる。選択可能なマーカーをコードする核酸は、本明細書で記載したポリペプチドをコードするベクターと同じベクターで、宿主細胞に導入することができるか、または別のベクターで導入することができる。導入した核酸で安定して形質転換され、組換え細胞を生じる宿主細胞は、適切な選択薬の存在下での増殖によって同定することができる。
同様に、ほ乳類細胞の安定した遺伝子導入のために、使用する発現ベクターおよび遺伝子導入技術に応じて、細胞の小画分のみが外来ＤＮＡをそのゲノムに組み込むことができることが知られている。これらの組み込み体を同定し選択するために、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を目的の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入することができる。好ましい選択可能なマーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与するマーカーが含まれる。選択可能なマーカーをコードする核酸は、本明細書で記載したポリペプチドをコードするベクターと同じベクターで、宿主細胞に導入することができるか、または別のベクターで導入することができる。導入した核酸で安定して遺伝子導入され、組換え細胞を生じる宿主細胞は、適切な選択薬の存在下での増殖によって同定することができる。
本明細書で使用される場合、「遺伝子ノックアウト」とは、インタクトなタンパク質の機能を低下させるかまたは排除するために、標的タンパク質をコードする遺伝子を改変または不活性化する手順を指す。遺伝子の不活性化は、ＵＶ照射による突然変異誘発またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンによる処理、部位特異的突然変異誘発、相同組換え、挿入欠失変異または「Ｒｅｄ−ｄｒｉｖｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９７：６６４０−４５， ２０００）などの一般的方法によって実施することができる。例えば、一実施形態では、得られた組換え細胞において相同組換え事象を選択することが可能であるように、コンストラクトを親細胞に導入する。当業者であれば、コンストラクトで相同組換え事象を受けた遺伝子導入（すなわち、組換え）細胞を効率よく選択するために、ポジティブおよびネガティブ選択遺伝子の両方を含むノックアウトコンストラクトを容易に設計することができるだろう。親細胞の変化は、例えば、シングルもしくはダブルクロスオーバー組換えによって、変化を含有するＤＮＡ配列で野生型（すなわち、内在性）ＤＮＡ配列を置換することによって得ることができる。形質転換体（すなわち、組換え細胞）の便利な選択のために、この変化は、例えば、抗生物質耐性マーカーをコードするＤＮＡ配列または宿主細胞の可能性のある栄養要求性を補完する遺伝子であってもよい。突然変異には、限定はしないが、欠失挿入突然変異が含まれる。組換え細胞におけるこのような変化の一例には、ある遺伝子から通常生成される生成物が機能型で生成されないような遺伝子破壊、すなわち、遺伝子の混乱が含まれる。これは、完全な欠失、選択マーカーの欠失もしくは挿入、選択マーカーの挿入、フレームシフト突然変異、インフレーム欠失または中途終止を引き起こす点突然変異によって行われ得る。場合によっては、遺伝子の全ｍＲＮＡが存在しない。他の状況では、生じるｍＲＮＡの量は変動する。
「内在性ポリペプチドの発現レベルの増加」という表現は、内在性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の過剰発現を引き起こすか、または内在性ポリペプチド配列の過剰発現を引き起こすことを意味する。過剰発現の程度は、約１．５倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約５倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上またはそれらの任意の範囲であってもよい。
「内在性ポリペプチドの活性レベルの増加」という表現は、内在性ポリペプチドの生化学的または生物学的機能（例えば、酵素活性）を増強することを意味する。活性増強の程度は、約１０％以上、約２０％以上、約５０％以上、約７５％以上、約１００％以上、約２００％以上、約５００％以上、約１０００％以上またはそれらの任意の範囲であってもよい。
「前記ポリヌクレオチド配列の発現は野生型ポリヌクレオチド配列に対して改変されている」という表現は、本明細書で使用される場合、内在性ポリヌクレオチド配列の発現および／または活性のレベルの増加または減少を意味する。いくつかの実施形態では、内在性ポリヌクレオチドの発現を制御する外来性調節要素は、組換え組み込みによって内在性ポリヌクレオチドを宿主細胞のゲノムに操作可能に連結される発現制御配列である。いくつかの実施形態では、発現制御配列は、当技術分野で公知の方法を使用して相同組換えによって宿主細胞染色体に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「前記ポリヌクレオチド配列（複数可）を発現するために有効な条件下で」という表現は、組換え細胞が所望する脂肪酸誘導体を生成することを可能にする任意の条件を意味する。適切な条件には、例えば、発酵条件が含まれる。発酵条件には、温度範囲、通気レベルおよび培地組成などの多くのパラメータを含めることができる。これらの条件はそれぞれ、個々におよび組み合わせて、宿主細胞の増殖を可能にする。培養培地例には、ブロスまたはゲルが含まれる。一般的に、培地には、組換え細胞が直接代謝することができる炭素源が含まれる。発酵とは、本発明の組換え微生物細胞などの生成宿主による炭素源の使用を意味する。発酵は、好気性、嫌気性またはそれらの変種（微好気性など）であってもよい。当業者によって理解されるように、組換え微生物細胞が炭素源をｏｃ−アシル−ＡＣＰまたは所望するｏｃ−ＦＡ誘導体（例えば、ｏｃ−脂肪酸、ｏｃ−脂肪エステル、ｏｃ−脂肪アルデヒド、ｏｃ−脂肪アルコール、ｅｃ−アルカン、ｅｃ−アルケンまたはｅｃ−ケトン）に処理できる条件は、一部には、特定の微生物に基づいて変化するだろう。いくつかの実施形態では、このプロセスは好気性環境で生じる。いくつかの実施形態では、このプロセスは嫌気性環境で生じる。いくつかの実施形態では、このプロセスは微好気性環境で生じる。
本明細書で使用される場合、「炭素源」という用語は、原核細胞または単純な真核細胞の増殖のための炭素の供給源としての使用に適切な基質または化合物を指す。炭素源は、限定はしないが、ポリマー、炭水化物（例えば、単糖類、二糖類、オリゴ糖類および多糖類などの糖類）、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチドおよび気体（例えば、ＣＯおよびＣＯ２）を含む様々な形態であってもよい。炭素源の例には、限定はしないが、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロースおよびアラビノースなどの単糖類、スクロース、マルトース、セロビオースおよびツラノースなどの二糖類、フルクトオリゴ糖およびガラクトオリゴ糖などのオリゴ糖類、デンプン、セルロース、ペクチンおよびキシランなどの多糖類、ヘミセルロース、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース物質および変異体、飽和または不飽和脂肪酸、コハク酸、乳酸および酢酸、エタノール、メタノールおよびグリセロールなどのアルコールまたはそれらの混合物が含まれる。炭素源は、グルコースなどの光合成の生成物であってもよい。ある種の好ましい実施形態では、炭素源はバイオマスから得られる。別の好ましい実施形態では、炭素源にはスクロースが含まれる。別の好ましい実施形態では、炭素源にはグルコースが含まれる。
本明細書で使用される場合、「バイオマス」という用語は、炭素源が得られる任意の生物学的材料を指す。いくつかの実施形態では、バイオマスは生物変換に適した炭素源に処理される。他の実施形態では、バイオマスはさらに炭素源に処理する必要はない。炭素源は、バイオ燃料に変換することができる。バイオマス源の例は、トウモロコシ、サトウキビまたはアメリカクサキビなどの植物質または植生である。別のバイオマス源の例は、動物質などの代謝廃棄物（例えば、牛糞肥料）である。バイオマス源のさらなる例には、藻類および他の海洋性植物が含まれる。バイオマスにはまた、限定はしないが、発酵廃棄物、エンシレージ、ワラ、木材、下水、ゴミ、セルロース性都市廃棄物および残飯を含む工業、農業、林業および家庭からの廃棄物が含まれる。「バイオマス」という用語はまた、炭水化物（例えば、単糖類、二糖類または多糖類）などの炭素源を指す。
条件が生成物の生成またはポリペプチドの発現を可能にするために十分であるかどうかを決定するために、組換え微生物細胞を、例えば、約４、８、１２、２４、３６、４８、７２時間またはそれ以上培養してもよい。培養中および／または後に、試料を採取し、その条件が生成または発現を可能にするかどうかを決定するために分析することができる。例えば、組換え微生物細胞が増殖した試料または培地中の組換え微生物細胞の所望する生成物の存在を試験することができる。奇数鎖脂肪酸誘導体（例えば、ｏｃ−脂肪酸、ｏｃ−脂肪エステル、ｏｃ−脂肪アルデヒド、ｏｃ−脂肪アルコールまたはｅｃ−炭化水素）などの所望する生成物の存在を試験するとき、限定はしないが、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、質量分析（ＭＳ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、水素炎イオン化検出器付きＧＣ（ＧＣ−ＦＩＤ）、ＧＣ−ＭＳおよびＬＣ−ＭＳなどのアッセイを使用することができる。ポリペプチドの発現を試験するとき、限定はしないが、ウェスタンブロットおよびドットブロットなどの技術を使用してもよい。
本明細書で使用される場合、「微生物」という用語は、古細菌、細菌および真核生物のドメインの原核および真核微生物種を意味し、後者には酵母および糸状菌、原生動物、藻類および高等原生動物が含まれる。「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」および「微生物細胞（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌ）」（すなわち、微生物の細胞）は「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」と同義に使用され、顕微鏡を用いてのみ見ることができる細胞または小生物を指す。
いくつかの実施形態では、宿主細胞（例えば、親細胞）は微生物細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ヒューミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、プレウロタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈａｍｏｎａｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）またはプロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）属から選択される微生物細胞である。
他の実施形態では、宿主細胞は、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）細胞、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）細胞、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）細胞、バチルス・リケニフォフミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｏｆｏｒｍｉｓ）細胞、バチルス・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）細胞、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）細胞、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）細胞、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ）細胞、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞、バチルス・クラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃｌａｕｓｉｉ）細胞、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）細胞、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞またはバチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）細胞である。
他の実施形態では、宿主細胞は、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）細胞、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）細胞、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）細胞、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）細胞、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）細胞、アスペルギルス・フミガータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｅｓ）細胞、アスペルギルス・フェチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）細胞、アスペルギルス・ニディランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）細胞、アスペルギルス・ニガ−（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）細胞、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）細胞、ヒューミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）細胞、ヒューミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ）細胞、ロドコッカス・オパクス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）細胞、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）細胞またはムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｃｈｅｉ）細胞である。
さらに他の実施形態では、宿主細胞はストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）細胞またはストレプトマイセス・ムリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）細胞である。
さらに他の実施形態では、宿主細胞はアクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である。
さらに他の実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃｖｌ細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞またはＰＣ１２細胞である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核植物、藻類、ラン藻、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、紅色非硫黄細菌、好極限性細菌、酵母、真菌、それらの操作された生物または合成生物の細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は光依存性であるかまたは炭素を固定する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は独立栄養活性を有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、光の存在下などにおいて光独立栄養活性を有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、光の非存在下において従属栄養性または混合栄養性である。
ある種の実施形態では、宿主細胞はアラビドプシス・タリアナ（Ａｖａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、パニカム・ウィルガツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）、ミスカンサス・ギガンテス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）、ジー・メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ボツリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓｅ ｂｒａｕｎｉｉ）、クラミドモナス・レインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ドナリエナ・サリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌａ ｓａｌｉｎａ）、シネココッカス種ＰＣＣ７００２、シネココッカス種ＰＣＣ７９４２、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）種ＰＣＣ６８０３、サーモシネココッカス・エロンガタス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｅｓ）ＢＰ−１、クロロビウム・テピダム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、クロロフレクサス・オウランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｊｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉｃｕｓ）、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、ロドスピリラム・ラブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、ロドバクター・カプスラータ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｒｉｓ）、クロストリジウム・リュングダーリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、パンテア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）またはザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）の細胞である。ある種の実施形態では、宿主細胞は、クロレラ・フスカ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｆｕｓｃａ）、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、クロレラ・ケスレリ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉ）、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・サッカロフィラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）、クロレラ・エリプソイディア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）、プロトテカ・スタグノラ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｓｔａｇｎｏｒａ）、プロトテカ・ポロトリセンシズ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｐｏｒｔｏｒｉｃｅｎｓｉｓ）、プロトテカ・モリフォルミス（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ）、プロトテカ・ウィッカハミイ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）またはプロトテカ・ゾフィ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｚｏｐｆｉｉ）の細胞である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は細菌細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はグラム陽性細菌細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はグラム陰性細菌細胞である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞はＥ．コリ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｅ．コリ細胞は、Ｂ株、Ｃ株、Ｋ株またはＷ株Ｅ．コリ細胞である。
本発明のある種の実施形態では、宿主細胞は輸送タンパク質を発現（または過剰発現）するために操作されている。輸送タンパク質は、ポリペプチドおよび有機化合物（例えば、脂肪酸またはそれらの誘導体）を宿主細胞の外に運び出すことができる。
本明細書で使用される場合、「代謝的に操作された」または「代謝操作」という用語は、例えば、本明細書で記載したような組換え微生物細胞などの組換え細胞におけるｏｃ−β−ケトアシル−ＡＣＰ、ｏｃ−アシル−ＡＣＰまたはｏｃ−脂肪酸誘導体などの所望する代謝物を生成するための合理的な経路設計ならびに生合成遺伝子、オペロンに関連する遺伝子に対応するポリヌクレオチドおよびこのようなポリヌクレオチドの制御要素のアセンブリーを含む。「代謝操作」はさらに、所望する経路に導く中間体と競合する競合代謝経路の低下、破壊またはノックアウトを含む遺伝子操作および適切な培養条件を使用した転写、翻訳、タンパク質安定性およびタンパク質機能の調節および最適化による代謝流の最適化を含むことができる。「生合成遺伝子」は、宿主細胞にとって内在性（天然）であってもよく（すなわち、宿主細胞から改変されていない遺伝子）、あるいは宿主細胞にとって外来性であることによってかまたは組換え細胞における突然変異誘発、組換えおよび／または外来性（異種）発現制御配列との関連によって改変されることによって、宿主細胞にとって外来性（異種）であってもよい。生合成遺伝子は、「生合成ポリペプチド」または「生合成酵素」をコードする。
「生合成経路」という用語はまた「代謝経路」とも呼ばれ、１化学種を別の化学種に変換する生合成酵素によって触媒される一連の生化学反応を指す。本明細書で使用される場合、「脂肪酸生合成経路」（または、より簡単に、「脂肪酸経路」）という用語は、脂肪酸誘導体（例えば、脂肪酸、脂肪エステル、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、アルカン、アルケン、ケトンなど）を生成する一連の生化学反応を指す。脂肪酸経路には、本明細書で記載したように、脂肪酸誘導体を生成するために操作することができ、いくつかの実施形態では、所望する炭素鎖特性を有する脂肪酸誘導体を生成するためにさらなる酵素と一緒に発現することができる脂肪酸経路生合成酵素（すなわち、「脂肪酸経路酵素」）が含まれる。例えば、本明細書で記載した「奇数鎖脂肪酸生合成経路」（すなわち、「ｏｃ−ＦＡ経路」）には、ｏｃ−脂肪酸誘導体を生成するために十分な酵素が含まれる。
「組換え微生物細胞」という用語は、選択した「親微生物細胞」（すなわち、宿主細胞）に遺伝物質を導入し、それによって親微生物細胞の細胞生理機能および生化学的機能を改変または変化させることによって、遺伝的に改変した（すなわち、操作された）微生物細胞（すなわち、微生物）を指す。遺伝物質の導入によって、組換え微生物細胞は親微生物細胞と比較して新たな、または改善された特性、例えば、新たな細胞内代謝物または既存の細胞内代謝物をより多量に生成する能力などを獲得する。本明細書で提供する組換え微生物細胞は、例えば、適切な炭素源からｏｃ−アシル−ＡＣＰ中間体またはｏｃ−脂肪酸誘導体を生成するための経路に関与する複数の生合成酵素（例えば、ｏｃ−ＦＡ経路酵素などの脂肪酸経路酵素）を発現する。親微生物細胞に導入された遺伝物質は、ｏｃ−脂肪酸誘導体の生成のための生合成経路（すなわち、生合成酵素）に関与する１種または複数の酵素をコードする遺伝子（複数可）または遺伝子の一部を含有していてもよく、代わりにまたはさらに、プロモーター配列などのこのような生合成酵素をコードする遺伝子の発現および／または発現の調節のためのさらなる要素を含んでいてもよい。したがって、本明細書で記載した組換え微生物細胞は、本明細書で記載したｏｃ−脂肪酸（ｏｃ−ＦＡ）生合成経路に関与する生合成酵素を発現または過剰発現するように遺伝的に操作されている。
「組換え微生物細胞」および「組換え微生物」という用語は、特定の組換え微生物細胞／微生物を指すだけでなく、このような細胞の後代または可能性のある後代も指すことを理解されたい。
組換え微生物細胞は、親微生物細胞に導入された遺伝物質を含むことの代わりに、あるいは、それに加えて、親微生物細胞の細胞生理学的機能および生化学的機能を変化させる遺伝子またはポリヌクレオチドの低下、破壊、欠失または「ノックアウト」を含んでいてもよい。遺伝子またはポリヌクレオチドの低下、破壊、欠失または「ノックアウト」（遺伝子またはポリヌクレオチドの「減衰」としても知られている）があっても、組換え微生物細胞は、親微生物細胞と比較して新たなまたは改善された特性（例えば、新たな、またはより多量の細胞内代謝物を生成する能力、所望する経路による代謝物の流れを改善する能力、および／または望ましくない副生成物の生成を低下させる能力）を獲得する。
奇数鎖脂肪酸誘導体を生成するための組換え微生物細胞の操作
多くの微生物細胞は通常、直鎖状脂肪族鎖が主に偶数の炭素原子を含有する直鎖脂肪酸を生成し、奇数の炭素原子を含有する直鎖状脂肪族鎖を有する脂肪酸の生成量は一般的に比較的少ない。Ｅ．コリなどのこのような微生物細胞によって生成される直鎖状奇数鎖脂肪酸（ｏｃ−ＦＡ）および他の直鎖状奇数鎖脂肪酸誘導体（ｏｃ−ＦＡ誘導体）の量が比較的少ないのは、場合によってはこのような細胞中に存在するプロピオニル−ＣｏＡが低レベルなためであり得る。このような細胞は主に、脂肪酸生合成にプライマー分子としてアセチル−ＣｏＡを利用して脂肪酸の大部分をもたらし、このような細胞によって生成される他の脂肪酸誘導体は直鎖状偶数鎖脂肪酸（ｅｃ−ＦＡ）および他の直鎖状偶数鎖脂肪酸誘導体（ｅｃ−ＦＡ誘導体）である。
本発明は、親微生物によって生成されるプロピオニル−ＣｏＡと比較して増加した量のプロピオニル−ＣｏＡを生成するように微生物を操作することによって、操作された微生物が親微生物によって生成されるｏｃ−ＦＡ誘導体の量と比較してより多量（力価）のｏｃ−ＦＡ誘導体を生成し、かつ／または親微生物によって生成される脂肪酸誘導体組成物におけるｏｃ−ＦＡ誘導体の割合と比較して高い割合のｏｃ−ＦＡ誘導体を有する脂肪酸誘導体組成物を生成するという発見に一部基づいている。
最終的な目的は、工業規模での炭素源からの開始した（例えば、炭水化物またはバイオマスなど）、環境的に信頼のおける対費用効果の高い、ｏｃ−ＦＡ誘導体を含む脂肪酸誘導体の生成方法を実現することなので、微生物によって生成されるｏｃ−ＦＡ誘導体分子の収量の改善および／または微生物によって生成される脂肪酸誘導体分子の組成の最適化（偶数鎖生成物に対する奇数鎖生成物の割合の増加などによって）が所望される。したがって、奇数鎖脂肪酸生成をもたらす経路を通る代謝流を増加させるために、様々な経路の中間体を過剰生成する戦略を検討した。糖などの開始物質からプロピオニル−ＣｏＡへ、奇数鎖アシル−ＡＣＰ（ｏｃ−アシル−ＡＣＰ）中間体を通り、ｏｃ−ＦＡ誘導体生成物への代謝流を目指す経路は、工業的に有用な微生物において操作することができる。
一態様では、本発明は、組換え微生物細胞を炭素源の存在下で、ポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で培養したとき、プロピオニル−ＣｏＡの生合成に関与する、および／またはｏｃ−アシル−ＡＣＰ中間体の生合成に関与する酵素活性を有するポリペプチド（例えば、酵素）をコードする１種または複数のポリヌクレオチドを含む組換え微生物細胞を含む。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞はさらに、脂肪酸誘導体酵素活性を有するポリペプチドをそれぞれコードする１種または複数のポリヌクレオチドを含み、組換え微生物細胞は、炭素源の存在下で、ポリヌクレオチドを発現するために十分な条件下で培養したとき、奇数鎖脂肪酸誘導体を生成する。本発明はまた、本発明の組換え微生物細胞を培養することを含む奇数鎖長脂肪酸誘導体を含む組成物の作製方法を含む。本発明はまた、微生物細胞によって生成されるプロピオニル−ＣｏＡの量を増加させる方法および微生物細胞によって生成される奇数鎖脂肪酸誘導体の量または割合を増加させる方法およびさらなる検討によって明らかな他の特性を含む。
組換え微生物細胞は、糸状菌、藻類、酵母または細菌などの原核細胞（例えば、Ｅ．コリまたはバチルス種）であってもよい。
一般的に、奇数鎖脂肪酸誘導体［奇数鎖脂肪酸、奇数鎖脂肪エステル（奇数鎖脂肪酸メチルエステル（ｏｃ−ＦＡＭＥ）、奇数鎖脂肪酸エチルエステル（ｏｃ−ＦＡＥＥ）および奇数鎖ワックスエステルを含む）、奇数鎖脂肪アルデヒド、奇数鎖脂肪アルコールおよび奇数鎖前駆体の脱カルボニル化もしくは脱カルボキシル化による、偶数鎖アルカン、偶数鎖アルケン、偶数鎖末端オレフィン、偶数鎖内部オレフィンおよび偶数鎖ケトンなどの偶数鎖炭化水素］は、本発明の組換え微生物細胞において図１Ｂで示した奇数鎖脂肪酸生合成経路（「ｏｃ−ＦＡ経路」）を介して生成することができる。
奇数鎖脂肪酸誘導体を生成するために、組換え微生物細胞は、脂肪アシル鎖伸長プロセスを開始するための「プライマー」としてプロピオニル−ＣｏＡを利用する。図１Ｂに示したように、脂肪アシル伸長プロセスは、最初に、図１Ｂの工程（Ｄ）に示したように、最初の奇数鎖β−ケトアシル−ＡＣＰ中間体（例えば、３−オキソバレリル−ＡＣＰ）を形成するために、β−ケトアシルＡＣＰ合成酵素活性を有する酵素（例えば、β−ケトアシルＡＣＰ合成酵素ＩＩＩ酵素）によって触媒される奇数鎖長プライマー分子プロピオニル−ＣｏＡとマロニル−ＡＣＰ分子の縮合を必要とする。奇数鎖β−ケトアシル−ＡＣＰ中間体は、最初の奇数鎖アシル−ＡＣＰ中間体を形成するために、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）複合体によってβ炭素でのケト還元、脱水およびエノイル還元を受け、図１Ｂの工程（Ｅ）に示したように、奇数炭素鎖長（「ｏｃ−アシル−ＡＣＰ」）の増加したアシル−ＡＣＰ中間体を形成するために、マロニル−ＡＣＰとの縮合、ケト還元、脱水およびエオニル還元のサイクルをさらに受けて、サイクル当たり２個の炭素単位を追加する。ｏｃ−アシル−ＡＣＰ中間体は、図１Ｂの工程（Ｆ）に示したように、１種または複数の脂肪酸誘導体酵素と反応し、奇数鎖脂肪酸誘導体（ｏｃ−ＦＡ誘導体）生成物を生じる。これは、比較的低レベルのプロピオニル−ＣｏＡを生成する細胞（例えば、野生型Ｅ．コリ細胞など）におけるプロセスとは対照的である。このような細胞は、偶数の炭素原子を有する直鎖脂肪酸を主に生成し、奇数の炭素原子を有する直鎖脂肪酸は低量または微量である。図１Ａに示したように、偶数鎖長プライマー分子アセチル−ＣｏＡは最初に、図１Ａの工程（Ｄ）に示したように、偶数鎖β−ケトアシル−ＡＣＰ中間体（例えば、アセトアセチル−ＡＣＰ）を形成するためにマロニル−ＡＣＰ分子と縮合し、今度は図１Ａの工程（Ｅ）に示したように偶数炭素鎖長（「ｅｃ−アシル−ＡＣＰ」）の増加したアシル−ＡＣＰ中間体を形成するために、同様に、ケト還元、脱水、エオニル還元およびさらなるマロニル−ＡＣＰ分子との縮合のＦＡＳ触媒サイクルを受け、同様にサイクル当たり２個の炭素単位を追加する。ｅｃ−アシル−ＡＣＰ中間体は、図１Ａの工程（Ｆ）に示したように、１種または複数の脂肪酸誘導体酵素と反応し、偶数鎖脂肪酸誘導体を生じる。
プロピオニル−ＣｏＡ「プライマー」分子は、いくつかの方法によって本発明の組換え微生物細胞のｏｃ−ＦＡ生合成経路に供給することができる。微生物細胞におけるプロピオニル−ＣｏＡの生成を増加させる方法には、限定しないが、以下が含まれる。
プロピオニル−ＣｏＡは、親微生物細胞の天然の生合成機構によって生成することができる（例えば、親微生物細胞に対して内在性の酵素によって）。親微生物細胞において生成されるプロピオニル−ＣｏＡの量の増加を所望するならば、プロピオニル−ＣｏＡの生成に寄与する親微生物細胞に対して内在性の１種または複数の酵素を組換え微生物細胞において過剰発現させることができる。
プロピオニル−ＣｏＡは、図２に示したように、中間体α−ケトブチレートを通る代謝流の進路を変える内在性酵素を過剰発現させる、および／または外来性酵素を発現させるように細胞を操作することによって生成することができる。このような経路の操作で使用するための非限定的な酵素の例を以下の表１および表２に挙げる。
プロピオニル−ＣｏＡは、図３に示したように、中間体メチルマロニル−ＣｏＡを通るスクシニル−ＣｏＡからの代謝流の進路を変える内在性酵素を過剰発現させる、および／または外来性酵素を発現させるように細胞を操作することによって生成することができる。このような経路の操作で使用するための非限定的な酵素の例を以下の表３に挙げる。
アプローチ例において、プロピオニル−ＣｏＡは、中間体マロン酸セミアルデヒドおよび３−ヒドロキシプロピオン酸を通るマロニル−ＣｏＡからの代謝流の進路を変える内在性酵素を過剰発現させる、および／または外来性酵素を発現させるように細胞を操作することによって生成することができる。このような経路の操作で使用するための非限定的な酵素の例は、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１０２０１０６８Ａ１号に挙げられている。
別のアプローチにおいて、プロピオニル−ＣｏＡは、中間体ラクトイル−ＣｏＡおよびアクリロイル−ＣｏＡを通るＤ−ラクテートからの代謝流の進路を変える内在性酵素を過剰発現させる、および／または外来性酵素を発現させるように細胞を操作することによって生成することができる。このような経路の操作で使用するための非限定的な酵素の例は、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１０２０１０６８Ａ１号に挙げられている。
前述のように、奇数鎖伸長プロセスの開始には、ｏｃ−β−ケトアシル−ＡＣＰ中間体を形成するためにプロピオニル−ＣｏＡとマロニル−ＡＣＰ分子との縮合が必要である。この工程は、図１Ｂの（Ｄ）部に表したように、組換え微生物細胞において、基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性、好ましくはβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＩＩ活性を有する酵素によって（例えば、ＥＣ２．３．１．１８０）触媒される。酵素は、組換え微生物細胞にとって内在性であってもよく、または組換え微生物細胞にとって外来性であってもよい。
一実施形態では、基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有する親微生物細胞にとって内在性のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、組換え微生物細胞において発現するか、または過剰発現する。別の実施形態では、親微生物細胞に対して外来性である、基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、組換え微生物細胞において発現する。
ｏｃ−ＦＡ経路（図１Ｂ）の工程（Ｄ）において生成されるｏｃ−β−ケトアシル−ＡＣＰ中間体は、例えば、ＩＩ型ＦＡＳ複合体などの脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）複合体によって触媒されるベータ炭素でのケト還元、脱水およびエノイル還元、マロニル−ＡＣＰ分子とのさらなる縮合の連続的サイクルによる伸長を受けることができ、それによって図１Ｂの工程（Ｅ）によって表されるｏｃ−アシル−ＡＣＰ中間体の長い奇数炭素鎖に２個の炭素単位が追加される。一実施形態では、組換え微生物細胞にとって天然な内在性ＦＡＳ複合体は、マロニル−ＡＣＰとの縮合／ケト還元／脱水／エノイル還元のサイクルを触媒して、ｏｃ−アシル−ＡＣＰ中間体を生成する。
奇数鎖脂肪酸誘導体（ｏｃ−脂肪酸、ｏｃ−脂肪エステル、ｏｃ−脂肪アルデヒド、ｏｃ−脂肪アルコール、ｅｃ−ケトンおよびｅｃ−炭化水素）は、以下に詳細を記載するように、ｏｃ−アシル−ＡＣＰ中間体から生成することができる。したがって、いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞はさらに、それぞれ脂肪酸誘導体酵素活性を有するペプチドをコードする１種または複数のポリヌクレオチド配列、例えば、チオエステラーゼ（例えば、ＴｅｓＡ）、デカルボキシラーゼ、カルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ、例えば、ＣａｒＡ、ＣａｒＢまたはＦａｄＤ９）、アルコール脱水素酵素／アルデヒドレダクターゼ、アルデヒドデカルボニラーゼ（ＡＤＣ）、脂肪アルコール形成アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＲ）、アシルＡＣＰレダクターゼ（ＡＡＲ）、エステル合成酵素、アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＡＣＲ１）、ＯｌｅＡ、ＯｌｅＣＤまたはＯｌｅＢＣＤを含み、組換え微生物細胞を炭素源の存在下でポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で培養したとき、微生物細胞は、ｏｃ−脂肪酸、ｏｃ−脂肪エステル（ｏｃ−脂肪酸メチルエステル、ｏｃ−脂肪酸エチルエステル、ｏｃ−ワックスエステルなど）ｏｃ−脂肪アルデヒド、ｏｃ−脂肪アルコール、ｅｃ−ケトンまたはｅｃ−炭化水素（ｅｃ−アルカン、ｅｃ−アルケン、ｅｃ−末端オレフィンまたはｅｃ−内部オレフィンなど）を含む組成物を生成する。本発明はまた、本発明の組換え微生物細胞を培養することを含むｏｃ−脂肪酸誘導体の生成方法を含む。
増加した量のプロピオニル−ＣｏＡを生成させるための微生物細胞の操作
一態様では、本発明には、微生物細胞によって生成される奇数鎖脂肪酸誘導体の量を増加させる方法が含まれ、増加した量のプロピオニル−ＣｏＡを生成させるために親微生物細胞を操作することが含まれる。増加した量のプロピオニル−ＣｏＡを生成させるための親微生物細胞の操作は、例えば、（ａ）アスパルトキナーゼ活性、ホモセリン脱水素酵素、ホモセリンキナーゼ活性、スレオニン合成酵素活性およびスレオニンデアミナーゼ活性を有するポリペプチド、（ｂ）（Ｒ）−シトラマル酸合成酵素活性、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性およびベータ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド、または（ｃ）メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性を有するポリペプチドならびにメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性およびメチルマロニルカルボキシルトランスフェラーゼ活性を有する１種または複数のポリペプチドならびに適宜メチルマロニルエピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現するために細胞を操作することによって実現することができ、少なくとも１種のポリペプチドが組換え微生物細胞にとって外来性であるか、または少なくとも１種のポリヌクレオチドの発現が、親微生物細胞おけるポリヌクレオチドの発現と比較して組換え微生物細胞においてモジュレートされており、組換え微生物細胞は、炭素源の存在下でポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で培養したとき、同条件下で培養した親微生物細胞によって生成されるプロピオニル−ＣｏＡの量に対してより多量のプロピオニル−ＣｏＡを生成する。
いくつかの実施形態では、（ａ）によるポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１種のポリペプチドは、外来性ポリペプチドである（例えば、親微生物細胞以外の生物から生じるポリペプチドまたは親微生物細胞にとって天然のポリペプチドの変異体）。場合によって、（ａ）によるポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１種のポリペプチドは、内在性ポリペプチドであり（すなわち、親微生物細胞にとって天然のポリペプチド）、内在性ポリペプチドは組換え微生物細胞において過剰発現する。
いくつかの実施形態では、（ｂ）によるポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１種のポリペプチドは、外来性ポリペプチドである。場合によって、（ｂ）によるポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１種のポリペプチドは、内在性ポリペプチドであり、内在性ポリペプチドは組換え微生物細胞において過剰発現する。
いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞は、（ａ）による１種または複数のポリヌクレオチドおよび（ｂ）による１種または複数のポリヌクレオチドを含む。場合によって、（ａ）または（ｂ）によるポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１種のポリペプチドは、外来性ポリペプチドである。場合によって、（ａ）または（ｂ）によるポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１種のポリペプチドは、内在性ポリペプチドであり、内在性ポリペプチドは組換え微生物細胞において過剰発現する。
いくつかの実施形態では、（ｃ）によるポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１種のポリペプチドは、外来性ポリペプチドである。場合によって、（ｃ）によるポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１種のポリペプチドは、内在性ポリペプチドであり、内在性ポリペプチドは組換え微生物細胞において過剰発現する。
親（例えば、非操作）微生物細胞と比較してプロピオニル−ＣｏＡを通る代謝流が増加した組換え微生物細胞を得るために親微生物細胞を操作することによって、操作された微生物細胞は、親微生物細胞によって生成されるｏｃ−ＦＡ誘導体の量と比較してより多量（力価）のｏｃ−ＦＡ誘導体を生成し、かつ／または親微生物細胞によって生成される脂肪酸誘導体組成物におけるｏｃ−ＦＡ誘導体の割合と比較してより高い割合のｏｃ−ＦＡ誘導体を有する脂肪酸誘導体組成物を生成する。
したがって、別の態様では、本発明は、微生物細胞によって生成される奇数鎖脂肪酸誘導体の量または割合を増加させる方法であって、同じ条件下で培養した親微生物細胞によって生成されるプロピオニル−ＣｏＡの量に対してより多量のプロピオニル−ＣｏＡを生成する、またはより多量を生成することができる組換え微生物細胞を得るために親微生物細胞を操作することを含み、組換え微生物細胞および親微生物細胞をそれぞれ炭素源の存在下で、組換え微生物細胞におけるプロピオニル−ＣｏＡのレベルを親微生物細胞と比較して増加させるために有効な同一の条件下で培養したとき、組換え微生物細胞の培養が親微生物細胞によって生成される奇数鎖脂肪酸誘導体の量または割合に対してより多量またはより高い割合の奇数鎖脂肪酸誘導体を生成する方法を含む。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞は、以下により詳細に記載するような経路（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の１種または複数によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、少なくとも１種のコードされたポリペプチドが組換え微生物細胞にとって外来性であるか、または少なくとも１種のポリヌクレオチドの発現が親微生物細胞におけるポリヌクレオチドの発現と比較して組換え微生物細胞においてモジュレートされている。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞は、脂肪酸誘導体酵素活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞は、基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
組換え微生物細胞におけるプロピオニル−ＣｏＡ生成の増加に有用な代謝経路の例を以下に記載する。組換え細胞においてプロピオニル−ＣｏＡ生成を増加させるためのこれらの経路の例は、本発明の範囲を限定するものではなく、細胞におけるプロピオニル−ＣｏＡ生成を増加させ、かつ／またはプロピオニル−ＣｏＡ中間体を通る細胞における代謝流を増加させる任意の適切な代謝経路が本発明の組換え微生物細胞、組成物および方法で使用するために適切であることを理解されたい。プロピオニル−ＣｏＡ生成を増加させ、かつ／またはプロピオニル−ＣｏＡ中間体を通る代謝流を増加させる代謝経路は、したがって、本発明の組換え微生物細胞、組成物および方法における使用に適切である。
α−ケト酪酸中間体を介するプロピオニル−ＣｏＡの生成
様々なアミノ酸生合成経路の操作が、微生物細胞におけるそれらの様々なアミノ酸の生成を増加させるために示されてきた（Ｇｕｉｌｌｏｕｅｔ Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６５：３１００−３１０７ （１９９９）； Ｌｅｅ Ｋ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｓｙｓｔ． Ｂｉｏｌ．
３：１４９ （２００７））。アミノ酸生合成経路が、Ｅ．コリにおける短鎖分枝アルコールの生成において使用されてきた（Ａｔｓｕｍｉ Ｓ． ａｎｄ Ｌｉａｏ Ｊ．Ｃ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７４（２４）： ７８０２−７８０８ （２００８）； Ｃａｎｎ Ａ．Ｆ． ａｎｄ Ｌｉａｏ Ｊ．Ｃ．， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８１（１）：８９−９８（２００８）； Ｚｈａｎｇ Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ． １０５（５２）：２０６５３−２０６５８（２００８））。
ある種のアミノ酸生合成代謝物の流れの進路を中間体α−ケト酪酸（アルファ−ケト酪酸、２−ケト酪酸、２−ケトブタノエート、２−オキソ酪酸および２−オキソブタノエートとしても知られている）の生成に向けることによって、プロピオニル−ＣｏＡ生成の増加が引き起こされる。したがって、一実施形態では、本発明は、組換え微生物細胞を炭素源の存在下で、ポリヌクレオチドを発現するために十分な条件下で培養したとき、炭素源（例えば、糖などの炭水化物）からα−ケト酪酸への変換に関与する１種または複数の酵素（すなわち、「ｏｃ−ＦＡ経路酵素」）をコードするポリヌクレオチドを含む組換え微生物細胞を含む。α−ケト酪酸分子は、ｏｃ−ＦＡ経路による直鎖状奇数鎖脂肪酸誘導体の生成におけるプライマーとして役立つプロピオニル−ＣｏＡの微生物生成における中間体である（図１Ｂ）。
ピルビン酸脱水素酵素複合体（ＰＤＣ）は、細菌においてプロピオニル−ＣｏＡを生成するためにα−ケト酪酸の酸化的脱カルボキシル化を触媒する（Ｄａｎｃｈｉｎ， Ａ．
ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １９３： ４７３ −４７８ （１９８４）； Ｂｉｓｓｗａｎｇｅｒ， Ｈ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ． ２５６：８１５−８２２ （１９８１））。ピルビン酸脱水素酵素複合体は、３種類の活性：ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ｅ１）、ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ（Ｅ２）およびジヒドロリポイル脱水素酵素（Ｅ３）を含有する多酵素複合体である。ピルビン酸以外のα−ケト酸基質を利用する類似の触媒様式を使用する他の適切なケト酸脱水素酵素複合体も存在する。ＴＣＡサイクルα−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体が一例である。一実施形態では、宿主細胞にとって内在性のピルビン酸脱水素酵素複合体（すなわち、親細胞にとって天然のピルビン酸脱水素酵素複合体）が、α−ケト酪酸からプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒するために利用される。他の実施形態では、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼおよび／またはジヒドロリポイル脱水素酵素活性を有する１種または複数のＰＤＣ複合体ポリペプチドをコードする遺伝子が、組換え微生物細胞において過剰発現する。α−ケト酪酸からプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒する他の酵素または酵素複合体は、α−ケト酪酸からプロピオニル−ＣｏＡへの代謝流をさらに増加させるために組換え微生物細胞において発現または過剰発現することができる。
α−ケト酪酸からプロピオニル−ＣｏＡへの変換はまた、α−ケト酪酸からプロピオン酸への変換およびプロピオン酸からプロピオニル−ＣｏＡへの活性化によって実現することができる。α−ケト酪酸からプロピオン酸への変換は、ｐｏｘＢ遺伝子によってコードされるＥ．コリピルビン酸オキシダーゼなどのピルビン酸オキシダーゼ（ＥＣ．１．２．３．３）によって触媒され得る（Ｇｒａｂａｕ ａｎｄ Ｃｒｏｎａｎ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４（１３）： ５４４９−５４６０ （１９８６））。天然のＥ．コリＰｏｘＢ酵素は、α−ケト酪酸およびピルビン酸と反応し、ピルビン酸に選択性を示すが、Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｒｏｎａｎ（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ３５２：７１７−７２４ （２０００））は、α−ケト酪酸に対して完全な活性を保持し、ピルビン酸に対する活性が低下しているＰｏｘＢ突然変異体酵素について記載した。プロピオン酸からプロピオニル−ＣｏＡへの活性化は、アセチル−ＣｏＡ合成酵素などのアシル−ＣｏＡ合成酵素によって触媒することができる（Ｄｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｅｍ
Ｓｏｃ． ２３： １６９６ （１９８６））。酵母アセチル−ＣｏＡ合成酵素は、プロピオン酸からプロピオニル−ＣｏＡへの活性化を触媒することが示された（Ｐａｔｅｌ
ａｎｄ Ｗａｌｔ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２： ７１３２ （１９８７））。プロピオン酸はまた、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）およびホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）の作用によってプロピオニル−ＣｏＡに活性化され得る。
親微生物細胞に対して内在性の１種または複数の酵素は、組換え微生物細胞において操作されたｏｃ−ＦＡ生合成経路の酵素と基質を競合することがあるか、または中間体（例えば、α−ケト酪酸）を分解するかそうでなければｏｃ−ＦＡ生合成経路から進路を変えさせることがあり、このような望ましくない内在性酵素をコードする遺伝子は、組換え微生物細胞による奇数鎖脂肪酸誘導体の生成を増加させるために減衰させることができる。例えば、Ｅ．コリにおいて、ＡＨＡＳ Ｉ（例えば、ｉｌｖＢＮ遺伝子によってコードされる）、ＡＨＡＳ ＩＩ（例えば、ｉｌｖＧＭ遺伝子によってコードされる）およびＡＨＡＳ ＩＩＩ（例えば、ｉｌｖＩＨ遺伝子によってコードされる）などの内在性アセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）複合体は、α−ケト酪酸からα−アセト−α−ヒドロキシ酪酸への変換を触媒し、したがって、代謝流の進路をプロピオニル−ＣｏＡから変えさせ、ｏｃ−ＦＡ生成を低下させることがある。したがって、１種または複数の内在性ＡＨＡＳ遺伝子の発現を欠如させるか、またはそうでなければ低下させることによって、組換え微生物細胞における生合成をよりプロピオニル−ＣｏＡに向かわせ、最終的により奇数鎖脂肪酸生成に向かわせることができる。ｏｃ−ＦＡ生合成経路酵素と競合し得る他の内在性酵素には、α−アセト−α−ヒドロキシ酪酸から２，３−ジヒドロキシ−３−メチル吉草酸への変換を触媒するアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ活性を備えた酵素（例えば、ｉｌｖＣ遺伝子によってコードされる）および２，３−ジヒドロキシ−３−メチル吉草酸から２−ケト−３−メチル吉草酸への変換を触媒するジヒドロキシ酸脱水酵素活性を備えた酵素（例えば、ｉｌｖＤ遺伝子によってコードされる）が含まれ、これらの遺伝子の１種または複数の発現を欠如させるかまたはそうでなければ低下させることによって、組換え微生物細胞における生合成をよりプロピオニル−ＣｏＡに向かわせ、最終的により奇数鎖脂肪酸生成に向かわせることができる。
以下の経路例のいずれかまたは両方は、一般的なα−ケト酪酸中間体を通る代謝流を増加させて、細胞内でのプロピオニル−ＣｏＡ生成の増加を引き起こすために、組換え微生物細胞において操作することができる。これらの経路例を図２に示し、以下により詳細に記載する。
経路Ａ（スレオニン中間体）
図２の経路（Ａ）に表される一般的なα−ケト酪酸中間体を導く第１の経路には、スレオニン生合成酵素による中間体スレオニンの生成、それに続くスレオニン脱水酵素活性を備えた酵素によって触媒されるスレオニンからα−ケト酪酸への脱アミノ化が関与する。
経路（Ａ）において、スレオニンへの代謝流の増加は、アスパラギン酸からアスパルチルリン酸への変換を触媒するアスパラギン酸キナーゼ活性（例えば、ＥＣ２．７．２．４；アスパルトキナーゼ活性とも称される）、アスパルチルリン酸からアスパラギン酸セミアルデヒドへの変換を触媒するアスパラギン酸−セミアルデヒド脱水素酵素活性（例えば、ＥＣ１．２．１．１１）、アスパラギン酸セミアルデヒドからホモセリンへの変換を触媒するホモセリン脱水素酵素活性（例えば、ＥＣ１．１．１．３）、ホモセリンからＯ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンへの変換を触媒するホモセリンキナーゼ活性（例えば、ＥＣ２．７．１．３９）およびＯ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンからスレオニンへの変換を触媒するスレオニン合成酵素活性（例えば、ＥＣ４．２．３．１）を有する酵素を含む、スレオニン生合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドを発現することによって実現することができる。スレオニン中間体を通る代謝流を増加させるために、上記に挙げた活性全てが組換え微生物細胞において操作される必要はなく、場合によっては、親微生物細胞において既に存在する活性（例えば、親微生物細胞において天然の遺伝子によって生成される活性を有するポリペプチド）は上記に挙げた工程を触媒するために十分であろう。一実施形態では、組換え微生物細胞は、アスパラギン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドであって、アスパラギン酸からアスパルチルリン酸への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素活性を有するポリペプチドであって、アスパルチルリン酸からアスパラギン酸セミアルデヒドへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ホモセリン脱水素酵素活性を有するポリペプチドであって、アスパラギン酸セミアルデヒドからホモセリンへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ホモセリンキナーゼ活性を有するポリペプチドであって、ホモセリンからＯ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、スレオニン合成酵素活性を有するポリペプチドであって、Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンからスレオニンへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから選択される１種または複数のポリヌクレオチドを組換えによって発現するために操作され、組換え微生物細胞は、親微生物細胞と比較して経路中間体スレオニンを通る代謝流が増加している。場合によっては、組換えによって発現したポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、同じ条件下で培養したとき、親微生物細胞における濃度と比較してより高い濃度で組換え微生物細胞中に存在する、すなわち、このポリペプチドは組換え細胞において「過剰発現」する。例えば、組換え発現したポリヌクレオチドは、同じ条件下で培養したとき、親微生物細胞において通常発現するよりも高い濃度で組換え微生物細胞においてポリヌクレオチドを発現するプロモーターに操作可能に連結することができる。一実施形態では、アスパラギン酸キナーゼおよびホモセリン脱水素酵素活性を有する二官能性ＴｈｒＡをコードするＥ．コリｔｈｒＡ遺伝子を使用する。別の実施形態では、アスパラギン酸キナーゼおよびホモセリン脱水素酵素活性を有し、親ＴｈｒＡ酵素に対してフィードバック阻害が低下した変異体酵素をコードする突然変異体Ｅ．コリｔｈｒＡ遺伝子を使用する（ＴｈｒＡ＊と称する；Ｏｇａｗａ−Ｍｉｙａｔａ，Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６５：１１４９−１１５４ （２００１）； Ｌｅｅ Ｊ．−Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８５： ５４４２−５４５１ （２００３））。
スレオニンは、スレオニンデアミナーゼ活性（例えば、ＥＣ４．３．１．１９；スレオニンアンモニアリアーゼ活性としても知られており、以前はＥＣ４．２．１．１６、スレオニン脱水酵素として分類された）を有する酵素によってα−ケト酪酸に脱アミノ化することができる。一実施形態では、親微生物細胞に既に存在する（すなわち、内在性）スレオニンデアミナーゼ活性は、スレオニンからα−ケト酪酸への変換を触媒するために十分である。別の実施形態では、組換え微生物細胞は、スレオニンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドであって、スレオニンからα−ケト酪酸への変換を触媒するポリペプチドを組換えによって発現するように操作する。いくつかの実施形態では、スレオニンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドは組換え微生物細胞において過剰発現する。
経路（Ａ）の操作に使用するための酵素およびこのような酵素をコードするポリヌクレオチドの非限定的な例を表１に挙げる。
Figure 0006609274
Figure 0006609274
例えば、上記のＥＣ番号によって分類されるポリペプチドについては、いずれもワールドワイドウェブで利用可能な関連のあるデータベース［ＫＥＧＧデータベース（東京大学）、ＰＲＯＴＥＩＮまたはＧＥＮＥデータベース（Ｅｎｔｒｅｚデータベース；ＮＣＢＩ）、ＵＮＩＰＲＯＴＫＢまたはＥＮＺＹＭＥデータベース（ＥｘＰＡＳｙ；スイスバイオインフォマティクス研究所）およびＢＲＥＮＤＡデータベース（Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）］を検索することによって、ポリペプチドをさらに同定することができる。例えば、アスパルトキナーゼポリペプチドはさらに、ＥＣ２．７．２．４に分類されたポリペプチドを検索することによって同定することができ、ホモセリン脱水素酵素ポリペプチドはさらに、ＥＣ１．１．１．３に分類されたポリペプチドを検索することによって同定することができ、ホモセリンキナーゼポリペプチドはさらに、ＥＣ２．７．１．３９に分類されたポリペプチドを検索することによって同定することができ、スレオニン合成酵素ポリペプチドはさらに、ＥＣ４．２．３．１に分類されたポリペプチドを検索することによって同定することができ、スレオニンデアミナーゼポリペプチドはさらに、ＥＣ４．３．１．１９に分類されたポリペプチドを検索することによって同定することができる。
いくつかの実施形態では、親脂肪酸経路ポリペプチド（例えば、表１で記載した、またはＥＣ番号によってもしくはポリペプチドの例に対する相同性によって同定されたポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、上記の酵素活性（例えば、アスパルトキナーゼ活性、ホモセリン脱水素酵素活性、ホモセリンキナーゼ活性、スレオニン合成酵素活性、スレオニンデアミナーゼ活性）および親ポリペプチドの特性と比較して改善された特性を有する変異体ポリペプチドを生成する当技術分野で周知の方法を使用して改変され、この特性は、例えば、組換え微生物細胞を培養する条件下での触媒活性の増加または安定性の改善、細胞代謝物による、または培養培地成分などによる阻害の低下（例えば、フィードバック阻害の低下）などの操作する微生物細胞および／または経路により適合している。
経路Ｂ（シトラマル酸中間体）
図２の経路（Ｂ）に表されるように、一般的なα−ケト酪酸中間体を導く第２の経路には、シトラマル酸合成酵素活性を有する酵素を介した中間体シトラマル酸（２−メチルリンゴ酸としても知られている）の生成およびイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼおよびアルコール脱水素酵素活性を有する酵素の作用によるシトラマル酸からα−ケト酪酸への変換が関与する。
アセチル−ＣｏＡとピルビン酸との反応を触媒して（Ｒ）−シトラマル酸を形成するシトラマル酸合成酵素活性（例えば、ＥＣ２．３．１．１８２）は、Ｍ．ヤンナスキイ（配列番号４０）またはＬ．インテロガンス（配列番号４２）のＣｉｍＡなどのＣｉｍＡポリペプチドをコードする、メタノコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉ）またはレプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）などの細菌のｃｉｍＡ遺伝子の発現によって供給することができる（Ｈｏｗｅｌｌ， Ｄ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８１（１）：３３１−３ （１９９９）； Ｘｕ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８６：５４００−５４０９（２００４））。あるいは、例えば、Ａｔｓｕｍｉ Ｓ． ａｎｄ Ｌｉａｏ Ｊ．Ｃ． （Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７４（２４）： ７８０２−７８０８ （２００８））によって記載されたＣｉｍＡ変異体、好ましくはｃｉｍＡ３．７遺伝子によってコードされたＣｉｍＡ３．７変異体（配列番号４１）などの組換え微生物細胞における触媒活性または安定性が改善された、および／またはフィードバック阻害が低下したＣｉｍＡ変異体をコードする改変されたｃｉｍＡ核酸配列を使用することができる。あるいは、レプトスピラ・インテロガンスＣｉｍＡ変異体（配列番号４３）を使用することができる。まず（Ｒ）−シトラマル酸からシトラコン酸へ、次にベータ−メチル−Ｄ−リンゴ酸への変換を触媒するイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性（ＥＣ４．２．１．３３、イソプロピルリンゴ酸脱水酵素とも称する）は、例えば、Ｅ．コリまたはＢ．ズブチリスｌｅｕＣＤ遺伝子によってコードされるヘテロ二量体タンパク質の発現によってもたらすことができる。ベータ−メチル−Ｄ−リンゴ酸から２−ケト酪酸（すなわちα−ケト酪酸）への変換を触媒するアルコール脱水素酵素活性（ＥＣ１．１．１．８５、ベータ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素）は、例えば、Ｅ．コリまたはＢ．ズブチリスｌｅｕＢ遺伝子または酵母ｌｅｕ２遺伝子の発現によってもたらすことができる。脂肪酸経路酵素およびｏｃ−ＦＡ経路の経路（Ｂ）の操作に使用するためのこのような酵素をコードするポリヌクレオチドの非限定的な例を表２に挙げる。
Figure 0006609274
例えば、上記のＥＣ番号によって分類されるポリペプチドについては、いずれもワールドワイドウェブで利用可能な関連のあるデータベース［ＫＥＧＧデータベース（東京大学）、ＰＲＯＴＥＩＮまたはＧＥＮＥデータベース（Ｅｎｔｒｅｚデータベース；ＮＣＢＩ）、ＵＮＩＰＲＯＴＫＢまたはＥＮＺＹＭＥデータベース（ＥｘＰＡＳｙ；スイスバイオインフォマティクス研究所）およびＢＲＥＮＤＡデータベース（Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）］を検索することによって、ポリペプチドをさらに同定することができる。例えば、（Ｒ）−シトラマル酸合成酵素ポリペプチドはさらに、ＥＣ２．３．１．１８２に分類されたポリペプチドを検索することによって同定することができ、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼポリペプチドはさらに、ＥＣ４．２．１．３３に分類されたポリペプチドを検索することによって同定することができ、ベータ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素ポリペプチドはさらに、ＥＣ１．１．１．８５に分類されたポリペプチドを検索することによって同定することができる。
いくつかの実施形態では、親脂肪酸経路ポリペプチド（例えば、表２で記載した、またはＥＣ番号によってもしくはポリペプチドの例に対する相同性によって同定されたポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、上記の酵素活性（例えば、（Ｒ）−シトラマル酸合成酵素活性、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性、ベータ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性）および親ポリペプチドの特性と比較して改善された特性を有する変異体ポリペプチドを生成する当技術分野で周知の方法を使用して改変され、この特性は、親ポリペプチドの特性と比較して、例えば、組換え微生物細胞を培養する条件下での触媒活性の増加または安定性の改善、細胞代謝物による、または培養培地成分などによる阻害の低下（例えば、フィードバック阻害の低下）などの操作する微生物細胞および／または経路により適合している。
メチルマロニル−ＣｏＡを介するプロピオニル−ＣｏＡの生成
経路Ｃ（メチルマロニル−ＣｏＡ中間体）
以下の経路例は、メチルマロニル−ＣｏＡ中間体を通る代謝流を増加させて、細胞内でのプロピオニル−ＣｏＡ生成の増加を引き起こすために組換え微生物細胞において操作することができる。この経路例を図３に示し、以下により詳細に記載する。
代謝流をメチルマロニル−ＣｏＡに向けることによって、プロピオニル−ＣｏＡ生成の増加を引き起こすことができる。したがって、一実施形態では、本発明は、組換え微生物細胞を炭素源の存在下で、ポリヌクレオチドを発現するために十分な条件下で培養したとき、炭素源（例えば、糖などの炭水化物）からスクシニル−ＣｏＡおよびメチルマロニル−ＣｏＡへの変換に関与するものをコードするポリヌクレオチドを含む組換え微生物細胞を含む。スクシニル−ＣｏＡおよびメチルマロニル−ＣｏＡは、ｏｃ−ＦＡ経路による直鎖状奇数鎖脂肪酸誘導体の生成におけるプライマーとして役立つプロピオニル−ＣｏＡの微生物生成における中間体である（図１Ｂ）。
図３に示したようなプロピオニル−ＣｏＡに導く経路（本明細書では「経路（Ｃ）」とも称する）には、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性を有する酵素を介したスクシニル−ＣｏＡからメチルマロニル−ＣｏＡへの変換ならびにメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有する酵素の作用および／またはメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の作用によるメチルマロニル−ＣｏＡからプロピオニル−ＣｏＡへの変換が関与する。場合によっては、使用した特定のメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼまたはメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシルトランスフェラーゼによって利用されるメチルマロニル−ＣｏＡの立体異性体に応じて、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ活性を有する酵素は、（Ｒ）−および（Ｓ）−メチルマロニル−ＣｏＡを相互変換するために利用してもよい。
スクシニル−ＣｏＡは、細胞ＴＣＡサイクルによってこの経路に提供することができる。場合によっては、フマル酸からコハク酸への流れは、例えば、内在性ｆｒｄ（フマル酸レダクターゼ）またはコハク酸もしくはスクシニル−ＣｏＡの生成に関与する他の遺伝子（複数可）の過剰発現によって増加し得る。スクシニル−ＣｏＡからメチルマロニル−ＣｏＡへの変換は、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性（例えば、ＥＣ５．４．９９．２）を有する酵素によって触媒され得る。このような活性は、外来性ｓｃｐＡ（ｓｂｍとしても知られている）遺伝子の発現によって、または内在性ｓｃｐＡ遺伝子の過剰発現によって、組換え微生物細胞に供給することができる。ｓｂｍ遺伝子の一例は、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性を有するＳｂｍポリペプチド（受託番号ＮＰ＿４１７３９２、配列番号５１）をコードするＥ．コリの遺伝子を含む（Ｈａｌｌｅｒ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：４６２２−４６２９ （２０００））。あるいは、例えば、α−サブユニットまたは「大サブユニット」（ＭｕｔＢ、受託番号ＹＰ＿００３６８７７３６）およびベータ−サブユニットまたは「小サブユニット」（ＭｕｔＡ、受託番号ＣＡＡ３３０８９）を含むプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ亜種シャーマニ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｎｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）のメチルマロニル−ＣｏＡムターゼを使用することができる。スクシニル−ＣｏＡからメチルマロニル−ＣｏＡへの変換を触媒するポリペプチドの非限定的例を以下の表３に挙げる。
一実施形態では、メチルマロニル−ＣｏＡからプロピオニル−ＣｏＡへの変換は、メチルマロニル−ＣｏＡのプロピオニル−ＣｏＡへの脱カルボキシル化を触媒するメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性（例えば、ＥＣ４．１．１．４１）を有するポリペプチドによって触媒され得る。このような活性は、外来性ｓｃｐＢ（ｙｇｆＧとしても知られている）遺伝子の発現によって、または内在性ｓｃｐＢ遺伝子の過剰発現によって、組換え微生物細胞に供給することができる。メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼポリペプチドの例には、例えば、Ｅ．コリｓｃｐＢ遺伝子によってコードされるメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼポリペプチド（Ｈａｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、上記）またはサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）もしくはエルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）によってコードされるメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼポリペプチドが含まれる。別の実施形態では、メチルマロニル−ＣｏＡからプロピオニル−ＣｏＡへの変換は、例えば、Ｐ．フロイデンライヒ亜種シャーマニ（ｍｍｄＡ、ＮＢＣＩ受託番号Ｑ８ＧＢＷ６．３）のメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシルトランスフェラーゼなどのメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシルトランスフェラーゼ活性（例えば、ＥＣ２．１．３．１）を有するポリペプチドによって触媒され得る。メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼによって、またはメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシルトランスフェラーゼによって利用されるメチルマロニル−ＣｏＡの立体異性体に応じて、例えば、バチルス・ズブチリス（ｙｑｊＣ；Ｈａｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：４６２２−４６２９ （２０００））またはプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ亜種シャーマニ（ＮＣＢＩ受託番号ＹＰ＿００３６８８０１８）のメチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼなどのメチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ活性（例えば、ＥＣ５．１．９９．１）を有するポリペプチドによって触媒され得る（Ｒ）−メチルマロニル−ＣｏＡと（Ｓ）−メチルマロニル−ＣｏＡとの間の変換が所望されることがある。
親微生物細胞に対して内在性の１種または複数の酵素は、組換え微生物細胞において操作されたｏｃ−ＦＡ生合成経路の酵素と基質を競合することがあるか、または中間体を分解するかそうでなければｏｃ−ＦＡ生合成経路から進路を変えさせることがあり、このような望ましくない内在性酵素をコードする遺伝子は、組換え微生物細胞による奇数鎖脂肪酸誘導体の生成を増加させるために減衰させることができる。例えば、Ｅ．コリにおいて、Ｅ．コリｓｃｐＣ（ｙｇｆＨとしても知られている）遺伝子によってコードされる内在性プロピオニル−ＣｏＡ：スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿４１７３９５）は、プロピオニル−ＣｏＡからスクシニル−ＣｏＡへの変換を触媒し、したがって、プロピオニル−ＣｏＡからの代謝流の進路を変え、ｏｃ−ＦＡ生成を低下させ得る。したがって、ｓｃｐＣ（ｙｇｆＨ）遺伝子の発現を欠如させるか、そうでなければ低下させることは、組換え微生物細胞における生合成をよりプロピオニル−ＣｏＡに向かわせ、最終的により奇数鎖脂肪酸生成に向かわせることができる。
ｏｃ−ＦＡ経路の経路（Ｃ）の操作に使用するための脂肪酸経路酵素およびスクシニル−ＣｏＡからメチルマロニル−ＣｏＡへの変換およびメチルマロニル−ＣｏＡからプロピオニル−ＣｏＡへの変換を触媒するこのような酵素をコードするポリヌクレオチドの非限定的な例を表３に挙げる。
Figure 0006609274
例えば、上記のＥＣ番号によって分類されるポリペプチドについては、いずれもワールドワイドウェブで利用可能な関連のあるデータベース［ＫＥＧＧデータベース（東京大学）、ＰＲＯＴＥＩＮまたはＧＥＮＥデータベース（Ｅｎｔｒｅｚデータベース；ＮＣＢＩ）、ＵＮＩＰＲＯＴＫＢまたはＥＮＺＹＭＥデータベース（ＥｘＰＡＳｙ；スイスバイオインフォマティクス研究所）およびＢＲＥＮＤＡデータベース（Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）］を検索することによって、ポリペプチドをさらに同定することができる。例えば、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼポリペプチドはさらに、ＥＣ５．４．９９．２に分類されたポリペプチドを検索することによって同定することができ、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼポリペプチドはさらに、ＥＣ４．１．１．４１に分類されたポリペプチドを検索することによって同定することができ、メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシルトランスフェラーゼポリペプチドはさらに、ＥＣ２．１．３．１に分類されたポリペプチドを検索することによって同定することができ、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼポリペプチドはさらに、ＥＣ５．１．９９．１に分類されたポリペプチドを検索することによって同定することができる。
いくつかの実施形態では、親脂肪酸経路ポリペプチド（例えば、表３で記載した、またはＥＣ番号によってもしくはポリペプチドの例に対する相同性によって同定されたポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、上記の酵素活性（例えば、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ活性、メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシルトランスフェラーゼ活性）および親ポリペプチドの特性と比較して改善された特性を有する変異体ポリペプチドを生成する当技術分野で周知の方法を使用して改変され、この特性は、例えば、組換え微生物細胞を培養する条件下での触媒活性の増加または安定性の改善、細胞代謝物による、または培養培地成分などによる阻害の低下（例えば、フィードバック阻害の低下）などの操作する微生物細胞および／または経路により適合している。
ｏｃ−ＦＡ誘導体の増加した量を生成させるための微生物細胞の操作
プロピオニル−ＣｏＡからｏｃ−β−ケトアシル−ＡＣＰ
前述したように、プロピオニル−ＣｏＡは、ｏｃ−ＦＡ誘導体の生成におけるその後のＦＡＳ触媒伸長工程のプライマーとして役立つ。このプロセスの開始には、ｏｃ−β−ケトアシル−ＡＣＰ中間体３−オキソバレリル−ＡＣＰを形成するためにプロピオニル−ＣｏＡとマロニル−ＡＣＰ分子との縮合が必要である（図１Ｂ）。この開始工程は、図１Ｂの工程（Ｄ）に表されるように、組換え微生物細胞において、基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有する酵素［例えば、ＩＩＩ型β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素（例えば、ＥＣ２．３．１．１８０）］によって触媒される。
特定の微生物のβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素の基質特異性は、その微生物の脂肪酸組成物を反映することが多い（Ｈａｎ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８０：４４８１−４４８６ （１９９８）； Ｑｕｉ， Ｘ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． １４：２０８７−２０９４ （２００５））。例えば、Ｅ．コリＦａｂＨ酵素は、プロピオニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡを利用するが、高い割合で直鎖状偶数鎖脂肪酸を生成することを反映してアセチル−ＣｏＡに対して非常に高い選択性を有し（Ｃｈｏｉ， Ｋ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８２：３６５−３７０ （２０００）； Ｑｕｉ， ｅｔ ａｌ．，
上記）、一方、ストレプトコッカス・ニューモネア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の酵素は、様々な直鎖状および分枝鎖脂肪酸を生成することを反映して、炭素の長さが２個と４個の間の短い直鎖アシル−ＣｏＡプライマーならびに様々な分枝鎖アシル−ＣｏＡプライマーを利用する（Ｋｈａｎｄｅｋａｒ Ｓ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：３００２４−３００３０ （２００１））。基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は一般的に、広範なアシル−ＣｏＡ基質特異性を備えたβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素を含有する微生物細胞から得ることができる。基質特異性の広いβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素源は、例えば、バチルス（例えば、Ｂ．ズブチリス）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）［例えば、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）］、ストレプトマイセス［例えば、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）］およびプロピオニバクテリウム（例えば、Ｐ．フロイデンライヒ亜種シャーマニ）などの分枝鎖脂肪酸を含む様々な脂肪酸構造物を生成する細菌を含むことができる。特に好ましいβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素には、内在性ＦａｂＨによって示されるよりもプロピオニル−ＣｏＡ対アセチル−ＣｏＡにより選択性を有するものが含まれる。例えば、Ｅ．コリ細胞を操作するとき、好ましいβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素は、限定はしないが、Ｂ．ズブチリスＦａｂＨ１（Ｃｈｏｉ
ｅｔ ａｌ． ２０００、上記）、ストレプトマイセス・グラウセンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｌａｕｓｃｅｎｓ）ＦａｂＨ（Ｈａｎ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８０：４４８１−４４８６ （１９９８））、ストレプトコッカス・ニューモネアＦａｂＨ（Ｋｈａｎｄｅｋａｒ Ｓ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：３００２４−３００３０ （２００１）およびスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＦａｂＨ（Ｑｕｉ， Ｘ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． １４：２０８７−２０９４ （２００５））を含むことができる。
１種または複数の内在性の酵素は、組換え微生物細胞において操作されたｏｃ−ＦＡ生合成経路の酵素と基質を競合することがあるか、またはｏｃ−ＦＡ経路中間体を分解するかそうでなければｏｃ−ＦＡ生成から代謝流の進路を変えさせることがあり、このような望ましくない内在性酵素をコードする遺伝子は、組換え微生物細胞によるｏｃ−ＦＡ誘導体の生成を増加させるために減衰させることができる。例えば、Ｅ．コリの内在性ｆａｂＨがコードするβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素は、基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するが、３炭素プロピオニル−ＣｏＡ分子よりも２炭素アセチル−ＣｏＡ分子に対してより選択性を有する（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ． ２０００、上記）。したがって、Ｅ．コリｆａｂＨ遺伝子を発現する細胞は、脂肪酸合成のプライマーとして選択的にアセチル−ＣｏＡを利用し、インビボにおいて偶数鎖脂肪酸分子を主に生成する。内在性ｆａｂＨ遺伝子の発現を欠如させるかそうでなければ低下させ、内在性ＦａｂＨによって示されるよりもプロピオニル−ＣｏＡにより選択性を有するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素をコードする外来性遺伝子を発現することによって（例えば、Ｅ．コリを操作するとき、内在性Ｅ．コリＦａｂＨを、Ｂ．ズブチリスＦａｂＨ１またはアセチル−ＣｏＡよりプロピオニル−ＣｏＡに対して、Ｅ．コリＦａｂＨによって示されるよりも高い選択性を有する代わりの外来性ＦａｂＨで置換する）、組換え微生物細胞における代謝流をよりｏｃ−β−ケトアシル−ＡＣＰ中間体に、最終的にはよりｏｃ−ＦＡ誘導体の生成に向けることができる。
脂肪酸経路酵素およびｏｃ−ＦＡ経路の工程Ｄの操作に使用するためのこのような酵素をコードするポリヌクレオチドの非限定的な例を表４に挙げる。
Figure 0006609274
Figure 0006609274
β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ポリペプチドは、例えば、ＥＣ２．３．１．１８０に分類されるポリペプチドについて、いずれもワールドワイドウェブで利用可能である関連のあるデータベース［ＫＥＧＧデータベース（東京大学）、ＰＲＯＴＥＩＮまたはＧＥＮＥデータベース（Ｅｎｔｒｅｚデータベース；ＮＣＢＩ）、ＵＮＩＰＲＯＴＫＢまたはＥＮＺＹＭＥデータベース（ＥｘＰＡＳｙ；スイスバイオインフォマティクス研究所）およびＢＲＥＮＤＡデータベース（Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）］を検索することによって、さらに同定することができる。
β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ポリペプチドはまた、以下に挙げた配列モチーフの１種または複数を含むポリペプチドについて、Ｐｒｏｓｉｔｅデータベース（ＥｘＰＡＳｙプロテオミクスサーバー、スイスバイオインフォマティクス研究所）などの配列パターンデータベースを検索することによってさらに同定することができる。これは、例えば、ＥｘＰａＳｙプロテオミクスサーバーのワールドワイドウェブサイトで利用可能なＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅツールを使用することによって容易に実現される。
一実施形態では、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ポリペプチドは、以下から選択される１種または複数の配列モチーフを含み、
D-T-[N,S]D-[A,E]-W-I-x(2)-[M,R]-T-G-I-x-[N,E]-R-[R,H] （配列番号１４）
[S,A]-x-D-x(2)-A-[A,V]-C-[A,S]-G-F-x(3)-[M,L]-x(2)-A （配列番号１５）
D-R-x-T-[A,I]-[I,V]-x-F-[A,G]-D-G-A-[A,G]-[G,A]-[A,V] （配列番号１６）
H-Q-A-N-x-R-I-[M,L] （配列番号１７）
G-N-T-[G,S]-A-A-S-[V,I]-P-x(2)-[I,L]-x(6)-G （配列番号１８）
[I,V]-x-L-x(2)-F-G-G-G-[L,F]-[T,S]-W-G （配列番号１９）
括弧のそれぞれのアミノ酸残基は特定の位置の代替アミノ酸残基を示し、各ｘは任意のアミノ酸残基を示し、「ｘ（ｎ）」中の各ｎは連続した一連のアミノ酸残基におけるｘ残基の数を示す。
いくつかの実施形態では、親脂肪酸経路ポリペプチド（例えば、表４で記載した、またはＥＣ番号もしくはモチーフもしくはポリペプチドの例に対する相同性によって同定されたポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性および親ポリペプチドの特性と比較して改善された特性を有する変異体ポリペプチドを生成するために当技術分野で周知の方法を使用して改変され、この特性は、例えば、触媒活性の増加および／またはプロピオニル−ＣｏＡに対する特異性の増加（例えば、アセチル−ＣｏＡと比較して）、組換え微生物細胞を培養する条件下での触媒活性の改善または安定性の改善、細胞代謝物による、または培養培地成分などによる阻害の低下（例えば、フィードバック阻害の低下）などの操作する微生物および／または経路により適合している。
本発明は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え微生物細胞であって、前記ポリペプチドが配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４６、１４７、１４８および１４９の１つに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含み、ポリペプチドが、基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有する組換え微生物細胞を含む。場合によっては、ポリペプチド配列は、配列番号１４〜１９から選択される１種または複数の配列モチーフを含む。本発明はまた、前記ポリペプチド配列を含む単離されたポリペプチドおよび前記ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、ポリペプチドは、Ｗ３１０位またはそれと同等の位置に置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドはＷ３１０Ｇ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、置換Ｗ３１０Ｇを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、アセチル−ＣｏＡよりもプロピオニル−ＣｏＡに対してより高い特異性を示す。
本明細書で使用される場合、「基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチド」には、基質プロピオニル−ＣｏＡを供給したとき検出可能なレベルのβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するいかなるポリペプチドも含まれる。
β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素のプロピオニル−ＣｏＡなどの基質に対する酵素活性および特異性は、公知の方法を使用して測定することができる。例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ
ａｌ． （Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８２（２）：３６５−３７０ （２０００））は、アセチル−ＣｏＡ基質に対するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素（「ＦａｂＨ」）活性を測定するために適切なフィルターディスクアッセイ（ｆｉｌｔｅｒｅｄ ｄｉｓｃ ａｓｓａｙ）について詳細に記載しており、このアッセイは基質としてプロピオニル−ＣｏＡをアッセイするために改変することができる。アッセイは、最終容量４０μＬ中ＡＣＰ ２５μＭ、β−メルカプトエタノール１ｍＭ、マロニル−ＣｏＡ ６５μＭ、［１−１４Ｃ］アセチル−ＣｏＡ ４５μＭ（比放射能約４５．８Ｃｉ／ｍｏｌ）、Ｅ．コリＦａｄＤ（０．２μｇ）および０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を含有する。β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性をアッセイするために、［１−１４Ｃ］アセチル−ＣｏＡは１４Ｃ標識プロピオニル−ＣｏＡで置換することができる。反応は、ＦａｂＨを添加することによって開始し、混合物は３７℃で１２分間インキュベートする。次に、一定量３５ｍＬを取り出し、Ｗｈａｔｍａｎ３ＭＭフィルターディスクに沈着させる。次に氷冷トリクロロ酢酸を３回交換してこのディスクを洗浄する（それぞれ２０ｍＬ／ディスクで２０分間）。次に、連続洗浄それぞれにおいて、トリクロロ酢酸の濃度は１０％から５％、さらに１％に低下させる。フィルターを乾燥させ、シンチレーションカクテル３ｍＬ中でカウントする。
あるいは、ＦａｂＨ活性は、生成物を分離し定量するために放射活性標識したマロニル−ＣｏＡ基質およびゲル電気泳動を使用して測定することができる（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ． ２０００、上記）。アッセイ混合物は、最終容量４０μＬ中ＡＣＰ ２５μＭ、β−メルカプトエタノール １ｍＭ、［２−１４Ｃ］マロニル−ＣｏＡ ７０μＭ（比放射能約９Ｃｉ／ｍｏｌ）、ＣｏＡ基質（例えば、アセチル−ＣｏＡまたはプロピオニル−ＣｏＡ）４５μＬ、ＦａｄＤ（０．２μｇ）、ＮＡＤＰＨ １００μＭ、ＦａｂＧ（０．２μｇ）および０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を含有する。反応は、ＦＡｂＨを添加することによって開始することができる。混合物を３７℃で１２分間インキュベートし、その後氷スラリー中に置き、次いでゲルロ−ディング緩衝液を添加し、混合物は、尿素０．５Ｍから２．０Ｍを含有する立体構造感受性１３％ポリアクリルアミドゲルにロードする。電気泳動は２５℃において３２ｍＡ／ゲルで実施することができる。その後、ゲルを乾燥させ、バンドはゲルをホスホイメージャースクリーン（ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ ｓｃｒｅｅｎ）に暴露させて定量する。比放射能は、アッセイ中における生成物形成対ＦａｂＨタンパク質濃度のプロットの勾配から算出することができる。
ｏｃ−β−ケトアシル−ＡＣＰからｏｃ−アシル−ＡＣＰ
図１Ｂの工程（Ｅ）に示されるように、工程（Ｄ）において生成するｏｃ−β−ケトアシル−ＡＣＰ中間体３−オキソバレリル−ＡＣＰは、例えば、ＩＩ型脂肪酸合成酵素複合体などの脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）複合体によって触媒されるマロニル−ＡＣＰとの縮合／ケト還元／脱水／エノイル還元の連続的サイクルによる伸長を受けることができ、それによって得られたｏｃ−アシル−ＡＣＰの長い脂肪酸鎖に２個の炭素単位が追加される。一実施形態では、微生物細胞にとって内在性のＦＡＳ酵素複合体（例えば、ＩＩ型ＦＡＳ複合体など）は、ｏｃ−アシル−ＡＣＰ中間体を生成するためのマロニル−ＡＣＰとの縮合／ケト還元／脱水／エノイル還元のサイクルを触媒するために使用される。
ｏｃ−アシル−ＡＣＰからｏｃ−ＦＡ誘導体
奇数鎖脂肪酸誘導体は、本発明の組換え微生物細胞によって生成することができる。図１Ｂの工程（Ｆ）に示したように、ｏｃ−アシル−ＡＣＰ中間体は、それぞれが脂肪酸誘導体化活性を有する１種または複数の酵素（すなわち、脂肪酸誘導体酵素）によって触媒される反応においてｏｃ−ＦＡ誘導体に変換される。脂肪酸誘導体酵素は、例えば、ｏｃ−アシル−ＡＣＰを最初のｏｃ−ＦＡ誘導体に変換するか、または最初のｏｃ−ＦＡ誘導体を第２のｏｃ−ＦＡ誘導体に変換することができる。場合によっては、最初のｏｃ−ＦＡ誘導体は、異なる脂肪酸誘導体化活性を有する酵素によって第２のｏｃ−ＦＡ誘導体に変換される。場合によっては、第２のｏｃ−ＦＡ誘導体はさらに、別の脂肪酸誘導体酵素によって第３のｏｃ−ＦＡ誘導体に変換されるなどとなる。
したがって、いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞はさらに、１種または複数のポリヌクレオチドを含み、それぞれのポリヌクレオチドは脂肪酸誘導体酵素活性を有するポリペプチドをコードし、組換え微生物細胞は、炭素源の存在下で、ポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で培養したとき、ｏｃ−ＦＡ誘導体を生成する。
様々な実施形態では、脂肪酸誘導体化活性には、組換え微生物細胞がｏｃ−脂肪酸を生成するチオエステラーゼ活性、組換え微生物細胞がｏｃ−脂肪エステルを生成するエステル合成酵素活性、組換え微生物細胞がｏｃ−脂肪アルデヒドを生成する脂肪アルデヒド生合成活性、組換え微生物細胞がｏｃ−脂肪アルコールを生成する脂肪アルコール生合成活性、組換え微生物細胞がｅｃ−ケトンを生成するケトン生合成活性または組換え微生物細胞がｅｃ−炭化水素を生成する炭化水素生合成活性が含まれる。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞は、２種以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、各ポリペプチドが脂肪酸誘導体酵素活性を有するポリヌクレオチドを含む。
さらに特定の実施形態では、組換え微生物細胞は、前述したような脂肪酸誘導体酵素活性を有する１種または複数のポリペプチドを発現または過剰発現し、組換え微生物細胞はｏｃ−脂肪酸、ｏｃ−脂肪エステル、ｏｃ−ワックスエステル、ｏｃ−脂肪アルデヒド、ｏｃ−脂肪アルコール、ｅｃ−ケトン、ｅｃ−アルカン、ｅｃ−アルカン、ｅｃ−内部オレフィンまたはｅｃ−末端オレフィンを含むｏｃ−ＦＡ組成物を生成する。
以下は、本発明の様々な実施形態による、脂肪酸誘導体酵素およびこのような酵素によって触媒される反応によって生成するｏｃ−ＦＡ誘導体のさらなる例である。
ｏｃ−脂肪酸
一実施形態では、組換え微生物細胞には、チオエステラーゼをコードするポリヌクレオチドが含まれ、組換え微生物細胞によって生成されるｏｃ−アシル−ＡＣＰ中間体はチオエステラーゼ（例えば、３．１．１．５、ＥＣ３．１．２．−、例えば、ＥＣ３．１．２．１４など）によって加水分解され、ｏｃ−脂肪酸の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、ｏｃ−脂肪酸を含む脂肪酸を含む組成物（本明細書では「脂肪酸組成物」とも称する）は、炭素源の存在下で、ポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で組換え細胞を培養することによって生成される。いくつかの実施形態では、脂肪酸組成物には、ｏｃ−脂肪酸およびｅｃ−脂肪酸が含まれる。いくつかの実施形態では、組成物は細胞培養物から回収する。
いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞は、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび他の脂肪酸誘導体酵素活性を有するポリペプチドをコードする１種または複数のさらなるポリヌクレオチドを含む。このような場合には、チオエステラーゼの作用によって生成するｏｃ−脂肪酸は、様々な脂肪酸誘導体酵素活性を有する１種または複数の酵素によって、例えば、ｏｃ−脂肪エステル、ｏｃ−脂肪アルデヒド、ｏｃ−脂肪アルコールまたはｅｃ−炭化水素などの別のｏｃ−脂肪酸誘導体に変換される。
一実施形態では、ｏｃ−アシル−ＡＣＰ中間体はチオエステラーゼと反応してｏｃ−脂肪酸を形成する。ｏｃ−脂肪酸は、細胞培養物から回収することができるか、またはｏｃ−脂肪エステル、ｏｃ−脂肪アルデヒド、ｏｃ−脂肪アルコールまたはｅｃ−末端オレフィンなどの別のｏｃ−ＦＡ誘導体にさらに変換することができる。
脂肪酸またはそれらから作製される脂肪酸誘導体の鎖長は、ある種のチオエステラーゼの発現を改変することによって選択することができる。チオエステラーゼは、生成した脂肪酸の鎖長ならびにそれらから作製された誘導体の鎖長に影響を及ぼす。したがって、組換え微生物細胞は、好ましい脂肪酸または脂肪酸誘導体化基質の生成を増加させるために、１種または複数の選択されるチオエステルを発現、過剰発現するように、発現が減衰するように、または発現しないように操作することができる。例えば、Ｃ１０脂肪酸は、Ｃ１０脂肪酸の生成を選択するチオエステラーゼを発現させ、およびＣ１０脂肪酸以外の脂肪酸の生成を選択するチオエステラーゼ（例えば、Ｃ１４脂肪酸の生成を好むチオエステラーゼ）を減衰することによって生成することができる。これは、炭素鎖長１０個を有する脂肪酸の比較的均一な集団をもたらす。他の場合、Ｃ１４脂肪酸は非Ｃ１４脂肪酸を生成する内在性チオエステラーゼを減衰させ、Ｃ１４−ＡＣＰを使用するチオエステラーゼを発現することによって生成することができる。場合によっては、Ｃ１２脂肪酸は、Ｃ１２−ＡＣＰを使用するチオエステラーゼを発現し、非Ｃ１２脂肪酸を生成するチオエステラーゼを減衰することによって生成することができる。脂肪酸過剰生成は、当技術分野で公知の方法、例えば、細胞溶解後の放射活性前駆体、ＨＰＬＣまたはＧＣ−ＭＳの使用によって検証することができる。
ｏｃ−脂肪酸経路で使用するためのチオエステラーゼおよびそれらをコードするポリヌクレオチドのさらなる非限定的例を表５および参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１０／０７５４８３号に挙げる。
Figure 0006609274
ｏｃ−脂肪エステル
一実施形態では、組換え微生物細胞は例えば、ｏｃ−脂肪酸メチルエステルまたはｏｃ−脂肪酸エチルエステルまたはｏｃ−ワックスエステルなどのｏｃ−脂肪エステルを生成する。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞によって生成されるｏｃ−脂肪酸は、ｏｃ−脂肪エステルに変換される。
いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞は、エステル合成酵素活性（本明細書では「エステル合成酵素ポリペプチド」または「エステル合成酵素」とも称する）を有するポリペプチド（すなわち、酵素）をコードするポリヌクレオチドを含み、ｏｃ−脂肪エステルは組換え微生物細胞において発現または過剰発現したエステル合成酵素ポリペプチドによって触媒される反応によって生成される。いくつかの実施形態では、ｏｃ−脂肪エステルを含む脂肪エステルを含む組成物（本明細書では「脂肪エステル組成物」とも称する）は、炭素源の存在下で、ポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で組換え細胞を培養することによって生成される。いくつかの実施形態では、脂肪エステル組成物には、ｏｃ−脂肪エステルおよびｅｃ−脂肪エステルが含まれる。いくつかの実施形態では、組成物は細胞培養物から回収する。
エステル合成酵素ポリペプチドには、例えば、ＥＣ２．３．１．７５として分類されるエステル合成酵素ポリペプチド、または限定はしないが、ワックス−エステル合成酵素、アシル−ＣｏＡ：アルコールトランスアシラーゼ、アシルトランスフェラーゼまたは脂肪アシル−ＣｏＡ：脂肪アルコールアシルトランスフェラーゼを含むアシル−チオエステルから脂肪エステルへの変換を触媒する任意の他のポリペプチドが含まれる。例えば、ポリヌクレオチドは、ワックス／ｄｇａｔ、シモンドシア・キネンシス（Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）種ＡＤＰ１株、アルカニボラックス・ボルクメンシス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ）、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、フンディバクター・ジャデンシス（Ｆｕｎｄｉｂａｃｔｅｒ ｊａｄｅｎｓｉｓ）、アラビドプシス・タリアナまたはアルカリゲネス・エウトロフス（Ａｌｋａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）の二官能性エステル合成酵素／アシル−ＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードしていてもよい。特定の実施形態では、エステル合成酵素ポリペプチドは、アシネトバクター種ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ワックス−ｄｇａＴ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ８ＧＧＧ１、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＯ１７３９１）またはシモンドシア・キネンシスワックス合成酵素（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９ＸＧＹ６、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＤ３８０４１）である。特定の実施形態では、エステル合成酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、組換え微生物細胞において過剰発現する。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞はさらにチオエステラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。
別の実施形態では、組換え微生物細胞は、例えば、ｏｃ−脂肪酸メチルエステルまたはｏｃ−脂肪酸エチルエステルなどのｏｃ−脂肪エステルを生成し、組換え微生物細胞は、ＡｔｆＡ１（アルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２から得られたアシルトランスフェラーゼ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ０ＶＫＶ８、ＧｅｎＢａｎｋ ＹＰ＿６９４４６２）またはＡｔｆＡ２（アルカニボラックス・ボルクメンシスＳＫ２から得られた別のアシルトランスフェラーゼ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ０ＶＮＪ６、ＧｅｎＢａｎｋ ＹＰ＿６９３５２４）などの２．３．１．２０として分類されるエステル合成酵素／アシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する。特定の実施形態では、エステル合成酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、組換え微生物細胞において過剰発現する。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞はさらにチオエステラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。
別の実施形態では、組換え微生物細胞は、例えば、ｏｃ−脂肪酸メチルエステルまたはｏｃ−脂肪酸エチルエステルなどのｏｃ−脂肪エステルを生成し、組換え微生物細胞は、ＥＳ９（ｗｓ２遺伝子によってコードされるマリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）ＤＳＭ８７９８から得られたワックスエステル合成酵素、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａ３ＲＥ５１、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢＯ２１０２１）またはＥＳ３７６（ｗｓ１遺伝子によってコードされるマリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカスＤＳＭ８７９８から得られた別のワックスエステル合成酵素、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａ３ＲＥ５０、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢＯ２１０２０）などのエステル合成酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する。特定の実施形態では、エステル合成酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、組換え微生物細胞において過剰発現する。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞はさらにチオエステラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。
これらの実施形態で使用するために適切なエステル合成酵素ポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチドのさらなる非限定的な例には、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／１３６７６２およびＷＯ２００８／１１９０８２に記載されたものが含まれる。
ｏｃ−脂肪アルデヒド
一実施形態では、組換え微生物細胞はｏｃ−脂肪アルデヒドを生成する。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞によって生成されるｏｃ−脂肪酸は、ｏｃ−脂肪アルデヒドに変換される。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞によって生成されるｏｃ−脂肪アルデヒドは、次にｏｃ−脂肪アルコールまたはｅｃ−炭化水素に変換される。
いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞は、脂肪アルデヒド生合成活性（本明細書では「脂肪アルデヒド生合成ポリペプチド」または「脂肪アルデヒド生合成酵素」とも称する）を有するポリペプチド（すなわち、酵素）をコードするポリヌクレオチドを含み、ｏｃ−脂肪アルデヒドは、組換え微生物細胞において発現または過剰発現した脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドによって触媒される反応によって生成される。いくつかの実施形態では、ｏｃ−脂肪アルデヒドを含む脂肪アルデヒドを含む組成物（本明細書では「脂肪アルデヒド組成物」とも称する）は、炭素源の存在下で、ポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で組換え細胞を培養することによって生成される。いくつかの実施形態では、脂肪アルデヒド組成物には、ｏｃ−脂肪アルデヒドおよびｅｃ−脂肪アルデヒドが含まれる。いくつかの実施形態では、組成物は細胞培養物から回収する。
いくつかの実施形態では、ｏｃ−脂肪アルデヒドは、組換え微生物細胞において、カルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）活性（例えば、ｃａｒ遺伝子によってコードされる）などの脂肪アルデヒド生合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現または過剰発現することによって生成される。この実施形態によって有用なカルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）ポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチドの例には、限定はしないが、ＦａｄＤ９（ＥＣ６．２．１．−、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ５０６３１、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿２１７１０６）、ＣａｒＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢＫ７５６８４）、ＣａｒＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＹＰ８８９９７２）および参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１０／０４２６６４に記載された関連するポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞はさらにチオエステラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ｏｃ−脂肪アルデヒドは、組換え微生物細胞において、例えば、ａａｒ遺伝子によってコードされるアシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＡＡＲ）活性を有するポリペプチドなどの脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現または過剰発現することによって生成される。この実施形態によって有用なアシル−ＡＣＰレダクターゼポリペプチドの例には、限定はしないが、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２（ＧｅｎＢａｎｋ ＹＰ＿４００６１１）のアシル−ＡＣＰレダクターゼおよび参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１０／０４２６６４に記載された関連するポリペプチドが含まれる。
いくつかの実施形態では、ｏｃ−脂肪アルデヒドは、組換え微生物細胞において、例えば、ａｃｒ１遺伝子によってコードされるアシル−ＣｏＡレダクターゼ活性（例えば、ＥＣ１．１．２．ｘ）を有するポリペプチドなどの脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現または過剰発現することによって生成される。この実施形態によって有用なアシル−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドの例には、限定はしないが、アシネトバクター種ＡＤＰ１株（ＧｅｎＢａｎｋ ＹＰ＿０４７８６９）のＡＣＲ１および参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１０／０４２６６４に記載された関連するポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞はさらにチオエステラーゼおよびアシル−ＣｏＡ合成酵素をコードするポリヌクレオチドを含む。
ｏｃ−脂肪アルコール
一実施形態では、組換え微生物細胞はｏｃ−脂肪アルコールを生成する。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞によって生成されるｏｃ−脂肪アルデヒドは、ｏｃ−脂肪アルコールに変換される。他の実施形態では、組換え微生物細胞によって生成されるｏｃ−脂肪酸は、ｏｃ−脂肪アルコールに変換される。
いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞は脂肪アルコール生合成活性を有するポリペプチド（すなわち、酵素）（本明細書では「脂肪アルコール生合成ポリペプチド」または「脂肪アルコール生合成酵素」とも称する）をコードするポリヌクレオチドを含み、ｏｃ−脂肪アルコールは、組換え微生物細胞において発現または過剰発現する脂肪アルコール生合成酵素によって触媒される反応によって生成される。いくつかの実施形態では、ｏｃ−脂肪アルコールを含む脂肪アルコールを含む組成物（本明細書では「脂肪アルコール組成物」とも称する）は、炭素源の存在下で、ポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で組換え細胞を培養することによって生成される。いくつかの実施形態では、脂肪アルコール組成物には、ｏｃ−脂肪アルコールおよびｅｃ−脂肪アルコールが含まれる。いくつかの実施形態では、組成物は細胞培養物から回収する。
いくつかの実施形態では、ｏｃ−脂肪アルコールは、組換え微生物細胞において、アルコール脱水素酵素（アルデヒドレダクターゼ）活性、例えば、ＥＣ１．１．１．１などの脂肪アルコール生合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現または過剰発現することによって生成される。この実施形態によって有用なアルコール脱水素酵素ポリペプチドの例には、限定はしないが、Ｅ．コリアルコール脱水素酵素ＹｑｈＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＰ＿００３５６２）および参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／１３６７６２およびＷＯ２００８／１１９０８２に記載された関連するポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞はさらに脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞はさらにチオエステラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ｏｃ−脂肪アルコールは、組換え微生物細胞において、脂肪アルコール形成アシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＦＡＲ）活性、例えば、ＥＣ１．１．１．ｘを有するポリペプチド、などの脂肪アルコール生合成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現または過剰発現することによって生成される。この実施形態によって有用なＦＡＲポリペプチドの例には、限定はしないが、参照により本明細書に参考として組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１０／０６２４８０に記載されたポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞はさらにチオエステラーゼおよびアシル−ＣｏＡ合成酵素をコードするポリヌクレオチドを含む。
ｅｃ−炭化水素
一実施形態では、組換え微生物細胞は、ｅｃ−アルカンまたはｅｃ−アルケン（例えば、ｅｃ−末端オレフィンまたはｅｃ−内部オレフィン）またはｅｃ−ケトンなどのｅｃ−炭化水素を生成する。いくつかの実施形態では、ｏｃ−アシル−ＡＣＰ中間体は脱カルボキシル化によって変換され、１個の炭素原子が除去されてｅｃ−内部オレフィンまたはｅｃ−ケトンを形成する。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞によって生成されるｏｃ−脂肪アルデヒドは、脱カルボニル化によって変換され、１個の炭素原子が除去されてｅｃ−炭化水素を形成する。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞によって生成されるｏｃ−脂肪酸は脱カルボキシル化によって変換され、１個の炭素原子が除去されてｅｃ−末端オレフィンを形成する。
いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞は炭化水素生合成活性を有するポリペプチド（すなわち、酵素）（本明細書では「炭化水素生合成ポリペプチド」または「炭化水素生合成酵素」とも称する）をコードするポリヌクレオチドを含み、ｅｃ−炭化水素は組換え微生物細胞において発現または過剰発現する炭化水素生合成酵素によって触媒される反応によって生成される。いくつかの実施形態では、ｅｃ−炭化水素を含む炭化水素を含む組成物（本明細書では「炭化水素組成物」とも称する）は、炭素源の存在下で、ポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で組換え細胞を培養することによって生成される。いくつかの実施形態では、炭化水素組成物はｅｃ−炭化水素およびｏｃ−炭化水素を含む。いくつかの実施形態では、炭化水素組成物は細胞培養物から回収する。
いくつかの実施形態では、ｅｃ−炭化水素は、組換え微生物細胞において、アルデヒドデカルボニラーゼ（ＡＤＣ）活性（例えば、ＥＣ４．１．９９．５）などの炭化水素生合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、プロクロロコッカス・マリナス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ）ＭＩＴ９３１３（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿８９５０５９）またはノストック・パンクチフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿００１８６５３２５）のアルデヒドデカルボニラーゼをコードするポリヌクレオチドを発現または過剰発現することによって生成される。この実施形態によって有用なアルデヒドデカルボニラーゼおよび関連するポリペプチドのさらなる例には、限定はしないが、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２００８／１１９０８２号およびＷＯ２００９／１４０６９５号に記載されたポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞はさらに脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞はさらにアシル−ＡＣＰレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ｅｃ−末端オレフィンは、組換え微生物細胞において、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２００９／０８５２７８号に記載されているようなデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドなどの炭化水素生合成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現または過剰発現することによって生成される。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞はさらにチオエステラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ｅｃ−内部オレフィンは、組換え微生物細胞において、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２００８／１４７７８１号に記載されているようなＯｌｅＣＤまたはＯｌｅＢＣＤ活性を有するポリペプチドなどの炭化水素生合成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現または過剰発現することによって生成される。
いくつかの実施形態では、ｅｃ−ケトンは、組換え微生物細胞において、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２００８／１４７７８１号に記載されているようなＯｌｅＡ活性を有するポリペプチドなどの炭化水素生合成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現または過剰発現することによって生成される。
ｏｃ−ＦＡ誘導体の飽和レベル
ｏｃ−アシル−ＡＣＰ（次に、前述したような様々なｏｃ−ＦＡ誘導体に変換することができる）の飽和度は、脂肪酸中間体の飽和度を調節することによって制御することができる。例えば、ｓｆａ、ｇｎｓおよびｆａｂファミリーの遺伝子は、ｏｃ−アシル−ＡＣＰの飽和の量を制御するために発現、過剰発現または低下したレベルで発現させる（例えば、減衰させる）ことができる。
ｏｃ−ＦＡ経路ポリペプチドおよびポリヌクレオチド
本開示は、本発明の組換え微生物細胞、方法および組成物において有用なポリヌクレオチドを同定するが、このようなポリヌクレオチドに対する絶対的な配列同一性は必要ないことを認識されたい。例えば、特定のポリヌクレオチド配列中に変化を与え、コードされたポリペプチドの活性をスクリーニングすることができる。このような変化は通常、保存された突然変異およびサイレント突然変異（例えば、コドン最適化など）を含む。改変または突然変異した（すなわち突然変異体）ポリヌクレオチドおよびコードされた変異体ポリペプチドは、当技術分野で公知の方法を使用して、限定はしないが、増加した触媒活性、増加した安定性または減少した阻害（例えば、減少したフィードバック阻害）を含む親ポリペプチドと比較して改善された機能などの所望する機能についてスクリーニングすることができる。
本開示は、本明細書で記載したｏｃ−ＦＡ生合成経路の様々な工程（すなわち、反応）に関与する酵素活性を酵素分類（ＥＣ）番号にしたがって同定し、このようなＥＣ番号に分類されるポリペプチドの例（すなわち、酵素）およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの例を提供する。受託番号および／または配列同定番号（配列番号）によって本明細書で同定したこのようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドの例は、本明細書で記載した組換え微生物細胞を得るために親微生物細胞におけるｏｃ−ＦＡ経路を操作するために有用である。しかし、本明細書で記載したポリペプチドおよびポリヌクレオチドは例であって、限定ではないことを理解されたい。本明細書で記載したポリペプチド例の相同体の配列は、例えば、いずれもワールドワイドウェブで利用可能な国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって提供されているＥｎｔｒｅｚデータベース、スイスバイオインフォマティクス研究所によって提供されているＥｘＰａｓｙデータベース、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇによって提供されているＢＲＥＮＤＡデータベースならびに京都大学および東京大学のバイオインフォマティクスセンターによって提供されているＫＥＧＧデータベースなどのデータベースを使用して当業者は利用可能である。
様々な微生物細胞が本明細書で記載したｏｃ−ＦＡ経路を含有するように改変し、奇数鎖脂肪酸誘導体の生成に適切な組換え微生物細胞を生じることができることをさらに理解されたい。様々な細胞は、本明細書で提供した組換え微生物細胞における使用に適切なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を含む遺伝子物質源を提供することができることも理解されたい。
本開示は、本明細書で記載したｏｃ−ＦＡ生合成経路において使用するために適切な活性を有するポリペプチド（すなわち、酵素）の数多くの例を提供する。このようなポリペプチドは、本明細書では集合的に「ｏｃ−ＦＡ経路ポリペプチド」（あるいは、「ｏｃ−ＦＡ経路酵素」）と称する。本発明の組換え微生物細胞において使用するために適切なｏｃ−ＦＡ経路ポリペプチドの非限定的例は、本明細書の表および説明および実施例に記載する。
いくつかの実施形態では、本発明には、ｏｃ−ＦＡ経路ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（本明細書ではまた、「ｏｃ−ＦＡ経路ポリヌクレオチド」配列と称する）を含む組換え微生物細胞が含まれる。
本発明の組換え微生物細胞におけるｏｃ−ＦＡ経路の操作において使用するために適切なさらなるｏｃ−ＦＡ経路ポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチドは、いくつかの方法によって得ることができる。例えば、ＥＣ番号は、触媒する反応に応じて酵素を分類する。本明細書で記載した生合成経路における反応を触媒する酵素は、例えば、いずれもワールドワイドウェブで利用可能なＫＥＧＧデータベース（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；京都大学および東京大学）、ＵＮＩＰＲＯＴＫＢデータベースまたはＥＮＺＹＭＥデータベース（ＥｘＰＡＳｙプロテオミクスサーバー；スイスバイオインフォマティクス研究所）、ＰＲＯＴＥＩＮデータベースまたはＧＥＮＥデータベース（Ｅｎｔｒｅｚデータベース；国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ））あるいはＢＲＥＮＤＡデータベース（Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）などのデータベースにおける反応に対応するＥＣ番号を検索することによって同定することができる。一実施形態では、ＥＣ番号（本明細書の説明または表の１つで挙げたＥＣ番号など）によって分類される酵素活性を有するｏｃ−ＦＡ経路ポリペプチドをコードするｏｃ−ＦＡ経路ポリヌクレオチドまたはその活性を有するそれらの断片もしくは変異体は、組換え微生物細胞におけるｏｃ−ＦＡ経路の対応する工程の操作において使用する。
いくつかの実施形態では、ｏｃ−ＦＡ経路ポリヌクレオチド配列は、操作する組換え細胞の親細胞にとって内在性のポリペプチドをコードする。いくつかのこのような内在性のポリペプチドは、組換え微生物細胞において過剰発現する。本明細書で使用する場合、「内在性ポリペプチド」とは、組換え微生物細胞を生成するために操作されている親（例えば、野生型）細胞のゲノムによってコードされるポリペプチドを指す。
例えば、内在性ｏｃ−ＦＡ経路ポリペプチドなどのｏｃ−ＦＡ経路ポリペプチドは、任意の適切な手段によって過剰発現させることができる。本明細書で使用する場合、「過剰発現」とは、同じ条件下で対応する親（例えば、野生型）細胞において通常発現されるよりも高い濃度で、細胞においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドを発現すること、あるいは発現を引き起こすことを意味する。例えば、ポリペプチドは、同じ条件下で培養したとき、同種の非組み換え宿主細胞（例えば、親細胞）における濃度と比較して、組換え細胞においてより高い濃度で存在するとき、ペプチドは組換え細胞内で「過剰発現」している。
いくつかの実施形態では、ｏｃ−ＦＡ経路ポリヌクレオチド配列は外来性または異種ポリペプチドをコードする。言い換えると、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、親微生物細胞に対して外来性である。本明細書で使用する場合、「外来性」（または「異種」）ポリペプチドとは、組換え微生物細胞を生成するために操作されている親（例えば、野生型）微生物細胞のゲノムによってコードされていないポリペプチドを指す。このようなポリペプチドはまた、「非天然」ポリペプチドと呼ぶことができる。
ある種の実施形態では、ｏｃ−ＦＡ経路ポリペプチドは本明細書で提供したポリペプチドの例の１つのアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含み、例えば、ｏｃ−ＦＡ経路ポリペプチドは、ポリペプチドの例の配列の相同体、断片または変異体である配列を含むことができる。
本明細書で使用する場合、「相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）」、「相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」および「相同の（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」という用語は、対応するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）相同である配列を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。当業者であれば、２種類以上の配列の相同性の測定方法は熟知しているであろう。簡単に説明すると、２種類の配列の「相同性」の計算は、以下の通り実施することができる。配列を最適な比較のためにアラインさせる（例えば、最適なアラインメントのためにギャップを第１および第２のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の１つまたは両方に導入することができ、比較のために非相同な配列は無視することができる）。好ましい実施形態では、比較のためにアラインさせる第１の配列の長さは、第２の配列の長さの少なくとも約３０％、好ましくは約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％である。その後、第１および第２の配列の対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が、第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められているときは、その分子はその位置において同一である（本明細書で使用する場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同等である）。２種類の配列の間のパーセント同一性は、２種類の配列の最適なアラインメントのために導入することが必要なギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一位置数の関数である。
２種類の配列の間の配列比較およびパーセント相同性（すなわち、パーセント同一性）の測定は、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５（３）： ４０３−４１０ （１９９０））などの数学的アルゴリズムを使用して実現することができる。２種類のアミノ酸配列の間のパーセント相同性はまた、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのどちらかを用いて、ギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４および長さ重み１、２、３、４、５もしくは６を用いて測定することができる（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４８： ４４４−４５３ （１９７０））。２種類のヌクレオチド配列のパーセント相同性はまた、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスおよびギャップ重み４０、５０、６０、７０もしくは８０および長さ重み１、２、３、４、５もしくは６を用いて測定することができる。当業者であれば最初に相同性計算を実施し、それによってアルゴリズムパラメータを適合させることができる。好ましいパラメータセット（および分子が特許請求の範囲の相同性制限内にあるかどうかを決定するためにどのパラメータを適用すべきか医師が不明である場合使用すべきであるパラメータ）は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリクスで、ギャップペナルティ１２，ギャップ拡張ペナルティ４、フレームシフトギャップペナルティ５を用いる。配列アラインメントのさらなる方法は、バイオテクノロジー分野では公知である（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， ６： ２７８ （２００５）； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｊ．， ２７２（２０）： ５１０１−５１０９ （２００５）を参照）。
「同等の位置」（例えば、「同等のアミノ酸位置」または「同等の核酸位置」）とは、本明細書では、本明細書で記載したアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインさせたとき、参照ポリペプチド（または参照ポリヌクレオチド）配列の対応する位置とアラインする試験ポリペプチド（または試験ポリヌクレオチド）配列の位置（例えば、アミノ酸位置または核酸位置）と定義される。試験ポリペプチドの同等のアミノ酸の位置は、参照ポリペプチドの対応する位置と同じ数字の位置番号である必要はなく、同様に、試験ポリヌクレオチドの同等の核酸の位置は、参照ポリヌクレオチドの対応する位置と同じ数字の位置番号である必要はない。
いくつかの実施形態では、ｏｃ−ＦＡ経路ポリペプチドは、本明細書で記載したｏｃ−ＦＡ経路ポリペプチドの例の変異体などの参照（例えば、親）ポリペプチドの変異体である。本明細書で使用する場合「変異体」（あるいは、「突然変異体」）ポリペプチドとは、親（例えば、野生型）ポリペプチドとは少なくとも１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。変異体は、親ポリペプチド配列と比較して、１種または複数の保存的アミノ酸置換を含むことができ、かつ／または１種または複数の非保存的置換を含むことができる。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチド配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０またはそれ以上のアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有する。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドの配列は、親ポリペプチドの配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。
いくつかの実施形態では、ｏｃ−ＦＡ経路ポリペプチドは、本明細書で記載したｏｃ−ＦＡ経路ポリペプチドの例の断片などの参照（例えば、親）ポリペプチドの断片である。「断片」という用語は、４個のアミノ酸残基から全体のアミノ酸配列マイナス１個のアミノ酸残基までの大きさの範囲の完全長ポリペプチドまたはタンパク質のより短い部分を指す。本発明のある種の実施形態では、断片は、ポリペプチドまたはタンパク質のドメイン（例えば、基質結合ドメインまたは触媒ドメイン）の全体のアミノ酸配列を指す。
いくつかの実施形態では、相同体、変異体または断片は、本明細書で定義したような１種または複数の配列モチーフを含む。一実施形態では、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ポリペプチドの相同体、変異体または断片は、配列番号１４〜１９から選択される１種または複数の配列モチーフを含む。配列が特定の配列モチーフを含有することの決定は、例えば、ＥｘＰＡＳｙプロテオミクスサーバーのワールドワイドウェブサイトで利用可能なＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅツールを使用して容易に実現することができる。
ｏｃ−ＦＡポリペプチドは、ｏｃ−ＦＡポリペプチドの生物学的機能または特性に対して実質的な効果を有さない、親ポリペプチドに対して保存的または非必須のアミノ酸置換を有していてもよいことを理解されたい。特定の置換が許容されるかどうか（すなわち、酵素活性などの所望する生物学的機能に悪影響を与えないこと）は、例えば、Ｂｏｗｉｅ
ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４７： １３０６−１３１０ （１９９０））において記載されたように決定することができる。
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野では定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷の極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。
変異体は天然に生じていてもよく、またはインビトロで作出してもよい。特に、変異体は部位特異的突然変異誘発、無作為な化学的突然変異誘発、エキソヌクレアーゼＩＩＩ削除手順または標準的クローニング技術などの遺伝子操作技術を使用して作出することができる。あるいは、このような変異体、断片、類似体または誘導体は、化学合成または改変手順を使用して作出することができる。
変異体の作製方法は当技術分野では周知である。これらには、工業的または研究室適用における価値を高める特性（限定はしないが、触媒活性（代謝回転数）の増加、安定性の改善およびフィードバック阻害の低下を含む）を有するポリペプチドをコードする核酸を生成するために、天然の単離物から得られた核酸配列を改変する手順が含まれる。このような手順では、天然の単離物から得られた配列に関して１種または複数のヌクレオチドが異なる多数の改変された核酸配列が生成され、特徴付けられる。通常、これらのヌクレオチドの違いによって、天然の単離物の核酸によってコードされるポリペプチドに関してアミノ酸の変化が引き起こされる。例えば、変異体は無作為または部位特異的突然変異誘発を使用することによって調製することができる。
変異体はまた、インビボ突然変異誘発によって作出することができる。いくつかの実施形態では、核酸配列における無作為な突然変異は、ＤＮＡ修復経路の１種または複数において突然変異を有するＥ．コリ株などの細菌株における配列の伝播によって生成される。このような「突然変異誘発」株は、野生型株よりも高い無作為突然変異率を有する。これらの株の１種におけるＤＮＡ配列の伝播は、最終的にＤＮＡ内における無作為突然変異を生成するものである。インビボにおける突然変異誘発で使用するために適切な突然変異株は、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ１９９１／０１６４２７号に記載されている。
変異体はまた、カセット突然変異誘発を使用して生成することができる。カセット突然変異誘発では、２本鎖ＤＮＡ分子の小領域を、天然の配列とは異なる合成オリゴヌクレオチド「カセット」と置換する。オリゴヌクレオチドは、完全に、および／または部分的に無作為化された天然配列を含有することが多い。
再帰的アンサンブル突然変異誘発（Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）も変異体の生成に使用することができる。再帰的アンサンブル突然変異誘発は、メンバーのアミノ酸配列は異なるが表現型が関連した突然変異体の多様な集団を生成するために開発されたタンパク質操作（すなわち、タンパク質突然変異誘発）のためのアルゴリズムである。この方法は、一連のコンビナトリアルカセット突然変異誘発を制御するためにフィードバック機構を使用する。再帰的アンサンブル突然変異誘発は、例えば、Ａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８９： ７８１１−７８１５ （１９９２）に記載されている。
いくつかの実施形態では、変異体は指数的アンサンブル突然変異誘発（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を使用して作出される。指数的アンサンブル突然変異誘発は、独特の機能的突然変異体の割合が高いコンビナトリアルライブラリーを生成するための方法であり、変化した各位置において、機能的タンパク質を導くアミノ酸を同定するのと並行して、残基の小群が無作為化される。指数的アンサンブル突然変異誘発は、例えば、Ｄｅｌｅｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｒｅｓ， １１： １５４８−１５５２ （１９９３）に記載されている。
親ポリペプチドの好ましい断片または変異体（例えば、親ｏｃ−ＦＡ経路ポリペプチドの断片または変異体）は、親ポリペプチドの生物学的機能または特性（例えば、酵素活性、熱安定性）のいくつかまたは全てを保持する。いくつかの実施形態では、断片または変異体は、親ポリペプチドの生物学的機能または特性の少なくとも７５％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％）を保持する。他の実施形態では、断片または変異体は、親ポリペプチドの生物学的機能または特性の約１００％を保持する。
いくつかの実施形態では、親ポリペプチドの断片または変異体は、組換え微生物細胞を培養する条件下において、親ポリペプチドに対して増加した触媒活性を示す（例えば、より高い代謝回転数、変化したｐＨ至適性、所望する基質に対して減少したＫｍまたは所望する基質に対して増加したｋｃａｔ／Ｋｍによって反映されるように）。例えば、親ポリペプチドが好熱性細胞にとって内在性（すなわち、好熱性細胞から得られる）場合、および組換え微生物細胞が一般的に好熱性細胞よりも低い温度で培養される場合、親ポリペプチドはより低い温度で著しく低下した活性を示す可能性があり、この場合、変異体ポリペプチドは、そのようなより低い温度で、親ポリペプチドに対して増加した触媒活性（例えば、より高い代謝回転数）を示すことが好ましい。
他の実施形態では、親ポリペプチドの断片または変異体は、組換え微生物細胞を培養する条件下において、親ポリペプチドの安定性に対して改善された安定性を示す。このような安定性は、組換え微生物細胞と親ポリペプチドが得られた細胞との間の温度、イオン強度、ｐＨにおける変化または増殖もしくは培地条件の任意の他の差違に対する安定性を含み得る。例えば、親ポリペプチドが耐冷性細胞から得られる場合、および組換え微生物細胞が一般的に耐冷性細胞よりも高い温度で培養される場合、親ポリペプチドはより高い温度で比較的不安定である可能性があり、この場合、変異体ポリペプチドは、このような高い温度で、親ポリペプチドの安定性に対して改善された安定性を示すことが好ましい。
他の実施形態では、親ポリペプチドの断片または変異体は、組換え微生物細胞を培養する条件下において、親ポリペプチドによって示されるこのような阻害に対して、細胞代謝物による、または培養培地成分による触媒活性の阻害の低下（例えば、フィードバック阻害の低下）を示す。
ある種の実施形態では、ｏｃ−ＦＡ経路ポリペプチドは、親ポリペプチドの相同体、断片または変異体であり、ｏｃ−ＦＡ経路ポリペプチドは、組換え微生物細胞におけるｏｃ−ＦＡ経路反応の実施に有効である。このようなｏｃ−ＦＡ経路ポリペプチドは、本発明の組換え微生物細胞において使用するために適切である。
ｏｃ−ＦＡ経路の反応の実施における試験ポリペプチド（例えば、本明細書で記載したｏｃ−ＦＡ経路ポリペプチドまたはそれらの相同体、断片もしくは変異体）の有効性は、いくつかの方法によって測定することができる。例えば、生化学経路の特定の反応の触媒における試験ポリペプチドの有効性を測定するために、まず、試験する特定の経路反応以外は、問題の生化学経路の反応を触媒するために必要な全活性を含む親細胞を得るために細胞を操作する（必要であれば）（場合によっては、親細胞は、試験する特定の経路反応を触媒する内在性ポリペプチド（複数可）を発現することがあるが、このような場合、内在性活性は試験ポリペプチドの活性による生成物の増加を容易に検出するために十分低いことが好ましい）。適切なプロモーターに操作可能に連結した試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは（例えば、発現ベクターにおいて）、次に親細胞に導入され、試験細胞を生成する。試験細胞および親細胞は、親および試験細胞培養における経路ポリペプチドの発現ならびに試験細胞培養における試験ポリペプチドの発現に十分な同一の条件下で別々に培養する。培養中および／または培養後の様々な時点で、試験細胞培養物および親細胞培養物から試料を採取する。試料は、特定の経路中間体または生成物の存在を分析する。経路中間体または生成物の存在は、限定はしないが、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、質量分析（ＭＳ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、水素炎イオン化検出器付きＧＣ（ＧＣ−ＦＩＤ）、ＧＣ−ＭＳおよびＬＣ−ＭＳを含む方法によって測定することができる。試験細胞培養物試料（複数可）においてｏｃ−ＦＡ経路中間体または生成物が存在すること、および親培養試料（複数可）においてｏｃ−ＦＡ経路中間体または生成物が存在しないこと（または量が低下していること）は、試験ポリペプチドがｏｃ−ＦＡ経路反応の実施において有効であり、本発明の組換え微生物細胞において使用するために適切であることを示唆している。
組換え微生物細胞における奇数鎖脂肪酸誘導体の生成
一態様では、本発明は、奇数鎖脂肪酸誘導体組成物の作製方法であって、炭素源を含有する培養培地中において、組換えポリヌクレオチド配列を発現するために有効な条件下で本発明の組換え微生物細胞を培養することと、生成した奇数鎖脂肪酸誘導体組成物を適宜単離することとを含む方法を含む。
「奇数鎖脂肪酸誘導体組成物」（略して「ｏｃ−ＦＡ誘導体組成物」）は、例えば、奇数鎖脂肪酸、奇数鎖脂肪エステル（例えば、奇数鎖脂肪メチルエステル、奇数鎖脂肪エチルエステル、奇数鎖ワックスエステル）、奇数鎖脂肪アルデヒド、奇数鎖脂肪アルコール、偶数鎖炭化水素（偶数鎖アルカン、偶数鎖アルケン、偶数鎖末端オレフィン、偶数鎖内部オレフィンなど）または偶数鎖ケトンなどの本明細書で定義した奇数鎖脂肪酸誘導体を含む組成物である。同様に、「奇数鎖脂肪酸組成物」は、奇数鎖脂肪酸を含む組成物であり、「奇数鎖脂肪アルコール組成物」は、奇数鎖脂肪アルコールを含む組成物であり、「偶数鎖アルカン組成物」は、偶数鎖アルカンを含む組成物であるなどである。奇数鎖脂肪酸誘導体を含む組成物はまた、偶数鎖脂肪酸誘導体を含んでいてもよいことも理解されたい。
一態様では、本発明は、奇数鎖脂肪酸誘導体を含む組成物の作製方法であって、（ａ）増加した量のプロピオニル−ＣｏＡを生成するために有効な酵素活性を欠如しているか、または量が低下している親微生物細胞において生成するプロピオニル−ＣｏＡの量に対して、組換え微生物細胞において増加した量のプロピオニル−ＣｏＡを生成するために有効な前記酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、少なくとも１種のポリペプチドが組換え微生物細胞にとって外来性であるか、または少なくとも１種のポリヌクレオチドの発現が親微生物細胞におけるポリヌクレオチドの発現と比較して組換え微生物細胞においてモジュレートされているポリヌクレオチド、（ｂ）基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび（ｃ）脂肪酸誘導体酵素活性を有するポリペプチドをコードする１種または複数のポリヌクレオチドを含む組換え微生物細胞（例えば、組換え微生物細胞を含む培養物）を得ることであり、組換え微生物細胞が、炭素源の存在下で、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）によるポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で培養したとき、奇数鎖脂肪酸誘導体および偶数鎖脂肪酸誘導体を含む脂肪酸誘導体組成物を生成することと、炭素源を含有する培養培地中で（ａ）、（ｂ）および（ｃ）によるポリヌクレオチドを発現し、奇数鎖脂肪酸誘導体および偶数鎖脂肪酸誘導体も含む脂肪酸誘導体組成物を生成するために有効な条件下で組換微生物細胞を培養することと、培養培地から組成物を適宜回収することとを含む方法を含む。
いくつかの実施形態では、組成物における脂肪酸誘導体の少なくとも５重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも８０重量％または少なくとも９０重量％が奇数鎖脂肪酸誘導体である。いくつかの実施形態では、脂肪酸誘導体組成物は、少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも２５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも２７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも３００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも３５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも３７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも４００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも４５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも４７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも５５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも５７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも６００ｍｇ／Ｌ、少なくとも６２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも６５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも６７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも７００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも７５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも７７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも８００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも８５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも８７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも９００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも９５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも９７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１３００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１３２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１３５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１３７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１４００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１４２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１４５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１４７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１６００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１６２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１６５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１６７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１８００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１８２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１８５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１８７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１９００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１９２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１９５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１９７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも２０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも６０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００００ｍｇ／Ｌの量で（例えば、力価）、または上述の値の任意の２つによって結びつけられた範囲で奇数鎖脂肪酸誘導体を含む。
様々な実施形態では、脂肪酸誘導体酵素活性には、チオエステラーゼ活性、エステル合成酵素活性、脂肪アルデヒド生合成活性、脂肪アルコール生合成活性、ケトン生合成活性および／または炭化水素生合成活性が含まれる。いくつかの実施形態では、組換え微生物細胞は、２種以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、各ポリペプチドが脂肪酸誘導体酵素活性を有するポリヌクレオチドを含む。
様々な実施形態において、組換え微生物細胞は、奇数鎖脂肪酸、奇数鎖脂肪エステル、奇数鎖ワックスエステル、奇数鎖脂肪アルデヒド、奇数鎖脂肪アルコール、偶数鎖アルカン、偶数鎖アルケン、偶数鎖内部オレフィン、偶数鎖末端オレフィンまたは偶数鎖ケトンを含む組成物を生成する。
様々な実施形態では、組換え微生物細胞は、（ｉ）アスパルトキナーゼ活性、ホモセリン脱水素酵素活性、ホモセリンキナーゼ活性、スレオニン合成酵素活性およびスレオニンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または（ｉｉ）（Ｒ）−シトラマル酸合成酵素活性、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性およびベータ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または（ｉｉｉ）メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性および／またはメチルマロニル−ＣｏＡカルボキシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドあるいは（ｉ）および（ｉｉ）、または（ｉ）および（ｉｉｉ）または（ｉｉ）および（ｉｉｉ）または（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）から選択される、組換え微生物細胞における増加した量のプロピオニル−ＣｏＡの生成に有効な酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、少なくとも１種のポリペプチドが、組換え微生物細胞にとって外来性であるか、または少なくとも１種のポリヌクレオチドの発現が親微生物細胞におけるポリヌクレオチドの発現と比較して組換え微生物細胞においてモジュレートされている。
本発明の方法によって生成される奇数鎖脂肪酸誘導体を含む脂肪酸誘導体組成物は、組換え微生物細胞培養物から回収または単離することができる。本明細書で使用する場合、脂肪酸誘導体などの生成物に関する「単離した」という用語は、細胞成分、細胞培養培地または化学的もしくは合成前駆体から分離した生成物を指す。本明細書で記載した方法によって生成した脂肪酸誘導体は、発酵ブロスならびに細胞質において比較的不混和性であり得る。したがって、脂肪酸誘導体は、細胞内または細胞外のどちらかの有機相において収集することができる。有機相において生成物を収集すると、細胞機能に対する脂肪酸誘導体の影響を少なくすることができ、組換え微生物細胞がより多くの生成物を生成するのを可能にすることができる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法によって生成される脂肪酸誘導体組成物（奇数鎖脂肪酸誘導体を含む）を精製する。本明細書で使用する場合、「精製する」、「精製した」または「精製」という用語は、例えば、単離または分離によって、その環境から分子を除去または単離することを意味する。「実質的に精製された」分子は、それらの関連する他の成分を少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％）含まない。本明細書で使用する場合、これらの用語はまた、試料から混入物を除去することを指す。例えば、混入物の除去は、試料中における他の成分に対する脂肪酸誘導体（例えば、脂肪酸または脂肪アルコールまたは脂肪エステルまたは炭化水素）の割合の増加をもたらすことができる。例えば、脂肪エステルまたは脂肪アルコールを組換え微生物細胞において生成するとき、脂肪エステルまたは脂肪アルコールは、組換え微生物細胞タンパク質の除去によって精製することができる。精製後、試料中の脂肪エステルまたは脂肪アルコールの他の成分に対する割合は増加する。
本明細書で使用する場合、「精製する」、「精製した」および「精製」という用語は、完全に純粋であることを必要としない相対的な用語である。したがって、例えば、脂肪誘導体組成物が組換え微生物細胞内で生成されるとき、精製された脂肪酸誘導体組成物は、他の細胞成分（例えば、核酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物または他の炭化水素）から実質的に分離された脂肪酸誘導体組成物である。
脂肪酸誘導体組成物（奇数鎖脂肪酸誘導体を含む）は、細胞外環境において存在することができるか、または組換え微生物細胞の細胞外環境から単離することができる。ある種の実施形態では、脂肪酸誘導体は、組換え微生物細胞から分泌される。他の実施形態では、脂肪酸誘導体は細胞外環境に輸送される。さらに他の実施形態では、脂肪酸誘導体は細胞外環境に受動的に輸送される。脂肪酸誘導体は、当技術分野で公知の方法を使用して組換え微生物細胞から単離することができる。
脂肪酸誘導体（本発明の方法によって生成される奇数鎖脂肪酸誘導体を含む）は、２重炭素同位体フィンガープリント法または１４Ｃ年代測定法に基づいて石油化学炭素由来の有機化合物と区別することができる。さらに、バイオ源の炭素（例えば、グルコース対グリセロール）の特定の供給源は、２重炭素同位体フィンガープリント法によって決定することができる（例えば、米国特許第７，１６９，５８８号参照）。
石油をベースにした有機化合物から組換え微生物細胞によって生成される脂肪酸誘導体を区別する能力は、商業目的でこれらの材料を追跡するために有益である。例えば、生物をベースにしたおよび石油をベースにした炭素同位体プロファイルの両方を含む有機化合物または化学物質は、石油をベースにした材料のみから作製された有機化合物および化学物質と区別することができる。したがって、本発明の方法によって調製された材料は、特有の炭素同位体プロファイルに基づいて商業的に追跡することができる。
組換え微生物細胞によって生成される脂肪酸誘導体は、それぞれの燃料中の安定炭素同位体比（１３Ｃ／１２Ｃ）を比較することによって、石油をベースにした有機化合物から区別することができる。本発明の方法によって生成されるそれらの所与の脂肪酸誘導体における１３Ｃ／１２Ｃ比は、二酸化炭素が固定された時の大気二酸化炭素中の１３Ｃ／１２Ｃ比の結果である。これはまた、正確な代謝経路を反映する。地域的な変動も生じる。石油、Ｃ３植物（広葉樹）、Ｃ４植物（イネ科植物）、海成炭酸塩は全て、１３Ｃ／１２Ｃおよび対応するδ１３Ｃ値に著しい差異を示す。さらに、Ｃ３およびＣ４植物の脂質物質は、代謝経路の結果として、同じ植物の炭水化物成分から得られた物質とは異なって分析される。
１３Ｃを測定する目盛りは元々、Ｐｅｅ Ｄｅｅベレムナイト（ＰＤＢ）石灰石をゼロと設定して定義され、値はこの物質からの千分偏差で与えられる。「δ１３Ｃ」値は、千分偏差（パーミル）で表され、略して０／００であり、以下のように算出する：
δ１３Ｃ（０／００）＝［（１３Ｃ／１２Ｃ）試料−（１３Ｃ／１２Ｃ）標準］／（１３Ｃ／１２Ｃ）標準×１０００
いくつかの実施形態では、本発明の方法によって生成される脂肪酸誘導体のδ１３Ｃは、約−３０以上、約−２８以上、約−２７以上、約−２０以上、約−１８以上、約−１５以上、約−１３以上または約−１０以上である。あるいは、またはさらに、脂肪酸誘導体のδ１３Ｃは、約−４以下、約−５以下、約−８以下、約−１０以下、約−１３以下、約−１５以下、約−１８以下または約−２０以下である。したがって、脂肪酸誘導体は、上記の終端の任意の２つによって結びつけられたδ１３Ｃを有することができる。例えば、脂肪酸誘導体のδ１３Ｃは、約−３０から約−１５、約−２７から約−１９、約−２５から約−２１、約−１５から約−５、約−１３から約−７または約−１３から約−１０であってよい。いくつかの実施形態では、脂肪酸誘導体のδ１３Ｃは、約−１０、−１１、−１２または−１２．３であってもよい。他の実施形態では、脂肪酸誘導体のδ１３Ｃは、約−１５．４以上である。さらに他の実施形態では、脂肪酸誘導体のδ１３Ｃは、約−１５．４から約−１０．９、またはδ１３Ｃは約−１３．９２から約−１３．８４である。
組換え微生物細胞によって生成される脂肪酸誘導体はまた、それぞれの化合物中の１４Ｃの量を比較することによって、石油をベースにした有機化合物から区別することができる。１４Ｃの核半減期は５７３０年なので、「古い」炭素を含有する石油をベースにした燃料は、「新しい」炭素を含有する脂肪酸またはそれらの誘導体と区別することができる（例えば、Ｃｕｒｒｉｅ，”Ｓｏｕｒｃｅ Ａｐｐｏｒｔｉｏｎｍｅｎｔ ｏｆ Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ”， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ， Ｊ． Ｂｕｆｆｌｅ ａｎｄ Ｈ． Ｐ． ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ， Ｅｄｓ．， Ｖｏｌ． Ｉ ｏｆ ｔｈｅ ＩＵＰＡＣ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ， Ｌｅｗｉｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ．３−７４（１９９２）参照）。
本明細書で使用する場合、「現代炭素の画分」または「ｆＭ」は、それぞれシュウ酸標準物質ＨＯｘＩおよびＨＯｘＩＩとして知られている国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）の標準物質（ＳＲＭ）４９９０Ｂおよび４９９０Ｃによって定義された意味と同じ意味を有する。基本定義は、ＨＯｘＩの１４Ｃ／１２Ｃ同位体比の０．９５倍に関する（ＡＤ１９５０を参考にする）。これは、減衰補正された産業革命以前の森林とほぼ同等する。現代の生きている生物圏（植物物質）では、ｆＭは約１．１である。
いくつかの実施形態では、本発明の方法によって生成される脂肪酸誘導体のｆＭ １４Ｃは、少なくとも約１、例えば、少なくとも約１．００３、少なくとも約１．０１、少なくとも約１．０４、少なくとも約１．１１１、少なくとも約１．１８、または少なくとも約１．１２４である。あるいは、またはさらに、脂肪酸誘導体のｆＭ １４Ｃは、約１．１３０以下、約１．１２４以下、約１．１８以下、約１．１１１以下、約１．０４以下である。したがって、脂肪酸誘導体は、上記終端の任意の２つによって結びつけられたｆＭ １４Ｃを有することができる。例えば、脂肪酸誘導体は、約１．００３から約１．１２４のｆＭ １４Ｃ、約１．０４から約１．１８のｆＭ １４Ｃ、または約１．１１１から約１．１２４のｆＭ １４Ｃを有することができる。
刊行物、特許出願および特許を含む本明細書で引用した参考文献は全て、それぞれの参考文献が個々に、および具体的に参照により組み込まれることが示され、本明細書にその全体が記載されているのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
本発明を説明する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語および類似の指示対象の使用は、本明細書で特に指示しない限り、または文脈と明らかに矛盾していない限り、単数および複数の両方を対象とするものとする。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する」という用語は、特に記載しない限り、オープンエンドな用語として解釈されるものである（すなわち、「限定はしないが、含む」を意味する）。本明細書の値の範囲の記述は、本明細書で特に指示しない限り、単に範囲内に含まれるそれぞれ別個の値を個々に言及する簡略化方法として使用されるものであり、それぞれ別個の値は本明細書で個々に記述したかのように本明細書に組み込まれる。本明細書で記載した方法は全て、本明細書で特に指示しない限り、または文脈と明らかに矛盾していない限り、任意の適切な順番で実施することができる。本明細書中で使用したあらゆる例または例示的な言い回し（「例えば（ｅ．ｇ．）」、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」、「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」）の使用は、単に本発明をより明確にするためのものであり、特に請求されない限り、本発明の範囲に制限を設けるものではない。本明細書中のいかなる言い回しも、本発明の実施に不可欠である、特許請求されていない要素を示すものと解釈すべきではない。
本発明を実施する本発明者らに公知の最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書で記載されている。それらの好ましい実施形態の変更は、前述の説明を読めば当業者には明らかになろう。本発明者は、当業者がこのような変更を適宜使用することを期待しており、本発明者らは特に本明細書で記載した以外の方法で本発明が実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用可能な法によって許可されるように、添付の特許請求の範囲に列挙された対象の全ての改変および同等物を含む。さらに、本明細書で特に指示しない限り、または文脈と明らかに矛盾していない限り、それらの可能な変更全てにおける前述の要素の任意の組合せは本発明に包含される。
培地組成
Ｃｈｅ−９培地：さらにＮＨ４Ｃｌ（さらに１ｇ／Ｌ）、ビス−Ｔｒｉｓ緩衝液（０．２Ｍ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（０．１％ｖ／ｖ）および微量鉱物（ＦｅＣｌ３．６Ｈ２Ｏ ２７ｍｇ／Ｌ、ＺｎＣｌ．４Ｈ２Ｏ ２ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２．６Ｈ２Ｏ ２ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ ２ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ １．９ｍｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３ ０．５ｍｇ／Ｌ、濃縮ＨＣｌ １００ ｍＬ／Ｌ）を補給したＭ９。
２ＮＢＴ：グルコース２０ｇ／Ｌ（２％ｗ／ｖ）を補給したＣｈｅ−９。
４ＮＢＴ：グルコース４０ｇ／Ｌ（４％ｗ／ｖ）を補給したＣｈｅ−９。
細菌株およびプラスミド
Ｅ．コリＭＧ１６５５ ΔｆａｄＥ（「Ｄ１」株）
この実施例は、脂肪酸分解酵素の発現が減衰している組換え微生物細胞の構築について記載する。脂肪酸分解に関与するアシルコエンザイムＡ脱水素酵素（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ７３３２５）をコードするＥ．コリのｆａｄＥ遺伝子（ｙａｆＨとしても知られている）は、Ｄａｔｓｅｎｋｏ， Ｋ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７： ６６４０−６６４５ （２０００））によって記載されたＲｅｄ系を使用し、以下の改変を行ってＥ．コリ株ＭＧ１６５５から削除した。
以下の２個のプライマーは、ｆａｄＥの欠失を作出するために使用した。
Ｄｅｌ−ｆａｄＥ−Ｆ ５’ ＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡ ＡＣＡＡＴＧＴＧＡＧ ＣＴＴＴＧＴＴＧＴＡＡＴＴＡＴ ＡＴＴＧＴＡＡ ＡＣＡＴＡＴＴ ＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ（配列番号８２）；および
Ｄｅｌ−ｆａｄＥ−Ｒ ５’ ＡＡＡＣＧＧＡＧＣＣＴ ＴＴＣＧＧＣＴＣＣＧＴＴＡＴＴ ＣＡＴＴＴＡＣＧＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣ ＴＴＴＣＣＴＧ ＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ（配列番号８３）
Ｄｅｌ−ｆａｄＥ−ＦおよびＤｅｌ−ｆａｄＥ−Ｒプライマーは、ＰＣＲによってプラスミドｐＫＤ１３からカナマイシン耐性（ＫｍＲ）カセットを増幅するために使用した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．、上記）。次に、このＰＣＲ生成物を使用して、Ｒｅｄリコンビナーゼ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．、上記）を発現し、既にアラビノースで３〜４時間誘導したプラスミドｐＫＤ４６を含有するエレクトロコンピテントＥ．コリＭＧ１６５５細胞を形質転換した。ＳＯＣ培地で３７℃で３時間増殖させた後、細胞をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含有するＬｕｒｉａ寒天プレートに播種した。耐性コロニーを同定し、３７℃で一晩インキュベーションした後単離した。Ｅ．コリｆａｄＥ遺伝子に隣接するように設計されたプライマーｆａｄＥ−Ｌ２およびｆａｄＥ−Ｒ１を使用してＰＣＲ増幅することによって、ｆａｄＥ遺伝子の破壊がコロニーのいくつかで確認された。ｆａｄＥ−Ｌ２ ５’−ＣＧＧＧＣＡＧＧＴＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＧＧＡＣ（配列番号８４）；および
ｆａｄＥ−Ｒ１ ５’−ＣＧＣＧＧＣＧＴＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧ（配列番号８５）
ｆａｄＥ欠失を確認した後、単一のコロニーを使用して、ｐＣＰ２０プラスミドを用いてＫｍＲマーカーを除去した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．、上記）。ｆａｄＥ遺伝子を削除し、ＫｍＲマーカーを除去して、得られたＭＧ１６５５ Ｅ．コリ株は、Ｅ．コリＭＧ１６５５ ΔｆａｄＥまたは「Ｄ１」株と称した。
Ｅ．コリＭＧ１６５５ ΔｆａｄＥ＿ΔｔｏｎＡ（「ＤＶ２」株）
この実施例は、脂肪酸分解酵素の発現および外膜タンパク質受容体の発現が減衰している組換え微生物細胞の構築について記載する。バクテリオファージ受容体としても作用するフェリクローム外膜輸送体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿４１４６９２）をコードするＥ．コリＭＧ１６５５のｔｏｎＡ（ｆｈｕＡとしても知られている）遺伝子を、Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．、上記にしたがってＲｅｄ系を使用して、以下の改変を行ってＤ１株（前述）から削除した。
ｔｏｎＡ欠失を作出するために使用したプライマーは、以下の通りであった。Ｄｅｌ−ｔｏｎＡ−Ｆ ５’−ＡＴＣＡＴＴＣＴＣＧＴＴＴＡＣＧＴＴＡＴＣＡＴＴＣＡＣＴＴＴＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＴＡＴＡＣ
ＣＡＡＴＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ（配列番号８６）；およびＤｅｌ−ｔｏｎＡ−Ｒ ５’−ＧＣＡＣＧＧＡＡＡＴＣＣＧＴＧＣＣＣＣＡＡＡＡＧＡＧＡＡＡＴＴＡＧＡＡＡＣＧＧＡＡＧ
ＧＴＴＧＣＧＧ ＴＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ（配列番号８７）
Ｄｅｌ−ｔｏｎＡ−ＦおよびＤｅｌ−ｔｏｎＡ−Ｒプライマーは、ＰＣＲによってプラスミドｐＫＤ１３からカナマイシン耐性（ＫｍＲ）カセットを増幅するために使用した。この方法で得られたＰＣＲ生成物は、既にアラビノースで３〜４時間誘導したｐＫＤ４６を含有するエレクトロコンピテントＥ．コリＭＧ１６５５ Ｄ１細胞（Ｄａｔｓｅｎｋｏ
ｅｔ ａｌ．、上記）を形質転換するために使用した。ＳＯＣ培地で３７℃で３時間増殖させた後、細胞をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含有するＬｕｒｉａ寒天プレートに播種した。耐性コロニーを同定し、３７℃で一晩インキュベートした後単離した。Ｅ．コリｔｏｎＡ遺伝子に隣接するプライマー：ｔｏｎＡ−ｖｅｒＦおよびｔｏｎＡ−ｖｅｒＲを使用してＰＣＲ増幅することによって、ｔｏｎＡ遺伝子の破壊がコロニーのいくつかで確認された。
ｔｏｎＡ−ｖｅｒＦ ５’−ＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＣＴＣＡＧＣＡＡ（配列番号８８）；および
ｔｏｎＡ−ｖｅｒＲ ５’−ＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＧＴＴ（配列番号８９）
ｔｏｎＡ欠失を確認した後、単一のコロニーを使用して、ｐＣＰ２０プラスミドを用いてＫｍＲマーカーを除去した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．、上記）。ｆａｄＥおよびｔｏｎＡ遺伝子を削除して得られたＭＧ１６５５ Ｅ．コリ株をＥ．コリ ＭＧ１６５５ ΔｆａｄＥ ΔｔｏｎＡまたは「ＤＶ２」株と称した。
Ｅ．コリ ＭＧ１６５５ ΔｆａｄＥ＿ΔｔｏｎＡ ｌａｃＩ：ｔｅｓＡ（「ＤＶ２ ‘ｔｅｓＡ」株）
この実施例では、脂肪酸誘導体酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え微生物細胞の構築について記載する。Ｅ．コリ アシル−ＣｏＡチオエステラーゼＩ（ＥＣ３．１．１．５、３．１．２．−；例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ７３５９６；配列番号６４）をコードするｔｅｓＡポリヌクレオチド配列は、リーダー配列を除去するために改変し、したがって、得られた‘ｔｅｓＡ遺伝子生成物の２５個のアミノ酸が切断され、元の２６位のアミノ酸、アラニンがメチオニンで置換され、このメチオニンが‘ＴｅｓＡポリペプチド配列の最初のアミノ酸になった（配列番号６５； Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０：４２１６−４２１９ （１９９５））。
ＰＴｒｃプロモーターおよびカナマイシン耐性遺伝子に操作可能に連結した‘ｔｅｓＡコーディング配列を含有する組み込みカセットは、プライマー
ｌａｃＩフォワード： ＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧＣＡＴＡＡＡＴＡＴＣＴＣ（配列番号９０）およびｌａｃＺリバース： ＧＣＧＴＴＡＡＡＧＴＴＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＡＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＧＴＣＴＧＧＡＴＴＴＴＧＡＡＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＣＧＧＡＡＣ（配列番号９１）
を使用してプラスミドｐＡＣＹＣ−ＰＴｒｃ−ｔｅｓＡからＰＣＲ増幅し（実施例１、以下）、ＤＶ２株にエレクトロポレーションし、ｐＫＤ４６プラスミドから発現したＲｅｄリコンビナーゼを使用して染色体に組み込んだ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．、上記）。形質転換体は、カナマイシンを補給したＬＢプレートで選択した。正確な組み込みは診断用ＰＣＲを使用して評価した。
ｐＤＧ２発現ベクター
ｐＤＧ２発現ベクターは、以下に記載したコンストラクトの多くの基礎となるプラスミドであった。ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ／ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、ＣｌｏＤＦ１３レプリコン、ｌａｃＩ遺伝子およびストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子（ａａｄＡ）を有する。ｐＤＧ２プラスミドを構築するために、下流ｆａｂＨ遺伝子用の内部プロモーターを含有するｐｌｓＸ遺伝子のＣ末端部分（Ｐｏｄｋｏｖｙｒｏｖ ａｎｄ Ｌａｒｓｏｎ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
（１９９６） ２４ （９）： １７４７−１７５２ （１９９６））をプライマー５’−ＴＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＣＧＣＡＡＣＴＣＡＣＴＣＴＴＣＴＴＴＴＡＧＴＣＧ−３’（配列番号９２）および
５’−ＣＡＧＴＡＣＣＴＣＧＡＧＴＣＴＴＣＧＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＣＧＣＴ ＣＡＧＴＣＡＣ−３’（配列番号９３）
を使用してＥ．コリＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡから増幅した。これらのプライマーは、末端近くにＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限部位ならびに内部ＮｄｅＩ部位を導入した。
ｐｌｓＸ挿入物（ＥｃｆａｂＨプロモーターを含有する）およびｐＣＤＦＤｕｅｔ−１ベクターの両方は、制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化した。切断ベクターは、Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼで処理した。挿入物は、ベクターにライゲートし、形質転換コンピテントＥ．コリ細胞に形質転換した。クローンはＤＮＡ配列決定によってスクリーニングした。ｐＤＧ２プラスミド配列は、本明細書では配列番号７３とした。
ＦａｂＨ発現プラスミド
Ｂ．ズブチリスＦａｂＨ１を発現するｐＤＧ６プラスミドは、ｐＤＧ２プラスミドを使用して構築した。ｆａｂＨ１コーディング配列は、プライマー
５’−ＣＣＴＴＧＧＧＧＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＣＴＧ−３’（配列番号９４）および
５’−ＴＴＴＡＧＴＣＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＣＡＣＣＴＣＡＣＣＴＴＴ−３’（配列番号９５）
を使用してバチルス・ズブチリス株１６８から増幅した。これらのプライマーは、増幅生成物の末端にＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位を導入した。
ｆａｂＨ１挿入物およびｐＤＧ２ベクターの両方は、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化した。切断ベクターは、Ａｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼで処理した。挿入物は、ベクターにライゲートし、形質転換コンピテントＥ．コリ細胞に形質転換した。クローンはＤＮＡ配列決定によってスクリーニングした。ｐＤＧ６プラスミド配列は、本明細書では配列番号７４とし、ＥｃｆａｂＨプロモーターの制御下でＢ．ズブチリスＦａｂＨ１ポリペプチド（配列番号２）を発現する。
ｐＤＧ２をベースにした他のプラスミドは、ｐＤＧ６プラスミドに使用した方法と類似の戦略を使用して調製した。プラスミドｐＤＧ７は、Ｂ．ズブチリスＦａｂＨ２ポリペプチド（配列番号３）を発現するバチルス・ズブチリスｆａｂＨ２コーディング配列を含む。プラスミドｐＤＧ８は、Ｓ．コエリカラーＦａｂＨポリペプチド（配列番号４）を発現するストレプトマイセス・コエリカラーｆａｂＨコーディング配列を含む。
ｐＡＣＹＣ−ＰＴｒｃ−ｔｅｓＡおよびｐＡＣＹＣ−ＰＴｒｃ２−ｔｅｓＡプラスミド
プラスミドｐＡＣＹＣ−ＰＴｒｃは、ｌａｃＩｑ、ＰＴｒｃプロモーターおよびｐＴｒｃＨｉｓ２Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡＡ）のターミネーター領域をプライマー
ｐＴｒｃ＿Ｆ ＴＴＴＣＧＣＧＡＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＧＣＣＡＡＣＡＣＣＣＧＣＴＧＡＣＧ（配列番号９６）および
ｐＴｒｃ＿Ｒ ＡＡＧＧＡＣＧＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＡＡ（配列番号９７）
を使用してＰＣＲ増幅することによって構築した。
次に、ＰＣＲ生成物をＡａｔＩＩおよびＮｒｕＩで消化し、ＡａｔＩＩおよびＳｃａＩで消化したプラスミドｐＡＣＹＣ１７７（Ｒｏｓｅ， Ｒ．Ｅ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １６：３５６ （１９８８））に挿入した。ｐＡＣＹＣ−ＰＴｒｃベクターのヌクレオチド配列は、本明細書では配列番号７５とした。
ｐＡＣＹＣ−ＰＴｒｃ２プラスミドを生成するために、単一の点突然変異をｐＡＣＹＣ−ＰＴｒｃプラスミドのＰＴｒｃプロモーターに導入し、変異体プロモーターＰＴｒｃ２およびｐＡＣＹＣ−ＰＴｒｃ２プラスミドを生成した。野生型ＰＴｒｃプロモーター配列は、本明細書では配列番号７６とし、ＰＴｒｃ２変異体プロモーターは本明細書では配列番号７７とした。
Ｅ．コリ アシル−ＣｏＡチオエステラーゼＩ（ＴｅｓＡ、ＥＣ３．１．１．５、３．１．２．−；例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ７３５９６。配列番号６４）をコードするヌクレオチド配列は、リーダー配列を除去するために改変し、したがって、得られた‘ｔｅｓＡ遺伝子生成物の２５個のアミノ酸が切断され、元の２６位のアミノ酸、アラニンがメチオニンで置換され、このメチオニンが’ＴｅｓＡポリペプチドの最初のアミノ酸になった（配列番号６５； Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０：４２１６−４２１９ （１９９５））。‘ＴｅｓＡポリペプチドをコードするＤＮＡをｐＡＣＹＣ−ＰＴｒｃベクターおよびｐＡＣＹＣ−ＰＴｒｃ２ベクターのＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位に挿入し、それぞれｐＡＣＹＣ−ＰＴｒｃ−‘ｔｅｓＡおよびｐＡＣＹＣ−ＰＴｒｃ２−‘ｔｅｓＡプラスミドを生成した。‘ｔｅｓＡ配列のプラスミドへの正確な挿入は、制限消化によって確認した。
ｐＯＰ８０プラスミド
ｐＯＰ８０プラスミドは、制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＳｆｏＩでクローニングベクターｐＣＬ１９２０（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ２３６９３０； Ｌｅｒｎｅｒ Ｃ．Ｇ． ａｎｄ Ｉｎｏｕｙｅ Ｍ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：４６３１
（１９９０））を消化することによって構築した。３種類のＤＮＡ断片がこの消化によって生成した。３７３７ｂｐ断片をゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用してゲル精製した。並行して、市販のプラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のＰＴｒｃプロモーターおよびｌａｃＩ領域を含有するＤＮＡ配列断片は、プライマーＬＦ３０２（５’−ａｔａｔｇａｃｇｔｃＧＧＣＡＴＣＣＧＣＴＴＡＣＡＧＡＣＡ−３’， 配列番号９８）およびＬＦ３０３（５’−ａａｔｔｃｔｔａａｇＴＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＡＡ−３’， 配列番号９９）を使用してＰＣＲによって増幅し、それぞれＺｒａＩおよびＡｆｌＩＩ酵素の認識部位を導入した。増幅後、ＰＣＲ生成物は、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製し、供給業者（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）の推奨にしたがってＺｒａＩおよびＡｆｌＩＩで消化した。消化後、ＰＣＲ生成物をゲル精製し、ｐＣＬ１９２０から得られた３７３７ｂｐ ＤＮＡ配列断片とライゲートし、ＰＴｒｃプロモーターを含有する発現ベクターｐＯＰ８０を生成した。
Ｌ．モノサイトゲネスｆａｂＨ１およびｆａｂＨ２プラスミド（ｐＴＢ．０７９およびｐＴＢ．０８１）
リステリア・モノサイトゲネスＬｉ２３（ＡＴＣＣ１９１１４Ｄ−５）のゲノムＤＮＡは、以下のプライマーを使用してｆａｂＨ遺伝子を増幅するための鋳型として使用した。ＴＲＥＥ０４４ （ｆａｂＨ＿フォワード） ＧＡＧＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＴＧＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＴＴＴＴＡＧＧＡＧＴＡＧ （配列番号１００）；プライマー６１ （ｆａｂＨ＿リバース） ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＡＴＧＡＴＴＡＧＧ （配列番号１０１）
次に、ＰＣＲ生成物をｐＤＳ８０（ファージラムダＰＬプロモーターを有するｐＣＬ１９２０をベースにしたベクター、配列番号７８）のＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、形質転換コンピテントＥ．コリ細胞に形質転換した。クローニングされた挿入物の配列を検証するために個々のコロニーを採取した。野生型Ｌ．モノサイトゲネスｆａｂＨの核酸配列は、野生型ＬｍＦａｂＨ１タンパク質（配列番号７）をコードし、この配列を発現するプラスミドはｐＴＢ．０７９と称した。
突然変異体Ｌ．モノサイトゲネスｆａｂＨ遺伝子は、９２８位にＴからＧへの変化を含有することが発見され、発現したタンパク質においてアミノ酸位置３１０のトリプトファン（Ｗ）からグリシン（Ｇ）への変化、すなわちＷ３１０Ｇ変異体が生じた。ＦａｂＨＷ３１０Ｇ変異体をコードする突然変異体Ｌ．モノサイトゲネスｆａｂＨ遺伝子（配列番号８）は、ＬｍＦａｂＨ２と称し、この配列を発現するプラスミドはｐＴＢ．０８１と称した。
ｐＯＰ８０をベースにしたｆａｂＨ発現プラスミド
各遺伝子は指示した鋳型およびプライマーからＰＣＲ増幅された（表６）。Ｅ．コリコドン最適化配列を使用したＰｆｆａｂＨ（配列番号１５０）以外は、各遺伝子の天然の配列型を使用した。遺伝子ＰｆｆａｂＨ（ｏｐｔ）、ＤｐｆａｂＨ１およびＤｐｆａｂＨ２は、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）によって合成した。クローニングベクターはまた、鋳型としてプラスミドＯＰ８０を使用して、プライマーＰＴｒｃ＿ベクター＿ＦおよびＰＴｒｃ＿ｖｅｃｔｏｒ＿Ｒ（表７）でＰＣＲ増幅した。次に、異なるｆａｂＨ遺伝子をＰＣＲ増幅ＯＰ８０ベクター主鎖にＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングを使用してクローニングした（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ ＣＡ）。製造者によって概略を示された標準プロトコールに従った。全コンストラクトは、配列決定によって検証した。
Figure 0006609274
Figure 0006609274
経路（Ａ）による奇数鎖脂肪酸の生成のためのＥ．コリの操作
以下の実施例は、図２の経路（Ａ）による中間体スレオニンおよびα−ケト酪酸を通ってプロピオニル−ＣｏＡに至る代謝流の増加に役立ち、これらの組換え細胞における奇数鎖アシル−ＡＣＰおよび奇数鎖脂肪酸誘導体の生成増加を引き起こす酵素をコードする外来遺伝子を発現する、および／または内在性遺伝子を過剰発現する組換えＥ．コリ株の構築について記載する。
この実施例はまた、内在性遺伝子の発現の減衰および内在性遺伝子と外来性遺伝子との置換のｏｃ−ＦＡ生成に対する効果を実証しており、この実施例において、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素をコードする内在性Ｅ．コリｆａｂＨ遺伝子の発現は、遺伝子の削除によって減衰し、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性は、外来性Ｂ．ズブチリスｆａｂＨ１遺伝子の発現によって供給された。
ＤＶ２ ＰＬｔｈｒＡ＊ＢＣ
スレオニン生合成に関与する染色体遺伝子が、強力な染色体組み込みラムダＰＬプロモーターの制御化にあり、遺伝子の１つが突然変異した組換えＥ．コリ株を構築した。
天然のアスパルトキナーゼＩ（ｔｈｒＡ）遺伝子に１つの突然変異を導入するために、Ｅ．コリＭＧ１６５５ＤＮＡから２つの部分の遺伝子を増幅した。第１の部分は、プライマーＴＲＥＥ０２６およびＴＲＥＥ０２８を使用して増幅し、一方、第２の部分はＴＲＥＥ０２９およびＴＲＥＥ０３０を使用して増幅した（表６）。２つの成分を増幅するために使用したプライマーは、次に個々の区画を一緒に「つなぎ合わせる（ｓｔｉｔｃｈ）」ために使用した重複する配列を含有した。２個のＰＣＲ生成物は、ｔｈｒＡ遺伝子全体を増幅するために１つのＰＣＲ反応ならびにプライマーＴＲＥＥ０２６およびＴＲＥＥ０３０と一緒にされた。プライマーＴＲＥＥ０２８およびＴＲＥＥ０２９は、天然のｔｈｒＡのコドン３４５において突然変異を作出するために設計されており、アスパルトキナーゼＩのＳ３４５Ｆ変異体（配列番号２１）を生じた。この突然変異は、宿主株においてスレオニンによる酵素のフィードバック阻害を排除することが示された（Ｏｇａｗａ−Ｍｉｙａｔａ，Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６５：１１４９−１１５４ （２００１）； Ｌｅｅ Ｊ．−Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８５： ５４４２−５４５１ （２００３））。この遺伝子の改変型を「ｔｈｒＡ＊」と称した。
ＰＬプロモーターは、プライマーＫｍ＿ｔｒｃ＿ｏｖｅｒＦおよびＴＲＥＥ０２７（表８）を使用して、鋳型としてプラスミドｐＤＳ８０（ファージラムダＰＬプロモーターを有するｐＣＬ１９２０をベースにしたベクター；配列番号７８）を使用して増幅した。この断片を次に、ＦＲＴ部位に隣接したカナマイシン耐性カセットにつなぎ合わせ、プラスミドｐＫＤ１３からプライマーＴＲＥＥ０２５およびＫｍ＿ｔｒｃ＿ｏｖｅｒＲ（表８）を使用してから増幅した。ＫｍＦＲＴカセットおよびＰＬプロモーターを含有する得られたＰＣＲ生成物をｔｈｒＡ＊ＰＣＲ生成物につなぎ合わせた。プライマーＴＲＥＥ０２５およびＴＲＥＥ０３０を使用して、ＫｍＦＲＴ−ＰＬ−ｔｈｒＡ＊突然変異誘発カセット全体を増幅した。これらのプライマーはまた、５’末端に組み込み部位に相同な約５０ｂｐ、３’末端に相同なｔｈｒＡ遺伝子全体を含有し、ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢおよびｔｈｒＣ遺伝子を含むオペロンの一部であるカセットをＥ．コリの天然のｔｈｒＡ部位に標的化する。この突然変異誘発カセットを、Ｒｅｄリコンビナーゼを発現するヘルパープラスミドｐＫＤ４６を含有する親株Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＶ２にエレクトロポレーションした（実施例１）（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．、上記）。染色体組み込みを含有するクローンは、カナマイシンの存在下で選択し、診断用ＰＣＲによって検証した。その後、カナマイシンマーカーをｐＣＰ２０プラスミドの発現によって除去した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．、上記）。適切な組み込みおよびマーカー除去は、ＰＣＲおよび配列決定によって検証した。突然変異体ｔｈｒＡ＊遺伝子ならびに内在性ｔｈｒＢおよびｔｈｒＣ遺伝子が染色体組み込みラムダＰＬプロモーターによって過剰発現している得られた株は、ＤＶ２
ＰＬ ｔｈｒＡ＊ＢＣと称した。
Figure 0006609274
ＤＶ２ ＰＬ ｔｈｒＡ＊ＢＣ ＰＬ ｔｄｃＢ
天然のＥ．コリ異化スレオニンデアミナーゼ（ｔｄｃＢ）遺伝子（スレオニンンアンモニアリアーゼとしても知られている）は、遺伝子のさらなるコピーをｌａｃＺ座に組み込み、強力な染色体組み込みラムダＰＬプロモーターの制御下に置くことによって過剰発現させた。
異化スレオニンデアミナーゼは、スレオニン分解／イソロイシン生成経路の第１反応であるスレオニンのα−ケト酪酸への分解を触媒する。触媒された反応は、最初に水の排除（したがって、この酵素はスレオニン脱水酵素として最初は分類された）、次いでＣ−Ｎ結合切断による生成物の異性化および加水分解に関与するものと考えられる。この遺伝子の発現増加は、異種生物においてイソロイシンのレベルを劇的に増加させることが示された（Ｇｕｉｌｌｏｕｅｔ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６５：３１００−３１０７ （１９９９））。さらに、スレオニンデアミナーゼはイソロイシンフィードバック機構に比較的耐性を有する（Ｇｕｉｌｌｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．、上記）。
Ｅ．コリＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡは、天然のｔｄｃＢ遺伝子を得るためにプライマーＴＲＥＥ０２０およびＴＲＥＥ０２１（表８）を使用して増幅した。同時に、プライマーＫａｎ／Ｃｈｌｏｒ１およびＫａｎ／Ｃｈｌｏｒ４（表８）を使用して、既に記載したような組み込み選択／スクリーニングに使用するためのＦＲＴ−カナマイシン耐性カセットを増幅した。鋳型としてＥ．コリＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡを使用し、プライマーＥＧ２３８およびＴＲＥＥ０１８（表８）はｌａｃＺ組み込み部位に相同な３’の領域を増幅するために使用し、一方プライマーＴＲＥＥ０２２およびＴＲＥＥ０２３（表８）はｌａｃＺ部位に相同な５’の領域を増幅するために使用した。プラスミドｐＤＳ８０（ファージラムダＰＬプロモーター；配列番号７８を有するｐＣＬ１９２０をベースにしたベクター）を鋳型として使用して、プライマーＴＲＥＥ０１７およびＴＲＥＥ０１８（表８）を用いることによってＰＬプロモーターを含有する断片を増幅した。これらの断片のそれぞれは、対応する近接した区画に重複して設計され、ＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲ技術を使用して一緒につなぎ合わせた。得られたＰＬｔｄｃＢ突然変異誘発カセット（約４．３ｋｂ）は、５’末端の組み込み部位に相同な約７００ｂｐおよび３’末端の組み込み部位に相同な７５０ｂｐを含有した。ＰＬｔｄｃＢ突然変異誘発カセットは、ヘルパープラスミド、ｐＫＤ４６を含有する宿主株Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＶ２ ＰＬｔｈｒＡ＊ＢＣ（上記）にエレクトロポレーションした（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．、上記）。染色体組み込みを含有するクローンは、カナマイシンの存在下で選択し、ＰＣＲおよび配列決定分析によって検証した。その後、カナマイシンマーカーをｐＣＰ２２プラスミドを使用して除去した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．、上記）。得られた株はＤＶ２ ＰＬｔｈｒＡ＊ＢＣ ＰＬ ｔｄｃＢと称した。この株を、Ｅ．コリｔｅｓＡの切断型を発現するプラスミドｐＡＣＹＣ−ｐｔｒｃ２−‘ｔｅｓＡ（実施例１）で形質転換した。
この株はまた、Ｂ．ズブチリスＦａｂＨ１酵素を発現するプラスミドｐＤＧ６（実施例１）で形質転換した。発酵実験を実施し、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、奇数鎖脂肪酸（ｏｃ−ＦＡ）およびｏｃ−ＦＡとして生成したＦＦＡの画分の力価を、実施例５および表１１に示したように測定した。あるいは、この株は、例えば、Ｂ．ズブチリスＦａｂＨ２を発現するｐＤＧ７、ストレプトマイセス・コエリカラーＦａｂＨを発現するｐＤＧ８、リステリア・モノサイトゲネスＦａｂＨを発現するｐＴＢ．０７９、リステリア・モノサイトゲネスＦａｂＨＷ３１０Ｇ変異体を発現するｐＴＢ．０８１または実施例５および表１２Ａ〜１２Ｃで記載したＦａｂＨプラスミドなどの様々なＦａｂＨポリペプチドを発現するプラスミドで形質転換することができる。発酵実験を実施し、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、奇数鎖脂肪酸（ｏｃ−ＦＡ）およびｏｃ−ＦＡとして生成したＦＦＡの画分の力価を測定する。
ＤＶ２ ＰＬ−ｔｈｒＡ＊ＢＣ ＰＴ５−ＢｓｆａｂＨ１
Ｂ．ズブチリスｆａｂＨ１遺伝子が染色体に組み込まれ、強力な構成Ｔ５プロモーターの転写制御下に置かれた組換え体Ｅ．コリ株を構築した。
最初に、ＤＶ２ＰＬｔｈｒＡ＊ＢＣのｆａｄＥ欠失痕の部位にクロラムフェニコール耐性遺伝子、Ｔ５プロモーター（ＰＴ５）およびＢｓｆａｂＨ１コーディング配列を含むｌｏｘＰｃａｔ組み込みカセットの染色体組み込みのためにＰＣＲ生成物を生成した。組み込みカセットの個々の成分を最初にＰＣＲ増幅した。ｌｏｘＰ−ｃａｔ−ｌｏｘＰ ＰＴ５成分は、プライマーＴＲＥＥ１３３およびＴＲＥＥ１３５（表９）を使用してプラスミドｐ１００．３８（配列番号７９）から増幅した。ＢｓｆａｂＨ１遺伝子は、プライマーＴＲＥＥ１３４およびＴＲＥＥ１３６を使用してＢｓｆａｂＨ１遺伝子を有するプラスミドから増幅した。プライマーＴＲＥＥ１３３およびＴＲＥＥ１３６は、組み込みのための相同配列の５’および３’の５０ｂｐを含有する。成分を増幅するために使用したプライマーは、次に個々の区画を一緒に「つなぎ合わせる」ために使用した重複する配列を含有する。ｌｏｘＰ−ｃａｔ−ＰＴ５およびＢｓｆａｂＨ１のＰＣＲ生成物は、１つのＰＣＲ反応において両区画を一緒にし、プライマーＴＲＥＥ１３３およびＴＲＥＥ１３６を使用することによって一緒につなぎ合わせ、最終的なｌｏｘＰｃａｔ−ＰＴ５−ＢｓｆａｂＨ１組み込みカセットを増幅した。
Figure 0006609274
ｌｏｘＰ−ｃａｔ−ＰＴ５−ＢｓｆａｂＨ１カセットは、Ｒｅｄリコンビナーゼ系を使用して組み込んだ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ， ｅｔ ａｌ．、上記）。ｌｏｘＰ−ｃａｔ−ＰＴ５−ＢｓｆａｂＨ１ＰＣＲ生成物を使用して、既にアラビノースで３０℃で３〜４時間誘導したプラスミドｐＫＤ４６を含有するエレクトロコンピテントＤＶ２ ＰＬ−ｔｈｒＡ＊ＢＣ細胞を形質転換した。ＳＯＣ培地で３７℃で３時間増殖させた後、細胞をクロラムフェニコール１７μｇ／ｍＬを含有するＬｕｒｉａ寒天プレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。クロラムフェニコール耐性コロニーのｌｏｘＰ−ｃａｔ−ＰＴ５−ＢｓｆａｂＨ１の適切な組み込みは、ＰＣＲによってスクリーニングした。染色体組み込み部位に隣接するプライマーｆａｄＥ−Ｌ２およびｆａｄＥ−Ｒ２（表９）を使用して、組み込みを確認した。組み込みを検証して、クロラムフェニコールマーカー遺伝子は、クロラムフェニコール耐性遺伝子に隣接する２つのｌｏｘＰ部位の間の再結合を促進するＣｒｅリコンビナーゼを発現することによって除去した。ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＪＷ１６８は、ＤＶ２ ＰＬ−ｔｈｒＡ＊ＢＣ ｌｏｘＰ−ｃａｔ−ＰＴ５−ＢｓｆａｂＨ１株に形質転換し、マーカーはＰａｌｍｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ２４７：２５５−２６４ （２０００））によって記載された方法にしたがって除去した。得られたＤＶ２ ＰＬ−ｔｈｒＡ＊ＢＣ ＰＴ５−ＢｓＦａｂＨ１株は、配列決定によって検証した。
ＤＶ２ ＰＬ−ｔｈｒＡ＊ＢＣ ＰＴ５−ＢｓｆａｂＨ１ ΔＥｃｆａｂＨ
内在性遺伝子の発現（この場合、Ｅ．コリのｆａｂＨ遺伝子）がその遺伝子の欠失によって減衰している組換えＥ．コリ株を構築した。
Ｅ．コリのｆａｂＨ遺伝子は、ＤＶ２ ＰＬ−ｔｈｒＡ＊ＢＣ ＰＴ５−ＢｓＦａｂＨ１からＲｅｄリコンビナーゼ系を使用して削除した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．、上記）。プライマーＴＲＥＥ１３７およびＴＲＥＥ１３８（表９）を使用して、ＰＣＲによってプラスミドｐＫＤ１３からカナマイシン耐性カセットを増幅した。次に、ＰＣＲ生成物を使用して、プラスミドｐＫＤ４６を含有するエレクトロコンピテントＤＶ２ ＰＬ−ｔｈｒＡ＊ＢＣ ＰＴ５−ＢｓｆａｂＨ１細胞を形質転換した。ＥｃｆａｂＨの削除およびカナマイシンマーカーの除去は、Ｗａｎｎｅｒ ａｎｄ Ｄａｔｓｅｎｋｏ、上記によって記載された方法にしたがって実施した。プライマーＴＲＥＥ１３９およびＴＲＥＥ１４０を使用してＥｃｆａｂＨの削除を確認した。最終的にマーカーのない株は、ＤＶ２
ＰＬ−ｔｈｒＡ＊ＢＣ ＰＴ５−ＢｓＦａｂＨ１ ΔＥｃｆａｂＨと称した。
ＤＶ２ ＰＬ−ｔｈｒＡ＊ＢＣ ＰＬ−ｔｄｃＢ ＰＴ５−ＢｓｆａｂＨ１ ΔＥｃｆａｂＨ
図２に示した経路（Ａ）および図１Ｂに示したｏｃ−ＦＡ生合成経路の工程（Ｄ）の酵素を過剰発現する染色体組み込み遺伝子を含有する組換えＥ．コリ株を構築した。ＰＬ−ｔｄｃＢ突然変異誘発カセット（前述したように調製）をＤＶ２ ＰＬ−ｔｈｒＡ＊ＢＣ
ＰＴ５−ＢｓｆａｂＨ１ ΔＥｃｆａｂＨ株に組み込んで、ＤＶ２ ＰＬ−ｔｈｒＡ＊ＢＣ ＰＬ−ｔｄｃＢ ＰＴ５ＢｓｆａｂＨ１ ΔＥｃｆａｂＦ株を生成した。この株では、組み込まれたＥ．コリｔｈｒＡ＊ＢＣ遺伝子および組み込まれたＥ．コリｔｄｃＢ遺伝子はいずれも強力なラムダＰＬプロモーターの制御下にあり、組み込まれたＢ．ズブチリスｆａｂＨ１遺伝子は、強力なＴ５プロモーターの制御下にあり、内在性Ｅ．コリｆａｂＨ遺伝子は削除された。発酵実験を実施し、結果を表１１に示す。
経路（Ｂ）による奇数鎖脂肪酸の生成のためのＥ．コリの操作
以下の実施例は、図２の経路（Ｂ）による中間体シトラマル酸およびα−ケト酪酸を通ってプロピオニル−ＣｏＡに至る代謝流の増加に役立ち、これらの組換え細胞における奇数鎖アシル−ＡＣＰおよび奇数鎖脂肪酸誘導体の生成増加を引き起こす酵素をコードする外来遺伝子を発現する、および／または内在性遺伝子を過剰発現する組換えＥ．コリ株の構築について記載する。
ＤＶ２ ＰＴｒｃ−ｃｉｍＡ３．７ ｌｅｕＢＣＤ
内在性ｌｅｕＢＣＤ遺伝子および外来性ｃｉｍＡ３．７遺伝子を過剰発現するＥ．コリ株を調製するために、内在性染色体Ｅ．コリｌｅｕＡとｌｅｕＢ遺伝子との間のＫｍＦＲＴカセット、ＰＴｒｃプロモーターおよびｃｉｍＡ３．７の染色体組み込みのためにＰＣＲ生成物を生成した。この組み込みによって天然のｌｅｕＡＢＣＤオペロンは破壊され、ｃｉｍＡ３．７およびｌｅｕＢＣＤはオペロン内で強力なＩＰＴＧ誘導性プロモーター、ＰＴｒｃの制御下に置かれた。
ＣｉｍＡ３．７をコードするＤＮＡは、Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。ＤＮＡは、プラスミドｐＭＫ−ＲＱ（ｋａｎＲ）のＳｆｉＩ部位にクローニングされた（Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。コーディング配列に隣接して、５’ＫｐｎＩ制限部位はＡＴＧ開始コドンの直接上流、３’ＳａｃＩ制限部位はＴＡＡ終止コドンのすぐ下流にそれぞれ導入された。ｃｉｍＡ３．７クローニングベクターは、配列決定によって検証した。
組み込みカセットの個々の成分を以下のようにＰＣＲ増幅した。ＫｍＦＲＴ成分は、プライマーＴＲＥＥ１４６およびＫｍ＿ｔｒｃ＿ｏｖｅｒＲ（表１０）を使用してプラスミドｐＫＤ１３から増幅した。ＰＴｒｃプロモーターは、プライマーＫｍ＿ｔｒｃ＿ｏｖｅｒＦおよびＴＲＥＥ０３３を使用してｐＯＰ８０から増幅した（実施例１）。
ｃｉｍＡ３．７コーディング配列は、プライマーＴＲＥＥ０３２およびＴＲＥＥ０３５を使用して、前述のｃｉｍＡ３．７クローニングベクターから増幅した。組み込みのための３’相同配列を形成するために、Ｅ．コリ天然ｌｅｕＢＣ遺伝子を、Ｅ．コリゲノムＤＮＡならびにプライマーＴＲＥＥ０３４およびＴＲＥＥ１０４を使用して増幅した。ＫｍＦＲＴカセットを増幅するために使用したフォワードプライマーＴＲＥＥ１４６には、組み込みのための相同配列の５’５０ｂｐが含まれた。成分を増幅するために使用したプライマーそれぞれは、個々の区画を一緒に「つなぎ合わせる」ために使用した重複する配列を含有した。最初に、ＫｍＦＲＴおよびＰＴｒｃは、１つのＰＣＲ反応において両区画を一緒にすることによって一緒につなぎ合わせ、プライマーＴＲＥＥ１４６およびＴＲＥＥ０３３を使用してＫｍＦＲＴ−ＰＴｒｃ生成物を増幅した。次に、プライマーＴＲＥＥ１４６およびＴＲＥＥ０３５を使用してＫｍＦＲＴ−ＰＴｒｃをｃｉｍＡ３．７とつなぎ合わせ、ＫｍＦＲＴ−ＰＴｒｃ−ｃｉｍＡ３．７を生成した。最終的な区画、ｌｅｕＢＣは、プライマーＴＲＥＥ１４６およびＴＲＥＥ１０４を使用してＫｍＦＲＴ−ＰＴｒｃ−ｃｉｍＡ３．７につなぎ合わせ、最終的な組み込みカセット：ＫｍＦＲＴ−ＰＴｒｃ−ｃｉｍＡ３．７ ｌｅｕＢＣを生成した。
Figure 0006609274
ＫｍＦＲＴ−ＰＴｒｃ−ｃｉｍＡ３．７ ｌｅｕＢＣカセットは、Ｒｅｄリコンビナーゼ系を使用してＥ．コリゲノムに組み込んだ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ， ｅｔ ａｌ．、上記）。ＫｍＦＲＴ−ＰＴｒｃ−ｃｉｍＡ３．７ ｌｅｕＢＣ ＰＣＲ生成物を使用して、既にアラビノースで３０℃で３〜４時間誘導されたプラスミドｐＫＤ４６を含有するエレクトロコンピテントＥ．コリＭＧ１６５５ＤＶ２細胞を形質転換した。ＳＯＣ培地で３７℃で３時間増殖させた後、細胞をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含有するＬｕｒｉａ寒天プレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。カナマイシン耐性コロニーのＫｍＦＲＴ−ＰＴｒｃ−ｃｉｍＡ３．７の適切な組み込みは、ＰＣＲによってスクリーニングした。染色体組み込み部位に隣接するプライマーＴＲＥＥ１５１およびＴＲＥＥ１０６を使用して、組み込みを確認した。組み込みを検証して、カナマイシンマーカー遺伝子はＤａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．、上記によって記載された方法によって除去した。最終的な株ＤＶ２ ＰＴｒｃｃｉｍＡ３．７ ｌｅｕＢＣＤにおけるＰＴｒｃ−ｃｉｍＡ３．７の組み込み成功およびカナマイシンマーカー遺伝子の除去は、配列決定によって検証した。
この株をＥ．コリｔｅｓＡの切断型を発現するプラスミドｐＡＣＹＣ−ｐｔｒｃ２−ｔｅｓＡで形質転換し、場合によっては、Ｂ．ズブチリスｆａｂＨ１を発現するｐＤＧ６で形質転換した。発酵実験を実施し、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、奇数鎖脂肪酸（ｏｃ−ＦＡ）およびｏｃ−ＦＡとして生成したＦＦＡの画分の力価を表１１に挙げる。
経路（Ａ）および（Ｂ）の組合せによる奇数鎖脂肪酸の生成のためのＥ．コリの操作
以下の実施例は、図２の経路（Ａ）および（Ｂ）の組合せによる一般的な中間体α−ケト酪酸を通りプロピオニル−ＣｏＡに至る代謝流の増加に役立ち、これらの組換え細胞におけるｏｃ−アシル−ＡＣＰおよび奇数鎖脂肪酸の生成増加も引き起こす酵素をコードする外来遺伝子を発現する、および／または内在性遺伝子を過剰発現する組換えＥ．コリ株の構築について記載する。
ＤＶ２ ＰＬ−ｔｈｒＡ＊ＢＣ ＰＴｒｃ−ｃｉｍＡ３．７＿ｌｅｕＢＣＤ ＰＴ５−ＢｓｆａｂＨ１ ΔＥｃｆａｂＨ（「Ｇ１」株）
図２の経路（Ａ）および（Ｂ）の組合せを開始するために、ＰＴｒｃ−ｃｉｍＡ３．７＿ｌｅｕＢＣＤカセット（実施例５）をＤＶ２ ＰＬ−ｔｈｒＡ＊ＢＣ ＰＴ５−ＢｓｆａｂＨ１ ΔＥｃｆａｂＨ株に組み込んで（実施例４）、株Ｇ１とも称するＤＶ２ ＰＬ−ｔｈｒＡ＊ＢＣ ＰＴｒｃ−ｃｉｍＡ３．７＿ｌｅｕＢＣＤ ＰＴ５−ＢｓｆａｂＨ１
ΔＥｃｆａｂＨ株を生成した。この株は、ｏｃ−ＦＡ経路の経路（Ｂ）による（Ｒ）−シトラマル酸合成酵素活性、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性およびベータ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドを過剰発現し、ｏｃ−ＦＡ経路（図２）の経路（Ａ）によるアスパルトキナーゼ活性、ホモセリン脱水素酵素活性、ホモセリンキナーゼ活性およびスレオニン合成酵素活性を有するポリペプチドを過剰発現した。
ＤＶ２ ＰＬ−ｔｈｒＡ＊ＢＣ ＰＬ−ｔｄｃＢ ＰＴｒｃ−ｃｉｍＡ３．７＿ｌｅｕＢＣＤ ＰＴ５−ＢｓｆａｂＨ１ ΔＥｃｆａｂＨ（株「Ｇ２」）
ｏｃ−ＦＡ経路の経路（Ａ）および（Ｂ）の組合せに対応する活性を有するポリペプチドを過剰発現するように操作した株を作出するために、ＰＬ−ｔｄｃＢカセット（実施例４）を株Ｇ１に組み込んで、株Ｇ２とも称するＤＶ２ ＰＬ−ｔｈｒＡ＊ＢＣ ＰＬ−ｔｄｃＢ ＰＴｒｃ−ｃｉｍＡ３．７＿ｌｅｕＢＣＤ ＰＴ５−ＢｓｆａｂＨ１ ΔＥｃｆａｂＨ株を生成した。この株では、組み込まれたＥ．コリｔｈｒＡ＊ＢＣ遺伝子および組み込まれたＥ．コリｔｄｃＢ遺伝子（経路（Ａ）に対応するアスパルトキナーゼ活性、ホモセリン脱水素酵素活性、ホモセリンキナーゼ活性、スレオニン合成酵素活性およびスレオニンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする）を強力なラムダＰＬプロモーターの制御下に置き、過剰発現させた。外来性ｃｉｍＡ３．７遺伝子および天然のＥ．コリｌｅｕＢＣＤ遺伝子（経路（Ｂ）に対応する（Ｒ）−シトラマル酸合成酵素活性、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性およびベータ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードする）はまた、Ｅ．コリ染色体において強力なＩＰＴＧ誘導性プロモーターＰＴｒｃの制御下に組み込み、したがってまた過剰発現させた。ｏｃ−ＦＡ経路の部分（Ｄ）（図１Ｂ）に対応する分枝鎖ベータケトアシル−ＡＣＰ合成酵素をコードする組み込まれたＢ．ズブチリスｆａｂＨ１遺伝子を、強力なＴ５プロモーターの制御下に置いた。内在性Ｅ．コリｆａｂＨ遺伝子はこの株から削除した。
奇数鎖脂肪酸生成の評価
以下の実施例は、スレオニン依存性経路（図２の経路（Ａ））またはシトラマル酸経路（図２の経路（Ｂ））のどちらかを介することによって、プロピオニル−ＣｏＡを生成するために一般的なα−ケト酪酸中間体を通る代謝流を増加させる酵素をコードする外来性遺伝子を発現し、および／または内在性遺伝子を過剰発現するように操作されたＥ．コリ株における直鎖状奇数鎖脂肪酸の生成を示す。奇数鎖脂肪酸生成のための「プライマー」分子として役立つプロピオニル−ＣｏＡをその後、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＩＩ（ＦａｂＨ）の作用によってマロニル−ＡＣＰと縮合して、奇数鎖脂肪酸およびｏｃ−ＦＡ誘導体を生成するための脂肪酸合成サイクルに入る奇数鎖β−ケトアシル−ＡＣＰ中間体を形成する。したがって、この実施例はまた、外来性ＦａｂＨ酵素の奇数鎖脂肪酸生成に対する効果を実証する。
１組目の実験では、４Ｎ−ＢＴプロトコールを使用して９６ディープウェルプレート発酵を実施することによって、株の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）生成を評価した。単一のコロニーまたはグリセロールストックからの掻き取りを使用してＬＢ＋抗生物質（複数可）３００μＬに接種した。ＬＢ種培養物は、濁るまで２５０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で６〜８時間増殖させた。ＬＢ培養物２０μＬを使用して２Ｎ−ＢＴ ４００μＬに接種した。これらを２５０ｒｐｍで振盪しながら３２℃で一晩増殖させた。翌朝、２Ｎ−ＢＴ培養物２０μＬを４Ｎ−ＢＴ ４００μＬに移した。４Ｎ−ＢＴ培養物を２５０ｒｐｍで振盪しながら３２℃で６時間増殖させ、その時点で細胞をＩＰＴＧ １ｍＭで誘導した。誘導して、培養物を１６〜１８時間さらに増殖させた後、抽出して、ＦＦＡ生成を分析した。ＨＣｌ １Ｍ ４０μＬ、次いでＣ２４アルカン内部標準５００ｍｇ／Ｌでスパイクした酢酸ブチル４００μＬを各ウェルに添加した。２０００ｒｐｍで１５分間ボルテックスすることによって細胞を抽出した。抽出物は、等容量のＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）で誘導体化した後、ＧＣ／ＭＳによって分析した。
Figure 0006609274
これらの実験で生成した奇数鎖脂肪酸は一般的に、Ｃ１３：０、Ｃ１５：０、Ｃ１７：０およびＣ１７：１脂肪酸を含み、Ｃ１５：０が生成される主なｏｃ−ＦＡである。
表１１の株１および２の比較によって、微生物細胞がスレオニンの生合成および分解に関与する遺伝子を過剰発現し、経路中間体α−ケト酪酸を通る代謝流を増加させ、細胞によって生成する奇数鎖長脂肪酸の割合を著しく増加させることが示される。親ＤＶ２株は直鎖脂肪酸を生成し、奇数鎖長脂肪酸の生成は無視できる量にすぎなかったが、ｔｈｒＡ＊ＢＣおよびｔｄｃＢ遺伝子（アスパルトキナーゼ活性、ホモセリン脱水素酵素活性、ホモセリンキナーゼ活性、スレオニン合成酵素活性およびスレオニンデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする）を過剰発現するＤＶ２株は、著しく多量および著しく高い割合の奇数鎖長脂肪酸を生成し、生成した直鎖脂肪酸の約１８％（重量）が奇数鎖長脂肪酸であった。
株２および３は、プロピオニル−ＣｏＡに対して高い特異性を有する外来性β−ケトアシルＡＣＰ合成酵素を含むことによってｏｃ−ＦＡ生成に対する効果を示す。株２は、天然（内在性）Ｅ．コリｆａｂＨ遺伝子を含有した。Ｂ．ズブチリスｆａｂＨ１遺伝子を発現するプラスミドを導入することによって、ｏｃ−ＦＡ生成は、生成した直鎖脂肪酸の約１８％（株２）から約３７％（株３）に著しく増加した。
ｏｃ−ＦＡ生成に対する際だった効果は、内在性Ｅ．コリｆａｂＨ遺伝子が削除され、Ｂ．ズブチリスｆａｂＨ１遺伝子が染色体に組み込まれたときに観察された。株４では、ｏｃ−ＦＡの割合は、生成した直鎖脂肪酸の７２％に増加した。
株５および６は、別のアプローチによって、今度はシトラマル酸生合成および分解に関与する経路によってα−ケト酪酸を通る代謝流を増加させることによってまた、生成する奇数鎖長脂肪酸の割合が増加することを示す。ｃｉｍＡ３．７およびｌｅｕＢＣＤ遺伝子（（Ｒ）−シトラマル酸合成酵素活性、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性およびβ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードする）を過剰発現するようにＤＶ２株を操作することによって、生成した直鎖脂肪酸の約４％が奇数鎖長を有し、プラスミド発現Ｂ．ズブチリスｆａｂＨ１を含めると約１３％に増加した。
株７および９は、ｏｃ−ＦＡ生成に対するスレオニンおよびシトラマル酸経路の組合せの効果を示す。ｔｈｒＡ＊ＢＣ、ｃｉｍＡ３．７およびｌｅｕＢＣＤ遺伝子が過剰発現している株Ｇ１では、内在性Ｅ．コリｆａｂＨ遺伝子は削除され、Ｂ．ズブチリスｆａｂＨ１遺伝子が染色体に組み込まれ、生成する直鎖脂肪酸の約２６％が奇数鎖脂肪酸であった。ｔｈｒＡ＊ＢＣ、ｔｄｃＢ、ｃｉｍＡ３．７およびｌｅｕＢＣＤ遺伝子が過剰発現している株Ｇ２では、内在性Ｅ．コリｆａｂＨ遺伝子は削除され、Ｂ．ズブチリスｆａｂＨ１遺伝子が染色体に組み込まれ、生成する直鎖脂肪酸のほぼ９０％が奇数鎖脂肪酸であった。‘ｔｅｓＡ遺伝子が染色体のＴｎ７付着部位に組み込まれた株Ｇ１／Ｔｎ７−ｔｅｓＡおよびＧ／Ｔｎ７−ｔｅｓＡ（それぞれ株８および１０）は、‘ｔｅｓＡ遺伝子がプラスミド発現した株Ｇ１およびＧ２（それぞれ、株７および９）におけるのとほぼ同等のｏｃ−ＦＡの量および割合を示した。
２組目の実験では、プロピオニル−ＣｏＡ生成の役割およびｏｃ−ＦＡ生成に対するＦａｂＨ酵素の効果を調べた。この実験では、外来性ｆａｂＨコーディング配列をｐＯＰ８０発現ベクターにクローニングし（実施例１）、発現を強力なＰＴｒｃプロモーターによって制御した。ｆａｂＨ発現コンストラクト（または、外来性ｆａｂＨを欠如する株においてはｐＯＰ８０ベクターのみ）を‘ｔｅｓＡプラスミドｐＡＣＹＣ−ＰＴｒｃ２−ｔｅｓＡと一緒に以下の株に形質転換した：
− ＤＶ２
− ＤＶ２ ｃｉｍＡ３．７＿ｌｅｕＢＣＤ（図２のシトラマル酸経路（Ｂ）を介したプロピオニル−ＣｏＡの増加）
− ＤＶ２ ｔｈｒＡ＊ＢＣｔｄｃＢ（図２のｔｈｒ依存経路（Ａ）を介したプロピオニル−ＣｏＡの増加）
単一のコロニーまたは凍結したグリセロールストックからの掻き取りを使用してＬＢ＋抗生物質（複数可）３００μＬに接種した。ＬＢ種培養物は、濁るまで２５０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で６〜８時間増殖させた。ＬＢ培養物２０μＬを使用して２Ｎ−ＢＴ培地４００μＬに接種した。これらを一晩２５０ｒｐｍで振盪しながら３２℃で少なくとも１４時間増殖させた。翌朝、２Ｎ−ＢＴ培養物２０μＬを４Ｎ−ＢＴ ４００μＬに移した。４Ｎ−ＢＴ培養物を２５０ｒｐｍで振盪しながら３２℃で６時間増殖させ、その時点で細胞をＩＰＴＧ １ｍＭで誘導した。誘導して、培養物を２０〜２２時間さらに増殖させた後、抽出して、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）生成を分析した。ＨＣｌ １Ｍ ４０μＬ、次いで酢酸ブチル４００μＬを各ウェルに添加した。２０００ｒｐｍで１５分間ボルテックスすることによって細胞を抽出した。抽出物は、等容量のＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）で誘導体化した後、水素炎イオン化検出器を結合させたＧＣ（ＧＣ−ＦＩＤ）によって分析した。
様々なｆａｂＨ遺伝子を発現する株によって生成される全遊離脂肪酸に対する奇数鎖脂肪酸の比を以下の表１２Ａ−Ｃに挙げる。対照ＤＶ２株において生成した奇数鎖脂肪酸比は表１２Ａに挙げ、一方、シトラマル酸経路（図２の経路（Ｂ））またはスレオニン依存性経路（図２の経路（Ａ））のどちらかの方法によってプロピオニル−ＣｏＡへの代謝流の増加のために操作された株における奇数鎖脂肪酸比はそれぞれ表１２Ｂおよび１２Ｃに示す。
Figure 0006609274
Figure 0006609274
Figure 0006609274
表１２Ａ〜１２Ｃで記載した株は全て、内在性Ｅ．コリｆａｂＨ遺伝子を発現した。株２〜１０はそれぞれ、プラスミド発現外来性ｆａｂＨ遺伝子をさらに含有した。内在性Ｅ．コリｆａｂＨ遺伝子の削除および外来性Ｂ．ズブチリスｆａｂＨ１遺伝子の染色体組み込みによって、内在性Ｅ．コリｆａｂＨおよびプラスミド発現外来性Ｂ．ズブチリスｆａｂＨ１を含有する株と比較して（表１１、株３）より多量およびより高い割合のｏｃ−ＦＡが生成されることが表１１（上記）で示された（表１１、株４）。それにも関わらず、表１２Ａ−１２Ｃに示した結果は、（ａ）試験したｆａｂＨ発現株の全てが、高いα−ケト酪酸およびプロピオニル−ＣｏＡレベルのために操作された株、ＤＶ２ ｃｉｍＡ３．７ ｌｅｕＢＣＤ（表１２Ｂ）およびＤＶ２ｔｈｒＡ＊ＢＣ ｔｄｃＢ（表１２Ｃ）において著しい直鎖状ｏｃ−脂肪酸生成を表したが、ＤＶ２対照株においてはあまりｏｃ−脂肪酸生成は観察されなかった（表１２Ａ）ので、プロピオニル−ＣｏＡは細菌における組換え直鎖状奇数鎖脂肪酸生成に必要な前駆体であり、（ｂ）組換え直鎖状ｏｃ−脂肪酸生成は、メンバーが分枝鎖脂肪酸および／または奇数鎖脂肪酸を含有する生物から単離された様々な異種ＦａｂＨ酵素の存在下で生じることを示している。このようなＦａｂＨ酵素は、脂肪酸生合成のプライミング反応においてプロピオニル−ＣｏＡ分子を利用し、奇数鎖脂肪酸生合成能力を組換え微生物に付与することができる。
結論として、この実施例は、通常偶数鎖脂肪酸を生成する微生物は、プロピオニル−ＣｏＡを通る代謝流を増加させ、プロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル合成酵素（ＦａｂＨ）酵素を発現することによって奇数鎖脂肪酸を生成するように操作することができることを示している。実施例６（以下）は、プロピオニル−ＣｏＡを通る代謝流を増加させるように操作できる代替経路を示す。奇数鎖脂肪酸を生成するように操作された組換え微生物は、奇数鎖脂肪アルコール（実施例７）および偶数鎖アルカン（実施例８）などの奇数鎖脂肪酸誘導体を生成するようにさらに改変することができる。
経路（Ｃ）による奇数鎖脂肪酸の生成のためのＥ．コリの操作
以下の実施例は、図３の経路（Ｃ）によってプロピオニル−ＣｏＡを生成するために中間体メチルマロニル−ＣｏＡを通る代謝流の増加に役立ち、これらの組換え細胞における奇数鎖アシル−ＡＣＰおよび奇数鎖脂肪酸誘導体の生成増加を引き起こす酵素をコードする外来遺伝子を発現する、および／または内在性遺伝子を過剰発現する組換えＥ．コリ株の構築について記載する。特に、この実施例は、プラスミドで内在性メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（ｓｃｐＡ／ｓｂｍ）およびメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ｓｃｐＢ／ｙｇｆＧ）遺伝子を過剰発現し、染色体のプロピオニル−ＣｏＡ：スクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ｓｃｐＣ／ｙｇｆＨ）およびｓｃｐＢ／ｙｇｆＧ遺伝子が削除されたＥ．コリ株における奇数鎖脂肪酸の生成について記載する。
Ｅ．コリ株ＤＶ２、プラスミドｐＤＧ６（Ｂ．ズブチリスＦａｂＨ１を発現する）およびプラスミドｐＡＣＹＣ−ｐＴｒｃ２−ｔｅｓＡ（切断型‘ＴｅｓＡポリペプチドを発現する）は、実施例１において記載されたように調製した。
プラスミドｐＡＣＹＣ−ＰＴｒｃ−ｓｂｍ−ｙｇｆＧ
プラスミドｐＡＣＹＣ−ＰＴｒｃ−ｓｂｍ−ｙｇｆＧは、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼをコードするＥ．コリｓｂｍおよびメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードするＥ．コリｙｇｆＧを過剰発現するｐＡＣＹＣ−ＰＴｒｃプラスミド（実施例１）である。ｐＡＣＹＣ−ＰＴｒｃ−ｓｂｍ−ｙｇｆＧの配列は、本明細書では配列番号８０とする。
ｓＤＦ４株
ｓＤＦ４株は、染色体のｓｃｐＢおよびｓｃｐＣ遺伝子を削除し、天然のｆｒｄプロモーターをｔｒｃプロモーターと置換し、‘ｔｅｓＡ遺伝子を染色体のＴｎ７付着部位に組み込んだＥ．コリ株ＤＶ２である。
‘ｔｅｓＡ遺伝子を組み込むために、ｐＡＣＹＣ−ＰＴｒｃ−‘ｔｅｓＡプラスミド（実施例１）を以下のプライマー：
ＩＦＦ： ５’−ＧＧＧＴＣＡＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＴＴＣＧＣＧＣＧＣＧＡＡＧＧＣＧ（配列番号１４０）
ＩＦＲ： ５’−ＴＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＣＴＡＧＧＧＣＡＴＴＡＣＧＣＴＧＡＣＴＴＧＡＣＧＧＧ（配列番号１４１）
を使用して増幅することによってＰＴｒｃ−‘ｔｅｓＡ組み込みカセットをまず調製した。
組み込みカセットは、ｐＧＲＧ２５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ４６０２２３）のＮｏｔＩおよびＡｖｒＩＩ制限部位に挿入し、ｌａｃＩｑ、ＰＴｒｃ−‘ｔｅｓＡカセットの左右にＴｎ７末端が隣接したＴｎ７ｔｅｓプラスミド（配列番号８１）を作出した。
ｓＤＦ４株を調製するために、ＭｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．， ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６：３９ （２００６）によって記載されたプロトコールを使用してプラスミドＴｎ７ｔｅｓをまずＥ．コリ株ＤＶ２（実施例１）にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、アンピシリン耐性細胞を、グルコース０．１％およびカルベニシリン１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ培地において３２℃で一晩増殖させることによって選択した。これに続いて、ＬＢおよびアラビノース０．１％プレートでの３２℃で一晩の細胞の増殖を使用して、Ｔｎ７遺伝子転移画分を含むプラスミドを選択した。単一のコロニーを選択し、アンピシリンを含むおよび含まない新たなＬＢ培地プレートに画線し、Ｔｎ７ｔｅｓプラスミドを回復するために４２℃で一晩増殖させた。したがって、ｌａｃＩｑ、ＰＴｒｃ−‘ｔｅｓＡをｐｓｔＳおよびｇｌｍＳ遺伝子の間に位置するＥ．コリ染色体のａｔｔＴｎ７部位に組み込んだ。これらの遺伝子の組み込みは、ＰＣＲおよび配列決定によって確認した。得られた株はＤＶ２Ｔｎ７−ｔｅｓＡと称した。
ＤＶ２Ｔｎ７−ｔｅｓＡからｓｃｐＢＣ遺伝子を削除するために、以下の２つのプライマーを使用した。
ＳｃｐＢＣ−ＫＯｆｗｄ ５’−ＧＣＴＣＡＧＴＧＡＡＴＴＴＡＴＣＣＡＧＡＣＧＣＡＡＴＡＴＴＴＴＧＡＴＴＡＡＡＧＧＡ ＡＴＴＴＴ ＴＡＴＧＡＴＴＣＣＧ ＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ（配列番号１４２）；および
ＳｃｐＢＣ−ＫＯｒｃ ５’−ＡＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＣＧＴＧＡＣＧＧＧＡＣＧＡＧＴＣＡＴＴＡＡＣＣＣＡＧＣＡＴＣＧＡＧＣＣＧＧＴＴＧＴ ＡＧＧＣＴＧ ＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ（配列番号１４３）
ＳｃｐＢＣ−ＫＯｆｗｄおよびＳｃｐＢＣ−ＫＯｒｃプライマーは、ＰＣＲによってプラスミドｐＫＤ１３からカナマイシン耐性（ＫｍＲ）カセットを増幅するために使用した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．、上記）。ＰＣＲ生成物を次に使用して、既にアラビノースで３〜４時間誘導された、Ｒｅｄリコンビナーゼを発現するプラスミドｐＫＤ４６を含有するエレクトロコンピテントＥ．コリＤＶ２ Ｔｎ７−ｔｅｓＡ細胞（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．、上記）を形質転換した。ＳＯＣ培地で３７℃で３時間増殖させた後、細胞をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含有するＬｕｒｉａ寒天プレートに播種した。耐性コロニーを同定し、３７℃一晩でインキュベートした後単離した。ｓｃｐＢＣ遺伝子の破壊は、染色体ｓｃｐＢＣ遺伝子に隣接するように設計した以下のプライマー：ＳｃｐＢＣ ｃｈｅｃｋ −６０ ｆｗｄ ５’−ＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＣＴＴＧＴＡＧＣＧ（配列番号１４４）
ＳｃｐＢＣ ｃｈｅｃｋ ＋６０ ｒｃ ５’−ＣＣＡＡＣＴＴＣＧＡＡＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＴＧ（配列番号１４５）
を使用して、ＰＣＲ増幅によって確認した。
ｓｃｐＢＣ削除を確認した後、単一のコロニーを採取し、ｐＣＰ２０プラスミドを用いてＫｍＲマーカーを除去するために使用した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．、上記）。Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．（上記）の手順の改変法を使用して、天然のフマル酸レダクターゼ（ｆｒｄ）プロモーターをＰＴｒｃプロモーターと置換した。得られたＥ．コリＤＶ２ ΔｓｃｐＢＣ：：ＦＲＴ、ΔＰｆｒｄ：：ＦＲＴ−ＰＴｒｃ、ａｔｔＴｎ７：：ＰＴｒｃ−‘ｔｅｓＡ株は「ｓＤＦ４」と称した。
株は以下に示したようにプラスミドで形質転換し、実施例５で記載した９６ディープウェルプレート発酵手順を使用して脂肪酸生成を評価し、ＳｃｐＡはＢ−１２依存性酵素なので、４Ｎ−ＢＴ培養培地にコバラミンを補給した。
Figure 0006609274
中間体スクシニル−ＣｏＡおよびメチルマロニル−ＣｏＡを介したプロピオニル−ＣｏＡの生成に関与する遺伝子を過剰発現する微生物細胞では、細胞によって生成する奇数鎖長脂肪酸の割合が増加した。ＤＶ２株（表１３の株１）の奇数鎖長脂肪酸の生成は無視できる量にすぎなかったが、内在性Ｅ．コリｓｂｍおよびｙｇｆＧ遺伝子（メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性およびメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする）を過剰発現するｓＤＦ４株では奇数鎖長脂肪酸の生成量が増加した。
表１３の株２および３は、プロピオニル−ＣｏＡに対して高い特異性を有する外来性β−ケトアシルＡＣＰ合成酵素を含むことによるｏｃ−ＦＡ生成に対する効果を示す。株２は、天然Ｅ．コリｆａｂＨ遺伝子を含有した。Ｂ．ズブチリスｆａｂＨ１遺伝子を発現するプラスミドを導入することによって、ｏｃ−ＦＡ生成は、株２において生成した脂肪酸の約４％から株３において生成した脂肪酸の約１６％までさらに増加した。
Ｅ．コリにおける奇数鎖脂肪アルコールの生成
以下は、本実施例において、アシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＡＡＲ）活性を有するポリペプチドも発現した、以前に記載した株による奇数鎖脂肪アルコールの生成を示す。ＡＡＲ活性はｏｃ−アシル−ＡＣＰ中間体をｏｃ−脂肪アルデヒドに変換し、これは内在性アルデヒドレダクターゼと反応してｏｃ−脂肪アルコールを形成した。
株ＤＶ２、ＤＶ２ ＰＬ−ｔｈｒＡ＊ＢＣ ＰＬ−ｔｄｃＢ ＰＴ５−ＢｓｆａｂＨ１
ΔＥｃｆａｂＨおよびＧ１（それぞれ実施例１、２および４において記載したように調製した）は、プラスミドｐＬＳ９１８５またはｐＤＳ１７１ｓのどちらかで形質転換した。プラスミドｐＬＳ９１８５はシネココッカス・エロンガタス脂肪アシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＡＡＲ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿４００６１１）を発現した。プラスミドｐＤＳ１７１ｓは、Ｓ．エロンガタスＡＡＲ、シアノバクテリウム・ノストックパンクチュフォルメ（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）（ｃＡＣＰ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿００１８６７８６３）のアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）およびバチルス・ズブチリス（Ｓｆｐ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿００４２０６３１３）のホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを発現した。これらの株は、実施例５で記載した９６ディープウェルプレート発酵手順を使用して脂肪アルコール生成を評価した。
Figure 0006609274
対照株ＤＶ２と比較して、株ＤＶ２ ｔｈｒＡ＊ＢＣ ｔｄｃＢ ＢｓｆａｂＨ１ ΔＥｃｆａｂＨおよびＧ１はいずれも、ＡＡＲを発現するプラスミドまたはＡＡＲ、ｃＡＣＰおよびＳｆｐを発現するプラスミド（表１４）で形質転換したとき、著しく高い力価および割合の奇数鎖脂肪アルコールを生成した。奇数鎖脂肪アルコールとして生成される脂肪アルコールの割合は、これらの株の脂肪酸生成を評価したとき認められた割合をほぼ反映しており（表１１）、ＡＡＲは類似の全体鎖長の奇数鎖または偶数鎖アシル−ＡＣＰに選択性を示さないことが示唆された。
Ｅ．コリにおける偶数鎖アルカンの生成
以下の実施例は、アシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＡＡＲ）活性を有するポリペプチドおよびアルデヒドデカルボニラーゼ（ＡＤＣ）活性を有するポリペプチドを発現する株による偶数鎖アルカンの生成を示す。ＡＡＲ活性は、ｏｃ−アシル−ＡＣＰ中間体をｏｃ−脂肪アルデヒドに変換し、ＡＤＣ活性はｏｃ−脂肪アルデヒドを脱カルボニル化して偶数鎖（ｅｃ−）アルカンを形成した。
株ＤＶ２、ＤＶ２ ｔｈｒＡ＊ＢＣ ｔｄｃＢ ＢｓｆａｂＨ１ ΔＥｃｆａｂＨおよびＧ１（それぞれ実施例１、２および４において記載したように調製した）は、プラスミドｐＬＳ９１８５およびｐＬＳ９１８１で形質転換した。プラスミドｐＬＳ９１８５はシネココッカス・エロンガタス脂肪アシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＡＡＲ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿４００６１１）を発現した。プラスミドｐＬＳ９１８１はノストック・パンクチュフォルメアルデヒドデカルボニラーゼ（ＡＤＣ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿００１８６５３２５）を発現した。両プラスミドで形質転換した株は、上記の実施例５で記載した９６ディープウェルプレート発酵手順を使用し、しかし誘導時にＭｎＳＯ４ ２５μＭ（最終濃度）のをさらに補給して、アルカン生成を分析した。
Figure 0006609274
対照株ＤＶ２と比較して、ＤＶ２ ｔｈｒＡ＊ＢＣ ｔｄｃＢ ＢｓｆａｂＨ１ ΔＥｃｆａｂＨおよびＧ１はいずれも、ＡＡＲおよびＡＤＣを発現するプラスミド（表１５）で形質転換したとき、著しく高い力価および割合の偶数鎖アルカンを生成した。偶数鎖アルカンとして生成されるアルカンの割合は、これらの株の脂肪酸生成（表１１）および脂肪アルコール生成（表１４）を評価したとき生成した奇数鎖生成物の割合をほぼ反映しており、ＡＤＣには、ＡＡＲのように、同程度の全体鎖長の奇数鎖または偶数鎖基質の間に選択性を示さないことが示唆された。
本発明はそれらの詳細な説明と併せて記載してきたが、前述の説明は本発明を例示するものであって、範囲を制限するものではなく、添付の特許請求の範囲によって定義されることを理解されたい。他の態様、利点および改変は以下の特許請求の範囲内である。
Ｋｎｏｔｈｅ Ｇ．，Ｆｕｅｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．８６：１０５９−１０７０（２００５）

Claims (6)

  1. （ａ）親微生物細胞で生成されるプロピオニル−ＣｏＡの量と比較して、組換え微生物細胞において増加した量のプロピオニル−ＣｏＡを生成するために有効な酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記親微生物細胞が前記酵素活性を欠如または前記酵素活性の減少した量を有しており、前記ポリヌクレオチドが組換え微生物細胞にとって外来性であるか、または前記ポリヌクレオチドが組換え微生物細胞にとって内在性であり、かつ
    （ｉ）それぞれが、（Ｒ）−シトラマル酸合成酵素活性、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性もしくはベータ−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有する、複数のポリペプチド、および／または
    （ｉｉ）それぞれが、アスパルトキナーゼ活性、ホモセリン脱水素酵素活性、ホモセリンキナーゼ活性、スレオニン合成酵素活性もしくはスレオニンデアミナーゼ活性を有する、複数のポリペプチド
    をコードするポリヌクレオチド、
    （ｂ）β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有し、基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに
    （ｃ）チオエステラーゼ活性（ＥＣ３．１．１．５、ＥＣ３．１．２．１４、ＥＣ３．１．２．−）を有するポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチド
    を含み、（ｉ）および／または（ｉｉ）に含まれる全てのポリペプチドを過剰発現するように操作した組換え微生物細胞であって、
    組換え微生物細胞が、炭素源の存在下で、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）によるポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で培養したとき、奇数鎖脂肪酸誘導体および偶数鎖脂肪酸誘導体を含む脂肪酸誘導体組成物を生成し、かつ
    脂肪酸誘導体組成物における脂肪酸誘導体の少なくとも１０％が奇数鎖脂肪酸誘導体である、組換え微生物細胞。
  2. 脂肪酸誘導体組成物における脂肪酸誘導体の少なくとも２０％が奇数鎖脂肪酸誘導体である、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
  3. 炭素源の存在下で、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）によるポリヌクレオチドを発現するために有効な条件下で培養したとき、奇数鎖脂肪酸誘導体を少なくとも１００ｍｇ／Ｌ生成する、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
  4. 基質としてプロピオニル−ＣｏＡを利用するβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドが組換え微生物細胞にとって外来性であり、組換え微生物細胞にとって内在性であるβ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素活性を有するポリペプチドの発現が減衰している、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
  5. 細菌細胞である、請求項１に記載の組換え微生物細胞。
  6. 請求項５に記載の細菌細胞を含む、細胞培養物。
JP2017011738A 2011-09-14 2017-01-26 組換え微生物細胞における奇数鎖脂肪酸誘導体の生成 Expired - Fee Related JP6609274B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/232,927 2011-09-14
US13/232,927 US8372610B2 (en) 2010-09-15 2011-09-14 Production of odd chain fatty acid derivatives in recombinant microbial cells

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014530656A Division JP6141282B2 (ja) 2010-09-15 2012-03-08 組換え微生物細胞における奇数鎖脂肪酸誘導体の生成

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019194213A Division JP7042785B2 (ja) 2011-09-14 2019-10-25 組換え微生物細胞における奇数鎖脂肪酸誘導体の生成

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2017131219A JP2017131219A (ja) 2017-08-03
JP6609274B2 true JP6609274B2 (ja) 2019-11-20

Family

ID=58543708

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017011738A Expired - Fee Related JP6609274B2 (ja) 2011-09-14 2017-01-26 組換え微生物細胞における奇数鎖脂肪酸誘導体の生成
JP2019194213A Active JP7042785B2 (ja) 2011-09-14 2019-10-25 組換え微生物細胞における奇数鎖脂肪酸誘導体の生成
JP2021195994A Pending JP2022043100A (ja) 2011-09-14 2021-12-02 組換え微生物細胞における奇数鎖脂肪酸誘導体の生成

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019194213A Active JP7042785B2 (ja) 2011-09-14 2019-10-25 組換え微生物細胞における奇数鎖脂肪酸誘導体の生成
JP2021195994A Pending JP2022043100A (ja) 2011-09-14 2021-12-02 組換え微生物細胞における奇数鎖脂肪酸誘導体の生成

Country Status (3)

Country Link
JP (3) JP6609274B2 (ja)
CN (1) CN107365733B (ja)
BR (1) BR112014005938A2 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109266592A (zh) * 2018-08-23 2019-01-25 天津科技大学 一种l-酪氨酸基因工程菌及其生产l-酪氨酸的方法
CN112410389B (zh) * 2019-08-23 2023-07-18 中国科学院微生物研究所 支链α-酮酸脱氢酶复合体在制备丙二酸单酰辅酶A中的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101490241A (zh) * 2006-05-19 2009-07-22 Ls9公司 脂肪酸及其衍生物的制备
EP2118266A4 (en) * 2007-02-09 2010-05-19 Univ California BIOFUEL PRODUCTION BY RECOMBINANT MICROORGANISMS
AU2008323673B8 (en) * 2007-11-10 2012-08-09 Joule Unlimited Technologies, Inc. Hyperphotosynthetic organisms

Also Published As

Publication number Publication date
JP7042785B2 (ja) 2022-03-28
BR112014005938A2 (pt) 2017-04-04
JP2022043100A (ja) 2022-03-15
JP2020022495A (ja) 2020-02-13
CN107365733B (zh) 2021-08-17
CN107365733A (zh) 2017-11-21
JP2017131219A (ja) 2017-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6141282B2 (ja) 組換え微生物細胞における奇数鎖脂肪酸誘導体の生成
US20240150774A1 (en) Production of fatty acid derivatives
US8530221B2 (en) Production of branched chain fatty acids and derivatives thereof in recombinant microbial cells
JP2016500261A (ja) 脂肪酸誘導体のａｃｐ媒介性生産方法
EP2663636B1 (en) Production of branched chain fatty acids and derivatives thereof in recombinant microbial cells
JP2022043100A (ja) 組換え微生物細胞における奇数鎖脂肪酸誘導体の生成
US10787648B2 (en) Omega-hydroxylase-related fusion polypeptide variants with improved properties
JP2019103507A (ja) 改善されたアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ変種

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170217

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20170217

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20180117

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20180416

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180514

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20181031

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20190128

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20190329

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190422

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20190930

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20191025

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6609274

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees